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The antidiuretic neurohormone RhoprCAPA-2 downregulatesfluid transport across the anterior midgut in the blood-
feeding insect Rhodnius prolixusJuan P. Ianowski, Jean-Paul Paluzzi, Victoria A. Te Brugge, and Ian Orchard
Department of Biology, University of Toronto Mississauga, Mississauga, Ontario, CanadaSubmitted 13 April 2009; accepted in final form 2 December 2009
La neurohormona antidiurética RhoprCAPA-2 regula negativamente el transporte de fluidos a través del intestino medio anterior en el insecto hematófago
Rhodnius prolixusAylen Odetto, Cintia Contreras, Ramón Linares y Stella M. Alvarez
IntroducciónLA MAYORÍA DE LOS INSECTOS…
Regulan la composición de la hemolinfa por medio del sistema excretor.
La hemolinfa es un fluido interno de los invertebrados que contiene sustancias nutritivas.
Sistema excretor consiste en
Túbulos de Malpighi Intestino
El transporte iónico y de fluidos por parte de los órganos
excretores es controlado por factores diuréticos y antidiuréticos
que actúan sobre lostúbulos de Malpighi y el epitelio
intestinal
La mayoría de los factores diuréticos aumentan el volumen producido de orina estimulando los túbulos de Malpighi
Factores diuréticos:● Aminas biogénicas: Serotonina y Tiramina● Peptidos: Factor liberador de corticotropina (CRF), Kininas, Calcitoninas● Péptidos cardioaceleradores de la familia CAPA
En hematófagos, luego de la alimentación, los factores diuréticos estimulan la secreción de sales y agua en los túbulos de Malpighi, pero también la absorción de sales y agua hacia la hemolinfa en la zona anterior del intestino medio.
Introducción
Pero se sabe poco de antidiuresis…
Se han descrito dos estrategias antidiuréticas en distintos modelos:
Manduca sexta: Péptido cardioacelerador(ManseCAP2b) tiene efectos diuréticos
en dípteros.R. prolixus: inhibe la producción primaria de la
orina en túbulos de Malpighi
Schistocerca gregaria: Dos péptidos de transporte iónico y una hormona estimulante del transporte de Cl-,
elevan el AMPc en intestino posterior, y estimulan la reabsorción de fluidos desde la orina primaria producida por túbulos de Malpighi. Tambiénse propone el rol de neurohormonas como
estimulantes de la reabsorción defluidos en el recto por vía dependiente del Ca2+.
Introducción
Propuesta del trabajo
Un tercer mecanismo para la estrategia antidiurética:
La neurohormona antidiurética RhoprCAPA-2 inhibe el transporte de iones y fluidos a través del intestino medio anterior en Rhodnius
prolixus
Introducción
Se trabajará con Adultos y ninfas de 5º estadio, ambos sexos, para comenzar
analizando siexiste una variación entre los mismos.
Materiales y Métodos
Criados en cámara, humedad 60%, 25°C y
alimentados con sangre de conejo.
Materiales y Métodos
Ensayos de absorción
Se aisló el intestino medio anterior y se ligaron los extremos posterior y anterior
formando un saco cerrado.
El saco se introdujo en solución salina, y se midió su masa antes y después del
experimento para conocer el volumen de agua que atraviesa el epitelio del intestino
medio anterior.
La diferencia en peso indica el transporte
salino
Se utilizaron distintas soluciones salinas.
Radioinmunoanálisis de AMPc y GMPc en el intestino anterior medio
•Se diseccionó el intestino medio anterior de adultos de ambos sexos.•Resto de sangre de la comida se enjuagó con solución salina.•Se prepararon tubos que contenían el preparado con 50 nmol/l de serotonina o 50nmol/l serotonina combinada con 0.1 μmol/l RhoprCAPA-2 y se incubaron.•Para preparar las muestras para el ensayo se descongelaron los tubos, se sonico lamuestra y se centrifugó.•Se recolectó el sobrenadante y se realizó el ensayo usando un kit deradioinminoensayo de cGMP y cAMP.
Materiales y Métodos
Experimentos con Cámara de UssingEs un aparato para medir las propiedades de transporte de iones de un tejido.
Puede ser operada por:• Circuito abierto• Current-clamp• Voltage-clamp
Los tejidos no pierden su polaridad. Se respeta el lado apical y el basolateral.
Consta de:• Dos cámaras separadas por
el tejido a estudiar.• Puentes y soluciones accesorias para mantener
la electroneutralidad.• Una fuente, un voltímetro y
un amperímetro.
Materiales y Métodos
Experimentos de cámara de Ussing
• El intestino medio anterior se cortó longitudinalmente y sesujetó entre un par de cámaras de Ussing .
• La cantidad de corriente para mantener el V se denominashort-current (Isc) y es un reflejo de la capacidad desecreción o absorción del tejido.
• Usualmente se clampea la membrana a 0 mV.• El experimento se realizó en condiciones de corriente
abierta (sin clampear a 0 mV) para no dañar los tejidos.
Se obtuvo un Isc equivalente (eIsc) a partir de la resistencia demembrana (R) y la diferencia de potencial (V), aplicando pulsosde corrientes cortos y midiendo el cambio en Vt
eIsc = Vt/Rt
Voltaje Transepitelial: VtShort-current equivalente: eIscResistencia Transepitelial: Rt
Materiales y Métodos
Resultados
Figura 1. Efecto de RhoprCAPA-2 sobre la velocidad de transporte de fluidos
Intestinos mediosanteriores
5º estadio ninfa
serotonina (5-HT, 0.1 μmol /l)
Respondieron a serotonina al aumentar la
velocidad de transporte de líquidos a 83 ± 11 ( n =
10) y 74 ± 7 nl / min ( n = 24)
El transporte de fluido estimulado por la
serotonina fue inhibido por RhoprCAPA-2 de una
manera dependiente de la dosis
Ensayos de absorción
Resultados
Figura 2. Efecto de RhoprCAPA-2 en el transporte de iones estimulado por 5-HT.
El tratamiento con serotonina aumentó e Isc y V t y redujo la resistencia del epitelio
La adición de RhoprCAPA-2 bloqueó los efectos de la serotonina.
RhoprCAPA-2 redujo tanto e Isc como Vt estimulados por serotonina, mientras que aumentaba la resistencia.
Estos resultados indican que la neurohormona
antidiurética RhoprCAPA-2 elimina el transporte de
fluido estimulado por serotonina por el intestino
medio anterior.resistencia
Voltaje transepitelial ( Vt )
corriente de cortocircuitoequivalente (e Isc )
Las deflexiones hacia arriba en Vt observadas en C son causadas por el paso de pulsos de 5 μA a través del epitelio. El tamaño de estas deflexiones es proporcional a la resistencia transepitelial y se usaron para calcular la resistencia y eIsc
Resultados
Figura 3. Papel de cAMP en el transporte de fluido del intestino medio anterior.
RhoprCAPA-2 (desencadena la antidiuresis a través de una vía del
segundo mensajero intracelular que puede implicar cGMP), aumenta el
cGMP en los túbulos de Malpighi estimulados por la serotonina.
Este incremento en cGMP se correlaciona con una reducción de los
niveles de cAMP intracelular
Resultados del radioinmunoanálisis
8-bromoadenosine 3 ', 5'-monofosfato cíclico (8-Br-cAMP; 1 mmol / l) análogo de cAMP
Estimulación con serotonina → aumenta el AMPc intracelular
RhoprCAPA-2 solo no tuvo efecto sobre los niveles de cAMPintracelular
8-Br-cAMP estimuló el transporte de fluido
El efecto de 8-Br-cAMP fue bloqueado por incubación con RhoprCAPA-2
Resultados
Figura 4. Efecto de RhoprCAPA-2 en el transporte estimulado por 8-Br-cAMP.
Experimentos de cámara de Ussing
El eIsc aumentó después de la adición de 8-Br-cAMP
La adición de RhoprCAPA-2 redujo eI sc
V t se redujo mediante la adición de RhoprCAPA-2
corriente de cortocircuito
equivalente (e Isc )
Voltaje transepitelial ( Vt )
La resistencia sufrió un pequeño aumento pero no se recuperó completamente después del tratamiento con RhoprCAPA-2
resistencia
Resultados
Figura 5. Papel de cGMP en intestinos medio anteriores tratados con RhoprCAPA-2.
Radioinmunoanálisis
El nivel de cGMP intracelular más bajo en los intestinos medio anteriores tratados con serotonina que en los tratados con serotonina más RhoprCAPA-2
Con RhoprCAPA-2 solo no da incremento en los niveles de cGMP intracelular
Con RhoprCAPA-2 en ausencia de serotonina produjo una disminución en e Isc
8-Br-cGMP análogo permeable a la membrana de cGMP
8-Br-cGMP aumentó la velocidad de secreción de fluido en preparación no estimulada y no bloqueó la secreción de fluido estimulada por serotonina
Resultados
Figura 6. Efecto de 8-Br-cGMP, RhoprCAPA-2 y 5-HT en eIsc
Con RhoprCAPA-2 redujo eIsc y Vt estimulados con serotonina y 8-Br-cGMP
Con 8-Br-cGMP a preparaciones estimuladas por serotonina no bloqueó el transporte de iones, sino que aumento de eIsc y Vt y la disminución de la resistencia
La adición de 8-Br-cGMP, en ausencia de serotonina, produjo un aumento en el transportetransepitelial
El efecto de 8-Br-cGMP se bloqueó mediante RhoprCAPA-2
eIsc como Vt aumentaron con 8-Br-cGMP
Una dosis más baja de 8-Br-cGMP aumentó el transporte transepitelial. Aumento eIsc y V y la reducción de la resistencia
Resultados
Figura 7. Efecto de la solución salina libre de Ca2 + , EGTA, BAPTA-AM, RhoprCAPA-2 y 5-HT en e Isc .
Probar si el Ca 2+ puede desempeñar un papel.
La estimulación con serotonina del transporte de iones no se vio afectada por la solución salina libre de Ca 2+
La adición de RhoprCAPA-2 redujo eIsc con estimulación de serotonina
Con EGTA y serotonina aumentó eI sc
Con RhoprCAPA-2 redujo la eIsc estimuladapor serotonina
El efecto RhoprCAPA-2 sobre el transporte de iones a través del intestino medio anterior es independiente del Ca 2+extracelular
La estimulación con serotonina aumentó eIsc
El tratamiento con RhoprCAPA-2 en presencia de BAPTA-AM redujo la e I sc estimulada por serotonina
Lo más importante, el tratamiento de la preparación con TMB-8-HCL no evitó el efecto de RhoprCAPA-2, lo que sugiere que el Ca2 + no tiene ningún papel en el efecto de RhoprCAPA-2
Discusión El estado antidiurético provocado por RhoprCAPA-2 es un proceso
complejo que involucra múltiples tejidos blanco.
Efecto de RhoprCAPA-2
En Drosophila melanogaster los péptidos relacionados con CAPA-2b se unen a un receptor acoplado a proteína G que estimulan el transporte de iones y la secreción de fluídos.
En R. prolixus los péptidos Rhopr-CAPA2 estimulan vías similares pero tienen un efecto opuesto (antidiurético).
DiscusiónDrosophila melanogaster
Discusión
Efecto de RhoprCAPA-2
Niveles de GMPc
Intestino medio anterior:
Serotonina + RhoprCAPA-2 > SerotoninaRhoprCAPA-2 ~ Serotonina
Túbulos de Malpighi:
Serotonina + RhoprCAPA-2 > Serotonina
Discusión
Efecto de RhoprCAPA-2
eIsc:
Intestino medio anterior:
RhoprCAPA-2 < Serotonina
RhoprCAPA-2 + Serotonina + 8-Br-GMPc < Serotonina + 8-Br-GMPc
=> El efecto de RhoprCAPA-2 es independiente de GMPc
Discusión Efecto de RhoprCAPA-2
•Bloquea el transporte de iones estimulado por serotonina en medio salino libre de Ca++.
•No se afecta la acción de RhoprCAPA-2 al usar un quelante de Ca++ extracelular (EGTA) o intracelular (BAPTA-AM, que atraviesa membranas)
•Tampoco se vio afectada la actividad de RhoprCAPA-2 usando un inhibidor del transporte intracelular de Ca++.
=> El Ca++ no es el segundo mensajero
Discusión
• RhoprCapa-2 se ha propuesto para bloquear el transporte de fluidos por los túbulos de Malpighi de R.prolixus al aumentar la actividad de fosfodiesterasas y reducción de niveles de AMPc, el segundo mensajero intracelular de la serotonina.
• Es probable que el efecto inhibitorio de RhoprCAPA-2 en el intestino medio anterior de R.prolixus sea el resultado de la hidrólisis de AMPC.
• RhoprCAPA-2 puede bloquear un sistema de transporte de iones involulcrado en el transporte transepiteliar a través del intestino medio anterior.
DiscusiónRelevancia fisiológica de RhoprCAPA-2
• Se concluye que en el intestino medio anterior de R. prolixus el efecto de los péptidos CAPA es in dependiente del calcio.
• La neurohormona antidiurética RhoprCAPA-2 que subregula la secreción de los túbulos de Malpighi, también inhibe el transporte de fluidos a través del intestino medio anterior de R. prolixus.
• Se hipotetiza que la función de RhoprCAPA-2 es hacer coincidir la actividad secretora de los tubos de Malpighi y la actividad absortiva de el intestino-medio anterior.
