LABORATORY LABORATORY

DIAGNOSTIC HIV AND DIAGNOSTIC HIV AND

AIDS AIDS

Prof. DR. Dr. Prof. DR. Dr. RatnaRatna AkbariAkbari GanieGanie, ,

SpPKSpPK, FISH, FISH

CLINICAL PATHOLOGY DEPARTMENT MEDICAL FACULTY USU / RSUP H.ADAM MALIK

MEDAN

Tujuan pemeriksaanTujuan pemeriksaan

MenegakkanMenegakkan diagnosisdiagnosis

MenentukanMenentukan angkaangka kesakitankesakitan, , infeksiinfeksi HIV HIV AIDS (surveillance)AIDS (surveillance)

MengamankanMengamankan darahdarah transfusitransfusiMengamankanMengamankan darahdarah transfusitransfusi

TransplantasiTransplantasi jaringanjaringan

WHO WHO menentukanmenentukan diagnosis HIV diagnosis HIV dandanAIDS AIDS berdasarkanberdasarkan gejalagejala klinisklinis dandan jenisjenistestes pemeriksaanpemeriksaan

GejalaGejala klinisklinis HIV HIV dandan AIDS AIDS menurutmenuruttahapantahapan daridari WHO WHO dimulaidimulai padapada tahuntahuntahapantahapan daridari WHO WHO dimulaidimulai padapada tahuntahun1990 1990 kemudiankemudian diperbaharuidiperbaharui bulanbulanSeptember 2005September 2005

KondisiKondisi iniini eraterat kaitannyakaitannya dengandengan infeksiinfeksioportunistikoportunistik..

Perkembangan HIV menurut WHO, Perkembangan HIV menurut WHO,

dibagi dalam 4 stadium:dibagi dalam 4 stadium:

Stadium IStadium IInfeksiInfeksi HIV HIV asimtomatikasimtomatik dandan tidaktidakdikategorikandikategorikan sebagaisebagai AIDS, AIDS, padapada tahaptahapiniini pengidappengidap HIV HIV tidaktidak menyadarimenyadari bahwabahwamerekamereka telahtelah terinfeksiterinfeksi ((serokonversiserokonversi))iniini pengidappengidap HIV HIV tidaktidak menyadarimenyadari bahwabahwamerekamereka telahtelah terinfeksiterinfeksi ((serokonversiserokonversi))

Stadium IIStadium IITermasukTermasuk manifestasimanifestasi membranmembran mukosamukosakecilkecil dandan radangradang saluransaluran pernafasanpernafasan atasatasyang yang berulangberulang, , padapada fasefase iniini belumbelumnampaknampak gejalagejala tetapitetapi virus virus tetaptetap aktifaktif

Stadium IIIStadium III

FaseFase simptomatiksimptomatik, , termasuktermasuk diarediare kronikkronikyang yang tidaktidak dapatdapat dijelaskandijelaskan selamaselama lebihlebihdaridari sebulansebulan, , infeksiinfeksi bakteribakteri parahparah, , dandantuberkulosistuberkulosis

Stadium IVStadium IVStadium IVStadium IV

AIDS, yang AIDS, yang berartiberarti kumpulankumpulan penyakitpenyakityang yang disebabkandisebabkan oleholeh virus HIV, virus HIV, adalahadalahfasefase akhirakhir dandan biasanyabiasanya bercirikanbercirikan suatusuatujumlahjumlah CD4 CD4 kurangkurang 200200

StrukturStruktur HIVHIV

Fig 19.28, buku medical microbiology hal 243Fig 19.28, buku medical microbiology hal 243Fig 19.28, buku medical microbiology hal 243Fig 19.28, buku medical microbiology hal 243

HIV replication cycleHIV replication cycle

Patogenesis Patogenesis

HIV/AIDSHIV/AIDS

Fig 19.33, hal 245, Fig 19.33, hal 245,

medical microbiologymedical microbiology

Clinical features and Clinical features and

progression of HIV progression of HIV

infectioninfection

Beberapa tes HIVBeberapa tes HIV

PemeriksaanPemeriksaan dasardasar::

–– FBC (full blood count)FBC (full blood count)

–– PemPem. . fungsifungsi hatihati

–– PemPem. . fungsifungsi ginjalginjal: : ureumureum dandan kreatininkreatinin–– PemPem. . fungsifungsi ginjalginjal: : ureumureum dandan kreatininkreatinin

–– AnalisaAnalisa urinurin

–– PemPem. . fesesfeses lengkaplengkap

PemeriksaanPemeriksaan penunjangpenunjang

–– TesTes antibodiantibodi terhadapterhadap HIVHIV

–– Viral loadViral load

–– CD4/CD8CD4/CD8–– CD4/CD8CD4/CD8

FULL BLOOD COUNT (FBC)FULL BLOOD COUNT (FBC)HbHb

EritrositEritrosit

HematokritHematokrit

LeukositLeukosit

TrombositTrombosit

HitungHitung jenisjenisHitungHitung jenisjenis

–– NeutrofilNeutrofil

–– LimfositLimfosit

–– MonositMonosit

–– EosinofilEosinofil

–– BasofilBasofil

LEDLED

IniIni sangatsangat tergantungtergantung padapada

stadium HIV stadium HIV dandan AIDS,AIDS,

sehinggasehingga diperlukandiperlukan

pemeriksaanpemeriksaan yang lainyang lain

sebagaisebagai pemeriksaanpemeriksaan dasardasar

Tes antibodi terhadap HIVTes antibodi terhadap HIV

TesTes menggunakanmenggunakan bahanbahan whole bloodwhole blood

AntibodiAntibodi dihasilkandihasilkan setelahsetelah seorangseorangterinfeksiterinfeksi HIV HIV lebihlebih kurangkurang 33--8 8 mingguminggu

Window periodWindow period ((tahaptahap jendelajendela), ), dimanadimanaWindow periodWindow period ((tahaptahap jendelajendela), ), dimanadimanapadapada saatsaat iniini antibodiantibodi belumbelum terdeteksiterdeteksi

PadaPada tahaptahap window periodwindow period kemungkinankemungkinanbisabisa dilakukandilakukan pemeriksaanpemeriksaan antigen antigen ataupunataupun pemeriksaanpemeriksaan viral loadviral load

Beberapa jenis tes antibodi HIVBeberapa jenis tes antibodi HIV

Rapid testRapid test

ELISA ELISA

Western Blotting Western Blotting

Rapid testRapid test

Material provided:Material provided:

–– SD BIOLINE HIVSD BIOLINE HIV--1/2 test device/ Multi1/2 test device/ Multi--

device/strip/POCTdevice/strip/POCT

–– Optional: Lancet, alcohol swab and capillaru Optional: Lancet, alcohol swab and capillaru –– Optional: Lancet, alcohol swab and capillaru Optional: Lancet, alcohol swab and capillaru

pipette (20 pipette (20 µµl/drop)l/drop)

–– Assay diluentAssay diluent

Test procedureTest procedure

I. Blood specimen (with a lancet):I. Blood specimen (with a lancet):

1.1. Pierce with sterile lancet providedPierce with sterile lancet provided

2.2. Take a 20 Take a 20 µµl capillary pipette provided, draw l capillary pipette provided, draw

blood into the capillary pipette to black lineblood into the capillary pipette to black line

3.3. Add Add 20 20 µµl of drawn blood into the sample l of drawn blood into the sample 3.3. Add Add 20 20 µµl of drawn blood into the sample l of drawn blood into the sample

well (s)well (s)

4.4. Add 4 drops of assay diluent into the sample Add 4 drops of assay diluent into the sample

well (s)well (s)

II. Blood (by venipucture), plasma or serum II. Blood (by venipucture), plasma or serum specimenspecimen

1.1. Add 10 Add 10 µµl of plasma or serum (l of plasma or serum (20 20 µµl of l of blood) into the sample well (s)blood) into the sample well (s)blood) into the sample well (s)blood) into the sample well (s)

2.2. Add 4 drops of assay diluent into the Add 4 drops of assay diluent into the sample well (s)sample well (s)

ELISA ELISA

PEMERIKSAAN ELISAPEMERIKSAAN ELISAPEMERIKSAAN ELISAPEMERIKSAAN ELISA

HumoralHumoral componentcomponent : :

PenderitaPenderita HIV ( + ) HIV ( + ) membentukmembentuk antibodiantibodi antianti--envelope envelope antibodiantibodi gp120, antigp120, anti--p24 p24 antibodiantibodi

MetodeMetode pemeriksaanpemeriksaan ::-- ELISA (KUANTITASI)ELISA (KUANTITASI)

-- Rapid test (KUALITASI)Rapid test (KUALITASI)

HIV Antigen ELISA HIV Antigen ELISA mendeteksimendeteksi HIV core Antigen HIV core Antigen (p24) (p24) merupakanmerupakan mayor antigen . mayor antigen .

HIV HIV antibodiantibodi terhadapterhadap protein gp120 protein gp120 dandan p24p24

Pemeriksaan antibodi → Induplo ( cek Pemeriksaan antibodi → Induplo ( cek

ulang dengan ulang dengan duplikasi ) duplikasi ) duplikasi ) duplikasi ) duplikasi ) duplikasi ) duplikasi ) duplikasi ) untuk untuk

menghindari teknikal error dan false menghindari teknikal error dan false

positif.positif.

Hasil : Reaktif → pemeriksaan Hasil : Reaktif → pemeriksaan

konfirmasi menggunakan metode konfirmasi menggunakan metode

Western Blotting Western Blotting Western Blotting Western Blotting Western Blotting Western Blotting Western Blotting Western Blotting (Immunoblotting) (Immunoblotting) . . . . . . . .

False positif jarang terjadi.False positif jarang terjadi.False positif jarang terjadi.False positif jarang terjadi.

Kekurangan : Kekurangan : Kekurangan : Kekurangan : Kekurangan : Kekurangan : Kekurangan : Kekurangan :

-- Memerlukan waktu yang lamaMemerlukan waktu yang lama

-- Membutuhkan Staff yang terlatihMembutuhkan Staff yang terlatih

-- Memerlukan biaya yang relatif mahalMemerlukan biaya yang relatif mahal

Western Blotting Western Blotting

(Confirmation Test)(Confirmation Test)

••UntukUntuk tujuantujuan surveilanssurveilans, , reagenreagen yang yang dipilihdipilih harusharus memilikimemiliki sensitivitassensitivitas >>99%, 99%, dandanspesifisitasspesifisitas reagenreagen berikutnyaberikutnya >98%, >98%, dandanuntukuntuk reagenreagen ketigaketiga spesifisitasspesifisitas >95%>95%StrategiStrategi III (Rapid Test) III (Rapid Test) untukuntuk pasienpasienStrategiStrategi III (Rapid Test) III (Rapid Test) untukuntuk pasienpasienasymptomaticasymptomatic

••SemuaSemua regensiaregensia yang yang dipakaidipakai harusharusterdaftarterdaftar didi DepKesDepKes RI.RI.

Tes HIV Viral Load PCRTes HIV Viral Load PCR

Metode PCR menyediakan suatu Metode PCR menyediakan suatu mekanisme untuk mendeteksi target mekanisme untuk mendeteksi target organisme dengan konsentrasi yang organisme dengan konsentrasi yang sangat kecil dengan spesifisitas yang sangat kecil dengan spesifisitas yang sangat kecil dengan spesifisitas yang sangat kecil dengan spesifisitas yang tinggi dan dibuat tiruannya berlipat ganda tinggi dan dibuat tiruannya berlipat ganda sehingga ada tidaknya virus dan bakteri sehingga ada tidaknya virus dan bakteri spesifik serta mutasi materi genetik dapat spesifik serta mutasi materi genetik dapat dideteksidideteksi

TahapanTahapan ProsesProses PCRPCR

Pre Pre –– PCR : PCR :

PreparasiPreparasi reagensiareagensia

PreparasiPreparasi spesimenspesimen : : isolasiisolasi/ / purifikasipurifikasi DNA/ DNA/

RNARNA

PCR : PCR : prosesproses amplifikasiamplifikasiPCR : PCR : prosesproses amplifikasiamplifikasi

DenaturasiDenaturasi ((pemisahanpemisahan rantairantai DNA)DNA)

Annealing (Annealing (penempelanpenempelan primer)primer)

Extension (Extension (pemanjanganpemanjangan oleholeh enzimenzim))

Post Post –– PCR :PCR :

DeteksiDeteksi/ / AnalisaAnalisa HasilHasil PCRPCR

Viral load HIV adalah jumlah partikel virus Viral load HIV adalah jumlah partikel virus HIV yang ditemukan dalam setiap mililiter HIV yang ditemukan dalam setiap mililiter darahdarah

Semakin banyak jumlah partikel virus HIV Semakin banyak jumlah partikel virus HIV Semakin banyak jumlah partikel virus HIV Semakin banyak jumlah partikel virus HIV di dalam darah, semakin cepat seldi dalam darah, semakin cepat sel--sel sel CD4 dihancurkan dan semakin cepat CD4 dihancurkan dan semakin cepat pasien menuju ke arah AIDSpasien menuju ke arah AIDS

Viral load HIV dapat diukur dengan PCR, Viral load HIV dapat diukur dengan PCR, salah satu metode PCR yang digunakan salah satu metode PCR yang digunakan saat ini adalah dengan COBAS saat ini adalah dengan COBAS AMPLICORTM AMPLICORTM Analyzer Process StepsAnalyzer Process Steps

Dalam proses amplifikasi target sekuen Dalam proses amplifikasi target sekuen digandakan berulangdigandakan berulang--ulang sehingga ulang sehingga digandakan berulangdigandakan berulang--ulang sehingga ulang sehingga didapat jutaan kopi yang dinamakan didapat jutaan kopi yang dinamakan amplikon. Hasil pemeriksaan dilaporkan amplikon. Hasil pemeriksaan dilaporkan sebagai copies/mL atau dalam sebagai copies/mL atau dalam perhitungan matematik logaritma atau ‘log’perhitungan matematik logaritma atau ‘log’

Misalnya hasil pasien X adalah 173.000 Misalnya hasil pasien X adalah 173.000 copies/mL=log 5,24 atau pelaporan dalam copies/mL=log 5,24 atau pelaporan dalam satuan International Unit= 88.230 satuan International Unit= 88.230 IU/mL=log 4,946IU/mL=log 4,946

Viral load Viral load (VL) menunjukkan tingginya (VL) menunjukkan tingginya Viral load Viral load (VL) menunjukkan tingginya (VL) menunjukkan tingginya replikasi HIV dan kecepatan replikasi HIV dan kecepatan penghancuran CD4 dan tinggi rendahnya penghancuran CD4 dan tinggi rendahnya VL menunjukkan cepatVL menunjukkan cepat--lambatnya lambatnya perjalanan penyakit dan kematianperjalanan penyakit dan kematian

PengukuranPengukuran CD4CD4++

PengukuranPengukuran cellular componentcellular component : :

Target cell Target cell adalahadalah T.helperT.helper (CD4+)(CD4+)

Normal :CD4+ :65 % Normal :CD4+ :65 % dandan CD8+ : 35% CD8+ : 35% daridari

total Ttotal T--cell cell

PadaPada penderitapenderita AIDS AIDS konsentrasikonsentrasi CD4+ CD4+ PadaPada penderitapenderita AIDS AIDS konsentrasikonsentrasi CD4+ CD4+

menurunmenurun secarasecara drastisdrastis. .

KonsentrasiKonsentrasi CD4+ CD4+ dihubungkandihubungkan dengandengan

konsentrasikonsentrasi CD8CD8

MenyebabkanMenyebabkan rasiorasio CD4+ / CD8 CD4+ / CD8 terbalikterbalik padapada

HIV / AIDSHIV / AIDS

TEKNIK PEMERIKSAAN TEKNIK PEMERIKSAAN CD4+ CD4+

Cara Cara ImmunophenotypingImmunophenotyping menggunakanmenggunakanFlow Flow CytometriCytometri dandan Cell sorterCell sorter

PrinsipPrinsip : : MenggabungkanMenggabungkan kemampuankemampuan alatalatuntukuntuk mengindentifikasimengindentifikasi karakteristikkarakteristik masingmasing--untukuntuk mengindentifikasimengindentifikasi karakteristikkarakteristik masingmasing--masingmasing permukaanpermukaan cell cell dengandengan kemampuankemampuanmemisahkanmemisahkan cell yang cell yang beradaberada dalamdalam suatusuatususpensisuspensi menurutmenurut karakteristikkarakteristik masingmasing--masingmasing dengandengan menggunakanmenggunakan satusatu atauatau lebihlebihProbe yang Probe yang sesuaisesuai secarasecara automatisautomatis melaluimelaluisuatusuatu celahcelah yang yang diteruskanditeruskan oleholeh seberkasseberkassinarsinar laser.laser.

CellCell SinyalSinyal elektronikelektronikdetectordetector

→→

Sinar laser

cell

DetectorDetector →→ dicatatdicatat sebagaisebagai karakteristikkarakteristikcell cell yang yang bersangkutanbersangkutan

→→ IdentifikasiIdentifikasi jenisjenis cellcell

→→ aktivitasaktivitas cellcell

→→ JumlahJumlah cell cell dalamdalam populasipopulasicampurancampuran

Diagnosis HIV pada bayiDiagnosis HIV pada bayi

InfeksiInfeksi HIV HIV dapatdapat terjaditerjadi padapada bayibayi selamaselamakehamilankehamilan, , saatsaat melahirkanmelahirkan, , dandan waktuwaktumenyusuimenyusui

HasilHasil testes HIV HIV positifpositif padapada seorangseorang anakanakHasilHasil testes HIV HIV positifpositif padapada seorangseorang anakanakberusiaberusia 18 18 bulanbulan keke atasatas berartiberarti anakanaktersebuttersebut terinfeksiterinfeksi HIVHIV

TesTes virus HIV (RNA virus) virus HIV (RNA virus) dengandengan alatalatPCR PCR dapatdapat dipakaidipakai untukuntuk diagnosadiagnosa HIV HIV padapada bayibayi

WHO mengusulkan Tes Viral Load untuk WHO mengusulkan Tes Viral Load untuk diagnosa infeksi HIV pada bayi sebaiknya diagnosa infeksi HIV pada bayi sebaiknya dilakukan pada usia 6 minggu ke atasdilakukan pada usia 6 minggu ke atas

Untuk menghindari negatif palsu Untuk menghindari negatif palsu sebaiknya dilakukan dua tes virus untuk sebaiknya dilakukan dua tes virus untuk konfirmasi bahwa anak tidak terinfeksikonfirmasi bahwa anak tidak terinfeksikonfirmasi bahwa anak tidak terinfeksikonfirmasi bahwa anak tidak terinfeksi

Sebaiknya tes antibodi juga harus Sebaiknya tes antibodi juga harus dilakukan setelah anak berusia 18 bulan dilakukan setelah anak berusia 18 bulan sebagai konfirmasi ulangsebagai konfirmasi ulang

TesTes antibodiantibodi HIV yang HIV yang positifpositif padapada anakanak berusiaberusia18 18 bulanbulan keke atasatas berartiberarti anakanak terinfeksiterinfeksi HIVHIV

TesTes PCR HIV yang PCR HIV yang negatifnegatif padapada anakanak belumbelumberusiaberusia enamenam mingguminggu tidaktidak meyakinkanmeyakinkan bahwabahwaanakanak tidaktidak terinfeksiterinfeksi HIVHIV

AnakAnak dengandengan testes PCR HIV PCR HIV negatifnegatif yang yang mengembangkanmengembangkan gejalagejala penyakitpenyakit terkaitterkait HIV HIV mengembangkanmengembangkan gejalagejala penyakitpenyakit terkaitterkait HIV HIV sebaiknyasebaiknya ditesdites PCR HIV PCR HIV ulangulang

((Antiretroviral therapy of HIV infection in infants Antiretroviral therapy of HIV infection in infants and children in resourceand children in resource--limited settinglimited setting, WHO , WHO 2006 )2006 )

UntukUntuk parapara klinisiklinisi dalamdalam memantaumemantauprogresivitasprogresivitas penyakit,penyakit, diperlukandiperlukanpemeriksaanpemeriksaan ::

CDCD44++ (immunophenotyping)(immunophenotyping)CDCD44++ (immunophenotyping)(immunophenotyping)

ViralViral LoadLoad (PCR)(PCR)