JB Accepts, published online ahead of print on 3 …...2011/06/03 · m {|} ~ | ~ | ~ | ¡ ¢ £ ~ | £ ~ | ¨ ¢ © ª ~ | « £ ¬ ¤ | ® | ¯ ~ ®

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Regulation of flagella number by FliA and FlgM and the role in biofilm formation of 1 " R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s

. 2

"3" D a v i d A W i l k i n s o n , S a r a h J C h a c k o , C a t h e r i n e V é n i e n ' B r y a n , G e o r g e H W a d h a m s , J u d i t h P4 " A r m i t a g e *5 "6" O x f o r d C e n t r e f o r I n t e g r a t i v e S y s t e m s B i o l o g y a n d D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y , U n i v e r s i t y o f7" O x f o r d , S o u t h P a r k s R o a d , O x f o r d , O X 1 3 Q U , U . K .8"9" R u n n i n g T i t l e : T h e r e g u l a t o r y r o l e s o f F l i A a n d F l g M i n R . s p h a e r o i d e s1 0 "1 1 " * C o r r e s p o n d i n g A u t h o r1 2" E m a i l : j u d i t h . a r m i t a g e @ b i o c h . o x . a c . u k1 3" P h o n e : + 4 4 1 8 6 5 6 1 3 2 9 3

1 4

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Copyright © 2011, American Society for Microbiology and/or the Listed Authors/Institutions. All Rights Reserved.J. Bacteriol. doi:10.1128/JB.00349-11 JB Accepts, published online ahead of print on 3 June 2011

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A b s t r a c t1 5"1 6 " T h e F l g M s e c r e t i o n c h e c k p o i n t p l a y s a c r u c i a l r o l e i n c o o r d i n a t i n g b a c t e r i a l f l a g e l l a r a s s e m b l y .1 7 " H e r e w e i d e n t i f y a n e w r o l e f o r F l g M a n d F l i A a s p a r t o f a c o m p l e x r e g u l a t o r y n e t w o r k w h i c h1 8 " c o n t r o l s f l a g e l l a n u m b e r a n d i s e s s e n t i a l f o r e f f i c i e n t s w i m m i n g a n d b i o f i l m f o r m a t i o n i n t h e1 9 " m o n o t r i c h o u s b a c t e r i u m R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s .

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B a c t e r i a l m o t i l i t y a n d c h e m o t a x i s a r e i m p l i c a t e d i n c o m p l e x p r o k a r y o t i c b e h a v i o u r s s u c h a s2 1" b i o f i l m f o r m a t i o n , p a t h o g e n e s i s a n d s y m b i o s i s ( 1 , 1 2 ) . T h e m o n o t r i c h o u s a l p h a ± p r o t e o b a c t e r i u m2 2" R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s h a s c o m p l e x c h e m o t a x i s a n d m o t i l i t y s y s t e m s ( 1 0 , 1 1 , 1 3 ) a n d i s2 3" m e t a b o l i c a l l y d i v e r s e , a l l o w i n g i t t o e x p l o i t m a n y d i f f e r e n t e n v i r o n m e n t a l n i c h e s . R . s p h a e r o i d e s2 4" a n d r e l a t e d o r g a n i s m s a r e p r i m a r y c o l o n i s e r s o f s u r f a c e s i n c o a s t a l w a t e r s ( 3 ) . F l a g e l l a r a s s e m b l y2 5" i s a n e n e r g e t i c a l l y e x p e n s i v e a n d h i g h l y r e g u l a t e d p r o c e s s w h i c h i n o t h e r s p e c i e s h a s b e e n s h o w n2 6" t o b e i n t r i n s i c a l l y l i n k e d t o p r o c e s s e s s u c h a s b i o f i l m f o r m a t i o n ( 1 4 ) . T h i s s t u d y e x a m i n e d t h e2 7" r e g u l a t i o n o f s y n t h e s i s o f t h e s i n g l e f l a g e l l u m i n R . s p h a e r o i d e s . L i n k s b e t w e e n f l a g e l l u m2 8" s y n t h e s i s a n d b i o f i l m f o r m a t i o n w e r e a l s o e x p l o r e d .2 9" R . s p h a e r o i d e s a c h i e v e s s w i m m i n g m o t i l i t y v i a t h e u n i d i r e c t i o n a l r o t a t i o n o f a s i n g l e l a t e r a l l y3 0" p o s i t i o n e d f l a g e l l a r f i l a m e n t ( 2 , 5 ) . A s s e m b l y o f t h e R . s p h a e r o i d e s f l a g e l l a r m o t o r i s c o n t r o l l e d3 1" b y a m u l t i ± t i e r e d h i e r a r c h y o f g e n e e x p r e s s i o n w h i c h i s i n i t i a t e d b y t h e t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t i o n3 2" o f t h e c l a s s I m a s t e r r e g u l a t o r , F l e Q . F l e Q p r o m o t e s e x p r e s s i o n o f c l a s s I I f l a g e l l a r g e n e s3 3" i n c l u d i n g F l e T , w h i c h r e s u l t s i n f o r m a t i o n o f t h e F l e Q / F l e T c o m p l e x . C l a s s I I I f l a g e l l a r g e n e s3 4" a r e e x p r e s s e d f r o m F l e Q / F l e T d e p e n d a n t

j5 4 p r o m o t e r s , l e a d i n g t o c o m p l e t i o n o f t h e f l a g e l l a r3 5

" H o o k B a s a l B o d y ( H B B ) . C l a s s I V f l a g e l l a r g e n e e x p r e s s i o n i s t h e n t h o u g h t t o b e a c t i v a t e d u p o n3 6" t h e s e c r e t i o n o f t h e a n t i ± s i g m a f a c t o r F l g M t h r o u g h t h e H B B , r e s u l t i n g i n r e l e a s e o f t h e s i g m a3 7" f a c t o r , F l i A ( 1 0 ) . H e r e , w e s h o w t h a t F l i A / F l g M a c t i v i t y r e g u l a t e s n o t o n l y f l a g e l l a r s y n t h e s i s3 8" b u t a l s o t h e n u m b e r o f f l a g e l l a p e r c e l l . T h e c o r r e c t a s s e m b l y o f f l a g e l l a i s n o t o n l y e s s e n t i a l f o r3 9" m o t i l i t y , i n c o r r e c t a s s e m b l y a l s o l e a d s t o r e d u c e d b i o f i l m f o r m a t i o n i n R . s p h a e r o i d e s .4 0"

Regulation of Flagella Number by FliA and FlgM. T o d e t e r m i n e t h e e f f e c t s o f F l g M a n d F l i A4 1

" a c t i v i t y o n e x p r e s s i o n o f t a r g e t g e n e s f r o m c l a s s e s I I I a n d I V o f t h e f l a g e l l a r a s s e m b l y h i e r a r c h y4 2" o f R . s p h a e r o i d e s , c h r o m o s o m a l i n ± f r a m e d e l e t i o n s o f f l g M a n d f l i A w e r e i n c o r p o r a t e d i n t o b o t h4 3"


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w i l d â t y p e a n d a v a r i e t y o f f l u o r e s c e n t â f u s i o n b a c k g r o u n d s t r a i n s . P r o t e i n c o p y n u m b e r s w e r e4 4" d e t e r m i n e d u s i n g a f l u o r e s c e n c e â b a s e d t e c h n i q u e s i m i l a r t o t h a t d e t a i l e d i n ( 1 5 ) ; f l u o r i m e t r y4 5 " m e a s u r e m e n t s o f c e l l u l a r s a m p l e s i n a F L U O S T A R O p t i m a p l a t e r e a d e r w e r e c o m p a r e d t o t h o s e4 6 " o f p u r i f i e d Y F P p r o t e i n o f k n o w n c o n c e n t r a t i o n s . W h e r e a n t i b o d i e s w e r e a v a i l a b l e , t h e r e s u l t s4 7 " w e r e c o n f i r m e d v i a q u a n t i t a t i v e w e s t e r n b l o t a n a l y s i s o f t h e w i l d â t y p e p r o t e i n l e v e l s .4 8 " F u s i o n p r o t e i n s w e r e c h o s e n t o r e f l e c t t h e d i f f e r e n t c l a s s e s o f t h e f l a g e l l a r a s s e m b l y h i e r a r c h y .4 9 " T h e s t a t o r p r o t e i n Y F P â M o t B , t h e s w i t c h p r o t e i n Y F P â F l i M a n d t h e a n t i â s i g m a f a c t o r F l g M â5 0 " Y F P , a r e a l l k n o w n t o b e e n c o d e d a s p a r t o f F l e Q / F l e T d e p e n d a n t , c l a s s I I I , o p e r o n s ( m o t A B ,5 1 " f l i K L M N O a n d f l h A , r e s p e c t i v e l y ) ( 9 ) . Y F P â C h e W 3 a n d C h e W 4 â Y F P , c o m p o n e n t s o f t h e t w o5 2" p a t h w a y s e s s e n t i a l f o r c h e m o t a x i s i n R . s p h a e r o i d e s ( e n c o d e d w i t h i n c h e O p 2 a n d c h e O p 3 ,5 3" r e s p e c t i v e l y ) , w e r e c h o s e n a s c l a s s I V g e n e r e p o r t e r s . E x p r e s s i o n o f c h e O p 2 h a s p r e v i o u s l y b e e n5 4 " o b s e r v e d t o b e r e g u l a t e d b y F l i A i n R . s p h a e r o i d e s ( 7 ) . I n c o r p o r a t i o n o f f l i A a n d f l g M i n t o t h e5 5 " I P T G i n d u c i b l e e x p r e s s i o n v e c t o r p I n d 4 ( 6 ) a l l o w e d t h e r e i n t r o d u c t i o n a n d o v e r â e x p r e s s i o n o f5 6 " t h e s e g e n e s w i t h i n t h e r e l e v a n t d e l e t i o n b a c k g r o u n d s t r a i n s ( T a b l e 1 ) .5 7 " T a b l e 1 s h o w s t h a t u n d e r t h e t e s t e d g r o w t h c o n d i t i o n s ( a l l c u l t u r e s w e r e g r o w n i n a m i n i m a l5 8 " m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h 7 . 5 m M s o d i u m s u c c i n a t e a n d 0 . 1 % c a s a m i n o a c i d s ( s u x m e d i u m )5 9 " ( 7 ) , a t 3 0 ° C w i t h s h a k i n g ) , b o t h c h e O p 2 a n d c h e O p 3 w e r e r e g u l a t e d b y F l i A ; f l g M d e l e t i o n a n d6 0 " f l i A o v e r â e x p r e s s i o n i n c r e a s e d c h e m o t a x i s g e n e e x p r e s s i o n , w h e r e a s f l i A d e l e t i o n r e d u c e d6 1 " c e l l u l a r l e v e l s o f b o t h c l a s s I V Y F P â C h e W 3 a n d C h e W 4 â Y F P . F l g M â Y F P e x p r e s s i o n a l s o6 2" s h o w e d a h i g h d e p e n d e n c e o n F l i A a c t i v i t y d e s p i t e b e i n g e n c o d e d a s p a r t o f t h e c l a s s I I I f l g A6 3 " o p e r o n ( 1 0 ) . T h i s s u g g e s t s t h a t c l a s s I I I p r o m o t e r a c t i v i t y m a y a c h i e v e b a s a l â l e v e l s o f e x p r e s s i o n6 4 " o f F l g M w i t h l a r g e r c h a n g e s i n t h e c e l l u l a r c o n c e n t r a t i o n o f F l g M b e i n g c o n t r o l l e d b y i n c r e a s e d6 5 " F l i A a c t i v i t y .6 6 "


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I n t e r e s t i n g l y , t h e e x p r e s s i o n o f t w o c h r o m o s o m a l l y d i s t a n t c l a s s I I I f l a g e l l a r g e n e s , M o t B W Y F P6 7" a n d Y F P W F l i M , i n c r e a s e d g r e a t l y u p o n b o t h d e l e t i o n o f f l i A a n d o v e r W e x p r e s s i o n o f f l g M b u t6 8" r e d u c e d u p o n d e l e t i o n o f f l g M a n d o v e r W e x p r e s s i o n o f f l i A . T h i s s u g g e s t s t h a t F l i A m a y r e p r e s s6 9" f l a g e l l a r s y n t h e s i s a s p a r t o f a f e e d b a c k l o o p w i t h i n t h e f l a g e l l a r a s s e m b l y p a t h w a y . A l t h o u g h7 0" c l a s s I I I g e n e e x p r e s s i o n i n c r e a s e d u p o n o v e r W e x p r e s s i o n o f F l g M , c h e m o t a x i s g e n e e x p r e s s i o n7 1" w a s t h e s a m e a s t h e p a r e n t a l Äf l g M s t r a i n , s h o w i n g t h a t t h e m e c h a n i s m o f r e g u l a t i n g c l a s s I V7 2" a n d c l a s s I I I g e n e s i s d i f f e r e n t .7 3" A s R . s p h a e r o i d e s i s m o n o t r i c h o u s , r e p r e s s i o n o f f l a g e l l a r s y n t h e s i s w a s p r e d i c t e d t o a f f e c t t h e7 4" n u m b e r o f c e l l s p o s s e s s i n g f u l l y f o r m e d f l a g e l l a w i t h i n a p o p u l a t i o n . T h e r e f o r e t h e p r o p o r t i o n o f7 5" m o t i l e c e l l s i n m i d W l o g p h a s e c u l t u r e s w a s e s t i m a t e d i n p h a s e W c o n t r a s t m i c r o s c o p y v i d e o s ( F i g .7 6" 1 B ) a n d f i l a m e n t s w e r e o b s e r v e d a n d t h e i r n u m b e r s c o u n t e d f o r > 1 0 0 n e g a t i v e l y W s t a i n e d c e l l s7 7" u s i n g a P h i l i p s C M 1 2 0 e l e c t r o n m i c r o s c o p e ( F i g . 1 D ) . S w i m m i n g b e h a v i o u r w a s a l s o a s s e s s e d7 8" o n s o f t W a g a r s w i m p l a t e s c o n t a i n i n g 0 . 1 m M p r o p i o n a t e w i t h F l i A a n d F l g M l e v e l s v a r i e d u s i n g7 9" t h e p I n d 4 e x p r e s s i o n v e c t o r a n d d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f I P T G ( F i g . 1 A ) . S o f t W a g a r s w i m8 0" p l a t e s m e a s u r e s w i m m i n g i n r e s p o n s e t o c h e m o s e n s o r y g r a d i e n t s , i n a g r o w i n g p o p u l a t i o n o f8 1" c e l l s . I f o n l y a s m a l l s u b s e t o f t h e p o p u l a t i o n d e v e l o p f u n c t i o n a l f l a g e l l a i t m a y b e o b v i o u s i n8 2" s w i m p l a t e s , b u t n o t m i c r o s c o p i c a l l y . A l t e r n a t i v e l y , i f t h e c h e m o s e n s o r y s y s t e m i s i m p a i r e d ,8 3" c e l l s m a y b e s e e n t o s w i m m i c r o s c o p i c a l l y , b u t n o t m o v e o n s w i m p l a t e s .8 4" A s h a d p r e v i o u s l y b e e n o b s e r v e d ( 7 ) , d e l e t i o n o f f l i A r e s u l t e d i n n o n W m o t i l e c e l l s w i t h n o8 5" f l a g e l l a r f i l a m e n t s . W h e n i n t r a c e l l u l a r a n d e x t r a c e l l u l a r f l a g e l l i n ( F l i C ) w a s s e p a r a t e d b y8 6" f i l a m e n t W s h e a r i n g a n d c e n t r i f u g a t i o n , n o n e w a s d e t e c t a b l e i n w e s t e r n b l o t a n a l y s e s o f e i t h e r8 7" f r a c t i o n ( F i g . 1 C ) . I n t r o d u c t i o n o f p I n d 4 : f l i A i n t h e a b s e n c e o f I P T G w a s s u f f i c i e n t t o r e s t o r e8 8" b o t h w i l d W t y p e p r o p o r t i o n s o f s w i m m i n g c e l l s a n d w i l d W t y p e s w i m m i n g b e h a v i o u r t o t h e d e l e t i o n8 9"


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b a c k g r o u n d , a s w e l l a s w i l d � t y p e l e v e l s o f i n t r a c e l l u l a r a n d e x t r a c e l l u l a r F l i C . H o w e v e r ,9 0" u n e x p e c t e d l y , o v e r � e x p r e s s i o n o f f l i A i n l i q u i d c u l t u r e s i n t h e p r e s e n c e o f 5 0 ° M I P T G r e s u l t e d9 1" i n t h e m a j o r i t y o f c e l l s b e i n g n o n � m o t i l e w i t h n o v i s i b l e f i l a m e n t s o b s e r v e d b y e l e c t r o n9 2" m i c r o s c o p y . T h i s o b s e r v a t i o n w a s a l s o s u p p o r t e d b y s o f t � a g a r s w i m p l a t e d a t a , w h e r e a r e d u c t i o n9 3" i n s w i m � d i a m e t e r w a s s e e n a t h i g h e r l e v e l s o f F l i A i n d u c t i o n . W e s t e r n b l o t a n a l y s i s s h o w e d t h a t9 4" i n t r a c e l l u l a r F l i C e x p r e s s i o n i n c r e a s e d a n d e x t r a c e l l u l a r F l i C d e c r e a s e d r e l a t i v e t o w i l d � t y p e9 5" w h e n F l i A w a s o v e r � e x p r e s s e d , s u g g e s t i n g t h a t f l a g e l l i n s e c r e t i o n w a s r e d u c e d u n d e r t h e s e9 6" c o n d i t i o n s .9 7" D e l e t i o n o f f l g M a l s o g r e a t l y r e d u c e d R . s p h a e r o i d e s m o t i l i t y , w i t h t h e p r o p o r t i o n o f s w i m m i n g9 8" c e l l s a n d t h e n u m b e r o f v i s i b l e f i l a m e n t s w i t h i n a p o p u l a t i o n b e i n g s i g n i f i c a n t l y l o w e r e d .9 9" I n t r a c e l l u l a r F l i C e x p r e s s i o n w a s s e e n t o i n c r e a s e s l i g h t l y u p o n d e l e t i o n o f f l g M , w h e r e a s1 0 0" e x t r a c e l l u l a r F l i C d e c r e a s e d . I n t r o d u c t i o n o f p I n d 4 :f l g M r e c o v e r e d a p r o p o r t i o n o f s w i m m i n g1 0 1" c e l l s , a n d s w i m � d i a m e t e r s w e r e s e e n t o i n c r e a s e a b o v e t h o s e o f

Äf l g M . W h e n f l g M w a s o v e r �1 0 2

" e x p r e s s e d , t h e a m o u n t o f b o t h i n t r a c e l l u l a r a n d e x t r a c e l l u l a r F l i C w a s a s w i l d � t y p e , h o w e v e r1 0 3" t h e r e w a s a s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n t h e p r o p o r t i o n o f c e l l s t h a t c o u l d s w i m m i c r o s c o p i c a l l y a n d1 0 4" s w i m � d i a m e t e r s o n s w i m p l a t e s . T h e r e w a s a l s o a n i n c r e a s e i n t h e n u m b e r o f c e l l s t h a t p o s s e s s e d1 0 5" e i t h e r z e r o o r m u l t i p l e f l a g e l l a w h e n o b s e r v e d b y E M . T h e s e d a t a s u g g e s t t h a t F l g M a c t i v i t y i s1 0 6" e s s e n t i a l i n r e g u l a t i n g f l a g e l l a r n u m b e r a n d t h e r a t e a t w h i c h f l a g e l l a a s s e m b l e . R e l i e v i n g F l i A ’ s1 0 7" r e p r e s s i o n o f c l a s s I I I g e n e e x p r e s s i o n b y o v e r � e x p r e s s i n g F l g M m a y i n c r e a s e t h e r a t e a t w h i c h1 0 8" H B B s c a n f o r m , r e s u l t i n g i n i n c r e a s e d t y p e I I I s e c r e t i o n a n d e x p l a i n i n g t h e a p p e a r a n c e o f1 0 9" m u l t i p l e f l a g e l l a . I n w i l d � t y p e c e l l s , t h e s e c r e t i o n o f F l g M w o u l d i n c r e a s e F l i A ’ s i n h i b i t i o n o f1 1 0" c l a s s I I I g e n e e x p r e s s i o n , i n h i b i t i n g f o r m a t i o n o f a s e c o n d f l a g e l l u m .1 1 1"


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7"

"

T h e m e c h a n i s m o f c l a s s I I I g e n e r e p r e s s i o n b y F l i A r e m a i n s u n k n o w n a n d t h i s i n h i b i t i o n m a y1 1 2" a l s o a f f e c t t h e e a r l i e r , c l a s s I a n d c l a s s I I f l a g e l l a r g e n e s . F e e d b a c k i n h i b i t i o n o f f l a g e l l a r1 1 3 " a s s e m b l y b y F l i A d e m o n s t r a t e s a n e w r o l e f o r t h e F l g M s e c r e t i o n c h e c k p o i n t i n a m o n o t r i c h o u s1 1 4 " b a c t e r i u m , r e p r e s s i n g s y n t h e s i s o f a s e c o n d f l a g e l l u m u p o n c o m p l e t i o n o f t h e f i r s t . T h e R .1 1 5 " s p h a e r o i d e s s i n g l e f l a g e l l u m i s r a n d o m l y p o s i t i o n e d r a t h e r t h a n p o l a r . T h i s i s s u p p o r t e d b y t h e1 1 6 " l a c k o f F l h F a n d F l h G , s h o w n t o p o s i t i o n p o l a r f l a g e l l a ( 5 ) . T h e s y s t e m o f r e g u l a t i n g f l a g e l l a r1 1 7 " p o s i t i o n i n p e r i t r i c h o u s s y s t e m s i s u n k n o w n a n d i t i s i n t e r e s t i n g t h a t f i l a m e n t p o s i t i o n s a p p e a r e d1 1 8" r a n d o m i n F l g M o v e r e x p r e s s i n g R . s p h a e r o i d e s c e l l s t h a t h a d a n i n c r e a s e d n u m b e r o f f i l a m e n t s .1 1 9 "

Motility defects in FliA and FlgM mutants impair biofilm formation. I n t e r e s t i n g l y , a n1 2 0

" o b v i o u s p h e n o t y p i c d i f f e r e n c e i n t h e m u t a n t s t e s t e d a b o v e w a s t h e i r a b i l i t y t o s t i c k t o s u r f a c e s1 2 1" a n d f o r m b i o f i l m s . M o t i l i t y i s k n o w n t o b e e s s e n t i a l f o r b i o f i l m f o r m a t i o n i n m a n y d i f f e r e n t1 2 2 " b a c t e r i a l s p e c i e s ( 1 , 8 , 1 4 ) , a l t h o u g h l i t t l e i s k n o w n a b o u t R . s p h a e r o i d e s b i o f i l m s . I n s t a t i c1 2 3 " c u l t u r e s , t h e f l i A a n d f l g M m u t a n t s s h o w e d d i f f e r e n t s u r f a c e g r o w t h p r o p e r t i e s c o m p a r e d t o w i l d 1 2 4 " t y p e c e l l s w h e n e x p r e s s i n g C F P o r Y F P f r o m p I n d 4 , a n d v i s u a l i s e d o n a N i k o n A 1 R c o n f o c a l1 2 5 " m i c r o s c o p e a f t e r 4 8 7 2 h o u r s ( F i g . 2 ) .1 2 6" W i l d t y p e c e l l s f o r m e d c l a s s i c a l b i o f i l m s w i t h p i l l a r s u p t o 2 0 � m h i g h . F l i A a n d F l g M a c t i v i t y1 2 7 " h a d n o e f f e c t o n E P S p r o d u c t i o n w h e n m e a s u r e d u s i n g 1 0 � M c a l c o f l u o r i n p l a t e s t a i n i n g ( d a t a1 2 8 " n o t s h o w n ) . H o w e v e r , Äf l g M o n l y p r o d u c e d s m a l l m i c r o c o l o n i e s o n s u r f a c e s a n d Äf l i A p r o d u c e d1 2 9 " n e i t h e r b i o f i l m s n o r m i c r o c o l o n i e s , s u g g e s t i n g t h a t m o t i l i t y i s r e q u i r e d f o r s u r f a c e a d h e s i o n a n d1 3 0" b i o f i l m n u c l e a t i o n u n d e r s t a t i c c o n d i t i o n s . I n t e r e s t i n g l y , w h e n g r o w n a s c o c u l t u r e s w i t h w i l d 1 3 1 " t y p e c e l l s , n e i t h e r Äf l i A n o r Äf l g M c e l l s g r e w w i t h i n d e v e l o p i n g w i l d t y p e b i o f i l m s , b u t r e m a i n e d1 3 2 " p l a n k t o n i c , s u g g e s t i n g e i t h e r t h a t m o t i l i t y o r g e n e s r e g u l a t e d b y F l i A a n d F l g M a r e r e q u i r e d f o r1 3 3 " d e v e l o p m e n t w i t h i n g r o w i n g b i o f i l m s .1 3 4 "


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8"

"

H e r e , F l i A a n d F l g M h a v e b e e n s h o w n t o b e p a r t o f a c o m p l e x r e g u l a t o r y n e t w o r k c o n t r o l l i n g1 3 5" e x p r e s s i o n o f l a t e f l a g e l l a r g e n e s a n d c h e m o t a x i s g e n e s w i t h i n R . s p h a e r o i d e s ( F i g . 3 ) . B o t h f l i A1 3 6 " a n d f l g M a r e e s s e n t i a l f o r t h e c o o r d i n a t e d s y n t h e s i s o f a s i n g l e f l a g e l l u m . D i s r u p t i o n o f e i t h e r1 3 7 " g e n e r e s u l t s i n a d r a m a t i c d e c r e a s e i n p o p u l a t i o n m o t i l i t y a n d t h e a b i l i t y t o f o r m b i o f i l m s . A s1 3 8" w e l l a s p r o m o t i n g t h e c o m p l e t i o n o f f l a g e l l a r a s s e m b l y b y u p [ r e g u l a t i n g t h e e x p r e s s i o n o f c l a s s1 3 9 " I V f l a g e l l a r g e n e s ( i n c l u d i n g f l a g e l l i n ) , t h e i n c r e a s e i n F l i A a c t i v i t y t h a t o c c u r s u p o n F l g M1 4 0 " s e c r e t i o n a l s o r e g u l a t e s f l a g e l l a r n u m b e r i n R . s p h a e r o i d e s b y r e p r e s s i n g f u r t h e r e x p r e s s i o n o f1 4 1" e a r l y f l a g e l l a r g e n e s o n c o m p l e t i o n o f t h e f i r s t H B B . A l t h o u g h t h e m e c h a n i s m f o r F l i A ’ s1 4 2 " r e p r e s s i o n o f e a r l y f l a g e l l a r g e n e e x p r e s s i o n r e m a i n s u n k n o w n , t h e a l l [ o r [ n o n e n a t u r e o f F l g M1 4 3 " s e c r e t i o n t h r o u g h a s i n g l e f l a g e l l u m i n R . s p h a e r o i d e s m a k e s t h i s a t r u e c h e c k p o i n t i n t h e1 4 4 " f l a g e l l a r a s s e m b l y h i e r a r c h y . I n t e r e s t i n g l y , F l g M m u t a t i o n s i n s o m e o t h e r s p e c i e s a l s o a f f e c t1 4 5 " m o t i l i t y ( 4 ) , s u g g e s t i n g t h a t t h i s m e c h a n i s m m a y a l s o b e u s e d b y o t h e r m o n o t r i c h o u s b a c t e r i a t o1 4 6 " r e g u l a t e f l a g e l l a n u m b e r .1 4 7" T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y t h e B B S R C a n d t h e O x f o r d C e n t r e f o r I n t e g r a t i v e S y s t e m s B i o l o g y .1 4 8"


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9"

"

References: 1 4 9

" 1 .Anderson, J. K., T. G. Smith, and T. R. Hoover. 2 0 1 0 . S e n s e a n d s e n s i b i l i t y :1 5 0 " f l a g e l l u m � m e d i a t e d g e n e r e g u l a t i o n . T r e n d s M i c r o b i o l

18:3 0 � 3 7 .1 5 1 " 2 .

Armitage, J. P., and R. M. Macnab.1 9 8 7 . U n i d i r e c t i o n a l , i n t e r m i t t e n t r o t a t i o n o f t h e1 5 2 " f l a g e l l u m o f R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s . J B a c t e r i o l

169:5 1 4 � 5 1 8 .1 5 3 " 3 .

Dang, H. Y., and C. R. Lovell. 2 0 0 2 . N u m e r i c a l d o m i n a n c e a n d p h y l o t y p e d i v e r s i t y o f1 5 4 " m a r i n e R h o d o b a c t e r s p e c i e s d u r i n g e a r l y c o l o n i z a t i o n o f s u b m e r g e d s u r f a c e s i n c o a s t a l1 5 5" m a r i n e w a t e r s a s d e t e r m i n e d b y 1 6 S r i b o s o m a l D N A s e q u e n c e a n a l y s i s a n d f l u o r e s c e n c e1 5 6 " i n s i t u h y b r i d i z a t i o n . A p p l E n v i r o n M i c r o b

68:4 9 6 � 5 0 4 .1 5 7 " 4 .

Ding, L., Y. Wang, Y. Hu, S. Atkinson, P. Williams, and S. Chen. 2 0 0 9 . F u n c t i o n a l1 5 8 " c h a r a c t e r i z a t i o n o f F l g M i n t h e r e g u l a t i o n o f f l a g e l l a r s y n t h e s i s a n d m o t i l i t y i n Y e r s i n i a1 5 9" p s e u d o t u b e r c u l o s i s . M i c r o b i o l o g y

155:1 8 9 0 � 1 9 0 0 .1 6 0 " 5 .

Haya, S., Y. Tokumaru, N. Abe, J. Kaneko, and S. Aizawa. 2 0 1 1 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f1 6 1" L a t e r a l F l a g e l l a o f S e l e n o m o n a s r u m i n a n t i u m . A p p l E n v i r o n M i c r o b i o l

77:2 7 9 9 � 2 8 0 2 .1 6 2 " 6 .Ind, A. C., S. L. Porter, M. T. Brown, E. D. Byles, J. A. de Beyer, S. A. Godfrey, and

1 6 3 "

J. P. Armitage. 2 0 0 9 . I n d u c i b l e � e x p r e s s i o n p l a s m i d f o r R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s a n d1 6 4 " P a r a c o c c u s d e n i t r i f i c a n s . A p p l E n v i r o n M i c r o b i o l75:

6 6 1 3 � 6 6 1 5 .1 6 5 " 7 .Martin, A. C., M. Gould, E. Byles, M. A. Roberts, and J. P. Armitage. 2 0 0 6 . T w o1 6 6

" c h e m o s e n s o r y o p e r o n s o f R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s a r e r e g u l a t e d i n d e p e n d e n t l y b y s i g m a1 6 7 " 2 8 a n d s i g m a 5 4 . J B a c t e r i o l188:

7 9 3 2 � 7 9 4 0 .1 6 8 " 8 .Merritt, P. M., T. Danhorn, and C. Fuqua. 2 0 0 7 . M o t i l i t y a n d c h e m o t a x i s i n1 6 9

" A g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s s u r f a c e a t t a c h m e n t a n d b i o f i l m f o r m a t i o n . J B a c t e r i o l1 7 0 "

189:8 0 0 5 � 8 0 1 4 .1 7 1 "


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1 0"

"

9 .Pena-Sanchez, J., S. Poggio, U. Flores-Perez, A. Osorio, C. Domenzain, G. Dreyfus,

1 7 2"

and L. Camarena. 2 0 0 9 . I d e n t i f i c a t i o n o f t h e b i n d i n g s i t e o f t h e s i g m a 5 4 h e t e r o Ø1 7 3 " o l i g o m e r i c F l e Q / F l e T a c t i v a t o r i n t h e f l a g e l l a r p r o m o t e r s o f R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s .1 7 4 " M i c r o b i o l o g y155: 1 6 6 9 Ø 1 6 7 9 .1 7 5 " 1 0 .

Poggio, S., A. Osorio, G. Dreyfus, and L. Camarena. 2 0 0 5 . T h e f l a g e l l a r h i e r a r c h y o f1 7 6 " R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s i s c o n t r o l l e d b y t h e c o n c e r t e d a c t i o n o f t w o e n h a n c e r Ø b i n d i n g1 7 7 " p r o t e i n s . M o l M i c r o b i o l58:

9 6 9 Ø 9 8 3 .1 7 8" 1 1 .

Porter, S. L., G. H. Wadhams, and J. P. Armitage. 2 0 1 1 . S i g n a l p r o c e s s i n g i n c o m p l e x1 7 9 " c h e m o t a x i s p a t h w a y s . N a t R e v M i c r o b i o l9: 1 5 3 Ø 1 6 5 .1 8 0 " 1 2 .

Wadhams, G. H., and J. P. Armitage. 2 0 0 4 . M a k i n g s e n s e o f i t a l l : b a c t e r i a l1 8 1 " c h e m o t a x i s . N a t R e v M o l C e l l B i o l5: 1 0 2 4 Ø 1 0 3 7 .1 8 2 " 1 3 .

Wadhams, G. H., A. C. Martin, A. V. Warren, and J. P. Armitage. 2 0 0 5 .1 8 3 " R e q u i r e m e n t s f o r c h e m o t a x i s p r o t e i n l o c a l i z a t i o n i n R h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s . M o l1 8 4" M i c r o b i o l

58:8 9 5 Ø 9 0 2 .1 8 5 " 1 4 .

Wang, Y., L. Ding, Y. Hu, Y. Zhang, B. Yang, and S. Chen. 2 0 0 7 . T h e f l h D C g e n e1 8 6 " a f f e c t s m o t i l i t y a n d b i o f i l m f o r m a t i o n i n Y e r s i n i a p s e u d o t u b e r c u l o s i s . S c i C h i n a C L i f e1 8 7 " S c i50:

8 1 4 Ø 8 2 1 .1 8 8 " 1 5 .Winkler, J., A. Seybert, L. Konig, S. Pruggnaller, U. Haselmann, V. Sourjik, M.

1 8 9"

Weiss, A. S. Frangakis, A. Mogk, and B. Bukau. 2 0 1 0 . Q u a n t i t a t i v e a n d s p a t i o Ø1 9 0 " t e m p o r a l f e a t u r e s o f p r o t e i n a g g r e g a t i o n i n E s c h e r i c h i a c o l i a n d c o n s e q u e n c e s o n p r o t e i n1 9 1 " q u a l i t y c o n t r o l a n d c e l l u l a r a g e i n g . E M B O J29:

9 1 0 Ø 9 2 3 .

1 9 2 "


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1 1"

"

1 9 3

"

Figure 1: Motility and Chemotaxis in Äf l i A

and Äf l g M

mutant strains. A) B a c t e r i a l s w i m &1 9 4 " d i a m e t e r s o n s o f t & a g a r s w i m p l a t e s . D i a m e t e r s a r e m e a s u r e d r e l a t i v e t o w i l d & t y p e . f l i A a n d f l g M1 9 5 " e x p r e s s i o n w e r e i n d u c e d i n t h e i r r e s p e c t i v e b a c k g r o u n d d e l e t i o n s t r a i n s b y t h e a d d i t i o n o f1 9 6 " d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f I P T G . D a t a f o r n o n & c h e m o t a c t i c ( J P A 1 3 0 1 ) a n d n o n & m o t i l e1 9 7 " ( J P A 1 2 1 5 ) c o n t r o l s t r a i n s a r e a l s o i n c l u d e d . E r r o r b a r s r e p r e s e n t t h e s t a n d a r d d e v i a t i o n o f t h r e e1 9 8" r e p e a t s o n t h r e e s e p a r a t e d a y s . B) T h e p r o p o r t i o n o f m o t i l e c e l l s w i t h i n a p o p u l a t i o n , m e a s u r e d1 9 9 " i n p h a s e & c o n t r a s t v i d e o s o f s w i m m i n g b a c t e r i a . N u m b e r s r e p r e s e n t t h e m e a n a n d s t a n d a r d2 0 0" d e v i a t i o n o f t h e a v e r a g e p r o p o r t i o n o f s w i m m i n g c e l l s o v e r a l l f r a m e s i n e a c h ~ 3 0 s e c o n d v i d e o2 0 1 " f o r t h r e e r e p e a t s o n t h r e e s e p a r a t e d a y s . T h e p r o p o r t i o n s a p p e a r l o w , a s n o n & m o t i l e c e l l s p e r s i s t2 0 2"


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1 2"

"

f r o m f r a m e t o f r a m e , w h e r e a s m o t i l e c e l l s e n t e r a n d l e a v e e a c h f i e l d o f v i e w q u i c k l y .C)

A n t i m2 0 3" F l i C w e s t e r n b l o t d a t a f o r b o t h i n t r a c e l l u l a r a n d e x t r a c e l l u l a r f r a c t i o n s o f t h e c e l l .

D) E M f l a g e l l a2 0 4 " t a l l y . T h e n u m b e r o f v i s i b l e f l a g e l l a o n i n d i v i d u a l c e l l s o f a n e g a t i v e l y m s t a i n e d p r e p a r a t i o n o f2 0 5 " m i d m l o g p h a s e c e l l s . E x a m p l e i m a g e s a r e d i s p l a y e d f o r e a c h c o n d i t i o n , s c a l e b a r s r e p r e s e n t 1 | m .2 0 6 " N u m b e r s i n b r a c k e t s s h o w t h e n u m b e r o f c e l l s w i t h c l e a r l y v i s i b l e d i v i s i o n s i t e s w i t h i n e a c h2 0 7 " s a m p l e . T h r o u g h o u t , f l i A + + r e p r e s e n t s t h e o v e r m e x p r e s s i o n o f p I n d 4 : f l i A a t 5 0 | M I P T G . f l g M + +2 0 8 " r e p r e s e n t s t h e o v e r m e x p r e s s i o n o f p I n d 4 : f l g M a t 1 0 0 | M I P T G .2 0 9"


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1 3"

"

2 1 0"

Figure 2: Äf l i A

and Äf l g M

mutants show impaired biofilm formation. E x a m p l e t w o ¤ c o l o u r2 1 1 " c o n f o c a l i m a g e s o f b i o f i l m s g r o w n f r o m m i x e d c u l t u r e s . S c a l e b a r s r e p r e s e n t 1 0 ³ m .2 1 2

" W T : y f p / W T : c f p(i), W T : y f p / Äf l i A : c f p

(ii), Äf l i A : y f p / W T : c f p

(iii), Äf l i A : y f p / Äf l i A : c f p

(iv),2 1 3 " W T : y f p / Äf l g M : c f p(v), Ä

f l g M : y f p / W T : c f p(vi), Ä

f l g M : y f p / Äf l g M : c f p(vii)

. T h e m e a n a n d2 1 4 " s t a n d a r d d e v i a t i o n f o r p e r c e n t a g e o c c u p a n c y o f Y F P a n d C F P ¤ c o n t a i n i n g b a c t e r i a i n a t l e a s t 1 52 1 5" i m a g e s f r o m b i o f i l m s g r o w n o n t h r e e s e p a r a t e d a y s w a s c a l c u l a t e d u s i n g c u s t o m M A T L A B2 1 6 " s o f t w a r e , a n d i s d i s p l a y e d b e n e a t h e a c h i m a g e . I m a g e a n a l y s i s w a s i m p o s s i b l e v i a t h i s m e t h o d2 1 7 " f o r p o p u l a t i o n s w h e r e v e r y f e w c e l l s w e r e s e e n t o f o r m m i c r o c o l o n i e s / b i o f i l m s

(N/A). I n d i v i d u a l2 1 8 " c o l o u r c o n t r a s t s h a v e b e e n a d j u s t e d u s i n g A d o b e P h o t o s h o p f o r p r i n t i n g p u r p o s e s .2 1 9 "


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1 4"

"

2 2 0

"

Figure 3: Schematic representation of FliA and FlgM within the flagellar assembly 2 2 1 "

pathway of R . s p h a e r o i d e s

. I n t h i s m o d e l , e x p r e s s i o n f r o m F l e Q / F l e T d e p e n d a n t c l a s s I I I2 2 2" p r o m o t e r s e n c o d i n g m o t A B , f l i K L M N O , f l g M a n d f l i A i s a c t i v a t e d b y e x p r e s s i o n o f t h e e a r l y2 2 3" f l a g e l l a r g e n e s a n d f l e Q . F l i A a c t i v i t y r e p r e s s e s t h e e x p r e s s i o n o f e a r l y f l a g e l l a r g e n e s ( b y a n2 2 4 " u n k n o w n m e c h a n i s m ) a n d p r o m o t e s e x p r e s s i o n o f t h e c l a s s I V g e n e s , i n c l u d i n g f l i C , t w o2 2 5" c h e m o t a x i s o p e r o n s a n d f l g M . T h i s a l l o w s c o m p l e t i o n o f t h e f i r s t f l a g e l l u m a n d i n h i b i t s2 2 6" p r o d u c t i o n o f a s e c o n d . F l g M i n h i b i t s F l i A a c t i v i t y , b u t i s i t s e l f s e c r e t e d f r o m t h e c e l l t e m p o r a l l y2 2 7" u p o n c o m p l e t i o n o f t h e H B B c o m p l e x , c o n t r o l l i n g c l a s s I I I a n d I V g e n e e x p r e s s i o n a n d2 2 8" m a i n t a i n i n g t h e m o n o t r i c h o u s n a t u r e o f t h e c e l l . A r r o w s r e p r e s e n t i n t e r a c t i o n s t h a t p r o m o t e2 2 9" e x p r e s s i o n . B a r s r e p r e s e n t i n h i b i t o r y i n t e r a c t i o n s o r p r o c e s s e s . T h e d o t t e d a r r o w d e n o t e s t h e2 3 0" f a c i l i t a t i o n o f H B B a s s e m b l y b y e x p r e s s i o n o f i t s c o m p o n e n t s . ‘ ? ’ i n d i c a t e s t h a t t h e m e c h a n i s m2 3 1 " o f i n h i b i t i o n o f t h e c l a s s I I I g e n e s i s u n k n o w n , a n d t h a t i t m a y o r m a y n o t b e a c h i e v e d v i a2 3 2" i n t e r a c t i o n w i t h t h e c l a s s I I I e n h a n c e r p r o t e i n s F l e Q a n d F l e T .2 3 3"


.org/D

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1 5"

"

Protein Flagellar

Gene Class

Copy Numbers

Wild-type Äf l i A

Äf l g M

Äf l i A , f l i A + +

Äf l g M , f l g M + +* Y F P / M o t B I I I 6 1 0 ± 2 0 1 7 0 0 ± 3 0 4 5 0 ± 3 0 / 1 5 0 0 ± 9 0Y F P / F l i M I I I 1 0 3 0 ± 1 8 0 3 7 6 0 ± 6 0 6 3 0 ± 2 0 / 3 6 0 0 ± 1 8 0F l g M / Y F P I I I / I V 8 2 0 0 ± 4 0 0 1 1 0 0 ± 2 0 0 N / A 2 7 6 0 0 ± 7 5 0 N / A* Y F P / C h e W 3 I V 8 7 0 0 ± 2 6 0 6 9 0 0 ± 2 7 0 1 0 3 0 0 ± 2 1 0 2 2 4 0 0 ± 1 3 0 0 1 0 9 0 0 ± 3 0 0* C h e W 4 / Y F P I V 1 2 7 0 0 ± 7 0 0 5 4 0 0 ± 9 0 0 1 5 7 0 0 ± 4 0 0 3 1 3 0 0 ± 7 8 0 1 5 5 0 0 ± 3 0 02 3 4

"

TABLE 1: T h e e f f e c t s o f f l g M a n d f l i A o n t a r g e t g e n e e x p r e s s i o n . C o p y n u m b e r s a r e m e a s u r e d2 3 5" b y f l u o r i m e t r y , a n d q u a n t i f i e d b y c o m p a r i s o n t o p u r i f i e d Y F P s a m p l e s o f k n o w n c o n c e n t r a t i o n .2 3 6" N u m b e r s r e p r e s e n t t h e m e a n a n d s t a n d a r d e r r o r o f a t l e a s t t h r e e i n d e p e n d e n t r e p e a t s . * I n d i c a t e s2 3 7" w h e r e s i m i l a r r e s u l t s w e r e a l s o o b s e r v e d v i a w e s t e r n b l o t a n a l y s i s . ‘ – ‘ i n d i c a t e s t h a t n o2 3 8" e x p r e s s i o n w a s d e t e c t a b l e . N / A i n d i c a t e s n o t a p p l i c a b l e . f l i A + + r e p r e s e n t s t h e o v e r � e x p r e s s i o n o f2 3 9" p I n d 4 : f l i A a t 5 0 � M I P T G . f l g M + + r e p r e s e n t s t h e o v e r � e x p r e s s i o n o f p I n d 4 :f l g M a t 1 0 0 � M2 4 0" I P T G .2 4 1"


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