Interaction entre le zinc(II) et le peptide amyloïde bêta

Thèse

Présentée devant

L’UNIVERSITE PAUL SABATIER TOULOUSE III

Ecole doctorale

CHIMIE

En vue de l’obtention du titre de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITE PAUL SABATIER

Spécialité

CHIMIE-BIOLOGIE-SANTE

par

Christine TALMARD

Interaction entre le zinc(II) et le peptide

amyloïde bêta lié à la maladie d’Alzheimer

Soutenue le

19 novembre 2007

Rapporteurs : P. DELANGLE Directeur de recherche CEA (DRFMC/LCIB, Grenoble)

A.-M. ALBRECHT-GARY Directeur de recherche CNRS (LPCB, Strasbourg)

Examinateurs : R. MELKI Directeur de recherche CNRS (LEBS, Gif-sur-Yvette)

C. BLONSKI Directeur de recherche CNRS (LSPCMIB, Toulouse)

B. FRANCES Professeur d’Université (UPS, Toulouse) Directeur de thèse : P. FALLER Professeur d’Université (UPS, Toulouse)

Laboratoire de Chimie de Coordination du CNRS 205, route de Narbonne, 31077 Toulouse

1

Table des matières

Liste des abréviations 5

Chapitre 1 9

Le peptide amyloïde bêta, les ions métalliques et la maladie d’Alzheimer I. La maladie d’Alzheimer, vue d’ensemble 11

I.1. Définition clinique 11 I.2. Rappel historique 12 I.3. La maladie d’Alzheimer, priorité de santé publique 13 I.4. Le diagnostic 14 I.5. Facteurs génétiques, biologiques et environnementaux 16

I.5.a. Facteurs génétiques 16 I.5.b. Facteurs biologiques et environnementaux 18 II. Plaques amyloïdes et neurofibrilles 19

II.1. La protéine tau 20 II.2. Le peptide amyloïde bêta 23

II.2.a. Cas général des amyloïdoses 23 II.2.b. La protéolyse de l’APP 27 II.2.c. Le peptide Aβ 29 II.2.d. Structure des fibres amyloïdes 31 II.2.e. Relation entre Aβ et tau 33 II.2.f. Hypothèse de la cascade amyloïde –Toxicité liée à Aβ 35

II.3. Traitements 38 II.3.a. Traitements actuels 38 II.3.b. Voies de recherche 39

II.4. Influence des métaux 45 II.4.a. Introduction : les métaux et l’organisme 45 II.4.b. Modulation des métaux avec l’âge 50 II.4.c. Evolution du stress oxydant avec l’âge 50 II.4.d. Modulation des métaux dans la MA 51 II.4.e. Implication des métaux dans la MA 52 II.4.f. Approche thérapeutique en relation avec le cuivre et le zinc 61 III. Conclusion et contexte de l’étude 64 Références 65

2

Chapitre 2 101

Etude de la liaison du zinc(II) au peptide amyloïde bêta I. Résumé de l’étude 103 II. Publication 104 III. Complément : principe de la calorimétrie de titrage isotherme 128

Chapitre 3 133

Etude de l’oligomérisation du peptide amyloïde bêta durant son agrégation en présence de zinc(II) ou de cuivre(II) I. Contexte bibliographique et étude de l’influence des métaux sur le degré d’agrégation du peptide amyloïde bêta 135 II. Formation d’un complexe monomérique observable 137 III. Matériels et méthodes 142 Références 148

Chapitre 4 151

Etude structurale du mécanisme de promotion de l’agrégation du peptide amyloïde bêta par le zinc(II) I. Introduction 153 II. Résultats et discussion 155 III. Matériels et méthodes 162 Références 166

Chapitre 5 169

Etude de l’interaction entre la métallothionéine-3 et le peptide amyloïde bêta, influence du stress oxydant I. Introduction bibliographique 171

3

II. La MT-3, source potentielle du zinc retrouvé dans les plaques amyloïdes 174 III. Résultats et discussion 175 III.1. Hypothèse 175 III.2. Expériences avec le modèle Cd7-MT-3 176 III.2.a. Interaction entre Cd7-MT-3 et Aβ 176 III.2.b. Interaction entre Cd7-MT-3 et Aβ en présence de H2O2 177 III.2.c. Interaction entre Zn7-MT-3 et Aβ, en présence de H2O2 178

III.3. Agrégation de Aβ en présence de H2O2 et de Zn7-MT-3 180 IV. Matériels et méthodes 182 IV.1. Matériels 182 IV.1.a. Préparation de Cd7-MT-3 et Zn7-MT-3. 182 IV.1.b. Autres solutions 183

IV.2. Méthodes 183 IV.2.a. Analyse d’acides aminés 183 IV.2.b. Spectroscopie d’absorption atomique 184 IV.2.c. Chromatographie d’exclusion stérique 184 IV.2.d. Spectroscopie d’absorption UV-visible 184 Références 185

Chapitre 6 187

Etude de l’interaction du peptide amyloïde bêta avec les membranes, influence du zinc I. Bibliographie 189 II. Résultats et discussion 191 III. Méthode : la BLM 196 Références 201

Conclusion et perspectives 203

Annexes 207 Remerciements 235 Abstract 237

4

Abréviations

5

Liste des abréviations

Aβ Amyloïde bêta

AD Alzheimer’s Disease

ADAM A Disintegrin And Metalloprotease

ADN Acide Désoxyribonucléique

ADRDA Alzheimer's Disease and Related Disorders Association

AICD APP Intracellular Cytosolic Domain

AINS Anti-Inflammatoires Non Stéroïdiens

AMPA α-amino-3-hydroxy-5-méthylisoazol-4-propionate

apoE apolipoprotéine E

Aph-1 Anterior pharynx defective 1

APP Amyloid Precursor Protein

Arc Activity-regulated cytoskeleton-associated protein

ARN(m) Acide Ribonucléique (messager)

BACE1 Beta site Cleaving Enzyme 1

BCA Acide Bicinchoninique

BLM Black Lipid Membrane

BPLED Bipolar Longitudinal Eddy current Delay

CDK Cyclin-Dependent Kinase

CQ Clioquinol

DC Dichroïsme Circulaire

DFOA Desferrioxamine

DMSO Diméthylsulfoxyde

DOPC 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline

EDTA Acide éthylène-diamine-tétraacétique

ESI-MS

Electrospray Ionization Mass Spectrometry (Ionisation par electronébullisation – Spectrométrie de masse)

EXAFS Extended X-Ray Absorption Fine Structure

GIF Growth Inhibitory Factor (MT-3)

GSK Glycogen Synthase Kinase

GTP Guanosine 5’-TriPhosphate

Hepes Acide [(hydroxy-2-éthyl)-4-pipérazinyl-1]-2éthanesulfonique

HPLC High-Performance Liquid Chromatography

Abréviations

6

Hsp Heat shock protein

IDE Insuline Degrading Enzyme (ou insulinase)

IRM Imagerie par Résonance Magnétique

ITC Calorimétrie de titrage isotherme (Isothermal Titration Calorimetry)

IUPAC-IUB

International Union of Pure and Applied Chemistry - International Union of Biochemistry

JIP JNK Interacting Protein

JNK c-Jun N-terminal Kinase

kDa kiloDalton

Kdapp Constante de dissociation apparente

LA-ICPMS

Analyse par couplage de l'ablation laser et de la spectrométrie de masse à source plasma

LCR Liquide Céphalorachidien

MA Maladie d’Alzheimer

Mint Munc18 interacting protein

MMP Matrices MétalloProtéinases

Mr Poids moléculaire

MT Métallothionéine

NADH Forme réduite du nicotinamide adénine dinucléotide

NEP Néprilysine

NG Newport Green

NINCDS

National Institute of Neurological and Communicative Diseases and Stroke (actuellement : National Institute of Neurological Disorders and Stroke)

NMDA N-Méthyl-D-Aspartate

PAQUID Quid des personnes agées

PAR 4-(2-pyridylazo)-resorcinol

Pen-2 Presenilin enhancer 2

PGSE NMR Pulse Gradient Spin-Echo Nuclear Magnetic Resonance

PI-3K PhosphoInositol-3-Kinase

Pin1 Protein interacting with NIMA (never in mitosis A) 1

PPARγ Peroxisome Proliferator-Activated Receptor γ

PP2A Protéine Phosphatase 2A

PS1 Préséniline-1

PS2 Préséniline-2

PSD Post Synaptic Density protein

Rac1 Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1

Abréviations

7

Rh Rayon hydrodynamique

RMN Résonance Magnétique Nucléaire

ROS Reactive Oxygen Species

SEC Size Exclusion Chromatography

TACE TNF-Alpha Converting Enzyme

TEP Tomographie par Emission de Positons

TFE 2,2,2-trifluoroéthanol

ThT Thioflavine T

TNF Tumor Necrosis Factor

Tris Tris(Hydroxymethyl)aminométhane

TSH Thyroid Stimulating Hormone

Zi Zincon

ZnT Zinc Transporter

8

9

Chapitre 1

La maladie d’Alzheimer,

introduction bibliographique

10

Chapitre 1 : la maladie d’Alzheimer

11

I. La maladie d’Alzheimer, vue d’ensemble

I.1. Définition clinique

La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative du système nerveux central.

Elle entraîne progressivement la perte des fonctions mentales, du fait de la détérioration du

tissu cérébral (Figure 1.1), et conduit finalement à un syndrome démentiel. La nature

neurodégénérative de la MA se traduit par des lésions histopathologiques bien précises qui

sont les plaques séniles et les dégénérescences neurofibrillaires.

Figure 1.1. Comparaison de cerveaux de personnes saines et d’individus atteints de la maladie d’Alzheimer (d’après (Mattson 2004)). (a) Volume global du cerveau (rétrécissement marqué du lobe temporal (partie basse) et des lobes frontaux (partie gauche)). (b) Imagerie TEP révélant le glucose : le patient atteint d’Alzheimer montre une forte diminution du métabolisme énergétique dans le cortex

frontal (haut du cerveau) et les lobes temporaux (sur les cotés).

Anatomiquement, elle est caractérisée par des lésions de l’hippocampe (impliqué dans le

processus de mémorisation) et une atrophie corticale diffuse mais souvent à prédominance

pariéto-occipitale, ce qui rend compte de la symptomatologie aphasie-apraxie-agnosie.

Ainsi, le premier symptôme frappant est la perte de la mémoire à court terme (amnésie) ; elle

se manifeste initialement par des distractions mineures qui s'accentuent avec la progression de

la maladie, tandis que les souvenirs plus anciens sont relativement préservés. En même temps

que les désordres progressent, l'affaiblissement cognitif s'étend aux domaines de la langue

(aphasie), de l'adresse des mouvements (apraxie), de la reconnaissance (agnosie), et aux


12

fonctions exécutives que sont la prise de décision et la planification, rattachées de près aux

lobes frontaux, reflétant l'extension du processus pathologique.

I.2. Rappel historique

Le 4 novembre 1906, lors de la 37ème conférence des psychiatres allemands à Tübingen, Aloïs

Alzheimer, médecin psychiatre à Francfort, décrit un cas de démence d’une femme de 51 ans

Auguste D. (Alzheimer 1907; Alzheimer 1911).

Figure 1.2. Aloïs Alzheimer (1864-1915)

Cette patiente, admise à l’hôpital de Francfort le 25 novembre 1901, décède le 8 avril 1906.

Elle présentait de très nombreux symptômes, allant d’une compréhension et d’une mémoire

réduite jusqu’à l’aphasie, la perte du sens de l’orientation, des comportements imprévisibles,

de la paranoïa, des hallucinations auditives et un délabrement psychosocial avancé.

L’autopsie, à Munich, du cerveau de la patiente révéla des « plaques » formées par une

substance particulière dans le cortex (déjà observé sur un patient épileptique plus âgé par

Blocq et Marinesco)(Blocq and Marinesco 1892) et, pour la première fois, des

enchevêtrements de neurofibrilles (Figure 1.3) (Goedert and Spillantini 2006). Or, en ce

temps-là, un état de démence du sujet âgé etait considéré par la grande majorité des

psychiatres comme normal, lié à l'usure normale du temps, à la fameuse artériosclérose

(maladie artérielle caractérisée par un dépôt de cholestérol et de calcium sur les parois

internes des artères). Cependant, à la suite de cette première observation, Emil Kraepelin, un

des rares psychiatres à croire en l'intérêt de l'étude histologique du cerveau dans les maladies

mentales, parla pour la première fois, dans son traité de psychiatrie en 1912, de la " maladie

d'Alzheimer " définie alors comme une démence du sujet jeune (Auguste D. est décédée à


13

l’àge de 56 ans seulement), rare et dégénérative, laissant au terme de "démence sénile", les

démences vasculaires du sujet âgé (Kraepelin 1910). C’est pourquoi, jusque dans les années

1960, on supposait que la maladie était rare, mais plus tard on s'aperçut que dans beaucoup de

cas, ce que l'on avait pris pour des aspects normaux de la sénescence relevait en fait de la MA.

Figure 1.3. Section du cortex d’Auguste D. révélée à l’argent de Bielschowsky (a) mettant en évidence la présence de neurofibrilles (b) et de plaques amyloïdes (c) (Goedert et al. 2006).

I.3. La maladie d’Alzheimer priorité de santé publique

La MA est à présent la maladie neurodégénérative la plus répandue dans le monde avec

environ 25 millions de malades. En France, on estime à 860 000 le nombre de personnes

atteintes de la MA (Alzheimer 2006). Si les lésions se développent assez tôt dans la vie, la

maladie ne s’exprime habituellement que tardivement, l’âge étant le premier facteur de risque

(sauf dans le cas de mutations génétiques familiales, cf. section I.5.a). L’affection touche plus

de femmes que d’hommes puisqu’au delà de 75 ans, les proportions sont de 13,2 % pour les

hommes et de 20,5 % pour les femmes. Au-delà de 85 ans, la prévalence s’accroît de manière

exponentielle avec une proportion de 25 % de sujets atteints. L’incidence s’élève à 225 000

nouveaux cas par an en France et l’espérance de vie après le début des symptômes est en

moyenne de 8,5 ans (Tableau 1.1).

Actuellement 40 % des patients sont pris en charge dans une institution, ce qui signifie que

60% des sujets atteints sont à la charge des familles. La dépense moyenne pour la prise en

charge d’un patient est de 22 000 euros par an, soit une charge annuelle de 10 milliards

d’euros (moitié pour l’Etat et moitié pour les familles) qui se répartit en 75 % de dépenses

médico-sociales et 25 % de dépenses médicales. Actuellement, ces dépenses s’élèvent à 0,6 %

du PIB mais, compte tenu du vieillissement de la population, elles passeront à 0,8 % en 2020

(estimation à 1,3 millions de cas) et à 1,8 % en 2040 (2,1 millions). La prise en charge des


14

personnes atteintes de démence représentera alors, si la tendance actuelle continue, 7 % des

dépenses de santé.

Age Hommes Femmes Total

75-79 4,6 3,7 4,1

80-84 9,6 15,3 13,2

85-89 15,2 23,8 21,0

> 90 21,6 46,5 40,9

Total 9,1 17,2 14,2

Tableau 1.1. Prévalence de la maladie d’Alzheimer en France pour les personnes âgées de 75 ans et plus (données issues de la cohorte PAQUID) (Ramaroson et al. 2003).

Il n’est donc pas étonnant que la MA ait été récemment désignée « grande cause nationale

2007 » par le gouvernement français et que le parlement européen la considère comme un

« fléau » depuis déjà une dizaine d’années.

I.4. Le diagnostic

Aujourd’hui encore, le seul diagnostic définitif de la MA ne peut être établi que post mortem

via l’autopsie du cerveau du malade. Ainsi, dans un premier temps, le diagnostic a reposé sur

des tests cognitifs simples comme les échelles de Blessed (1968), de Pfeiffer (1975) et le

célèbre Mini Mental Status Examination de Folstein (1975). Ces tests ont été conçus comme

des outils de dépistage rapide et des indicateurs de sévérité de la démence, ils ne sont donc

pas spécifiques de la MA.

En 1984, le NINCDS-ADRDA, groupe américain de spécialistes de la MA, propose les

premiers critères diagnostic de la maladie. Peu à peu se dégage un consensus pour

l'élaboration d'outils d'évaluation performants regroupés autour de 4 axes :

- tests cognitifs : Mattis Dementia Rating Scale ; Alzheimer Disease Assessment Scale-

cognitive subscale (ADAS-cog) ; Syndrom Kurztest ;

- évaluation fonctionnelle (activité de la vie quotidienne) : Instrumental Activities of Daily

Living (IADL) ; Physical Self-maintenance Scale ;

- évaluation comportementale (troubles comportementaux et de l'humeur) : ADAS-non

cognitive subscale ; Behavioral pathology in Alzheimer Disease scale ; Neuropsychiatric


15

Inventory ;

- échelles de classification globale de sévérité : Global Deterioration Scale ; Clinical

Dementia rating Scale.

Actuellement, ces tests sont toujours d’actualité car il n’existe pas encore de marqueur

spécifique de la MA, toutefois ils s’accompagnent de quelques examens complémentaires

plus ou moins routiniers (Sarazin and Dubois 2005).

Le scanner cérébral ou l’IRM sont régulièrement pratiqués mais ces examens ne permettent

pas de mettre en évidence de lésions spécifiques : l'amincissement du cortex (atrophie

corticale ou sous-corticale) se voit dans d'autres maladies de la personne âgée ; ils servent

essentiellement à éliminer d'autres causes : tumeurs, accident vasculaire cérébral, hématome

intra-cérébral ou sous-dural... Des indices sont cependant en cours d'évaluation pour tenter de

faire un diagnostic précoce (dont la diminution de la taille de l'hippocampe, Figure 1.4).

Figure 1.4. Progression de l’atrophie hippocampique chez un patient atteint de la MA,

l’examen annuel par IRM montre l’augmentation de l’atrophie hippocampique et parahippocampique ( rouge) accompagnée d’un élargissement ventriculaire ( verte) et

des sillons corticaux ( grise) (service de neurologie, Hôpital la Salpêtrière). Plus récemment, des techniques de neuroimagerie fonctionnelle telle l’imagerie par résonance

magnétique fonctionnelle (IRMf) ou la tomographie par émission de positons (TEP) et la

tomographie de simple photon (TEMP) qui utilisent des traceurs radioactifs, ont été

développées. Elles permettent l’évaluation du métabolisme des cellules (TEP au 18F-

flurodéoxyglucose), l’analyse de la perfusion cérébrale et la réalisation d’études

pharmacologiques. Des recherches visant à développer des marqueurs de plaques amyloïdes à

l’aide de la TEP sont actuellement en cours.

Enfin, le dosage de la vitamine B12 et de la vitamine B9 (folates), ainsi qu'un bilan thyroïdien

(TSH) sont systématiquement réalisés, car une carence en vitamine B12 ou B9 et une

hypothyroïdie peuvent être causes de démence (démence curable).

Ainsi, en pratique, le diagnostic de la MA se fait donc essentiellement chez une personne


16

présentant des signes de démence d'apparition progressive et pour lesquelles les autres causes

ont été éliminées. Un des enjeux majeurs de la recherche sur la maladie d’Alzheimer concerne

donc la découverte de marqueurs prédictifs fiables permettant de faire un diagnostic sûr et le

plus précoce possible, avant l’apparition de la maladie, c’est-à-dire lors de l’étape dite

asymptomatique qui peut durer plusieurs années. Ce dépistage précoce permettrait une

meilleure prise en charge et un allongement de la durée de vie du patient. La mise au point de

marqueurs spécifiques permettrait également un suivi et une évaluation plus efficaces des

traitements pharmacologiques.

I.5. Facteurs génétiques, biologiques et environnementaux

I.5.a. Facteurs génétiques

La MA est une affection polyfactorielle qui résulte de l’interaction entre un terrain génétique

et des facteurs environnementaux. L’implication des gènes dans la maladie d’Alzheimer est

double (Tableau 1.2) : d’une part, il existe des formes monogéniques exceptionnelles,

caractérisées par un début précoce (inférieur à 60 ans) et par l’atteinte d’un sujet sur deux à

chaque génération (formes autosomiques dominantes) ; d’autre part, dans les formes, de loin

les plus courantes, dites sporadiques de la maladie, sont impliqués des facteurs de risque

génétique (polymorphismes de l’ADN) qui constituent simplement un terrain génétique

favorable.

Chromosome Protéine Age moyen de survenue Conséquence biologique Conséquence

clinique

21 APP 50aine Augmentation de la production d’Aβ totale et Aβ42

MA familiale et/ou angiopathie amyloïde

14 Préséniline-1 40aine 50aine

Augmentation de la production d’Aβ42 MA familiale

1 Préséniline-2 50aine Augmentation de la production d’Aβ42 MA familiale

19 Apo E4 60aine et plus

Augmentation de la densité des plaques d’Aβ et des dépôts vasculaires

Risque supérieur de MA

Tableau 1.2. Principales mutations génétiques corrélées à la MA et leurs conséquences


17

Les formes familiales et héréditaires sont relativement rares (inférieure à 9%) et

correspondent à plus de 150 mutations réparties sur 3 gènes : un gène du chromosome 21

codant pour la protéine APP (amyloid precursor protein), précurseur du peptide amyloïde bêta

(Aβ) principal composant des plaques séniles ; un gène du chromosome 14 et du chromosome

1 codant respectivement pour le préséniline 1 (PS1) et 2 (PS2), les mutations sur ces derniers

favorisent la libération de la forme longue Aβ42 (versus Aβ40), moins soluble.

Quant aux facteurs de susceptibilité génétique, la principale mutation concerne un gène situé

sur le chromosome 19 qui code pour l’apolipoprotéine E (apoE) impliquée dans le transport

du cholestérol (Corder et al. 1993; Strittmatter et al. 1993). En effet, les individus porteur

d’un ou deux allèles ε4 (15 % de la population) ont plus de chance de développer la MA (40 à

65 % des cas sporadiques et familiales), contrairement aux allèles ε3, le plus courant, et ε2,

protecteur (Farrer et al. 1997). L’allèle ε4 est également un facteur de risque pour d’autres

maladies comme les démences vasculaires, la maladie de Creutzfeldt-Jacob et autres

démences. Les mécanismes biologiques qui sous-tendent le rôle de l’apoE sont multiples et

encore mal connus. Plusieurs hypothèses ont été émises : l’apoE E4 peut se lier au peptide Aβ

et pourrait ainsi favoriser son agrégation (Stratman et al. 2005) ; elle augmenterait la

production d’APP (Ye et al. 2005) ; l’apoE E4 est également la moins performante dans la

restauration des membranes lésées via l’apport des lipides constitutifs nécessaires (Mahley et

al. 2006) ; enfin elle pourrait, de manière indépendante au mécanisme amyloïde, avoir des

effets toxiques sur les mitochondries via le clivage de sa partie C-terminale bioactive(Huang

et al. 2001; Chang et al. 2005; Mahley and Huang 2006; Mahley et al. 2006).

Par ailleurs, deux gènes du chromosome 12 codant pour l’α2-macroglobuline et un récepteur

des lipoprotéines de faible densité (tous deux impliqués dans la dégradation de Aβ) ont été

identifiés comme facteurs de risque (Pericak-Vance et al. 1997; Myers and Goate 2001).

Enfin la présence d’un ou plusieurs loci sur le chromosome 10 pourrait également être un

facteur de risque pour la MA (Majores et al. 2000; Pericak-Vance et al. 2000). Cette région

pourrait correspondre à l’enzyme de dégradation de l’insuline (qui jouerait un rôle dans la

dégradation d’Aβ (Vekrellis et al. 2000) ; mais également dans l’augmentation du taux

d’Aβ42 (Ertekin-Taner et al. 2000; Myers et al. 2001)).


18

I.5.b. Facteurs biologiques et environnementaux

Nous avons déjà vu que l’âge est un facteur prédominant pour l’apparition de la MA (cf.

I.1.c). Le tableau 1.1 montre également que les femmes sont plus touchées que les hommes

du fait de leur espérance de vie plus longue mais également à cause de la baisse en

oestrogènes à la suite de la ménopause (Alberca et al. 2002; Candore et al. 2006). En effet les

oestrogènes interviennent dans de nombreux processus au sein du cerveau (apoptose, stress

oxydant, plasticité synaptique, effets sur les neurotransmetteurs, transport du glucose, réaction

inflammatoire…) dont certains ont une influence dans le développement de la MA

(Henderson 2000), cependant les mécanismes sous-jacents sont complexes et encore à

élucider. En effet, paradoxalement, les femmes de plus de 65 ans ayant une supplémentation

en œstrogène ont plus de chance de développer des démences (Henderson 2006).

De plus, un faible niveau d’éducation, ce qui est souvent le cas chez les femmes âgées, a

également une incidence négative et favorise l’apparition de la MA.

De nombreuses études ont également démontré qu’un taux élevé de cholestérol est un facteur

de risque pour la MA (Michikawa 2003). Des hypothèses, parfois contradictoires, ont

également été avancées concernant l’influence des radeaux lipidiques lors de la coupure de

l’APP (Riddell et al. 2001; Wahrle et al. 2002; Cordy et al. 2003; Ledesma et al. 2003; Chen

et al. 2006). Mais il faut savoir que le taux de cholestérol dans le sang est largement

indépendant de celui du système nerveux central (SNC), en effet ce dernier en synthétise la

majeur partie de novo, le lien serait donc plutôt indirect. D’autant plus que les traitements à

base de statines (visant à diminuer le taux cholestérol sanguin chez les patients atteint de

problèmes cardiovasculaires) ont été supposés diminuer l’incidence de la MA (Jick et al. 2000;

Wolozin et al. 2000), indépendamment de leur propriétés lipophiles et donc de leur capacité à

passer la barrière hémato-méningée (Canevari and Clark 2007).

De manière générale, une carence alimentaire en vitamines antioxydantes (notamment C et

E), fréquentes chez les personnes âgées alors que le stress oxydant est important, est un

facteur aggravant de la MA (Morris et al. 2006).

L’hypertension artérielle, qui est connue pour être un facteur aggravant de la MA, pourrait

également être un facteur de risque. De plus, des études ont montré que des personnes traitées


19

contre l’hypertension artérielle avaient un risque moindre de développer la MA, reste à savoir

si ce résultat est lié à l'effet direct des molécules ou uniquement au contrôle de la tension

(Birkenhager and Staessen 2004). Paradoxalement, il a été rapporté qu’une faible pression

diastolique (<65 mmHg) était également un facteur de risque pour la MA (Qiu et al. 2003).

La MA s’accompagne généralement de mécanismes inflammatoires (probablement dus au

stress oxydant), ainsi on note un rôle protecteur des anti-inflammatoires non stéroïdiens

(AINS) comme l’aspirine et l’ibuprofène. Mais les effets secondaires de ces médicaments ne

permettent pas d’envisager une prévention systématique. Cependant, de récentes et

prometteuses recherches ont démontré que certains de ces AINS, dont l’ibuprofène, ont la

propriété étonnante de diminuer le taux de peptides Aβ42 (forme longue plus agrégeante), via

peut-être une modulation de l’activité des γ-secrétases (Czirr and Weggen 2006).

Enfin on peut citer comme derniers facteurs de risque : les traumatismes crâniens (Fleminger

et al. 2003), l’exposition aux pesticides (Baldi et al. 2003), les dépressions nerveuses (Jorm et

al. 1991; Alexopoulos et al. 1993; Devanand et al. 1996). Il semblerait finalement qu’une

consommation modérée de vin ou d’alcool diminue le risque de démence et de MA

(Letenneur 2004).

II. Plaques amyloïdes et neurofibrilles

La maladie d'Alzheimer est caractérisée par la rencontre de deux processus dégénératifs

différents, qui semblent se conjuguer pour provoquer la dégénérescence des cellules

nerveuses : l'agrégation de la protéine tau sous forme de filaments dans les cellules nerveuses

(processus de dégénérescence neurofibrillaire ou pathologie tau) et l’agrégation du peptide

amyloïde bêta (Aβ) sous forme de plaques amyloïdes à l’extérieur des neurones. L’état actuel

des connaissances sur l’agrégation de la protéine tau sera présenté succinctement, puis nous

nous intéresserons plus longuement au peptide Aβ sur lequel porte cette thèse.

II.1. La protéine tau

Les protéines tau forment une famille de protéines dont la masse moléculaire s'échelonne de


20

45 à 62 kilodaltons. Elles sont codées par un seul gène contenant 16 exons et situé sur le

chromosome 17. L'épissage alternatif de ce gène génère la formation de six isoformes (de 48 à

67 kDa), co-existant dans les neurones dans certains rapports (Wischik et al. 1988; Goedert et

al. 1989; Goedert et al. 1989).

Ces protéines comportent des régions répétitives du côté C-terminal (en noir sur la figure 1.5)

qui permettent l'accrochage aux microtubules1 (Lee et al. 1989). En effet, le rôle des protéines

tau est de réguler l’assemblage des sous-unités de tubuline en microtubules : les protéines

phosphorylées induisent la dépolymérisation des microtubules alors que les protéines

déphosphorylées les stabilisent.

Figure 1.5. Représentation schématique des six isoformes de la protéine tau exprimées dans le cerveau humain adulte. Les régions communes à tous les isoformes sont représentées en

bleu, en noir les régions s’associant aux microtubules.

Dans la MA, la dégénérescence neurofibrillaire (Figure 1.6) résulte de l’agrégation

intraneuronale de protéines tau anormalement phosphorylées sous la forme de paires de

filaments appariés en hélice (Kidd 1963; Grundke-Iqbal et al. 1986; Ihara et al. 1986; Goedert

et al. 1988; Wischik et al. 1988; Wischik et al. 1988; Goedert et al. 1992). Ces filaments ont

un diamètre de 10 nm et un pas d'hélice de 80 nm, ils s'accumulent dans les corps cellulaires

des neurones ainsi que dans leurs prolongements neuritiques.

1 Les microtubules, fibres constitutives du cytosquelette, sont des tubes dont la paroi est constituée de plusieurs protofilaments de tubuline. Très nombreux dans les neurones, en particulier dans les dendrites et les axones, ils permettent d'acheminer divers composants vers leurs extrémités.


21

Figure 1.6. exemples de dégénérescences neurofibrillaires ou neurofibrilles (a : localisation

himmunohistochimique avec anticorps spécifiques de l’état de phosphorylation de tau (Goedert et al. 2006) ; b : section du cortex cérébral d’Auguste D. marqué à l’argent de

Bielscowsky (Graeber et al. 1998)).

Plusieurs observations et hypothèses ont été faites pour tenter d’expliquer la formation de ces

neurofibrilles à partir de protéines tau non mutées et donc a priori fonctionnelles.

• Les protéines tau hyperphosphorylées ont également été décrites comme étant

anormalement glycosylées, ce qui induirait une stabilisation l’hélicité des paires de

filaments (Wang et al. 1996). Cette glycosylation précède et favoriserait

l’hyperphosphorylation et ainsi la formation des filaments (à noter que la

glycosylation seule n’a pas d’effet sur la capacité d’assemblage des microtubules) (Liu

et al. 2002; Liu et al. 2004).

• L’état de phosphorylation d’une phosphoprotéine est fonction d’un équilibre entre

l’activité de protéines kinases et de protéines phosphatase. Or il se trouve que

l’activité d’une de ces dernières, la protéine phosphatase 2A (PP2A), est diminuée

d’environ 20 % dans le cerveau de personnes atteintes de la MA (Gong et al. 1993).

Cette diminution influe sur l’hyperphosphorylation de le protéine tau (Gong et al.

1995) et ainsi sur sa capacité d’assemblage des microtubules (Gong et al. 1994; Gong

et al. 2000; Bennecib et al. 2001). La diminution de PP2A est elle-même

probablement due à l’augmentation (d’environ 20 %) d’une de ces deux protéines

inhibitrices IPP2A 1 (protéine cytosolique de 30 kDa) (Li et al. 1995).

• La protéine tau est également plus facilement phosphorylée quand elle est libre que

liée aux microtubules.

• La séquence peptidique joue aussi un rôle, la vitesse et le taux de phosphorylation

a


22

variant avec le nombre de domaines de liaison aux microtubules (3 ou 4, en noir sur la

figure 1.5) et d’inserts N-terminaux (0, 1 ou 2, en rose et vert) (Singh et al. 1997).

Mais quelles sont les conséquences de cette hyperphosphorylation en terme de toxicité ? La

quantité globale en protéine tau est équivalente dans un cerveau sain et dans celui atteint de la

MA. Cependant la concentration en protéine tau hyperphosphorylée est environ 8 fois

supérieure dans ce dernier (Khatoon et al. 1992; Khatoon et al. 1994). Or

l’hyperphosphorylation diminue la capacité de la protéine à s’apparier avec les microtubules

(Lindwall and Cole 1984; Bramblett et al. 1993; Yoshida and Ihara 1993; Tanaka et al. 1995).

Pire encore, ces protéines tau anormalement phosphorylées désassemblent les MT déjà formés

en séquestrant les protéines tau normales (Alonso et al. 1994; Santacruz et al. 2005) La perte

en microtubules induit vraisemblablement une inhibition du transport axoplasmique suivie

d’une dégénérescence synaptique et neuronale.

Tauopathies

Maladie d’Alzheimer Sclérose latérale amyotrophique ou maladie de Charcot Maladie des grains argyrophiles Maladie de Parkinson précoce autosomique dominante Parkinsonisme autosomique dominant Maladie de Parkinson juvénile autosomique récessive Dégénérescence cortico-basale Dementia pugilistica (démence des boxeurs) Démence avec dégénerescence neurofibrillaire diffuse et calcifications intracrâniennes Syndrome de Down (trisomie 21) Démence britannique familiale Démence frontotemporale avec parkinsonisme liée au chromosome 17 Syndrome de Gerstmann-Sträussler-Scheinker Parkinsonisme atypique de Guadeloupe Maladie de Hallervorden-Spatz Dystrophie myotonique (maladie de Steinert) Maladie de niemann-pick de type C Maladie de Pick Parkinsonisme post-encéphalitique Angiopathie amyloïde cérébrale à protéine prion Gliose sous-corticale progressive Paralysie supranucléaire progressive Panencéphalite sclérosante subaiguë Démence à dégénérescence neurofibrillaire seule

Tableau 1.3. Maladies dans lesquelles la présence de dépôts de protéine tau a été décrite.


23

La formation de dépôts de protéines tau n’est pas spécifique à la MA. Ce processus

dégénératif, qui n’est pas forcément doublée de la présence de plaques amyloïdes (Spillantini

et al. 1996; Spillantini et al. 1998; Crowther and Goedert 2000), est en effet le plus répandu

parmi les pathologies démentielles et neurodégénératives. Une grande partie de ces maladies,

nommées tauopathies, est listée dans le tableau 1.3. Les sites de phosphorylation sont

similaires, avec des différences mineures entre les maladies. Cependant la distribution des

différents isoformes dans la composition des filaments varie. Ainsi la MA et le complexe

‘‘sclérose latérale amyotrophique / syndrome parkinsonien’’ de l’île de Guam sont

caractérisés par l’hyperphosphorylation des isoformes de 60, 64 et 68 kDa (présence

également, mais minoritaire, de l’isoforme de 72 kDa). En comparaison, l’isoforme de 60 kDa

n’apparaît pas dans les filaments correspondant à la paralysie supranucléaire progressive et la

dégénération corticobasale (Flament et al. 1991; Ksiezak-Reding et al. 1994), mais est

majoritaire, avec l’isoforme à 64 kDa, dans la maladie de Pick.

L’identification dans les années 90, de mutations dans le gène de l’APP et de la préséniline

dans les cas héréditaires de la MA (environ 1% des personnes atteintes) (Goate et al. 1991;

Murrell et al. 1991; Levy-Lahad et al. 1995; Rogaev et al. 1995; Sherrington et al. 1995) et le

fait que les dépôts de filaments de protéines tau soient présents dans différentes conditions

sans relations apparentes, a conduit une partie de la communauté scientifique à considérer

cette agrégation comme un épiphénomène de peu d’importance. A l’heure actuelle, le débat

reste ouvert.

II.2. Le peptide amyloïde bêta

II.2.a. Cas général des amyloïdoses

Lors de la synthèse de protéines au sein d’une cellule, il y a toujours un risque qu’elles

s’agrègent. Mais la formation d’agrégats est normalement inhibée par les molécules

chaperons et les processus de dégradation, de plus ils sont défavorisés par les séquences

d’acides aminés choisies par l’évolution. Il arrive pourtant que certaines protéines, du fait de

mutations ou de facteurs environnementaux défavorables, s’agrègent ; dans le cas où les

agrégats sont de type fibrillaire (à distinguer des agrégats amorphes), il s’agit d’une

amyloïdose (ou amylose). Il existe ainsi de nombreuses maladies humaines associées à la

formation de fibres amyloïdes extracellulaires ou d’inclusions intracellulaires de type


24

amyloïde, à partir de protéines normalement solubles. Quelques exemples d’amyloses sont

donnés dans le tableau 1.4 où elles sont classées en trois groupes distincts : les maladies

neurodégénératives, comme la MA, dans lesquelles l’agrégation a lieu dans le cerveau ; les

amyloses non neuropathiques localisées pour lesquelles l’agrégation a lieu dans un type de

tissu précis autre que le cerveau et enfin les amyloses non neuropathiques systémiques dont

les dépôts sont retrouvés dans différents tissus de l’organisme (Chiti and Dobson 2006;

Gillmore and Hawkins 2006).

Maladie Protéine / peptide impliqué Nombre de résidus

Structure native

Maladies neurodégénératives

Maladie d’Alzheimer a Peptide amyloïde bêta 40-42 Non structuré

Encephalopathie spongiforme a, c

Prion 253 Résidus 1-120 non structuré Résidus 120-230 hélice alpha

Maladie de Parkinson a Α-synucléine 140 Non structuré

Maladie d’Huntington Huntingtine – poly Q 3144 Principalement non structuré

Démence britannique familiale b

Abri 23 Non structuré

Démence familiale danoise b

ADan 23 Non structuré

Amyloses non neuropathiques localisées

Diabète du type II a Amyline 37 Non structuré

Dystrophie héréditaire de la cornée b

kérato-épithéline (fragment C-terminal principalement)

50-200 Inconnu

cataracte a Cristalline γ variable Inconnu

myosite à inclusions (myopathie) a

Peptide bêta amyloïde 40-42 Non structuré

Amyloses non neuropathiques systémiques

Amylose AL (primaire) a

Immunoglobuline (chaîne légère) ~90 Feuillet bêta

Amylose AA (inflammatoire) a

Sérum amyloïde A (fragments) 76-104 Hélice alpha


25

Amylose ApoAI a, II a ou IV b

Fragment N-terminal de l’apolipoprotéine AI, II ou IV

98, ~70 ou 71

Non structurée

l’amylose de la lysozyme b

Lysozyme muté 130 Hélice alpha + feuillet bêta

l’amylose du fibrinogène b

Fibrinogène (chaîne α) 27-81 Inconnu

Amylose systémique sénile a

Transthyrétine normale 127 Feuillet bêta

Polyneuropathie amyloïde familiale b

Transthyrétine mutée 127 Feuillet bêta

a majoriatirement sporadique b majoritairement héréditaire c 5% de cas par transmission

Figure 1.4. Exemples et classification des amyloses (ou amyloïdoses) (Chiti et al. 2006; Gillmore et al. 2006).

Certaines de ces amyloses sont majoritairement sporadiques, c’est le cas de la MA et de la

maladie de Parkinson, bien que des formes héréditaires soient également présentes (Baltasar-

Rodriguez et al. 2006). D’autres, comme l’amylose de la lysozyme ou celle du fibrinogène,

sont dues à des mutations spécifiques et sont héréditaires. A cela faut-il ajouter

l’encéphalopathie spongiforme qui peut être transmissible (5 % des cas contre 85 % de formes

sporadiques et 10 % héréditaires).

De façon générale, les dépôts amyloïdes extracellulaires sont majoritairement constitués de la

protéine incriminée, qui forme le cœur du dépôt, associée à diverses molécules

(glycosaminoglycanes, apolipoprotéine E, collagène, ions métalliques,… et bien d’autre). Les

fibres qui composent en partie ces dépôts, sont généralement constituées de 2 à 6

protofilaments de 2 à 5 nm de diamètre chacun (Serpell et al. 2000) (à ne pas confondre avec

les protofibrilles, agrégats sphériques de diamètre similaire constitués d’une vingtaine de

protéines en feuillets bêta) (Harper et al. 1997; Harper et al. 1997; Walsh et al. 1997; Walsh et

al. 1999). Une description plus précise de la structure des fibres amyloïdes sera donnée pour

le cas de la MA dans la section II.2.d.

Ces différentes protéines susceptibles de former des dépôts amyloïdes n’ont paradoxalement

pas de séquence peptidique commune ou d’homologie structurale évidente. En effet, autant du

point de vue des structures secondaires que des longueurs / compositions des chaînes


26

peptidiques, l’hétérogénéité est de mise. Cependant, un nombre élevé de résidus hydrophobes,

l’absence de charge nette locale ou globale élevée, et une propension à former des structures

en feuillets bêta, semblent être les trois dénominateurs communs de ces protéines (Broome

and Hecht 2000; Otzen et al. 2000; Schwartz et al. 2001; Chiti et al. 2002; Uversky 2002;

Wurth et al. 2002).

Enfin, il faut noter que, dans quelques cas relativement rares, la formation de fibres amyloïdes

a été conservée par l’évolution pour générer des nanostructures naturelles exploitées par

l’organisme. La plupart de ces amyloses naturelles connues sont développées par des

bactéries, champignons ou levures (Coustou et al. 1997; Eaglestone et al. 1999; True and

Lindquist 2000; Mackay et al. 2001; Chapman et al. 2002; Claessen et al. 2003; Chien et al.

2004; True et al. 2004). Mais il en existe aussi par exemple chez l’araignée : les fibres de

spidroïne forment la soie de la toile de la Nephila Edulis (Kenney et al. 2002). Chez l’être

humain, un fragment de la glycoprotéine Pmel17 polymérise en fibres amyloïdes afin de

séquestrer la mélanine, durant la biogenèse des mélanosomes. Cette fibrillation est régulée via

la coupure de Pmel17 par la furine, une convertase de proprotéine, ce qui n’est pas sans

rappeler la coupure de l’APP (Amyloid Precurseur Protein) par les γ et β-sécrétases

impliquées dans la MA (cf. section II.2.b). Le mécanisme de ces amyloses naturelles

contrôlées pourrait ainsi inspirer l’élaboration de traitement permettant de réguler les

amyloses pathologiques.

II.2.b. La protéolyse de l’APP

Description et fonction de l’APP

L’APP (amyloid precursor protein) est une protéine transmembranaire de type 1 du système

nerveux central, d’environ 700 acides aminés. Elle est constituée d’un large domaine

extracellulaire (environ 88% du poids total, pour l’isoforme majoritaire), d’une unique région

transmembranaire et d’une petite partie cytosolique. Son rôle exact n’est pas encore élucidé,

mais il est clair qu’elle est impliquée dans la synaptogénèse et la plasticité synaptique (Gralle

and Ferreira 2007). Il a été montré que l’APP interagissait avec de nombreuses protéines : la

protéine Go (protéine liant le GTP et intervenant donc dans la signalisation intracellulaire)

(Nishimoto et al. 1993), des protéines adaptatrices comme, par exemple, Fe65 (impliquée

dans la mobilité cellulaire, elle stimulerait la production d’APP/Aβ et interagirait également


27

avec la protéine tau) (Sabo et al. 2001; Sabo et al. 2003; Barbato et al. 2005; Yoon et al.

2005), X11/Mint (impliquée, entre autres, dans la formation des synapses, diminuerait la

production d’APP/Aβ) (Lau et al. 2000; Mueller et al. 2000) et JIP (dont l’interaction avec

APP déboucherait sur une dégradation du signal axonal via la protéine kinésine-1) (Matsuda

et al. 2003).

Génération du peptide Aβ

La région Aβ se situe au niveau de la partie membranaire de la protéine APP. Elle est

composée des 28 acides aminés jouxtant le domaine transmembranaire et des 12 à 14 résidus

voisins faisant partie du domaine transmembranaire. L’Aβ résulte d’un clivage séquentiel de

l’APP par deux enzymes protéolytiques (Figure 1.7) : la β- et la γ-sécrétase (Wolfe 2006).

Dans un premier temps, la β-sécrétase, une protéase aspartique aussi nommée BACE1 (pour

Beta site APP Cleaving Enzyme 1, également appelée memapsin 2) et dont l’activité

enzymatique n’est possible qu’en milieu subcellulaire (à pH acide), clive l’APP au niveau du

site bêta, libérant dans le milieu extracellulaire un large ectodomaine soluble (sAPPβ) (Vassar

et al. 1999). Puis le fragment transmembranaire C-terminal restant, C99, est clivé au niveau

de la bicouche lipidique près de la frontière cytosolique par la γ-sécrétase, générant ainsi les

peptide Aβ40 ou Aβ42 et le fragment AICD (APP Intracellular Cytosolic Domain) libéré dans

le cytosol.

L’APP peut également, et plus couramment, être clivé par l’α-sécrétase plutôt que la β-

sécrétase, c’est la voie non amyloïdogénique. L’α-sécrétase est une protéine de la famille

ADAM (A Disintegrin And Metalloprotease, protéines intervenant dans l’adhésion, la

migration cellulaire et le clivage protéolytique de cytokines et facteurs de croissance), la

littérature propose 3 candidates : ADAM-10, ADAM-17 (TACE) et ADAM-9 (Kojro and

Fahrenholz 2005). Le site alpha se trouvant au milieu de la région Aβ, le clivage

correspondant libère un large ectodomaine soluble (sAPPα), puis l’action de la γ-sécrétase sur

le fragment C-terminal restant C83 génère le peptide p3 non pathogène.


28

Figure 1.7. Représentation schématique du clivage de l’APP libérant le peptide Aβ (Pearson

and Peers 2006).

BACE1 est une protéine membranaire de type 1 caractérisée par un large domaine

extracellulaire comprenant deux résidus aspartiques impliqués dans l’activité β-sécrétase

(Hussain et al. 1999). Elle semble être particulièrement active dans les endosomes (son

activité requérant un pH acide), ce qui pourrait indiquer que le clivage de l’APP se fait

préférentiellement durant son internalisation (Koo and Squazzo 1994; Koo et al. 1996; Perez

et al. 1999). Au niveau de la membrane, elle est localisée dans les radeaux lipidiques

(microdomaines de la membrane biologique enrichis notamment en cholestérol) (Riddell et al.

2001; Cordy et al. 2003; Ehehalt et al. 2003; Abad-Rodriguez et al. 2004), ces derniers

renforçant son activité (Kalvodova et al. 2005). De récentes études ont également avancé que

BACE1 pourrait se dimériser, acquérant ainsi une spécificité catalytique envers l’APP, en

particulier si celui-ci est sous forme d’homodimères ou tétramères (Multhaup 2006).

La γ-sécrétase, qui ne coupe que les liaisons peptidiques situées à l’intérieur de la bicouche

lipidique (Weihofen and Martoglio 2003; Wolfe and Kopan 2004), est un complexe composé

de 4 protéines : la préséniline (PS1 et PS2), la nicastrine, Aph-1 et Pen-2 (De Strooper et al.

1998; Yu et al. 2000; Francis et al. 2002; Goutte et al. 2002). La stoechiométrie et la fonction

de chacune de ces sous-unités au sein du complexe restent à déterminer, on sait cependant que

l’activité catalytique du complexe est très probablement portée par PS1 (Herreman et al. 2000;

Zhang et al. 2000). Il est à noter que la préséniline joue également un rôle essentiel dans la

voie de signalisation Notch (mis-en jeu dans la différenciation cellulaire) (Artavanis-Tsakonas

et al. 1995; De Strooper et al. 1999; Radtke et al. 2004), limitant ainsi les applications


29

thérapeutiques la ciblant. La majorité des cas héréditaires de la MA proviennent de mutations

au niveau des gènes codant pour PS1 ou PS2.

La phosphorylation de APP sur certains résidus sérine et thréonine joue également un rôle

important dans la production de Aβ (Lee et al. 2003; Lu et al. 2003). Plus précisément, il a été

montré que la phosphorylation du motif Thr668-Pro induit un changement conformationnel

(trans → cis, passage de ~0 à ~10% de formes cis) favorisant la voie amyloïdogénique

(clivage par la β-sécrétase au lieu de l’α-sécrétase) (Ramelot and Nicholson 2001). Pour

rétablir l’équilibre initial, la peptidyl-prolyl isomérase Pin1 catalyse le changement cis →

trans, favorisant ainsi à nouveau la voie non-amyloïdogénique (Figure 1.8).

Figure 1.8. Diminution de la production de Aβ sous l’effet de la protéine Pin1, catalyseur de

l’isomérisation du motif pThr 668-Pro de l’APP (Pastorino et al. 2006).

Une dérégulation de la protéine Pin1 et/ou son inhibition par oxydation pourrait donc

favoriser le développement de la MA (Pastorino et al. 2006).

Pin1 pourrait également avoir un effet protecteur dans les tauopathies (cf. section II.1) et le

cancer (Lu 2003; Lu et al. 2006).

II.2.c. Le peptide Aβ

Description


30

Le clivage de l’APP par la β- et la γ-sécrétase conduit principalement à un peptide Aβ de 40

acides aminés noté Aβ40. Cependant, d’autres formes plus courtes ou plus longues sont

également produites (entre 39 et 43 acides aminés), en particulier la forme Aβ42, dont la

séquence peptidique est indiquée sur la figure 1.9, représente environ 10 % des espèces d’Aβ.

Les deux peptides Aβ40 et Aβ42 sont normalement présents en tant qu’espèces solubles dans

les fluides biologiques de tous les individus. Cependant l’Aβ42, plus hydrophobe et principal

constituant des plaques séniles, est supposé jouer un rôle plus important qu’Aβ40 dans la

pathologie.

Asp1-Ala-Glu-Phe-Arg-His6-Asp-Ser-Gly-Tyr10-Glu11-Val-His13-His14-Gln-

Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-

Gly-Leu-Met35-Val-Gly-Gly-Val-Val40-Ile41-Ala42

Figure 1.9. Séquence peptidique du peptide Aβ42, écrite du N- vers le C-terminal. La partie en gras correspond au domaine intramembranaire. En bleu sont indiqués les acides aminés correspondant uniquement à Aβ42, en rouge ceux ayant été évoqués comme participant à la chélation des ions métalliques (dans le site de plus forte affinité) (Clippingdale et al. 2001).

Dans le cadre des études portant sur l’interaction du peptide avec les métaux, les formes

tronquées Aβ16 et Aβ28 (c’est-à-dire comprenant les acides aminés respectivement 1 à 16 et

1 à 28) sont couramment utilisées. En effet, elles contiennent les acides aminés correspondant

au principal site de fixation des métaux et ont l’avantage d’être entièrement (Aβ16) ou

partiellement (Aβ28) solubles, ce qui peut dans certains cas faciliter l’expérimentation mais

ne permet généralement pas l’étude à l’état agrégé.

Rôle du peptide Aβ chez le sujet sain

Le fait que le peptide Aβ soit généré tout au long de la vie sans forcément induire une

pathologie, permet de penser qu’il a peut-être une fonction physiologique. Cependant cette

dernière est encore largement méconnue : une activité neurotrophique et un effet stimulant sur

la viabilité neuronale ont été évoqués (Whitson et al. 1990; Yankner et al. 1990), notamment

en contrôlant un relargage excessif de glutamate dans la synapse (Lesne and Kotilinek 2005;

Pearson et al. 2006), l’hypothèse d’une régulation au niveau de canaux ioniques et dans

l’homéostasie du calcium a également été avancée (Abramov et al. 2004; Plant et al. 2006). Il


31

a également été montré qu’Aβ42 pouvait réguler négativement le taux de sphingomyéline et

Aβ40 la synthèse de cholestérol (Grimm et al. 2005). Il faut cependant être prudent dans

l’assignation d’un rôle physiologique à Aβ, sa séquence peptidique étant très peu conservée

chez les humains et rongeurs (bien que ce ne soit pas le cas chez d’autres mammifères), il est

possible que ce peptide n’ait pas de fonction physiologique essentielle.

II.2.d. Structure des fibres amyloïdes

Le processus de formation de fibres et de plaques amyloïdes à partir du peptide monomérique

soluble, sujet d’intenses recherches, n’a pas encore été élucidé. Mais il est admis que ce

processus passe par l'association de petits agrégats ordonnés ou unités de nucléation, dont la

croissance va déboucher sur de longs protofilaments qui s'enroulent pour former des fibres

amyloïdes matures (figure 1.10).

Figure 1.10. Représentation schématique du processus de formation des fibres amyloïdes.

Cependant, la structure de fibres formées in vitro est, elle, bien décrite dans la littérature.

Cette description a été élaborée à partir de données expérimentales obtenues principalement

par RMN du solide (en accord avec d’autres techniques RMN, diffraction des rayons X et

microscopie électronique) (Malinchik et al. 1998; Antzutkin et al. 2000; Goldsbury et al. 2000;

Antzutkin et al. 2002; Balbach et al. 2002; Petkova et al. 2002; Antzutkin et al. 2003).


32

Figure 1.11. Modèle structural des protofilaments d’Aβ40 (Tycko 2003),(a) représentation en ruban, (b) représentation atomique (en vert les résidus hydrophobes, en magenta les résidus

polaires, en bleu ceux chargés positivement, en rouge ceux chargés négativement).

Dans le modèle structural des protofilaments obtenu par RMN du solide, figure 1.11, les

peptides sont agencés en couches de deux feuillets bêta, perpendiculairement à l’axe de la

fibre (structure dite « cross bêta »). Les résidus 12-24 et 30-40 sont impliqués dans les

feuillets bêta, 25-29 dans le coude, les 10 premiers acides aminés ne sont pas structurés. Les

liaisons C=O et N-H du squelette sont approximativement perpendiculaires à la page. Le cœur

du protofilament est majoritairement hydrophobe (interactions hydrophobes entre brins), à

l’exception des résidus chargés D23 et K28 qui forment un pont salin. La diversité de

morphologie des fibres observées en microscopie électronique reflète les différences

d’association latérale des protofilaments (Goldsbury et al. 1997; Jimenez et al. 2002).

Les protofilaments formés par le peptide Aβ42 ont vraisemblablement une structure très

similaire, leur plus grande vitesse de formation serait d’avantage due à la moindre solubilité

d’Aβ42 par rapport Aβ40 plutôt qu’à une différence structurale (Antzutkin et al. 2002; Torok

et al. 2002; Tycko 2003).


33

Les caractéristiques fondamentales des fibres amyloïdes sont une coloration au rouge Congo

(associée à une biréfringence en lumière polarisée), une augmentation/déplacement de la

fluorescence de la Thioflavine T et leur résistance aux protéases.

II.2.e. Relation entre Aβ et tau

Bien que les deux caractéristiques de la MA, les plaques amyloïdes et les neurofibrilles, aient

été identifiées depuis maintenant plus de cent ans, les relations existant entre Aβ et tau sont

encore mal définies. Actuellement, les dernières recherches tendent à montrer qu’Aβ pourrait

directement ou indirectement interagir avec tau pour accélérer la formation de neurofibrilles

(Gotz et al. 2001; Lewis et al. 2001; Oddo et al. 2003), confirmant ainsi l’hypothèse de la

cascade amyloïde. A titre d’exemple, l’accumulation de plaques amyloïdes précède de

quelques mois le dévelopement de neurofibrilles chez des souris triplement mutées (sur l’APP,

tau et PS1) (Oddo et al. 2003). Il semble donc qu’Aβ, via des mécanismes cellulaires et

moléculaires distincts, facilite la phosphorylation, l’agrégation, une mauvaise localisation et

l’accumulation de tau, aboutissant sur l’apparition de neurofibrilles (Blurton-Jones and

Laferla 2006).

Il a été montré qu’un grand nombre de kinases, en particulier GSK3β et CDK5 (impliquées

dans la phosphorylation de tau et donc indirectement dans la formation de neurofibrilles)

(Cruz et al. 2003; Necula and Kuret 2004; Necula and Kuret 2005), voient leur expression

augmentée dans la MA (Pei et al. 2001; Ferrer et al. 2002; Swatton et al. 2004; Derkinderen et

al. 2005; Griffin et al. 2005; Ho et al. 2005; Stoothoff and Johnson 2005). Or des expériences

in vitro ont montré que la présence d’Aβ dans les cultures cellulaires entraîne une activation

de GSK3β et une augmentation de la phosphorylation de tau (Takashima et al. 1993;

Busciglio et al. 1995; Alvarez et al. 1999). De plus, certaines études semblent indiquer que la

toxicité induite par Aβ est dépendante de tau. Par exemple, le blocage in vitro de GSK3β et

CDK5 protège les neurones contre Aβ (Michaelis et al. 1998; Rapoport et al. 2002). De même,

in vivo, des souris transgéniques porteuses du gène muté de l’APP exhibent une augmentation

de l’activation de kinases de tau (Hwang et al. 2004; Puig et al. 2004). Plus récemment, une

réduction in vivo de la quantité d’oligomères solubles d’Aβ (mais pas des insolubles) a été

corrélée avec une réduction de l’activité de GSK3β et de la phosphorylation de tau (Ma et al.

2006). Il faut cependant rappeler que les souris transgéniques porteuses du gène muté de


34

l’APP ne développent pas la pathologie correspondante à l’hyperphosphorylation de tau et à

la formation de neurofibrilles (excepté une très faible quantité au niveau des plaques

neuritiques extracellulaires). En dehors de l’espérance de vie limitée des rongeurs, il est

possible que la différence d’espèce implique l’absence d’une kinase nécessaire au lien entre

Aβ et tau.

Il est établi que les cerveaux atteints de la MA sont particulièrement sujets à des réactions

inflammatoires (celles-ci étant à la fois bénéfiques – phagocytose d’Aβ - et préjudiciables -

activation des cytokines proinflammatoires) (Duffy et al. 1980; Sheng et al. 1995; Akiyama et

al. 2000; Wyss-Coray and Mucke 2002; Koenigsknecht-Talboo and Landreth 2005). De plus,

des études in vitro ont également montré qu’Aβ était capable d’induire directement une

réponse inflammatoire (Galimberti et al. 1999; Tan et al. 2000; Combs et al. 2001). Or

certaines cytokines proinflammatoires induisent, in vitro et parfois in vivo, une accélération

de l’hyper phosphorylation de tau et de la formation de neurofibrilles (Sheng et al. 2000; Li et

al. 2003; Quintanilla et al. 2004). Ce dernier mécanisme semble impliquer CDK5 (Cruz et al.

2003; Kitazawa et al. 2005).

Plusieurs études ont également montré que la voie ubiquitine-protéasome, mécanisme

principal de dégradation des protéines, était déficient chez les patients atteints de la MA

(réduction de 48 % de l’activité du protéasome dans l’hippocampe) (Keller et al. 2000) et que

cette déficience pourrait contribuer à la formation d’agrégats de tau. En effet de récentes

études semblent indiquer qu’Aβ est impliqué directement ou indirectement dans le

dysfonctionnement du protéasome (Gregori et al. 1997; Lopez Salon et al. 2003; Oh et al.

2005), tandis qu’il existe de nombreux indices attestant d’un lien fort entre la déficience du

protéasome et l’accumulation de tau, même s’il n’est pas encore bien établi si le phénomène

est en aval ou en amont dans la cascade moléculaire et cellulaire (Mori et al. 1987; Perry et al.

1987; Keller et al. 2000; Shimura et al. 2004; Sahara et al. 2005; Qian et al. 2006).

Enfin, une déficience dans le transport neuronal pourrait aussi jouer un rôle important dans la

MA, ainsi que d’autres maladies neurodégénératives (Roy et al. 2005). En effet, des études

montrent une interaction entre l’APP, Aβ et le transport axonal, mais ces interactions sont

complexes et il n’est pas encore clair à partir duquel, du dysfonctionnement du transport

axonal ou de l’augmentation de la production d’Aβ, le mécanisme débute (Koo et al. 1990;

Kamal et al. 2000; Kamal et al. 2001; Pigino et al. 2003; Lazarov et al. 2005; Stokin et al.


35

2005). Parallèlement, certaines données indiquent que l’augmentation de la production ou la

diminution de la dégradation de tau conduirait à une déficience du transport axonal (Ebneth et

al. 1998; Stamer et al. 2002; Mandelkow et al. 2004). De plus, la protéine tau et son ARNm

sont eux-mêmes transportés le long des axones, ainsi un déficit du transport axonal (du fait

par exemple d’une phosphorylation des kinésines, protéines motrices des microtubules, induit

par Aβ) pourrait conduire à une localisation erronée de tau et de son ARNm (cf. revue

(Blurton-Jones et al. 2006)).

L’ensemble de ces données bibliographiques met clairement en évidence une interaction plus

ou moins directe, via des mécanismes distincts, entre Aβ et tau. Il est à noter que la majorité

des ces données pointe plutôt en faveur de l’hypothèse de la cascade amyloïde : la pathologie

amyloïde induirait la formation de neurofibrilles et serait ainsi la cause première de la MA.

II.2.f. Hypothèse de la cascade amyloïde –Toxicité liée à Aβ

L’hypothèse de la cascade amyloïde (Figure 1.12) considère l’agrégation d’Aβ comme

l’initiateur de la MA, plaçant les pathologies associées à tau, ainsi que d’autres modifications

dégénératives, en aval (Hardy and Higgins 1992; Hardy and Selkoe 2002). Cette hypothèse

provient de l’observation des plaques amyloïdes dans le cerveau des patients atteints de la

MA qui est caractéristique de la pathologie, ce qui n’est pas le cas des dégénérescences

neurofibrillaires (cf le tableau 1.3 des tauopathies) ; mais elle a surtout été renforcée par la

découverte des mutations génétiques responsables de la forme familiale autosomale

dominante de la MA sur les gènes codant pour l’APP, PS1 ou PS2 (Hardy et al. 2002). Ainsi,

d’après cette hypothèse, l’agrégation anormale d’Aβ entraînerait une série de déséquilibres et

de processus neurotoxiques débouchant sur la mort neuronale et la démence.

Cependant, l’hypothèse de la cascade amyloïde, même si elle est considérée par une grande

partie de la communauté scientifique comme une base pour la compréhension du processus de

développement de la MA, est en constante évolution. En effet, la corrélation entre plaques

séniles et pertes cognitives n’était pas satisfaisante (« [plaques appear] at the wrong time and

in the wrong places » (Naslund et al. 2000)). Depuis, un grand nombre d’articles ont attesté

d’une meilleure corrélation et d’une toxicité comparativement bien plus importante pour les

oligomères de faible poids moléculaire (protofilaments, petits oligomères, monomères,

agrégats sphériques…mais la difficulté d’isoler ces différents types d’agrégats n’a pas permis


36

d’apporter une réponse définitive à ce jour) (Lambert et al. 1998; Haass and Steiner 2001;

Walsh et al. 2002; Kayed et al. 2003; Stefani and Dobson 2003; Klein et al. 2004).

Figure 1.12. Hypothèse classique de la cascade amyloïde pour les formes familiales de la

maladie d’Alzheimer (d’après (Hardy et al. 2002)). Pour les formes sporadiques, les causes de l’augmentation de la production et de l’accumulation d’Aβ sont moins bien définies.

D’un point de vue de la toxicité, ces espèces de faibles poids moléculaire auraient la capacité

d’induire une dépolarisation et une perméabilisation des membranes (celles-ci facilitant

probablement l’étape de nucléation), altérant ainsi l’activité neuronale et débouchant

finalement sur la mort cellulaire (Hartley et al. 1999; Stefani 2006). Plus précisément, un

déséquilibre au niveau du calcium intracellulaire a été plusieurs fois observé (voir revue

(Stefani et al. 2003)), ce déséquilibre pourrait affecter le bon fonctionnement des

mitochondries (perméabilité, libération de cytochrome C) et/ou directement activer les

caspases, conduisant ainsi à l’apoptose (Orrenius et al. 2003). D’autres voies de toxicité ont

également été avancées : déséquilibre dans l’homéostasie des lipides (Janciauskiene and

Ahren 2000), interactions avec des récepteurs membranaires en quantité croissante (du fait de


37

l’accumulation de produits terminaux de glycation avancée) (Mruthinti et al. 2003; Mruthinti

et al. 2006), liaisons à des intégrines (protéines d’adhésion) activant des voies de signalisation

intracellulaires (Caltagarone et al. 2007), formation de pores au niveau des membranes

(Arispe et al. 1993; Yip and McLaurin 2001; Ji et al. 2002; Quist et al. 2005) (cf. chapitre 5),

accumulation d’Aβ dans les mitochondries couplée à des interactions enzymatiques

perturbant son fonctionnement (Chen and Yan 2006).

Les premiers symptômes de la maladie, comme les défauts de stockage mnésique, pourraient

s’expliquer par une localisation préférentiellement synaptique des oligomères d’Aβ (en

particulier au niveau des clusters de protéines PSD-95) (Allison et al. 2000), associée à la

surexpression de protéines Arc (activity-regulated cytoskeletal-associated protein) inhibitrices

du processus de mémorisation à long terme (Guzowski 2002).

La formation d’un complexe entre Aβ et l’hème pourrait également être source de production

d’espèces oxydantes par les mitochondries, le complexe se comportant comme une

peroxydase (Atamna 2006).

La toxicité liée à l’interaction avec les métaux sera abordée dans la section II.4. de ce chapitre.

Cependant, en marge des courants tauistes (qui place les neurofibrilles à l’origine du

développement de la MA) et βAPPtistes (soutenant l’hypothèse de la cascade amyloïde), une

partie de la communauté scientifique s’interroge encore sur le bien-fondé de ces deux axes de

recherche, argumentant que les deux types de lésions observés chez les patients atteints de la

MA sont pathognomoniques (caractéristiques de la maladie) mais pas forcément

pathologiques, pointant le manque de corrélation entre neurofibrilles / dépôts amyloïdes et

pertes cognitives / mort neuronale (Knowles et al. 1998; Andorfer et al. 2005; Santacruz et al.

2005; Nunomura et al. 2006). En se basant sur (1) l’observation d’une diminution des lésions

représentatives de stress oxydant au voisinage des dépôts amyloïdes (Nunomura et al. 1999;

Nunomura et al. 2000; Nunomura et al. 2004), (2) sur le fait que l’apparition de stress oxydant

semble précéder les dépôts amyloïdes (Misonou et al. 2000; Nunomura et al. 2000; Paola et al.

2000; Pratico et al. 2001; Bayer et al. 2003; Drake et al. 2003; Li et al. 2004; Sung et al.

2004), (3) un effet protecteur d’Aβ40 et 42 sur le stress oxydant induit par le fer et le cuivre

(Zou et al. 2002; Bishop and Robinson 2003) (probablement par chélation des ions

métalliques), ils suggèrent que la production d’Aβ serait une voie de défense contre le stress

oxydant, faisant ainsi de la conséquence (dans l’hypothèse de la cascade amyloïde), la cause.

De même, en attribuant à tau des propriétés anti-oxydantes, la formation de neurofibrilles peut


38

être vu comme une conséquence du stress oxydant (Nunomura et al. 2001; Wataya et al. 2002;

Gomez-Ramos et al. 2003; Nakashima et al. 2004). Dans le cas où cette théorie s’avèrerait

exacte, il faudra alors rechercher les causes de ce stress oxydant, décrit comme relativement

faible (insuffisant pour entraîner une mort cellulaire rapide) mais chronique (Keyse and

Tyrrell 1989; Rushmore et al. 1990; Davies et al. 1995; Wiese et al. 1995) et débouchant sur

des modifications compensatoires, réversibles dans un premier temps, puis permanentes

(incluant entre autre la formation de neurofilaments, de plaques séniles et, en parallèle, une

dérégulation mitotique) (Zhu et al. 2007).

Ainsi, malgré d’intenses recherches menées en ce sens, l’étiologie de la MA est encore loin

d’être élucidée, retardant d’autant la découverte de traitements curatifs, faute d’axes de

stratégie thérapeutique clairs.

II.3. Traitements

Actuellement, il n’existe aucun traitement thérapeutique curatif et/ou étiologique pour la MA,

seuls sont disponibles des traitements symptomatiques (et, en dernier lieu, palliatifs), qui ont

pour but de retarder le développement de la maladie et d’améliorer les conditions de vie des

malades.

II.3.a.Traitements actuels

Différents traitements sont actuellement utilisés pour améliorer les conditions de vie des

patients atteints de la MA, mais aucun d’entre eux n’est curatifs.

Concernant les troubles cognitifs, les inhibiteurs de cholinestérase (donepezil (Shintani and

Uchida 1997; Rogers et al. 1998; Rogers et al. 1998; Burns et al. 1999), tacrine (Davis et al.

1992; Knapp et al. 1994; Samuels and Davis 1997; Gracon et al. 1998), galantamine (Bickel

et al. 1991; Bores et al. 1996), rivastigmine (Sramek et al. 1996; Rosler et al. 1999)) sont les

plus couramment utilisés, aux différents stades de la maladie. Ils inhibent les enzymes

responsables de l’hydrolyse de l’acétylcholine, compensant ainsi la déficience de ce

neurotransmetteur.

A un stade avancé de la MA, la mémantine, un antagoniste non compétitif des récepteurs

glutamatergiques NMDA (N-methyl-D-aspartate), permettrait de contrebalancer le taux

excessif de glutamate en partie responsable de l’augmentation des troubles mnésiques


39

(Fleischhacker et al. 1986; Robinson and Keating 2006; Cosman et al. 2007; Schmitt et al.

2007).

D’autres traitements thérapeutiques sont évoqués dans la littérature, mais leur efficacité reste

encore à confirmer, les résultats des précédentes études réalisées étant parfois contradictoires.

Les traitements à base d’œstrogène pour les femmes en fin de ménopause semblent retarder

de quelques années l’apparition de la maladie, mais aucun résultat positif n’a été vérifié avec

les personnes plus âgées atteintes de la MA (Henderson et al. 1994; Paganini-Hill and

Henderson 1996; Schmidt et al. 1996; Asthana et al. 1999).

Des études rétrospectives ont montré que les anti-inflammatoires non stéroïdiens pouvaient

ralentir la progression de la maladie (via l’inhibition des cyclooxygénases, enzymes de la

biosynthèse des dérivés de type prostaglandine intervenant dans les processus inflammatoires)

(Breitner et al. 1994; Stewart et al. 1997), mais ces résultats n’ont malheureusement pas pu

être reproduits dans des études plus récentes (Aisen et al. 2000; Reines et al. 2004). Certains

d’entre eux, cependant, agiraient selon un mécanisme différent et prometteur, ils seront

évoqués dans la section suivante.

La prise d’anti-oxydant (vitamine E, sélégiline qui stimule la production de superoxyde

dismutase) devrait permettre de compenser la baisse d’enzyme anti-oxydante associée à

l’augmentation d’espèces radicalaires, mais là encore les différences observées entre le

placebo et la molécule active ne sont pas significatives (Pratico and Delanty 2000; Ames and

Ritchie 2007).

Quant aux troubles comportementaux (dépression, psychose), ils sont généralement traités à

l’aide d’anti-dépresseur et d’anti-psychotique jugés compatibles avec la maladie (Schachter et

al. 2000).

En dehors des pharmacopées, l’environnement psychosocial joue un rôle primordial. Une

alimentation saine, des exercices physiques et intellectuels réguliers et variés, une bonne

hygiène permettent de retarder significativement l’avancé de la maladie. Un environnement

social apaisant (soutien familial, maintien au domicile quand c’est possible) est également

nécessaire pour ces personnes fragilisées, plus enclins aux insomnies, syndromes d’anxiété et

dépressions (Mittelman et al. 1996; Stern et al. 1997).

II.3.b.Voies de recherche

Puisque la MA est caractérisée par la formation de plaques amyloïdes, l’inhibition de


40

l’agrégation d’Aβ est apparue comme un axe de recherche logique pour combattre cette

maladie. Dans cette optique, deux groupes de molécules thérapeutiques potentielles ont été

élaborées : les peptides et les « petites » molécules organiques. Dans les deux cas, l’idée est

de concevoir une entité capable de se lier au peptide de façon à empêcher la formation ou

l’accolement de feuillets bêta. Concernant les peptides, de nombreux candidats ont été

avancés : fractions de peptide Aβ sans (Sciarretta et al. 2006) ou avec modifications (Findeis

et al. 1999; Gordon and Meredith 2003), peptides à base d’acides aminés dextrogyres

(Chalifour et al. 2003), ou contenant des résidus prolines (Yamashita et al. 2003) comme la

colostrinine (dérivé du colostrum de mouton) (Gladkevich et al. 2007), certaines protéines

comme la neuroserpine (un inhibiteurs de. protéases à sérine, responsable, dans sa forme

mutée, d’encéphalopathie avec corps d'inclusion de neuroserpine) (Kinghorn et al. 2006).

Même si certains résultats sont encourageants, ce type de molécules a peu de chance de

devenir, en l’état, un médicament efficace, du fait de leur fort potentiel immunogénique

(protéolyse probable avant d’atteindre la cible) et leur faible capacité à passer la barrière

hémato-méningée (Sciarretta et al. 2006). Néanmoins, l’un de ces composés est actuellement

en phase II de tests cliniques : AL-108, développé par Allon, est un petit fragment d’une sous-

unité d’une protéine neuroprotectrice à activité-dépendante (Melnikova 2007).

Une immense panoplie de molécules organiques (non peptidiques) a donc également été

testée, certaines d’entre-elles se sont révélées efficaces dans l’inhibition de l’agrégation d’Aβ :

la DAPH (4,5-dianilinophthalimide) qui désagrège également les fibres préformées

(Blanchard et al. 2004), des dérivés de la triazine (Kim et al. 2006), le scyllo-

cyclohexanehexol (AZD-103, développé par Elan) actuellement en phase II (Melnikova 2007),

la Tramiprosate (considéré comme un glycosaminoglycane-mimétique, développé par

Neurochem) qui est le composé le plus avancé dans les tests cliniques (fin de phase III, cf.

www.neurochem.com/PR209FR.htm) (Melnikova 2007).

Les résultats des tests cliniques devraient permettre d’y voir plus clair quant à l’efficacité de

ce type de traitement. En effet, la réduction des plaques amyloïdes (mesurée in vitro) ne doit

pas impliquer l’augmentation de petits oligomères toxiques (plus difficiles à mesurer). De

plus, comme il a été vu en début de chapitre, il existe dans les mélanocytes (et peut-être

ailleurs) des processus amyloïdiques naturels et contrôlés, nécessaire au bon fonctionnement

de l’organisme. Le manque de spécificité de la plupart de ces composés pourrait donc être

source d’effets secondaires nuisibles (Cohen and Kelly 2003).

http://www.neurochem.com/PR209FR.htm


41

Une autre possibilité pour réduire la quantité des plaques séniles serait de stimuler la

dégradation du peptide Aβ et/ou de ses agrégats. On peut envisager d’activer des protéines

chaperons (Hsp20, Hsp27 , Hsp70, Hsp90, Hsp40, αB-cristalline) (Evans et al. 2006;

Wilhelmus et al. 2006), toutefois leur effet est limité par leur localisation intracellulaire. Il

existe également des enzymes connues pour dégrader le peptide Aβ qui sont : la néprilysine

(NEP), glycoprotéine membranaire impliquée dans de nombreux processus physiologiques en

différents endroits de l’organisme (Kenny and Stephenson 1988; Letarte et al. 1988; Kumar et

al. 1990; Turner and Tanzawa 1997; Broccolini et al. 2006) ; son homologue l’endothéline-

convertase ECE-1 (Eckman et al. 2001; Eckman et al. 2003) ; l’insulinase (ou IDE pour

insulin-degrading enzyme, elle dégrade de multiple substrats dont l’amyline) dont l’altération

génétique pourrait être un facteur de risque (Vekrellis et al. 2000; Vepsalainen et al. 2007) ;

l’enzyme de conversion de l’angiotensine (ECA, exopeptidase qui catalyse la conversion de

l'angiotensine I en angiotensine II, un puissant vasoconstricteur) dont l’action est controversée

(Hu et al. 2001; Eckman et al. 2006) ; la plasmine (ou fibrinolysine, hydrolyse la fibrine et

d’autres facteurs de coagulation) (Van Nostrand and Porter 1999; Tucker et al. 2000) ; les

MMP (matrix metalloprotease, enzymes de dégradation de la matrice extracellulaire) (Sung et

al. 2005; Yan et al. 2006). On peut remarquer qu’AICD, le fragment d’APP cytosolique libéré

lors du clivage de la γ-sécrétase, semble réguler l’expression de NEP (Hass and Yankner 2005;

Pardossi-Piquard et al. 2005; Hebert et al. 2006; Pardossi-Piquard et al. 2006). Cette stratégie

thérapeutique est relativement nouvelle, mais les premiers résultats obtenus en laboratoire,

que ce soit via une thérapie génique ou une approche pharmacologique, semblent prometteurs

(Levites et al. 2003; Marr et al. 2003; Iwata et al. 2004; Turner et al. 2004; Saito et al. 2005).

Enfin il est également possible de stimuler le système immunitaire contre le peptide via

l’immunisation active ou passive. Cette dernière alternative est sujette à controverse, en effet

les premiers résultats obtenus en laboratoire étaient très encourageants (réduction des plaques,

amélioration de l’état cognitif chez les animaux) (Schenk et al. 1999; Schenk et al. 2004),

malheureusement les tests cliniques (consistant en l’injection d’anticorps monoclonaux anti

Aβ) durent être arrêtés précipitamment en phase II, du fait de la survenue de cas de méningo-

encéphalite (4 sur 360) (Orgogozo et al. 2003). Les bénéfices de l’immunothérapie semblaient

pourtant (mis à part ces 4 cas) réels (Hock et al. 2003), mais d’autres rapports ont depuis revu

ces bénéfices à la baisse (Fox et al. 2005; Gandy and Heppner 2005; Gilman et al. 2005). Il

faut également considérer le risque que le système immunitaire ainsi activé cible l’APP,

protéine très probablement nécessaire au bon fonctionnement des neurones (cf. section II.2.b).


42

Néanmoins une nouvelle génération de vaccins (ACC-001, Elan) ne requerrant pas

l’activation du système immunitaire du patient, est actuellement en phase I de test (cf.

www.elan.com/research_development/Alzheimers) (Melnikova 2007). D’autres anticorps

sont aussi en cours de développement : bapineuzumab (Elan/Wyeth) et LY2062430 (Eli Lilly)

en phase II, RN1219 (Pfizer) en phase I (Melnikova 2007).

Le second grand axe de recherche thérapeutique basé sur l’hypothèse amyloïde est la

régulation de la production d’Aβ à partir de l’APP : soit en inhibant la β- et/ou la γ-

sécrétase, soit en activant l’α-sécrétase (voie non-amyloïdogénique).

Malgré la complexité de la γ-sécrétase, protéine composée de plusieurs sous-unités, et le

manque d’information sur sa structure, de nombreux composés inhibant ou modulant son

activité enzymatique ont vu le jour et certains sont déjà entrés en phase de tests cliniques. Le

problème majeur posé par cette sécrétase est qu’elle agit également dans la voie de

signalisation Notch (clivage en S3 du récepteur Notch (De Strooper et al. 1999)), vitale pour

l’organisme et qui est impliquée dans divers processus de différentiation cellulaire durant

l’embryogenèse et chez l’adulte (Artavanis-Tsakonas et al. 1995; Radtke et al. 2004). De plus,

à l’heure actuelle, plus de 30 substrats de la γ-sécrétase ont été rapportés (Nyborg et al. 2006),

ce qui montre clairement la toxicité potentielle que peut entraîner l’utilisation d’inhibiteur de

cette enzyme. La réussite de tels composés repose donc sur la spécificité de la modulation. La

plupart des inhibiteurs actuellement à l’essai reposent sur le motif sulfonamide/sulfone ou

benzodiazepine/benzolactame (Harrison et al. 2004) : le LY-411575, bien que diminuant le

taux de Aβ40 et 42, s’est révélé toxique pour le développement lymphocitaire et le système

gastro-intestinal (attribuable à un disfonctionnement du signal Notch) (Wong et al. 2004) ; les

composés BMS-2999897 et SCH 697466 semblent, d’après les premiers essais effectués sur

des souris transgéniques, pouvoir atteindre un niveau thérapeutique convenable sans toxicité,

cela reste à confirmer (Hyde et al. 2006) ; le LY-450139, même si apparemment non toxique,

ne paraît pas capable, aux doses administrées, de diminuer significativement la production

d’Aβ (tests cliniques en phase II) (Siemers et al. 2006); des premiers résultats positifs ont été

obtenus avec le composé de Merck MK-0752 actuellement en phase II (résultats exposés à la

« 10th international conference on Alzheimer’s disease and related disorders », 2006). Au vu

des difficultés de spécificité rencontrées dans les tentatives d’inhibition, la modulation de

l’activité de la γ-sécrétase pourrait être une bonne alternative. Une nouvelle classe de

médicaments potentiels a récemment attiré l’attention en ce sens : en effet certains anti-

http://www.elan.com/research_development/Alzheimers


43

inflammatoires non stéroïdiens (AINS) (ibuprofèn, indométhacine, sulindac sulphide) ont

montré qu’ils pouvaient réduire la sécrétion d’Aβ42 sans perturber la voie de signalisation

Notch, un effet indépendant de leur habilité à inhiber l’activité des cyclooxygénases (Weggen

et al. 2001). Le Flurizan (myriad Genetics), l’énantiomère R de l’AINS flurbiprofène, a

montré des résultats positifs en phase II et si la phase III l’est autant (résultats fin 2008), le

médicament pourrait être commercialisé d’ici 2009/2010 (Lundkvist and Naslund 2007;

Melnikova 2007). Le mécanisme d’action de ces AINS sur la γ-sécrétase est encore largement

méconnu, cependant une étude a montré qu’il pourrait consister en une altération de la

conformation de PS1 et de l’interaction entre PS1 et APP (Lleo et al. 2004). Une autre série

de composés modulateurs de la γ-sécrétase, NGX 83232, structurellement différents des AINS,

sont également à l’étude (SL Wagner, 7th International Conference AD/PD, 2005).

Dans le cadre d’études précliniques, un nouveau composé, EHT 1864, a permis une

diminution significative de la quantité d’Aβ40 et 42 intra et extra cellulaire, sans inhiber la

voie de signalisation Notch (Desire et al. 2005). La raison réside dans le mode d’action

indirect de ce composé. Celui-ci en inhibant la protéine Rac1, une petite protéine G,

déstabiliserait les radeaux lipidiques (siège probable des interaction APP / γ-sécrétase mais

pas du clivage Notch), perturbant ainsi le clivage du site γ (Field et al. 2000; Rozelle et al.

2000; Gianni et al. 2003; Maillet et al. 2003; Zambrano et al. 2004; Desire et al. 2005;

Vetrivel et al. 2005).

La deuxième sécrétase impliquée dans la production de Aβ, BACE1, est une cible attractive.

En effet des souris transgéniques porteuses d’un gène inactif pour cette protéine ne révèlent

aucune aberration phénotypique apparente (Luo et al. 2001; Roberds et al. 2001; Wolfe 2002;

Hamaguchi et al. 2006). De plus la structure du domaine protéase de la BACE1 est connu, ce

qui facilite la conception d’inhibiteur (Hong et al. 2000). Cependant d’autres études ont

également montré que BACE1 modulerait la plasticité synaptique et la myélinisation (Laird et

al. 2005; Hu et al. 2006; Willem et al. 2006), la prudence est donc de mise. Le nombre de

candidats potentiels correspondant à cette stratégie thérapeutique est actuellement en pleine

expansion, en voici quelques exemples. Une série de composés contenant le dipeptide Leu-

Ala a donné de premiers bons résultats in vitro (Ghosh et al. 2006), d’autres composés

peptidomimétiques et une série d’acylguanidines ont également montré une inhibition de

BACE1 in vitro (Hanessian et al. 2005; Cole et al. 2006; Freskos et al. 2007). Afin de palier à

la faible pénétration au travers de la barrière hémato-méningée de ces composés à caractère


44

peptidique, diverses stratégies consistant à attacher de façon covalente le composé actif à un

« transporteur » ou diminuer la flexibilité conformationelle via une macrocyclisation, ont été

élaborées (Chang et al. 2004; Stachel et al. 2006). Récemment, un inhibiteur non peptidique,

GSK188909, développé par GlaxoSmithKline, s’est également montré satisfaisant in vivo

(tests précliniques)(Hussain et al. 2007) et ATG-Z1, développé par CoMentis, devrait entrer

en phase I de test clinique d’ici peu (annoncé sur www.athenagen.com) (Melnikova 2007).

Une approche potentiellement plus tolérable pour l’organisme serait d’associer les deux types

d’inhibiteur (γ et β), enfin de diminuer la toxicité relatives aux deux médicaments tout en

additionnant leur effet étiologique. De plus, il pourrait être dangereux d’utiliser exclusivement

un type d’inhibiteur, par exemple inhiber uniquement le clivage du site γ pourrait conduire à

l’accumulation de fragments C-terminaux de l’APP, phénomène lié à un déficit mnésique

(Saura et al. 2005). Il semble que les AINS aillent dans le sens de cette « bithérapie », une

récente étude a montré que, en plus de leur capacité à inhiber la γ-sécrétase, ils diminueraient

l’expression de BACE1 en agissant sur le récepteur au facteur activé de prolifération des

peroxysomes γ (Peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ), un répresseur de la

transcription du gène de BACE1 (Sastre et al. 2006). Les AINS seraient donc d’excellents

candidats à la thérapie anti-amyloïde pour la MA.

D’autre recherche se sont orientées vers la stimulation de l’α-sécrétase en défaveur de la

voie amyloïdogénique. De plus, certains fragments issus de la protéolyse non-

amyloïdogenique de l’APP ont des propriétés neuroprotectives, rendant cette approche

d’autant plus attractive (Bowes et al. 1994; Mattson 1994; Smith-Swintosky et al. 1994). Or il

a été montré que la stimulation des récepteurs cholinergiques augmentait la production de

sAPPα, diminuant d’autant la production d’Aβ (Rossner et al. 1998). Ainsi, des agonistes

cholinergiques tels que l’acétylcholine, la nicotine ou le carbacol pourrait jouer ce rôle (Seo et

al. 2001; Suh and Checler 2002). Plusieurs composés sont actuellement à l’étude, mais il est

intéressant de remarquer que le donepezyl, un des médicaments actuellement sur le marché

pour les patients atteint de la MA, pourrait avoir, en plus de son effet symptomatique, un effet

étiologique via la stimulation de l’α-sécrétase (Borroni et al. 2001), ce n’est pas le cas de la

tacrine qui aurait tendance à inhiber la voie non-amyloïdogénique (Lahiri et al. 1994; Chong

and Suh 1996; Lahiri et al. 2000).

Au vue des difficultés rencontrées pour traiter les causes de la MA, d’autres voies


45

thérapeutiques s’attèlent à palier les conséquences (dans l’hypothèse amyloïde) des dépôts

amyloïdes avec le développement : d’anti-inflammatoires (dont, indirectement, des thérapies

induisant une réponse des cellules régulatrices T) (Butovsky et al. 2006; Sela 2006) ; d’anti-

oxydants (Ono et al. 2003) comme, par exemple, les polyphénols du thé vert (Weinreb et al.

2004), le resveratrol (trans-3,4',5-trihydroxystilbene, présent dans le vin rouge) et qui, de plus,

activerait la dégradation des plaques amyloïdes via le protéasome (Dore 2005; Marambaud et

al. 2005; Anekonda 2006), la curcumine capable de réduire les plaques amyloïdes (Yang et al.

2005; Garcia-Alloza et al. 2007), la mélatonine (voir revue (Wang and Wang 2006)), l’acetyl-

L-carnitine (stimule la production de glutathion) (Abdul et al. 2006) ; de composés

neuroprotecteurs (la mémantine, antagoniste des récepteurs NMDA (N-methyl-D-aspartic

acid), agit sur l’excitotoxicité) (Lipton 2007), thérapies stimulant la production de

nicotinamide adénine dinucléotide (agit sur l’axonopathie, dégénérescence de l’axone)

(Belenky et al. 2007; Khan et al. 2007), prévention de l’induction du cycle cellulaire chez les

neurones post-mitotiques (Chong et al. 2005), modulation des récepteurs glutamates

métabotropiques (Riederer and Hoyer 2006; Bernareggi et al. 2007), actions sur les cytokines

et facteurs trophiques (Chong et al. 2005), traitement au lithium(II) (Chuang and Manji 2007).

Cependant, considérant que, en l’état actuel des recherches, il ne semble pas y avoir de voie

unique ou privilégiée conduisant à la mort cellulaire dans la MA, les avis sont mitigés quant à

l’efficacité de ces différentes approches thérapeutiques (Shen et al. 2006).

Les pistes de recherche thérapeutiques sont donc très nombreuses et l’on espère qu’au moins

une d’entres elles aboutisse. Il existe cependant une dernière piste : la thérapie par chélation

des métaux (cf. section II.4.f.). Elle repose sur l’hypothèse d’une influence néfaste des métaux

(cuivre, zinc et fer, en particulier) qui seraient à l’origine de l’agrégation et de la toxicité du

peptide Aβ.

II.4. Influence des métaux

II.4.a. Introduction : les métaux et l’organisme

Un des processus clef qui pourrait expliquer le développement de la MA, est l’altération de

l’homéostasie des métaux, incluant la dérégulation de la neurochimie des métalloprotéines.

C’est cette hypothèse que nous allons traiter dans ce manuscrit, et en particulier le rôle du

zinc dans la MA.


46

Les métaux sont largement présents dans les systèmes biologiques et peuvent être

grossièrement classés en deux catégories : les métaux essentiels, ayant une fonction

physiologique au sein de l’organisme (Zn Fe, Cu, Mn, Mb, Ca…), et les métaux non

essentiels ou toxiques (Cd, Hg, Pb…). A fortes concentrations, les métaux essentiels peuvent

devenir toxiques d’où l’intérêt pour les organismes de les séquestrer pour ensuite les éliminer

ou les transformer au sein d’organites de stockage spécifiques sous forme inerte ou, au moins,

non toxique (Figure 1.13).

Figure 1.13. Effet des métaux sur le métabolisme cellulaire.

Les métaux non essentiels ne possèdent pas de rôles biologiques connus et peuvent présenter

une haute toxicité pour les organismes. Les êtres vivants doivent donc mettre en oeuvre des

processus qui permettent de limiter l’accumulation de ces métaux ou de les stocker sous

forme non toxique (Figure 1.13).

Le zinc dans l’organisme

Le zinc est un élément indispensable à la survie des êtres vivants (Outten and O'Halloran

2001). Dans les micro-organismes, les plantes et les animaux, le zinc est impliqué dans la

fonction de plus de 300 métalloenzymes, où il remplit trois rôles principaux : catalytique,

cocatalytique et structural (Vallee and Auld 1992; Vallee and Auld 1992; Vallee and Falchuk

1993; Takeda 2000). Ces métalloenzymes sont impliquées dans une grande variété de

fonctions, comme la régulation de l’expression des gènes, l’adressage des protéines ou la


47

réponse métal-spécifique au stress (O'Halloran 1993). En tant qu’élément catalytique ou co-

catalytique, le zinc est indispensable au fonctionnement d’enzymes telles que les

carboxypeptidases pancréatiques, la phosphatase alcaline, diverses déshydrogénases ou

encore la superoxyde-dismutase. Chez les mammifères, le zinc est absorbé au niveau de la

bordure en brosse de la muqueuse intestinale. Il est ensuite transporté par le sang vers les

tissus où il est utilisé. Une alimentation appauvrie en zinc cause des perturbations chez

l'animal et chez l’homme, et peut affecter le développement du système nerveux central (SNC)

(O'Dell 1993; Sandstead 1994; Prasad 1995). Certaines affections pourraient également

résulter d’une carence en zinc : acrodermatite entéropathique (ou syndrome de Danbolt et

Closs), troubles de la cicatrisation, de la spermatogenèse ou du comportement alimentaire

(diminution de l’appétit, altération du goût), dermites séborrhéiques, eczéma, psoriasis,

alopécie, certains problèmes immunologiques, des surinfections mycosiques et bactériennes,

des inflammations de la commissure des lèvres, etc. Par ailleurs, des troubles

comportementaux comme la léthargie et la dépression pourraient aussi être liés à une

déficience en zinc (Harrison and Gibbons 1994). En outre, des apports excessifs de zinc

(ouvriers travaillant en zinguerie) ou certaines maladies héréditaires (l’hyperzincémie

familiale ou la maladie de Pick) conduisent également à des désordres du SNC et à des

anémies.

La quantité de zinc dans l'organisme varie entre 2 et 3 g et sa concentration dans le sérum et

dans le liquide extracellulaire est estimé à 0,15 μM (Takeda 2000). À l’exception des îlots de

Langerhans (cellules endocrines du pancréas), le SNC est l'organe le plus riche en zinc. La

quantité du zinc dans le SNC est de 10 μg par gramme de tissu (Frederickson 1989). La teneur

moyenne en zinc total des neurones est estimée à environ 150 μmol/L (Wallwork 1987;

Harrison et al. 1994; Takeda 2000) ; la plus grande partie du zinc dans le cytosol n’est pas

libre, mais liée à des métallothionéines et à d’autres protéines (Frederickson 1989). En

utilisant des sondes fluorescentes, la quantité du zinc libre dans le cytosol a été estimée à 1

nM (Canzoniero et al. 1997; Thompson et al. 2002). La distribution du zinc dans le système

nerveux central (SNC) n'est pas uniforme : il est plus concentré dans la substance grise que

dans la substance blanche, et certaines régions du SNC, comme l'hippocampe, en sont

particulièrement riches (cf. figure 1.14). Entre 5 et 15 % de la quantité du zinc total se trouve

dans des neurones glutamatergiques (Haug 1967; Perez-Clausell and Danscher 1985), où il se

localise à l'intérieur des vésicules synaptiques (Frederickson and Moncrieff 1994).


48

Figure 1.14. A. Fine section de cerveau humain analysée par LA-ICPMS (laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry) montrant une répartition non uniforme du

zinc dans l’hippocampe, en particulier une concentration plus élevée dans les fibres moussues (Becker et al. 2005). B. Localisation de l’hippocampe dans le cerveau humain.

Pendant l'activité synaptique ou suite à la dépolarisation des terminaisons nerveuses de

neurones contenant du zinc, ce dernier est libéré dans la fente synaptique où il est colocalisé

avec le glutamate (ce qui en fait un modulateur potentiel de la transmission glutamatergique)

(Howell et al. 1984; Charton et al. 1985; Aniksztejn et al. 1987; Thompson et al. 2002). Ainsi,

dans les synapses des fibres moussues hyppocampiques, la concentration en zinc pourrait

alors atteindre des dizaines voir des centaines de μM dans les cas extrêmes (Li et al. 2001;

Thompson et al. 2002; Ueno et al. 2002). Cependant d’autres études suggèrent qu’après

stimulation, la concentration du zinc ne dépasserait pas 1 nM (Kay 2003). Ce point reste donc

sujet à controverses, en particulier la pertinence des méthodes de mesure est actuellement

discutée (Frederickson et al. 2006; Bastian and Li 2007).

Les principales voies d’entrée du zinc dans les cellules sont les transporteurs spécifiques du

A.

B.


49

zinc et différents canaux ioniques (activés par le voltage ou des ligands) qui, sans être

spécifiques au zinc, sont cependant perméables à cet ion. Parmi ces canaux, ont été identifiés

les canaux calciques dépendants du voltage, les récepteurs NMDA et les récepteurs AMPA

perméables au calcium (Weiss et al. 1993; Sheline et al. 2002). Les transporteurs spécifiques

du zinc se classent en plusieurs groupes appelés ZnT 1-7 (cf. revue (Colvin et al. 2003)), mais

seul les ZnT 1, 3, 4 et 6 sont présents dans le cerveau. De nombreuses observations

expérimentales indiquent que ZnT3 serait le transporteur responsable de l’accumulation de

zinc dans les vésicules synaptiques des terminaisons glutamatergiques (Palmiter et al. 1996;

Wenzel et al. 1997; Cole et al. 1999).

Figure 1.15. Transport du zinc synaptique. Les vésicules ornées de ZnT3 sont assemblées dans l’appareil de Golgi du neurone glutamatergique (1) et transportées le long de l’axone

(2).Une fois dans la terminaison présynatique (3), les vésicules contiennent à la fois du zinc et du glutamate qui vont être libérés dans la fente synaptique par exocytose calcium- et

impulsion-dépendante (4). Le zinc module de nombreux canaux, transporteurs et récepteurs localement et diffuse (peut-être) jusqu’à ceux de cellules gliales et d’autres neurones (6-10).

Tous les canaux à calcium sont perméables au zinc (5, 9) le zinc étant ensuite chaperonné par les MT (11). Oxydation et nitrosylation des thiols de la MT libèrent le zinc, ce qui pourrait

avoir des conséquences dans la MA (12) (Frederickson et al. 2005).

Un grand rôle dans l’homéostasie du zinc (Figure 1.15) est également attribué aux

métallothionéines (MT), un groupe de protéines de faible poids moléculaire, riches en résidus

cystéines, qui présentent de nombreux sites de liaison pour le zinc et le cuivre. On a identifié


50

plusieurs isoformes de ces protéines, appelées MT-1, MT-2, MT-3 et MT-4 (Ebadi et al.

1995). Dans le cerveau, les formes MT-1 et MT-2 ont été trouvées dans les astrocytes

(Hidalgo and Carrasco 1998) tandis que la MT-3 est présente dans les cellules neuronales et

notamment dans les neurones glutamatergiques (Palmiter et al. 1992; Masters et al. 1994).

Certaines études indiquent une déficience en MT-3 chez les personnes atteintes de la maladie

d’Alzheimer (Tsuji et al. 1992; Uchida 1994) mais son implication dans le développement de

cette affection reste controversée (cf. chapitre 5).

II.4.b. Modulation des métaux avec l’âge

Chez la souris, une augmentation des concentrations en cuivre, fer et cobalt avec l’âge a été

observée, tandis que celle du zinc et du manganèse restaient constantes (Maynard et al. 2002).

Similairement, dans le cerveau humain, la concentration en cuivre dans le plasma augmente

régulièrement avec l’âge, tandis qu’elle reste constante pour le zinc jusqu’à ~75 ans pour

diminuer ensuite (McMaster et al. 1992; Madaric et al. 1994; Monget et al. 1996).

L’augmentation en cuivre peut être due à une élévation avec l’âge de ceruloplasmine (ou

ferroxidase, une alpha 2-globuline fixant 90 % du cuivre plasmatique) (Connor et al. 1993;

Milne and Johnson 1993). On observe également une augmentation avec l’âge de clusters de

cuivre et d’ions fer dans le cerveau (Wender et al. 1992). Il faut cependant noter que la plupart

des métaux étudiés (Na, K, P, Ca, Mg, Si, Cr, Cu, Ni, Zn, Fe, Al, Cd, Pb et As) ont des

concentrations différentes en fonction de la localisation dans le cerveau, des altérations dans

cette distribution pourraient également jouer un grand rôle dans le développement de la MA

(Rajan et al. 1997).

Dans le cas du zinc, on dénote aussi chez les sujets âgés une surproduction en

métallothionéine (particulièrement MT-1 et MT-2, les résultats obtenus pour la MT-3 étant

controversés) et α-2 macroglobuline, apparemment en réponse à l’élévation du stress oxydant

(Mocchegiani et al. 2000). Du fait de la forte affinité des ces protéines pour le zinc, cette

surexpression entraînerait une diminution du zinc « accessible » aux autres protéines (en

particulier la thymuline, d’où un déclin du système immunitaire) (Mocchegiani et al. 2006).

II.4.c. Evolution du stress oxydant avec l’âge

La production d’espèce réactives de l’oxygène (ROS) est une des principales hypothèses pour

expliquer le processus de vieillissement (Harman 1956; Barja 2004). C’est également une


51

hypothèse pour l’apparition de la MA. Ce phénomène est en effet d’une ampleur considérable

puisqu’il semble qu’environ la moitié des protéines d’un animal sénescent soient oxydées

(Gafni 1997). Les ROS sont dérivés de la réduction univalente de l’oxygène et incluent les

espèces telles que l’anion superoxyde, le peroxyde d’hydrogène et les radicaux hydroxyles.

Les ROS peuvent être produits au sein de l’organisme via une grande variété de mécanismes,

cependant la réaction de l’oxygène avec des métaux à activité redox, lié ou non à des

protéines, est la principale source de ROS (Halliwell and Gutteridge 1984). Une petite

quantité de ROS peut être bénéfique à la cellule en jouant le rôle de messager, régulateur de

gènes ou médiateur de l’activation cellulaire. Cependant une augmentation de leur

concentration peut entraîner de nombreux effets néfastes : peroxydation des lipides (Gupta et

al. 1991; Cini and Moretti 1995; Zhu et al. 2006), inactivation d’enzymes, altération des

structures tertiaires de protéines (Forster et al. 1996; Poon et al. 2006) et oxydation de l’ADN

(dont l’ADN mitochondriale) (Hamilton et al. 2001). Parallèlement, on observe une

diminution, avec l’âge, de l’ensemble des mécanismes de défense contre les ROS

(métalloenzymes comme la catalase, glutathion, vitamine E/C, …) (Gracy et al. 1985;

Rosenberger 1991).

Dans les cerveaux de personnes atteintes de la MA, le stress oxydant semble encore plus

important : un taux élevé en lipides peroxydés et la présence de nombreux produits

d’oxydation de protéines et d’ADN ont été observés (Butterfield and Lauderback 2002; Keller

et al. 2005; Sultana et al. 2006).

II.4.d. Modulation des métaux dans la MA

De nombreuses études ont montré la présence d’un déséquilibre de l’homéostasie des métaux

de transition dans le cerveau (hippocampe, amygdale, néocortex et bulbe olfactif) des

personnes atteintes de la MA (Adlard and Bush 2006). En effet, on remarque une

augmentation (facteur 3 à 5) en zinc, cuivre et fer dans les noyaux cortico-médians et baso-

latéraux de l’amygdale, mais les plus grandes concentrations se situent au niveau des plaques

amyloïdes : 390 μM de cuivre, 1050 μM de zinc, 940 μM de fer, à comparés aux

concentrations de 70, 350 et 340 μM respectivement chez le sujet sain (Lovell et al. 1998).

Des analyses histochimiques ont également montré une concentration élevée en zinc au

niveau des neurofilaments et des dépôts amyloïdes caractéristiques de l’angiopathie amyloïde

(Suh et al. 2000). Dans le sérum et le liquide céphalorachidien (LCR), les résultats diffèrent

suivant les études, par exemple : diminution du taux de fer et zinc et une élévation du taux de


52

cuivre (Basun et al. 1991), ou diminution en zinc dans le LCR (mais pas en fer, cuivre ni

manganèse) et pas de changement notable dans le sérum (Molina et al. 1998). Les principaux

transporteurs de ces métaux (céruloplasmine, protéine de transport du zinc ZnT1,

métallothionéines, protéines liées au fer) semblent également connaître des altérations régio-

spécifiques lors de la MA (Uchida et al. 1991; Connor et al. 1993; Adlard et al. 1998; Smith

et al. 1998; Yu et al. 2001; Bishop et al. 2002; Lovell et al. 2005; Moreira et al. 2005). Ainsi il

apparaît assez clairement une perturbation significative de l’homéostasie du cuivre, fer et zinc

chez les personnes atteintes de la MA. Compte tenu des rôles multiples des ces ions

métalliques au sein de l’organisme et en particulier du système nerveux central (SNC)

(maintient des fonctions enzymatiques et mitochondriales (Yamaguchi et al. 1982; Rossi et al.

2004), immunité (Percival 1998), myélination (Hara and Taketomi 1986; Wegner 2000),

apprentissage et mémoire (Youdim and Yehuda 2000; Bhatnagar and Taneja 2001; Takeda

2001), etc…) leur dérégulation participe inévitablement au spectre des altérations

caractéristiques de la MA. Cependant, l’interaction de ces métaux avec le peptide Aβ suggère

qu’une dérégulation de leur homéostasie pourrait être fondamentalement impliquée dans la

MA en tant que cause et pas seulement en tant que conséquence.

II.4.e.Implication des métaux dans la MA

Implication de métaux toxiques

Dans le cas de métaux particulièrement toxiques comme le plomb, le mercure et le cadmium,

la démonstration de leur implication dans différents processus contribuant à la

neurodégénération est largement établie (Weisskopf et al. 2004; Bleecker et al. 2005;

Lanphear et al. 2005). Leur lien éventuel avec la MA est moins clair. Une surexposition au

plomb en début de vie pourrait favoriser ensuite l’élévation d’APP et Aβ (Basha et al. 2005).

Une théorie concernant l’aluminium est également présente dans la littérature. Il a ainsi été

impliqué dans la formation des neurofilaments, dans l’agrégation et la toxicité d’Aβ (cf.

revues (Gupta et al. 2005; Kawahara 2005)). Ce métal, sans activité redox intrinsèque,

pourrait également promouvoir le stress oxydant via la formation du radical AlO22+ facilitant

les oxydations biologiques dues à l’ion superoxyde (oxydation du coenzyme NADH,

accélération de l’oxydation due au fer, peroxydation des lipides) (Exley 2004). Cependant,

l’aluminium, qui n’a pas de fonction biologique, a des propriétés toxiques, son implication

dans la MA demeure donc controversée (Forbes and Hill 1998; Munoz 1998).


53

D’un point de vue thérapeutique, la desferrioxamine (DFOA), utilisée depuis 1963 comme

chélateur du fer puis de l’aluminium en 1980 (Keberle 1964; Ackrill et al. 1980; Arze et al.

1981; Swartz 1985; Domingo 1989), semble ralentir le développement de la maladie

(McLachlan 1991), mais l’existence d’effets secondaires ne permet pas un traitement sur la

durée (Kruck et al. 1990; McLachlan 1991; Domingo 1996). De plus, l’administration de

DFOA n’empêche pas la formation de neurofibrilles comme escompté, son action est donc

probablement anti-oxydante et anti-inflammatoire non spécifique (Savory et al. 1994). Des

résultats plus encourageants ont cependant été décrits, en laboratoire, avec des composés

comme Feralex-G (Shin et al. 2003), mais à l’heure actuelle aucun traitement ciblant

l’aluminium dans la MA n’a été rapporté être en phase de tests cliniques. Cependant la

recherche de chélateurs de l’aluminium ayant moins d’effet secondaire que DFOA est

toujours d’actualité, ne serait-ce que pour les cas d’intoxication à ce métal (Missel et al. 2005).

Implication du Fer...

...avec Tau

Le fer semble jouer un rôle important dans la toxicité et l’agrégation de tau : la présence de

fer dans les neurofilaments pourrait exercer une activité pro-oxydante (Sayre et al. 2000) et le

fer (III) (mais pas le fer(II)) peut induire l’agrégation de tau hyperphosphorylé (agrégation

réversible si le fer (III) est réduit en fer(II)) (Yamamoto et al. 2002).

L’homéostasie du fer est également liée indirectement à tau, via le bon fonctionnement des

microtubules. En effet, il a été montré que les microtubules jouent un rôle important dans la

régulation de le ferritine, une protéine de stockage du fer (Hasan et al. 2005). La ferritine a

également été identifiée dans les filaments de tau dans le cas de paralysie supranucléaire

progressive (ou maladie de Steele, Richardson et Olszewski) (Perez et al. 1998) et il semble

que son dysfonctionnement dans la MA soit en partie responsable de l’augmentation du stress

oxydant (Quintana et al. 2006).

… avec l’APP

Le fer semble réguler l’expression de l’APP, comme suggéré par des expériences utilisant le

gène rapporteur codant la luciférase, accolé à la région 5' non traduite de l’ARNm de l’APP.

La biosynthèse de l’APP est donc ainsi sous contrôle post-transcriptionnel « fer-dépendant »,

un taux élevé de fer intracellulaire augmente ainsi la production d’APP (Rogers et al. 2002;

Venti et al. 2004; Reznichenko et al. 2006).


54

...avec Aβ

La concentration physiologique du fer ionique libre (Fe3+, Fe2+) est de l’ordre du pico- / nano-

molaire. Or la constante de dissociation du fer(II) serait de l’ordre du micromolaire (la

littérature étant très réduite dans ce domaine, cet ordre de grandeur reste à confirmer)

(Garzon-Rodriguez et al. 1999), ce qui n’explique pas la présence massive de fer dans les

plaques amyloïdes (Beauchemin and Kisilevsky 1998). Une dérégulation de l’homéostasie de

ce métal pourrait donc en être l’origine. Il semble par exemple qu’un dysfonctionnement de la

ferritine soit en partie à l’origine de l’accumulation de fer dans les plaques séniles, de plus

elle a été retrouvée agrégée autour des plaques amyloïdes (Quintana et al. 2006).

...relativement à la toxicité

La littérature concernant le rôle du fer dans la MA est beaucoup moins importante que pour le

cuivre et le zinc. Cependant il semble que, de la même manière que pour le cuivre, le peptide

Aβ ait la capacité de catalyser la réduction de Fe3+ en Fe2+ (éventuellement en présence

d’agents réducteurs tels que l’ascorbate ou le gluthathion), favorisant ainsi la production de

ROS (Smith et al. 1997; Huang et al. 1999). On peut envisager le mécanisme suivant, avec

Meox-Aβ représentant Fe3+-Aβ ou Cu2+-Aβ :

Meox-Aβ + e- (agent réducteur) Mered-Aβ (1)

Mered-Aβ + O2 Meox-Aβ + O2•- (2)

O2•- + O2

•- + 2 H+ H2O2 + O2 (3)

Mered-Aβ + H2O2 Meox-Aβ + HO- + HO• (4)

La réaction (3) est catalysée par la superoxyde dismutase mais on peut aussi envisager la

réaction suivante : Mered-Aβ + O2•- + 2 H+ Meox-Aβ + H2O2 (3’)

Concernant l’agrégation d’Aβ, la présence de fer ne semble ni promouvoir, ni retarder le

processus (Yoshiike et al. 2001; House et al. 2004). Par contre, d’un point de vue structural,

l’agrégation d’Aβ en présence de fer(III) conduit à des structures en feuillets bêta, il pourrait

donc directement participer à la formation des plaques amyloïdes (House et al. 2004).

... en corrélation avec une approche thérapeutique

Le principal polyphénol contenu dans le thé vert, l’épigallocatechine-3-gallate, pourrait

chélater le fer intracellulaire, diminuant ainsi la production de l’APP (l’étape post-

traductionnelle étant dépendante du fer à cause de la luciférase) (Reznichenko et al. 2006).

Des études ont également été menées avec la desferrioxamine (DFOA), utilisée depuis une

quarantaine d’années dans le cas de surcharge en fer dans l’organisme (Chaston and

Richardson 2003; Kalinowski and Richardson 2005). Cependant la DFOA, même si elle


55

donne de bons résultats in vitro (inhibition post-transcriptionnelle de l’APP) n’a pas la

capacité de passer la barrière hémato-méningée. D’autres chélateurs du fer, capables de

franchir la barrière hémato-méningée, sont donc à l’étude (Bandyopadhyay et al. 2006;

Mandel et al. 2007). Ainsi un composé nommé M-30, qui active la différentiation neuronale, a

un effet neuroprotecteur et permet la réduction du taux d’APP et d’Aβ, dans les cultures

cellulaires (Avramovich-Tirosh et al. 2007).

Implication du cuivre…

...avec Tau

Le cuivre peut se lier à des peptides correspondant à la deuxième (R2) et troisième (R3)

région répétitive d’accrochage aux microtubules de la protéine tau, induisant ainsi un

changement conformationnel. Ce dernier correspond, pour le peptide R2, à la formation d’une

structure en hélice alpha, ce qui pourrait favoriser la formation de filaments en paires

d’hélices (Ma et al. 2005; Ma et al. 2006). D’autres études ont également avancé que la

présence de cuivre dans les neurofilaments pourrait exercer une activité pro-oxydante (Sayre

et al. 2000).

Il faut enfin noter que le cuivre perturbe la polymérisation des tubulines et donc l’assemblage

en microtubules, ainsi une augmentation du taux en cuivre pourrait avoir des conséquences

néfastes sur les neurones.

… avec l’APP

L’APP comporte un site de fixation du cuivre composé des ligands His-147, His-151, Tyr-168,

Met-170 (Hesse et al. 1994; Atwood et al. 2000; Wegner 2000; Simons et al. 2002; Barnham

et al. 2003). De plus, son expression semble réguler le taux de cuivre cytosolique (Davis et al.

2000; Armendariz et al. 2004; Bellingham et al. 2004) : la surexpression de l’APP induit une

baisse du taux de cuivre cytosolique et inversement, en accord avec son rôle potentiel de

transporteur du cuivre de l’intérieur vers l’extérieur de la cellule (White et al. 1999; Maynard

et al. 2002; Bayer et al. 2003; Phinney et al. 2003; Bellingham et al. 2004).

Le cuivre pourrait également jouer un rôle dans la protéolyse de l’APP, en effet la β-sécrétase

BACE1 peut lier un atome de cuivre dans son domaine C-terminal (via des résidus cystéines),

or le domaine cytoplasmique de BACE1 interagit avec la protéine chaperon consacrée au

cuivre de la superoxyde dismutase 1 (SOD1) et l’expression de BACE1 réduit l’activité de

SOD1 (Angeletti et al. 2005; Dingwall 2007).


56

…sur la concentration d’Aβ

Paradoxalement, des études ont montré qu’un taux en cuivre élevé diminue la production

d’Aβ, ce qui implique une régulation au niveau de la protéolyse de l’APP, la production de ce

dernier étant sensée diminuer pour compenser l’élévation du taux de cuivre (Maynard et al.

2002; Bayer et al. 2003; Phinney et al. 2003). En effet le cuivre semble favoriser la voie non-

amyloïdogénique puisqu’une augmentation de la concentration en fragments p3 non-

amyloïdogéniques a été observée (Borchardt et al. 1999).

Cependant dans le cas d’un régime à haute teneur en cuivre et en cholestérol, on observe

l’effet inverse, c’est-à-dire une augmentation de la production d’Aβ et l’apparition de plaques

séniles (Sparks and Schreurs 2003). Ceci dénote la complexité de l’action du cuivre dans la

MA et son caractère potentiellement pléiotropique (probablement dépendant de sa localisation

extra- ou intracellulaire). De plus, suivant la technique utilisée pour révéler la présence de

cuivre et en fonction de la localisation dans le cerveau (amygdale, néocortex ; tissus, plaques

amyloïdes), les résultats peuvent parfois différer (Deibel et al. 1996; Loeffler et al. 1996;

Lovell et al. 1998).

...avec Aβ

In vitro, il n’est pas clair si le cuivre accélère ou non l’agrégation du peptide Aβ, les deux

types de résultats pouvant être trouvés dans la littérature (dépendant probablement du pH,

tampon et de la technique de détection) (Atwood et al. 1998; Zou et al. 2001; Raman et al.

2005; Ha et al. 2007). Cependant, certaines études indiquent que les agrégats formés en

présence de cuivre sont majoritairement amorphes et ne contiendraient donc peu ou pas de

fibres (Exley 2004).

Le site de fixation du cuivre, de géométrie plan carrée, est vraisemblablement constitué d’au

moins 3 azotes provenant du cycle imidazole des histidines 6, 13 et 14 (Curtain et al. 2001;

Schoneich and Williams 2002; Kowalik-Jankowska et al. 2003; Lim and Vachet 2003;

Kowalik-Jankowska et al. 2004; Syme et al. 2004; Karr et al. 2005; Guilloreau et al. 2007).

Le 4ème ligand n’a pas encore été clairement identifié et serait dépendant du pH : oxygène à

bas pH, azote à haut pH (hétérogène à pH physiologique) (Kowalik-Jankowska et al. 2003;

Syme et al. 2004; Guilloreau et al. 2007). Ainsi, en fonction des conditions expérimentales,

différents ligands ont été proposés : N-terminal, carboxylate de l’aspartate 1 ou du Glutamate

11, azote du squelette carboné (Kowalik-Jankowska et al. 2003; Syme et al. 2004; Karr et al.

2005; Hou and Zagorski 2006). Un équilibre entre le N-term et l’oxygène de l’aspartate 1 est

très probable (spectre de dichroïsme circlaire modifié quand le peptide est acétylé, perte du


57

ligand oxygène par délétion des trois premiers acides aminés, effet paramagnétique important

sur Asp1 en RMN du proton). La présence ainsi que l’absence d’effet de l’eau marquée ont

été rapportés, ce qui ne permet pas de statuer sur la présence de ligand H2O axial labile, qui

dépend probablement des conditions expérimentales (Karr et al. 2005; Guilloreau et al. 2007).

Bush et al. ont montré qu’Aβ (et ses formes tronquées) était capable de fixer 2 équivalents de

cuivre(II) avec des constantes de dissociation différentes, faisant ainsi apparaître un site de

forte affinité et un site de fixation plus faible. Garzon-Rodriguez et al. ont mesuré les

constantes d’affinité du cuivre(II) pour le peptide Aβ40 et 42 sur le site de plus forte affinité

en suivant la fluorescence due à la Tyrosine (en position 10) (Garzon-Rodriguez et al. 1999).

Les expériences ont révélé des constantes de dissociation de l’ordre de 2μM dans le tampon

Tris. Des expériences similaires, dans le même tampon, ont été menées par Karr et al.,

révélant des constantes de dissociation de 11 ; 28 ; 47 μM respectivement pour les peptides

Aβ40, Aβ28 et Aβ16 (Karr et al. 2005). Cependant ces constantes sont des constantes

apparentes car les expériences ont été réalisées dans un tampon qui lui aussi possède une

affinité pour le cuivre. Il y a donc compétition entre le tampon et le peptide. Pour s’affranchir

de ce paramètre, Syme et al. ont effectué des mesures par compétition avec deux ligands du

cuivre (Histidine et Glycine) (Syme et al. 2004). Ils ont ainsi encadré le Kd de l’Aβ28 entre

1,5 et 500 nM. Si on tient compte du tampon utilisé (et de son affinité pour le cuivre), les Kd

sont similaires. Le peptide Aβ soluble et les peptides modèles plus courts présentent à pH

physiologique un Kd apparent de l’ordre du nanomolaire. Les dernières études réalisées par

calorimétrie de titrage isotherme et différentes méthodes spectroscopiques confirment ces

valeurs : Kd apparent de l’ordre 100 nM dans l’Hepes à pH 7,4 (10 μM pour le site de faible

affinité) (Guilloreau et al. 2006).


D’un point de vue de l’agrégation, des études in vivo, ont montré une augmentation de

plaques séniles liée à un déclin cognitif, lors d’un régime riche en cuivre et cholestérol

(Sparks et al. 2003; Morris et al. 2006). De plus, l’administration de clioquinol à des souris

transgéniques induit une diminution des plaques amyloïdes de près de 50% (Cherny et al.

2001). In vitro, à pH 7,4, des traces de cuivre(II) (concentration inférieure à 0,1 μM) suffisent

à induire la précipitation du peptide (Atwood et al. 2000). Ce phénomène est amplifié à pH

acide (pH = 6,6), ce qui est également le cas de fer(III) (Atwood et al. 1998). Or le pH au sein

du cerveau d’un patient atteint de la MA a tendance à s’acidifier légèrement suite à un

phénomène d’inflammation, favorisant ainsi la précipitation d’Aβ par le cuivre et le fer.

Or il existe une relation évidente entre les espèces réactives de l’oxygène (ROS) et la toxicité


58

d’Aβ pour les neurones (Bush et al. 2003). De nombreuses études ont montré qu’Aβ est

toxique in vitro et in vivo en relation avec la présence d’ions métalliques redox actifs trouvés

associés aux lésions amyloïdes dans des cerveaux post-mortem (Smith et al. 1997; Sayre et al.

2000; Tabner et al. 2002; Cuajungco et al. 2005). La présence de peptide Aβ oxydé sur la

méthionine 35, retrouvé associé aux métaux cuivre(II) et zinc(II) dans les plaques amyloïdes

post mortem, traduit également un environnement pro-oxydant au niveau de ces plaques

(Dong et al. 2003). En effet, le peptide Aβ (en particulier les formes longues), en présence

d’ions métalliques FeIII ou CuII et de réducteurs biologiques extérieurs tels que l’ascorbate, la

dopamine ou le cholestérol, est capable de générer du peroxyde d’hydrogène H2O2 (Huang et

al. 1999a; Opazo et al. 2002). Une récente étude a confirmé que le peptide Aβ42 était le plus

toxique vis-à-vis de la production de ROS (produisant notamment 5 fois plus de HO• que

Aβ40), tout en indiquant que la quantité de HO• générée par les complexes CuII-Aβ était

modéré (se situant entre celles de CuII-GHK et CuII-DAHK, 2 complexes physiologiques)

(Guilloreau et al. 2007).

Implication du zinc…

...avec Tau

Plusieurs des kinases phosphorylant tau (notamment p70 S6) peuvent être activées par le zinc

(Harris et al. 2004; Bjorkdahl et al. 2005; Pei et al. 2006). Or il a été montré que le taux de

zinc dans le néocortex augmentait significativement chez la personne atteinte de la MA

(Danscher et al. 1997; Lovell et al. 1998; Opazo et al. 2006), ce qui pourrait favoriser

l’hyperphosphorylation de tau.

Plus généralement, le zinc (ainsi que le magnésium) est également impliqué dans la

polymérisation des tubulines, en effet une carence alimentaire maternelle en zinc peut altérer

le développement du cerveau du fait de perturbations dans la formation des microtubules

(Gaskin and Kress 1977; Oteiza et al. 1990; Oteiza et al. 1990; Yoshiike et al. 2001).

… avec l’APP

L’APP comprend un site de fixation du zinc (Bush et al. 1993; Bush et al. 1994; Bush et al.

1994). Il est compris dans la région 170-188 de la protéine et est constitué de deux résidus

cystéines 186 et 187 et d’autres ligands potentiels (Cys-174, Met-170, Asp-177, Glu-184). La

fixation de zinc pourrait favoriser la formation d’un dimère in vivo (Scheuermann et al. 2001;

Ciuculescu et al. 2005).

Le zinc joue également un rôle important sur la protéolyse de l’APP et donc la production


59

d’Aβ. Tout d’abord le domaine de fixation du zinc dans la région Aβ de l’APP s’étend sur le

domaine de clivage de l’α-sécrétase, le métal pourrait donc potentiellement moduler le

clivage ainsi que la dégradation du peptide (Hoke et al. 2005). Ensuite, la préséniline, une

sous-unité de la γ-sécrétase, est également sensible au taux de zinc (la production de PS1

augmentant avec l’administration exogène de zinc) (Park et al. 2001).

Une des α-sécrétases potentielles, la TACE, possède un ion zinc dans son domaine

catalytique. La liaison cystéine–zinc régule (parmi d’autres interactions) l’activité catalytique

de la sécrétase (Cross et al. 2002; Gonzales et al. 2004; Buckley et al. 2005). Similairement,

ADAM-10, une autre candidate pour le clivage en α de l’APP, possède également un site de

fixation du zinc indispensable à son activité catalytique (Lammich et al. 1999).

…sur la concentration d’Aβ

Environ 15 % du zinc cérébral est stocké sous forme ionique dans des vésicules pour être

ensuite transitoirement libéré dans la synapse. Des études ont montré que le zinc synaptique

des fibres moussues de l’hippocampe semble avoir un effet important sur la production d’Aβ,

en effet, une ablation du gène codant pour la protéine transportant le zinc dans les vésicules

synaptiques (ZnT3) induit une importante réduction des plaques amyloïdes chez les souris

transgéniques surexprimant l’APP (Lee et al. 2002).

...avec Aβ

La présence de zinc induit la précipitation du peptide dans une large gamme de pH (5,5-7,5)

(Bush et al. 1994; Cherny et al. 1999; Yoshiike et al. 2001). Mais la nature fibrillaire des

agrégats induits par le zinc est controversée (Exley 2006; Ha et al. 2007). Le mécanisme

d’agrégation d’Aβ en présence de zinc sera l’objet des chapitres 3 et 4 de cette thèse.

La fixation du zinc à Aβ correspond, d’après la littérature, à un Kd apparent de l’ordre du

micromolaire (pour plus de détails, se reporter à la partie introduction du chapitre 2)

(Clements et al. 1996; Mekmouche et al. 2005), le peptide fixe donc moins bien le zinc que le

cuivre. De plus, comme pour le fer, les concentrations en zinc libre sont généralement trop

faibles pour permettre à Aβ de se lier au métal et l’affinité du zinc pour les protéines à zinc du

cerveau, telles la MT-3, est beaucoup plus forte (environ 6.1010 M-1) (Hasler et al. 2000; Xiao

et al. 2004), pointant là encore l’hypothèse d’une dérégulation de l’homéostasie du zinc pour

expliquer la présence importante de zinc au sein des plaques amyloïdes. Il existe cependant

une exception au niveau des synapses où les concentrations en zinc peuvent être

transitoirement très importantes (cf paragraphe II.4.a), en particulier dans le cas d’ischémie ou

de traumatisme cérébral.


60

Le site de fixation du zinc n’est pas encore parfaitement défini, Comme pour le cuivre, la

fixation via les trois histidines 6 et 13 et 14 a largement été décrite, mais le 4ème ligand est

sujet à controverse (Liu et al. 1999; Yang et al. 2000; Kozin et al. 2001; Mekmouche et al.

2005; Syme and Viles 2006). Les dernière études suggèrent respectivement le carboxylate du

glutamate 11 (à pH 6,5 et 7,5, basé sur des données RMN du peptide Aβ16 acétylé,

empêchant ainsi une interaction N-term et altèrant peut-être celle avec l’aspartate 1) (Zirah et

al. 2006) et le N-terminal (Figure 1.16 ; RMN du peptide Aβ40 à pH 7,0-7,3) (Danielsson et

al. 2007), similairement au cuivre. Elles excluent également définitivement la Tyr10 comme

ligand potentiel. Zirah et al. indiquent que la fixation du zinc favoriserait une structuration en

hélice alpha, en accord avec la formation d’agrégats majoritairement amorphes en présence de

zinc (Huang et al. 1997; Curtain et al. 2001). Cependant, il est possible que l’utilisation d’un

peptide acétylé modifie le site de fixation du zinc (Glu11 plutôt que Asp1/N-term) et donc la

structure secondaire du complexe.

Un deuxième site de plus faible affinité (avec un rôle physiologique probablement assez

limité) serait situé au niveau des résidus Asp23, Val24, Asn26 et Lys28 du peptide Aβ

(Danielsson et al. 2007).

Figure 1.16. Représentation schématique du site de fixation du zinc dans le peptide Aβ40 non

acétylé à pH physiologique (Danielsson et al. 2007).


61

...dans la dégradation d’Aβ

IDE et NEP (cf. paragraphe sur la stimulation de la dégradation d’Aβ, section II.3.b.) font

parties de la famille des métalloprotéines à zinc, lesquelles comprennent généralement une

séquence du type HEXXH où les deux histidines jouent le rôle de ligand pour le zinc

catalytique (Gomis-Ruth 2003). Ainsi ces deux enzymes peuvent potentiellement être

influencées par un dysfonctionnement dans l’homéostasie de zinc. De plus elles peuvent être

oxydées dans le cas de la MA et perdre ainsi une partie de leur activité (Wang et al. 2003;

Caccamo et al. 2005; Shinall et al. 2005). La plasmine semble également liée indirectement

au zinc ; l’activité des matrices métalloprotéinases (MMP) est elle aussi dépendante de l’ion

zinc (cf. revue (Yong et al. 1998)).


Contrairement au cuivre et au fer, le zinc, dont les orbitales atomiques d sont saturées, n’a pas

d’activité redox et n’induit pas directement de production de ROS lorsqu’il est lié à Aβ. Ainsi,

en prenant la place du cuivre, le zinc aurait plutôt un effet protecteur (Cuajungco et al. 2000;

Yoshiike et al. 2001). Cependant, la fixation du zinc accélère l’agrégation du peptide, ce qui,

dans la première hypothèse de la toxicité des plaques amyloïdes, aurait un effet toxique. Or,

actuellement, les formes oligomériques solubles semblent plus toxiques. De plus, le zinc ne

semble pas favoriser la formation de feuillet β et de fibres amyloïdes. Des études ont

cependant montré que l’injection dans le cortex cérébral de rats de peptides Aβ42 en présence

de zinc était plus toxique que l’injection du peptide seul (Bishop and Robinson 2004). Mais il

est possible que ce résultat soit uniquement du à l’excitotoxicité du zinc(II) libre (processus

pathologique de destruction neuronale par hyperactivation des récepteurs excitateurs

neuronaux) et pas au complexe ZnII-Aβ42. Certaines études émettent également l’hypothèse

qu’Aβ pourrait former des pores dans la membrane lipidique et entraîner ainsi une

dégénération neuronale. Le zinc bloquerait ces canaux, protégeant ainsi les cellules (Lin et al.

1999; Lin et al. 2001) (cf. chapitre 6). Le rôle direct, toxique ou protecteur, du zinc dans la

MA est très controversé et requiert donc des recherches complémentaires.

II.4.f. Approche thérapeutique en relation avec le cuivre et le zinc

L’utilisation de chélateurs du cuivre et du zinc pour le traitement de la MA repose sur deux

hypothèses principales : 1) chélater le cuivre lié à Aβ (aux différents stades d’agrégation)

permettrait de réduire la production de ROS, 2) chélater le zinc permettrait de réduire la


62

formation de plaques amyloïdes et de dissoudre celles préexistantes.

Les résultats obtenus en laboratoire (in vitro et in vivo), en particulier avec le clioquinol (5-

chloro-7-iodo-8-hydroxyquinoline, CQ, chélateur du zinc(II) et du cuivre(II)), tendent à

conforter cette théorie puisqu’une forte diminution des plaques amyloïdes et une amélioration

de l’état cognitif ont été observées (Cherny et al. 2001; Regland et al. 2001; Ritchie et al.

2003; Bellingham et al. 2004). Cependant des effets secondaires non négligeables, peut-être

dus à une dérégulation trop importante de l’homéostasie de ces deux métaux associée à une

déficience en vitamine B12, ont eu pour conséquences l’arrêt des tests cliniques (Yassin et al.

2000; Tabira 2001).

Le mécanisme étiologique supposé du clioquinol vis-à-vis du peptide Aβ in vivo n’a

cependant pas été démontré et de récentes études suggèrent une voie d’action bien différente

de l’hypothèse de départ (White et al. 2006). En effet, ce chélateur semble stimuler la

dégradation du peptide Aβ via l’activation des matrices métalloprotéinases (MMP), elle-

même due à l’activation de la phosphoinositol-3-kinase (PI-3K) et des JNK (c-Jun N-terminal

Kinase) du fait de l’augmentation de la concentration en métaux (libérés des plaques

amyloïdes). Cette réduction massive des plaques chez les rongeurs a été observée lors de

l’administration conjointe de CQ (ou d’autres chélateurs) et de Zn2+ ou Cu2+ (sans qu’une

augmentation importante en ROS soit identifiée) (Caragounis et al. 2007). Différents types de

chélateurs ont été testés avec succès sur des cultures cellulaires (Figure 1.17) : 8-

hydroxyquinoline, dérivés de la phénanthroline et un composé sulfuré la pyrrolidine

dithiocarbamate. La diversité de ces chélateurs pointe plutôt vers un rôle de transport des

métaux plutôt qu’une interaction direct avec un récepteur. Généralement, leur capacité à

diminuer le taux de Aβ est corrélée à leur lipophilie et à leur capacité à augmenter les taux de

cuivre et zinc cellulaires.

Cette récente hypothèse demande évidemment à être confirmée d’un point de vue du

mécanisme et de la toxicité à long terme (Minogue et al. 2003), mais elle ouvre le champ à de

nouvelles approches quant à la conception de chélateurs de métaux pour la MA.


63

Dérivés de la 8-hydroxyquinoline (clioquinol : R1 = Cl et R2 = I)

Dérivés de la phénantroline Pyrrolidine dithiocarbamate

Desferrioxamine (DFOA)

Figure 1.17. Exemples de chélateurs du cuivre et du zinc (d’après (Caragounis et al. 2007))

De manière générale, au vue de la diversité du rôle des différents métaux évoqués dans les

différentes étapes supposées du développement de la MA, il y a de fortes chances que l’action

des chélateurs de métaux soit multifactorielles, la difficulté étant d’obtenir un maximum

d’effet curatif en évitant une trop grande dérégulation de l’homéostasie des métaux, néfaste

pour l’organisme (par exemple dans le cas du CQ, l’élévation du taux de zinc et de cuivre

aurait conduit à une diminution en vitamine B12) (Wang et al. 2006; Caragounis et al. 2007;

Prodan et al. 2007). Cette voie de recherche reste évidemment très prometteuse et requiert une

meilleure compréhension du rôle joué par les métaux de transition, tels le zinc et le cuivre,

dans le développement de la MA.


64

III. Conclusion et contexte de l’étude

Ce chapitre bibliographique illustre bien la complexité des mécanismes pathogéniques de la

maladie d’Alzheimer. Les difficultés rencontrées par la communauté scientifique pour

élucider l’origine étiologique, probablement multifactorielle, de la maladie a conduit à un

élargissement, voir à une dispersion, de l’éventail des stratégies thérapeutiques. Une meilleure

compréhension des mécanismes de développement de la maladie est donc nécessaire pour

mieux cibler la recherche de traitements curatifs.

Dans cette thèse, nous nous sommes basé sur l’hypothèse principale de la cascade amyloïde.

L’ensemble des études présentées s’articule donc autour du peptide amyloïde bêta. D’autre

part, il est important de comprendre le rôle joué par les ions métalliques (en particulier zinc et

cuivre) dans la maladie d’Alzheimer. En effet, leur implication semble essentielle puisqu’ils

prennent part à l’agrégation et probablement à la toxicité d’Aβ. Ainsi l’étude de l’affinité du

peptide amyloïde bêta pour ces métaux (chapitre 2) s’inscrit logiquement dans cette optique.

Elle est de plus nécessaire à l’élaboration de stratégies thérapeutiques par chélation des

métaux.

Nous nous sommes ensuite focalisés sur le zinc, dont l’interaction avec Aβ a été moins

étudiée que le cuivre. Le zinc a été rapporté induire l’agrégation d’Aβ. Afin d’expliquer cette

influence et de saisir sa pertinence vis-à-vis de la formation des fibres amyloïdes, il nous a

semblé important de rechercher l’existence d’éventuelles espèces intermédiaires (chapitre 3)

et de déterminer leur structure secondaire (chapitre 4).

La provenance des quantités élevées de zinc dans les plaques amyloïdes reste encore à

élucider. Ainsi, l’hypothèse d’une interaction avec la métallothionéine-3, protéine à zinc très

répandue dans le cerveau, a été explorée au chapitre 5.

Enfin, d’un point de vue de la toxicité, une des voies envisagées dans la littérature consistant

en la formation de pores d’Aβ dans les membranes cellulaires, a été analysée au chapitre 6 en

prenant compte de l’influence du zinc.


65

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100

101

Chapitre 2

Etude de la liaison du zinc(II)

au peptide amyloïde bêta

102

Chapitre 2 : la liaison zinc(II) - Aβ

103

I. Résumé de l’étude

Ce chapitre a fait l’objet d’un article dans Biochemistry (sous presse). N’ayant pas d’élément

nouveau à ajouter à cette étude, la publication constitue le corps de ce chapitre. A titre

informatif, un complément sur le fonctionnement et principe de la calorimétrie de titrage

isotherme a été ajouté en dernière partie. Pour plus de clarté, le format des références choisi

par l’éditeur a été conservé dans le résumé de l’article.

Comme exposé dans le chapitre 1, l’agrégation du peptide Aβ est considérée comme la cause

principale de la MA dans l’hypothèse largement acceptée de la cascade amyloïde.(1-4)

Cependant les formes oligomériques solubles semblent être plus toxiques que les fibres ou

protofibrilles.(2) Dans ce contexte, l’étude des facteurs influençant l’agrégation est donc d’un

grand intérêt.(5) Or de nombreuses études ont montré le rôle important joué par les métaux, et

en particulier le zinc, dans l’agrégation d’Aβ.(1, 4, 6, 7) Ce dernier possède en effet un site de

fixation du zinc localisé sur la partie N-terminale du peptide, constitué assez

vraisemblablement des histidines 6, 13 et 14 et d’un quatrième ligand dont l’identification est

encore sujet à discussion.(19, 24-34) La détermination de l’affinité du zinc(II) pour Aβ est

également d’une grande importance pour l’élucidation des sources de zinc et les applications

thérapeutiques par chélation des métaux. Cependant, les valeurs de constante de dissociation

données dans la littérature diffèrent en fonction des conditions et techniques utilisées.(17, 28,

34-37)

Dans cette étude, l’interaction du zinc avec Aβ40 et 42, mais également les formes tronquées

(moins agrégeantes mais possédant le site de fixation du métal) Aβ16 et Aβ28, a été étudiée

par calorimétrie de titrage isotherme (ITC) et réaction de compétition avec différents

chélateurs du zinc (zincon, Newport green, et zinquin).

Les constantes de dissociation apparentes (Kdapp) entre Aβ et le zinc(II) (tampon Hepes 20

mM, NaCl 100 mM, pH 7,4) ainsi déterminées se situent toutes dans le bas micromolaire

(environ 1 à 20 μM), même s’il semble que les peptides les plus longs aient une affinité

légèrement plus forte pour le métal (Aβ40-42 > Aβ28 > Aβ16). L’état d’agrégation du

peptide ne semble pas influer sur le Kdapp, les résultats obtenus avec le peptide à l’état soluble,

sous forme de fibres ou préincubé en présence de zinc, ne diffèrent pas significativement. Il

apparaît également que le zinc présent dans les formes solubles et agrégées de ZnII-Aβ est

facilement accessible par les chélateurs de ce métal, ce qui indique que le développement de


104

thérapie de chélation des métaux spécifique aux formes solubles de Zn-Aβ semble très

difficile.

Les expériences d’ITC ont également permis d’estimer qu’environ 0,9 protons par peptide

sont libérés lors de la fixation du zinc(II) à pH 7,4. Ce résultat est en accord avec la présence

de 3 ligands histidines et d’un quatrième non déprotoné lors de la fixation. Dans ce contexte,

le groupement carboxylate de l’aspartate 1 (mais pas le N-term) serait un bon candidat.

II. Publication

Zinc Binding to Amyloid-β: Isothermal Titration Calorimetry (ITC)

and Zn-Competition Experiments with Zn-Sensors§

Christine Talmard, Anaïs Bouzan, Peter Faller

Laboratoire de Chimie de Coordination, CNRS UPR 8241 ; associated with University

Toulouse III, 205, route de Narbonne, 31077 Toulouse Cedex 4 France

§ This work was supported by the grant from the French ministry: ACI-INTERFACE PCB

(DRAB). C.T. was supported by a grant from ESF.

Abbreviations: Aβ16: amyloid-β1-16 Aβ28: amyloid-β1-28 Aβ40: amyloid-β1-40 Aβ42:

amyloid-β1-42: Hepes: {2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)ethanesulfonic acid; ITC:

isothermal titration calorimetry; Kdapp: apparent dissociation constant; Tris:

Tris(Hydroxymethyl)aminomethane.

Abstract

Aggregation of the peptide beta-amyloid (Aβ) to amyloid plaques is a key event in

Alzheimer’s disease (AD). According to the amyloid cascade hypothesis, Aβ-aggregates are

toxic to neurons via the production of reactive oxygen species and are hence directly involved in

the cause of the disease. Zinc ions play an important role, because they are able to bind to Aβ

and influence the aggregation properties. In the present work isothermal titration calorimetry

and Zn-sensors (Zincon, Newport green and zinquin) were used to investigate the interaction

of Zn with the full length Aβ1-40 and Aβ1-42, as well as the truncated Aβ1-16 and Aβ1-28.


105

The results suggest that Zn binding to Aβ induces a release of ~0.9 protons by the peptide.

This correspond to the expected value upon Zn-binding to the three histidines and indicates

that further ligands are not deprotonated upon Zn-binding. Such behaviour is expected for

carboxylates, but not the N-terminus. Moreover, the apparent dissociation constant (Kdapp) of

Zn-binding to all forms of Aβ is in the low µM range (1-20µM) and rather independent on the

aggregation state including soluble Aβ, Aβ-fibrils or Zn-induced Aβ aggregates. Finally, Zn

in the soluble or aggregated Zn-Aβ form is relatively well accessible for Zn-chelators. The

potential repercussions on the metal chelation therapy are discussed.

Introduction

The aggregation of the peptide amyloid-β (Aβ) into fibrils is considered to be a key

event in Alzheimer’s disease (AD).(1-4) In vivo, the most prevalent forms of Aβ consist of 40

(Aβ40) and 42 amino acids (Aβ42). Aβ is cleaved off from the membrane protein amyloid

precursor protein (APP). The longer form Aβ42 is more prone to aggregation and more toxic

to neurons than Aβ40. This is in agreement with the widely accepted amyloid cascade

hypothesis, which proposes that an increased Aβ accumulation and aggregation lead to the

formation of fibrils in amyloid plaques and to neuronal disfunction and later on dementia.(2)

However, it is thought that soluble, oligomeric forms of Aβ are the most toxic species, rather

than more aggregated fibrils or protofibrils.(2) In this context, factors influencing this

aggregation are of high interest.(5) Studies in vitro, in cell cultures and AD model mice

indicate an important role for metals (Zn, Cu, and Fe) in this respect.(1, 4, 6, 7)

In the case of Zn, a large body of evidence has been accumulated supporting an

important role of this metal ion in the metabolism of Aβ linked to Alzheimer’s disease. Zn has

been found in the amyloid plaques at high concentrations (~mM) and treatment with chelators

partially solubilized the plaques.(8) APP possesses a high affinity Zn-binding site, which is

located outside of the Aβ-region.(9, 10) Transgenic mice, which express human APP, develop

amyloid plaque pathology and then can serve as models for AD. In such mice the lacking of

the Zn-transporter ZnT3 (transports Zn into synaptic vesicles) reduced the plaque load. Hence,

it was concluded that endogenous Zn contributed to the amyloid deposition in transgenic

mice.(11) Chelators, such as clioquinol, DP109 and cyclo-phen-type, known to bind Zn (and

Cu) reduced successfully the amyloid plaques burden in transgenic mice.(7, 12-15)

In vitro studies revealed that Zn binds to Aβ and promotes its aggregation.(5, 16, 17)


106

Zn binds to Aβ in a monomeric and stoichiometric Zn-Aβ complex, which is transiently stable

prior to aggregation.(18) Moreover, Zn-binding influences also the morphology of the Aβ

aggregates. Generally their structures were described to be more amorphous, i.e. containing

no or less fibrils. Zn-induced aggregates are less reactive with the marker thioflavin T than

aggregates formed in the absence of Zn.(19-23)

The first Zn-binding site of Aβ is located in the N-terminal part. Several studies on

soluble Aβ40 or truncated forms containing the Zn-binding site (i.e. Aβ16 and Aβ28) tried to

identify the ligands of Zn in Aβ.(19, 24-34) Although there is some contradiction, the

involvement of the histidines 6, 13 and 14 has been suggested by most articles. Less

agreement is found concerning further ligands. Mostly suggested was the aspartate at position

1, either by the N-terminus or carboxylate side chain.(28, 29, 34) In the case of an acetylated

N-terminus, a NMR structure of the Zn-Aβ1-16 was solved and showed that Zn is bound to

the three His and Glu11.(31) Less is known for the Zn-binding site in Zn-induced aggregates

of Aβ. Raman spectroscopy studies indicated that it is provided by 3 His similar to soluble

Aβ.(25) In contrast EXAFS measurements detected differences between soluble and

aggregated Aβ, among others the number of His involved.(32) It has been also suggested that

the peptide aggregates through intermolecular His(N(tau))-Zn(II)-His(N(tau)) bridges.(25)

Concerning Zn-binding to Aβ fibrils formed in the absence Zn, to our best knowledge no

information is available.

A key parameter in the interaction of Zn with Aβ is the affinity for the metal. The

knowledge of the dissociation constant allows the comparison with other biological and non-

biological Zn-ligands. This can give insights into the possible sources of Zn ions able to be

chelated by Aβ, as well as which ligands (proteins or others) would be able to withdraw Zn

from Aβ. This is of particular interest concerning the metal chelation therapy. In such a

therapy, chelators should have an intermediate affinity, capable of disrupting low affinity but

pathologically relevant metal-Aβ, without disrupting higher affinity essential metal-

protein/peptide interactions. This allows specific, rather than systemic, chelation of excess

metals in the brain of AD patients.

The dissociation constant of Zn-Aβ found in the literature differed dependent on the

conditions and methods used. Initially a substoichimetric binding of Zn to Aβ40 with a Kd of

~ 100 nM and a second site of 5 µM by using a displacement assay with radioactive and cold

Zn binding to blotted Aβ40 has been reported.(17) In a subsequent study using also blotted

peptide, Clements et al. found no evidence for a sub µM binding but confirmed a Kd of ~ 5

µM for Aβ40 by their value of 3.2 µM.(35) Similar values in the low µM range (i.e. 5-10 µM)


107

have been also reported for truncated Aβ (Aβ16) by competition with the Zn-sensor zincon

(28) and for Aβ28 by competition with Cu binding followed by fluorescence (~7µM).(34) By

using fluorescence enhancement of the single Tyr10 due to Zn-binding to Aβ different results

have been reported (although under very similar conditions, Tris-buffer, pH 7.4, 100-150 mM

NaCl). Ricchelli et al. 2005 agreed with a Kd in the low µM range for Aβ16/40/42,(36) but

Garzon et al. deduced a higher Kd of 300 µM for Aβ40 and 57 µM for Aβ42.(37) Although

generally the apparent Kd of Aβ and its truncated forms Aβ16/28 is in the low µM range, not

much is known of the influence of the aggregation state on the Kdapp, a parameter which could

explain some of the discrepancy reported.

In the present study we investigated the interaction of Zn with Aβ40 and Aβ42 as well

as the truncated forms Aβ16 and Aβ28. Isothermal titration calorimetry and competition

experiments with Zn-sensors were applied to study this interaction. In particular, the apparent

dissociation constants (Kdapp) were compared between soluble, aggregated Zn-Aβ40 and

Aβ40 fibrils. This could have importance concerning the metal chelation therapy, which is

discussed.

Material and Methods

Material: The peptides Aβ16, Aβ28, Aβ40 and Aβ42 were either purchased from EZBiolab

(Westfield, IN, USA), Geneshere Biotechnologies (Paris, France) or Activotec (Cambridge,

UK). The peptide concentrations were determined by absorption spectroscopy, by using the

well established extinction coefficient of the Tyr at 275 nm ε = 1410 cm-1 M-1. Aβ40/42

which are prone to aggregation, were monomerized according by a short incubation at pH 11-

12.(38, 39)

Aggregating concentration: In order to determine at which concentration the different Aβ

peptides aggregate in the presence of Zn, turbidity measurements at 400 nm were performed

at different concentrations over 3h (maximal time of an ITC experiment). The results showed

that Zn-Aβ16 is mainly soluble up to 60 µM, Zn-Aβ28 up to 20 µM and Aβ40 up to 10 µM.

Isothermal Titration Calorimetry (ITC). ITC experiments were performed at 298.0 ±0.1 K on

a Microcal VP-ITC calorimeter (Microcal, Northampton, MA). Ligand and receptor solutions

were prepared with the same buffer stock solution 20 mM {2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-

piperazinyl)ethanesulfonic acid (Hepes), Tris(Hydroxymethyl)aminomethane (Tris) or

cacodylate buffer with 100 mM NaCl at pH 7.4. All samples were degassed by stirring under


108

vacuum before use. In the cell, the peptide solution has a concentration of 10 to 140 µM. In

each ITC experiment, about thirty injections of 7-8 µL of 150 to 800 µM zinc solution were

made into the cell containing the peptide. The syringe speed was set at 300 rpm. Control

experiments (heat dilution measurement) were performed by injected zinc solution into the

buffer, suggesting that the heat dilution was negligible for Tris buffer (∆HTris ~-0.15 kcal.mol-

1). In the case of Hepes, and cacodylate the ∆H of dilution was lower, but compared to the

measured ∆H not insignificant (However, fits of the curve showed similar Kdapp independent

if the dilution curve was subtracted or not). Thus the ITC data were corrected for the heat of

dilution of the titrant by subtracting the excess heats at high molar ratios of zinc to peptide.

Some inverse titrations (100 µM Aβ16 solution injected in 500 µM zinc solution) confirmed

the range of the reaction enthalpy values. Data were analysed with Microcal Origin 7.0, the

fitting curves were calculated according to one set of binding site model. The number of

protons nH+ released (> 0) or taken up (< 0) by the buffer during Zn-Aβ complexation is

expressed by the following equation :

ΔHbinding = ΔHreaction + nH+ ΔHionization

where ΔHbinding is the measured enthalpy of binding and ΔHreaction the intrinsic enthalpy of

reaction.(40)

Apparent dissociation constant (Kdapp): The apparent Zn-Aβ dissociation constant was

estimated by competition assay with the colorimetric Zn-chelator zincon (2-carboxy-2’-

hydroxy-5’-(sulfoformazyl)benzene), from Acros organics. It has been reported in the

literature that zincon forms a complex with ZnII in a 1 to 1 stoichiometry (ZnII– zincon),

showing a distinct absorption band at 620 nm (ε = 23200 cm-1M-1) at pH 7.4 and having an

apparent binding constant (Kapp) of 7.9×104, i.e. Kdapp of 12.6 µM (41) We verified this

parameters by titration of ZnSO4 with different concentrations of zincon (10–20 μm) under

our conditions (pH 7.4, 20 mM HEPES, 100 mM NaCl). Slighlty higher affinity was found

(Kdapp of 5.8±1.5 µM) and molecular extinction coefficient was lower than reported (15000 ±

1500 cm-1 M-1).

The binding equilibrium of ZnII between Aβ and zincon can be expressed as Equation (1):

ZnII-Aβ + zincon Aβ + ZnII-zincon (1)

The apparent binding constant of ZnII–Aβ can be calculated by resolving Equation (Zi =

zincon) (2):

(2)


109

In the case of titration of Aβ-Zn complex with zincon, the absorption band at 620 nm is due to

the Zn–zincon complex, which increases upon addition of zincon. The tailing from the

absorption band at 470 nm due to apo-zincon was subtracted from the Zn-zincon complex

signal. Assuming that all the zinc is bound, to either zincon or Aβ, it can be deduced that, at

half maximal absorption (see Figure 4), [zincon-Zn] = [Aβ-Zn] = [Zn]total /2. [zincon] and [Aβ]

could be calculated by subtracting the Zn-bound fraction from the initial concentration (i.e.,

[zincon]= [zincon]total-[Zn–zincon] and [Aβ]=[Aβ]total-[Zn–Aβ]). Then, using the binding

constant of ZnII–zincon obtained from the titration realized the same day, the apparent binding

constant of ZnII–Aβ could be calculated.(28) In order to make sure that most Zn was bound to

the ligand, an excess of Aβ over Zn (2:1 ratio) was used as a starting point of the titration. An

analogous approach was used for the inverse titration: that is, the addition of Aβ to Zn–zincon.

Both approaches yielded similar apparent binding constants of ZnII–Aβ, indicating that

reaction 1 had reached equilibrium.

Similar approach has been used with the fluorescent sensor Newport Green DCF dipotassium

salt (NG), from Invitrogen (λex = 485 nm, λem = 530 nm).(42) Its dissociation constant with

zinc has been reported to be around 1μM,(43) which was confirmed by our experiments

(0.9±0.5×106 M-1). A concentration of 3 µM has been used in the titration experiment since

the enhancement of fluorescence of the NG-Zn complex has been found to be linear with its

concentration only up to 5 μM.

Zinquin (2-methyl-. 8-[(4-methylphenyl)sulfanylamino]-6(carbowymethyloxy)quinoline, was

purchased from Sigma-Aldrich. Excitation and emission wavelength was 370 nm and 490 nm

respectively. Zinquin was first solubilized in DMSO then in water. The concentration has

been determined using the molecular extinction coefficient of about 9000 M cm-1 at 340 nm

calculated from reference (44).

Fibrils preparation. Solution of 200 μM soluble Aβ40 in either Tris or Hepes 20 mM, NaCl

100 mM, 0.01% NaN3 at pH 7.4, have been placed at 30°C under gentle agitation for 3 weeks.

Presence of fibrils were confirmed by negative stain transmission electron microscopy and

ThT fluorescence.(45)

Results

Isothermal Titration Calorimetry (ITC): Isothermal titration calorimetry experiments can be

used to study the binding between two molecules (often called ligand and receptor).(46-48)


110

Direct indications of three parameters can be obtained. These are the stoichiometry between

ligand and receptor, the binding constant (K) and the enthalpy (∆H). Based on the binding

constant and the enthalpy, the entropy (∆S) can be calculated. However, it is important to note

that the heat measured, and as a consequence the thermodynamic parameters (K and ∆H),

stem from the entire reaction (i.e.; from starting reagents to final product) and are thus

apparent (for more detailed discussion of ITC measurement of metal-peptide/protein

references 49-54).

As the Kd of Zn-Aβ16 has been reported to be in the low µM range, the first ITC

measurements were conducted with the recommended 10 to 100 times higher concentration.

An ITC measurement of Zn added to 140 µM Aβ16 or Aβ28 in 100 mM Tris/HCl at pH 7.4 is

shown in Figure 1.

Figure 1: ITC: Zn titration to Aβ16 (■) and Aβ28 (●) at 140 µM in 20 mM Tris buffer, 100

mM NaCl, pH 7.4.

The best fits at this concentrations revealed apparent Kd of 61 ± 4 μM and 30 ± 4 μM for

Aβ16 and 28, respectively. But they also revealed a stoichiometry around 1.5 which is above

the integer stoichiometry of the Zn-binding sites as suggested by spectroscopic data.(28, 29,


111

33, 34) Moreover, parallel turbidity measurement revealed that under this concentration Aβ28

and also partially Aβ16 aggregate in the presence of Zn over the time period of 3h (time for

ITC experiment; for details see Materials and Methods). This means that the measured heat is

the sum of two events, i.e. sum of Zn-binding to is the peptide and the aggregation. In order to

obtain only the contribution of the Zn-binding, ITC measurements at lower concentrations of

10-20 µM Aβ16/28 were conducted (Figure 2).

Figure 2: ITC of Aβ16 (■), 28 (●) and 40 (♦) at low concentration (10 - 20 µM) in 20 mM

Tris buffer, 100 mM NaCl, pH 7.4.

Turbidity and centrifugation measurements showed that at this concentration Zn-Aβ16/28 did

not aggregate significantly. The best fit of Zn titrations to Aβ16 and 28 at lower concentration

revealed generally an integer stoichiometry, i.e. one Zn per Aβ16/28. The Kdapp obtained for

Aβ16 and Aβ 28 were 22 ± 15 and 10 ± 8µM, respectively (Table 1). However at lower

concentration the titration curve is only partially measured and hence the value obtained for

ΔH is less accurate. As shown below, we confirmed the ΔH by inverse titration, where it is

much better defined.


112

Table 1 :Apparent Kd deduced from ITC a

Aβ16 Aβ28 Aβ40

Low concentration of Zn-Aβ (10-20 µM)

22 ± 15 µM 10 ± 8 µM 7 ± 3 µM

High concentration of Zn-Aβ (70-150 µM)

61 ± 5 µM b 30 ± 4 µM b 3 ± 2 µM

Preformed fibrils of Aβ (without Zn)

9 ± 4 µM

a The variance of the Kdapp values indicated derived from the variance of the Kdapp obtained by fitting several experiments under the same conditions. b the best fit yielded a stoichiometry of about 1.5

After these experiments with the truncated peptides Aβ16 and 28, measurements were

extended to the full length Aβ40. ITC experiments with Aβ40 were conducted at higher

(70µM) and lower (10µM) concentration, i.e. under conditions where aggregation with Zn

occurs or is almost absent. In either case the best fits exhibited an about one to one

stoichiometry. The Kdapp were in the same range: 20 ± 14 and 7 ± 3µM at high and low

concentration, respectively (Table 1). Taken together the ITC experiments indicate that the

Kdapp of Zn to Aβ40 and truncated peptides Aβ16/28 are in the low µM range. It seems that

the longer peptides bind Zn slightly stronger than the shorter, i.e. Aβ40 > Aβ28 > Aβ16.

Moreover, Zn-binding under aggregating and non-aggregating concentrations did not show

large difference, indicating that the aggregation does not contribute much to the measured

reaction heat.

The same experiments have been repeated in the presence of HEPES and cacodylate buffer at

pH 7.4 (100 mM NaCl). The results in HEPES confirmed the about one to one stoichiometry

and a Kdapp in the low µM range obtained in the Tris buffer. In the cacodylate buffer the

signal was positive (ΔH > 0) but very small. The best fits revealed Kdapp in the same range as

in the other buffers Tris and HEPES. However the stoichiometry given by the best fit was

beyond a one to one complex.

The ITC measurement of Zn titration to Aβ in different buffers allows the estimation of the

number of protons displaced by the binding of ZnII to Aβ. The displaced proton will bind to

the buffer, which have different ∆H for proton binding. A difference in ∆H of two titrations,

which differ only in their buffer, should be only due to the proton binding to the buffer. Since


113

the ∆H of Tris, HEPES and cacodylate are known (11.51, 5.0, and -0.56 kcal/mol,

respectively),(55) the number of protons displaced by the Zn-binding has been calculated to

be 0.76 ± 0.37 from the ITC measurements (Figure 3).

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

-2 0 2 4 6 8 10 12

∆H bi

ndin

g(k

cal.m

ol-1

)

∆H ionization (kcal.mol-1)

(a)

(b)

(c)

Figure 3: Enthalpy change of binding of Aβ16 to zinc at pH 7.4 as a function of the ionization

enthalpy of the reaction buffer (a: cacodylate, b: Hepes, c: Tris). The absolute value of the

slope of the linear regression yields the number of protons released by the buffer when one

zinc binds to one Aβ16. The circles correspond to the values obtained when Zn was added

(0.76 ± 0.37 proton released) and the squares when the peptide was added (0.89 ± 0.07 proton

released).

Due to the relatively low concentrations of Aβ in the ITC measurements, the ∆H deduced

from the binding isotherm is not that well defined. This is due to the fact that when Zn is

added at low Aβ concentration, Zn is in equilibrium between free and bound. To get a good

estimate of the ∆H of Zn-binding to Aβ, conditions are needed where Zn completely binds to

Aβ. This is achieved by inverse experiment, when clearly substoichiometric amounts of Aβ

are added to Zn in the buffer. Under this conditions all Aβ added will bind to Zn and the ∆H

is better defined. Such experiments were conducted in Tris, HEPES and cacodylate and

revealed ∆H of -8.9, -2.6, +1.8 kcal/mol respectively. This corresponds to a replacement of

0.89 ± 0.07 protons and hence confirming, with more accuracy, the previous value of 0.8


114

protons displaced by the Zn-binding to Aβ. Moreover, the values for ∆H obtained by the

inverse experiment in Tris and Hepes buffers, are very similar to the ∆H obtained by the fit of

the titration curve from titration of Zn to the peptides, and hence corroborate the other

parameters of the fit, i.e. Kdapp and stoichiometry. (see above)

Determination of Kdapp of Zn-binding to soluble Aβ by competition assay followed by

absorption and fluorescence spectroscopy:In order to confirm the above measured Kdapp of

Zn-Aβ and to have the possibility to measure at lower peptide concentration and thus under

non-aggregating condition, the Kdapp was also measured by a competition assay. Apparent

binding constants can be estimated by competition with a chelator, which binding constant is

known and in the same range. The Zn-chelator zincon has been shown to be appropriate for

Zn-protein complexes (41, 56, 57) and was already successfully applied for the soluble

Aβ16.(28) Thus the same methodology was applied to measure the Kdapp of Aβ28, 40 and 42,

at a concentration where no significant aggregation was observed by turbidity for Aβ28 and

Aβ40.(i.e at 10 µM). Figure 4 showed the titration experiments followed by absorption at 620

nm. The upper panel showed the absorption at 620 nm of the Zn-zincon complex by adding

increasing amounts of Aβ40. The decrease of the absorption at 620 nm reflected the transfer

of Zn from zincon to Aβ40. About 13 µM Aβ40 were necessary to decrease the band at 620

nm by half, indicating that half of the 5 µM Zn bound to zincon was transferred to Aβ40.

Thus globally the binding constants were very similar, whereas zincon was slightly stronger

than Aβ40. The calculations lead to a Kdapp of about 6.3 µM for Zn-Aβ40. The lower panel

showed the inverse experiment, in which zincon was added to Zn-Aβ40. Here half of the 5

µM Zn was bound to zincon after adding 6 µM of zincon (thus, Kdapp.~ 9.6 µM) This

confirmed the above experiment which showed that globally the binding constants were in the

same range, zincon being a little stronger then Aβ40. The fact that the two approaches yielded

the same Kdapp (in experimental limits) indicated that the reaction of Zn exchange reached

equilibrium, a prerequisite for the calculation of Kdapp.


115

0

20

40

60

80

100

0 10 20 30 40

% A

bs 6

20 n

m

[Zi]t (μM)

0

20

40

60

80

100

0 10 20 30 40 50

% A

bs 6

20 n

m

[Aβ40]t (μM)

Figure 4: Estimation of the Zn(II)-binding constant by competition with the chelator zincon:

Upper panel: Absorption at 620 nm of the Zn-Zincon complex upon addition of increasing

amount Aβ1-40. Conditions: zincon 10 µM; Zn 5µM; pH 7.4, 20 mM HEPES, 100 mM NaCl.

Lower panel: To the complex of Zn-Aβ1-40 increasing concentrations of zincon were added

and the absorption at 620 nm of the Zn-zincon was followed. Conditions: Aβ1-40 10 µM; Zn

50µM; pH 7.4, 20 mM HEPES, 100 mM NaCl. In ordinate is the percent of absorption at 620

nm with 100 % standing for the maximum absorption obtained (at t0 and t∞ respectively).

Analogue experiments were conducted with Aβ42, Aβ28 and Aβ16 (Table 2). In general no

large difference between the entire and truncated peptide was observed at low concentration.

The Kdapp were in the low µM range 1-20 µM, with a tendency to a higher affinity by the

longer peptides. Similar experiments were performed with the Zn-sensitive chelator Newport

green. Newport green has an apparent Kd of 1 µM.(42, 43, 58) This value was confirmed by

Zn-titration to Newport green under our conditions (20 mM Hepes buffer pH 7.4, 100mM

NaCl), which revealed a Kdapp of about 0.9 µM. In general the competition experiments

confirmed a Kdapp in the low µM range for Zn-Aβ. Also the tendency that the longer Aβ-


116

peptides bind Zn slightly stronger was observed again.

Table 2: apparent Kd from Zincon (Zi added, [Aβ]/[Zn]=2))

Peptide Kdapp (μM)

Aβ16 14 ± 5

Aβ28 12 ± 5

Aβ40 and Aβ42

non aggregated

7 ± 3

Aβ40 Fibrils 9 ± 6

(Aβ40 or 42 + Zn) aggregated 3 hours 3 ± 2

Another widely used fluorescent Zn-chelator is zinquin. Zinquin has a apparent binding

affinity at physiological pH in the pM to low nM range, i.e. much stronger than soluble Zn-

Aβ.(44) Titration experiment of zinquin to Zn-Aβ showed that zinquin withdraws Zn

quantitatively from Aβ. In contrast, Aβ was not able to compete significantly for Zn-binding

with zinquin, even at 10-times excess of Aβ compared to zinquin. These results are in line

with the at least 100 times stronger affinity of zinquin compared to Aβ.

Zn-binding to preformed fibrils of Aβ: Next, the Zn binding to Aβ40 fibrils (incubated over 3

weeks in the absence of Zn) was measured. The ITC measurement is shown in Figure 5. The

best fits revealed an Kdapp of 9 ± 4 µM, i.e. not significantly different of the Zn-binding to

soluble Aβ (Table 1). Also the ΔH did not differ significantly. However, a change was

observed concerning the stoichiometry of the Zn-binding site, i.e. a substoichiometric binding

of ~0.2 equivalents Zn per Aβ-peptide (when using 60 μM of fibrils). This suggests that Zn

binds to only a portion of the binding-sites with a similar Kdapp. This could indicate that the

binding site is perhaps the same. The rest of the binding sites is either not accessible to Zn-

binding because they are buried in the fibril structure (ii) or did change due to structural

modifications induced by aggregation. Such changes could lead to a lower affinity not

detectable by ITC or to a Zn-binding with a very small ΔH not detectable by ITC. In order to

confirm these results the Zn-binding to the fibrils was also analysed by the competition assay


117

with zincon, which were in agreement with a substoichiometric Zn-binding with a Kdapp in the

low µM range (not shown) (Table 2).

Figure 5: ITC of Zn titration to soluble Aβ40 (70 μM) (♦) and to fibrils of Aβ40 (60 μM) (•)

in 20 mM Tris buffer, 100 mM NaCl, pH 7.4.

Zn-binding in Zn-induced aggregates of Aβ: Zn-binding to Aβ induces rapid aggregation and

formation of Zn-Aβ aggregates. In order to measure the apparent binding affinity of the Zn in

these aggregates, they were titrated with the Zn-sensors zinquin and zincon 2 . First, the

question was addressed if the Zn in the Zn-Aβ aggregates is readily accessible to chelator-

binding. As zinquin has a much stronger (at least 100 times) apparent Zn-binding affinity than

the soluble Zn-Aβ, all Zn should be transferred to zinquin. Indeed, Figure 6 shows that

zinquin immediately bind free Zn and Zn from the soluble Zn-Aβ16 quantitatively after

mixing (i.e; in a couple of second). Addition of zinquin to Zn-Aβ40 aggregates yielded alo a

complete Zn-transfer from the Zn-Aβ aggregates to zinquin. However, in this case the transfer

was only completed after 5 minutes. This indicates that Zn transfer to zinquin is slower in Zn-

2 The opposite titration, i.e. add Zn-Aβ aggregates to the zinc sensor was avoided, because in such an experiment Zn-Aβ aggregates would be highly diluted in to the sensor solution, with the risk to disaggregate the Zn-Aβ aggregates.


118

Aβ aggregates than in soluble Zn-Aβ.

0

10

20

30

40

50

60

70

0 5 10 15 20

% I

at 4

90 n

m

Time (min)

Figure 6: Fluorescence relative intensity of a solution of 2.1 equivalent of zinquin with 60μM

of zinc (◊), {Aβ16-Zn} (□) or {Aβ40-Zn, incubated overnight} (▲).

Moreover it also shows that zinquin has a stronger affinity than Zn-Aβ aggregates, which

limits the Kdapp of Zn in Zn-Aβ aggregates to a value in the nM range or above. To get a

better estimate of the binding affinity of Zn-Aβ aggregates, the chelator zincon and Newport

green were used. Competition experiments with zincon or Newport green suggested a small

but reproducible 2-3 fold stronger Zn-binding to the Zn-induced aggregates of Aβ28 and

Aβ40 compared to soluble Aβ28/ Aβ40.3

3 The observation that capacity of zincon or Newport green to withdraw Zn from Zn-Aβ aggregates is smaller than from soluble Zn-Aβ is assigned to a higher affinity of Zn in the aggregates (thermodynamics) and not kinetics, because i) the experiments with zinquin (see above) showed that Zn transfer is finished after a couple of minutes and ii) the reaction of addition of zincon and Newport green to Zn-Aβ was followed over 10 min and no increase in the absorption band at 620 nm (reflecting the Zn-Zincon complex) or fluorescence of Zn-Newport green was observed (such experiments are limited to the minutes time scale since the Zn-zincon and –Newport green complexes are degrading slowly with time).


119

Discussion

The present results indicate the Kdapp of Zn-binding (pH 7.4, 0.1 M NaCl) of different Aβ-

forms are relatively similar, i.e. all in the low µM range (3-15 µM). No indication was found

for the initially reported high affinity binding site (Kd of 104 nM).(17) But the present Kdapp

agrees with values reported for truncated, soluble Aβ16/28.(28, 29, 34) No significant

difference was observed at non-aggregating and aggregating concentration. This includes Zn-

induced Aβ40 aggregates as well as Zn-binding to fibrils formed in the absence of Zn. This

suggests that the affinity of the Zn-binding site is similar in the soluble and the different

aggregated forms. Thus it is well possible that the Zn-binding site is the same in aggregated

and non-aggregated Aβ including the same ligands (3His, Asp1 or Glu11).4

Although no significant difference in Zn affinity between soluble and aggregated Aβ could be

observed, other parameters showed differences. First in the case of the Zn-induced Aβ

aggregates, the kinetics of Zn-transfer from the aggregate to the zinc-sensor was substantially

slower. Two scenarios could explain this slower kinetics i) The Zn-sites are buried in the

aggregate and hence it takes more time to transfer zinc to the sensor ii) as the aggregates are

normally in equilibrium with soluble Aβ,(59, 60) the sensor withdraw Zn rapidly from the

soluble fraction but slower or not from the aggregates. This provokes resolubilisation of Zn-

Aβ from the aggregates to reach equilibrium of soluble and aggregated Zn-Aβ. In this case the

kinetics would reflect the resolubilisation of the Zn-Aβ aggregates.

The second remarkable difference was observed between Zn-binding to soluble Aβ and

preformed Aβ fibrils. Soluble Aβ bound about one equivalent of Zn, the preformed fibrils

bound only a substoichiometric (i.e. ~0.2) amount of Zn, indicating that not all binding sites

were accessible (or existing).

The finding that the Kdapp of Zn to Aβ is in the low µM range independent of its aggregation

state has implication for the so called metal-chelation therapy. The concept of this therapy

consists of chelating the metal ions bound to Aβ and favour the disaggregation from toxic

aggregates forms (e. g. oligomers) to non-toxic monomers. Several chelators of this type have

been developed or have entered clinical trials, like clioquinol,(12) DP-109,(13) bifunctional

metal chelator.(61) Such chelators should have an intermediate affinity, capable of disrupting

4 Supposing that the Zn-binding site is the same in the soluble monomeric and aggregated Aβ would more point to a mechanism where Zn binds to Aβ as a monomeric complex and induces a conformational change, which favours the aggregation by pure peptide-peptide contacts. It points less to a mechanism where Zn-Aβ is first a soluble monomeric complex and aggregation is induced by Zn forming a bridge between two molecules of Aβ, because this would include a change in the coordination (for discussion of the two mechanisms see Talmard et al. 2007).(18)


120

low affinity but pathologically relevant metal-Aβ, but do not withdraw higher affinity

essential metal-protein/peptide interactions. This allows specific, rather than systemic,

chelation of excess metals in the brain of AD patients. The Kd of Clioquinol at pH 7.4 has

been determined.(62) An apparent Kd value of 1.4 10-9 M has been reported at concentrations

of 1µM Zn and 200 µM Clioquinol. However, since clioquinol forms a 2:1 complex with

Zn,(63) the apparent Kd is dependent on the clioquinol concentration, for which 200µM is

rather high for physiological conditions. A Kd of 4.10-8 M (pH 7.0) was determined for Zn-

DP-109 (Jonathan Friedman, personal communication). Our results indicate that concerning

Zn, a Kdapp of about 1µM is enough to withdraw the majority of the Zn from Aβ, independent

of the aggregation state. Moreover, a chelator with a Kd in this range is unlikely to withdraw

Zn from proteins and enzymes as they have generally a stronger Zn affinity.(64-66)

ITC proton displacement: ITC measurement indicated that Zn-binding to Aβ leads to the

release of 0.8-0.9 protons. It is relatively well determined from the literature that Zn binds to

the 3 His. As a fourth ligand, aspartate at position 1, either by the N-terminus or carboxylate

side chain, is the most reported.(28, 29, 34) However, the carboxylate of Glu11 has also been

suggested (31). As Asp and Glu are normally deprotonated at pH 7.4, Zn-binding does not

lead to a proton release. In contrast, the pKa of the N-terminus of a peptide is normally

around 7.8, a value confirmed by 8.0 deduced from potentiometric measurements.(67) Thus

Zn-binding to the N-terminus would lead to a release of 0.8 protons at pH 7.4. This would in

principle allows the distinction between Zn-binding to a carboxylate and to the N-terminus, if

the pKa of the 3 His are known as well. Unfortunately, two quite different sets of data are

available for pKa of His 6, 13 and 14. NMR measurements on acetylated Aβ16 determined

pKa of 7.0, 6,9 and 6.8 respectively. Potentiometric measurement suggested pKa of 7.0, 6.5,

and 5.7 for non-acetylated Aβ16. On the basis of the NMR data, the calculation gives 0.7 ±

0.3 protons released by Zn-binding to the three His in agreement with our measurement.

When N-terminal binding is added, 1.5± 0.4 protons are calculated to be released, which is

not in agreement with the data. For the potentiometric set, Zn-binding to only 3 His gives 0.4

± 0.3 protons replaced, when including N-terminus as ligand, 1.2 ± 0.4 protons. So these pKa

deduced from potentiometry are more in favour of Zn-binding to the N-terminus. However, in

our previous publication,(28) we found chemical shifts of the three His at different pH for the

non-acetylated Aβ16 almost identical to those reported for the acetylated Aβ16, indicating

that under our conditions the pKa of the three His correspond to 6.9 ± 0.1. Thus it seems that


121

the measured release of 0.89 protons by Zn-binding to Aβ is entirely due to the binding to the

3 His. It suggests that no other proton is released, which is in favour of binding to a

carboxylate rather than the N-terminus (or tyrosine). 5

ITC comparison between Cu and Zn: We previously reported ITC measurement on the

interaction of Cu2+ with Aβ16 and Aβ28.(53) Cu is supposed to bind to the same three His as

Zn in a square planar geometry. The fourth ligand is likely to be Asp1 (either by N-terminus

and carboxylate). Cu binding was stronger than Zn binding and it was more dependent on the

buffer (see table 1). In Hepes Kdapp of Cu was ~0.1 µM compared to ~10 µM for Zn, whereas

in Tris Kdapp of Cu was only ~1µM. Not only the Kdapp were different, so also did ΔH and ΔS

(Table 3).

Table 3: Comparison of the thermodynamic parameters, obtained by ITC, of the Zn-Aβ16 and

Cu-Aβ16 interaction.

metal Kd (μM) ∆HTris (kcal.mol-1)

∆STris (cal.K-1.mol-1)

∆HHepes (kcal.mol-1)

∆SHepes (cal.K-1.mol-1)

Zn(II) 22 ± 15 -8.4 ± 4.0 -8 ± 15 -2.3 ± 0.2 18 ± 7

Cu(II) 0.1 -3 12 -0.5 31

In the case of Zn-binding ΔS, even if not very accurate, was clearly smaller than for Cu-

binding. The difference of ΔH was less striking, but Zn-binding had a little more negative ΔH.

This means that for Zn-binding the enthalpic contribution is slightly higher and the entropic

lower compared to Cu-binding. Or in other words, it is principally the higher entropic

contribution which is responsible for the higher affinity of Aβ towards Cu (compared to Zn).

The higher entropic contribution could be due to (i) release of more water molecules from the

hydrated CuII upon CuII-Aβ formation. (ii) release of more water molecules from the peptide

hydration or (iii) conformational changes, i.e. less degree of freedom upon binding of CuII or

(iv) entropic changes due to metal-buffer interaction (before complex formation). In particular,

5 The suggestion that Zn is not binding predominantly to the N-terminus is not in contradiction with the NMR measurements, which showed a line-broadening of the resonances of the N-terminal Asp upon Zn-binding. Transiently and partial Zn-binding could be sufficient to explain the line-broadening in NMR, but would not lead to substantial proton release in ITC.


122

assumption (i) is likely to contribute to the higher entropic contribution of Cu versus Zn-

binding. Hydrated Cu is likely to loose all its water upon binding to Aβ, since no indication

for a labile ligand to the square planar Cu in Cu-Aβ was found.(53) In contrast, Zn, which is

most likely bound to the same four amino acids, prefers penta- and hexacoordination and is

thus likely to keep one or two water molecules upon binding to Aβ. This is supported by the

~13-20 cal mol-1K-1 higher value of ΔS for Cu than Zn-binding (see table 3), and by the fact

that a value of 9.5 calmol-1K-1 per water released from a metal ion has been reported.(52)

Conclusions In conclusion, the present work shows evidence that the apparent Zn-binding affinity to Aβ40

and Aβ42 is in the low µM range and is not much dependent on the aggregation state of

Aβ, i.e. soluble Aβ, Aβ-fibrils or Zn-induced Aβ. Moreover, Zn in the soluble or aggregated

Zn-Aβ form is relatively well accessible for Zn-chelators. This suggests that chelators, i.e. in

the metal chelation therapy, withdraw Zn concomitantly from soluble and aggregated Zn-Aβ,

and specific chelation only from soluble Zn-Aβ seems very difficult.

Acknowledgements:

We wish to thank Dr. D. Fournier (IPBS, Toulouse) for access to the microcalorimeter.


123

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128

III. Complément : principe de la calorimétrie de titrage isotherme

Lorsque deux molécules interagissent (dans le contexte de l’ITC, on les nomme généralement

ligand et récepteur) la réaction s'accompagne d'une libération ou d'une absorption de chaleur

selon le signe de l'enthalpie standard ΔH° de la fixation. Les microcalorimètres modernes

peuvent mesurer de très faibles variations de chaleur et en déduire, dans des conditions

adaptées, les paramètres thermodynamiques de la réaction. Ainsi la calorimétrie de titrage

isotherme (Isothermal Titration Calorimetry, ITC) permet d’étudier l’affinité d’un ligand pour

un récepteur de manière précise. Le principe est le suivant : le récepteur est placé dans la

cellule appropriée (sample cell sur la figure 2.1) situé dans l’enceinte adiabatique, le ligand

placé dans la seringue est ajouté par petits volumes successifs, entre chaque injection

l'appareil détermine la chaleur dégagée ou absorbée puis la compense pour maintenir la

température constante.

Figure 2.1. Schéma constitutif du microcalorimètre de titrage isotherme VP-ITC (Microcal).

Cette méthode non destructive permet, si l’enthalpie de réaction globale dans le tampon utilisé

Système d’injection et d’agitation

Enceinte adiabatique contenant le système

de mesure


129

est non nulle, de déterminer des constantes d’association comprises entre 102 et 109 M-1.

Le principe des mesures est le suivant : soit [M] la concentration en macromolécule, [X] en

ligand et [MX] en complexe, à l’équilibre. On considère une réaction de stœchiométrie 1 :1,

où Ka est la constante d’équilibre de formation du complexe.

M + X MX ]].[[

][XM

MXKa =

La constante d’équilibre est exprimée en fonction des concentrations totales Mtot et Xtot qui

sont les seules connues.

][][ MMXMtot +=

][][ XMXX tot += d’où ( )( )][.][][

MXMMXXMXK

tottoa −−=

Après réarrangement, on obtient l’équation du second degré suivante :

0.].[1][ 2 =+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛++− tottot

atottot XMMX

KXMMX

Dont les deux racines sont :

2

.411

][

2

totXM

KXM

KXM

MXtot

atottot

atottot −⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛++±++

=

En dérivant la racine positive par rapport à Xtot :

2

2

2

.11

.112

22.11

1

21][

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛++⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛−−

−+

−+=

totatotatot

tot

tot

tot

tot

tottota

tot

MKMKMX

MX

MXMK

dXMXd (*)


130

Or la quantité de chaleur Q dégagée ou absorbée à la saturation pendant une expérience ITC

peut être exprimée ainsi (soit V0 volume utile de la cellule et ΔH° enthalpie standard de

réaction en J.mol-1) :

De manière générale :

dH = dU + d(PV) = δQ + δW + d(PV) = δQ + VdP

Mais la réaction est isobare donc on peut simplifier :

dH = δQ d’où ΔH = Q

Or, dans les expériences ITC, Q mesuré est en joules et ΔH° doit être obtenue en

joules par mole de réaction (c’est-à-dire par mole de complexe formé) donc :

Q = ΔH°.[MX].V0

Soit, en prenant l’expression dérivée, avec ΔH° etV0 constants :

dQ = d(ΔH°.[MX].V0) = ΔH°.V0.d[MX]

En remplaçant d[MX] par son expression dans (*), il vient :

⎥⎥⎥⎥⎥⎥⎥

⎦

⎤

⎢⎢⎢⎢⎢⎢⎢

⎣

⎡

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛++⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛−−

−+

−+°Δ=

2

2

20

.11

.112

22.11

1

21.1

totatotatot

tot

tot

tot

tot

tottota

tot

MKMKMX

MX

MXMK

HdXdQ

V

Le paramètre expérimental mesuré en ITC est la dérivée de la chaleur par rapport à la

concentration totale de ligand. Ce paramètre dépend de la valeur de Mtot en relation avec Ka et

Xtot.6

Le terme Xtot / Mtot représente le rapport molaire qui augmente au cours de la titration, tandis

que KaMtot est défini comme le paramètre c, sans dimension, qui détermine l’allure de la

courbe de titration 1/ V0 (dQ/dXtot) en fonction du rapport molaire Xtot / Mtot (Figure 2.2).

Cette courbe porte le nom d’isotherme de réaction et a l’allure d’une sigmoïde. Le point

d’inflexion de la courbe indique la valeur du coefficient stoechiométrique n, la différence

entre les deux plateaux permet la détermination de l’enthalpie globale de la réaction ΔH° et la

constante d’affinité est fonction de la pente de la sigmoïde. 6 T. Wiseman, S. Williston, J. F. Brandts, L. N. Lin (1989) Anal Biochem.179(1):131-7.


131

Figure 2.2. Allures des isothermes de réaction obtenues lors d’une expérience ITC, en

fonction de la valeur du paramètre c. Ainsi, pour une concentration donnée, plus l’affinité est forte, plus la courbe de titrage sera marquée. Une valeur de c élevée (>100) permet une

définition précise de ΔH°, tandis que la détermination de la constante d’affinité requiert une valeur de c intermédiaire (idéalement autour de 40).

Le problème majeur qui s’est posé lors de la détermination des paramètres thermodynamiques

relatifs à l’interaction Aβ-Zn a été l’agrégation importante de ce complexe, empêchant ainsi

l’utilisation des concentrations appropriées pour l’obtention d’une courbe de titrage nette (c

compris entre 5 et 20 suivant les peptides). Il en résulte une incertitude plus grande que celle

généralement obtenue avec l’ITC, en particulier dans l’estimation de l’enthalpie standard

globale de réaction. Ce phénomène étant d’autant plus marqué que la valeur absolue de cette

grandeur est faible : |ΔH°Tris| > |ΔH°Hepes| > |ΔH°Cacodyl| (en effet la libération de protons par le

peptide lors de l’interaction Aβ-Zn implique la présence d’un terme d’enthalpie d’ionisation

du solvant dans l’expression de l’enthalpie globale de la réaction).

Cette propriété de l’association a d’ailleurs permis, en utilisant des tampons avec des

enthalpies d’ionisation différentes, de déterminer le nombre de protons échangés par mole de

réaction. En effet, le nombre de protons libérés (>0) ou captés (<0) par le tampon durant la

complexation du zinc au peptide peut être exprimé suivant l’équation suivante :

ΔHbinding = ΔHreaction + nH+ ΔHionization

où ΔHbinding est l’enthalpie mesuré lors de la réaction et ΔHreaction l’enthalpie intrinsèque de la


132

complexation.7

D’un point de vue pratique, les expériences ont été réalisées à 298,0 ±0,1 K sur un calorimètre

VP-ITC de Microcal (Nortampton, MA). Les solutions de peptides et métaux ont été

préparées à partir de la même solution stock de tampon (20 mM acide [(hydroxy-2-éthyl)-4-

pipérazinyl-1]-2éthanesulfonique (Hepes, Flucka), Tris(Hydroxymethyl)aminométhane (Tris,

Fluka) ou diméthylarseniate de sodium trihydraté (cacodylate, Acros), avec 100 mM NaCl à

pH 7.4, Figure 2.3).

Figure 2.3. Formules des tampons Hepes, Tris et cacodylate de sodium.

Tous les échantillons ont été préalablement dégazés avant utilisation. La cellule de référence

contenait toujours de l’eau ultra pure changée au moins une fois par semaine. Dans la cellule

de mesure, le peptide a une concentration comprise entre 10 et 140 μM. Une expérience ITC

englobe une quarantaine d’injections de ligand (7-8 μL de 150 à 1000 μM). La vitesse

d’agitation a toujours été fixée à 300 rpm. Des expériences de contrôle consistant à injecter le

ligand dans du tampon montrent que la chaleur de dilution est négligeable dans le cas du Tris

(∆HTris ~-0.15 kcal.mol-1). Pour les deux autres tampons la chaleur de dilution, bien

qu’inférieure, n’est pas négligeable comparée aux enthalpies de réaction. Cependant le fit des

courbes donne des valeurs de constante d’association similaires avec et sans soustraction de la

courbe de dilution. Ainsi les courbes ont été traitées en soustrayant à tous les points de la

courbe la chaleur de dilution (valeur correspondante à l’enthalpie mesurée ou extrapolée pour

une grande valeur du rapport [métal]/[peptide]). Quelques titrages inverses ont également été

réalisés (100 μM Aβ16 injecté dans 500 μM de solution de zinc(II)) et confirment l’ordre de

grandeur des enthalpies de réaction obtenues par titrage direct. Les données ont été analysées

avec le logiciel fourni avec l’appareil (Microcal Origin 7.0) et les courbes expérimentales ont

été lissées suivant le modèle à un site de fixation.

7 M. M. Pierce, C. S. Raman, and B. T. Nall (1999) Methods 19, 213-21.

133

Chapitre 3

Etude de l’oligomérisation du peptide

amyloïde bêta durant son agrégation en

présence de zinc(II) ou de cuivre(II)

134

Chapitre 3 : étude de l’oligomérisation des complexes cuivre(II)- et zinc(II) - Aβ

135

I. Contexte bibliographique et étude de l’influence des métaux sur le degré d’agrégation

du peptide amyloïde bêta

Comme énoncé précédemment dans le premier chapitre, l’étude des mécanismes d’agrégation

d’Aβ est primordiale pour l’élucidation des processus de développement de la MA (Multhaup

and Masters 1999; Hardy and Selkoe 2002; Suh and Checler 2002; Klein, Stine et al. 2004;

Maynard, Bush et al. 2005). D’autant plus que les dysfonctionnements neuronaux semblent

être majoritairement le fruit d’agrégats intermédiaires plutôt que des fibres matures.

Cependant, autant les fibres que les petits oligomères ont été décrits comme étant

neurotoxiques (Hardy and Selkoe 2002). Plusieurs intermédiaires de l’agrégation d’Aβ ont été

observés, allant du dimère à de larges agrégats d’environ 10 nm de diamètres (Klein, Stine et

al. 2004). L’étude des conditions influençant l’agrégation et la formation d’intermédiaires est

donc d’un grand intérêt et, en ce sens, nous nous sommes intéressés à l’influence du zinc et du

cuivre, retrouvés in vivo particulièrement concentrés dans les produits finaux de l’agrégation,

les plaques amyloïdes (Multhaup and Masters 1999; Maynard, Bush et al. 2005).

En effet, ces métaux, qui se lient à la partie N-terminale du peptide (acides aminés 1-16),

influent sur l’agrégation d’Aβ : le zinc (II) semble clairement l’accélérer, tandis que le cuivre

(II) a été rapporté tantôt accélérer, tantôt ralentir l’agrégation, probablement en raison des

différentes conditions utilisées (Atwood, Moir et al. 1998; Zou, Kajita et al. 2001; Raman,

Ban et al. 2005).

Aβ40 +2 eq Cu

Aβ40 + DFOA

Aβ40 +1 eq Cu

Aβ40 +1 eq Zn

apo-Aβ40

100

80

60

40

20

0

% a

grég

atio

n

Aβ40 +2 eq Cu

Aβ40 + DFOA

Aβ40 +1 eq Cu

Aβ40 +1 eq Zn

apo-Aβ40

100

80

60

40

20

0

% a

grég

atio

n

Figure 3.1. Effet du zinc (II) et cuivre (II) sur l’agrégation d’Aβ40. Mesure du taux

d’agrégation à pH 7,4 après 3 heures d’incubation à 37°C (concentration initiale en Aβ40 soluble de 50 μM).


136

Sous nos conditions (50 mM Hepes, 100 mM NaCl, pH 7,4, Aβ40 à 50 μM, incubation de 3h

à 37 °C) l’ordre de propension à l’agrégation est le suivant (Figure 3.1) : (ZnII-Aβ40) > (CuII2-

Aβ40) > (apo-Aβ40) ≈ (CuII1-Aβ40) > (apo-Aβ40 en présence de desferrioxamine (DFOA)).

L’agrégation d’une protéine ou d’un peptide induite par des métaux peut être modélisée selon

deux mécanismes distincts : le métal se lie à des ligands provenant de deux protéines et forme

un pont (Figure 3.2.A) ; le métal se lie à une protéine en un complexe monomérique et induit

un changement de conformation qui va favoriser l’interaction entre les protéines (Figure

3.2.B). Des mécanismes intermédiaires peuvent également être envisagés, tel que la formation

de dimères induits par le métal qui ensuite agrègent via l’interaction entre dimères (Figure

3.2.C).

…

…

A)

B)

C) …2

…

…

A)

B)

C) …2

Figure 3.2. Mécanismes théoriques potentiels illustrant l’induction de l’agrégation de protéines ou peptides par des métaux.

L’objectif principal a donc été la recherche d’un éventuel dimère d’Aβ induit par la présence

de métaux. En effet, l’existence d’un tel dimère aurait une importance certaine car :

1. cela apporterait une explication plausible quant à l’accélération de l’agrégation d’Aβ

en présence cuivre (II) (> 1 équivalent) et de zinc (II) (Schmechel, Zentgraf et al.

2003) ;

2. cela expliquerait pourquoi une concentration sous stœchiométrique en métaux est

suffisante pour induire l’agrégation (particulièrement le zinc) et pourquoi ces deux

métaux ont été retrouvés en proportion sous stœchiométrique dans les plaques

amyloïdes (Huang, Atwood et al. 2004) ;

3. la dimérisation de protéines induite par des métaux est un schéma classique et peut

être directement reliée à une fonction (Frankel, Bredt et al. 1988; Hopfner, Craig et al.

2002; Ciuculescu, Mekmouche et al. 2005) ;


137

4. un dimère d’Aβ a été isolé à partir de tissu de cerveau humain et s’est révélé être

neurotoxique (Klein, Stine et al. 2004) ;

5. basé sur des mesures de RPE à basse température, il a été suggéré que Cu(II) se lie à

Aβ en formant des complexes dimériques de type CuII2-Aβ2 (Curtain, Ali et al. 2001).

II. Formation d’un complexe monomérique observable

Le passage de l’apo-, CuII-, ZnII-Aβ16, 28 et 40 en chromatographie d’exclusion stérique

conduit à la détection d’un seul pic d’élution correspondant à une espèce de faible poids

moléculaire (Figure 3.3). Pour le cas des complexes de métaux, l’analyse des fractions a

confirmé la présence quantitative de cuivre et de zinc (présent, pour ce dernier, dans le

tampon d’élution, cf. matériels & méthodes).

dimère monomère

Figure 3.3. Chromatogramme qualitatif (la hauteur des pics d’absorption ayant été modifiée pour une meilleure lecture) de l’apo- (rouge), CuII- (bleu) et ZnII-Aβ28 (vert). Conditions :

Hepes 20 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4. Les flèches indiquent le volume d’élution attendu pour le monomère et le dimère du peptide Aβ28 non structuré (calculée d’après la référence

(Danielsson, Jarvet et al. 2002)).

Il ne semble donc y avoir, dans la gamme de poids moléculaires étudiée (jusqu’à environ 75

kDa), qu’une seule espèce détectable. En comparant les volumes d’élutions vis-à-vis des

poids moléculaires pour apo-Aβ, CuII-Aβ, ZnII-Aβ, les protéines de calibration (globulaires)

et deux oligonucléotides (structure plus allongée), plusieurs constatations peuvent être faîtes


138

(Figure 3.4) :

1. les différents segments sont parallèles ce qui confirme que Aβ16, 28 et 40 se comporte

de façon similaire en terme de ratio Vélution / log (Mr) ;

2. pour un poids moléculaire donné, le rayon hydrodynamique de Aβ et de ses

complexes métalliques se situe entre celui des oligonucléotides et celui des protéines

globulaires ;

3. les complexes CuII0,5-Aβ, CuII

1-Aβ et CuII2-Aβ sont élués aux même volumes (pour

chaque longueur de peptide) que les formes apo ;

4. les complexes de zinc sont élués plus tard que les formes apo.

Figure 3.4. Chromatographie d’exclusion stérique d’Aβ ( ) et de ces complexes métalliques (CuII et ZnII ), des molécules de calibration (---) et des oligonucléotides ( ) de 6 et 12

bases. Conditions : Hepes 20 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4. Le graphe montre le comportement du volume d’élution en fonction du logarithme du poids moléculaire des molécules et

complexes élués (seule une partie de la régression linéaire correspondant aux molécules de calibration apparaît sur le graphe principal, la totalité du segment est représenté sur le petit

graphe).

Si l’on se base sur les protéines de calibration pour calculer la masse moléculaire apparente

d’Aβ et des complexes métalliques, on obtient des poids moléculaires 2 à 3 fois supérieurs

aux valeurs réelles. Cela a conduit certains auteurs à proposer que l’apo-Aβ40/42 existe à

l’état de di-, tri-, et tétramères stables (cf. par exemple référence (Garzon-Rodriguez,

Sepulveda-Becerra et al. 1997)), bien que d’autres méthodes (RMN à écho de spin avec


139

gradient de champ magnétique pulsé, ultracentrifugation analytique) aient suggéré un état

monomérique. Cette erreur provient du fait que les protéines de calibration ont une structure

globulaire ce qui n’est pas le cas d’Aβ, qui est majoritairement random coil (conformation en

pelote statistique non périodique) (Tseng, Esler et al. 1999; Danielsson, Jarvet et al. 2002;

Hou, Shao et al. 2004). Or la chromatographie d’exclusion sépare les molécules suivant leur

rayon hydrodynamique, c’est-à-dire à la fois suivant leur poids moléculaire et leur structure.

Par exemple, les protéines globulaires exhibent un rayon hydrodynamique 2 à 4 fois supérieur

après dénaturation. De même, pour une masse moléculaire donnée, l’oligonucléotide est élué

bien plus tôt que la protéine globulaire (Figure 3.4), du fait de leur structure allongée. Il n’est

donc pas exclu, au contraire, que le volume d’élution des peptides Aβ et de leurs complexes

métalliques correspondent à des monomères (ou complexes monomériques).

De plus, Danielsson et al. (Danielsson, Jarvet et al. 2002) ont montré que l’apo-Aβ40 et 28

étaient monomériques et se comportaient de façon très similaire aux protéines dénaturées.

Pour ces dernières, la formule empirique Rh (en nm) = 0,02 Mr0,5 donne un très bon fit sur une

large gamme de poids moléculaires. Cette relation découle d’une autre formule empirique

développée pour les protéines hautement dénaturées Rh (en Å) = 2,21 N0,57 avec N le nombre

d’acides aminés. Les Rh calculés d’après cette première formule correspondent très bien aux

Rh mesurés des apo- et MeIIx-Aβ (calculés d’après la régression linéaire obtenue avec les

protéines de calibration de Rh connus) si l’on considère qu’Aβ est sous forme monomérique,

ce qui n’est pas le cas avec les formes dimériques (Tableau 3.1). A cela s’ajoute le fait qu’en

RMN du proton, on n’observe qu’un shift modéré de quelques signaux durant la liaison au

métal. Ceci indique que le complexe soluble MeIIx-Aβ n’est pas plus structuré que la forme

apo et justifie l’emploi de la formule empirique pour les complexes métalliques (Syme, Nadal

et al. 2004; Mekmouche, Coppel et al. 2005; Syme and Viles 2005; Hou and Zagorski 2006).

Dans le cas de ZnII-Aβ cependant, le rayon hydrodynamique mesuré en SEC est plus petit que

celui de apo- et CuIIx-Aβ (Figure 3.3 et 3.4, Tableau 3.1). Cela est peut-être dû à une

conformation légèrement plus compacte et structurée comme suggérée par la structure RMN

de ZnII-Aβ16 (Zirah, Kozin et al. 2006). Mais une légère interaction du zinc et donc de ZnII-

Aβ avec la résine de la colonne ne peut pas être exclue (cf. Matériels & méthodes). Afin de

confirmer cette tendance l’apo-Aβ16, -28, -40 et leur complexe avec 0,2 - 0,5 et 1 équivalent

de zinc(II) ont été analysés en RMN à écho de spin avec gradient de champ magnétique pulsé

(PGSE NMR). L’ensemble des Rh déduits de ces expériences correspondent assez bien à ceux

obtenus par SEC (Tableau 3.1). De plus, pour toutes les longueurs d’Aβ mesurées, une


140

tendance à la diminution du Rh sous l’effet de la liaison au zinc a été observée, en accord avec

la SEC et l’existence d’un complexe monomérique.

Il est intéressant de noter qu’aucune dimérisation substantielle n’a été observée, même en

présence d’un demi équivalent de zinc(II) ou de cuivre(II) par Aβ, c’est-à-dire dans des

conditions favorisant la formation de complexes par métal pontant (voir Figure 3.2.C). Ce

constat est important d’un point de vue biologique, car les ions métalliques sont supposés être

en proportion sous stoechiométrique dans les plaques amyloïdes et qu’une quantité sous

stoechiométrique en ions métalliques est suffisante pour induire l’agrégation d’Aβ (Tseng,

Esler et al. 1999; Danielsson, Jarvet et al. 2002; Hou, Shao et al. 2004).

Rh (nm) expérimental déterminé par Rh (nm) calculé d’après Mr a SEC b RMN de diffusion Aβ

monomère dimère apo Cu Zn apo Zn

16 1,19 1,69 1,37 1,40 1,14 1,16 ± 0,05 1,14 ± 0,05

28 1,54 2,18 1,69 1,64 1,41 1,5 ± 0,2 1,4 ± 0,1

40 1,78 2,52 1,85 1,86 1,59 1,7 ± 0,2 1,5 ± 0,2

42 1,81 2,57 1,85 1,86 - - - a Calculée d’après la référence (Danielsson, Jarvet et al. 2002). b erreur expérimentale inférieure à 0,1 nm dans les données SEC.

Tableau 3.1. Rayons hydrodynamiques d’Aβ et de ses complexes de cuivre(II) et de zinc(II).

La quantification des expériences de SEC a montré que CuII-Aβ42, ZnII-Aβ28 et ZnII-Aβ40

agrégeaient partiellement à toutes les concentrations utilisées (10-800 μM), avec des pertes

allant jusqu’à environ 80 % pour ZnII-Aβ40. CuII-Aβ40 et ZnII-Aβ16 agrègent seulement à

des concentrations supérieures, tandis que CuII-Aβ16 et 28 n’agrègent pas significativement.

Cependant, les chromatogrammes de l’ensemble de ces complexes exhibent un unique pic

correspondant au monomère. Ces résultats montrent que, entre le monomère et les agrégats

trop grand pour traverser la matrice de la colonne, aucun intermédiaire stable (di-, tri-,

jusqu’au 20-mère) n’a été formé en quantité suffisante pour être détecté.

L’élution du complexe ZnII-Aβ42 n’a pas été possible, même à basse concentration, du fait

d’une agrégation importante et rapide, cependant l’élution du complexe CuII-Aβ42 a mis en


141

évidence un pic supplémentaire au niveau du volume mort (Figure 3.5), ce qui n’est pas le cas

pour CuII-Aβ40, indiquant un processus d’agrégation potentiellement différent. Un pic

similaire a été décrit avec apo-Aβ40 et assigné à des protofibrilles (Walsh, Lomakin et al.

1997).

Figure 3.5. Chromatogramme du complexe CuII

1-Aβ42. Les flèches indiquent le volume d’élution attendu pour le monomère et le dimère du peptide Aβ42 non structuré (calculée

d’après la référence (Danielsson, Jarvet et al. 2002)).

Ces résultats montrent que le cuivre(II) et le zinc(II) forment un complexe monomérique avec

Aβ40 ou 42 qui est formé transitoirement, mais qui est assez stable pour être observé. Durant

l’agrégation, aucun oligomère stable de masse apparente inférieure à 75 kDa n’a pu être

observé, indiquant que la formation du dimère est l’étape cinétiquement déterminante en

début d’agrégation (voir Figure 3.6).

Me

Oligomères >75 kDa

ProtofibrillesAβ

Figure 3.6. Model de l’agrégation d’Aβ induite par le zinc(II) ou le cuivre(II).

Conclusion

Il est clair que l’agrégation passe par la formation d’un dimère, en présence ou absence de

métal, cependant ce dimère est très instable et agrége rapidement. La liaison au zinc(II) ou au

cuivre(II) n’induit pas la formation de quantité signifiante de dimère, même dans des

conditions favorables. Il semble donc qu’Aβ40 et 42 n’ont pas d’aptitude à former des


142

dimères du fait de la liaison au métal, pointant ainsi vers un mécanisme impliquant un

changement de conformation (Figure 3.2.B) plutôt qu’un ion pontant (Figure 3.2.A).

III. Matériels et méthodes

Préparation des solutions de peptides Aβ.

Les peptides Aβ16, Aβ28, Aβ40, Aβ42 ont soit été synthétisés par processus standard Fmoc

et purifiés par HPLC avec une colonne C8 par Honoré Mazarguil (IPBS, Toulouse), soit

achetés à EZBiolab (Westfield, IN, USA), Geneshere Biotechnologies (Paris, France) ou

Activotec (Cambridge, UK). L’ESI-MS des peptides Aβ16, 28, 40 et 42 montre des masses,

pour les espèces monochargées, correspondantes aux masses calculées à moins de 0,3 unités

près.

Les solutions stocks de peptides sont préparées en dissolvant les peptides dans l’eau ou

directement dans le tampon de travail à pH 9-10 pour faciliter leur dissolution et s’assurer

qu’ils sont sous forme monomérique. Le pH est ensuite ajusté. Les solutions sont conservées à

-20 °C. Dans ces conditions, elles sont stables plusieurs semaines. Les spectres RMN 1H des

peptides Aβ16, Aβ28, Aβ40 ont montré qu’il n’y avait aucune dégradation ni agrégation des

peptides dans ce laps de temps.

La concentration des peptides est déterminée par spectroscopie d’absorption UV-Vis en

utilisant le coefficient d’absorption de la Tyr à λ = 276 nm, ε = 1410 cm-1.M-1 (Gill and von

Hippel 1989). La structure des peptides est principalement “random coil” et la Tyr10 se

comporte donc comme une Tyr libre. Il est donc raisonnable de considérer qu’elle a le même

coefficient d’absorption molaire qu’une Tyr libre. A partir de la Loi de Beer-Lambert, A =

ε.l.c (où l = 1 cm), un simple spectre d’absorption permet de déduire la concentration du

peptide.

Préparation des solutions de métaux.

Les solutions de métaux sont préparées par pesée d’une masse de sulfate de zinc heptahydraté

(ZnSO4, 7 H2O, Alfa Aesar), chlorure de cuivre dihydraté (CuCl2, 2 H2O, Sigma) ou chlorure

de cadmium (CdCl2, Aldrich) diluée dans l’eau. Ces solutions mères stocks sont conservées à

-20°C. Elles sont ensuite diluées dans le tampon approprié jusqu’à 1 mM, 500 ou 100 μM.

L’ajout d’HCl avant dilution est généralement nécessaire afin d’éviter la formation de


143

précipité d’hydroxydes Métal(OH)2.

Spectroscopie d’absorption UV-visible

Les spectres d’absorption UV/Visible ont été réalisés à température ambiante avec les

spectromètres Cary 2300 et Agilent 8453 dans une cuve en quartz de 1 cm de large.

Etude de la diffusion par RMN à écho de spin avec gradient de champ magnétique pulsé

(Pulse Gradient Spin-Echo Nuclear Magnetic Resonnance, PGSE NMR)

La mesure de la diffusion d’une particule permet d’en déduire son rayon hydrodynamique et

ainsi sa taille. Soit kB la constante de Boltzmann, T la température, f le coefficient de friction :

La formule du coefficient de friction donnée ici correspond au cas d’une particule sphérique,

où η est la viscosité du liquide et r le rayon de Stockes de la particule diffusante.

La séquence de base du gradient de champ pulsé est représentée sur la figure 3.7. A l’état

initial, l’ensemble des spins des noyaux des atomes d’hydrogènes est en équilibre thermique

et orienté suivant l’axe z, c’est-à-dire parallèle au champ magnétique statique. A t0 on

applique, pendant un cours instant, un champ de π/2 suivant l’axe des x afin d’orienter les

spins dans le plan perpendiculaire au champ magnétique statique. Ensuite un premier gradient

de champ pulsé est appliqué de manière à induire un déphasage des spins en fonction de leur

position suivant z. A la fin de la première période τ, un champ pulsé π selon l’axe y permet

d’inverser le signe de la phase. Ainsi, lorsque l’échantillon reçoit le 2ème gradient de champ

pulsé identique au premier, les particules ne s’étant pas déplacées suivant z voient le

déphasage de leur spins nucléaires entièrement compensé, les autres restent déphasées

proportionnellement à leur déplacement suivant z entre l’application des deux champs de

gradient. Si toutes les particules ne se sont déplacées uniformément, on obtient une

Mesure de la diffusion

Taille de la molécule

Loi de Stokes-Einstein: D = kB.T/f où f = 6π.η.rs


144

distribution de phase et une atténuation du signal RMN. On associe enfin à chaque signal du

spectre RMN 1H de la solution un coefficient de diffusion.

Figure 3.7. Représentation schématique d’une séquence RMN à gradient de champ pulsé

(Price 1997).

Les expériences de RMN ont été effectuées avec un spectromètre Bruker Avance500 équipé

d’une sonde 5mm triple résonance inversée selon z. Toutes les mesures ont été réalisées selon

la séquence pulsée BPLED (Wu, Chen et al. 1995) avec un retard de 5 ms (Te) des courants de

Foucault. La température a été fixée à 291 K. Le délai de recyclage a été ajusté à 10 secondes

afin de permettre une complète relaxation. La forme du gradient était rectangulaire avec une

longueur de 2,6 ms pour Aβ40 et 2,4 ms pour Aβ28 et Aβ16, la force variant selon 16 in


145

créments (2-95 %) selon la rampe du gradient créé par le logiciel de Bruker DOSY (Diffusion

Ordered Spectroscopy). La force du gradient a été calibrée par mesure de l’auto-diffusion du

signal résiduel HDO dans un échantillon à 100% D2O à 298 K (1,90.10-9 m2.s-1). Le temps de

diffusion Δτ a été pris égal à 180 ms pour Aβ40 et 150 ms pour Aβ28 et Aβ16. Le signal

résiduel de l’eau a été supprimé par une séquence WATERGATE. Les échantillons n’ont pas

été mis en rotation pour éviter une surévaluation du coefficient de diffusion (remarquée

expérimentalement). Tous les échantillons ont été préparés dans D2O pur et le pH a été ajusté

à environ 7,4. Les coefficients de diffusion ont été déterminés en fittant avec la méthode des

moindres carrées les points obtenus par l’équation de Stejskal-Tanner en utilisant

l’algorythme Simfit du logiciel de Bruker T1/T2.

Le rayon hydrodynamique a été calculé d’après les coefficients de diffusion obtenus

expérimentalement selon la relation de Stockes-Einstein (He and Niemeyer 2003).

rTkD B

..6.ηπ

=

avec D le coefficient de diffusion (cm2.s-1), T = 291 K, ηD2O = 1,3.10-3 kg.m-1.s-1 et r le rayon

hydrodynamique (m). Les valeurs de coefficients de diffusion mesurées pour l’apo-Aβ sont

respectivement de 1,39 ; 1,06 et 0,93.10-10 m2.s-1 pour Aβ16, Aβ28 et Aβ40 ; et 1,42 ; 1,19 et

1,08.10-10 m2.s-1 pour les complexes ZnII-Aβ.

Chromatographie d’exclusion stérique (SEC)

L’analyse séparative des mélanges d’oligomères d’Aβ en présence et absence de métaux

(Cu(II) et Zn(II)) est réalisée par chromatographique d’exclusion stérique couplée à une FPLC.

Elle est effectuée à température ambiante sur une colonne superdex 75 10/300 GL avec une

instrumentation AKTA (Amersham Pharmacia Biotech) sous des conditions isocratiques.

L’éluant utilisé est une solution tampon de 20 mM de Hepes à pH 7,4 contenant 100mM de

NaCl. Son débit est généralement de 0,4 ml.min-1. L’absorption a été enregistrée aux 3

longueurs d’ondes : 220 nm, 276 nm et 600 nm. Le système est calibré avec les molécules

globulaires de rayons hydrodynamiques connus suivantes: l’albumine (35,5 Å, 67kDa), la

ribonucléase A (17,5Å ; 13,7 kDa), le cytochrome C (17 Å ; 12,3 kDa), l’aprotinine (13,5 Å;

6,5 kDa), la vitamine B12 (8,5 Å ; 1,35 kDa). Les oligonucléotides (de séquences 5’-

CGTACG et 5’-TCCATATCACAT) ont été donnés par G. Pratviel et B. Meunier (LCC,

Toulouse). Après équilibration de la colonne avec élution du tampon 20 mM Hepes, 100 mM

NaCl, pH 7.4 (2 volumes de colonne), 100 μl d’échantillons de protéines (concentration


146

comprise entre 10 et 200 μM) sont injectés. Le pic d’Aβ est collecté puis quantifié par

absorption.

Sous ces conditions, le complexe Aβ-Zn perd partiellement le zinc. Des expériences

similaires ont donc été effectuées en présence de 50 ou 100 μM de ZnCl2 dans le tampon

d’élution afin de maintenir le zinc fixé au peptide (Kd de l’ordre du micromolaire). Les

concentrations de zinc ont été mesurées avec le 4-(2-pyridylazo)-resorcinol (PAR)

(Ciuculescu, Mekmouche et al. 2005). Le PAR, de plus forte affinité que Aβ pour le zinc,

forme des complexes 1:1 et 2:1 avec Zn(II), ainsi l’utilisation d’un large excès de PAR permet

à plus de 99 % du zinc(II) présent de former un complexe 2:1 avec le PAR : Zn(PAR)2. Celui-

ci est caractérisé par un maximum d’absorbance à 490 nm (ε = 66000 M-1.cm-1) (Shaw, Laib

et al. 1990; Walkup and Imperiali 1997).

La quantité de cuivre présente dans la fraction a été estimée par l’absorbance à 600 nm (ε =

60 M-1.cm-1) et par test colorimétrique test avec la bathocuproïne (Poillon and Dawson 1963).

Dans ce test, le Cu(II) est d’abord réduit en Cu(I) par addition d’un excès d’acide ascorbique

(30 équivalents). Le Cu(I) est ensuite complexé par la bathocuproïne, qui exhibe alors une

bande de transition à 480 nm (ε = 13500 M-1.cm-1). L’acide bathocuproïne disulfonique

(Acros) est 10 fois en excès.

Etude de l’agrégation

Des solutions de 50 μM d’Aβ40 monomérique (tampon Hepes 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4)

ont été incubés pendant 3 heures à 37°C, sous agitation modérée, en présence ou non de métal.

La déféroxamine (achetée chez Sigma, figure 3.8) a été utilisée pour chélater d’éventuelles

traces de métaux. Les échantillons ont ensuite été centrifugés 30 min à 21000g à 4°C. Les

fractions d’Aβ40 soluble et agrégé ont été déterminées en mesurant le contenu en peptide des

culots et surnageants grâce au test colorimétrique de détection de protéines BCA (Pierce,

Rockville CA).

Figure 3.8. Molécule de déféroxamine libre ou liée à du fer(III).


147

Le test BCA est étalonné à partir de solutions d’albumine de sérum bovin de concentration

connue (Smith, Krohn et al. 1985). Le réactif de détection est composé d’acide

bicinchoninique (BCA) et de sulfate de cuivre (II) en présence d’hydroxyde de potassium. Le

principe du test repose sur la réaction de réduction des ions cuivriques en ions cuivreux par

les liaisons peptidiques en milieu très alcalin. Les ions Cu+ sont ensuite captés spécifiquement

par le BCA pour former un complexe 2:1 exhibant une bande d’absorption à 562 nm (Figure

3.9).

Figure 3.9. Réactions conduisant à la détection colorimétrique des protéines par le test BCA.

Ce test colorimétrique possède plusieurs avantages, puisqu'il est :

- quantitatif, sensible (détection à partir de 0,02 μM d’Aβ) et linéaire dans la gamme

de concentration de protéine étudiée (jusqu'à 6 μM d’Aβ),

- relativement peu dépendant de la séquence de la protéine puisque ce sont les

liaisons peptidiques qui réagissent lors du dosage et non les résidus des acides

aminés (comme par exemple le test de Bradford basé sur la coloration des

arginines).

- - compatible avec l'utilisation de CuII et de chélateurs d'ions métalliques aux

concentrations de l'étude.

Il est toutefois préférable d’utiliser la protéine ou le peptide étudié plutôt que la BSA lors de

l’étalonnage. En effet, des différences parfois significatives ont été trouvées entre la

concentration initiale réelle et celle déduite des tests BCA.


148

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150

151

Chapitre 4

Etude structurale du mécanisme de

promotion de l’agrégation du peptide

amyloïde bêta par le zinc(II)

152

Chapitre 4 : mécanisme de promotion de l’agrégation d’Aβ par le zinc(II)

153

I. Introduction

Les amyloïdoses sont caractérisées par un repliement et un assemblage anormal d’une

protéine, conduisant à la déposition de fibres de protéines insolubles (amyloïdes), provoquant

ensuite des dysfonctionnements cellulaires suivis de la mort des cellules (revues : (Sacchettini

and Kelly 2002; Chiti and Dobson 2006)). Il faut noter cependant, comme énoncé dans le

chapitre 1, que toutes les amyloïdoses ne sont pas pathologiques, des amyloïdoses

fonctionnelles ont récemment été découvertes dans un certains nombres d’organisme vivants,

dont l’homme (Fowler et al. 2007). Plus de 20 protéines ou peptides différents ont été

rapportés former des dépôts amyloïdes in vivo. Bien que ces protéines n’aient pas de lien

évident entre elles, tant au niveau de leur séquence peptidique que de leur fonction, elles

polymérisent en des fibres similaires d’un diamètre d’environ 10 nm (Pepys 2006), organisées

en structure dite « cross bêta » et pouvant être révélées par des marqueurs amyloïdophiles tels

la Thioflavine T (ThT) ou le rouge Congo.

Ces protéines peuvent ou non avoir une structure native définie. Quand c’est le cas, comme

pour le lysozyme et la transthyrétine, le changement conformationnel nécessaire à la

formation de structures amyloïdes, passe par une déstabilisation de la structure native du fait

de mutations ou de facteurs environnementaux défavorables (Ohnishi and Takano 2004; Jahn

and Radford 2005). Dans le cas de protéines ou peptides non structurées, tel que Aβ ou

l’alpha-synucléine, la structure du monomère initiateur de l’arrangement en feuillets bêta

n’est pas connu. Teplow et ses collaborateurs (Walsh et al. 1997; Walsh et al. 1999;

Kirkitadze et al. 2001) ont rapporté des indications en faveur de l’existence d’un intermédiaire

de structure partiellement hélice alpha dans la formation de fibres amyloïdes à partir de

peptide Aβ majoritairement non structuré. Cette hypothèse est également confirmée par le fait

que, en présence d’environ 20 % de 2,2,2-trifluoroéthanol (TFE) connu pour promouvoir les

structures en hélice, la formation de fibres est favorisée (Fezoui and Teplow 2002). Cette effet

cesse à des concentrations supérieures en TFE pour lesquelles le taux d’hélices alpha

augmente, soulignant ainsi l’importance d’une conversion partielle en hélice alpha.

Un des facteurs environnementaux physiologiques capable d’affecter la conformation et ainsi

les propriétés d’agrégation des protéines et peptides amyloïdogéniques, est la présence d’ions

métalliques tels le zinc(II) et le cuivre(II). Le zinc a été rapporté se lier à diverses protéines et

peptides comme Aβ, le prion, l’alpha-synucléine, la transthyrétine Abri, etc (Bush et al. 1994;

Atwood et al. 1998; Khan et al. 2004; Gaggelli et al. 2005; Binolfi et al. 2006; Wilkinson-


154

White and Easterbrook-Smith 2007). Généralement le zinc favorise l’agrégation de la protéine

ou du peptide amyloïdogénique. Dans le cas de Aβ, dont l’interaction avec le zinc est une des

mieux décrite, la structure des agrégats a été décrite comme étant majoritairement amorphe

(dépendant des conditions expériementales et temps d’incubation). En effet les agrégats

induits par le zinc semblent moins réagir avec la ThT que ceux formés en l’absence de zinc

(Yang et al. 2000; Yoshiike et al. 2001; Klug et al. 2003; House et al. 2004; Raman et al.

2005).

Comme indiqué dans le premier chapitre, le site de fixation du zinc est localisé sur la partie

N-terminale de Aβ (acide aminés 1 à 16). Plusieurs études utilisant Aβ40 ou les formes

courtes de Aβ (Aβ16 et 28) ont tenté d’identifier les ligands du zinc (Liu et al. 1999; Miura et

al. 2000; Yang et al. 2000; Curtain et al. 2001; Kozin et al. 2001; Zirah et al. 2003;

Mekmouche et al. 2005; Hou and Zagorski 2006; Stellato et al. 2006; Syme and Viles 2006;

Zirah et al. 2006; Danielsson et al. 2007). Bien qu’il y ait quelques contradictions,

l’implication des histidines 6, 13 et 14 sont suggérés par la plupart des publications. Les

conclusions concernant d’autres ligands concordent moins, le plus fréquemment évoqué étant

l’aspartate en position 1, via la fonction amine terminale ou du groupement carboxyle du

résidu (Zirah et al. 2003; Mekmouche et al. 2005; Danielsson et al. 2007). Dans le cas d’un

N-terminus acétylé, la structure RMN du complexe ZnII-Aβ16 a été résolue et indique que le

zinc est lié aux trois histidines et au glutamate 11 (Zirah et al. 2006).

Cependant, le mécanisme de promotion de l’agrégation par le zinc est mal connu. Le but de ce

chapitre est donc d’essayer de comprendre l’effet du zinc sur l’agrégation de Aβ en présence

de TFE, ainsi que le rôle de l’intermédiaire partiellement structuré en hélice alpha. Cette étude

a été menée avec le peptide Aβ28, contenant le site de fixation du zinc, qui a l’avantage

d’agréger beaucoup plus lentement que Aβ40 et 42, rendant ainsi possible les études

spectroscopiques avec un suivi dans le temps, tout en ayant la capacité à former des fibres

amyloïdes classiques (Kirschner et al. 1987).8

8 Le zinc(II) a été choisi préférentiellement au cuivre(II) car sa liaison aux histidines ou carboxylates n’absorbe pas dans la région correspondante aux liaisons peptidiques (190-240 nm). Ainsi les changements observés lors de l’ajout du métal dans le spectre de dichroïsme circulaire ne sont dus qu’à des modifications dans la structure secondaires du peptide. Ce n’est pas le cas du cuivre qui absorbe dans cette région via la liaison aux histidines.


155

II. Résultats et discussion

Le degré d’agrégation de Aβ28 en présence ou non de zinc(II) et en fonction de la teneur en

TFE est donné sur la figure 4.1. Différentes méthodes ont été utilisées pour mesurer l’état

d’agrégation. Premièrement, après 30 minutes d’incubation puis centrifugation, les quantités

de peptide contenues dans le surnageant et le culot ont été mesurées avec le test BCA (voir

Matériels et méthodes). Cette analyse montre qu’en l’absence de zinc, l’agrégation de l’apo-

Aβ28 est faible quelque soit la teneur en TFE de la solution (0 à 40 %). Par contre, la

présence d’un équivalent de zinc(II) induit une précipitation dont l’importance dépend du

pourcentage de TFE : très faible en l'absence de TFE (~10 %), elle est quasi-totale à 10 % de

TFE, puis diminue progressivement jusqu’à retrouver des valeurs très faibles pour une teneur

en TFE de 40 %.

0

20

40

60

80

100

0 10 20 30 40 50 60

% TFE

% a

grég

atio

n et

inte

nsité

de

flore

scen

ce re

lativ

e

Figure 4.1. Pourcentage d’agrégation (déterminé avec le test BCA et par mesure de

l’absorption du surnageant ) ou intensité de fluorescence relative du à la fixation de ThT , après 30 minutes d’incubation à 37°C, en fonction de la teneur en TFE de la solution, en absence (en pointillé) ou en présence (lignes pleines) d’un équivalent (50 μM) de zinc(II).

Les agrégats ont également été analysés par coloration à la ThT. Celle-ci se fixe

spécifiquement aux structures en feuillet bêta en modifiant son émission de fluorescence

(émission à 480 nm pour une excitation à 445 nm) et est donc logiquement utilisée depuis de

nombreuses années pour révéler les structures amyloïdes riches en feuillet bêta. Les résultats


156

obtenus avec la ThT corrèlent tout à fait avec ceux obtenus par centrifugation : la fluorescence

mesurée en absence de zinc est très faible, alors qu’en présence de zinc(II) on retrouve la

même dépendance à la teneur en TFE, c’est-à-dire une fluorescence importante à 10-20 % de

TFE et beaucoup moins en deçà et au-delà. Cette corrélation indique que les agrégats

précédemment observés contiennent des structures en feuillet bêta.

Afin de mieux comprendre le phénomène d’induction de l’agrégation par le zinc, celle-ci a été

suivie dans le temps par turbidimétrie et dichroïsme circulaire à 10 % de TFE (Figure 4.2 et

4.4).

0

0.03

0.06

0.09

0.12

0.15

0.18

0 1 2 3 4 5 6 7 8t (h)

Abs

orpt

ion

à 40

0 nm

Figure 4.2. Mesure de la turbidimétrie d’une solution à 50 μM d’Aβ28 à température

ambiante : seul ( rose), en présence d’un équivalent de ZnII ( orange), en présence de 10 % TFE ( bleu), en présence d’un équivalent de ZnII et de 10 % TFE ( vert).

En présence d’un équivalent de zinc(II) mais sans TFE, Aβ28 exhibe une augmentation

modérée de la turbidité, atteignant un plateau après environ 8 heures d’incubation (pas

d’augmentation significative entre 8 et 30 heures). En revanche, la présence de 10% de TFE,

associée au zinc, accélère et augmente très significativement l’agrégation qui atteint un

plateau au moins trois fois supérieur en à peine 3 heures. Le temps nécessaire pour atteindre

la moitié du maximum de turbidimétrie est de 4 heures en absence de TFE et environ 10

minutes à 10 % TFE.

En absence de zinc, l’augmentation de turbidité est très limitée. Cependant la présence de 10

% de TFE induit au bout de 8 heures, une légère agrégation. Des expériences

complémentaires, sans zinc et à 0 et 10 % de TFE, réalisées sur une semaine, n’ont pas mis en


157

évidence une augmentation supplémentaire de la turbidité. De même, une coloration par ThT

a montré une très faible et relativement constante émission de fluorescence sur l’ensemble des

échantillons de 1 à 7 jours en présence de 10 % de TFE. Sans TFE, aucune émission de

fluorescence significative n’a pu être détectée même après 10 jours. Il semble donc que la

présence de 10 % de TFE favorise légèrement l’agrégation, avec une structure en feuillet bêta,

de l’apo-Aβ28. Cet effet peut être attribué à la stabilisation d’un intermédiaire partiellement

structuré en hélice alpha, favorable à la formation d’agrégats de type amyloïde (Figure 4.3).

On peut également émettre l’hypothèse qu’une quantité importante de TFE stabiliserait trop

fortement l’intermédiaire en hélice qui ne pourrait ainsi plus basculer vers une structure en

feuillet bêta.

Majoritairementrandom coil

Favorisée par 10% TFE

1ère étape 2ème étape

Partiellement hélice α

Majoritairement feuillet β

Majoritairementrandom coil

Favorisée par 10% TFE

1ère étape 2ème étape

Partiellement hélice α

Majoritairement feuillet β

Figure 4.3. Modèle d’agrégation d’Aβ via un intermédiaire partiellement hélice alpha.

Le spectre de dichroïsme circulaire (DC) de ZnII-Aβ28 dans 10 % TFE indique une cinétique

similaire à celle mesurée en turbidimétrie (Figure 4.4) : la moitié du temps nécessaire à la

stabilisation de la structure secondaire est également de l’ordre de 10 minutes. Ainsi

l’agrégation s’accompagne d’un changement de structure d’abord principalement random coil

(avec environ 20 % d’hélice alpha) puis finalement majoritairement feuillet bêta (un peu plus

de 50 %, avec seulement ~3-4 % d’hélice alpha).


158

-13

-11

-9

-7

-5

-3

-1

1

195 205 215 225 235

Wavelength (nm)

[teta

] (kd

eg c

m2

dmol

-1)

0

20

40

60

80

0 50 100 150 200t (min)

%

Longueur d’onde (nm)

[Θ] (

kdeg

.cm

2 .dm

ol-1

)

-13

-11

-9

-7

-5

-3

-1

1

195 205 215 225 235

Wavelength (nm)

[teta

] (kd

eg c

m2

dmol

-1)

0

20

40

60

80

0 50 100 150 200t (min)

%

-13

-11

-9

-7

-5

-3

-1

1

195 205 215 225 235

Wavelength (nm)

[teta

] (kd

eg c

m2

dmol

-1)

0

20

40

60

80

0 50 100 150 200t (min)

%

-13

-11

-9

-7

-5

-3

-1

1

195 205 215 225 235

Wavelength (nm)

[teta

] (kd

eg c

m2

dmol

-1)

0

20

40

60

80

0 50 100 150 200t (min)

%

Longueur d’onde (nm)

[Θ] (

kdeg

.cm

2 .dm

ol-1

)

Figure 4.4. Dépendance dans le temps du spectre de dichroïsme circulaire d’une solution à

50 μM de ZnII-Aβ28 contenant 10 % de TFE (déconvolution avec le logiciel Dichroprot, base de donnée Fasman : random coil, feuillet β, hélice α). Mesures à 0, 25 sec, 4, 8, 11,

15, 23, 31, 48, 150, 202 et 228 min (Greenfield and Fasman 1969; Deleage and Geourjon 1993).

Les spectres DC d’apo- et ZnII-Aβ28 à 0 et 40 % de TFE n’exhibent que peu, voire pas, de

changement dans cet intervalle de temps, parallèlement à leur faible degré d’agrégation. Ces

résultats sont également confirmés par les mesures par coloration à la ThT, qui indiquent

également que les agrégats contiennent des structures en feuillet bêta. Ces données concordent

donc bien avec l’idée que les agrégats formés en présence de zinc sont, au moins en partie, du

type amyloïde. Au vu de l’ensemble de ces résultats, il est clair que l’association d’un

équivalent de zinc et la présence de 10-20 % de TFE a un effet synergique sur l’agrégation

d’Aβ, en accélérant et augmentant la formation d’agrégats contenant des structures en

feuillets bêta.

Ainsi, en se référant au modèle précédent (Figure 4.3), le zinc pourrait accélérer soit la

formation de l’intermédiaire en hélice alpha (1ère étape), soit la transition de cet intermédiaire

vers une structure en feuillet de type amyloïde (2ème étape). Autrement dit, le zinc soit favorise,

soit déstabilise l’hélice alpha. Afin d’évaluer cette incidence, l’effet du zinc sur la proportion

en hélice alpha a été déterminée par spectroscopie DC. Les figures 4.5 et 4.6 comparent

l’intensité du signal à 208 nm, dont la valeur est principalement conditionnée par le taux


159

d’hélice alpha, pour ZnII- et apo-Aβ (respectivement 28 et 16) pour différente teneur en TFE.

A 208 nm, le signal de l’hélice alpha est négatif, la liaison du zinc à Aβ28 induit donc une

diminution de la teneur en hélice alpha en présence de TFE (10-40 %) avec un effet maximal

à 10 et 20 % TFE. Par contre, en absence de TFE, la liaison du zinc semble induire une

augmentation de structure en hélice alpha. Ainsi, dans les conditions favorisant l’agrégation

d’Aβ (10-20 % TFE), le zinc a tendance à déstabiliser l’hélice alpha, pointant donc plutôt vers

une promotion de la 2ème étape dans le modèle précédent.

-16

-14

-12

-10

-8

-6

-4

0 10 20 30 40% TFE

[O] (

kdeg

.cm

2.dm

ol-1

)[Θ

] (kd

eg.c

m2 .d

mol

-1)

-16

-14

-12

-10

-8

-6

-4

0 10 20 30 40% TFE

[O] (

kdeg

.cm

2.dm

ol-1

)[Θ

] (kd

eg.c

m2 .d

mol

-1)

Figure 4.5. Ellipticité molaire à 208 nm, en fonction du pourcentage de TFE, pour des

solutions à 50 μM d’Aβ28, en présence ( vert) ou absence ( bleu) d’un équivalent de zinc(II).

Cependant, la présence de zinc(II) induisant l’agrégation de Aβ28, il est difficile de séparer le

phénomène de formation d’hélice alpha de l’agrégation, bien qu’à la longueur d’onde choisie

les autres structures contribue peu (mais une perte global de signal ne peut être exclue). Le

comportement du peptide modèle Aβ16 ont donc été étudié, en effet il possède le site de

fixation du zinc mais il reste soluble dans les conditions présentes (Mekmouche et al. 2005;

Talmard et al. 2007). Les spectres de dichroïsme obtenus avec Aβ16 sont similaires à ceux

obtenus avec Aβ28. On retrouve la même diminution, en valeur absolue, du signal à 208 nm

du fait de l’ajout de zinc(II) en présence TFE (mais sans l’effet maximal à 10-20% TFE), et

une augmentation an absence de TFE.


160

[Θ] (

kdeg

.cm

2 .dm

ol-1

)

-16

-14

-12

-10

-8

-6

-4

0 20 40 60 80% TFE

[Θ] (

kdeg

.cm

2 .dm

ol-1

)

-16

-14

-12

-10

-8

-6

-4

0 20 40 60 80% TFE

Figure 4.6. Ellipticité molaire à 208 nm, en fonction du pourcentage de TFE, pour des solutions à 50 μM d’Aβ16, en présence ( vert) ou absence( bleu) d’un équivalent de

zinc(II).

Néanmoins, il est clair qu’à 10 % TFE la liaison du zinc(II) à Ab16 induit une diminution du

taux de structures en hélice alpha, indiquant que c’est également le cas pour Ab28.

Conclusion

Il a été montré dans la littérature que la présence de 10-20 % de TFE induit la formation

partielle d’hélices alpha et, parallèlement, favorise la formation d’agrégats d’Aβ de type

amyloïde (riches en feuillets bêta). L’hypothèse a donc été émise qu’une structure

partiellement hélice alpha constitue un intermédiaire dans la formation des fibres amyloïdes.

Cependant cette dernière est inhibée par un taux trop important d’hélices alpha (du fait

probablement d’une trop grande stabilité). Dans ce chapitre, l’influence du zinc sur

l’agrégation du peptide modèle amyloïdogénique Aβ28 a été étudié, en fonction de la teneur

en TFE. Le zinc accentue l’effet du TFE, en effet, à 10-20 % de TFE, il accélère la formation

d’agrégats d’Aβ28 de type amyloïde. Etant donné que, à cette concentration de TFE, la

présence de zinc diminue le taux d’hélice alpha, on peut supposer que la liaison au zinc

favorise la transformation de l’intermédiaire partiellement hélice alpha vers une structure plus

encline à former des fibres riches en feuillets bêta. Cette hypothèse est résumée sur la figure

4.7. Ainsi, dans une première étape, la présence de 10-20 % de TFE stabiliserait intermédiaire

de structure partiellement hélice alpha et, dans une deuxième étape, le zinc accélèrerait la

transformation de cet intermédiaire vers les structures caractéristiques des dépôts amyloïdes,

via une légère déstabilisation des hélice alpha, mais sans pour autant favoriser le retour vers


161

l’état majoritairement non structuré initial. Cette hypothèse est également en accord avec

l’effet synergique observé du TFE et du zinc : séparément les deux facteurs favorisent

l’agrégation, mais conjointement l’effet promoteur est plus que doublé.

Majoritairement random coil

Favorisée par 10%

TFEPartiellement

hélice αMajoritairement

feuillet β

2ème étape1ère étape

Favorisée par ZnII

Majoritairement random coil

Favorisée par 10%

TFEPartiellement

hélice αMajoritairement

feuillet β

2ème étape1ère étape

Favorisée par ZnII

Figure 4.7. Modèle de l’effet synergique du zinc(II) et du TFE (à 10-20 %) sur la formation

d’agrégats d’Aβ28 de type amyloïde : la faible teneur en TFE stabilise l’intermédiaire partiellement en hélice alpha et la liaison du zinc déstabilise cet intermédiaire en faveur de

structure amyloïde en feuillet bêta.

Il est possible que le mécanisme de promotion de la formation de fibres amyloïdes par le

zinc(II) soit le même en l’absence de TFE. En effet, dans ce cas, les intermédiaires

partiellement hélice alpha sont moins nombreux et l’agrégation plus lente. Néanmoins la

transformation de l’intermédiaire vers une structure amyloïde en feuillet bêta peut encore être

accélérée par le zinc. Il faut cependant noter que, l’intermédiaire en hélice ayant été observé

(Walsh et al. 1997; Walsh et al. 1999), il ne peut pas être le nucleus, et une accélération en

aval (après cet intermédiaire) est possible. On peut également supposer que ce mécanisme de

promotion de fibres amyloïdes peut être applicable à d’autres peptide ou protéines

(préférentiellement de structure native aléatoire) incluant le peptide Aβ40/42.

Il est aussi intéressant de remarquer qu’une récente publication (Garai et al. 2007) rapporte la

capacité du zinc à faire accélérer sélectivement l’agrégation de certains intermédiaires d’Aβ40.

Les intermédiaires concernés ont une taille d’environ 10-300 nm (mesurée par spectroscopie

de corrélation de fluorescence). Ils ont montré que le zinc n’avait pas d’effet sur la transition

du monomère vers l’intermédiaire, mais favorisait l’agrégation de ces intermédiaires vers des

agrégats non fibrillaires. Ainsi, en supposant que l’intermédiaire partiellement hélice alpha

observé par Teplow et coll. et l’intermédiaire de Garai et al. correspondent à la même espèce,

alors le modèle présenté dans ce chapitre concorde avec leurs observations.


162

III. Matériels et méthodes

Remarque : pour la préparation des solutions de peptides Aβ et de métaux, se reporter au

paragraphe matériels et méthodes du chapitre 3.

Coloration à la Thioflavine-T (ThT)

La ThT est un produit commercial dont le spectre caractéristique de fluorescence présente

avec un pic d’émission à 445 nm obtenu avec une excitation à 385 nm. Lorsque la ThT

interagit avec les structures en feuillet bêta commune aux structures amyloïdes, il en résulte

un nouveau maximum d’émission à 482 nm pour une excitation vers 450 nm (LeVine 1993).

Une solution de ThT à 2 μM est préparée par dilution successive dans le tampon, à laquelle

sont ajoutés de petits volumes de la solution à analyser (correspondant à 0.1 jusqu’à 2

équivalents de peptide par ThT). Une régression linéaire (hors saturation) permet une

quantification, relative à l’ensemble des échantillons analysés pour une date et une solution de

ThT données, précise.

Figure 4.8. Formule chimique de la ThT composée d’une extrémité hydrophobe (groupe

diméthylamine attaché à un groupe phényl) lié à un groupe benzothiazole plus polaire (via le souffre et l’azote chargé)

Il a été suggéré que la ThT se lie aux fibres amyloïdes selon les sillons formés par

l’interaction entre les feuillets bêta (Krebs et al. 2005). Mais cette hypothèse est controversée,

du fait que la ThT se lie également aux acides nucléiques (Canete et al. 1987) mais pas aux

fibres formées à partir de peptides portant une charge importante. Il a donc été également

proposé que la fixation de la ThT aux fibres d’Aβ implique des interactions à la fois

électrostatiques et hydrophobes (Figure 4.8) (Khurana et al. 2005).

Spectroscopie de fluorescence

Les spectres de fluorescence ont été collectés avec spectrophotomètre de fluorescence Cirad.

Les échantillons sont placés dans une cuve en quartz et les données sont enregistrées à


163

température ambiante. Pour la ThT, l’excitation se fait à 440 nm (bande passante : 4), et les

données sont enregistrées entre 460 – 550 nm (bande passante : 3, photomultiplicateur réglé à

1100 V).

Dichroïsme circulaire.

Les macromolécules biologiques, du fait de leur chiralité, sont optiquement actives. Par

conséquent, lorsqu’elles sont placées dans un faisceau de lumière polarisée rectilignement,

leurs chromophores asymétriques interagissent différemment avec la composante circulaire

droite et gauche de la lumière. Ceci donne lieu à deux phénomènes : 1) une rotation du plan

de polarisation de la lumière (ou pouvoir rotatoire) résultant de la biréfringence du milieu

optiquement actif (l’indice de réfraction est différent suivant la polarisation de la lumière), 2)

une absorption différente des deux composantes de la lumière (coefficients d’extinction

différents). Ce dernier phénomène, appelé dichroïsme circulaire, est très sensible à

l’agencement des chromophores entre eux et notamment, pour les protéines, des liaisons

peptidiques (fonction amide des liaisons peptidiques, étude dans l’UV lointain 180-250 nm).

Ainsi il est directement corrélé à la structure secondaire de la protéine, ce qui fait du

dichroïsme circulaire une méthode spectroscopique de choix pour l’étude de leur repliement.

Par comparaison avec les spectres de protéines de structure secondaire connue, il est possible

de déterminer relativement précisément les proportions d’hélices alpha, feuillets bêta

(parallèles ou antiparallèles) et structures désordonnées (random coil) au sein d’une protéine

(Figure 4.9).

Elli

ptic

ité

190 210 230 250Longueur d’onde (nm)

Elli

ptic

ité

190 210 230 250Longueur d’onde (nm)

Figure 4.9. Modèle de spectre de dichroïsme circulaire de protéines de structure 100% hélice

alpha ( ⎯ ), feuillet bêta (---) ou aléatoire ( ).


164

L’appareil de dichroïsme circulaire, ou spectropolarimètre, décompose la lumière en ses deux

composantes circulaires droite et gauche de mêmes intensité et amplitude. Après passage dans

l’échantillon optiquement actif, les deux composantes mesurées, absorbées différemment,

n’ont plus la même amplitude, leur résultante décrit une ellipse (figure 4.10).

Figure 4.10. Phénomène de dichroïsme circulaire. Un rayon de lumière polarisée rectiligne

monochromatique peut être en deux composantes circulaires gauche et droite de même amplitude (figure de gauche). Après passage au travers d’un échantillon optiquement actif,

les deux composantes sont absorbées différemment, le rayon polarisé résultant est elliptique.

Historiquement, l’ellipticité, exprimée en millidegrés et définie comme le rapport entre le

petit axe et le grand axe de l’ellipse, était le paramètre mesuré en dichroïsme circulaire. Cette

unité a perduré en dépit du fait que la grandeur mesurée par les instruments actuels est la

différence d’absorption, paramètre qui obéit à la loi de Beer-Lambert. Les deux unités sont

toutefois reliées. Soit Δε le dichroïsme circulaire c’est-à-dire la différence de coefficient

molaire d’absorption, εg et εd les coefficients d’extinction molaire des ondes polarisées

circulairement respectivement à gauche et à droite, ag et ad les absorptions correspondantes, l

longueur du trajet optique et c concentration molaire de l’espèce considérée :

claa dg

dg .−

=−=Δ εεε (M-1.cm-1)

Pour relier le dichroïsme circulaire à l’ellipticité, on fait l’hypothèse que l’effet de ce

dichroïsme est faible, autrement dit Δa << 1. Sous cette approximation, l’ellipticité molaire [θ]

est proportionnelle à Δε :


165

εΔ=Θ .3298][ (deg.cm2.dmol-1)

Une fois le spectre obtenu, il est possible d’utiliser l’un des nombreux logiciels de

déconvolution disponibles afin de déterminer le pourcentage de chacune des différentes

conformations (les données exposées dans ce chapitre ont été déconvoluées avec le logiciel

DichoProt) (Greenfield et al. 1969; Andrade et al. 1993; Deleage et al. 1993; Sreerama and

Woody 2000).

Les données décrites dans cet ouvrage ont été obtenues sur un spectropolarimètre Jobin &

Yvon CD6 (Division d’Instrumentation S.A., Longjumeau, France), à 298 K, avec des

cellules en quartz de 1 mm d’épaisseur hermétiquement bouchées pour éviter l’évaporation en

particulier du TFE (solution commerciale à 99%, Aldrich).

Etude de l’agrégation par test BCA.

Les différents échantillons ont été incubés 30 minutes à 37°C puis centrifugés 30 minutes à

20000 g à 4°C. Les fractions d’Aβ28 soluble et agrégé ont été déterminées en mesurant le

contenu en peptide des culots et surnageants grâce au test colorimétrique de détection de

protéines BCA (pour plus de précision quant au principe de ce test, se reporter au paragraphe

Matériels et Méthodes du chapitre 3).


166

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169

Chapitre 5

Etude de l’interaction entre la

métallothionéine-3 et

le peptide amyloïde bêta,

influence du stress oxydant

170

Chapitre 5 : l’interaction MT-3 / Aβ

171

I. Introduction bibliographique

Les métallothionéines (MT) sont une famille de protéines de faible poids moléculaire (6-7

kDa, 60 à 68 acides aminés), riches en cystéines (25 à 30%, Figure 5.1) et qui ne contiennent

généralement pas d’acide aminé aromatique et d’histidine (Vasto et al. 2007). Les MT sont

ubiquitaires dans le règne animal et ont également été décrites chez les végétaux et chez les

procaryotes (Zhou and Goldsbrough 1994; Zhou and Goldsbrough 1995). Du fait de leur

richesse en cystéines, elles possèdent la capacité de fixer, par des interactions non covalentes,

des ions métalliques des groupes Ib et IIb de configuration électronique d10 (en particulier le

zinc(II) et le cuivre(I)) : 7 ions divalents et 8 à 14 ions monovalents par MT. Ainsi, elles sont

supposées jouer un rôle majeur dans le transport et/ou le stockage du zinc intracellulaire mais

sont également impliquées dans l’homéostasie du cuivre et dans la séquestration de métaux

toxiques tels le cadmium et le mercure (affinité relative vis-à-vis du groupement thiol :

Hg(II)>> Cu(I), Ag(I), Bi(III) >> Cd(II) > Pb(II) > Zn(II) > Co(II) > Fe(II) (Vasak 1991).

Dans les conditions naturelles, les métallothionéines ne sont généralement pas complexées par

un métal unique, le contenu en métaux de MT purifiées est variable et dépend de l’organisme,

du tissu, et de l’histoire de l’exposition aux métaux (Hamer 1986). Les métaux peuvent être

libérés des MT lorsque l’on abaisse le pH (Daniels et al. 1998).

Chez les mammifères, on retrouve 4 isoformes : MT-1, 2, 3 et 4 (Vasak and Hasler 2000).

MT-1 et 2 sont présentes dans tous les organes, MT-3 est principalement exprimée dans le

cerveau et MT-4 est limitée aux épithéliums cellulaires tels que celui de la peau ou de la

langue (Quaife et al. 1994; Moffatt and Denizeau 1997; Vasak et al. 2000).

MT-1 MDPN·CSCSTGGSCTCTSSCACKNCKCTSCKKSCCSCCPVGCSKCAQGCVCKGA······ADKCTCCA

MDPN·CSCATDGSCSCAGSCKCKQCKCTSCKKSCCSCCPVGCAKCSQGCICKEA······SDKCSCCAMT-2domaine β domaine α

1 10 20 30 40 50 60 68¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦MDPETCPCPSGGSCTCADSCKCEGCKCTSCKKSCCSCCPAECEKCAKDCVCKGGEAAEAEAEKCSCCQMT-3 / GIF

MT-1 MDPN·CSCSTGGSCTCTSSCACKNCKCTSCKKSCCSCCPVGCSKCAQGCVCKGA······ADKCTCCA

MDPN·CSCATDGSCSCAGSCKCKQCKCTSCKKSCCSCCPVGCAKCSQGCICKEA······SDKCSCCAMT-2domaine β domaine α

1 10 20 30 40 50 60 68¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦MDPETCPCPSGGSCTCADSCKCEGCKCTSCKKSCCSCCPAECEKCAKDCVCKGGEAAEAEAEKCSCCQMT-3 / GIF

Figure 5.1. Séquences peptidiques des MT-3, MT-1 et MT-2

En plus de la régulation de l’homéostasie des métaux, les MT jouent également un rôle anti-

oxydant, anti-apoptotique, protecteur lors de lésions cérébrales (MT-3), régulateur de

croissance neuronale (MT-3) (Moffatt et al. 1997; Hidalgo et al. 2001).


172

La cristallographie et la résonance magnétique nucléaire (RMN) ont permis la détermination

structurale de quelques MT, mettant ainsi en évidence les caractéristiques communes à cette

famille de protéines. Les MT possèdent 2 domaines de fixation comprenant généralement

chacun un cluster de 3 (domaine β, N-terminal, Zn3(CysS)9) ou 4 (domaine α, C-terminal,

Zn4(CysS)11) métaux (cf. figure 5.2). Dans ces clusters, les métaux sont coordonnés dans une

géométrie tétraédrique formée par les fonctions thiolates des cystéines, pontants ou terminaux

(Figure 5.3). La fixation des ions sur les deux domaines n’est pas figée et leur déplacement

d’un site de fixation à un autre est toujours possible (Otvos et al. 1993). Lorsque les MT ne

sont pas complexées avec des ions métalliques, l’absence de ponts disulfures au sein de la

chaîne confère à ces molécules une structure tridimensionnelle hautement désordonnée

caractéristique d’une chaîne d’acides aminés aléatoire. Au contraire, la structure

tridimensionnelle de la protéine complexée est entièrement dominée par l’organisation de la

chaîne d’acides aminés autour des métaux (Stillman et al. 2000).

Figure 5.2. Structure tridimensionnelle de la (Cd5,Zn2)-MT-2 de rat (les sphères représentent

les ions métalliques insérés entre les résidus cystéines) (Romero-Isart and Vasak 2002).(


173

Figure 5.3. Représentations schématiques des clusters Zn-thiolate dans les domaines de fixation N- (à gauche) et C-terminal (à droite) des MT (Maret 2006).

L’affinité des MT pour le zinc est élevée, généralement entre 1010 et 1014 M-1 (Kaji et al. 1993;

Jacob et al. 1998), et vers 6,2.1010 pour la MT-3 humaine (Hasler et al. 2000; Romero-Isart et

al. 2002). Les sites de fixation semblent cinétiquement labiles, permettant ainsi des transferts

intramoléculaires (Otvos et al. 1993; Romero-Isart et al. 2002).

Nous nous intéresserons ici plus particulièrement à la MT-3, anciennement appelée growth

inhibitory factor (GIF) du fait de sa propriété à inhiber la croissance neuronale. La MT-3 se

retrouve principalement et logiquement dans les neurones riches en zinc, tels que ceux de

l’hippocampe et para-hippocampe (Kojima et al. 1999). Bien que de nombreuses études

montrent une élévation de la production de MT-1 et 2 avec l’âge, les résultats concernant la

MT-3 sont plus controversés, diminution et élévation de la concentration de MT-3 ont été

décrites (Uchida et al. 1991; Miyazaki et al. 2002; Gomi et al. 2005). De même, chez les

patients atteints de la MA, le taux de MT-3 a été rapporté être, soit nettement diminué

(Uchida et al. 1991; Tsuji et al. 1992; Yu et al. 2001), soit stable (Erickson et al. 1994;

Amoureux et al. 1997). Il est possible que les méthodes de détection utilisées influent sur ces

résultats (utilisation d’anticorps spécifiques de la protéine, mesure de la quantité d’ARN).

Son rôle est encore mal connu, elle est probablement impliquée dans la régulation de

l’homéostasie des métaux dans le cerveau et aurait des fonctions protectrices contre les

métaux toxiques. Elle semble également interagir avec de nombreuses protéines (la protéine

de choc thermique 84 (HSP84) et 70 (HSP70), la protéine reliée à la dihydropyrimidinase 2,

la créatine kinase et la ß-actine) (El Ghazi et al. 2006), ce qui pourrait lui conférer de

nouvelles fonctions qui restent à déterminer. De plus, sous l’influence de stress oxydant, sa

concentration intra- et extracellulaire augmente, reflétant ses propriétés anti-oxydantes et son

probable rôle de messager chimique dans les processus anti-inflammatoire (Chen et al. 2006;

Lynes et al. 2006).

Il a été montré que la MT-3 (mais ni MT-1 ou 2) protégeait les neurones (en culture cellulaire)


174

des effets toxiques d’Aβ (Irie and Keung 2001), en particulier à faible concentration (Irie and

Keung 2003). Mais le mécanisme sous-tendant cette protection et sa spécificité n’a pas encore

été élucidé. Récemment, une étude a mis-à-jour la capacité de la Zn7MT-3 à lier les ions Cu2+,

via la libération de trois ions zinc(II), pour former un cluster de 4 cuivre(I) réduits

particulièrement stable, dans le domaine N-terminal (Meloni et al. 2007). Ainsi, sur ce modèle,

la MT-3 pourrait prendre et ainsi stabiliser le cuivre, libre (dû à la dérégulation de

l’homéostasie de ce métal dans la MA) ou lié au peptide Aβ (affinité plus faible), supprimant

ainsi la principale source de production de ROS (Barnham et al. 2004; Kitzberger et al. 2005;

Gaggelli et al. 2006).

II. La MT3, source potentielle du zinc retrouvé dans les plaques amyloïdes

Les plaques amyloïdes contiennent une quantité anormalement élevée de métaux de transition

comme le cuivre et le zinc, mais leur provenance est actuellement largement méconnue. Dans

le cas du zinc, il est possible qu’une petite partie du zinc(II) libéré dans la synapse lors de la

transmission synaptique (10 nM à 300μM), se lie à Aβ (Assaf and Chung 1984; Howell et al.

1984). Cependant, la présence de cette forte concentration en zinc libre est très limitée dans le

temps du fait de sa liaison rapide aux ligands et récepteurs de plus forte affinité pour le zinc

qu’Aβ, présents dans l’espace intersynaptique.

Une autre alternative serait de s’intéresser aux protéines de transport ou de stockage du zinc,

or, dans le cerveau la MT-3 en est une des principales. Les études portant sur la variation de

son expression avec l’âge et chez les personnes atteintes de la MA sont contradictoires.

Cependant, dans le cas de la MA, la concentration de MT-3 extracellulaire semble augmenter,

alors qu’elle est plutôt intracellulaire chez le sujet sain (Chen et al. 2006; Lynes et al. 2006). Il

a également était remarqué une nette élévation du stress oxydant avec l’âge et encore plus

chez le sujet atteint de la MA, qui pourrait être la cause de la présence marquée de MT-3

extracellulaire (celle-ci se comportant alors comme senseur du stress oxydant). Ainsi la MT-3

pourrait agir en tant que piégeur d’espèces oxydantes, via la formation d’un pont cystéine et la

libération de Zn2+ (cf. Figure 5.4) (Maret and Vallee 1998). Le zinc libéré, en particulier si le

relarguage a lieu dans le cytosol, pourrait alors être capté par les peptides Aβ.


175

Figure 5.4. L’oxydation des soufres des cystéines est accompagnée des la libération d’ions

Zn2+ et de la formation d’un pont disulfure (Maret 2006).

Afin de confirmer cette hypothèse, l’interaction entre la MT-3 et le peptide Aβ a été étudiée

en collaboration avec l’équipe du Professeur Vasak de l’université de Zurich.

III. Résultats et Discussion

III.1. Hypothèse

Nous avons précédemment remarqué que la présence d’ions zinc(II) accélère l’agrégation d’

Aβ. Ainsi, à partir d’une certaine concentration en peptide, dépendante de la longueur de ce

dernier, la précipitation peut être relativement rapide (c > 10 μM pour Aβ40 et > 30 μM pour

Aβ28 dans nos conditions). Ainsi, si la MT-3 cède bien le zinc(II) qu’elle contient en

présence de stress oxydant (représenté dans l’ensemble des expériences par du peroxyde

d’hydrogène), on peut formuler l’hypothèse suivante qui va permettre de caractériser les

échanges de zinc entre MT et Aβ (Figure 5.5).

R-S-Zn-S-R’ + H2O2 + 2 H+ R-S-S-R’ + 2 H2O + Zn2+

(Zn7-MT-3) pont disulfure

Agrégation du complexe ZnII-Aβ Aβ

R-S-Zn-S-R’ + H2O2 + 2 H+ R-S-S-R’ + 2 H2O + Zn2+

(Zn7-MT-3) pont disulfure

Agrégation du complexe ZnII-Aβ AβAβ

Figure 5.5. Représentation schématique de l’hypothèse de travail (pour une représentation

correcte du site de fixation de ZnII dans les MT, voir figure 5.3).

En effet, le dosage du culot (Aβ-Zn) et du surnageant (Zn7-x-MT-3, Aβ restant), devrait nous


176

permettre de quantifier le relarguage du zinc vers le peptide Aβ en présence de stress oxydant.

III.2. Expériences avec le modèle Cd7-MT-3

III.2.a. Interaction entre Cd7-MT-3 et Aβ

Dans un premier temps, il est important de savoir si le peptide Aβ est capable de capter le zinc

lié à la MT-3 en l’absence de peroxyde d’hydrogène. Cela peut sembler peu probable compte

tenu des constantes d’affinité rapportées pour la MT-3, très supérieures à celle d’Aβ.

Cependant il s’agit de constantes globales, c’est-à-dire une moyenne sur les sept ZnII, il est

donc possible qu’un zinc soit moins fortement lié. Une méthode simple consiste à regarder la

perte en liaison métal-Cys en spectroscopie UV, cependant, dans le cas du zinc, la bande

d’absorption de la liaison Zn-Cys (235 nm) est trop proche de celle des liaisons peptidiques.

On utilise donc le la MT-3 chargée en cadmium (bande Cd-Cys à 250 nm) dont la réactivité

est similaire à celle du zinc (sans toutefois être identique, ainsi sa constante d’affinité pour la

MT-3 est supérieure, de l’ordre de 1014 M-1 pour l’ensemble des CdII) (Romero-Isart et al.

2002).

Ainsi des solutions de MT-3 avec 2 et jusqu’à 10 équivalents d’Aβ40 ont été réalisées (en

tampon Hepes 10 mM, NaCl 20 mM, pH 7,4) et suivis pendant plus de 4 heures. La figure 5.6

montre que même pour 10 équivalents d’Aβ (160 μM contre 16 de MT-3), la perte en

cadmium de la MT-3 n’est pas significative. Des résultats similaires ont été obtenus pour des

ratios Aβ / MT-3 inférieurs.


177

0

1

2

220 240 260 280 300 320

Longueur d'onde (nm)

Abs

orba

nce

0 min40 min1h102h504h20

Figure 5.6. Spectres UV d’une solution d’Aβ40 (160 μM), Cd7-MT-3 (16 μM) (tampon Hepes

10 mM, NaCl 20 mM, pH 7,4) laissée à température ambiante. L’épaulement à 250 nm correspond à la liaison Cd-Cys.

Il apparaît donc que, en l’absence de peroxyde d’hydrogène, le peptide Aβ ne soit pas capable

de capter le cadmium de la MT-3.

III.2.b. Interaction entre Cd7-MT-3 et Aβ en présence de H2O2

Apres avoir montré que la présence d’Aβ n’induit pas de relarguage de cadmium par la MT-3,

l’expérience est répétée en ajoutant du peroxyde d’hydrogène, afin d’évaluer le rôle du stress

oxydant. On observe alors une diminution significative de la bande de transfert de charge

(Cd-Cys) à 250 nm, vraisemblablement due à une oxydation des cystéines et un relarguage de

cadmium. La figure 5.7, représentant la quantité de cadmium relargué (estimée d’après la

diminution du de l’absorption à 250 nm), indique une dépendance au temps et à la quantité de

H2O2 introduite. La réaction est relativement lente (s’étale sur plusieurs heures) et 10µM d’

H2O2 sont suffisants pour relarguer une quantité significative de Cd(II). L’utilisation de

concentrations supérieures en peroxyde d’hydrogène induit une augmentation de la quantité

de cadmium libéré par la MT-3.


178

0

5

10

15

20

25

30

0 1 2 3 4 5 6t (h)

[CdII ]

rela

rgué

(μM

)0

0.51

1.52

220 250 280 310λ (nm)

Abs

100 μM H2O2

00.5

11.5

2

220 250 280 310λ (nm)

Abs

100 μM H2O2

0

5

10

15

20

25

30

0 1 2 3 4 5 6t (h)

[CdII ]

rela

rgué

(μM

)

0

5

10

15

20

25

30

0 1 2 3 4 5 6t (h)

[CdII ]

rela

rgué

(μM

)0

0.51

1.52

220 250 280 310λ (nm)

Abs

100 μM H2O2

00.5

11.5

2

220 250 280 310λ (nm)

Abs

100 μM H2O2

Figure 5.7. Suivi dans le temps du relarguage de cadmium par 20 μM de Cd7-MT-3 en

présence de 20 μM d’Aβ40 et 0 ( rouge), 10 ( vert), 20 ( orange) ou 100 μM ( bleu) de H2O2 dans le tampon habituel. Les valeurs des concentrations de cadmium relargué ont

été calculées à partir des spectres d’absorption (en insert : diminution dans le temps du signal Cd-Cys à 250 nm, en présence de 20 μM d’ Aβ40 et 100 μM d’ H2O2).

III.2.c. Interaction entre Zn7-MT-3 et Aβ, en présence de H2O2

L’on sait à présent que la présence de H2O2 induit un relarguage du métal pour la Cd7-MT-3,

mais en est-il de même pour la forme native chargée en zinc. Comme indiqué précédemment,

la bande de transfert de charge de Zn-MT-3 se situe vers 235 nm, elle est donc beaucoup plus

difficile à suivre que celle de la MT-3 chargée en cadmium (à 250 nm). Le choix de la

méthode d’analyse pour suivre la réaction entre la Zn7-MT-3 et H2O2 s’est donc porté sur la

chromatographie d’exclusion stérique (SEC). Ainsi des solutions de 20 μM de Zn7-MT-3

(dans le tampon Hepes 10 mM, NaCl 20 mM à pH 7,4) contenant différentes concentrations

de H2O2 ont été éluées sur chromatographie d’exclusion stérique (SEC) après 30 minutes à

température ambiante (Figure 5.8).


179

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

250

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Volume d'élution (mL)

Abs

220

nm

0 uM H2O25 uM H2O210 uM H2O220 uM H2O2100 uM H2O2200 uM H2O2500 uM H2O2

monomères

dimèrestrimères

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

250

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Volume d'élution (mL)

Abs

220

nm

0 uM H2O25 uM H2O210 uM H2O220 uM H2O2100 uM H2O2200 uM H2O2500 uM H2O2

monomères

dimèrestrimères

Figure 5.8. Chromatogramme de solutions à 20 μM en Zn-MT-3 contenant 0, 5, 10, 20, 100, 200 ou 500 μM d’eau oxygénée (détection de l’absorption à 220 nm, tampon 10 mM Hepes,

20 mM Na Cl, pH 7,4).

Le coefficient d’absorption à 220 nm étant affecté par le relarguage du zinc (baisse du signal

Zn-Cys à 235 nm), cette étude est strictement qualitative, cependant on peut constater que

l’ajout de H2O2 provoque une diminution de l’absorbance totale à 220 nm que l’on peut

attribuer au relarguage du zinc. Mais on ne peut pas exclure une perte de matériel due à la

formation d’agrégats trop grands pour s’insérer dans la matrice de la colonne (cependant les

résultats décrits sur la figure 5.10 tendent à invalider cette dernière hypothèse). On peut

également remarquer que l’ajout d’H2O2 entraîne : 1) l’apparition d’espèces oligomériques

qui témoigne de la création de pont disulfures intermoléculaires ; 2) un déplacement du pic

des espèces monomériques attestant d’une diminution du rayon hydrodynamique engendrée

par la formation de pont disulfures intramoléculaires. L’ensemble de ces phénomènes indique

la libération d’ions Zn2+ par la MT-3. L’hypothèse de départ est donc en partie vérifiée

(Figure 5.5) : la présence de peroxyde d’hydrogène provoque un relarguage partiel mais

significatif du zinc de la MT-3.


180

III.3. Agrégation d’Aβ en présence de H2O2 et de Zn7-MT-3

Afin de vérifier si le zinc (ou du moins une partie des clusters stabilisé par les cystéines)

libéré par la MT-3 est capable de se fixer sur l’Aβ et de provoquer son agrégation, un suivi de

la turbidimétrie d’un mélange de 50 μM d’Aβ40 et 500 μM de H2O2 a été réalisé (le choix,

dans un premier temps, d’une forte concentration en peroxyde d’hydrogène devant permettre

de mettre en évidence le phénomène). La figure 5.9 montre clairement que l’ajout d’un

équivalent de zinc induit rapidement l’agrégation d’une grande partie du peptide Aβ présent

dans la solution. La présence de MT-3 chargée en zinc et de H2O2 n’ont pas d’effet immédiat

mais semble après un certain temps (un peu plus d’une heure) déboucher sur la même

situation, l’agrégation massive du peptide. Cette agrégation ne peut pas être due directement à

l’eau oxygénée puisque cette dernière n’induit quasiment aucune augmentation de

l’absorption et est donc vraisemblablement le fait de la libération de zinc par la MT-3. La

cinétique de l’agrégation d’Aβ est du même ordre de grandeur que celle du relarguage du

cadmium sous les mêmes conditions, donc, en supposant que le zinc se comporte de façon

similaire au cadmium, cela implique que c’est bien le zinc relargué par la MT-3 qui induit

l’agrégation du peptide Aβ.

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Evol

utio

n de

l'ab

sorp

tion

à 35

0 nm

t (min)

Figure 5.9. Evolution de la turbidité d’échantillons à 50 μM d’Aβ40 (tampon habituel) contenant : ♦ (bleu) un équivalent de zinc(II), ● (rouge) 500 μM de H2O2 et 20 μM de Zn7-

MT-3, ■ (vert) uniquement 500 μM de H2O2.


181

Afin de corroborer les données obtenues en turbidimétrie par le suivi de l’agrégation d’Aβ

induit par le zinc relargué de la MT-3 en présence de H2O2, il a été choisi de suivre la réaction

par centrifugation et dosage du zinc, Aβ et MT-3 dans le culot et le surnageant. La

composition en acides aminés d’Aβ et MT-3 étant assez différente (par exemple, présence de

cystéines dans la MT-3 et pas dans Aβ, etc.), il est possible de doser leur mélange par analyse

d’acide amine. Ainsi, en considérant l’hypothèse exprimée précédemment, des solutions

contenant Aβ28 (50 μM), Zn7MT-3 (20 μM) et différentes concentrations d’eau oxygénée (0

à 500 μM) ont été laissées 3 heures à 25 °C sous faible agitation, puis centrifugées. Les culots

et surnageants ont ensuite été analysés par spectroscopie d’absorption atomique et analyse

d’acides aminés. Les résultats sont exposés sur la figure 5.10.

0

10

20

30

40

50

60

70

Con

cent

ratio

n ag

régé

e (u

M)

0 5 20 100 500

[H2O2] (uM)

Figure 5.10. Concentrations d’Aβ28 (bleu), MT-3 (violet) et zinc (jaune) ayant agrégées, en 3h, en fonction de la concentration de H2O2 présente dans le milieu (tampon Hepes 10 mM, NaCl 20 mM, pH 7,4 ; pourcentage d’erreur jusqu’à 15%). Concentrations initiales sont 50

μM Aβ28, 20 μM Zn7-MT-3.

Les résultats montrent que les concentrations en Aβ et zinc agrégés augmentent avec la

quantité de peroxyde d’hydrogène introduit initialement. Par contre l’agrégation de la MT-3

reste marginal voir non significative (< 2 μM, c’est-à-dire très proche de la limite de détection

(0,75 μM). Ceci est donc en accord avec l’hypothèse que le H2O2 provoque la relarguage du

zinc, qui se fixe sur l’Aβ et entraîne ainsi l’agrégation du complexe ZnII-Aβ. Cependant,

malgré cette confirmation qualitative des résultats, il faut noter que la présence de zinc dans

les agrégats est largement sur-stoechiométrique par rapport à Aβ28. Cet effet aurait pu être


182

imputé à la présence de MT-3 qui même agrégée peut encore contenir quelques équivalents de

zinc, mais on ne la retrouve qu’en très petite quantité dans les agrégats. De plus le phénomène

a été reproduit même en absence de MT-3, il s’agit donc probablement d’un problème de bruit

de fond.

Conclusion

Le présent chapitre est principalement constitué de résultats préliminaires, en effet une

majeure partie des manipulations présentées n’ont pas pu être répétées, faute de temps. Ainsi

au vu de ces premiers résultats qui restent à confirmer, il apparaît que si le peptide Aβ et la

MT-3 (majoritairement chargée en zinc dans le cerveau) coexistent dans un milieu où règne

un stress oxydant prolongé (quelques heures), la MT-3 soit capable de céder une partie de son

zinc à Aβ. Le stress oxydant augmentant nettement avec l’âge, de même, d’après la littérature,

que la localisation extracellulaire de la MT-3, il est possible que cette situation favorise la

formation de plaques amyloïdes possédant une grande quantité de zinc.

IV. Matériels et méthodes



IV.1. Matériels

IV.1.a. Préparation de Cd7-MT-3 et Zn7-MT-3.

La MT-3 a été fournie aimablement par le groupe de Milan Vasak de l’université de Zurich.

La MT-3 humaine est surexprimée dans E. coli puis purifiée. Elle est conservée en milieu

réducteur en présence de mercaptoéthanol (en effet, il semble que la ZnxCuy-MT-3 ait

tendance à s’oxyder à l’air, formant ainsi des ponts disulfures pour finalement libérer du zinc).

Les solutions stocks de MT-3 sont préparées en solubilisant le peptide (~ 1mg) dans l’eau

désionisée (150 μl), auxquelles sont rajoutés 8μl de mercaptoéthanol à 144 mM. La séparation

de la MT-3 et du mercaptoéthanol est réalisée juste avant son utilisation sur une colonne

(pipette pasteur) de résine d’exclusion stérique séphadex G-15 avec pour éluant une solution


183

tampon de 20mM Hepes, 100mM NaCl, pH 7,4. La concentration des échantillons est

déterminée par un dosage des cystéines. Ce dosage est basé sur la réaction de la dithiopyridine

(en excès) avec les thiols de la MT-3 pour donner le 2- pyridinethiol, qui présente une bande

d’absorption caractéristique à 343nm (ε = 7600 M-1.cm-1). Sachant que la MT-3 contient 20

fonctions thiols, la concentration peut être déterminée suivant la formule suivante : [MT] =

DO343/(7060x20) (Roschitzki and Vasak 2002).

Homométallation de la MT-3 :

Dans un premier temps l’apo-MT-3 est préparé, à partir de Znx,Cdy-MT-3 obtenue

précédemment, par chromatographie d’exclusion stérique (Sephadex G-50) à pH 2 (Vasak et

al. 1987). La fraction correspondant au pic monomérique est alors collectée et lyophilisée

après avoir ajuster le pH à 2,5 par dilution. Ensuite, afin de charger la protéine en cadmium ou

zinc, 20 mg d’apo-MT-3 diluée dans 50 mM HCl est mélangé à 8 équivalents de CdCl2 ou

ZnCl2 au même pH. Pour que le métal se lie, le pH est élevé jusqu’à 8,6 avec une solution à

0,5 M Tris. L’ensemble de cette opération se déroule sous atmosphère inerte et les solutions

sont préalablement dégazées. Une petite portion de Chelex 100 est alors ajoutée à la solution,

puis éliminée par centrifugation, le surnageant est concentré par ultrafiltration. Ce dernier est

ensuite passé sur colonne d’exclusion (Sephadex G-50) équilibrée avec 20 mM Tris-HCl / 10

mM NaCl à pH 8,6. Le rapport métal/protéine est vérifié par analyse d’un aliquot en

spectroscopie d’absorption atomique et par spectroscopie d’absorption UV-visible à pH acide.

IV.1.b. Autres solutions

Les solutions diluées d’eau oxygénée utilisées ont été obtenues à partir d’une solution

commerciale à 30 % d’H2O2 (Fluka).

IV.2. Méthodes

IV.2.a. Analyse d’acides aminés

Les échantillons ont été centrifugés 30 minutes à 15000 g et le surnageant entièrement pipeté

pour être remplacé par 200 μL d’acide trifluoroacétique à 0,1 %. Les solutions ont ensuite été

placées dans les tubes adaptés pour l’analyse d’acides aminés et lyophilisés sur la nuit. Les

échantillons ont été analysés par le groupe d’analyse protéique (service commun) de

l’université de Zurich.


184

IV.2.b. Spectroscopie d’absorption atomique

Les échantillons de 300 μL ont été centrifugés 30 minutes à 15000 g puis le culot et le

surnageant ont été séparés (150 μL chacun). Leur concentration en zinc a été déterminée à

l’aide d’un spectromètre d’absorption atomique monofaisceau SpectrAA-110 de Varian Inc.,

équipé d’une lampe à cathode creuse de zinc. Une flamme air-acétylène permet l’atomisation

des gouttelettes.

L’appareil a été calibré avec les étalons appropriés avant passage des échantillons.

IV.2.c. Chromatographie d’exclusion stérique

L’analyse séparative des mélanges d’oligomères de MT-3 en présence de différentes

concentrations de H2O2 a été réalisée par chromatographique d’exclusion stérique couplée à

une FPLC. Elle est effectuée à température ambiante sur une colonne superdex 75 10/300 GL

avec une instrumentation AKTA (Amersham Pharmacia Biotech) sous des conditions

isocratiques. L’éluant utilisé est une solution tampon de 20 mM de Hepes à pH 7,4 contenant

100mM de NaCl. La présence de MT-3 en sortie de colonne a été détectée par absorption à

220 nm. Les solutions ont toutes été préalablement centrifugées 30 minutes à 10000 g afin de

n’éluer que les espèces solubles.

IV.2.d. Spectroscopie d’absorption UV-visible

Les spectres d’absorption UV/Visible ont été réalisés à température ambiante avec les

spectromètres Cary 2300 et Agilent 8453 dans une cuve en quartz de 1 cm de large.


185

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187

Chapitre 6

Etude de l’interaction du peptide amyloïde

bêta avec les membranes, influence du zinc

Etude réalisée à l’université de Würzburg,

dans l’équipe du Prof. R. Benz

188

Chapitre 6 : Aβ et les membranes, influence du zinc

189

I. Bibliographie

De nombreuses études ont tenté de comprendre le mécanisme par lequel l’agrégation de

certaines protéines est toxique pour les cellules (comme c’est le cas pour la grande majorité

des amyloïdoses). Il a été conclu que cette toxicité s’exerçait suivant les mêmes modifications

de propriétés biochimiques spécifiques de la cellule, indépendamment de la nature du peptide

étudié (Bucciantini et al. 2002). De plus, certaines amyloïdoses sont intracellulaires quand

d’autres résident dans le cytosol (Bodles et al. 2000; Kayed et al. 2003). Ces observations font

des membranes cellulaires des cibles potentielles privilégiées pour la pathogénie amyloïde. En

effet, une altération des membranes cellulaires, via des lésions non spécifiques (Green et al.

2004; Kayed et al. 2004) ou la formation de canaux ioniques (Arispe et al. 1993; Rhee et al.

1998; Lin et al. 1999; Kawahara et al. 2000; Hirakura et al. 2002; Kourie and Henry 2002),

peut engendrer une dishoméostasie ioniques et entraîner ensuite la mort cellulaire (Cecchi et

al. 2005).

Le peptide Aβ est amphipatique, les 28 résidus N-terminaux, correspondant à une portion du

domaine extracellulaire de l’APP, sont hydrophiles, tandis que la partie C-terminale restante,

transmembranaire dans l’APP, est hydrophobe. Du fait de sa provenance, Aβ pourrait donc

potentiellement interagir de lui-même avec les membranes cellulaires, par exemple en se

réinsérant sous forme d’hélice alpha via sa partie hydrophobe (favorisant ainsi plutôt la

formation de pores), ou par le biais d’interactions électrostatiques qui accélèreraient

l’agrégation du peptide en favorisant les structures en feuillet bêta et en jouant le rôle de site

de nucléation (Figure 6.1) (Jarrett and Lansbury 1993; Bokvist et al. 2004). Ces interactions

entraîneraient une diminution de la fluidité des membranes (Kremer et al. 2000) induisant une

altération de leurs propriétés, comme leur dépolarisation (Hartley et al. 1999) ou

l’augmentation de leur perméabilité (Arispe et al. 1996).


190

Figure 6.1. Représentation schématique de différents types d’interaction Aβ-membranes :

adsorption électrostatique avec accélération de la formation d’agrégat en structure feuillets bêta ; insertion par la partie hydrophobe d’Aβ. Une élévation du potentiel membranaire

favoriserait les deux processus (adsorption facilitée / insertion plus importante du peptide) (Bokvist et al. 2004).

D’un point de vue de la toxicité, le peptide Aβ a été rapporté induire une dégénération

neuritique (Aβ42 à 50 nM), une mort cellulaire (Aβ42 à 10 μM) et une altération de

l’homéostasie du calcium, phénomènes qui découleraient de la formation de canaux ioniques

(Lin et al. 2001). Confirmant cette hypothèse, des images de pores membranaires composés

de plusieurs (généralement 4 ou 6) sous-unités d’Aβ42 ont été publiées (Figure 6.2) (Lin et al.

2001; Quist et al. 2005). Les structures de ces canaux semblent toutefois assez hétérogènes.

Figure 6.2. Pores formés par Aβ40 dans une bicouche lipidique (DOPC, 1,2-dioleoyl-sn-

glycero-3-phosphocoline) visualisé par microscopie à force atomique (taille de l’image : 25 nm) (Quist et al. 2005).

Une augmentation de la conductance des bicouches lipidiques (DOPC), en présence d’Aβ

(10μM Aβ42 et 21μM Aβ40, 100 mM KCl 10 mM Hepes, pH 7,4) a également été observée


191

(Figure 6.3) (Lin et al. 2001; Quist et al. 2005), en particulier, avec les oligomères solubles

(Kayed et al. 2004).

Figure 6.3. Visualisation du courant traversant un canal constitué de peptides Aβ (solution

tamponnée à pH 7,4, 100 mM KCl, Aβ à 21 μg.L-1, bicouche plane de phospholipides, d’après (Quist et al. 2005)).

De plus, Aβ interagit chimiquement et biochimiquement avec les lipides : les produits

d’oxydation des lipides modifient Aβ, augmentant ainsi son agrégation (Bieschke et al. 2006) ;

inversement, Aβ peut oxyder les lipides via la production de ROS (en présence de cuivre et de

fer) (Murray et al. 2005; Lau et al. 2007).

II. Résultats et discussion

Dans ce chapitre, on s’intéressera aux effets du zinc(II) sur les « pores » formés par Aβ.

L’ensemble des expériences a été réalisé, sauf mention contraire, dans le tampon Hepes 20

mM KCl 1 M à pH 7, avec une membrane bicouche de cholestérol oxydé et en utilisant le

peptide Aβ42. Des essais ont également été réalisés avec le lipide L-α-Phosphatidylcholine

(Avanti Polar Lipids) plus couramment utilisé, mais l’insertion d’Aβ42 n’y est pas détectable,

il faut y ajouter un minimum de 30 % en cholestérol oxydé pour visualiser un début

d’insertion. Ce groupe de lipides est pourtant plus couramment utilisé dans ce type d’étude, en

effet il fait partie de la famille des phosphatidylcholines (ou lécithine, Figure 6.4), sous-

groupe des phospholipides (ou diacylphosphoglycérides, classe la plus abondante des lipides

des cellules animales) (IUPAC-IUB 1978). En comparaison, le cholestérol (de la famille des

stérols) est beaucoup plus compact et apolaire, mais il constitue tout de même environ 30 %


192

de l’ensemble des lipides et des membranes plasmiques. La difficulté d’insertion du peptide

dans une bicouche classique de phospholipides par rapport à la celle constituée de cholestérol

oxydé, semble indiquer que: 1) Aβ ne s’insère pas dans les membranes aussi aisément qu’une

protéine membranaire classique (qui n’a aucune difficulté à s’insérer rapidement dans les

bicouches phospholipidiques) ; 2) Aβ pourrait s’insérer préférentiellement dans les radeaux

lipidiques riches en cholestérol.

Figure 6.4. Haut : structure générale des lipides de la classe des phophatidylcholines,

constitué de l’association des groupements choline, phosphate, glycérol et d’acides gras (nomenclature : palmitoyl-oleyl-sn-phosphatidyl-choline). Bas : formule de la L-α-

Phosphatidylcholine (lécithine de soja).

La concentration en sel semble également influer puisque l’insertion d’Aβ42 se fait moins

aisément à 100 mM de KCl qu’à 1M. Il est possible que l’interaction entre les parties

hydrophobes du peptide et des lipides soit favorisée par l’ajout de sel, ce dernier perturbant la

solvatation des résidus C-term d’Aβ42.

Quant aux peptides Aβ16 et Aβ28, principalement utilisés pour étudier l’interaction avec les

métaux et dépourvu de la partie hydrophobe transmembranaire dans l’APP, leur insertion est

extrêmement faible (même en introduisant 10 μM de peptide dans chaque compartiment et en

augmentant la tension aux électrodes jusqu’à 70 mV). On constate une très légère

augmentation de la conductivité (maximum de 22 nS avec Aβ28) mais celle-ci n’est pas

stable. Il est probable qu’il ne s’agisse que d’une légère déstabilisation de la membrane du fait

de l’interaction du peptide avec la partie hydrophile (groupement alcool ou fonctions oxydées

carbonyles ou carboxyles) des molécules de cholestérol. La partie hydrophobe d’Aβ apparaît

donc indispensable à son insertion dans les membranes.


193

Aβ42 s’insère dans les membranes de cholestérol à partir de 0,7 μM de peptide dans les deux

compartiments, l’initiation de l’insertion du peptide peut parfois prendre quelques minutes

voire nécessiter une destruction (un léger choc suffit) puis reformation de la membrane,

comme c’est le cas dans l’expérience illustrée à la figure 6.5 (indiqué par une flèche bleue).

Ensuite la conductivité augmente progressivement jusqu’à une valeur limite, atteinte

généralement en quelques minutes. Cette phase d’insertion nous renseigne sur l’homogénéité

des pores formés : sur la figure 6.5, on n’observe pas de paliers lors de l’insertion des peptides

dans la membrane ce qui indique que les pores formés n’ont pas de conductivité définie, ils

sont hétérogènes. La conductivité à saturation résultant de la présence de 0,7 μM d’Aβ42 est

variable, entre 30 et 100 nS suivant les expériences, confirmant l’hétérogénéité des pores

d’Aβ.

Figure 6.5. Conductivité d’Aβ42 0,7 μM (tampon 20 mM Hepes, 1 M KCl, pH 7) inséré dans une bicouche lipidique cholestérol oxydé (échelle : 1 cm en abscisse, 5 nS en ordonnées), la flèche bleue indique la destruction/reformation volontaire de la membrane, initiatrice dans

cet exemple de l’insertion du peptide).

L’influence du zinc a également été mise en évidence : l’ajout d’ions Zn2+ après stabilisation

d’Aβ42 dans la membrane entraîne une diminution de la conductivité, c’est-à-dire la

fermeture des pores (Figure 6.6). Cette fermeture est réversible, en effet l’ajout d’un chélateur

(EDTA, de plus grande affinité pour le zinc qu’Aβ) à la fin du titrage induit une élévation de

la conductivité.


194

Figure 6.6. Suivi de la conductance d’une membrane de cholestérol. 1ère partie :

augmentation du signal avec l’insertion d’Aβ42 (0,7 μM dans chaque compartiment) dans la membrane. 2ème partie : diminution de la conductance durant le titrage par Zn2+. 3ème partie :

réouverture des pores via l’ajout d’un équivalent (1,77 mM) d’EDTA, chélateur du zinc.

On peut déjà constater, en observant la figure 6.6, que l’ajout de 10 équivalents de zinc ne

suffit pas à bloquer les pores (malgré le champ électrique présent dans la solution qui a

tendance à conduire les ions positifs vers la membrane pour l’un des deux compartiments). En

effet, les constantes de dissociation obtenues, dans l’hypothèse d’une stoechiométrie 1:1, sont

beaucoup plus élevées que celles calculées au chapitre 2 : entre 270 et 350 μM, soit presque

cent fois supérieures. Plusieurs hypothèses peuvent être avancées pour expliquer ce

phénomène : 1) l’insertion du peptide dans la membrane induit un changement

conformationnel qui défavorise la liaison au métal ; 2) l’interaction de plusieurs zincs par

peptide est nécessaire pour induire une baisse de la conductivité, mettant en jeu des sites de

plus faible affinité (incluant des ligands appartenant à Aβ et éventuellement au cholestérol

oxydé).

Remarque 1 : afin de mettre en valeur un éventuel renforcement de la toxicité de (ZnII-Aβ)


195

sur les membranes lorsqu’il se trouve dans un état agrégé, une tentative d’insertion de (ZnII-

Aβ42) préincubé durant 5 jours (solution à 50 μM dans le tampon habituel, à température

ambiante) a été réalisée. L’étude a montré un temps de latence avant insertion

comparativement très supérieur à l’apo-Aβ42 monomérique. Il est probable que, vu la faible

concentration utilisée (0,3 μM), les agrégats se soient partiellement solubilisés et les

complexes ZnII-Aβ également partiellement rompus. Le faible signal finalement obtenu

(maximum à 20 nS) correspond finalement aux valeurs précédentes ramené à 0,3 μM d’Aβ42

(le zinc n’étant pas assez concentré pour abaisser la conductivité), confirmant la dissolution

des agrégats et leur incapacité à s’insérer directement dans la membrane. Ce résultat devrait

bien sûr être reproduit et confirmé pour être pris en compte.

Remarque 2 : des expériences antérieures réalisées dans le laboratoire (université de

Würzburg, équipe du Prof. Benz) montraient également une baisse de la conductivité lors de

l’ajout d’ions Cu2+ après stabilisation d’Aβ42 dans la membrane. Ces métaux sont donc

protecteurs vis-à-vis de la perméabilité membranaire induite par Aβ. Cependant, la présence

au niveau des membranes de cuivre (II), qui peut conduire à la production de ROS (même lié

à Aβ), est potentiellement toxique pour les cellules.

Remarque 3 : plusieurs tentatives ayant pour but de faire apparaître un éventuel effet

protecteur du peptide humanine (séquence : MAPRGFSCLLLLTSEIDLPVKRRA,

(Hashimoto et al. 2001; Niikura et al. 2004; Benaki et al. 2005; Armas et al. 2006)) via la

fermeture des pores d’Aβ (en présence ou non de zinc) n’ont pas abouti du fait de la

destruction quasi immédiate de la membrane après ajout de l’humanine (Figure 6.7). Cette

forte déstabilisation a été observée indifféremment en présence et en absence d’Aβ, la

reconstruction de la membrane n’étant ensuite plus possible. Au vu de sa séquence peptidique,

il est possible que l’humanine agisse comme un détergent qui interagirait avec la membrane

en favorisant la formation de micelles.


196

Figure 6.7. Stabilisation de l’insertion du peptide Aβ42 suivie de la rupture de la membrane

de cholestérol suite à l’ajout de peptide humanine (flèche verte).

Conclusion

On constate une légère déstabilisation des membranes riches en cholestérol lors de l’ajout du

peptide Aβ42, dont la partie hydrophobe semble jouer un rôle essentiel. Les « pores » formés

sont cependant très hétérogènes puisque la conductivité augmente de façon plutôt linéaire

avant de se stabiliser. Le zinc (qui n’induit pas la formation de ROS contrairement au cuivre)

pourrait jouer un rôle protecteur en se liant au peptide et ainsi fermer les canaux. Cependant

des concentrations importantes en zinc libre sont nécessaires pour induire une baisse

significative de la conductivité membranaire et cette situation est peu probable in vivo (ou

alors transitoirement). Toutefois, la déstabilisation de la bicouche lipidique par Aβ reste faible

et dépendante d’un certain nombre de facteurs (haute teneur en cholestérol, forte

concentration en sel, destruction/reformation de la membrane souvent nécessaire). Ainsi, au

vue de ces expériences et en accord avec certaines publications (Gonzalez-Montalban et al.

2007), il ne semble pas que la perméabilité des membranes cellulaires induite par le peptide

Aβ soit la cause principale de toxicité de la maladie d’Alzheimer, il est en effet probable que

plusieurs voies de toxicité coexistent dans la MA. Il faut cependant garder à l’esprit que les

membranes de cholestérol oxydé utilisées (très ordonnées) ne sont que des modèles et que le

comportement du peptide vis-à-vis de membranes biologiques peut différer.

III. Méthode : la BLM



197


La membrane noire ou BLM (Black Lipid Membrane) est constituée d’une bicouche lipidique

plate séparant deux solutions aqueuses dans chacune desquelles trempe une électrode (Figure

6.7). Une différence de potentiel est appliquée entre les deux électrodes et l’on mesure le

passage du courant (porté par les ions de la solution, en général KCl) au travers de la

membrane, ce qui permet d’en déduire sa conductance c’est-à-dire sa perméabilité aux ions.

En absence de protéine et d’impureté, le courant entre les deux compartiments est constant et

proche de zéro. La cuve et les électrodes sont placées dans une cage de Faraday pour les isoler

de nuisances électriques et électromagnétiques extérieures et l’ensemble de l’appareil est

placé sur un marbre amortissant les tremblements susceptibles de rompre la membrane.

Figure 6.7. Représentation schématique du matériel de BLM. Les deux compartiments en

téflon sont séparés par une ouverture de 0,1 mm dans laquelle est formée la bicouche lipidique. Les protéines ajoutées ensuite dans un des compartiments, peuvent s’insérer dans

la membrane, laissant ainsi passé des ions et donc du courant. Lorsque l’on étudie des protéines membranaires, qui forment des canaux stables, l’augmentation de courant se fait

par paliers, chaque palier correspondant à la formation d’un pore.


198

Les compartiments en téflon sont remplis respectivement de 5 mL de solution tampon (1 M

KCl, 20 mM Hepes, pH 7). Un système d’agitation magnétique permet de travailler avec des

solutions homogènes. Dans l’ensemble des expériences réalisées, sauf mention contraire, les

membranes sont constituées de cholestérol oxydé (Figure 6.8). Les lipides sont conservés

dans le chloroforme à -20°C. Le solvant est évaporé avant utilisation et remplacé par un

mélange de n-décane et butanol, ce dernier stabilisant la membrane.

Figure 6.8. Le cholestérol et ses formes oxydées. La présence d’une double liaison peut

conduire, in vivo, à une oxydation ménagée (aldéhyde) ou complète (acide carboxylique).

Cette solution à 1 % de cholestérol oxydé est appliquée à l’aide d’une boucle sur l’ouverture

de 0,1 mm séparant les deux compartiments (Figure 6.7 et 6.9) (Benz and Gisin 1978). La

qualité de la membrane est vérifiée à l’aide d’un microscope placé devant l’ouverture réalisée

dans l’un des compartiments, la membrane ne doit contenir aucun reflet ou bulle et être

entièrement « noire », signe de la formation d’un film homogène d’épaisseur bimoléculaire.

L’ensemble du matériel utilisé doit être soigneusement lavé et séché entre chaque expérience.

Un temps d’attente d’une heure minimum doit être observé, sous agitation, entre la formation

de la membrane et l’ajout du peptide, afin de vérifier l’absence d’impureté. Toutes les

expériences ont été effectuées à température ambiante.


199

Figure 6.9. Photographies de l’appareil et de ses différents éléments : 1- boucle en téflon, 2-

barreaux aimantés, 3- générateur de tension, 4- amplificateur de tension, 5- cage de Faraday, 6- microscope et lampe, 7- marbre, 8- enregistreur à papier déroulant, 9- cuvette en téflon.

Mesure de la conductivité

Les membranes de lipide sont quasiment imperméables aux ions de la solution électrolytique.

C’est pourquoi, lors de l’application d’une tension de l’ordre de 20 mV, aucun courant n’est

décelé. Après ajout de la protéine étudiée, l’interaction avec la membrane se traduit par le

passage d’ions (formation de pore ou simple altération de la membrane induisant une certaine

perméabilité) et l’intensité mesurée augmente. Si la protéine introduite forme des pores

stables (protéines membranaires), on observera un signal en escalier, chaque palier

correspondant à la formation d’un pore. Ceci à condition bien sûr que les pores ne soient pas

spécifiques d’un ion particulier ou que celui-ci fasse partie des électrolytes du tampon.

La conductivité d’une protéine est obtenue d’après les expressions suivantes :

eUIG =

Avec G conductivité en Siemens (S), I intensité (A) et Ue la tension appliquée entres les

électrodes (entre 20 et 70 mV).

L’intensité mesurée est amplifiée d’un facteur Vf (généralement égal à 109 V.A-1) et convertie

en tension (Ua, en V).


200

f

a

VUI =

En remplaçant dans l’expression précédente, il vient :

ef

a

UVUG.

=

L’échelle Uv de l’enregistreur à papier déroulant est choisie par rapport à la valeur de Ua.

Ainsi la hauteur du papier déroulant, correspondant à Uv, contient 10 graduations. Une simple

règle de 3 permet d’obtenir la conductivité par graduation Gg, indiquée sur les spectres.

ef

vg UV

UG..10

=

La méthode de titrage

Une fois le peptide inséré et le signal stabilisé, une molécule (métal, protéine,…) peut être

ajoutée dans l’un des compartiments. Si cette molécule, en se liant au canal, est capable de le

bloquer, il est alors possible d’effectuer un titrage et d’en déduire la constante d’association

entre la macromolécule introduite dans la membrane et son ligand. De petits ajouts successifs

de ligand vont ainsi diminuer la conductivité mesurée jusqu’à une valeur maximale

correspondant à la saturation de tous les pores. On associe ensuite la constante de dissociation

à la valeur de la concentration en métal à la moitié de la saturation. Dans le cas du peptide Aβ,

on fait l’hypothèse d’une stœchiométrie 1:1 entre Aβ et le métal puisque le signal n’est pas

assez net pour connaître le nombre de pores et le nombre de peptide par pore (qui semble de

toute façon hétérogène d’après la littérature). De plus même après saturation en métal, il reste

une conductivité résiduelle (10 à 30 % de la conductivité maximale avant titrage)

probablement due à une fermeture incomplète de l’ensemble des pores. On ne peut cependant

pas exclure qu’une fraction des pores aient une structure telle que le zinc ne puisse pas les

fermer. Les constantes de dissociation ont été calculées graphiquement par lecture de la

concentration de zinc totale (quasi identique à la concentration en zinc libre dans l’hypothèse

d’une stœchiométrie 1 :1) à la moitié de la diminution maximale de conductivité (k1/2). Les

valeurs obtenues pour les constantes de dissociation sont donc assez approximatives et

doivent être considérées comme des ordres de grandeur.


201

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205

Conclusion

et

perspectives

206

Conclusion et perspectives

207


Ces travaux nous ont principalement permis de caractériser l’interaction entre le peptide Aβ,

impliqué dans le maladie d’Alzheimer, et le zinc(II), retrouvé en grande quantité dans les

plaques amyloïdes.

Dans un premier temps, l’affinité du zinc pour le peptide a été étudiée par calorimétrie de

titrage isotherme et réactions de compétition avec différents chélateurs. Il en ressort que la

constante de dissociation apparente du complexe ZnII-Aβ se situe dans le bas micromolaire,

quelle que soit sa longueur (16, 28, 40 ou 42 acides aminés), mais surtout quel que soit l’état

d’agrégation. Il pourrait d’ailleurs être intéressant de vérifier ce résultat avec des plaques

amyloïdes formées in vivo puis isolées. D’après cette étude in vitro, il semble qu’une thérapie

par chélation des métaux (principalement le zinc et le cuivre) visant préférentiellement les

espèces solubles à priori plus toxiques, soit difficile à mettre en œuvre, le risque étant de

solubiliser les plaques amyloïdes (moins toxiques d’après la littérature). Cependant, le

mécanisme d’action des chélateurs de métaux n’étant pas encore élucidé (possible activation

des voies de dégradation d’Aβ), cet inconvénient n’entravera pas forcément les progrès dans

cette stratégie thérapeutique. Des études in vivo seront finalement nécessaires pour définir le

bénéfice des chélateurs de métaux dans la maladie d’Alzheimer.

L’utilisation de différents tampons d’enthalpies d’ionisation bien distinctes avec la

calorimétrie de titrage isotherme a également permis la détermination du nombre de protons

échangés lors de la fixation du zinc(II) sur Aβ à pH 7,4. Ainsi, dans l’hypothèse qui semble la

plus probable, où le premier acide aminé serait le quatrième ligand du zinc (avec les histidines

6, 13 et 14), ce résultat privilégie le groupement carboxylate de l’aspartate 1 par rapport au N-

terminal. Il serait intéressant de faire des expériences similaires à des pH légèrement acides ou

basiques, en effet le site de fixation du cuivre(II), apparemment similaire à celui du zinc(II), a

été rapporté être dépendant du pH, il en est donc peut-être de même pour le zinc(II).

Ensuite, après avoir remarqué que le zinc(II) accélère fortement l’agrégation d’Aβ, nous

avons voulu vérifier l’explication qui semblait la plus plausible pour expliquer ce phénomène :

la formation de dimère par l’intermédiaire de métal pontant. Cependant, aucun oligomère

(jusqu’à 75 kDa) n’a pu être détecté par chromatographie d’exclusion stérique et RMN de

diffusion, au contraire du monomère ZnII-Aβ qui est apparu assez stable. Il semble donc que

l’agrégation d’Aβ induite par le zinc passe par un changement de conformation qui favorise


208

l’agrégation par contact entre peptides.

L’agrégation de ZnII-Aβ a donc finalement été quantifiée (par turbidimétrie et test BCA) et

suivie par dichroïsme circulaire en présence de différentes concentrations de TFE qui favorise

les structures en hélice alpha. Cette étude a permis d’établir un modèle de l’agrégation d’Aβ.

Ainsi , dans l’hypothèse où le mécanisme serait le même en absence et en présence de métal,

une première étape, favorisée par la présence de 10-20 % de TFE, constituerait en une

structuration partielle en hélice alpha, puis dans une deuxième étape favorisée par la liaison au

zinc(II), l’hélice alpha serait déstabilisée vers une conformation principalement feuillet bêta.

Il serait cependant intéressant de vérifier la concordance entre agrégation en présence et en

absence de métaux en caractérisant les agrégats de (ZnII-Aβ) en microscopie électronique et

en RMN du solide.

Un mécanisme de toxicité potentielle a également était étudié. En effet, au vu des précédents

résultats, rien n’indique clairement que l’interaction du zinc avec Aβ est source de toxicité, au

contraire, ce métal qui n’a pas d’activité redox, ne semble pas favoriser les oligomères

solubles, les plus toxiques (des études in vivo impliquant des agrégats formés en présence de

zinc seraient cependant nécessaires pour confirmer cette hypothèse). Le peptide Aβ a donc

ainsi été inséré dans des bicouches lipidiques modèles dont on a suivi la conductance. Le zinc

s’est alors révélé protecteur vis-à-vis de cette forme de toxicité, puisqu’il permet, en bouchant

partiellement les pores d’Aβ, de diminuer significativement la conductance de la membrane.

Il serait cependant intéressant d’utiliser des bicouches lipidiques de composition plus proche

des membranes biologiques afin de mieux estimer la toxicité d’Aβ.

Enfin, une hypothèse sur la provenance du zinc retrouvé dans les plaques amyloïdes a été

explorée. En effet, l’affinité du zinc pour Aβ étant relativement faible par rapport aux

principales protéines à zinc présentes dans le cerveau, le stress oxydant pourrait favoriser le

transfert du zinc vers Aβ par l’intermédiaire de la formation de ponts disulfures dans la

métallothionéine-3 qui libèrerait ainsi une partie de son zinc. Les premiers résultats obtenus

dans cette étude semblent confirmer cette hypothèse, cependant les expériences doivent être

répétées. Ce modèle in vitro a toutefois des limites, ainsi il n’est pas certain que la

concentration physiologique en stress oxydant soit suffisante, d’autant que la cinétique avec le

peroxyde d’hydrogène est relativement lente. Ainsi l’utilisation d’autres modèles de stress

oxydant est à envisager afin de comparer les vitesses de réaction. L’influence de réducteurs

comme le glutathion ou la vitamine C serait également intéressant à étudier.

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Annexes

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Enfin, pour conclure brièvement ce long manuscrit, je voudrais remercier très

chaleureusement l’ensemble des personnes avec qui j’ai eu le plaisir et la

chance de travailler, en France et à l’étranger, durant ces trois années de thèse.

Last but not least, I would like to express my most sincere acknowledgements to

all people whom I had the pleasure and opportunity to work with during this last

three years.

236

Ce manuscrit est dédicacé : Aux chercheurs d’aiguilles. Aux géniaux ingénieurs. Aux experts techniciens. Aux Fantastiques sponsors.

Ce manuscrit n’est pas dédicacé : Aux faxeurs ineptes. Aux pauseurs grincheux. Aux formations venteuses.

D’une façon générale, ce manuscrit est dédicacé au monde de la recherche avec lequel mes rapports furent aussi divers qu’enrichissants.

237

Interaction between zinc(II) and the amyloid beta peptide in Alzheimer’s disease

Abstract :

Alzheimer’s disease (AD) is a neurodegenerative disorder. Brain regions involved in memory

and learning are diminished in size due to death of neurons and synaptic degeneration. The

morphological hallmarks of AD are the extracellular amyloid plaques and the intracellular

neurofibrillary tangles. The formers are mainly constituted by the amyloid beta peptide (Aβ),

a cleaving product of a membrane protein called amyloid-precursor-protein (APP). According

to the widely held amyloid cascade hypothesis, increased Aβ production and accumulation

leads to its aggregation. The generated oligomers are supposed to provoke neuronal

dysfunction which will later leads to dementia. A large body of evidence indicates that the

essential metal ions zinc, copper and iron are involved in Alzheimer’s disease (AD): they are

found in the amyloid plaques at high concentrations (~mM) and metal-binding to Aβ and APP

has been demonstrated. In vitro and in vivo studies showed that these metal ions influence the

amyloid cascade and thus the neurotoxicity. This thesis deals with the bioinorganic aspects of

the zinc-binding to Aβ. Particular attention has been paid on the binding affinity and the

influence of metal-binding on protein structure and aggregation. The question of whether

metallothionein could provide Aβ with zinc ions has also been investigated. The toxicity

caused by amyloid pores and the influence of metals in this respect is also discussed.

Key words : Alzheimer, amyloid beta peptide, aggregation, zinc, bioinorganic chemistry,

calorimetry, metallothionein.

UNIVERSITE TOULOUSE III - PAUL SABATIER

Thèse d’Université, école doctorale de chimie, spécialité Chimie-Biologie-Santé

Soutenue le 19 novembre 2007 à Toulouse

Christine TALMARD

Directeur de thèse : Prof. Peter FALLER

Interaction entre le zinc(II) et le peptide amyloïde bêta lié à la maladie d’Alzheimer

Résumé : La nature dégénérative de la maladie d’Alzheimer se traduit par des lésions

histopathologiques intra- et extracellulaires, au niveau des neurones. Ces dernières, les

plaques amyloïdes, résultent de l’agrégation en fibres amyloïdes du peptide amyloïde bêta.

L’hypothèse communément admise de la cascade amyloïde place même l’oligomérisation de

ce peptide à l’origine de la maladie. Dans ce contexte, des expériences in vivo et in vitro

attestent d’une influence des ions métalliques (zinc, cuivre et fer principalement) sur

l’agrégation du peptide et sa toxicité. Nous nous sommes donc attaché à étudier l’équilibre de

fixation de l’ion zinc(II) sur le peptide amyloïde bêta (détermination des constantes

thermodynamiques) et l’influence de l’ion métallique sur l’agrégation et la structure

secondaire du peptide. La question de la toxicité causée par la formation de pores dans les

membranes cellulaires, ainsi qu’une hypothèse concernant la provenance du zinc ont

également été abordées.

Mots clés : Alzheimer, peptide amyloïde bêta, agrégation, zinc, chimie bioinorganique,

calorimétrie, métallothionéine.

Laboratoire de Chimie de Coordination, 205 route de Narbonne 31077 Toulouse, France

Interaction between zinc(II) and the amyloid beta peptide in Alzheimer’s disease

Abstract : Alzheimer’s disease (AD) is a neurodegenerative disorder. Brain regions involved

in memory and learning are diminished in size due to death of neurons and synaptic

degeneration. The morphological hallmarks of AD are the extracellular amyloid plaques and

the intracellular neurofibrillary tangles. The formers are mainly constituted by the amyloid

beta peptide (Aβ), a cleaving product of a membrane protein called amyloid-precursor-protein

(APP). According to the widely held amyloid cascade hypothesis, increased Aβ production

and accumulation leads to its aggregation. The generated oligomers are supposed to provoke

neuronal dysfunction which will later leads to dementia. A large body of evidence indicates

that the essential metal ions zinc, copper and iron are involved in Alzheimer’s disease (AD):

they are found in the amyloid plaques at high concentrations (~mM) and metal-binding to Aβ

and APP has been demonstrated. In vitro and in vivo studies showed that these metal ions

influence the amyloid cascade and thus the neurotoxicity. This thesis deals with the

bioinorganic aspects of the zinc-binding to Aβ. Particular attention has been paid on the

binding affinity and the influence of metal-binding on protein structure and aggregation. The

question of whether metallothionein could provide Aβ with zinc ions has also been

investigated. The toxicity caused by amyloid pores and the influence of metals in this respect

is also discussed.

Key words : Alzheimer, amyloid beta peptide, aggregation, zinc, bioinorganic chemistry,

calorimetry, metallothionein.

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Interaction entre le zinc(II) et le peptide amyloïde bêta