LA INMUNIZACIÓN CON ADN:¿UNA NUEVA GENERACIÓN DE VACUNAS?

Orlando L Pardo

División Vacunas, CIGB, Apdo. 6162, c.P. 10600, Ciudad de la Habana, Cuba.

ABSTRACT '

In the last five years, it has been foun~ !hat ~irect nucleic acid transfer into living organisms is a feasible ap- .proach to obtain expression levels that although a-re still farfrom being of emy therapeutic value, are indeedenough to elicit in the host a significative immune response against the protein codified by the nucleic acid .as', .such. This methodology of immunization has many advantages over more conventional ones, namely: t.q!3.., :'need of purifying proteins is obviated, as the expression occurs in the host cells the appropriate protein p~oc}~",

essing and conformation are guaranteed, and most pros of live (e.g. elicitation of an efficient cellula,rp~~, .sponse) and subunit vaccines (e.g. high safety) are combined while most cons of both are avoided (e.g, eJ¡~i.-,tation of an immune response against the proteins of the specific live vector used). Therefore, although monyquestions on the topic still remain unanswered, the possibility of nucleic acid vaccines becoming a new ge~-

eration of human vaccines belongs now to the near future. .." ;:~..Key words: DNA immunization, DNA vaccines, gene-transfer, plasmid D~A. ':;:.

Blotecnologla Aplicada J996; 13:8 J-88(); .'1 ;.~ i." ~ .

y ;:RESUMEN

En los últimos cinco años se ha logrado demostrar que la transferencia directa de ácidos nucleic::o~:a'org'anis-mos vivos genera niveles de expresión que si bien son aún de escaso valor terapéutico,' son sufldehtesparadespertar en el hospedero una respuesta inmune significativa contra la proteína codificada poi el'a'Cido nu-cleico en cuestión. Esta metodología de inmI;Jnización posee múltiples ventajas sobre las ya convencionales:se obvia la necesidad de purificar proteínas, la expresión en las propias células.del hospedero garantiza unamaduración y conformación adecuadas para la proteína de interés, y se combinan muchos aspectos 'positivosde las vacunas vivas (p.e. obtención de respuesta celular eficiente) con los de las vacunas de subunidades(p.e. alta seguridad), evitándose además muchos de los aspectos negativos de ambas (p.e. desencadenamien-to de respuesta contra los antígenos propios del vector vivo empleado). Por consiguiente, y aunque'aún exis-ten muchas interrogantes abiertas al respecto, la posibilidad de que las vacunas de ácidos nucleicos se con-viertan en una nueva generación de vacunas humanas pertenece ahora a un futuro no muy lejano.

Palabras claves: ADN plasmídico, transferencia genética, vacunas de ADNIntroducciónEn enero de 1989, un grupo de científicos de la Uni-versidad de Wisconsin (EE.UU.) dirigido por JonWolfT,trabajaba en la verificación de una hipótesiselaborada pocos meses antes por el grupo de PhilipFelgner en la compañía biotecnológica Vical Inc.,de San Diego, Califomia. La idea. en resumen, con-sistía en emplear los complejos eIectrostáticos quesurgen entre el ADN y determinados lípidos ca-tiónicos, como vehículo para lograr una transfec-ción in vivo eficiente, que rindiera niveles de ex-presión de cierto valor terapéutico.

Para sorpresa de todos, en los animales usados'como controles negativos (en los que sólo se ad-ministró ADN plasmídico en solución acuosa) losniveles de expresión del transgén en el músculomunno eran significativos también. Una vez com-probada la reproducibilidad de semejante hallazgo,la llamada tecnología de "transferencia directa deADN desnudo" recién había nacido, lo cual des-pertó gran interés en toda la comunidad científicaintemacional.

Si bien era la primera vez que se demostraba ex-presión in vivo mediante la administración directade ADN "desnudo", existían varios precedentes de"transferencia genética directa" desde los añosochenta, cuando la inyección inlraperitoneal deADN plasmídico coprecipitado con fosfato cálcicogeneró expresión delectable en varios órganos mu-rinos (1). Poco antes, un intent.o similar habíasugerido que sólo las moléculas replicativas seríancapaces de persislir suficiente tiempo en el orga-nismo en cuestión (2), y de hecho, era conocido quela inyección del ADN genómico de ciertos virus sírendía tral1sfecciones exitosas in vivo.

Asimismo, no sólo los complejos ADN lípidos,sino también los de ADN proteínas (entre otrossistemas más o menos sofisticados), se venían estu-diando intensamente durante esos años con el ob-

jetivo común de desarrollar mi vehículo efectivopara la transfección del ADN i1/vivo. Pero es sólo

después.del inusitado descubrimiento dc los gruposde WolIT y Fclgner (3), que se presta suficiclIl<:

87

o Pardo Inmunización con ADN

atención a la posibilidad de lograr dicho objelivosin necesidad de apelar a fonnulaciones especiales.

La presente revisión se concentra básicamente enlos estudios desencadenados a raíz del mencionadodescubrimiento, y está enfocada, como lo indica sutítulo, hacia el campo de las vacunas, pero tambiénse abordan otras aplicaciones no menos importantesque van siendo ensayadas con esta novel tecnologíade "transferencia directa de ADN desnudo".

Estudios inicialesVarios estudios fueron iniciados a partir de 1990 paradilucidar los aspectos básicos de la "transferencia di-'recta de ADN desnudo", así como para establecer lascondiciones óptimas en las que ésta se verificaba (3-22, revisado en 23). Los resultados más relevantes deestos primeros estudios pueden resumirse de Ifsiguiente manera:

l. Mediante la inyección directa de ADN plas-mídico puro en animales se obtiene expresión impor-tante en el tejido muscular estriado (esquelético ycardiaco), pero apenas en otros órganos como son elcerebro, pulmón, estómago, bazo, útero y ru1ón(5).Esporádicamente se ha reportado expresión tambiénen el higado (24) y la gláJldula tiroides (25).

2. La solución a ulyectar requiere por lo general decierta fuerza iónica (16), por ejemplo: NaCI 0,9 %p:v,prefiriéndose un pH cercano a la neulrnlidad, si bien laimplantación quirúrgica de precipit.1dosetanólicos delplásmido puro también resulta efectiva (4).

3. El n!imero de fibras transfectadas, salvo en ca-sos particulares, resulta inferior al I % del total quecompone al músculo en cuestión, pero la expresiónes detectable durante más de un w10(15), especial-mente cuando se emplean promotores virales"promiscuos" como el inmediato-temprano del ci-tomegalovirus humano.

4. La presencia física del plásmido en el tejidomuscular, al igual que su expresión, es detectabledurwlte varios meses (15), a pesar de que la mayorparte tiende a ser degradado rápidamente, y de queno hay evidencias de su integración ni de su replica-ción en el wnbiente [posmitótico) de las libras mus-culares (15). La fonna superenrollada del plásmidoresulta 20-100 veces más eficiente que la lineal(15), lo cual pudiera estar relacionado con unamayor resistencia a la degradación o con e] meca-nismo, aÚndesconocido, de entrada a la célula.

5. En muy pocos casos la inyección del plásmidoprovoca infiltración de células mononucIeares a] te-j ido muscular (17), Ytambién es limitado el númerode fibras dañadas por esta técnica.

6. En el modelo murino, se considera que la dosis"saturwJte" de plásmido es inferior aSO Jlg (16), Ysi bien es recomendable inyectar durante las seo'manas de rápido crecimiento (12), se ha verificadoexpresión en casi todas las edades del animal. Entrelas especies donde inicialmente también se de-

mostró expresión mediante la inyección de ADNplasmídico se incluyen carpas, pollos, perros, gatos,puercos, hwnsters y conejos.

7. Por último, las moléculas de ARN traJ1SCril3Syprocesadas apropiadamente in vilro también ge-neran expresión' detectable por esta técnica, peromucho más transiente que la generada por el ADNplasmídico (3).

De todas las generalizaciones aportadas por losestudios iniciales referidos arriba (3-23), quedabacIaro que la tecnología de "transferencia directa deADN desnudo" era una realidad que podría revolu-cionar los protocolos convencionales de terapiagénica, especialmente los diseñados para combatirmiopatías primarias como la distrofia muscular deDuchelllle, entre olJ'as, y en este sentido se comenzóa investigar (8).

I.a inmunización con ADNAl margen de las posibles aplicaciones terapéuticasde la "transferencia directa de ADN desnudo",quedaba otro campo aún sin explorar: ¿sería posiblegenerar una respuesta inmune en el hospedero altransferirle genes heterólogos? ¿Cuán efectiva re-sultaría dicha respuesta para protegerlo contra unpatógeno específico?

En 1992, De-chu Tang y colaboradores en laUniversidad de Texas (EE.UU.), responden afirma-tivamente la primera de las interrogantes anterioresal detectar anticuerpo s en ratones inoculados conlos genes de la honnona del crecimiento y/o la an-titripsina-al humanas, si bien la técnica empleadaen este caso no fue la inyección intramuscular, sinola proyección intradérmica de micra partículas deoro recubiertas superficialmente con los plásmidosen cuestión (26). Esta variante de administración illvivo del ADN plasmídico será abordada con algúndetalle más adelante. En el mismo reporte (26), senotó una evidente respuesta secundaria al inmuni-zar más de una vez los animales, pudiéndose detec-tar los wlticuerpos durante al menos cinco meses.

A partir de entonces, numerosos grupos científi-cos interesados en generar inmunidad protectoracontra determinados patógenos (especialmente in-tracelulares), decidieron ensayar la inmunizacióncon ADN para detenninar si las respuestas inmunesobtenidas mediante esta técnica tenían algún signi-ficado biológico (revisado en 27-32). De ser así,podrían compararse los resultados de esta incipien-te tecnología con los alcanzados mediante las yaconvencionales (inmunización con proteínas puras,microorganismos inactivados o atenuados, etc.).

Un patógeno en el que se comenzó a trabajar congran intensidad fue el virus de la influenza humana(33-43, revisado en 44) empleando como modelosanimales ratones, pollos, y más recientemente,hurones.

82 Biolecnología Aplicada 1996; Vol. 13, No. 2

o Pardo Inmunización con ADN

Los resultados positivos obtenidos han superadocon toda s~guridad cualquier vaticinio preliminar.En el mode1o-.murino,en varios casos se generarontítulos discretos de anticuerpos.contra la hemaglu-tinina (HA) y la nucleocápsida (NP), los que resul-tarOn capaces de inhibir la hemaglutinación viral eincluso neutralizar el virus in vitro. Se generó,además, respuesta citotóxica de amplio espectrocontra NP, la cual fue detectable aún al año de la in-munización (38, 42). Pero lo que resulta más impor-tante: en dependencia de la dosis de ADN y la víade inmunización empleada, hasta un 95 % de los ra-tones inmunizado s quedaron protegidos contra UIJreto letal del virus de la influenza (33-35, 40).

Los estudios realizados con este ortomixovirus no

sólo demuestran que las vacwlas de ADN resultan dehecho efectivas, sino que han modificado en granmedida los conocimientos iniciales ya mencionadossobre "la transferencia directa de ADN desnudo".

Por ejemplo, además de la vía intramuscular deinmunización, la intravenosa (35) y la intradérmica(35,42) también generan respuestas inmunes im-portantes. Asimismo, en ratones la dosis de ADNplasmídico puede ser tan poca como I J.1g(40), Ysise emplea la variante de los microproyectiles in- .tradénnicos, mucho menor aún (35).

Otro importante patógeno abordado por la imnu-nización con ADN es el virus de la imnunodeficien-cia humana (VIIi-I) (45-53). En este caso, se hanobtenido anticuerpos contra epítopes relevantes delas glicoproteínas gp 120 Y gp4 I en ratones y pri-mates no humanos. Estos anticuerpos neutralizan illvitro al virus, inhiben la fonnación de sincisio porel mismo, e interfieren parcialmente la unión degpl20 con su receptor celular (45, 46).

Además, también se genera respuesta citotóxicacontra las proteínas gpl60 y gpl20 de esteretrovirus, la cual tiende a anteceder la aparición delos anticuerpo s (47), Y resulta suficiente para pro-teger a más del 90 % de los ratones imnwlizados deun reto letal con células tumorales transfectadas

con la gpl60 del propio VIH-I (48).Un resumen de los principales patógenos donde se

ha aplicado (con mayor o menor éxito) la inmuni-zación con ADN, aparece en la Tabla 1; también sehan iniciado estudios con los genes de las proteínasgB de citomegalovirus, porinas deSalmonella typhi, yvarios antígenos Oavivirales,entre otros.

Vías AlternativasAdemás de la inyección intramuscular en soluciónsalina fisiológica, se han desarrollado varias víasaltemativas de inmunización, algunas de las cualesya han demostrado ser superiores a la primera. Acontinuación se describen brevemente estas vías al-

temativas. También aparecen relacionadas, en arasde brindar un cuadro más completo, algunas es-trategias "directas" de inmunización con ADN que

no lo emplean "desnudo" exactamente, sino conju-gado a otras moléculas. Estas estrategias persiguen,en última instancia, lograr una transfección más efi-ciente in vivo, o dirigir específicamente la ex-presión a determinado tejido de interés que no seael muscular estriado.

Cañón de micropartículasEn la sección anterior se mencionó el empleo de losmicroproyectiles intradénnicos, primero como re-porte original de la obtención de anticuerpo s al in-munizar éon ADN (26), Yya luego aplicado al casoespecífico del virus de la influen~a humana' (35).

Esta variante de administración hace uso de un

"cm1ón" capaz de propulsar las micropartículas re-cubiertas con el ADN en cuestión a través de variascapas celulares del tejido a transfectnr, bien sea esteun órgano quirúrgicamente expuesto, o simple-mente la piel (54-56).

La expresión de los genes transferidos medianteesta técnica, al igual que con la inyección directa, seha demostrado en múltiples especies de animales(ratón, rata, hámster, conejo y mono rhesus), perodistintivamente, la misma no se limita sólo al músculoestriado, sino que es detectabl.etambién en epidemlis,dennis, hígado, rú1ón,páncrens y, algo menos, en co-razón, bazo y músculos abdominales (22).

Con dosis tan bajas como 15 ng de ADN ya esposible obtener una respuesta biológica eficiente(57), lo que es atribuible no sólo a la alta efectivi-dad en la entrega intracelular del ADN, sino tam-bién a la posibilidad de transfectar tejidos más in-muno-competentes que el músculo (58).

Propulsor de fluidosEl principio de funcionamiento es la proyeccióncon alta presión de la solución donde se haBadisuelto el ADN. Este procedimiento ha sido em-pleado con anterioridad para la vacunación conven-cional en humanos... Al parecer no resulta tan eficaz cpmo el "cw1ón"de micropartículas, pero el mero hecho de no intro-ducir tales partículas metálicas en el orgmlismo, lohace muy atractivo para WIapresunta inmunizacióncon ADN en seres humwlOs. Además, esta técnicamWItienela ventaja de pennitir expresión no sólo en elmúsculo estriado, sino taJnbiénen picI, tejido adiposoy glándulas mamarias (59, 60), lo cual generarespuestas humorales y ccIularcs signilicalivas (61).

Complejos ADN lípidos (3D,62)Si bien la inyección intramuscular directa de com-plejos ADN lípidos no rinde ventajas significativassobre el ADN "desnudo", por vía intravenosa sí seobtiene con ellos una expresión importante en mús-culo, así como en muchos otros tejidos y órganos:pulmón, riñón, hígado, bazo, timo, médula ósea, en-dotclio vascular, útero, páncreas e intestino. Sinembargo, la expresión en estos tejidos resulta, por

83 Biolecnología Aplícacla 1996: Vol.13,No. 2

o Parda Inmunización can ADN

lo general, menos duradera que en el músculo, aun-que en ratones tamhién se ha rcportado la transferen-cia ~.e\plesiÚn de dichos wmplcJos en los fetos y pro-genie neouala de hemhras inmunizadas (63).

( '(I/UI''''}''.\' ..11J.\'/>rcJleiI1OS (6-1-66)

Se han empleado mÚltiples variantes de complejos¡\:)N proteínas. La dección de la proteína (trans-fenina. insulina, asialoglico-prolcínas. etc.) se basaen la presencia de los rcceptores celulares cspecífi-l'I1Sen d lcjido a transfeclar U,Ú).¡\demás, tambiénse han desanollado complejos más sofisticados queIncluven particulas adenovirales no replicativas,con d ohjclivo de favorecer el escape cndosomaluna vez endocitado el complejo (65);

Otras AplicacionesLas aplicaciones de la "transferencia directa degenes" no se reducen a generar inmunidad contraagentes infecciosos, sino que, mediante la transferen-cia de los gcnes codificantes para las proteínas delsistema principal de histocompatibilidad (67-72),mÚltiples linfoquinas (73-76), regiones variables deinmunoglobulinas (77), el receptor de las células T(7R) así como las moléculas de diferenciación CD4y CD8 (79), ya se ha comenzado a manipular i" vivo'd sistema inmune de una fonna mucho más prác-tica que las disponibles por las metodologías con-vencionales.

Los resultados obtenidos en este campo son tam-bién muy alentadores, como lo indican los ejemploscitados a continuación:

l. En r~tones, la transferencia intramuscular delos genes de IL2, IL4 Y GM-CSF adyuva larespuesta humoral que estos animales desarrollancontra un antígeno determinado, mientras que latransferencia de los genes de TGF-j31 y IFN-y lasuprimen (73, 76). Asimismo, la administración in-

travenosa de los genes del propio TGF-j31 y dePDGF B, provoca marcados efectos biológicos enel tejido endotelial transfectado (75, 80).

2. Se han iniciado estudios con los genes codili-cantes para la cadena de receptores de células T"patogénicos" (provenientes de tejidos sino vialesde pacientes con artritis reumatoide), y es posiblegenerar respuesta humoral contra esa proteína enratones (78), lo cual pudiera tener importanciaterapéutica de verificarse en humanos.

3. Varios esquemas de inmunización con ADNplasmídico se han realizado en animales para gene.,rar una respuesta inmune protectora antitumoral.Los transgenes por excelencia han resultado ser lasmoléculas del sistema principal de histocompati-bilidad tipo 1 (67, 68, 71, 72) (con el propósito deprovocar un rechazo hacia las células tumoralestransfectadas), si bien otros candidatos (como losantígenos T del virus SV40 y el antígeno carci-noembrionario) también han sido empleados (81 ).

Por lo general, en estos estudios el ADJ-..se haevaluado acomplejado con lípidos catiónicos, bus-cando amplificar los efectos biológicos de la terapia(respuesta cito tóxica antitumoral, regresión o pro-gresión retardada del tumor, etc.), pero en soluciónsalina fisiológica también se desata una respuestailUnune en el animal vacunado (69, 70),

Es precisamente en pato.logías incurables por lamedicina actual, donde la "transferencia directa deADN" ha sido aplicada en seres humanos porprimera vez. Varios estudios clínícos de fase 1 y 11,que involucran en total a decenas de pacientes decáncer, han sido realizados o están en desarroIlo enEE.UU. (82).

En estos estudios, los panímetros seguidos másrigurosamente han sido la toxicidad de la formu-lación, la aparición de síntomas de autoinmunidad ypor supuesto, la cuantificación y localización tantode la pro.teína for-ánea como dcI plásmido que lacodifica. Aún es muy temprano para emitir vere-dicto alguno sobre los efectos biológicos de laterapia, si se toma en cuenta que las vías de inocu-lación, fonnulaciones y dosis aún están siendo op-timizadas.

Por último, no debe omitirse aquí la mención dedos aplicaciones muy recientes de la inmunizacióncon ADN, y que resultan no menos espectaculares:

l. El empleo de detenninadas bacterias transfor-madas con el plásmido de interés como vehículovivo para su entrega a nivel de las mucosas (83).

2. La inmunización directa con bibliotecas

genómicas de detenninados patógeno s, como meto-dología de identificación .de los antígenos protec-tores contra eIlos (84).

8ioseguridad y RegulacionesTres consecuencias negativas que en principio po-drian derivarse de la ilUnwlización con ADN son:

l. La aparición de anticuerpo s contra el ADNinyectado pudiera generar estados autoininunes re-miniscentes de los que se presentan, por ejemplo,en ellupus eritematoso sistémico.

2. La integración genómica al azar del ADNinyectado pudiera activar un oncogén, inactivargenes supresores de oncogenes, etc.

3. La expresión continua de "bajos" niveles delantígeno, y su presentación al sistema ilUnune porlargos periodos, pudiera generar estados de toleran-cia, hiperilUnunidad, etc.

El primero de estos puntos es tal vez el menospreocupante de los tres, ya que durante años seconoce la escasa imnunogenicidad de la confonna-d{)n B (más usual) del ADN, especialmente libre ensolución. La obtención de anticuerpos contra elADN B se logr.a mediante su conjugación a pro-teínas inmunogénicas. Además, de los anticuerpo scontra el ADN doblecatenario, solamente aqueIlosde alta afinidad que posea.naminoácidos básicos ensus paratopos resultan realmente patogénicos, al de-

84 Biofecno/og(a Aplicada 1996; Vol. 13, No. 2

o Pardo Inmunizacióh con ADN

PÁTÓGENO

Tabla 1. Principales patógenos contra los que se ha aplicado la inmunización con ADN.

COMENTARIOS

Herpesvirusbovino 1

Virus

de las hepatitisByC

Virus de la corio-

meningitislinfocltica

Virus de la rabia

Micobacterias

Leishmania majar

Plasmodium yoelii

Virus herpessimplex

Schistosoma

japonicum

Mycoplasmapulmonis

Cryptosporidi umparvum

Papilomavirus

Anticuerpos murinos contra gl, glll, YglV, estol últimos neutrali%antes. la inmunización d. terneros

con ..1 g..n d.. glV confi..r.. prot..cción parcial.

Anticuerpos murinos contra prot..lnas quiméricas NP (del VHC) y pr..S2-S o S (d..1 VHB). Tambión

en ratas y conejos 'o han generado anticuerpo. contra S, y s. ha d.tectado respuCtsta cito'óxicoen raton..s contra la NP d..1 VHC.

Escasos onticu..rpos murinos conlro lo NP o GP, pero sensibilización d.. linfocitos citotóxicos

in vivo y 50 % d.. prot..cción (..n ocosion..s inmunoamplificación).

REFERENCIAS

(92)

(93-101,102)

(103-105)

Obt..nción d.. anticu..rpos murinos n..utralizant..s y r..spu..sta citotóxica contra gG, asi como inmunidad

prot..ctora, d..t..ctándos.. adyuvación o supr..sión m..diante la coinoculación d.. plásmidos codificant...

para GM-CSF o IFN-1. r...p..ctivam..nte.

(106,107,76)

La inmunización d.. raton... con ..1 g..n d.. HSP65 d.. M. leprae rind.. m..nor... bact..r..mia. h..pática.

tras un r..to con M. tuberculosis. Tambión s.. ..studian los g..n..s d.. HSP65, 85A, 85B Y85C

d.. M. tuberculosis.

La inmunización d.. ratones con el g..n de gp63 de L. maior confi..re prot..cción parcial.

Obt..nción de anticuerpo. murinos contra ..1 antlg..no CSP d.. P. yoelii (lo. qu.. in vitro inhib..n

parcialmento la invasión microbiana a h.patocitos), as( como respuesta cito'óxico y protección parcial.

Anticu..rpos murino. contra gB de HSV.¡ poco n..utralizant..s, pero 80 % d.. prot..cción. Tambión

anticu..rpo. n..utralizont... contra gD de HSV.2.

Anticuerpo. murino. contra Sj97, no a.i contra Sj26.

Anticuerpos murinos y respuesta citotóxica contra determinados antígenos.

La inmunización d. ovoias con 01 g8n de CP15/60 genera anticuorpo, en ,uoro y calostro.

La inmunización con el gen de L¡ en con..jos g..n..ró anticu..rpos n..utralizant... y prot..ctor....

(108)

(109,110)

(111 -114)

(115,116,117)

(118)

(119,84)

(120)

(121 )

positarse fundamentalmente .en la membrana basalde los glomérulos (85). Por último, en todos losesquemas de inmunizació\1 con ADN donde sc hanbuscado anticuerpos a.nti-ADN, éstos nunca se hand,etectado (14).

Los otros dos aspectos son de mayor significación,ya su vez, mucho mós difíciles de monitorcar ;n vivo.

Los plásmidos que se emplean para la inmuniza-ción no poseen regiones reportadas como orígcncs dcreplicación en células eucarióticas, ni tampoco sc-cuencias homólogas promotoras dc evcntos recomhi-nativos-integrativos (exceptuando los casos donde elgen a transferir es homólogo). Adcmás, nunca se halogrado detectar esos eventos expcrimentalmente(15), si bien es imposihle aún excluir su oculTcnciaalazar con muy baja frecucncia.

Tampoco se han dctect;:¡dosíntomas de tolenUlciaohiperinmunidad en los animales inmunizados conADN, ni ningún tipo de trdstomo autoilUnunedegene-rativo. Pero, obviamente, muchos experimentos con-trolados han de ser diseiiados aim antes de que la Últi-ma palabro sobre tan delicado aspccto sea dicha.

Tal v~ Wlaaltemativa que aún no haya sido apre-ciada a cabalidad sea el empleo del ARN en lugar delADN. De hecho, ya se han comenzado a desarrollarsistcmas replicativos de ARN capaces de rcndirexpre-siones suficientemente estables como para gencrarrespuestas i1Ul1unessignificativas (86, 87).

C'onclusiones¿Cuánto habrá qué esperar para la aplicación en se-res humanos de una vacuna de ADN? La rcspuestadcpelide de los conocimientos quc sumi-nistren losestudios mencionados arriba. También dcpcnde dclpatógeno específico contra el quc se prctcnda prote-ger. Por ejemplo, en el caso del HIV-l (incurablepor la ciencia actual) algunas compmiías norteame-ricmlas ya han obtenido la autorización olicial pararealizar cxpcrimentos de inmunización con ADN enseres humanos.

Los controles que habrán de realizarse prelimi-narmente, así como las regulaciones que rcgirán lapresunta aplicación en humanos de la primera vacu-na de ADN, recién comienzan a ser discutidos (88,

85 Biolecno/ogla Aplicado 1996; Vol. 13, No. 2

-- ..

o Pardo Inmunización con ADN

89,90,91), y ya se han celebrado varios eventos in-ternacionales de gran prestigio para abordar el temade las vacW1asde ADN, como los sostenidos en Gi-nebra (Suiza) en mayo '94, en Arlington (EE.UU.)en abril '95, y en Bethesda (EE.UU.) en febrero '95Y '96.

Son muchos los argumentos emitidos por lacomunidad científica internacional fuera y dentrode estos eventos, tanto a favor como en contra deuna posible vacunación con ADN en seres huma-nos. Muchas son las interrogantes que se han

1. Benv.ni'ly N ond R..h.1 L. Direct inlro-dUdion 01 ganes ¡nto ratsand eXpr8s.$ion01Ih. gen... PNAS USA 1986;83:9551-9555.

2. Dub.n.ky TW. CompbeU 8A ond ViUor.real lP. Direct .rond.dion o, viral ondplo.mid DNA inlo Ih. liver or .pl..n 01mic.. PNAS USA 1984;81 :7529-7533.

3. WolII JA, Molon. RW. Williom. p. ChongW. Acsadi G, Jani A, el 01. Direct genetronsl.r ¡nto mouse muscl. In vivo. Science1990;247: 1465-1468.

4. WolII JA, Williom. P, A<sodi G, Jioo A,Joni A ond Chong W. Condilion. ollectingdirect gene transf., ¡nto roden! muscle Inv;vo. 8iol.ehniqu.. 1991;11:474-485.5. Ae.odi G, Jioo S. Joni A, Duk. D. Wil.lioms P, Chong W, el al. Dired oene trans..f., and expression ¡nto ra' heort In vivo.New 8iologi'l 1991;3:71-81.

6. Hans." E, F.rnonde, K, Goldspink G,8utt.rworth p. Umedo PK ond Chong K.Strong expression 01 lareign gene' follow.ing dir.ct iniection inlo li.h mu.de. FE8SL.tt 1991;290:73-76.

7. Kihi. RN, 8uttrick PM, MeNoUy EM,Koplon ML ond L.inwond LA. Hormonalmodulo'ionof o gene in¡eded ¡nto ra' heortIn vivo. PNAS USA 1991;88:4138-4142.8. Anadi G, Dickson G, Lave DR, Joni A,Wol.h FS, Guru.inllh. A..' al. Humondystrophin ."presion in mdx-mice ofter in-tromusculor ¡n¡adioR 01 DN'" cons'ruch.Noluro 1991;352:815-818.9. leinwand LA and Leiden JM. Genetrans'., inlo cardioc myocyl8' in vivo.Trend. Cordiovo.e Med 1991;1:271-276.

10. Lin H. Pormoe.k MS. Morl. G. 80lling Sond L.iden JM.Expressiono, recombinan'genes in myocardium in vivo ahe, direct in-iection 01 DNA. Cireulolion 1990;82:2217-2221.

11. Donko 1, Frilz JD, Jioo S, Hogon K.Lol.ndr JS ond WolII JA. Phormo-cologicol .nhoRe.men' 01 In ",Ivo 'areigngene exprenion in muscl.. Cen. The,1994;1:114-121. .

12. Well. DJ ond Goldopink G. Ag. ond o..¡nfluence expression o, plosmid DNA di.redly injected into mous. ,k. l. tal muscl..FE8S L." 1992;306:203-205.13. Bu"rick PM. Ko.. A. Kit.i. RN, KoplonML ond L.indwond LA. Behovior 01 gone.dir.ctly iniected inlo rol hoort In v;vo. CircRoo 1992;70:193-198.

14. Jioo S, Willioms P, 8.rg RK, HadgemaR8A, liu L, R.peno e,.t 01. Dír.ct oen.Iransf., ¡nto nonhuman primole myofibersin vivo. Hum Gen._Th.r 1992;3:21-33.15.WolII JA, Ludlk. JJ. Aesadi G, Williom.

, and Joni A. Long-..rm persistence o,plosmid DNA ond tareign gene exprenionin mouse muscl.. Hum Mal Gen1992; 1:363-369.

16. Monlhorpo M. J.n..n FC. Hortikko J.F.lgnor J. Rund.1I A. Morgolilh M, 01 o,.Gene theropy by intromUKulor ¡n¡.dion o,plosmid DNA: .tudie, on 'ireny luci'eros8g8ne 8Kpression in mice. Hum Gene Ther1993;4:419-431.17. Dovis HL, eemenei. 8A, Quontin 8,Coulomb. J ond Wholon RG. Plo.mid DNA

abierto, y muchas serán las que surjan en la medidaque las primeras encuentren respuesta en los resul-tados experimentales que vayan obteniéndose.

Por hoy, nos basta con saber que la iJUnunizacióncon ácidos nucleicos "desnudos" es ya una altema-tiva real que va abriéndose camino paulatinamentecomo fonna práctica de manipulación del sistemaiJUnune.Para maJlana nos queda la graJl incertidum-bre de si esta técnica llegará a convertirse o no enuna nueva generación de vaCWlashwnaJlas.

is superior to virol vedors 'or dir.d g.n.tronder into adult mous. sk.letal muscle.Hum Gen. Th.r 1993;4:733-740.18. Dovi. HL. Whol.n RG ond D.m.n.ixBA. Dired oene tron,'er into ,keletal mu,-ele In vltro: 'octon in'luencing efficiency oftrons'er and stobility o, expression. HumG.n. Ther 1993;4:151-159. .19. Dovi. HL ond Jo.min 8J. Dir.ct g.n.Ironder inlo mouo. diophrogm. FEBSL."1993;333: 146-150.

20. WolII JA, Dowty ME. Jioo S. R.pe"o G,Berg RK, Ludlke JJ. o, a'. Expr...ion 01 no.k.d ploomido by eullured myolube. ond .n.Iry 01 plo.mido inlo T lubule. ond eoveolo.01 mommolion .k.l.lol mu.d.. J C.U Sei1992;103: 1.249-1259.21, N.ck... LM. C.llulor inl.rnolizolion 01olioodeoxynucleotide,. Gene Therapeutics:methodl and applications o, direct geneIronsl.r. IEd. por JA W,III). 8irkhilu..r.80010n 1994;180-192.

22. Chong L,Zi.gelholler .PRond Yong NS.In vivo promoter odivity and tronsgene ex-p,ession in mammolian somatic Ussue,ovoluoled by u.ing partido bombordm.nl.PNAS USA 1993;90:4455-4459;

23. Donko I ond WoHf JA. Dir.d g.no Iron.-lor in mu.do. Voccine 1994;12:1499-1502.

24. Molon. RW, Hickmon MA, Lehmonn K,Wolzem R, 80uiri M ond PoweUJS. Hepoticoene tronder following dlrect In vivo iojee-lion. J C.II 8ioch.m 1993;17E:239.25. Sike. ML, O'MoUoy Jr 8W ond L.dl.yFD. Invivo oene tronsfer inlo robbilIhyroidby dirocl DNA in¡oction: o nov.1 .Irol.gylor g.n. Ih.ropy. J ColI 8ioeh.m1993jI7E:208.

26. Tong DC. D. Vil M ond John.lon SA.Genetic immunization is o simple me.hodfor elidting on imm'lne ,e'pons.. No'ur.1992;356:152-154.

27. Ulm.r JB. Polynucl.olid. voecin...Curr Opin Inv.'1 Drug. 1993;2:983.989.

28. 8rociol. n. Nok.d DNA ond voeein.d..oign. Trend. in Microb 1993; 1:323-325.29. Woino GJ ond McMonu. DP. Nud.ieocids: voccines of the fulure. Porosilol To-doy 1995;11:113.116.

30. Horw.ij.r H. Frilz JD. Hog.lrom JE andWolH JA. Dir.ct gon. Irond.r In vivo. So.molie g.n. Ih.ropy CRC;: Pr Ine1995;183-202.

31. Donn.lly JJ, Ulm.r JB ond Liu MA. 1m.munizolion with DNA. J Immunol M.lh.1994;176: 145-152.

32. Pordoll DM ond Beck.rl.g AM. Expos-ing Ih. immunology 01 nok.d DNA voe-cin...lmmunily 1995;3:165-169.

33. Ulm.r J8, Donn.lly Ji, Pork.r SE.R'hod.. GH, Felgnor PL. Dworki VJ. ., o/.Helerologous proledion ooainst influenzaby injoclion 01 DNA .ncoding o virol pro-I.in. Scienc. 1993;259:1745-1749.

34. Monlgomory DL. Shiv.r JW. L.ond.rKR, Porry HC. Friedmon A Mortln.z D,., o,,Helerologous ond homologaus prolectionogoinol inlluenzo A by DNA voecinotlon:oplimizolion 01 DNA vocto... DNA C.U 8iol1993;12:777-783.

86

35. Fynon EF, W.b.l.r RG. Full.r DH.Hoyn.. JR. Sonloro JC ond Robin.on HL.DNA vaccines: protedive immunizotio"s byparenterol, mucosol, and o.ne-oun inocu-lolion.. PNAS USA 1993;90:11478.11482.

36. Ei..nbroun MD. FuUor DH ond Hoyn..JR. Examinalian of parome'en affectinothe elicitotion of humoral immune re-sponse,by partide bombordment-medi-oted genetic immunizotion. DNA eeu liol1993;12:791-797.

37. Robin.on HL, Hunl LAond Web'l.r RG.Proledion ogainst a lethal influenza viruschallenoe by immunizotion with o haemag.glutinin-expressing plasmid DNA. Vaccine1993;11 :957-960.

38. Yonkoucko. MA, Morrow JE, Porlt.r SE,Aboi Á, Rhode. GH. Dworlti VJ. .1 01. Long-term anti-nucleoprotein cellular and hu.moral immunity is induced by intromusculorinj.elion 01 plo.m id DNA conloining NPgon.. DNA C.U8ioI1993;12:771-776.

39. Fynon EF. Robin.on HL ond W.b.l.rRG. U.. 01 DNA .ncoding inllu.nzo hoo-mogolutininos an avian influenza voccin..DNA C.II 8iol 1993;12:785-789.

40. Ulmer J8. Dock RR, DeWitt CM, Fri.d.mon A, DonneUy JJ ond Liu MA. Protectiveimmunity by Intrornuscular ¡n¡.dion of lowdose, of influenza virus DNA voccines.Vocein. 1994;12:1541-1544.

41. W.bol.r RG. Fynon EF, Sonloro JC ondRobinson H. Prol.clion of 'erre" aoainstinfluenza challenoe wilh a DNA vaccine toIh. hoomogglulinin. Voccine 1994; 12:1495-1498.

42, Roz E. Corson DA ond Porkor SE. In-'rad.rmol oene immunizotion: the po\Siblerol. 01 DNA uplok. in Ih. induction 01 c.l-lulor immunity lo viru PNAS USA1994;91 :9519-9523.

43. DonnoUy JJ. Fri.dmon A, Mortln.z D.Monlgom.ry DL. Shiv.r JW. Molz.1 SL, .,0/. Pr.dinical oHieocy 01 o prololype DNAvoccina: enhanced proledion against onfi.oenic dr¡ft in influenza virus. Nolur. Med1995;1 :583-587.

44. Fynon E, W.b..or RG. Fullor DH.Hoyn.. JR. Sonloro JC ond Robin.on HL.DNA vaccines: a novel opproach to immu.nizolion. Inl J Immunophormoe 1995;17:79-83.

45. Wong 8, Ug.n KE, Srikonlon V. Agod.jonyon MG, Dnog K. Refoeli Y. .1 o,. G.n.inoculotion oenera.es immune r.sponsesagains' humon im munodeficiency virusIype 1.PNAS USA 1993;90:4156-4160.

46. Wong 8. Boy.r J, Srikonlon V. Conoy L,Carrano R, Phan e, .t al. ONAinoculotioninduce, neutralizing immune rasponsasogainst humon immunod.ficiency virustypi 1 in mice ond nonhumon primotes.DNA C.U BioI1993;12:799-805.

47. FuU.r DH ond Hoyno. JR. A quolilolivoprogr...ion in HIV Iyp. 1 glycopt"ot.in 120-specific cyloloxic ce!lulor ond humoral im.mune response' in mice receivino aDNA-bo.od glyeoprol.in 120 voccine. AIDSRe. & Hum Rolrov 1994;10:1433-144 1.

SiolClen%gla Aplicada 1996; Vol. 13. No. 2

o Pardo Inmunización con ADN

48. Wong B, Mervo M, Dong K, Ugen K,Boyer J, Williams WV, et 01. DNA inoculo-tion induces protedive In vIvo immune re.'ponses agoinst cellular chollenge wilhHIV.1 ontigen.expreuing cells. AIDS RIn &Hum hlroy 1.99~;10:S35-S~ 1.

49. Hoynes JR, Fuller DH, Eisenbroun MD,Ford MJ ond Parlmer TM, Accell" portide-m.diot.d D A immunizotion .Ucih hu-moral, cytotoxic, and protectiv8 immun.respons.s. AIDS Res & Hum R.'rov199~;10:S~3-S~5,

50. Coney L, Wong B, Ugen KE, Boyer J,McCollus D, Srikonlon V, el 01. FocililoledDNA inoculo.ion induces an.i-HIV-1 immu-nity In vIvo. Voccine 199~; 12: 15~5-1550.

51. Ugen KE. DNA inoculotion as a novelvaccination method cgcí"s. humonr.troviruses with- rheumatic diseos8 0150.ciolions. Immunol Res 199~;13:15~.162.

52. WQng B, Boyer J, Srikonlon V, Ugen K,Gilbert L, Phon C, el al. Induction 01 hu.moral and cellular immune respons.s '0.he humon immunodeficiency type 1 virusin nonhumon prima.es by In vivo DNA in-oculolion. Virol 1995;211: 102-112.

53. Okudo K, Bukowo H, Homojimo K,Kowamoto S, Sekigowo KI, Yomodo Y, ftl01. Induclion 01 poten' humoral and cell-medioted immune responses lollowing di-rect in¡.ction 01 DNA encoding the HIV'ype 1 env and rev gene produds. AIDSRes& Hum Relrov 1995;11:933-9~3.54. John.lon SA ond Tong DC. The u.e 01micropar1icle iniedioo '0 introduce genesinto animol cells in vitro and in vivo. Ge-nelic Engineering (Ed. por JK Sellow) Ple-num Pre.., NY 1993;15:225-236.

55. John.lon SA ond Tong DC. Gene gun'ronlfection of animol cells ond genetic im-munizotion, Melh. Cell Biol 199~;~3:353.365.

56. Yong NS, De Luna C ond Cheng loGene trander vio par1icle bombardment:opplica'ions 01 the AeeeU gene gun. GeneTherapeutics: me.hods and opplicotions ofdired gene Ironder. (Ed. by JA Wolff) Birk-houser, Bo.lon 199~;193-2P9.

57. Pertmer TM, Eisenbraun MD, MccobeD, Proyogo SK, Fuller DF ond Hoyne. JR.Gene gun-bosed nucleíe ocíd immunizo-tion: Elicitotion 01 humoral ond cytotoxic TIymphocyte responses following epidermoldelivery of nonogram quontilies of DNA.Voccine 1995;13: 1~27 -1~30.

58. Holhleld R ond Engel AG. The immuno-biology 01 muscle. Immunol Todoy199~;15:269-27~.

59. Furth PA, Shomoy A, WolI RJ ond Hen.nighousen lo Gene tronsfer ¡nto somalic.issues by ¡et injeetion. Anol Biochem1992;205:365-368.

60. Furth PA, Shomoy A ond Hennighou...nlo Gene trander into mommolion celh by jetinjedion. Hybridomo 1995;H:l~9-152.

61. Vohl.ing HL, Yonkoucko. MA, SowdeyM, Gromkow.ki SH ond Monlhorpe, M. Im-munizolion with plasmid DNA using opneumotic gun. J Immunol Meths199~; 175: 11-22.

62. Singhol A ond Huong L. Gene Ironderin mammolion eells using liposomes os eor-riers. Gene 'herapeutics: methods ond op-plications 01 dired gene tronder. (Ed. porJA Wolff) Birkhlluser, Bo>lon 199~;118-1~2.

63. Tsukomo.o M, Oehiyo T, Yoshido S,Sugimura T and Terado M. Gene tronsferand expression in progeny oher introve-nous DNA iniection ¡nto pregnont miee.NoI Genel 1995;9:2~3-2~8.

64. Findeis MA, Merwin JR, Spilolny GL ondChiou HC. Torgeled delivery 01 DNA lorgene 'herapy vio reeepton. Trends inBiolech 1993;11 :202-205.

65. Michoel SI ond Curiel DT. Slrolegie. loachieve targeted gene delivery via .he re.eeptor.medioted endocytosis pathway.Gene Ther 199~;1 :223-232.

66. Perole. JC, Ferkol T, Malos M ond Hon-son RW. An .voluotion 01 receptor-medi-ated gene trans'er using syntheticDNA-ligond complexes. Eur J Biochem199~;226:255-266.

67. Ploulz GE, Yong ZY, Wu B, Goo X,Huong L ond Nobel GJ. Immunolheropy 01malignoncy by In vivo gene transler into tu.mono PNAS USA 1993;90:~6~5-~6~9.

68. Nobel GJ, Nobel EG, Yong ZY, Fox BA,Ploulz GE, Goo X, el al. Dired gene lrons-ler wilh DNA liposome complexes in melo-nomo: express ion, biolog;e octivity, andlock 01 toxicily in humons. PNAS USA1993;90:11307-11311.

69. Geiuler EK, Wong J, Fechner JHJ,Burlinghom WJ ond Knechlle SJ. Immunitylo MHC don I onligen ofter diree! DNAIronder inlo .hlelol muscle. J Immunol199~;152:~ 13-~21.70. Vile RG ond HortlR. In vllro ond In vivotargeting 01 gene express ion lo melanomocells. Concer Re. 1993;53:962.

71. Lew D, Porkor SE, Lolimer T, Aboi AM,Kuwohoro-Rundell A. Doh SG, el 01. Con-cer theropy using plosmíd DNA: phorma-cokinetic study 01 DNA lollowing in¡_dionin mico. Hum Gene Ther 1995;6:553-56~.

72. Porker SE, Vohl,ing HL, Serlilippi LM,Fronklin Cl. Doh SG, Gromkowski SH, el01. Cancer gene therapy using plosmidDNA:salety evoluolion in rodents ondnon..human primotes. Hum Gene Ther1995;6:575-590.

73. ROl E, Wolonobe A, Baird SM, Eisen-berg RA, Pon T8, lotz M, el al. Systemie im.munologicol effech 01 cytokine gene,iniected into skeletol muscle. PNAS USA1993;90:~523-~527.

74. Hengge UR. Cytokine gene expressionin epidermis with biological 8fteds lollow-ing injedioo of noked DHA. Noture Genet1995;10:161-166.

75. Nobel EG, liploy S, Yong Z, Gordon D,Houden.child C ond Nobel GJ. Recombi-nant platelet.derived growth fador b gen.expression in pordne arteries induces inti.mal hyperplosia in vivo. J Clin Invest1993;91 :1822-1829.

76. Xiong ZQ ond Erll HCJ. Monipulolion01 the immune response to a plasmid.en.coded virol on.igen by eoinoculo.ion withplosmids expresing cytokines. Immunity1995;2:129-135.

77. Wolonobe A, Roz E, Koh.oko H, Tigh..H, Boird SM ond Kipp. TJ. Indudion 01 on-tibodies to a V region bygeneimmunizo-tion. J ImmunoI1993;151:2871-2876.

78. Williom;WV, Fong Q, von Feldl JM,Boyer JD, Luchi M, Wong B, el 01. Immuno-Iheropeutic slro.egies torgeting rheumotoidsynoviol T-cell receplof'$ by DNA inoculation.Immunol Re, 199~;13:1~5.153.

79. Wong B, Mervo M, Dong K, Ugen KE,Willioms W ond W.iner 08. Immunizationby direct DNA inoculation induces rejection01 tumor eell chollenge. Hum Gene Ther1995;6:~07-~18.

80. Nobel EG, Yong Z, Ploulz G, ForoughR, Zhon X, Houden.child CC, el al. Recom-binant libroblost growth lodor.1 gene ex.pression in porcino or1eries induced intimolhyperplosio ond aogiogenesis In vivo. Na-lure 1992;362:8~~-8~6.

81. Conry RM. A earcinoembryonic ontigenpolynucleotide voecine has In vivo antitu-mor octivily. Gene Ther 1995;2:59-65.

82. Norma" JA, Porker S, Lew D, Man-.horpe M ond Marquet M. Preclinical phar.maeokinetics, monulaeturing, and safetystudies supporting a multicenter conee,gene Iheropy Iriol. Hum Gene Ther1995;6:5~9-550.

83. Sizemore DR, Bronslrom AA ond SodoffJC. Allenuoled Shigello os o DNA deliveryvehicle lor ONA-mediated immunization.Science 1995;270:299-302.

84. Borry MA, Loi WC ond JohR$lon SA.Protection agoins. mycoplosmo inlection

87

using expression-librory immunization.Nolur. 1995;377:632-635.

85. Slollor BD. Moleculor onoly.is 01 onli-DNA onlibodies. FASEB J 199~;8:337-3~2.

86. Herweijer H. A plo.mid-bo.ed .ell-om-plilying Sindbis virus veclor. Hum GeneTher 1995;6:1161-1167.

87. Zhou X, Berglund P, Rhode. G, PorkerSE, Jondol M ond Lilje.lrom P. Sel'-replicol-ing Semliki Fores' virus RNA os recombinantvocane. Voccine 199~;12:1510.151~.

88. Smilh HA. Regulolory con.iderolion.lor nucleic ocid "Voccines. Vaccine199~;12:1515-1519.

89. Robert.on JS. Solely con.iderolions lornucleic acid vaecines. Voccine 199"';12:"1526-1528.

90. Piselsky DS, Immunologic con.e-quence, o, nucleic ocid 'herapy. "ntisenseRes Dev 1995;5:219-225.

91. Ledley FD. Nonvirol gene Iheropy: Thepromise o, genes os phormoceu.icol prod-ud.. Hum GeneTher 1995;6:1129-11~~.

92. Cox GJM, Zomb TJ ond Bobiuk LA. Bo-vine herpesvirus 1: immune responses inmie. ond eoffle iniected wilh plosmid ONA.J Virol 1993;67:566~.5667.

93. Mojor ME, Vilvihki L, Mink MA, SchleelM, Wholen RG, Trepo C, el 01. DNA-bo,edimmunization wilh ehimeric vedors lor theindudion of immune responses ogcíns. Ihehepatitis C virus nucleocapsid. J Virol1995;69 :5798-5B05.

94. Logging LM, Meyer K, HolI D,Houghlon M, Bel.he RBond Roy R. Immuneresponses'o plosmid DNA eneoding .hehepatitis C virus eore proleio. J Virol1995;69:5859-5863.

95. Michel ML. DNA medioted immunizo.

tion '0 'he hepotiti$ 8 surlaee ontigen inmic.: ospeets o, Ihe humoral responsemimie hepatitis 8 viral infedion in humans.PNAS USA 1995;92:5307-5311.

96. Dovi. HL, Michel ML, Moncini M,Schleel M ond Wholen RG. Direcl geneIronder in .kelelol mu.cle: plo.mid DNAbosed immunization agoinst the hepatitis Bvirus surlace antigen. Vaccine 199"';12:1503-1509.

97. Doyis HL, Michel ML ond Wholen RG.DNA-based immunizotion for hepatitis 8induces con.inuous seeretion 01 ootigenond high leyel. 01 circuloling onlibody.Hum Mol Gen 1993;2:18~7-1851.

98. Wholen RG ond Dovi. HL. DNA medi-ated immunization ond the energetic im-mune immune res pon se to hepotitis Bsurlace antigen. Clin Immunollmmu-nopolhoI1995;75:1-12.

99. MeDonnell WM. Gene trander as anew mode of vaccination: implicolions forHCV. Hepolology 1993;8:696.702.

100. Michel ML. DNA medioled immunizo.tion. Prospeds for hepatitis B voecination.Res ViroI1995;H6:261-265.

101. Schirmbeck R, Bohm W, Ando K, Chi.-ori FV and Reimonn J. Nucleie acid voeci-no.ion primes hepatitis 8 virus surlaceontigen-specilic cytoloxic T Iymphocytesinnonre.ponder mice. J YiroI1995;69:5929-593~.

102. Schirmbeck R, 80hm W, Ando K, Chi.-ari FV and Reimonn J. Nucleic acid vocci-notion primes hepoti.is B virus surtoceantigen-specilie cy.otoxic T lymphocy1es innonre.ponder mice. J Virol 1995;69:5929-593~.

103. Mortin. LP, Lou LL, A.ono MS ond Ah-med R. DNA vaccinotion ogoinst persistentvirol inledion. J ViroI1995;69:257~-2582.

104. Yokoyomo M, Zhong J ond WhillonJL. DNA.immunizotion confers protedionogaínst lethollymphocytie choriomeningitisvirus inleclion. J Virol 1995;69:268~-2688.

8iolecnologla Aplicada 1996; Vol.13,No. 2

o Pardo Inmunización con ADN

105. Zorozin.ki CC, Fynon EF, Solin lK. Ro-blnl.On Hl and W.lsh 1M. Protedive CTl.dependen' immun¡ty ond enhancedimmunopothology in mica immunized bypartid. bombordmen' with DNA encodingon int.rnol virion prot.in. J Irnmuno'1995; 154:40 10-4017.

106_ Xiong za. 5pilolnik 5, Tron M. Wun-ner WH, Cheng J ond ErtlHC. Voccinotionwith o plasmid veclor conying Ih. rabi.svirus glycoprolein oen. induc.s protediveim m unity ogains' rabi.s virus. Viral1994; 199: 132-140.

107. Xiong za, Spilolnik Sl. Chong J, Erik-son J, Woiczyk Bond Ertl HC. Immuno ro-SPO"'.S '0 nueleic ocid voccine, lo rabiesviru.. ViroI1995;209:569-579.108. lo",,;o DB, TO$Con RE. Col.lon MJ ondSilvo Cl. Towards o DNA vQccine aooio,'tubereulo.i.. VoeeinoI994;12:1537-1540.109. Xv D and liew FY. Gen.tic vaccino.tion aQainst I.ishmaniasis. Vaccine1994;12:1534-1536.

110. Xu D ond lio", FY. Prolodion ogoin,'le¡shmaniasis by iniection o, DNA encodingo mojor surlac. glycoprotein, gp63. o,Lma;or.lmmunoI1995;84:173-176.

111. Hoflmon Sl, Sodogoh M ond H.d-slrom RC. Prol.ctioo ogoins. malaria byimmunizo.ion with o Plosmodlum yoelll cir.cumsporoloit. protein nucleic ocid vac-eino. Voeeino 1994;12:1529-1533.

112. Sod.goh M, Hod.lrom R, Hobort Pond Hoffman Sl. Pral.ctioo agaíns. mo.lorio by immunizotion with a plasmid DNAencoding circumsporozoite protein. PNASUSA 1994;91 :9B66-9870.

113. HodslrDm RC, Sodogoh M ond Hoff-m 01\,SI, Pro'ped, ond '!ro'ogio, lor donl-apmen' o, DNA voccitie, aooíns. malaria.Re.lmmunoI1994;145:476-483.

114. Mor G, Klinmon DM, Shopiro S, Hogi-"'ara E. 50dogoh M, Normon JA, 01 a'. Com-ploxity 01 tho cytokino ond ontibody r..pon..olicaod by immunizing mico ",ah I'lasmod/umyoelil circumsporozoit. prot.in plasmid DNA.J ImmunoI1995;155:2039.2046.

115. Moniekon E, Rou,. RJD, Yu Z, Wir.WS ond Rou,. 8T. Gen.tic Immunizotionagaind herpe, simplex virus. Protedion ismediolod by CD4 + T Iymphocyte.. J Immu-noI1995;155:259-265.

116. Rou.o RJD, Noir SK, lydy Sl, Bo",onJC ond Rou.. BT. 'nduclion In vllro o, pri-

ReCIbIdo enfebrero de /996. Aprobado en morzo de /996.

88

mary cyto.oxie T..Iymphocyte re'ponse,with DNA encoding herpe, simple. virusproloin.. J ViroI1994;68:5685-5689.

117. Ghio.i H, Coi S. Slonino S. No.burnA8 ond Wachsler Sl. Voccinolion o, micawith herpe, simple. virus type 1 glycopro-..in D DNA produce, low I.vels 01 protec.tion ooaínst lethal HSV.1 challenoe. AntivirR...1995;28:147-157.

118. Yong W, Woino GJ ond Memonu. DP.Anlibodio. lo Sch/s'osomo loponlcum

¡ ian blo<><!fluko¡ poromyo.in indueod bynucleic ocid vaccinotion. Bioch Biophys, ResComm 1995;212:1029-1039.

119. la; WC. Proleelion ogoin" Myco-plasmo pu/monls inleqion by genetic vacci.nolion. DNA CoU BioI1995;1~:643.651.

120. Jonkin. M, Korr D, Foyor R ond WolI R.S.rum and coSostrum anlibody responses in.ducod by ¡o'-injodion 01 .hoop ",ah DNA on-coding a Cryptosporidlum parvum ootigen.Voceino 1995;13:165B-1664.

121. DonneUy JJ. Prolodion ogoin,' popil-lomavirus with a polynucleotide voccine. JInl Di. 1996; 173:314-320.

Biol.cno/aglo Aplicado 1996; Vol. 13, No. 2