2

IX WORKSHOP MRAMA – XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION

DIRECTOR GENERAL:Alfonso López de la CarreraDIRECTOR DE PRODUCCIÓN:

C.M. Gallegoproduccion@eypasa.com

REDACTORA JEFE:Alicia Díaz (Redactora Jefe)

redaccion@eypasa.comSID-Alimentaria:

Noemí Buenolegislacion@eypasa.com

DISEÑO Y MAQUETACIÓN:lucimagen

lucimagen@lucimagen.comADMINISTRACIÓN:Mª Ángeles TeruelMª Teresa Martínez

informacion@eypasa.com

ISSN: 1989-1512EDITA:

(Ediciones y Publicaciones Alimentarias, S.A.)C/ Genaro Álvarez de Castro, 38, local A

28010 - MadridTels. +34 91 446 96 59

Telefax: +34 91 593 37 44

ALIMENTARIA CONGRESOS considerará para su publicación todos aquellostrabajos de carácter técnico y científico relacionados con la tecnología, laelaboración y el control de los alimentos.

INSTRUCCIONES PARA LA PUBLICACIÓN DE ORIGINALES:Exclusivamente podrán remitirse para su publicación trabajos que no hayansido editados previamente en otras publicaciones, de cualquier naturaleza ocontenido editorial.El texto podrá ser redactado en español o en inglés.Las referencias bibliográficas se incluirán al final del texto, ordenadas según elorden de aparición o de cita en el texto, con numeración correlativa. La cita ollamada se hará presentando el número entre paréntesis.Para cada referencia bibliográfica sé detallará el nombre del autor o autores, eltítulo del artículo o capítulo, nombre de la revista, libro o publicación, el nº delvolumen, nº de la primera y última página y año de la publicación.El documento digital del trabajo debe ser guardado en formato .doc de MicrosoftWord (u otro tratamiento de texto) sin incorporar gráficos, esquemas, diseños oimágenes que serán guardadas aparte. En ningún caso se admitirán trabajos enotras aplicaciones ofimáticas como Power Point, Excell, etc.Las tablas, fotografías y gráficos se adjuntarán en un documento distinto deltexto, en formato JPEG, EPS, TIFF o BMP, con una resolución de 300 ppp (dpi).No se publicarán posters ni comunicaciones oralesLa extensión máxima de los documentos de las ponencias y/o conferenciasestará acordada con la organización en base a las cantidad de ponencias quese produzcan en el congreso, jornada o evento.La extensión acordada incluirá fotografías, cuadros, gráficas o cualquier otroelemento que no sea texto. El tipo de fuente utilizada será Times New Romancon un tamaño 11, márgenes superior e inferior a 2,5 cm. y derecho e izquierdoa 3 cm., interlineado sencillo y espaciado anterior y posterior a 0 pto.Los autores, deberán aparecer al menos con su nombre, cargo, lugar de trabajoy dirección de correo electrónico siendo optativa la aparición de dirección postaly teléfono.Los trabajos deben ser remitidos a la organización del congreso, jornada osimposio que centralizará, aprobará y remitirá conjuntamente los trabajos a laredacción de Alimentaria congresos.El autor concede expresamente todos los permisos y derechos necesarios parala publicación de los trabajos por él remitidos y que sean aceptados para supublicación, que podrá ser impresa o digital así como para su traducción,distribución, comunicación pública, o cualquier otra forma que Eypasa puedaconsiderar oportuna.Los autores quedan autorizados para la reproducción total o parcial de sustrabajos en la forma en que sean maquetados, compuestos y publicados porAlimentaria Congresos y Alimentaria, sin ningún tipo de restricción o limitacióncon la única condición de citar la procedencia.

NOTA: La empresa editora declina toda responsabilidad sobre el contenido delos artículos originales, cuya total responsabilidad es de sus correspondientesautores y de los comités organizadores de los congresos, jornadas o simposiosrecogidos en la presente publicación. Todos los derechos reservados.

NORMAS PARA LOS AUTORES

www.revistaalimentaria.eswww.eypasa.com

www.sid-alimentaria.com

3

IX WORKSHOP MRAMA

Monitorizacion por bioimpedancia en la industria alimentaria.Xavier Ferrando Martínez ................................................................................... 05

Transgénicos, Nutrigenética y Nutrigenómica en alimentación.Daniel Ramón Vidal .......................................................................................... 08

La polymerase chain reaction (PCR).Armand Sánchez Bonastre .................................................................................. 10

International harmonization of microbiological methods.Cécile Lahellec ............................................................................................... 14

La automatización total en un laboratorio de microbiología. Experiencia con técnicas rápidas en la industria alimentaria.Hilario Zapata Bozalongo .................................................................................... 20

Método para comprobar la limpiabilidad in situ de equipos para el procesado de los alimentos. EHEDG Documento nº2.Mª Irene Llorca Pellicer ..................................................................................... 22

Biosensores para bacterias patógenas en seguridad alimentaria.María Isabel Pividori ......................................................................................... 25

Detección de Vibrio Parahaemolyticus, Vibrio Cholerae y Vibrio Vulnificus por PCR a tiempo real.Verónica Blanco Abad y Jaime Martínez Urtaza .......................................................... 32

Sistemas BD para identificación.BD (Becton, Dickinson and Company) ...................................................................... 35

Sistema de Detección microbiológica BD MicroPro.(Becton, Dickinson and Company).......................................................................... 36

Validación del sistema de microbiología rápida Bactrac 4300 según ISO 16140:2003.Gomensoro.................................................................................................... 38

Introducing the new foodproof® RoboPrep+ Series for automated DNA extractionand PCR set-up.BIOTECON ..................................................................................................... 39

IX WORKSHOP MRAMA

5

IX WORKSHOP MRAMA

Medida de la impedancia en uncultivo: Una herramienta preci-sa y potente como técnica enMicrobiología rápida.Las técnicas basadas en lo que deno-minamos Microbiología Clásica se ba-san en la proliferación de los micro-organismos en los diferentes mediosnutritivos de cultivo. Típicamente se basan en la observa-ción directa de colonias, que han deser visibles a simple vista, para corro-borar la presencia de un determina-do microorganismo y obtener el re-cuento del mismo en el alimento deorigen.Para conseguirlo existen diferentesmétodos siendo los más comunes lasiembra directa en placas estánda-res de medios nutritivos con agaressemisólidos (siembra directa en su-perficie, siembra por vertido en masay siembra espiral con dilución entreotras). Para obtener un resultado, esdecir las colonias visibles, requerire-mos de un tiempo y de una tempera-tura de incubación que haga óptimo elcrecimiento de los microorganismosque conformarán una colonia. Estacolonia suele estar formada por un to-tal de 10^8 – 10^9 células aproxima-damente y los tiempos de incubaciónoscilan, en los métodos más genera-les, entre las 24 y las 72 horas apro-ximadamente (con la excepción demicroorganismos esporulantes dondepueden ser más largos).Además en la mayoría de ocasionesvamos a requerir de diluciones delcontenido de la muestra para llegar aobservar colonias bien definidas y ais-ladas de forma que hagan posible elrecuento. Esto implica que el recuen-to estará en relación a un factor de di-lución de la muestra conocido y que

será utilizado para calcular el núme-ro total de microorganismos en el ali-mento en origen. La medida por bioimpedancia, de lamisma manera que en el anterior caso,se basa también en la capacidad proli-ferativa de los microorganismos en unmedio de cultivo. En esta ocasión semonitoriza la actividad metabólica enun caldo nutritivo. El metabolismo es elconjunto de reacciones bioquímicasque sustentan la vida y el crecimientomicrobiano asimilando los nutrientesdel medio.

La actividad metabólica de los microor-ganismos comporta la transformaciónde moléculas de nutrientes complejasy a menudo con poca polaridad en me-tabolitos más simples, de menor pesomolecular y mayor polaridad (ácidos or-gánicos). Estos actúan como electroli-tos en el caldo nutritivo mejor que losnutrientes (peptonas, polisacáridos).En el caldo de cultivo la presencia deestos nuevos electrolitos confierencambios en los parámetros electroquí-micos del medio líquido tales como laconductancia, la capacitancia y la im-

Xavier Ferrando Martínez Responsable Área MicrobiologíaClinical Nutrition, S.A.xavier.ferrando@clinicalnutrition.es

MMonitorizacion porbioimpedancia en la industriaalimentaria

Fig. 1.- Representación gráfica.

IX WORKSHOP MRAMA

6

pedancia. Concretamente este últimoes al cual nos referimos en relación ala técnica que describimos en este ar-tículo.Se trata de medir estos cambios elec-troquímicos en un caldo de cultivo yque son monitorizados continuamentedurante todo el periodo de incubación,en unas condiciones nutritivas especí-fico-selectivas para un microorganis-mo/s objeto del estudio y a una tem-peratura de incubación óptima para sucrecimiento. Quiere decirse con estoque al tratarse también de un cultivomicrobiano se requiere también untiempo total de incubación para el es-tudio, aunque generalmente en la ma-yoría de protocolos no será superior alas 24-48 horas.Los cambios registrados en la impe-dancia ofrecen resultados más rápidosen la detección y recuento de los micro-organismos de estudio. Esto se debea que los cultivos líquidos son másapropiados para las necesidades nu-tricionales y las tasas de crecimientoserán mayores. Así por ejemplo, gra-cias del sistema basado en laImpedancia de Corte (1) los resultadosse obtienen cuando la población delmicroorganismo en cuestión se en-cuentra en una tasa de 10^6 -10^7 cé-lulas en el medio de crecimiento. Estoes unos tres órdenes de magnitud de-cimal menos de lo que es necesariopara obtener una colonia visible, yasea recuento o investigación, en unaplaca estándar con agar nutritivo semi-sólido.La sencillez de la técnica reside tam-bién en que los medios nutritivos utili-zados son equivalentes a los utilizadosen Microbiología clásica. La especifici-dad de estos se debe, de la misma ma-nera que los medios clásicos, a suscomposiciones galénicas. La sensibi-lidad en esta técnica se considera des-de una unidad formadora de colonia(u.f.c.) por muestra puesto que, si tie-ne capacidad proliferativa, su actividadmetabólica aportará desde la primeracélula cambios en las propiedadeselectroquímicas del medio.

Desarrollo de la señal en un ins-trumento BacTrac 4300 de Sy-Lab: Impedancia directa delmedio, Impedancia directa delelectrodo, Impedancia indirec-ta y Análisis de la Impedanciade CorteEl aumento de metabolitos con cargapolar va a producir, en el transcurso dela incubación, una disminución de la re-sistencia (impedancia) que opone elmedio líquido cuando aplicamos unacorriente eléctrica. Esta puede ser me-dida por el instrumento mediante unoselectrodos inmersos en el medio de losque disponen unas celdillas especiales(Fot. 2). A través de estos electrodosel equipo registra cambios en la señaleléctrica del medio. Cuando los cam-bios registrados de la impedancia sonen la superficie del electrodo, inmersoen el medio, diremos que se trata deuna impedancia directa del electrodo ytiene un valor E. Cuando registramoscambios de la impedancia del medio(caldo de cultivo) se trata de una im-pedancia directa de valor M.Existe otra posibilidad que hace que loscambios del valor de la impedancia, devalor M, se realicen en un segundo es-pacio líquido que es diferente al mediode crecimiento. Se basa en la utiliza-ción de un medio valorable que, por ac-

ción también del metabolismo micro-biano, se va a ver modificado en suspropiedades electroquímicas. Se tratade la Impedancia Indirecta y el valor re-gistrado es la variación de la impedan-cia M medida normalmente en una so-lución de potasa llevada a saturación.Se fundamenta en la producción dedióxido de carbono como producto finalde la respiración microbiana en condi-ciones aeróbicas. El dióxido de carbo-no se disuelve en la solución de pota-sa formándose carbonato potásico,

IX WORKSHOP MRAMA

Fot. 1.- Equipos BacTrac 4300 Sy-Lab.

Fot. 2.- Celdillas impedancia.

7

menos conductor que el hidróxido po-tásico, cosa que provocará un aumen-to de la impedancia M en este medio.

CO2 + 2 OH- → CO32- + H2O

Los resultados se representan comocambios relativos en porcentaje del va-lor de la impedancia (M y E) a lo largode la incubación respecto a un valorconocido inicial. En la representacióngráfica estos valores definen curvasdel tipo sigmoideo (Fig. 1) en la que sepueden observar tres fases que refle-jan a su vez también las tres etapas deuna curva típica de crecimiento pobla-cional de un microorganismo en un cul-tivo. Estas son: una fase inicial esta-cionaria donde los microorganismos seadaptan a las nuevas condiciones nu-tritivas del medio y sintetizan toda lamaquinaria metabólica necesaria pa-ra la proliferación celular, seguida deuna fase exponencial (correlacionadacon la fase de exponencial de creci-miento) y una fase estacionaria finalsin incrementos debido al agotamien-to de los recursos nutritivos, acumula-ción de metabolitos tóxicos y por fe-nómenos de exclusión in-tra/interespecífica.A partir de que la cantidad de célulasdel cultivo de impedancia sea aproxi-madamente de 10^6 – 10^7 u.f.c/ml elinstrumento, BacTrac 4300 (Fot. 1) deSy-Lab, será capaz de registrar unaseñal de impedancia que se encontra-rá, lógicamente, en fase exponencial.Tomando un valor umbral de variación

% de un valor definido, sea impedanciade M o de E, si esta variación supera-se dicho umbral se debería a un fenó-meno de proliferación celular. Este va-lor umbral excluye cualquier otra cau-sa que lo produzca de forma inespecí-fica. El sistema avisa al usuario que seha producido un corte que se registraen ese preciso momento debido a uncrecimiento en fase exponencial. Dada la relación existente entre un he-cho y el otro, la variación por encima deun umbral por un lado y el crecimientoactivo en fase exponencial por el otro,el BacTrac 4300 registra el momentodel corte con un valor de tiempo trans-currido hasta entonces denominado T.A cada valor en tiempo de corte le co-rresponderá una concentración u.f.c. /ml de caldo de cultivo. Si somos capa-ces de calibrar el sistema, es decir, co-nocer a diferentes tiempos T de cortela concentración microbiana del culti-vo en ese momento mediante un ban-co de diluciones y un posterior recuen-to de colonias, podremos correlacionarregresivamente y de forma automáticael recuento por impedancia. El softwa-re de monitorización interpola ese tiem-po de corte detectado en el cultivo conla ecuación de regresión (gráfica % deM o E respecto tiempo de corte duran-te el cultivo) de forma que encuentreel valor de la concentración de micro-organismos de la muestra a un tiempoinicial o To y conocer, por consiguiente,el recuento inicial en el alimento.Si por el contrario lo que nos interesano es el recuento sino una investiga-

ción, sólo requerimos que el sistemaregistre que se ha generado una señalde corte a un umbral establecido de% de variación de M o de E. El siste-ma se puede configurar para avisarmediante un señal gráfico o incluso porun código de colores (rojo= corte; ver-de = no corte) que se ha detectado uncrecimiento en el medio. Si este es es-pecífico y selectivo, como en un pro-tocolo de investigaciónAusencia/Presencia, el sistema nosestará avisando que se ha detectadoun presunto crecimiento del microorga-nismo objetivo de la investigación ynos avisará del resultado. Si no haycorte en toda la incubación el resulta-do será de ausencia para ese micro-organismo objeto del estudio.Si a todo esto consideramos que cuan-to mayor sea la concentración inicialde el/los microorganismo/s, ya sea unrecuento o una investigación (preenri-quecimiento), antes se alcanzará unaconcentración de 10^6 – 10^7 u.f.c./ mly el tiempo de corte será más corto.Esto propicia que para la mayoría deprotocolos de recuento o de investi-gaciones tengamos resultados muchoantes de que finalice el tiempo total delprotocolo de incubación dándose, co-mo encontramos en muchas ocasio-nes, cortes de presuntivos a las 4-11horas de incubación (E. coli , S. au-reus, Salmonella) o recuentos de mi-croorganismos totales en 8-11 horas,todos ellos muy por debajo de lostiempos necesarios por métodos clási-cos.En protocolos de esterilidad, realiza-dos mediante impedancia indirecta, sino se detecta ningún corte durante eltiempo total de la incubación el resul-tado será de ausencia de microorga-nismos.

Bibliografía1.- BacTrac 4000 Series Microbiological Operation

Manual V1.05e © 2002, SY-LAB Instruments

GmbH.

IX WORKSHOP MRAMA

En protocolos de esterilidad, realizadosmediante impedancia indirecta, si

no se detecta ningún corte durante eltiempo total de la incubación el

resultado será de ausencia demicroorganismos

8

IX WORKSHOP MRAMA

El empleo directo de la gené-tica en la agrolimentación:mejora genética de los ali-mentosLa comunidad científica entiende porbiotecnología el uso de un organis-mo vivo con un propósito industrial.Biotecnología de alimentos no esmás que el uso de seres vivos en laproducción de alimentos, lo que in-cluye toda la alimentación, porquetodo cuanto comemos son, o han si-do, seres vivos, ya sean animales,vegetales, o alimentos o bebidasfermentadas por un microorganis-mo. Pero el consumidor, sobre todoel europeo, tiene una percepcióndistinta de lo que es y entiende queéste término hace referencia a laaplicación de la genética en la ali-mentación. En otras palabras, losconsumidores europeos entiendenpor biotecnología de alimentos “po-ner genes en su sopa”. Hay que recordar a los consumido-res que la genética se ha aplicadoen la alimentación desde que co-menzó la agricultura y la ganade-ría. Desde entonces el hombre hamejorado empíricamente el genomade las variedades vegetales comes-tibles, las razas animales y los fer-mentos. Esta mejora se ha funda-mentado en la aparición de mutan-tes espontáneos, la variabilidad na-tural, y la aplicación del cruce se-xual o hibridación. De esta forma sehan obtenido variedades de trigocon espigas incapaces de disper-sar sus semillas en la naturaleza,pero capaces de generar unas ha-rinas panaderas con inmejorableaptitud tecnológica, o patatas co-mestibles al contener niveles míni-mos de alcaloides tóxicos. Desdehace treinta años los científicos aís-lan en el laboratorio fragmentosconcretos que portan genes deter-minados. Esos genes se pueden va-riar en el tubo de ensayo y se pue-den reintroducir en el organismo na-tural o en uno distinto generando untransgénico. Al global de estas téc-

nicas las llamamos ingeniería gené-tica y cuando se aplica en el diseñode un alimento surgen los llamadosalimentos transgénicos.Hoy se comercializan muchos ali-mentos transgénicos en todo elmundo, sobre todo en EstadosUnidos, Australia, Canadá y China.Los más conocidos son la soja re-sistente al herbicida glifosato y elmaíz Bt aunque existen muchosmás. Son de gran importancia losque hacen referencia a la mejoranutricional de los alimentos. Desdealgunas organizaciones ecologistasse acusa a los alimentos transgéni-cos de ser un veneno para la saludy el medioambiente. No es cierto.Desde hace más de quince años,FAO, OCDE y OMS han estableci-do grupos de trabajo para evaluar laseguridad para el consumidor de losalimentos transgénicos. Se ha lleva-do a cabo una evaluación de riesgossanitarios de todos los alimentostransgénicos comercializados aten-diendo al contenido nutricional, laposible presencia de alérgenos y elnivel de toxicidad. Son los alimentosmás evaluados de la historia de laalimentación y no disponemos de undato científico que indique que re-presenten un riesgo para la saluddel consumidor superior al que im-plica la ingestión del alimento con-vencional correspondiente. Este he-cho ha sido puesto de manifiestopor la OMS en su página de inter-net. Es interesante destacar quetras la publicación de esta decisióndichos grupos han variado su estra-tegia y apenas hablan de los riesgossanitarios de los transgénicos perosi de los riesgos ambientales. Ahílas cosas son menos claras porque

hay una falta de metodologías paraanalizar este tipo de riesgos queafectan tanto a las plantas transgé-nicas como a las convencionales.Aun así debemos afirmar con con-tundencia que existen tres posiblesriesgos: la transferencia de los ge-nes exógenos desde la variedadtransgénica a variedades silvestres,la pérdida de biodiversidad y losefectos dañinos que ciertas plantastransgénicas resistentes a insectospueden tener sobre poblaciones deinsectos distintos de aquellos con-tra los que protegen. Todos estosriesgos ya existen con las varieda-des convencionales. Por ello, lacuestión clave es conocer si el em-pleo de transgénicos acelerará laaparición de estos riesgos. Pareceque no, siempre que se mantengany mejoren las normas de evaluaciónque empleamos actualmente conlas plantas transgénicas.Finalmente debemos considerar losriesgos económicos. El 90% de losagricultores que utilizaron semillastransgénicas en el 2009 eran agri-cultores pobres de países en des-arrollo. Una realidad muy lejana delestereotipo que hace de lo transgé-nico un negocio en manos de pocascompañías multinacionales.Pero conviene debatir acerca de laopinión del consumidor sobre lostransgénicos. En general, y desta-cando la falta de formación e infor-mación en biotecnología de nuestrasociedad, así como la constante pre-sencia de los grupos en contra en losmedios de comunicación, los perci-ben como algo peligroso. Por ello re-sulta importante la divulgación de losdatos reales que desde la Ciencia te-nemos de estos productos.

Daniel Ramón Vidal Biópolis, S.L.daniel.ramon@biopolis.es

Transgénicos, nutrigenética ynutrigenómica en alimentación

9

Las nuevas aplicaciones dela genética en la agroalimen-tación: nutrigenética y nutri-genómicaEn el año 2003 se hizo pública la se-cuencia que conforma nuestro geno-ma, el genoma humano. Somos po-co más de 23.000 genes interaccio-nando con el ambiente. Pero lo quesomos no depende de nuestro colorde piel, ni de nuestro credo políticoo religioso; está escrito en ese alfa-beto molecular y se traduce en fun-ción de nuestro ambiente físico ocultural. Es evidente el impacto de lagenómica en nuestra vida cotidianay ello ha dado lugar a la aparición dedos nuevas disciplinas científicas: lanutrigenética y la nutrigenómica. Pornutrigenética entendemos la discipli-na científica que estudia el efecto delas variaciones genéticas entre indi-viduos en la interacción dieta y en-fermedad. Por nutrigenómica aque-lla que estudia el efecto de los nu-trientes de los alimentos sobre la ex-presión de nuestros genes. Con suempleo empezamos a entender co-mo se va a definir en el futuro unaalimentación a la carta en función delo que podríamos llamar “pasaportegenético”. Puede que a muchos lesaterre, pero quizás no lo vean tangrave si piensan en la ventaja quepara un recién nacido puede supo-ner que sus padres sean informadossobre una posible mutación en sugenoma que le predisponga a des-arrollar una enfermedad cardiovas-cular si su alimentación no es ade-cuada. Es claro el enorme potencial que elconocimiento del genoma humanopuede tener en las pautas de ali-mentación, pero no será menor elque tenga la secuenciación de losgenomas de otros organismos vivosde interés agroalimentario. Hastaahora se han secuenciado totalmen-te más de quinientos genomas dis-tintos y hay más de setecientos pro-yectos de secuenciación en marcha.Algunos de ellos se refieren a ani-

males, plantas o microorganismosde relevancia alimentaria, como porejemplo el arroz, la levadura pana-dera, la bacteria Bifidobacterium bi-fidum (usada en muchos productosprobióticos) o patógenos responsa-bles de toxiinfecciones alimentariascomo Escherichia coli. El conoci-miento de los genes que componenel genoma de estos organismos per-mite conocer sus genes clave paraasí definir estrategias de mejora porgenética clásica (la llamada mejoraasistida por marcadores) o por in-geniería genética, desarrollar meca-nismos de defensa frente a su pato-genicidad, o descubrir nuevas fun-ciones fisiológicas con impacto nu-tricional.La secuenciación de genomas ha si-do hasta ahora una técnica costosaen tiempo y dinero. Hace apenas unaño se describió una nueva técnicade secuenciación basada en el em-pleo de nanomateriales. Dicha técni-ca se denomina pirosecuenciación ypermite secuenciar genomas de for-ma masiva en mucho menos tiempoy a un menor costo. Por ejemplo, latecnología clásica de secuenciaciónaplicada en un laboratorio conven-cional tardaba en secuenciar el ge-noma de una bacteria láctica untiempo variable entre uno y tresaños. Con la tecnología de pirose-cunciación es posible hacerlo en tansólo ocho horas y por un precio encosto de materiales diez veces me-nor al de la tecnología convencional.Sin duda la pirosecuenciación va arevolucionar la secuenciación de ge-nomas y también de los llamadosmetagenomas. Con este último sus-tantivo se hace referencia a la se-cuenciación de DNA extraído de unecosistema, de forma que a partir delos datos de secuencia es posible in-ferir los organismos presentes en di-cho nicho ecológico. Su aplicaciónen alimentación y nutrición es máspróxima de lo que muchos imaginan.Por ejemplo, recientemente se hanllevado a cabo proyectos de secuen-

ciación masiva en voluntarios huma-nos, determinándose que más detrece mil cepas bacterianas distintaspueblan nuestro tracto digestivo.También mediante el empleo de me-tagenómica se han detectado dife-rencias en la composición de la flo-ra microbiana del tracto digestivo deindividuos obesos. Son los primerosresultados de una tecnología poten-te que permitirá conocer aspectosnuevos de nuestra fisiología y su re-lación con la alimentación.Podemos concluir por todo lo ex-puesto que el futuro de la genéticaen la alimentación es importante. Laépoca en que los tecnólogos de ali-mentos eran expertos en el manejode las tuberías de las instalacionesindustriales ha quedado lejos. Lanueva tecnología de alimentos pre-cisa de nuevos profesionales queentiendan la importancia de la bio-tecnología y la genética y tambiénpuedan discutir sobre conocimientosde otros campos del saber como lafarmacología, la nutrición, el controlautomático de sistemas o las nano-tecnologías.

Bibliografía1.- Fedoroff N. (2004). Mendel in the kitchen.

Joseph Henry Press, Washington.

2.- Pafundo S, Agrimonti C, Maestri E,

Marmiroli N. (2007). Applicability of SCAR mar-

kers to food genomics: olive oil traceability. J.

Agric. Food Chem. 55:6052-6059.

3.- Turnbaugh PJ, Ley RE, Mahowald MA,

Magrini V, Mardis ER, Gordon JI.(2006). An

obesity-associated gut microbiome with increa-

sed capacity for energy harvest. Nature

444:1027-1031.

4.- Withee J, Dearfield KL. (2007). Genomics-

based food-borne pathogen testing and diag-

nostics: possibilities for the U.S. Department of

Agriculture's Food Safety and Inspection

Service. Environ. Mol. Mutagen. 48:363-368.

IX WORKSHOP MRAMA

10

IX WORKSHOP MRAMA

La reacción en cadena de la polime-rasa (conocida como PCR por sussiglas en inglés, Polymerase ChainReaction) es un método de análisisde ácidos nucleicos, desarrolladopor Kary Mullis a mediados de losaños 80, para producir grandes can-tidades de un fragmento específicode ADN de secuencia y longitud de-finida a partir de una pequeña can-tidad de material inicial.La técnica permite amplificar selec-tivamente una molécula de ADN oARN varios millones de veces en po-cas horas. Mediante la PCR pode-mos realizar la detección y análisisde secuencias específicas de un gensin necesidad de aislarlo previamen-te por técnicas de clonación de ADN.Los análisis pueden realizarse a par-tir de unas pocas células o de unamínima cantidad de muestra biológi-ca sin la necesidad de aislar previa-mente grandes cantidades de ácidosnucleicos.La PCR ha revolucionado el campodel diagnóstico molecular y se haconvertido en una técnica de rutinaen el ámbito de la genética, la micro-biología y la biotecnología.

Principios básicos de la PCRLa PCR se fundamenta en la ampli-ficación enzimática de un fragmen-to de ADN flanqueado por dos se-cuencias de oligonucleótidos que hi-bridan en la cadena complementariade la molécula molde que se va aamplificar (cebadores o “primers”) yque son utilizados por una ADN po-limerasa termoresistente (general-mente se emplea la de la bacteriatermófila Thermus Aquaticus, capazde crecer a elevadas temperaturas)para copiar la secuencia de la mis-ma. La reacción es un proceso que cons-ta de 3 etapas (repetidas unas 30-35veces): desnaturalización, hibrida-ción de los cebadores y extensión delos mismos.Desnaturalización: Para que puedainiciarse la reacción es preciso que

las moléculas de ADN molde se en-cuentren en forma de cadena sim-ple. Esto se consigue calentando atemperaturas de 90 a 95ºC para queproduzca la rotura de los enlacespuente de hidrógeno intercatenariosy la separación de ambas cadenas.Para asegurar la completa separa-ción de la doble cadena del ADN es-ta temperatura debe mantenerseunos minutos. Si el ADN solo se des-naturaliza parcialmente éste tende-rá a renaturalizarse muy rápidamen-te dificultándose una eficiente hibri-dación de los primers y la posteriorextensión de los mismos.Hibridación: Una vez que el ADNestá desnaturalizado se disminuyela temperatura de la reacción hastaun rango comprendido entre los 40 ylos 60ºC para que se pueda produ-cir la hibridación específica de loscebadores a las secuencias flan-queantes del fragmento que se de-sea amplificar. Esta etapa se deno-mina también fase de “annealing” yla temperatura a la que se realizadebe establecerse para cada reac-ción en función de la longitud de loscebadores y su secuencia (tempera-turas inferiores a la óptima nos pro-ducirán hibridaciones inespecíficasde los cebadores y temperaturas su-periores nos dificultarán la eficienciade la misma). Extensión: Durante esta etapa laADN polimerasa termoresistente in-corpora nucleótidos en el extremo3' del cebador utilizando como mol-de la cadena de ADN previamentedesnaturalizada. La temperatura a laque se realiza esta etapa de la reac-ción suele ser de 72ºC ya que es latemperatura a la que la Taq polime-

rasa alcanza su máxima actividad.Normalmente una extensión de 20segundos es suficiente para frag-mentos menores de 500 pares debases, y 40 segundos para fragmen-tos por encima de 1.2Kb. Al finalizar cada uno de los ciclos elnúmero de copias obtenidas se du-plica y después de 20 ciclos ya tene-mos aproximadamente 1 millón decopias de cada una de las molécu-las molde iniciales de ADN.La técnica puede usarse para la am-plificación de moléculas de ARN sipreviamente se realiza una copia delas mismas mediante la enzimatranscriptasa reversa. De este modopodemos realizar estudios sobremoléculas de ARNm o bien la pode-mos aplicar para la detección de vi-rus ARN.La elección de los cebadores y el ta-maño del fragmento amplificado esde gran importancia para el resulta-do final. En pruebas de diagnósticoel tamaño del fragmento amplificadono debe superar los 100-150 paresde bases de ADN si partimos demuestras que puedan haber sufridouna degradación de los ácidos nu-cleicos y la elección de los cebado-res debe realizarse para fragmen-tos específicos de la diana que que-ramos amplificar para evitar falsospositivos.Una vez realizada la amplificación,se procede a la identificación de lasecuencia obtenida mediante elec-troforesis, hibridación con sondascomplementarias o técnicas de aná-lisis de polimorfismos.El análisis por PCR puede ser dedos tipos: cualitativo (detección dela presencia o ausencia de un frag-

Dr. Armand Sánchez Bonastre Dep. de Ciencia Animal y de losAlimentos. Facultad de Veterinaria.Universidad Autónoma de Barcelona.armand.sanchez@uab.cat

La polymerase chain reaction(PCR)

11

mento de ADN determinado) o cuan-titativo (detección de la cantidad deun fragmento de ADN determinado).

Análisis cualitativo de ADNmediante PCREste tipo de análisis se suele reali-zar cuando tan sólo es necesario co-nocer la presencia o ausencia de al-guna secuencia específica de ADN oARN, como por ejemplo la detecciónde la presencia de un patógeno enuna muestra. El análisis del produc-to amplificado suele realizarse me-diante electroforesis en gel o capi-lar y su visualización por tinción enbromuro de etidio o por detecciónfluorescente si previamente hemosutilizado uno de los cebadores mar-cado con algún tipo de fluorescen-cia.En algunos análisis resulta necesa-rio identificar la secuencia del pro-ducto amplificado y el producto de laPCR debe ser sometido a un análi-sis específico (secuenciación, diges-tión con enzimas de restricción...etc.).

Análisis cuantitativo de ADNmediante PCRLa PCR convencional no es una téc-nica cuantitativa ya que la amplifica-ción exponencial del ADN molde nose mantiene constante especialmen-te en los últimos ciclos de la reac-ción.Para poder realizar estimas cuanti-tativas se han desarrollado técnicasde PCR en “tiempo real” (PCR cuan-titativa) en las que es posible deter-minar la fase exponencial de la am-plificación y poder extrapolar de for-ma cuantitativa la cantidad de mol-de inicial que se esta amplificando.La metodología de PCR cuantitativa,facilita además la automatización yno suele requerir el procesamientoulterior del producto amplificado loque reduce el riesgo de contamina-ción. En la actualidad, existen en el mer-cado varios equipos y protocolos pa-

ra la realización de esta técnica.Desde el punto de vista de la detec-ción del producto amplificado en ca-da ciclo, existen tres métodos prin-cipales de análisis de PCR cuanti-tativa basados en técnicas de fluo-rescencia y que se diferencian en eltipo de detección de los productosde PCR. Estos métodos son: el queemplea una sonda con doble marca-do fluorescente (TaqMan ®) especí-fica de la secuencia amplificada, losbasados en el uso de dos sondasque hibridan de forma adyacente enel fragmento que amplificamos y, porúltimo, el que utiliza una sustanciaintercalante que se une a la doblecadena de ADN denominado SYBRGreen I y produce emisión de fluo-rescencia.El método más difundido, es el queemplea sondas TaqMan ®. Este mé-todo se basa en la actividad 5’-exo-nucleasa de la Taq polimerasa y enla amplificación mediante PCR deuna determinada secuencia diana enpresencia de una sonda fluorescen-te específica (sonda TaqMan ®) quehibrida con la secuencia diana queestamos amplificando. La sondaTaqMan®, de un tamaño aproxima-do de 20-30 bases, tiene unido unfluorocromo en posición 5’ y un se-gundo fluorocromo que actua por in-terferencia con el primero cómoamortiguador de fluorescencia enposición 3’. Además, esta sonda es-tá fosforilada en 3’ para evitar su ex-tensión durante la reacción de PCR.Si la secuencia diana está presenteen la muestra, la sonda TaqMan hi-bridará específicamente con ella, si-tuándose entre los dos cebadores.Cuando se produce la etapa de ex-tensión en la reacción de PCR, laactividad 5’-exonucleasa de la Taqpolimerasa degrada a la sondaTaqMan liberando el fluorocromo,que al quedar separado del amorti-guador emitirá una señal que puedeser captada por el sistema óptico delequipo. Este proceso de degrada-ción de la sonda tiene lugar en ca-

da uno de los ciclos y es directamen-te proporcional al número de molé-culas que están siendo extendidasen cada uno de ellos que podemosvisualizar por el incremento de la se-ñal de fluorescencia.Además, la Taq polimerasa no digie-re la sonda libre sino únicamente lahibridada, por lo que la cantidad deseñal fluorescente emitida es pro-porcional a la cantidad de productoacumulado. La medición de la inten-sidad de fluorescencia se realiza deforma continúa lo que nos proporcio-na una información dinámica entiempo real del proceso. El sistemade detección permite establecer elciclo umbral (Ct-cycle threshold), ci-clo de la PCR a partir del cual la can-tidad de fluorescencia emitida alcan-za el nivel de detección que haya-mos fijado, lo que a su vez se co-rrelaciona directamente con la can-tidad de ADN molde de la muestraanalizada. La cuantificación del nú-mero de copias de una muestra serealiza mediante la comparación dela Ct de la muestra problema con laCt de una serie de diluciones de unamuestra-control positiva. La cuanti-ficación de la muestra control posi-tiva permite establecer una curva es-tándar que refleja el número de co-pias y el número de ciclo en el queha sido realizada la detección de for-ma objetiva y reproducible.Cuando se realiza la cuantificaciónde una muestra problema, el cicloumbral de su detección se lleva a lacurva estándar lo que permite cono-cer el número de copias de la se-cuencia diana existente en la mues-tra analizada.El método de PCR cuantitativa basa-do en la química por hibridación desondas, emplea dos sondas secuen-cia-específicas que hibridan en re-giones adyacentes espaciadas entreuno y cinco nucleótidos. Una sondaestá marcada con un fluorocromoemisor en posición 3’ y la otra son-da está marcada con un fluorocromoaceptor en su extremo 5’. Esta son-

IX WORKSHOP MRAMA

12

da además tiene bloqueado su extre-mo 3’ con un grupo fosfato para evi-tar su extensión. Sólo cuando las dossondas han hibridado y están próxi-mas se origina una emisión de fluo-rescencia por el fluorocromo acep-tor cuya intensidad aumenta propor-cionalmente a la cantidad de secuen-cia diana formada en la reacción dePCR. Esta metodología se diferenciade la química de sondas TaqMan ®en que no se requiere la hidrólisisde sonda para la emisión de fluores-cencia.El tercer tipo de detección de los pro-ductos específicos de PCR de la se-cuencia molde consiste en la utiliza-ción del agente intercalante SYBRGreen I. Esta sustancia se une espe-cíficamente a la doble hélice de lasmoléculas de ADN formadas en ca-da ciclo de la reacción de PCR pro-duciendo la emisión de fluorescen-cia. De esta forma, la señal fluores-cente se incrementa en función de lacantidad de producto amplificado. Laventaja de esta opción es que no seprecisa la síntesis de sondas fluores-centes específicas para cada tipo dedetección, aunque su inconvenientereside en su inespecificidad ya quese detecta fluorescencia para todoslos productos de ADN de doble cade-na presentes en la reacción (inclu-yendo los dímeros de cebador quesuelen producirse en la mayor partede reacciones de PCR).La realización de estas técnicas dePCR en tiempo real requiere dispo-ner de un equipo que disponga de unsistema de detección de fluorescen-cia. Existen actualmente en el mer-cado distintas alternativas cuyo cos-te suele estar relacionado con los ni-veles de sensibilidad y capacidad deanálisis de muestras de los mismos.Actualmente existen además plata-formas de alto rendimiento en for-ma de chip para la realización de unelevado número de reacciones deforma simultánea. Basadas en elmismo tipo de químicas que las em-pleadas en los equipos de PCR

cuantitativa convencionales estasplataformas utilizan volúmenes dereacción muy inferiores (en la esca-la de nanolitros), en forma de reac-tivos liofilizados o utilizando técnicasde microfluídica en el chip, con elconsiguiente ahorro de reactivos ydisminución del coste de los análi-sis.La utilización de este tipo de equiposjunto al incipiente desarrollo de téc-nicas que permiten amplificar selec-tivamente los ácidos nucleicos co-rrespondientes a células viables, có-mo el uso de EMA (ethidium bromi-de monoazide) o PMA (propidiummonoazide), permite pensar en unarápida expansión de protocolos ba-sados en PCR en los laboratorios demicrobiología de los alimentos.

Bibliografía1.- Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore

DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K.

Current Protocols in Molecular Biology.

Hoboken, NJ: Wiley, 2005.

2.- Bai S, Zhao J, Zhang Y, Huang W, Xu S,

Chen H, Fan LM, Chen Y, Deng XW. Rapid and

reliable detection of 11 food-borne pathogens

using thin-film biosensor chips. Appl Microbiol

Biotechnol. 2010 Apr;86(3):983-90.

3.- Bell A.S. and Lisa C. Ranford-Cartwright.

Real-time quantitative PCR in parasitology.

Trends in Parasitology, 2002, 18:8:338-342.

4.- Bohaychuk VM, Gensler GE, McFall ME,

King RK and Renter DG. A real-time PCR assay

for the detection of Salmonella in a wide variety

of food and food-animal matricest. J Food Prot.

2007, 70(5):1080-7.

5.- Brehm-Stecher B, Young C, Jaykus LA,

Tortorello ML. Sample preparation: the forgotten

beginning. J Food Prot. 2009,

Aug; 72(8):1774-89.

6.- Bustin S.A.. A PCR guide for clinical scien-

tists. Clinical Applications of PCR edited by

Y.M.D. Lo. Humana Press, 1998.

7.- Bustin SA and Nolan T. Pitfalls of quantitative

real-time reverse trasncription polymerase chain

reaction. J Biomol Tech 2004, 15: 155–166.

8.- Cai HY, Archambault M, Gyles CL and

Prescott JF. Molecular genetic methods in the

veterinary clinical bacteriology laboratory:

current usage and future applications. Anim

Health Res Rev. 2003 Dec;4(2):73-93.

9.- Cenciarini-Borde C, Courtois S, La Scola B.

Nucleic acids as viability markers for bacteria

detection using molecular tools. Future Microbiol.

2009, 4:45-64.

10.- Demeke T, Jenkins GR. Influence of DNA

extraction methods, PCR inhibitors and quantifi-

cation methods on real-time PCR assay of bio-

technology-derived traits. Anal Bioanal Chem.

2010 Jun;141(1-2):45-50

11.- Dwivedi HP, Jaykus LA. Detection of patho-

gens in foods: the current state-of-the-art and

future directions. Crit Rev Microbiol. 2010 Oct 7.

1–24, Early Online [Epub ahead of print]

12.- Edwards K, Logan J. and Saunders N. Real-

time PCR: an Essential Guide. Norfolk, UK:

Horizon Bioscience, 2004.

13.- Foley SL, Lynne AM, Nayak R. Molecular

typing methodologies for microbial source trac-

king and epidemiological investigations of Gram-

negative bacterial foodborne pathogens. Infect

Genet Evol. 2009, (4):430-40.

14.- Johnson J.R.. Development of polymerase

chain reaction-based assays for bacterial gene

detection. Journal of Microbiological Methods,

2000, 41:3:201-209.

15.- Jordan J.. Real-time detection of PCR pro-

ducts and microbiology. New technologies for life

sciences: A Trends Guide, 2000, 2000:6:61-66.

16.- Josefsen MH, Löfström C, Hansen TB,

Christensen LS, Olsen JE, Hoorfar J. Rapid

quantification of viable Campylobacter bacteria

on chicken carcasses, using real-time PCR and

propidium monoazide treatment, as a tool for

quantitative risk assessment. Appl Environ

Microbiol. 2010 Aug;76(15):5097-104. Epub

2010 Jun 18.

IX WORKSHOP MRAMA

13

17.- Justé A, Thomma BP and Lievens B.

Recent advances in molecular techniques to

study microbial communities in food-associa-

ted matrices and processes. Food Microbiol.

2008 25(6):745-61.

18.- Kawasaki S, Fratamico PM, Horikoshi N,

Okada Y, Takeshita K, Sameshima T,

19.- Kawamoto S. Multiplex real-time polyme-

rase chain reaction assay for simultaneous

detection and quantification of Salmonella

species, Listeria monocytogenes, and

Escherichia coli O157:H7 in ground pork sam-

ples. Foodborne Pathog Dis. 2010

May;7(5):549-54.

20.- Klein D.. Quantification using real-time

PCR technology: applications and limitations.

Trends in Molecular Medicine, 2002, 8:6:257-

260.

21.- Krämer N, Löfström C, Vigre H, Hoorfar J,

Bunge C, Malorny B. A novel strategy to obtain

quantitative data for modelling: Combined

enrichment and real-time PCR for enumera-

tion of salmonellae from pig carcasses. Int J

Food Microbiol. 2010 Sep 18. [Epub ahead of

print].

22.- Lambertz ST, Nilsson C, Hallanvuo S and

Lindblad M. Real-time PCR method for detec-

tion of pathogenic Yersinia enterocolitica in

food. Appl Environ Microbiol. 2008,

74(19):6060-6067.

23.- Lauri A, Mariani PO. Potentials and limita-

tions of molecular diagnostic methods in food

safety. Genes Nutr. 2009, 4(1):1-12.

24.- Lie Y.S., Christos J Petropoulos.

Advances in quantitative PCR technology: 5'

nuclease assays. Current Opinion in

Biotechnology 1998, 9:43-48.

25.- Liu D. Preparation of Listeria monocyto-

genes specimens for molecular detection and

identification. Int J Food Microbiol. 2008,

122(3):229-242.

26.- Ludwig W. Nucleic acid techniques in

bacterial systematics and identification. Int J

Food Microbiol. 2007, 120(3):225-236.

27.- Mackay I.M. Real-time PCR in the micro-

biology laboratory. Clin Microbiol Infect. 2004,

Mar;10(3):190-212.

28.- Mackay I.M. Real-Time PCR in

Microbiology: From Diagnosis to

Characterization. 2007, Caister Academic

Press. ISBN: 978-1-904455-18-9.

29.- Mackay J. Introduction to kinetic (real-

time) PCR. Methods Mol. Biol. 2007. 353: 167-

176.

30.- Mackay J., Landt O. Real-time fluorecent

chemistries. Methods Mol. Biol. 2007. 353:

237-261.

31.- Malorny B, Tassios PT, Radstrom P, Cook

N, Wagner M, Hoorfar J.Standardization of

diagnostic PCR for the detection of foodborne

pathogens. Anim Health Res Rev. 2003 May

25;83(1):39-48.

32.- Malorny B, Löfström C, Wagner M, Krämer

N and Hoorfar J. Enumeration of salmonella

bacteria in food and feed samples by real-time

PCR for quantitative microbial risk assessment.

Appl Environ Microbiol. 2008, 74(5):1299-304.

33.- Maurer, John (Ed.) PCR Methods in

Foods. Series: Food Microbiology and Food

Safety. 2006, VIII, 148 p. Springer. ISBN: 978-

0-387-28264-0.

34.- McKillip J.L., Drake M. Real-time nucleic

acid-based detection methods for pathogenic

bacteria in food. J Food Prot. 2004,

Apr;67(4):823-32.

35.- Niessen L. PCR-based diagnosis and

quantification of mycotoxin producing fungi. Int

J Food Microbiol. 2007, 119(1-2):38-46.

36.- Nocker A, Camper AK. Novel approaches

toward preferential detection of viable cells

using nucleic acid amplification techniques.

FEMS Microbiol Lett. 2009 Feb;291(2):137-42.

37.- Nogva HK, Dromtorp SM, Nissen H, Rudi

K. Ethidium monoazide for DNA-based diffe-

rentiation of viable and dead bacteria by 5 -

nuclease PCR. Biotechniques. 2003:

810:812–813.

38.- Peirson SN., Butler JN. Quantitative poly-

merase chain reaction. Methods Mol. Biol.

2007. 362:349-362.

39.- Peters I.R., Helps, C.R. and Day, M.J..

Real-time RT-PCR: considerations for efficient

and sensitive assay design. J. Immunol.

Methods. 2004 Mar;286(1-2):203-17.

40.- Rasooly A and Herold KE. Food microbial

pathogen detection and analysis using DNA

microarray technologies. Foodborne Pathog

Dis. 2008, 5(4):531-550.

41.- Sandhya S, Chen W and Mulchandani A.

Molecular beacons: a real-time polymerase

chain reaction assay for detecting Escherichia

coli from fresh produce and water. Anal Chim

Acta. 2008 May 5;614(2):208-212.

42.- Settanni L., Corsetti A. The use of multi-

plex PCR to detect and differentiate food- and

beverage-associated microorganisms: a

review. J. Microbiol. Methods. 2007 69(1): 1-22.

43.- Shin GW, Hwang HS, Chung B, Jung GY.

Recent developments in CE-based detection

methods for food-borne pathogens.

Electrophoresis. 2010 Jul;31(13):2137-53.

44.- Suo B, He Y, Tu SI, Shi X. A multiplex real-

time polymerase chain reaction for simultane-

ous detection of Salmonella spp., Escherichia

coli O157, and Listeria monocytogenes in meat

products. Foodborne Pathog Dis. 2010

Jun;7(6):619-28.

45.- Velusamy V, Arshak K, Korostynska O,

Oliwa K, Adley C. An overview of foodborne

pathogen detection: in the perspective of bio-

sensors. Biotechnol Adv. 2010 Mar-

Apr;28(2):232-54.

46.- Wang L, Mustapha A. EMA-real-time PCR

as a reliable method for detection of viable

Salmonella in chicken and eggs. J Food Sci.

2010 Apr;75(3):M134-9.

IX WORKSHOP MRAMA

14

IX WORKSHOP MRAMA

It is my great honor and pleasure tobe here today and I would like tothank very warmly the organizers,Josep and Marta, for inviting me topresent the introductive paper of theIX Workshop on Rapid Methods andAutomation held in Barcelona. I must say that the world of rapid me-thods in which I have been submer-ged a very long time ago is really afascinating one,in terms of techni-ques but also of scientists: they areall so enthusiastic and eager to findnew ways of working in Food micro-biology in order to decrease the costof analysis while increasing the num-ber of samples! However, it took along time for those alternative me-thods to be officially accepted; oneof the reasons, of course, is that theresults have to be recognized by thescientific community as well by officialbodies; considering the fact that ha-monization of traditional methods wasand remains a difficult topic, it is veryeasy to understand that, when rapidmethods did appear on the market,other problems of acceptance had tobe faced: that was unavoidable In spite of their importance, espe-cially for international trade, differentaspects of harmonization of micro-biological methods are not widelyknown.and, even if my knowledge ofthe topic is far to be perfect, I thoughtit would be useful, as an introductivepresentation to that IX workshop heldin Barcelona, to share with you a fewdata and comments on that topic andI propose to divide my presentationinto four parts:• In a first time, I would like to pre-

sent some general considerationsand definitions.

• In a second time, if you allow me todo so, I will tell you a few wordsconcerning the reasons which ledme to be involved in the field ofHarmonization of MicrobiologicalMethods.

• Then, I will describe some of themain Standardization bodiesaround the world.

Finally and before my conclusion, Iwould like to focus on recent appro-aches which show the willingness ofinternational harmonization in Foodmicrobiology.

General considerations anddefinitionsHarmonization, in a first approach,relates to music, to equilibrium bet-ween different registers but it con-cerns different fields and we can findexamples of harmonization every-where. According to ISO (the InternationalStandards Organization about whichI will tell a few words very soon),standards are “documented agree-ments containing technical specifica-tions or other precise criteria to beused consistently as rules, guidelinesor definitions of characteristics to en-sure that materials, products, proces-ses and services are fit for their pur-pose”; Concerning Food microbiology har-monisation, we all know the neces-sary conditions to be filled for a com-parable evaluation of the food quality.The food samples examined have tobe representative of the food exami-ned, in fact, I should say “should be”,in terms of size of the samples,as itis really impossible, for practical re-asons, to analyse a sample of a suf-ficient size (with the help of statisti-cians we can only try to be close tothe reality). However, we can alwaysfollow the same rules in terms of typeof sample and also of methods ofanalysis, which is very important. Considering the type of sample, I will

explain from a simple example: if wewant to define the contamination of apoultry carcase, examining the skinor the muscle is not the same thingand results will surely be very diffe-rent.Considering the methods of analysis,harmonization is of upper importan-ce to obtain the same or, at least,equivalent results. In Europe, a spe-cial emphasis on those problems hasbeen given and can be seen whenreading the paper on microbiologicalcriteria for food published 15December 2005 in the OfficialJournal of European Communities;however, everybody knows that theharmonization of methods remainsa difficult task and we can remem-ber that, a few decades ago, therewere a lot of techniques used to de-tect or enumerate the same type ofmicroorganism and each microbiolo-gist wanted to keep his (her) own me-thod….

Entering in the field ofHarmonization ofMicrobiological Methods A long time ago, when I began towork, I was in Ploufragan (Brittany)where I have been working for 27 ye-ars.At that time, there was no labora-tory in the place, only a control lab,far from a few kilometers. My projectwas to improve the quality of poultryproducts, in order to help industrialsto improve their techniques and in-crease the shelflife of poultry meat(which was sold as refrigerated whi-le the conditions of processing werenot so good) and to improve the

Cécile Lahellec (cecile.lahellec@sfr.fr)Honorary Research Director, French FoodSafety Agency IX Workshop on Rapid Methods andAutomation in Food MicrobiologyBarcelona. 23 November 2010

International harmonization ofmicrobiological methods

15

hygienic quality of their products. …Different options had to be takenconcerning - The types and size of the samples. - The types of microorganisms to be

studied and the methods of analy-sis.

Many years later, I can’t do otherwi-se than to observe that, without anynecessity or willingness of standardi-zation; from the beginnings, we hadprobably felt its necessity..We were also convinced of the ne-cessity of studying a high number ofsamples in order to avoid “precisionin error”; in fact, we had no idea ofthe poultry contamination and we hadin mind the objective to set up gene-ral laws which regulate the level ofcontaminations.. determine criticalpoints and try to improve the micro-biological quality. Later on, we deci-ded to try determining the origin ofcontaminations; then to look at pa-thogenic microorganisms along theproduction lines (“from farm to fork”)All that work was very expensive andthe necessity of using alternative me-thods became obvious from that pe-riod. In France, some scientists hadsimilar preoccupations and we beganto exchange with Prs C.Bourgeoisand P.Mafart in Quimper with PrH.Leclerc in Lille. but the most deci-sive for our future work was my par-ticipation in a symposium which washeld in Kiel(D) in 1974. I can’t forgetit...I did not present anything on thatday; I was just learning and listeningat the different papers when, sud-denly, we had a very interesting andunusual presentation: the speaker, ayoung American Chinese was quite“dancing”, showing beautiful slides:

the miniaturized methods used to de-tect or enumerate microorganismsfrom poultry was the subject of hispresentation: he was using micropla-tes instead of tubes and a micro-ino-culator instead of platina loops …Hehad a very simple principle“THINKSMALL”. As I was working on poultrymeat microbiology and was verymuch interested by rapid and econo-mic methods in order to study a lar-ge number of strains simultaneously,I met Dr Fung at the end of the ses-sion, asking for informations and re-prints; I must say it was the begin-ning of a long story.. first because hesent me reprints and even his thesisand, from that time we became verygood friends but I must say, too, thatit opened me new horizons, new con-tacts and a willingness to communi-cate about the possibilities which we-re offered to food microbiologists:they could use rapid method whichwere, till that period, used in the me-dical field only... for me, it was the be-ginning of a long story in science andfriendship …..Dr Fung visited ourInstitute in 1976 and, from that time,miniaturized methods were introdu-ced in our laboratory and used toidentify a lot of strains to traceSalmonella, then different types ofpathogenic microorganisms “fromfarm to fork”; we were so enthusias-tic with those methods that we pre-sented the technique as well as theresults during different meetings indifferent laboratories: we wanted tho-se methods be adopted by the scien-tific community … and were some-what successful.Here, I would like to tell you one shortstory:

I remember the visit of a politician inour lab: I was explaining him that witha low quantity of media, in a veryshort time, we could examine far mo-re strains than usual. He told me: inthat case, you will decrease yourstaff! And I answered: NO ! the sa-me technicians will study far morethan usual, that’all ! he said: OK…As you surely know, from the idea ofDr Fung (THINK SMALL !), a lot ofkits appeared on the market; you areaware of the present situation …butthe following is also a very beautifulstory, i.e the creation of courses sho-wing rapid methods in microbiologyall around the world. I want to re-member: once, I was in K.StateUniversity and, after my presenta-tion, I met a young Spanish scien-tist, eager of knowledge and new in-formations; that was just when Foodsafety Agencies in Europe werebeing organized; he told me: I wasvery interested in your talk but itwould have been interesting to saymore.. he looked somewhat disap-pointed.. Was it the reason why heinvited me different times inBarcelona to present the introductivepaper to the Spanish workshop ? Idon’t know but, anyway, I am veryhappy to be here today and I thinkthat what we are living is a perfectexample of a chain in Science.. However, the necessity of validatingthose methods in order to make themaccepted became obvious veryearly.and, for me, personally, it wasa big concern. In Afnor, the questionof rapid, alternative methods becameone branch of standardization in the1980’s. As I was concerned by harmoniza-tion, not only for traditional methodsbut also, and mainly for rapid me-thods, I was introduced, step by step,in that world of standardization: atthe time I was in charge of theCentral Food Hygiene Laboratory inParis, I was requested to be the con-venor of working group 6 of the tech-nical committee 275 of CEN (Comité

IX WORKSHOP MRAMA

Considering the methods of analysis,harmonization is of upper importance

to obtain the same or, at least,equivalent results

16

Européen de Normalisation); at thattime, I also participated in some me-etings of Codex alimentarius (tomention those related to standardiza-tion)In 1995, that group of CEN becameconcerned by rapid methods.Personally, I retired from CEN in2005 but I remain in contact and, in2009, I had the great pleasure to joinmy previous colleagues for the joinedmeeting ISO/CEN in Valencia (Spain)

Short history and descriptionof some international organi-zations connected with Foodmicrobiology The first historic writings showthat governments took interest in co-difications of rules set up to protectthe consumer, but the first laws, con-cerning mainly the chemical purityappeared during the first part of the19th century. AOAC (created as theAssociation of Agricultural OfficialChemists) was created in 1884 butis more a validation than a standar-dization body; then, at the beginningof the 20th century, one can mentionthe existence of IDF (InternationalDairy Federation), of BSI (BritishStandards Institute), etc… but thefruitful period appeared just after thesecond World War and I shall focuson them a few minutes.

ISO (International StandardsOrganization)As you probably know, different offi-cial bodies are concerned by stan-dardization under different aspectsfor different types of production andeverybody knows ISO, i.e. theInternational StandardsOrganisation; this organization wascreated in October 1946; its seat islocated in Geneva (CH); the creationresults from the fusion of two orga-nizations: ISA which was the InternationalFederation of National Associationsof Standardization, founded in New-York in 1926 and

UNSC, i.e Committee for coordina-tion of standardization of UnitedNations, created in 1944.The first national Assembly was heldin 1949 in the great amphitheater inSorbonne (Paris)ISO is composed of 247 committees.All standards are obtained by con-sensus; however, they are not man-datory..The technical committee incharge of Food microbiology is TC34/ SC9; the actual president isBertrand Lombard (F); the meetingsare held in a different country eachyear; for example, in 2009, the mee-ting was held in Valencia (Spain); InMay 2010,so quite recently, the me-eting was held in Argentina; as usual,it was a joined ISO/CEN meeting

CEN, Comité Européen deNormalisation (in English“European Committee forStandardization “) has been createdin 1961 in order to harmonize thestandards elaborated in Europe; thatmeans that the standards are man-datory in all countries of EC (at thecontrary, the standards which areelaborated by ISO are facultative,which means a great difference … Allmembers are members of ISO aswell. The seat of CEN is located inBrussels (B).In the beginnings, it wascreated by the national organisms forstandardization from France,Germany and Benelux coun-tries.Nowadays, the full members arethe 27 countries of EU and the threecontries of AELE (AssociationEuropéenne de Libre Echange)which own such an organism

(Switzerland, Norway and Island).CEN elaborates technical standardsin favor of international trade.CEN/TC275/WG6 was created in1993 and I was nominated as theconvenor; nowadays, from July 2005,Alexandre Leclercq from InstitutPasteur in Paris, is in charge of thegroup. From the beginnings, one main prin-ciple has been followed during thework of this group, i.e the ViennaAgreement; this agreement requiresthat, as often as possible, ISO me-thods are taken into account.In order to avoid any overlap, thereis also an agreement between diffe-rent groups of CEN that only onegroup is in charge of a particular me-thod (the “Vienna agreement”). Forexample, TC302 in charge of milkand dairy products analysis may cho-ose one specific technique. In thiscase, it requests TC 275/WG6 to re-fer to this specific technique in thestandard method. The necessity oftaking into account the experience ofother groups around the world, forexample AOAC and IDF(International Dairy Federation), hasalso been emphasized from the be-ginning and, presently, the basis fora good cooperation has been set up. In order to maintain a good interna-tional cooperation, one part of themeeting concerns the liaison withother organizations, ie: InternationalDairy Federation (IDF) CodexCommittee on Food Hygiene, AOAC(Association of Official AnalyticalChemists), WHO (World’HealthOrganisation), IUMS (InternationalUnion of Microbiological Societies),

IX WORKSHOP MRAMA

AOAC was created in 1884 but is more a validation

than a standardization body

17

OIE, (Office International desEpizooties) and also NMKL (coope-ration agreement between NMKL(Nordic Committee on Food Analysis)and ISO/TC34SC9)and ISO TC347and ISO TC147/SC4 Water microbio-logy.

Codex alimentarius Of couse, all of you have heard ofCodex alimentarius: the name meansa food code and is a compilation ofstandards for food, which can be ap-plied in all countries. Codex has be-en created in 1962 when the organi-zation of United Nations for Food andAgriculture (FAO) and the World’sHealth organization decided it wasnecessary to elaborate internationalstandards which may be used by theFood industry which was in full ex-pansion in order to protect consume-r’s health. in fact, in the first volume,it is said that the objectives of Codexalimentarius are: “to guide and pro-mote the elaboration and setting upof definitions and criteria for food, inorder to contribute to their harmoni-zation and facilitate international ex-changes. Codex alimentarius has a noticeableeffect on quality and safety of foodaround the world; it has allowed,everywhere, to improve the stan-dards which are applied at differentsteps of the food chain and to incre-ase a lot the international exchanges. In the Codex alimentarius, there ishigh number of committees, i.e twogroups of world committees, one on

general problems, the other on foodproducts. There are also some regio-nal committees. Food hygienists may be experts in

many of those groups; personally, Iparticipated different times in thecommittee “Food Hygiene“for whichUSA are the leader. All committees work in strong colla-boration with scientific organizationsin order to elaborate standards andrecommendations. As an example, I would like to re-member some sentences of one pa-per written in the “InternationalJournal of Food Microbiology“in1998: During the 21st session of CodexAlimentarius which was held inRome, Italy in July 1995, theCommission was invited to adapt asCodex general standards, a numberof draft texts submitted at step 8 ofthe Uniform Procedure for theLaboratory Codex Standards and re-lated texts – i.e.general standards forcontaminants and toxins in foods –methods of analysis and sampling “.Chemical contaminants were consi-dered first but, when, under CEN co-llaborative studies were carried outand that precision parameters wereintroduced into the ISO standards,they have been transmitted to CodexAlimentarius, so creating an interna-tional consensus.

Harmonisation of microbiolo-gical methods and of procedu-res for validation

The harmonization of methods isthe major task of the standardizationbodies. “Stricto sensu”, International stan-dards are axclusively elaborated byISO (the technical work of ISO ishighly decentralised and carried outin technical committees, subcommit-tees and working groups asTC34/SC9 for microbiological me-hods)Different national bodies: Afnor, BSI,DIN… in Europe, ANSI in USA (AN-SI is not an active member of ISO butclose relationships have been esta-blished in the Food microbiologicalsector. As an example, I’ll say a few wordsabout the elaboration of a ISO stan-dard: It always take into account the follo-wing principles: • The consensus: all points of view

are considered, whichever their ori-gin.

• At the industry scale, the solutionsmust aim to satisfy all concernedparties around the world.

• It depends on the willingness of thepartners

Three phases of elaboration can bedescribed:• The need of a standard is usually

submitted by a sector of the in-dustry which informs a nationalmember of that need; the nationalmember informs ISO. When theneed of a standard for a giventechnique, product … has been ap-proved and accepted, the followingtask is to define the technical sub-ject of the future standard. Thatphase is carried on within workinggroups composed of experts ofcountries interested in the ques-tion.

• When an agreement concerningthe technical aspects is obtained,a second phase begins: it is theconsensus phase

• The last part of the work concernsthe formal approval of the draft ofinternational standard (the criteria

IX WORKSHOP MRAMA

Codex has been created in 1962 when FAO and the World’s

Health organization decided it was necessary to elaborate

international standards

18

are that two thirds of the ISOmembers who have participatedin the elaboration procedure mustapprove the draft; also 75% ofthe voting members must appro-ve it). Then, the draft is accep-ted as an International ISOStandard. It is also possible, pre-sently, to publish drafts at diffe-rent stages.

It seems important to know that so-me standards, obtained by consen-sus had not been validated by inter-laboratory tests; but the necessityof their validation appeared obviousespecially for the acceptance of al-ternative methods: as it is alwaysnecessary to compare a given me-thod with a reference one. This isthe reason why, under WG6 ofCEN/TC275 and quite a short timeafter the creation of the workinggroup, a proposal for a project en-titled “Evaluation of microbiologicalmethods for detection and/or enu-meration of microbiological conta-minants in foods “was presentedand then accepted as an EU project(SMT4/CT96-2098). The trials we-re carried on from 1996 to 2000; theresults for all types of contaminantsstudied have been accepted by theequivalent group of ISO and publis-hed in the “International Journal ofFood Microbiology“and later on,adapted as Codex standards. Theyhave become Reference methods,which was essential for the deve-lopment of alternative methods …From that time, we had referencemethods for Bacillus cereus,Staphylococcus aureus, Clostidiumperfringens, Listeria monocytoge-nes enumeration, for Salmonellaand Listeria monocytogenes detec-tion. The results obtained wouldmake possible the comparison of al-ternative methods with the referen-ce ones and, hopefully, their vali-dation. The results obtained duringthat SMT Project were published inthe International Journal of FoodMicrobiology.

At that time also, a close coope-ration began between CEN/ISOand AOAC and I’ll will always re-member one day in The Hague(NL) when we discussed around atable about the possible organiza-tion of common experiments con-cerning European and US labora-tories (that was a big concern asit was a European Project !)Finally some trials were organized byEuropean and US laboratories in or-der to compare the ISO method forthe detection of Salmonella (6579/2002)with the AOAC method. Finally, ISO 6579:2002 was recom-mended to be adopted as officialFirst Action for the analysis of freshcheese, fresh chilled and frozenpoultry and dried egg product.I shallgo back on that point in a few minu-tes. For the first time, one could re-ad “Hands touch over the sea “Another point has to be added. Howto introduce new technologies inthat world of traditional methods?;that was also the subject of many dis-cussions. Finally, An important resolution was takenduring the joined meeting ofISO/TC34/SC9 andCEN/TC275/WG6 held in Parma (It)in April 2004.“Each time a standard method isbeing revised, the possibility of usingnew technologies, including PCR,must be examined by comparing re-sults with those obtained when usingthe official conventional method”.For a given microorganism, in order

to complete the existing method, thedevelopment of standardised me-thods based on new technologiescan be proposed when the purposeto be obtained (for example pathoge-nicity level) makes it necessary.When new technologies, includingPCR, are used as alternative me-thods, they must be validated againstthe reference method.Those sentences look probably asquite simple,but I am sure youcannot imagine the number ofhours of discussions which werenecessary to obtain a consensus:that is “international cooperation“But the hours of discussions werevery fruitful..as, finally, rapid methodswere accepted according to the ECregulation 2073 15 December 2005concerning microbiological criteria:“Test results are dependent on theanalytical method used and, there-fore, a given reference methodshould be associated with each mi-crobiological criterion. However,Food business operators have thepossibility to use analytical methodsother than the reference method, inparticular more rapid methods, aslong as the use of these alternativemethods provide equivalent results “

So, alternative methods were fi-nally, officially accepted in the EC

Recent approaches in the har-monization of Food microbio-logical methods

IX WORKSHOP MRAMA

Finally, ISO 6579:2002 was recommendedto be adopted as official

First Action for the analysis of freshcheese, fresh chilled and frozen

poultry and dried egg product

19

But, of course, difficulties we-re not over.. How to validatealternative methods was thefirst question. As we have said, a lot of alternativemethods can be found on the mar-ket and the present workshop is de-voted to those methods, but two mainsystems of validation do exist: - The AOAC Validation process.- The standard EN/ISO 16140.They both are composed of two pha-ses:• A method comparison (Pre-colla-

borative study).• An Interlaboratory Collaborative

Study. Of course there are some differencesbetween the two systems concerningespecially the number of matrices (6for AOAC, 1 for ISO/16140); the re-ference methods are also different(USDA, FDA, AOAC for AOAC, ISOfor EN/ISO/16140) but the principlesare similar, of course.Significant ef-forts have been realized for a mutualrecognition.I would also like to add a few wordsabout recent advances concerningMicroVal.- MicroVal is an “Eurekat“project (the

Eureka programme was set upon1985 to stimulate cross- bordertechnological cooperation and ad-vancement throughout Europe). itstarted in 1993 with the aim of set-ting up European validation proce-dure in four years time and further-more of creating such conditionsthat the results of the procedurewould be accepted as far as pos-sible by all interested parties inEurope Standardization and certi-fication play important roles in thisrespect.

MicroVal started as a Dutch-Frenchinitiative. The project was ended by21 full partners from 7 countries. Let’s me say a few words about thethree working groups which were setup: - Working group 1 studied informa-

tion on the validation used or pro-

posed by AFNOR (AssociationFrançaise de Normalisation), TheAOAC Research Institute, theEuropean Community (EC), theInternational Dairy Federation(IDF) and the International Unionof Pure and AppliedChemistry(IUPAC). The final reportof the first working group was pre-sented at the First Annual Meetingin Paris, 1994.

- Working group 2 drew up the ge-neral rules for the organization ofthe validation procedure and theValidation Certification Scheme.

-The third group started in parallelwith the second and focused ondrawing up the technical rules forvalidation, the test protocol andthe organization of the trial valida-tions in the second stage of theproject.

- The fourth working group lookedafter the financial aspects of theproject.

The General Rules describe the me-thods and the organization to beused for the European certification ofalternative methods for the food anddrink industry by an independent or-ganization: MicroVal certification. In the spring 1996, the MicroVal ste-ering committee started the procedu-re for European Standardization byforwarding to the EuropeanStandardization Committee (CEN), aproposal for a European Standardbased on criteria developed byMicroVal for the validation of alterna-tive microbiolgical methods. Thisproposal was accepted in June 1996by CEN /TC 275/WG6 as a new workitem for a European Standard“Protocol for the validation of alter-native microbiological me-thods“based on the two MicroVal do-cuments “General“and“Technical“rules for Validation crite-ria.. That was the beginning ofMicroVal..One really important event is the ac-ceptance of the results of combinedvalidations Microval / AOAC, last

November during the 2nd MicroValSymposium which was held in theHague (NL). What does it mean ? It means that (cf Michele Smoot):AOAC and MicroVal joined forces tocombine a MicroVal (basisEN/ISO/16140) certificate with AOACValidation (Official Methods ofAnalysis and/or Performance TestedMethods)Both organizations seek to fulfill theirown requirements with respect to theprocedures, rules, fees, etc, while de-signing a protocol that fits both AOACand MicroVal requirements Those two examples I just mentionedseem to me to be very promising ….

What to say as a conclusion ? Everybody knows that harmonizationof Food microbiological methods willsurely take a very long time even if oneknows that “a broad acceptance of mi-crobiological methods and associatedresults would facilitate knowledge ex-change and would speed up the imple-mentation of new methods / technolo-gies across appropriate food matrices“(Michele Smoot, IAAP Europe)However, I think we can be somewhatoptimistic: even if a recent observercould think that the progress is verylow, alternative methods seem to benow fully accepted quite everywhere;some good reference methods doexist, even if the work is not complete…, some approaches to harmonizethe systems of validation do exist andeven combined validations have be-en set up !And all that internationalHarmonization of MicrobiologicalMethods will take a growing importan-ce with the extension of FoodMicrobiolgy to the primary produc-tion..We may hope that, in the future,the situation will improve day by day…May we be allowed to considerInternational Harmonization ofMicrobiological Methods as a wonder-ful school to find the way of consen-sus in different situations of human li-ves ?

IX WORKSHOP MRAMA

20

IX WORKSHOP MRAMA

En la sociedad actual el término se-guridad alimentaria supone un com-promiso muy serio de los producto-res con la sociedad, o mejor, de lasempresas elaboradoras o manipu-ladoras de alimentos con los consu-midores finales de éstos. Las exi-gencias del mercado son cada díamayores, se demandan productosseguros y competitivos, este hechocondiciona la forma de actuar de to-da la cadena alimentaria, principal-mente de la industria transformado-ra, que se ve obligada a buscar téc-nicas de análisis rápidas que le per-mitan poner en el mercado los pro-ductos en el menor tiempo posibley con todas las garantías sanitarias.Mahn Mac no es una excepción,nuestra principal actividad es la fa-bricación de ensaladas refrigeradas,un producto de difícil definición, yaque no encaja en los denominadosde cuarta gama, ni en los de quintagama. Se trata de una comida pre-parada terminada o lista para comer,envasada y conservada sin trata-miento térmico. Esta definición nospermite incluir a nuestros productosdentro del grupo A según describe elReal Decreto 3484/2000 sobre comi-das preparadas.La característica de nuestro produc-to es su corta vida, fijada en 90 dí-as desde su fabricación; esto nosobliga a fabricar prácticamente so-bre pedido, no es posible mantenerun stock ya que supondría consumirdías de su vida útil en nuestros al-macenes perdiéndolos de los linea-les del cliente. Para asegurar la calidad sanitaria denuestros productos durante toda sivida útil aplicamos una combinaciónde efectos barrera, es decir, aplica-mos barreras químicas y físicas a losmicroorganismos de forma que sola-mente puedan sobrevivir el menornúmero de microorganismos bana-les, y ningún patógeno. Para garan-tizar que esto se cumple aplicamosun protocolo de análisis microbioló-gicos en todas las etapas del pro-

ceso donde se incluyen microorga-nismos indicadores de higiene y al-gunos patógenos. Los microorganis-mos analizados son: microorganis-mos aerobios mesófilos, mohos y le-vaduras, enterobacterias, E. coli (co-liformes), Staphylococcus aureus,Salmonella y Listeria monocytoge-nes. Todos ellos incluidos en el RealDecreto 3484/2000 sobre comidaspreparadas. Actualmente seguimosempleando esta batería de microor-ganismos a pesar de la nueva direc-tiva comunitaria.La evolución del número de análisismicrobiológicos en los últimos ochoaños ha sido muy importante, pasa-mos de 4 análisis por día a los 40actuales. Esto supuso dos cosas: unmayor gasto en analítica y una ma-yor necesidad de recursos, tantotécnicos como humanos, para ges-tionar este volumen de trabajo. Porestas razones nos planteamos sus-tituir las técnicas tradicionales, algu-nas con más de 100 años de anti-güedad, por métodos alternativosmás rápidos. Los métodos conven-

cionales tienen la ventaja de su sen-sibilidad, su fácil interpretación y elbajo coste en equipamiento; por elcontrario necesitan mucho tiempopara la obtención de datos, son muylaboriosos y requieren un tamaño demuestra considerable. Cuando nosplanteamos automatizar el labora-torio de microbiología, nos pusimosunas exigencias mínimas que debe-rían cumplir los nuevos métodos al-ternativos, deberían tener precisióny resolución, deberían ser fáciles deusar por los analistas, deberían ge-nerar datos de forma rápida, debe-rían tener aceptabilidad y validacióninternacional, su coste analítico de-bería ser razonable, debería tenerun soporte técnico por parte del pro-veedor y no debería quedarse ob-soleto con el tiempo. Esto es, nues-tras necesidades se resumían en labúsqueda de un método fiable, efi-caz y de costes equilibrados. Todos las técnicas rápidas estudia-das presentaban las mismas venta-jas: permitían una reducción de ma-teriales y de tiempo, lo que se tradu-

Hilario Zapata Bozalongo Director Técnico Mahn Mac Delicatessen, S. L.hilario@mahnmac.com

La automatización total en unlaboratorio de microbiología.Experiencia con tecnicas rápidasen la industria alimentaria

La evolución del número de análisismicrobiológicos en los últimos ocho

años ha sido muy importante, pasamosde 4 análisis por día a los 40 actuales

21

cía en la posibilidad de realizar unnúmero mayor de análisis con elmismo personal y en el mismo tiem-po; pero como desventaja se obser-vó que algunas determinaciones noreducían considerablemente eltiempo de ensayo y que el coste dealguno de estos análisis no solo noera menor, sino que era muy supe-rior, y además, alguna técnica pre-cisaba de personal especializado. Estudiadas todas las posibilidades,nos decantamos por la opción pro-puesta por Biomerieux Industriescon sus equipos Mini Vidas yTempo, ya que con ambos se cum-plían los requisitos exigidos de rapi-dez, fiabilidad, validación internacio-nal y costes equilibrados. Tanto elequipo TEMPO para el recuento demicroorganismos indicadores de ca-lidad, como con el miniVidas para ladetección de patógenos, nos per-miten reducir los pasos necesariosque necesitaban las técnicas tradi-cionales empleadas hasta el mo-mento: ya no es necesario prepararel medio, ni hacer diluciones, ni ino-cular, ni leer placas y tampoco eranecesario hacer el informe final.Todas estas etapas se evitaban em-pleando los protocolo de trabajo deambos equipos.Podemos ver los ahorros de tiempoentre las técnicas convencionales ylas automatizadas en los siguientescuadros (Figura 1).Durante los primeros tres meses serealizaron ensayos por duplicado,empleando técnicas tradicionales(métodos ISO y/o oficiales) y técni-cas rápidas (Tempo y miniVidas),

para comprobar la correlación en-tre ambas, los resultados demostra-ron que ambos sistemas son fiablesy eficaces, el coeficiente de correla-ción fue superior a 0,98 en todos losparámetros testados.El siguiente estudio realizado sobrelas técnicas rápidas empleadas,Tempo y miniVidas, consistió en versu relación costo-beneficio, paraello se realizaron estudios de tiem-pos y de estructura del coste poranálisis. En estudio de tiempos podemos vercomo la microbiología tradicionalemplea para la preparación del en-sayo un 68 % del tiempo, mientrasque las técnicas rápidas emplean el80%; para la realización propiamen-te del ensayo las técnicas conven-cionales destinan un 20 % del tiem-po, y las técnicas automatizadasdestinan un 12%; para la lectura, in-terpretación y emisión del informeempleamos un 12% del tiempo enlas técnicas tradicionales, mientrasque con las técnicas rápidas emple-amos un 8 % del tiempo. Pero es-tos datos por si solos no nos dicennada si no los comparamos entreellos. Las técnicas convencionalesnecesitan, entre un 40 y un 60 %más de tiempo total que las técnicasautomáticas.Si estudiamos la estructura de loscostes por ensayo, podemos com-probar que la mano de obra en lastécnicas tradicionales absorbe un65% del coste, mientras que en lasrápidas solamente supone un 30%.En el caso de los materiales y re-activos empleados, las técnicas

convencionales consumen el 20%del coste, mientras las técnicas rá-pidas absorben el 52%; el concep-to de otros gastos supone en ambastécnicas un 15-18% del coste finaldel análisis.Estas han sido razones principalespor las que Mahn Mac ha automati-zado el análisis microbiológico y haadoptado métodos de ensayo rápi-dos. Es importante destacar algunade las ventajas encontradas en es-tas técnicas: a) la necesidad de li-berar lotes con mayor rapidez, b)ejercer una vigilancia rápida de to-das las etapas que componen elproceso de fabricación, c) la posi-bilidad de realizar un mayor núme-ro de controles que garanticen aúnmás nuestros productos, y c) unahorro de costes a medio plazo.Todas ellas contribuyen a la mayorsatisfacción de nuestros clientes.Podemos concluir diciendo que laautomatización de un laboratorio demicrobiología, así como el empleode técnicas rápidas nos ha contribu-ye a evitar errores humanos, hemosahorrado mucho trabajo manual, he-mos racionalizado los recursos hu-manos, ahorrado espacio, nos hafacilitado la eliminación de residuosy a medio plazo hemos conseguidoun ahorro en los costos. Además, noprecisamos de personal altamentecualificado, solamente con nuestropersonal bien formado y adiestradoen la ejecución de las nuevas tare-as es suficiente para garantizar lacorrecta realización de los análisismicrobiológicos con técnicas rápi-das como Tempo y miniVidas.

IX WORKSHOP MRAMA

22

IX WORKSHOP MRAMA

La inocuidad alimentaria es un objeti-vo común al sector agroalimentario, yuna clara exigencia y preocupación delos consumidores. Del mismo asegu-rar la inocuidad de sus productos, esobjetivo primordial para el sector far-macéutico y cosmético. Para conse-guirlo la industria debe cumplir conuna seria de medidas y controles quegaranticen la obtención de productosinocuos. El mantenimiento de un elevado nivelde limpieza de los equipos y de las ins-talaciones y del entorno de trabajo,afecta de forma directa sobre la inocui-dad del producto final. Para conseguir-lo no solo deben ser regularmente lim-piados y desinfectados sino que su di-seño inicial debe facilitar la realizaciónde estas operaciones eficazmente asicomo garantizar que tanto las instala-ciones como los equipos por su dise-ño no se convierten en foco de conta-minación de los alimentos.El diseño de un equipo o instalaciónse considera “higiénico” si incorpora,con carácter preventivo, característi-cas que reducen o eliminan el riesgode constituir una fuente de contamina-ción para los alimentos, tanto de for-ma directa como indirecta. Por ejemplo, gracias a un adecuadodiseño higiénico es posible garantizarque un equipo o instalación determi-nada no transfiere ningún cuerpo ex-traño, sustancia química, ni microor-ganismo. Para ello, en el ámbito del di-seño higiénico de equipos e instalacio-nes se consideran factores tales comolos materiales de construcción, super-ficies de contacto, drenabilidad, her-meticidad, accesibilidad entre otrosmuchos. Errores o deficiencias en el diseño hi-giénico de instalaciones y de equipospueden hacer fracasar o dificultar laobtención de alimentos inocuos, au-mentando y/o dificultando las tareasde mantenimiento, limpieza, desinfec-ción, control de plagas y control delproceso fundamentalmente necesa-rias para asegurar unas condicionesde producción adecuadas.

Por lo tanto para conseguir equipos einstalaciones higiénicas estas debendiseñarse y construirse cumpliendo re-quisitos higiénicos. Pero aún así en al-gunos casos por razones funcionalesno es posible cumplir totalmente conestos requisitos y se hace necesariodisponer de métodos o ensayos quenos permitan comprobar que aún asíel equipo o instalación es limpiable oesterilizable , según exigencias de uso.

EHEDGEHEDG (European HygienicEngineering and Design Group) es unconsorcio europeo de fabricantes deequipos, industrias alimentarias, insti-tutos de investigación y autoridadespúblicas, fundado en 1989 con el ob-jeto de promover la higiene durante elprocesado y envasado