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質量分析法（MALDI-TOF MS）を用いた臨床微生物同定と感染症迅速診断への応用

東山智宣 1，中西豊文 2，田窪孝行 1,2

1 大阪医科大学附属病院中央検査部（〒 569-0801　大阪府高槻市大学町 2-7）2 大阪医科大学臨床検査医学教室（〒 569-0801　大阪府高槻市大学町 2-7）

要旨　マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry：MALDI-TOF MS）を用いた微生物同定法は，MS法により得られた微生物特有のリボソームタンパク質を主成分とした分子のフィンガープリント（マススペクトルパターン）を，既知標準菌株ライブラリーと検索・照合し，目的菌種を同定する新手法である．従来法に比して特異性・迅速性に優れている．現在，我々の検査室では，主に臨床検体（血液，尿，糞便，喀痰等）から培養で発育した細菌や酵母様真菌の培地上のコロニーを対象にMALDI-TOF MSによる微生物同定を実施している．一方，菌血症・敗血症等の起因菌を検出・同定検出する場合は，培養コロニーではなく，血液培養陽性培養液から直接同定する方法も検討している．今回，本法による微生物迅速同定の成績と感染症迅速診断への応用について概説する．

キーワード：細菌同定；迅速同定；微生物検査；MALDI-TOF MS，MALDI Biotyper

はじめに

　従来の微生物同定の手順（塗抹検鏡→分離培養→純培養→同定）はその殆どが手作業で実施されて来た．同定に関しては，一般細菌や酵母様真菌に対して利用出来る生化学的手法による自動機器が開発され，自動化されてきた．更に最近では，MALDI-TOF MSによる微生物同定法が開発され，我が国でも医療機器として認可された専用機器による方法が保険適用となったのを契機に，多くの医療施設で導入に向けた種々の検討がなされている1）, 2）．　我々は，MSによる微生物同定法の将来のルーチン化に備え，医学部の研究用MS計に Biotyperソフトを搭載し，基礎的検討と臨床応用への可能性を検討している．　

1.　MALDI-TOF MSによる微生物同定の原理（図 1）

　MALDI-TOF MSによる微生物同定は，微生物菌体を専用サンプルプレートに載せ，マトリックスを混合後，乾燥させレーザーを照射し，主として菌体のリボソームタンパク質をイオン化し，

連絡先＊ 〒569-081　大阪府高槻市大学町2-7 大阪医科大学付属病院中央検査部　電話：072-683-1221　電子メール：kns012@

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図 1　従来法による微生物同定法とMALDI-TOF MS法との比較および原理

図 2　代表的な菌種のマススペクトルパターン

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MS計内部での飛行時間計測結果から構成タンパクの質量荷電比（m/z）と強度によるマススペクトルパターンを得る．このマススペクトルパターンは，そのサンプル菌株独自のものであるが，菌種により複数の共通ピークを持つため，これを利用し同定する（図 2）．すなわち，予め数千株の既知標準菌株のマススペクトルパターンを模式化したMSP（Main Spectra）をデータベースとして登録しておき，サンプル菌株由来のマススペクトルパターンのMSPを既知標準菌株由来のものと比較し（図 3），最も類似するものを選び出すことにより同定が可能となる3）（図 4）．

2.　培養コロニーを用いたMALDI-TOF MSによる微生物同定

　我々の使用しているMALDI-TOF MS計は，Autoflex Speed（Bruker Daltonics社製）Linearモードであり，これに Biotyperソフト Ver3.0（Bruker Daltonics社製）を用い Real Time Classificationにて自動測定／自動解析を実施している．マトリックスは HCCA（α-cyano-4-hydroxy- cinnamic acid）を用いた．　培養コロニーを用いる方法は，大きく分けると 2法ある．コロニーを直接MALDI-TOF MS用

図 3　MALDI BiotyperによるMSPのパターンマッチング

図 4　MALDI Biotyperによる同定結果表記

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Plateに塗布する方法をセルスメア法（スメア法）と言い，このセルスメア法で良好なマススペクトルパターンが得られない場合は，培養コロニーによる菌浮遊液をエタノール・蟻酸抽出法（抽出法）で処理した抽出液をMALDI-TOF MS用 Plateに塗布し測定することで同定成績が改善されることが多い．実際に我々の測定結果でも，酵母様真菌の一部ではスメア法で同定成績が悪く，抽出法を用いることで改善された4）．

セルスメア法（スメア法）①　培地上のコロニーの一部を直接MS用サンプルプレートに塗布②　乾燥後，HCCAマトリックスを 1 μl重層し，乾燥後MS計にて測定

エタノール・蟻酸抽出法（抽出法）①　エッペンチューブに入れた滅菌蒸留水 250 μl にコロニーを懸濁混和（ボルテックス）②　純エタノール 750 μlを加え混和（ボルテックス）③　2200 × g-10 min遠心し，上清を捨てる④　沈渣に 50 μl蟻酸を加え混和（ボルテックス）⑤　更に，50 μlアセトニトリルを加え混和（ボルテックス）⑥　2200 × g/10 min遠心し，上清 1 μlをMS専用サンプルプレートに載せる

表 1　MALDI-TOF MS法と従来法との同定一致率（N＝184）

Aerobic organisms N＝146 （100％） Concordance to Conventional IDTotal

MALDI Biotyper ID Score ◎species genus not reliable

≧ 2.000 （Secure-Probable） 112 （76.7％） 6 （4.1％） ― 118 （80.8％）1.700-1.999 （Probable） 20 （13.7％） 5 （3.4％） ― 25 （17.1％）≦ 1.699 （Not reliable） ― ― 3 （2.1％） 3 （ 2.1％）

Total 132 （90.4％） 11 （7.5％） 3 （2.1％） 146 （100％）

Anaerobic organisms N＝16（100％） Concordance to Conventional IDTotal

MALDI Biotyper ID Score ◎species genus not reliable

≧ 2.000 （Secure-Probable） 12 （75.0％） 1 （ 6.3％） ― 13 （81.2％）1.700-1.999 （Probable） 1 （ 6.3％） 1 （ 6.3％） ― 2 （12.5％）≦ 1.699 （Not reliable） ― ― 1 （ 6.3％） 1 （ 6.3％）

Total 13 （81.2％） 2 （12.5％） 1 （ 6.3％） 16 （100％）

Yeasts N＝22（100％） Concordance to Conventional IDTotal

MALDI Biotyper ID Score ◎species genus not reliable

≧ 2.000 （Secure-Probable） 11†（50.0％） ― ― 11 （50.0％）1.700-1.999 （Probable） 6††（27.3％） 1 （ 4.5％） ― 7 （31.8％）≦ 1.699 （Not reliable） ― ― 4 （18.2％） 4 （18.2％）

Total 17 （77.3％） 1 （ 4.5％） 4 （18.2％） 22 （100％）

　†：3株は抽出法の結果による††：1株は抽出法の結果による

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⑦　乾燥後，HCCAマトリックスを 1 μl載せ，乾燥後MS計にて測定　（上記の遠心条件に関しては，10,000 × g以上での冷却遠心で短時間の適用が可能．）　表 1に培養コロニーを用いたMALDI-TOF MSによる微生物同定についての我々の検討成績と従来法との一致率を示す4）．好気性菌での従来法との一致率は菌種一致で 90.4％（属一致まで含め97.9％）．嫌気性菌は菌種一致で 81.2％（属一致まで含め 93.7％），酵母様真菌は菌種一致で 77.3％（属一致まで含め 81.8％）であった．酵母の一部では抽出法で同定率が改善した．スメア法 20 検体での全行程所要時間は約 60 分（1検体約 3分）であり，生化学的性状を用いた従来法（所要時間約 6～12 時間）に比べ格段に短い．また 1検体あたりのランニングコスト（試薬代）も従来法の10 分の 1程度と安価である．　従来法は，生化学的性状により同定を行う自動機器 VITEK2（Sysmex-Biomerieux社：好気性菌，酵母），生化学的性状による用手法同定キット RapID ANAⅡ System（Remel社：嫌気性菌）または簡易同定法等を用いて同定した．

3.　MALDI-TOF MS法による血液培養陽性培養液からの直接微生物同定（図 5）

　本来，血液は無菌状態にあり，血液培養検査により菌が検出されるということは，菌血症あるいは，より重篤な敗血症が疑われ，迅速な起因菌の同定と迅速・適切な抗菌薬治療が重要となる．したがって，本法により血液培養陽性培養液から直接微生物同定が可能となれば臨床的意義は高い．MS法による血液培養陽性培養液からの直接微生物同定については，ヨーロッパの複数の研究グループが良好な検討成績を報告している5）, 6）, 7）．表 2に我々の検討成績を示す8）．グラム陰性桿菌陽性ボトルでは良好（従来法と 100％菌種一致）であったが，グラム陽性球菌陽性ボトルでは，我々の施設で採用している血液培養ボトルが抗菌薬吸着活性炭入りであるため，この活性炭の悪影響を受け易く同定精度が低下した（従来法と 28％菌種一致）．なお，この活性炭入り培養ボトルは，今年中にビーズに変更された培養ボトルになるため，今後はその欠点が解消され，MS法による直接微生物同定成績は格段向上する事が期待されている．

図 5　血液培養陽性培養液からの直接微生物同定法

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4.　Aspergillusなどの糸状菌についてのMALDI-TOF MSによる同定法

　糸状菌に関しては，現状では一般細菌や酵母様真菌のように安定した同定結果を得るには，前処理法のさらなる検討が必要であろうという段階である．現在のメーカー推奨の糸状菌同定プロトコールでは，サブローブロスなどの液体培地で 2，3日振盪培養した後に，エタノール・蟻酸抽出法を実施してMS測定するとなっている．また同定検索に用いる標準菌株データベースも真菌専用のものを使用する必要がある．我々も現在，数株の糸状菌臨床分離株を用いて，測定手法の問題点の解決に向け試行錯誤しながら標準的前処理法の確立を試みている．　　　 　　　　

5.　MALDI-TOF MSによる微生物同定法の利点と問題点

　MALDI-TOF MS法の利点は，1） 同定に要する時間が極端に短い．これにより，感染症の治療方針の決定が約 1日早まることが予想される．

2） MS測定の処理能力が極めて高いことである．これにより，多数のサンプルを一気に同定することが可能である．

3） 測定ランニングコストが安価であること．4） 好気性一般細菌，嫌気性菌，酵母様真菌いずれがサンプルであっても，基本的な測定手技が同じであること．これにより検査効率向上や検査試薬の無駄削減が可能である．

表 2　血液培養陽性培養液からの直接微生物同定法の成績（ID Score順）

No.Quantity （cfu/ml） Conventional ID Category

MALDI-TOF MS result: Organism （best match）

ID Score Value

Concordance to Conventional ID

1 3 × 10^9 Escherichia coli AER-GNR Escherichia coli 2.465 ◎sp2 1 × 10^9 Klebsiella pneumoniae AER-GNR Klebsiella pneumoniae 2.453 ◎sp3 N.T. Bacteroides fragilis ANA-GNR Bacteroides fragilis 2.427 ◎sp4 5 × 10^8 Klebsiella pneumoniae AER-GNR Klebsiella pneumoniae 2.3 ◎sp5 1 × 10^9 Escherichia coli AER-GNR Escherichia coli 2.22 ◎sp6 1 × 10^9 Klebsiella pneumoniae AER-GNR Klebsiella pneumoniae 2.191 ◎sp7 2 × 10^8 Bacteroides fragilis ANA-GNR Bacteroides fragilis 2.165 ◎sp8 N.T. Escherichia coli AER-GNR Escherichia coli 2.135 ◎sp9 4 × 10^8 Staphylococcus hominis AER-GPC Staphylococcus hominis 1.99 ◎sp10 N.T. Pseudomonas aeruginosa AER-GNR Pseudomonas aeruginosa 1.965 ◎sp11 7 × 10^8 Staphylococcus hominis AER-GPC Staphylococcus hominis 1.916 ◎sp12 8 × 10^8 Escherichia coli AER-GNR not reliable identification （E. coli） 1.682 ◎sp13 N.T. Staphylococcus epidermidis AER-GPC not reliable identification 1.485 ×14 9 × 10^7 Staphylococcus epidermidis AER-GPC not reliable identification 1.446 ×15 6 × 10^8 Staphylococcus hominis AER-GPC not reliable identification 1.408 ×16 4 × 10^6 Streptococcus sanguinis AER-GPC not reliable identification 1.367 ×17 3 × 10^6 Candida albicans Yeast not reliable identification 1.362 ×18 N.T. Staphylococcus aureus AER-GPC not reliable identification 1.03 ×

グラム陰性桿菌発育の場合（10 例）には，全て（100％）従来法と菌種一致グラム陰性球菌発育の場合 7例中 2例（28％）のみ従来法と菌種一致

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5） MS法で得られるマススペクトルパターンは個々の菌株特異的なパターンを示すことから，これを用いて複数株のグルーピングが可能であり，パルスフィールドゲル電気泳動法（Pulsed- field gel electrophoresis：PFGE）に替わる菌株識別法として院内感染アウトブレイク対策の有用なツールとなると考えられる．

　問題点としては，1） 薬剤感受性試験ができないこと．すなわち，現時点ではMS法は同定専用機と考えてよい．2） 糸状菌や抗酸菌など，まだ十分な同定成績が得られるプロトコールが確立していない菌種については同定できないことがある．

3） 遺伝子学的には相違のない菌種同志（大腸菌と赤痢菌など）は区別が不可能な場合がある．4） 複数の菌種が混在している試料の場合に，すべてを漏らさず同定することが困難である．ただし，ソフトウェアのバージョンアップで 2菌種の同定は対応可能の見通し．

6.　ま と め

　MALDI-TOF MSによる微生物同定法は，従来法と比較して高い一致率を示す同定結果が迅速に得られる．さらに，高い検体処理能力と高いコストパフォーマンスを持ち，検査手技も基本的な部分は簡便であることから，非常に有用な検査法と考えられる．今後は，臨床微生物検査のみならず，広く微生物学分野の基幹となる同定方法となり，この分野の発展に大きく寄与するものと考えられる．

謝　　辞

　本研究を遂行するに当たり，松山由美子氏（Bruker Daltonics K. K.）に種々の助言並びに技術支援を受けた．此処に深謝致します．

参考文献

１） Sogawa, K., Watanabe, M., Sato, K., Segawa, S., Ishii, C., Miyabe, A., Murata, S., Saito, T., and Nomura, F.: Use of the MALDI BioTyper system with MALDI-TOF mass spectrometry for rapid identi-fication of microorganisms. Anal Bioanal Chem, 400, 1905-1911 （2011）

２） 曽川一幸，渡邊正治，佐藤謙一，瀬川俊介，石井知里，宮部安規子，村田正太，齊藤知子，野村文夫：MALDI-TOF Mass SpectrometryとMALDI BioTyperを用いた微生物迅速同定法の評価．JJCLA, 37, 65-73（2012）

３） 大楠清文：質量分析技術を利用した細菌の新しい同定法．モダンメディア，58, 113-122（2012）４） 東山智宣，中西豊文，松山由美子，田窪孝行：MALDI-TOF MS法による感染症起因微生物の迅速同定に関する基礎的検討とその最適化．第 59 回日本臨床検査医学会学術集会抄録集．臨床病理．60 補冊．148（2012）

５） Loonen, A.J.M., Jansz, A.R., Stalpers, J, et al.: An evaluation of three proces-sing methods and the effect of reduced culture times for faster direct identification of pathogens from BacT/ALERT blood cultures by MALDI-TOF MS.: Eur Clin Microbiol, Infect Dis, 31,1575-1583 （2011）

６） Martiny, D., Dediste, A., Vandenberg, O.: Comparison of an in-house method and the commercial Sepsi-

216　東山智宣ら Mycotoxins

typerTM kit for bacterial identification directly from positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption-ionisation time-of-flight mass spectrometry. Eur J. Clin Microbiol Infect Dis, 31, 2269-2281 （2012）

７） Moussaoui, W., Jaulhac, B., Hoffmann, A.M., et al.: Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials Clin Microbiol Infect, 16, 1631-1638 （2010）

８） 東山智宣，谷口真樹子，柴田有理子，池本敏行，中西豊文，田窪孝行：MALDI-TOF MSを用いた微生物同定におけるサンプル前処理法の最適化．第 23 回生物試料分析科学会年次学術集会抄録集．生物試料分析 36. 74（2013）

The identification of microorganism in clinical sample by MALDI-TOF MS technique and application to the rapid diagnosis of infectious disease

Tomohiro HIGASHIYAMA1, Toyofumi NAKANISHI

2, Takayuki TAKUBO1, 2

1 Central Clinical Laboratory, Osaka Medical College Hospital, 2 - 7 Daigaku-cho, Takatsuki-City, Osaka, 569 - 8686 ,

Japan2 Department of Clinical and Laboratory Medicine, Osaka Medical College, 2-7 Daigaku-cho, Takatsuki-City, Osaka,

569-8686, Japan

　　Matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry （MALDI-TOF MS） is a new

powerful tool to identify the profiles of the ribosome proteins derived from microorganisms. By comparison between

the fingerprints of ribosome proteins of microorganism and those of the standard strain library, we can easily identify

the species of microorganisms in the clinical sample. This new MS method is more specific and rapid than the conven-

tional method.

　　In our laboratory, we have been directly identified microorganism and yeast in a colony on the solid medium from

the clinical sample （blood, urine, feces, sputum, etc.） by the MALDI-TOF MS. Moreover, we applied positive blood

culture broths instead of a bacterial colony, when we identify microorganism caused with the infectious disease such as

bacteremia and sepsis. At this time, we described the outline about the identification of microorganisms by

MALDI-TOF MS, and its application to rapid diagnosis of infectious disease.

Key words：�identification of microorganisms; MALDI Biotyper; MALDI-TOF MS; microbiological analysis, rapid

identification,