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INTRODUCTION
1. L’ÉLECTROPHORÈSE CAPILLAIRE Les molécules sont soumises à 2 flux : Le flux électrophorétique : sous l'influence d'un champ électrique, les molécules
chargées se déplacent à une vitesse caractéristique qui est fonction de leur charge et de leur taille. Les molécules chargées positivement se déplaceront vers la cathode alors que celles chargées négativement seront attirées vers l'anode. Les molécules neutres ne sont pas soumises à ce phénomène. La vitesse de ce flux est notée Ve.
Le flux électroosmotique : c'est un phénomène particulier au capillaire de silice, en effet les groupements silanol sont très acides et donnent facilement S-‐O2-‐, ce qui confère au capillaire une charge interne négative. Dans le tampon les molécules chargées positivement vont venir s'adsorber à la paroi interne et lorsqu'un courant est imposé, elles vont être entraînées vers la cathode créant ainsi un flux comparable à un tapis roulant. La vitesse de ce flux est notée Veo. La vitesse totale d'une molécule est la somme de ces deux vitesses :
Vt = Ve + Veo La migration se fait dans un capillaire constitué de polymères de silicate d'un diamètre inférieur à 100 µm (ici 75 µm). Il est rempli d'une solution tampon; on injecte à l'anode et on détecte à la cathode. On applique une tension aux bornes du capillaire et le déplacement des espèces est régi par les deux phénomènes que sont l'électromigration et l'électro-‐osmose.
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +Ve Anode + Ve -‐ Cathode -‐ Veo
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
2. LA DÉTECTION Sur le type d'appareil utilisé en TP, la détection se fait par spectrophotométrie UV-‐visible. La mesure s'effectue directement à travers le capillaire de silice dénudé de sa gaine flexible polyimide. Il est utilisé comme cellule de détection avec un trajet optique de l'ordre de 50 µm. La détection directe utilise l'absorbance naturelle du composé. Il donnera un pic positif à l'écran. La détection indirecte utilise l'absorbance d'un chromophore rajouté au tampon. Il servira à détecter les composés qui n'absorbent pas, ceci donnera un pic négatif car ils vont diminuer l'absorption du chromophore.
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PROCÉDURE D'OBTENTION D'UN ÉLECTROPHORÉGRAMME
1. L'APPAREILLAGE
MDQ Système P/ACE Beckman Coulter
Capillaires Electrodes Tampon Enregistreur
d
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2. MISE EN ROUTE F Allumer l'appareil d'électrophorèse capillaire, l'imprimante, l'écran et le PC., double-‐cliquer sur l'icône représentant l'appareil d'électrophorèse capillaire : PACE System MDQ,
Une fenêtre s'ouvre :
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F Cliquer sur OK, sélectionner alors Instrument 1 :
La fenêtre générale du logiciel apparaît. 1) Procédure de placement des vials dans la machine :
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F Cliquer sur l'icône Control , la fenêtre de contrôle s'affiche :
F Cliquer sur LOAD. Cette manipulation va vous permettre d'ouvrir le couvercle de plateau de l'EC afin de pouvoir placer correctement les différents vials. Remarque : laisser toujours en arrière plan cette fenêtre ouverte. ATTENTION : Tous les vials doivent contenir 1,4 mL de liquide ! Sur le plateau tampons entrée : (à gauche en avant) � Placez en BI:A1 (Buffer Inlet Position A1), un vial de soude à 0,1 mol.L-‐1 qui va servir au nettoyage du capillaire; (En principe : ce nettoyage n'est effectué qu'une seule fois par jour !) � Placez en BI:B1 (Buffer Inlet Position B1), un vial d'eau ultrapure qui va servir au rinçage du capillaire; � Placez en BI:C1 (Buffer Inlet Position C1), un vial de tampon qui va servir à la fois à la détection des anions et à l'inversion de flux électro-‐osmotique (imprégnation de l'intérieur du capillaire); � Placez en BI:D1 (Buffer Inlet Position D1), un vial de tampon qui va servir à la fois à la détection des anions et à l'inversion de flux électro-‐osmotique (vial utilisé lors de la séparation). � Placez en BI:F1 (Buffer Inlet Position F1), un vial vide (vial utilisé pour le stockage du capillaire). Remarque : les anions à séparer et à quantifier n'absorbent pas dans l'UV : la détection indirecte utilise l'absorbance d'un chromophore rajouté au tampon (le chromate). Ceci donnera un pic négatif car ils vont diminuer l'absorption du chromophore : le fait de travailler en inverse permet d'observer des pics positifs ! D'autre part, les anions se dirigeant vers l'anode (électrode +), le tampon dispose d'un inverseur de flux électroosmotique (cela va permettre de raccourcir la durée d'analyse).
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Sur le plateau tampons sortie : (à droite en avant) � Placez en BO:A1 (Buffer Outlet Position A1), un vial vide (vial utilisé comme poubelle de récupération); � Placez en BO:D1 (Buffer Outlet Position D1), un vial de tampon qui va servir à la fois à la détection des anions et à l'inversion de flux électro-‐osmotique (vial utilisé lors de la séparation); � En BO:B1 et BO:C1 (Buffer Outlet Position B1 et C1), les emplacements restent vides; � Placez en BO:F1 (Buffer Outlet Position F1), un vial vide (vial utilisé pour le stockage du capillaire). Sur le plateau échantillons : (à gauche à l'arrière) � Placez en SI:A1 (Sample Inlet Position A1), un vial rempli d'ions Cl-‐ à une concentration de 20 ppm; � Placez en SI:B1 (Sample Inlet Position B1), un vial rempli d'ions SO42-‐ à une concentration de 40 ppm; � Placez en SI:C1 (Sample Inlet Position C1), un vial rempli d'ions NO3-‐ à une concentration de 40 ppm; � Placez en SI:D1 (Sample Inlet Position D1), un vial rempli d'ions HCO3-‐ à une concentration de 20 ppm. F Fermer le couvercle de plateau de l'EC. 2) Procédure de programmation d'une analyse :
F Cliquer sur l'icône de Time Program , une fenêtre apparaît :
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F Vérifier les informations suivantes dans la colonne de gauche : Initial Conditions :
Inlet Sample Tray : 48 Vial Outlet Sample Tray : 48 Vial Cartridge : 25,0 °C Sample : 25,0 °C Power : (no data collection) Max = 9,00 W Voltage : (no data collection) Max = 30,00 kV Current Channel C Max = 300,00 µA Peak Detect : Threshold : 2 Peak Width : 9
F Vérifier les informations suivantes dans la colonne de droite : PDA Detector Initial Conditions :
Scan Data : Channel A Data Rate : 4,0 Channel 1 : Channel B Use Reference Channel : No Wavelength : 254 Bandwith : 10 Channel 2 : (no data collection) Channel 3 : (no data collection) Peak Detect : (no data collection) Data Rate : 4,0 Filter Normal : 16 to 25 Relays : Off
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F Vous allez maintenant créer la programmation de l'électrophorèse capillaire. � Rinçage du capillaire avec de la soude à 0,1 mol.L-‐1 sous une pression de 20 psi pendant 1 minute. (Etape de rinçage qui ne s'effectue que pour la première analyse) � Rinçage du capillaire avec de l'eau ultrapure sous une pression de 20 psi pendant 1 minute. � Rinçage du capillaire avec du tampon sous une pression de 20 psi pendant 1 minute. � Injection de l'échantillon sous une pression de 0,5 psi pendant 4 secondes. � Phase de Séparation sous -‐ 18 kV pendant 5 minutes. F Pour cela, vous allez créer les différents événements en cliquant dans la case Event, comme indiqué ci-‐dessous :
F Choisir Rinse; une fenêtre s'ouvre : dans la zone Values, dans la case Pressure, choisir 20,0 psi; dans la case Duration, choisir 1,00 min; dans la zone Tray Positions : dans la case Inlet, choisir BI:A1; dans la case Outlet, choisir BO:A1. Ne rien changer dans les autres zones de la fenêtre, cliquer sur OK.
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F Pour le deuxième événement : dans la case Event, choisir Rinse; dans la case Pressure, choisir 20,0 psi; dans la case Duration, choisir 1,00 min; dans la case Inlet, choisir BI:B1; dans la case Outlet, choisir BO:A1. F Pour le troisième événement : dans la case Event, choisir Rinse; dans la case Pressure, choisir 20,0 psi; dans la case Duration, choisir 1,00 min; dans la case Inlet, choisir BI:C1; dans la case Outlet, choisir BO:A1. F Pour le quatrième événement : dans la case Event, choisir Inject; dans la zone Values, dans la case Pressure, choisir 0,5 psi; dans la case Duration, choisir 4,0 sec; dans la zone Tray Positions, dans la case Inlet, choisir SI:A1; dans la case Outlet, choisir BO:A1.
Ne rien changer dans les autres zones de la fenêtre, cliquer sur OK. F Pour le cinquième événement : dans la case Event, choisir Separate; dans la zone Values, dans la case Voltage, choisir 18,0 KV; dans la case Duration, choisir 5,00 min; dans la zone Tray Positions, dans la case Inlet, choisir BI:D1; dans la case Outlet, choisir BO:D1; dans la zone Polarity, côcher Reverse.
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Lorsque la programmation est terminée, la fenêtre Time Program doit présenter toutes les informations suivantes :
Assurez-‐vous que les positionnements des vials sur les plateaux correspondent bien à votre programmation ! F Lorsque la programmation est terminée, fermer la fenêtre. Sauvegarder votre méthode sous un nom explicite (8 caractères au plus) en cliquant sur File → Save As.
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3) Procédure de lancement d'une seule analyse
F Cliquer sur l'icône de Run Single , une fenêtre apparaît :
F Dans Sample ID : indiquer l'échantillon à analyser ainsi que sa concentration. F Dans Method, aller chercher la méthode que vous avez sauvegardée précédemment et que vous voulez utiliser pour faire votre analyse. F Dans Save Run As, donner un nom explicite (8 caractères au plus) à votre analyse. F Cliquer sur Start pour démarrer l'analyse. F Cliquer dans la fenêtre Control, pour vérifier que les différentes étapes de rinçages se passent comme prévu; puis, dès que l'étape de séparation est entamée, vous pouvez alors cliquer dans la fenêtre principale pour voir apparaître l'électrophorégramme. Fermer la fenêtre Channel A qui ne servira à rien ici et agrandir la fenêtre Channel B représentant l'électrophorégramme. Remarque : Pour zoomer en temps réel : appuyer simultanément sur les touches Ctrl + Z.
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F À la fin de l'analyse, si le ou les pics de l'électrophorégramme ne sont pas intégrés, cliquer dans Analysis → Analyze pour faire apparaître le ou les temps de migration ainsi que la ou les aires sous le ou les pics.
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F Pour imprimer, cliquer sur l'icône et Print Electropherogram Channel B.
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4) Procédure d'étalonnage : F Lorsque le 1er point de gamme est réalisé, il faut avant tout, créer une table des pics, pour cela cliquer sur Method → Graphical Events Programming → Define Peak(s)..
F Il faut remplir la table des pics en fonction de leur temps de migration. Lorsque la table est remplie, vous devez obtenir la table suivante :
Remarque : pour supprimer une ligne, il suffit de la sélectionner et Edit Delete.
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F Dans la table des pics, il faut indiquer toutes les concentrations des différents points de gamme (Level). Faire une sauvegarde de la méthode.
F Cliquer sur l'icône de recalcul afin de créer le premier point de gamme de la courbe d'étalonnage. Réitérer le processus pour chaque électrophorégramme de chaque point de gamme. F Cliquer dans Method Review Peak Calibration Curve pour observer le résultat de la calibration comme indiquer ci-‐dessous :
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F Pour visualiser toutes les courbes de calibration, il suffit de sélectionner dans la liste des pics (zone de la fenêtre en haut à droite) le composé désiré. Exemple du chlorure ci-‐dessous :
Pour imprimer un rapport personnalisé, cliquer sur Print report → Custom :
