PowerPoint Presentation
Oleh:Mutiara RachelRizki OviantiSuci UtamiPembimbing: dr. Eva
Susana Putri,SpAn
JOURNAL READING
PENDAHULUAN
Propofol (2,6-diisopropyphenol) merupakan anastesi dan sering
digunakan sebagai sedasi jangka pendek ketika pembedahan yang juga
baik sebagai kombinasi terapi bagi pasien dengan penyakit yang
kritis. Propofol memberikian efek farmakodinamik yang beragam,
dimulai dari hipnosis pada general anastesi, dan juga amnestik yang
baik dan memberikan efek relaksasi otot.
Propofol juga memiliki peran sebagai imunomodulator dengan
menurunkan produki dari proinflamasi sitokin dan mengubah
biosintesi nitrit oxida (NO). Propofol menghambat fungsi neutrofil
(chemotaxis, attachment, migrasi, fagositosis, dan produksi dari
reactive oxygen species/ROS).
Propofol memberikan aktifitas antioxidant dengan cara
mengumpulkan radical bebas dan peroxynitrate sehingga menurunkan
stress oxidatic yang menimbulkan peroksidasi lipid. Karena aksi
anti inflamasi tersebut, efek farmakologi propafol hingga saat ini
masih diselidiki.
Pemberian propofol secara intavena memiliki efek anti-inflamasi
in vivo. Contohnya pada endotoximeal induced septik, propofol
menghambat produksi stimuli-induced dari proinflamasi sitokin dan
kemokin termasuk TNF-a, IL-1, IL-6, dan IL-8.
Lebih lanjut propofol menekan produksi pro-inflamasi sitokin dan
sintesis NO/biosintesis NO pada aktivasi endotoxin lipopolisakarida
(LPS) makrofag dan sel mononuklear darah perifer in vitro.
Propfol memiliki efek anti-inflamasi pada LPS-induced alveolar
tipe II ephitelial cell injury dengan menurunkan regulasi CD14 dan
menekan TLR 4. Propofol memoulasi LPS induce inflamasi pada sel
monosit THP1 dengan menghambat aktivitas cyclooxygenase..
Song et al menunjukan bahwa propofol menghambat aktivasi hepatic
nuclear factor(NF)-kB sehingga terjadi menurunan produksi
pro-inflamasi sitokin TNF-a dan IL-6
Chiu et al mengkomfirmasi mengenai efek inhibitor dari propofol
pada LPS atau lipoteichoic acid activated NF-kB pada makrofag.
Dibawah stress oxidatif yang menyebabkan inflamasi, propofol
menghalag phosphorylasi dan degradasi dari inhibitor kB (ikB)
kinase (IKK) dan iKB, hasilnya berupa inaktivasi NF-kB pada
hepatosit. Stimulasi propofol juga menghambat LPS atau aktivasi
asam lipotoichoic, aktivasi protein mitogen kinase
(MAPK)/extraxellular, regulasi signal kinase (ERK), upstream
regulator NF-kB nuclear translocation.
Infeksi bakteri gram negatif menyebabkan endotoxemia yang
menyebabkan syndrom kegagalan/disfungsi multiple organ, atau bisa
juga menimbulkan penyakit yang mengancam nyawa seperti shock
septic.
Inflamasi organ sistemik berat mengambil peran terhadap
terjadinya sepsis, oleh karena itu pemberian agent anti-inflamasi
untuk melindungi sel dari kerusakan seluler karena LPS. Inhibisi
sinyal LPS menimbulkan proses anti-inflamasi.
Latar Belakang Masalah
Anastesi propofol memiliki efek immunomodulator, terutama
sebagai anti-inflamasi. Endotoxin liposakarida pada bakteri
merangsang inflamasi melalui 4 sinyal toll-like receptor (TLR).
Tujuan Penelitian
Penelitian ini mencari tau mekanisme molekuler dari propofol
terhadap LPS/TLR4 yang merangsang aktivas inflamasi pada murine
macrophage RAW264.7
Materials and Methods
Reagent
Propofol
LPS (lipopolisakarida)qqq derivad E-coli dilarutkan dalam saline
phosphate-buffered steril (PBS)
NF-kB inhibitor pyrrolidine dithiocarbamate (PBDTC),
Phospoinositide-3 kinase(PI3K) inhibitor LY294002, PP2A inhibitor
okadaic acid (OA), Antioxidant diphenyl iodonium (DPI), dilarutkan
dalam DMSO untuk didilusi dengan PBS
Rabbit anti-mouse iNOS, IKKB, Phopoho-IKKB (ser180), NF-kB,
phospho-p38 MAPK (Thr180/Tyr 182), JNK, phospho-JNK (Thr180/Tyr
185), ERK1/2, phospho-Akt (Scr473), p38 MAPK, phospo-ERK1/2, PTEN
dan phopsp-PTN
Antibodi B-actin dan horseradish perogsidase-conjugated
anti-rabbit IgG
Animal Treatment
Penelitian ini menggunakan 6 anak tikus jantan berusia 6 minggu,
diberimakan seperti biasa dan air yang ditambah libitum,
masing-masing disuntikan 15mg/kg LPS derivat E-coli yang dilarutkan
kedalam PBS steril, konsetntrasi dari volume total yaitu
20uL/injeksi.
Untuk membuktikan peran anti-inflamasi pada propofol, anak tikus
diberi 5mg/kgb propofol yang diencerkan dengan PBS
Kultur cell
RAW264.7 murine makrofage, dibiakan didalam cawan petri dengan
2mM L-glutamine, dan 15mM HEPES disuplementasi dngan 10% serum
bivine fetal (FBS), 100 unit penisilin dan 100ug/ml streptomisin.
Disimpan dengan suhu 37C dangan atmosphere CO2 5%
Penilaian Viabilitas
Menggunakan penilaian WST-8, sel dikultur dalam 96 jaringan
didalam medium DMEM baik dengan adanya propofol dan tanpa propofol.
Reagent diberikan setelah 24 jam
Penilaian Citotoxixitas
Penilaain colorimetric digunakan untuk mengevaluasi kerusakan
sel dan aktivitas lactac dehydrogenase.
Penilaian Apoptosis
Apoptosis dianalisa menggunakan propidium iodide (PI)
Western Blotting
Cell yang telah dikumpulkan di lisis dengan buffer mengandung 1%
Triton X-100, Tris (pH7.5) 50mM, EDTA 10mM, 0.02% sodium azide dan
protease inhibitor coctail selama 5 menit.
Deteksi produksi NO
Produksi NO diukur sebagai akumulasi nitrin (NO2) didalam medium
menggunakan reaksi kolometrik dengan reagen Griess. Sampel dicampur
dengan perbandingan 1:1. Sodium nitrit dilarutkan dakam
double-distlled kemudian digunakan sebagai standar (1-50nM)
Cell kultur supernatants dan murine ascites dikumpulkan dan
dilihat kadar TNF-a, IL-6 dan IL-10 dengan perangkat ELISA
Immunocytochemistry staining
Seldidiamkan dalam 3.7% formaldehyd PBS selama 10 menit, setlah
dibersihkan 2x dengan PBS, lalu sel dicampurkan dengan nti-NF-kB
p65 antibodi, dinkubasi dalam semalam dengan suhu 4C. Selanjutnya
dicuci lagi kemudian diinkubasi kembali selama 1 jam dalam suhu
ruangan, lalu dicucikembali dan dilihat melalui mikroskop
fluroroscent. Kemudian dihitung sell positif dalam tiga lapang
pandang.
Pengukuran ROS Intraselullar
Stress oxidative intraselular diukur dengan oksidasi
dichrodihydroflurescein diacetat. Sel ditanam selama semalaman
kemudian dicuci 2x dengan Hanks Buffered Salt Solution (HBSS)
sebelum dilakukan percobaan. Kadar ROS dikalkulasi dengan cara
melihat peningkatan persentasi dengan membandigkan dengan kontrol,
nilai kontrol normalnya hingga 100% dari nilai basal.
Analisa Statistik
Tiap kelompok diabndikan menggunakan t-test dua sisi atau
analisa ANOVA satu sisi, diikuti dengan test post-hic Dunnets.
Hasil analisis dianggap signifikan dengan p value
