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Biokatalysatoren und Verfahrenstechniken
/21/ U. Kragl, W. Kruse, W. Hummel, C. Wandrey: Enzyme Engineering Aspects of Biocatalysis: Cofactor Regeneration as Example. Biotechnol. Bioeng. 52, 309-319 (1996).
/22/ S. Fey, L. Elling, U. Kragl: The cofactor Mg2+ - a key switch for effective continuous enzymatic production of GDP-mannose using recombinant GDP-mannose pyrophosphorylasse; Carbohydr. Res., eingereicht.
/23/ S. Rissom, U. Schwarz-Linek, M. Vogel, V. I. Tishkov, U. Kragl, U.: Synthesis of chiral e-lactones in a two-enzyme system of cyclohexanone monooxygenase and formate dehydrogenase with integrated bubblefree aeration; Tetrahedron: Asymmetry 8, 2523-2526 (1997).
Anschrift des Autors:
Dr. U. Kragl Forschungszentrum Jülich GmbH Institut für Biotechnologie 2 52425 Jülich
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Lipasen aus Pflanzen als Katalysatoren für die Biokonversion von Fetten
Lipasen aus Pflanzen als Katalysatoren für die Biokonversion von Fetten
K. D. Mukherjee Bundesanstalt für Getreide-, Kartoffel- und Fettforschung Institut für Biochemie und Technologie der Fette, H. P. Kaufmann-Institut, Münster
Einleitung
Lipase-katalysierte Umesterung und Veresterung von Fetten und anderen Lipiden werden in industriellen Verfahren zur Herstellung von strukturierten Triglyceriden (z. B. Kakaobutterersatzstoffe und Humanmilchfettsubstitute) und „Bioestern" (z. B. Isopropylester von Fettsäuren für Kosmetika) kommerziell genutzt. Die zur Herstellung derartiger Produkte verwendeten Triacylglycerin-Lipasen stammen zum Teil aus pathogenen und transgenen Mikroorganismen. Ihre Akzeptanz als Biokatalysatoren ist nicht immer gegeben.
Lipasen aus Pflanzen - im Gegensatz zu denen aus pathogenen oder transgenen Mikroorganismen - bieten als alternative Biokatalysatoren interessante Möglichkeiten zur Biokonversion von Fetten aus nachwach-senden Rohstoffen. ·
Die vorliegenden Untersuchungen befassen sich mit der Substratselektivität von Raps-Lipase [l, 2] und Papaya-Lipase [3] als Biokatalysatoren bei der Veresterung von Fettsäuren gewöhnlicher und ungewöhnlicher Struktur mit n-Butanol und Oleylalkohol.
Raps-Lipase wurde aus keimenden Rapssamen nach Extraktion mit Aceton als Extraktionsrückstand (Aceton-Pulver) gewonnen.
Papaya-Lipase kommt neben dem proteolytischen Enzym Papain im Latex aus Stamm und unreifen Früchten von Papaya (Carica papaya) vor.
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Biokatalysatoren und Verfahrenstechniken
Das preiswerte papainhaltige Enzympräparat wird seit langem bei der Herstellung von Lebensmitteln verwendet.
2 Methoden
Fünf Tage alte Keimlinge von Raps (Brassica napus, Sorte „Ceres") wurden homogenisiert und wiederholt 'mit kaltem Aceton extrahiert. Der Extraktionsrückstari.d („Acetonpulver") wurde nach Entfernung des Lösungsmittels als Biokatalysator verwendet.
Der gereinigte Extrakt aus C. papaya-Latex (Fa. Sigma) wurde auf Partikelgröße < 0,8 mm zerkleinert und ohne weitere Behandlung als Biokatalysator verwendet.
In Kontrollversuchen wurden Myristinsäure (50 mM) und n-Butanol (100 mM) in 250 µl Hexan mit 20 mg Raps-Acetonpulver bzw. 5 mg C. papaya-Latex bei 30 °C für unterschiedliche Zeiten gerührt.
Zur Bestimmung der Substratselektivität wurde die zu untersuchende Fettsäure (25 mM) zusammen mit Myristinsäure (25 mM) als Referenzsubstrat und n-Butanol (100 mM) in 250 µl Hexan mit 20 mg Raps-Acetonpulver bzw. 5 mg C. papaya-Latex wie oben angegeben für unterschiedliche Zeiten gerührt.
Reaktionsprodukte, bestehend aus Butylestern und nicht umgesetzten Fettsäuren, wurden vom Biokatalysator abgetrennt und nach Eindampfen des Lösungsmittels mit einer Lösung von Diazomethan in Diethylether behandelt. Das resultierende Gemisch von Methylestern und Butylestern wurde gaschromatogaphisch analysiert. Aus den Konzentrationen der beiden Fettsäuresubstrate zu Beginn der Reaktion (AclXO und Ac2XO) und nach einer bestimmten Reaktionszeit (AclX und Ac2X) wurde nach Rangheard et al. [4] der kompetitive Faktor (a) errechnet als
a =log (AclXO/ Ac1X)/log(Ac2XO/ Ac2X).
Die Spezifitätskonstante einer Fettsäure wurde angegeben als 1 / a, bezogen auf die Spezifitätskonstante der Ölsäure bzw. Myristinsäure = 1,00.
Bei der Raps-Lipase wurde zusätzlich die Veresterung der Ölsäure mit Oleylalkohol unter den oben angegebenen Bedingungen sowie die Hydrolyse des Rapsöles und Umesterung des Methyloleats mit n-Butanol untersucht.
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Lipasen aus Pflanzen als Katalysatoren für die Biokonversion von Fetten
3 Ergebnisse
Tabelle 1 gibt einen Überblick über die unter Verwendung der Raps-Lipase durchführbaren Hydrolyse-, Veresterungs- und Umesterungsreaktionen. So konnte mit Hilfe der Raps-Lipase nach einer Reaktionszeit von 48 Std. Ölsäure mit n-Butanol oder Oleylalkohol bis zu einem Umsatz von über 90 % verestert werden [1] .
Tabelle 1:
Reaktion
Hydrolyse
Veresterung
Veresterung
Umeresterung
Beispiele der durch Raps-Lipase katalysierten Hydrolyse-, Veresterungs- und Umesterungsreaktionen
Reaktions- Hauptprodukt dauer (Std) (Umsatz %)
Rapsöl Wasser 48 Fettsäuren (ca. 60)
Ölsäure n-Butanol 48 Butyloleat (> 90)
Ölsäure Oleylalkohol 48 Oleyloleat (> 90)
Methyloleat n-Butanol 24 Butyloleat (ca. 40)
Unter den angewandten Bedingungen katalysiert Papaya-Lipase die Veresterung der Öl- bzw. Myristinsäure mit n-Butanol sehr viel schneller als Raps-Lipase. So wurde mit Hilfe der Papaya-Lipase bereits nach einer f<.eaktionszeit von 1 Std. über 70 % der Myristinsäure in Butylester überführt [3] .
Die Substratselektivität der Raps-Lipase und Papaya-Lipase als Biokatalysatoren wurde bei der Veresterung von Fettsäuren gewöhnlicher und ungewöhnlicher Struktur mit n-Butanol untersucht. Das bei Verwendung von beiden Lipasen beobachtete auffallend geringe Ausmaß der Veresterung von Fettsäuren mit einer cis-4-Doppelbindung (Docosahexaensäure), cis-6-Doppelbindung (Petroselin-, y-Linolen- und Stearidonsäure) oder cis-8-Doppelbindung (Dihomo-y-Linolensäure) (Abb. 1 und 2) wurde bereits bei gereinigten Lipasepräparaten aus Raps [5] Mikroorganismen [4, 6] und Tieren [4, 6] gefunden. Abb. 2 zeigt, daß beispielsweise a-Linolensäure mit einer endständigen cis-9-Doppelbindung genauso schnell mit n-Butanol verestert wird wie Myristinsäure, während y-Linolensäure mit einer endständigen cis-6-Doppelbindung sehr viel langsamer verestert wird.
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Myristin-
cis-9, 10-fpoxystearin-
trans-9, 10-fpoxystearin
12-Hydroxystearin-
Ricinol-
Chaulmoogra-
Hydnocarpus-
Oocosahexaen- ~ Eicosapentaen-
Dihom ogam m a-Linolen- ... Stearidon- ~
gamma-Linolen- ~ alpha-Linolen-
Petroselin- ~ Öl-
0
Biokatalysatoren und Verfahrenstechniken
1
1
1
2
Spezifitätskonstante
1
3
Abbildung 1: Substratselektivität (Spezifitätskonstante) einzelner Fettsäuren bei der Veresterung mit n-Butanol unter Verwendung von Raps-Lipase D und Papaya-Lipase • als Biokatalysator (SpeziJitätskonstante der Referenzsubstrate Ölsäure bzw. Myristinsäure=l,00) [2, 3]
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70
60
:.!! 50 . 1:11
40 c 2
* 30 I!! ~ 20
10
0
60
50 '#. 1:11 40 c :::1 „
30 !! UI
I!! 20 ~
10
0
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0
0
-o- Myristinsäure
--- alpha·Linolensä ure
10 20 30 zeit (min)
-o- Myristinsäure
---gamma-Linolensäure
10 20 30 zeit (min)
40 50 60
40 50 60
Abbildung 2: Zeitlicher Verlauf der Veresterung von Myristinsäure (Referenzsubstrat) im Vergleich zu a-Linolensäure (oben) und y-Linolensäure (unten) mit n-Butanol unter Verwendung von Carica papaya-Latex als Biokatalysator [3]
Sowohl Raps-Lipase als auch Papaya-Lipase zeigten als Biokatalysatoren bei der Veresterung mit n-Butanol hohe Präferenz für Fettsäuren mit ungewöhnlicher Struktur, wie z. B. Cyclopentenylfettsäuren (Hydnocarpussäure), Hydroxyfettsäuren (Ricinol- und 12-Hydroxystearinsäure) und Epoxyfettsäuren (cis- und trans-9,10-Epoxystearinsäure) (Abb. 1). Berner-
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Biokatalysatoren und Verfahrenstechniken
kenswert ist, daß Gorlisäure - eine Cyclopentenylfettsäure mit einer cis-6-Doppelbindung in der Alkylkette - ebenfalls sehr viel langsamer mit n-Butanol verestert wird als Cyclopentenylfettsäuren mit einer gesättigten Alkylkette, z. B. Hydnocarpussäure und Chaulmoograsäure [l, 2].
Korianderöl
Fettsäuren
n-Butylester
(ca. 80% cis-6-18:1)
JJ. chemische oder enzymatische Hydrolyse
+ n-Butanol + Lipase (Brassica napus)
JJ. Veresterung
+ unveresterte Fettsäuren (angereichert mit cis-6-18:1)
[+ Natriumcarbonat + Lösungsmittel (Cyclohexan)] JJ.
organische Phase: (n-Butylester)
+ wäßrige Phase: (Na-Salz der cis-6-18:1)
J.l.Ansäuern
Petroselinsäure-Konzentrat (> 95 %)
· Schema 1: Anreicherung der Petroselinsäure (cis-6-18:1) aus Korianderöl-Fettsäuren durch Lipase-katalysierte selektive Veresterung mit n-Butanol [1]
4 Ausblick
Aufgrund der beobachteten Substratselektivität können Raps-Lipase sowie Papaya-Lipase - ein in Lebensmitteln gebräuchliches und preiswertes Enzympräparat - statt Lipasen aus transgenen Mikroorganismen möglicherweise zur Herstellung wertvoller Produkte aus natürlichen Fetten und anderen Lipiden eingesetzt werden. Beispielsweise ist die Herstellung angereicherter Fettsäuren wie z. B. y-Linolensäure und Docosahexaensäure aus Nachtkerzen- und Borretschöl bzw. Algen- und
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Lipasen aus Pflanzen als Katalysatoren far die Biokonversion von Fetten
Fischölen möglich. Solche Konzentrate könnten in diätetischen, pharmazeutischen und kosmetischen Produkten Anwendung finden. Außerdem können mit Hilfe der Raps-Lipase und Papaya-Lipase durch selektive Hydrolyse oder Veresterung Petroselinsäure aus Korianderöl (Schema 1) oder Ricinolsäure aus Rizinusöl gewonnen werden.
Literatur
/1/ Jachmanian, 1., Mukherjee. K. D.: Esterification and interesterification reactions catalyzed by acetone powder from germinating rapeseed. J. Am. Oll Chem. Soc. 73, 1527-1532 (1996)
/2/ Jachmanian, 1., Schulte, E., Mukherjee, K. D.: Substrate selectivity in esterification of less common fatty acids catalysed by lipases from different sources. Appl. Microbiol. Biotechnol. 44, 563-567 (1996)
/3/ Mukherjee, K. D., Kiewitt, 1.: Specificity of Carica papaya latex as biocatalyst in the esterification of fatty acids with 1-butanol. J. Agric. Food Chem. 44, 1948-1952 (1996)
/ 4/ Rangheard, M.-S., Langrand, G., Triantaphylides, C., Baratti, J.: Multicompetitive enzymatic reactions in organic media: a simple test for the determination of lipase fatty acid specificity. Biochim. Biophys. Acta 1004, 20-28 (1989)
/5/ Hills, M. J., Kiewitt, 1., Mukherjee, K. D.: Lipase from Brassica napus L. discriminates against cis-4 and cis-6 unsaturated fatty acids and secondary and tertiary alcohols. Biochim. Biophys. Acta 1042, 237-240 (1990)
/6/ Mukherjee K. D., Kiewitt, 1., Hills, M. J.: Substrate specificity of lipases in view of kinetic resolution of unsaturated fatty acids. Appl. Microbiol. Biotechnol. 40, 489--493 (1993)
Anschrift des Autors
Dr. K. D. Mukherjee Bundesanstalt für Getreide-, Kartoffel- und Fettforschung Institut für Biochemie und Technologie der Fette, H. P. Kaufmann-Institut Piusallee 68, 48147 Münster
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