Meilleure compréhension de la machine biologique de photoproduction d’H2

- Fonctionnement

- Rôle dans le métabolisme global

- Régulation (lumière, SO4, NO3, CO2)

Photoproduction d’H2

Identification de verrous biologiques &

Elaboration de stratégies de

reprogrammation métabolique pour une

production d’H2 forte et durable

Ingénierie de la cyanobactérie modèle Synechocystis, pour une meilleure

photoproduction d'hydrogène (EngineeringH2Cyano) ANR BioE09-13

Partenaires: EngineeringH2Cyano et nouvelle collaboration

CEA/DSV/iBiTec-S

& CNRS/URA2096

Coordinateur & responsable partenaire 1:

F. CHAUVAT

Collaborateurs

C. CASSIER-CHAUVAT

H. BOTTIN

T. JITTAWUTTIPOKA (Postdoc ANR)

C. LEPLAT (Postdoc ANR)

J. DUTHEIL (Thèse CEA)

M. ORTEGA-RAMOS (Thèse ANR)

S. FARCI

CNRS/UPR9036/BIP

Responsable scientifique partenaire 2:

M. ROUSSET

Collaborateurs

M. BRUGNA

A. KPEBE

S. LE LAZ (Postdoc ANR)

Nouvelle collaboration: CEA/DSV/iBEB

Responsable : Laurent COURNAC

Collaborateurs

P. RICHAUD

G. GUEDENEY

Les cyanobactéries (“algues” bleues):

anciennes, robustes, fort impact sur la biosphère

- Organismes photosynthétiques les plus abondants de la planète Colonisent la plupart des écosystèmes aquatiques et terrestres

(mers, océans, rivières, lacs, eaux saumâtres, sols même désertiques….)

- A l'origine de l’atmosphère oxygénique de la planète qu’elles continuent à renouveler 30 à 40% de la production d'O2 par les océans

Fixation annuelle de 25 giga tonnes de CO2 (puit de carbone)

- Composante majeure du phytoplancton : base de la chaîne alimentaire

-Organismes pionniers

Potentiel biotechnologique des cyanobactéries

Fermes à cyanobactéries

Alimentation animale & humaine

Cosmétiques

Source de produits thérapeutiques

- Anticancer, Antiviraux (anti HIV)

- Vitamines & antioxidants*

Bioremédiation

Biofuels (our projects*)

H2*, Ethanol*, Ethylène*, Butanol & bio-diesels

Bio-plastiques (PHA, PHB)

Robustes & Compétitives

Pas besoins de

- terres cultivables

- d’engrais

- de pesticides, d’herbicides

- d’eau douce

Notre approche: Biologie intégrative

Génomique fonctionnelle, Mesures dégagement H2, Dosage enzymatiques,

Transcriptome, Métabolome, Bioinformatique, etc..

WT M

cadmium et h2o2

...

...

...

Selected Gene Tree: cd et h2o2 sur gn modulÈsSelected Experiment Tree: cadmium et h2o2

Colored by: N/AGene List: modulÈ 1/4 h2o2 and modulÈ 1/9 cadmium (455)

RT: 0.00 - 29.99 SM: 7G

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rela

tive

Abu

ndan

ce

5.34

4.23

3.01

12.04

12.1711.89 12.30

17.6714.7914.05

11.45 15.27

19.95 27.2918.03 26.41 28.9220.19 24.9524.2522.22

10.83

2.789.75

5.880.32 6.47 9.650.76

6.94 9.41

NL: 9.06E3

Base Peak m/z= 87.00790-87.00964 F: FTMS - p ESI Full ms [50.00-1000.00] MS 080911_HSF5_09

Synechocystis PCC6803: la cyanobactérie modèle utilisée dans notre projet

Unicellulaire, euryhaline (pousse bien en eau de mer)

Photosynthèse oxygénique

Productions naturelles: anti-oxydants, alkanes, PHB, EPS, etc…

Propriétés électrogéniques

Hydrogénase bidirectionnelle (réversiblement inactivée par O2)

Petit génome séquencé facilement manipulable grâce à nos outils

(50 publications voir http://www.researcherid.com/rid/E-7394-2010 )

1.1.1 SEM : 3¸me

essai

Figure 1 Figure 2 Images SEM de Synechocystis, fixˇe avec 2.27% de glutaraldˇhyde et 0.15% de bleu

alcian, et sˇchˇe par sˇchage supercritique CO2.

HoxH

HoxY

HoxF

HoxE HoxU

H2 NADPH

NADP+ 2H+

+ 2 e-

HoxH

HoxY HoxF

HoxE HoxU

Active hydrogenase

Maturation & assembly

Les verrous biologiques I:

La machine de production d’H2 est complexe, peu-abondante et fragile

O2

?

Inactive

forme

Ketoglutarate

+ glutamine

Fed

1e-

GltS

Sir FTR

Trx ox

2e-

Trx red

2e-

SO32- S2-

6e-

NarB

NH4+-

NirA

NO3-

NO2-

6e-

2e-

2 glutamates

NADP+ NADPH

Bidirectional hydrogenase

H2 NADPH

NADP+ 2H+ + 2 e-

PQ

2H2O O2 + 4e- + 4H+

2e-

Cytb6/f PSII PSI

SDH

NDH-2

CO2 assimilation

NDH-1 NADP+

NADH NAD+

h

Flv

Carbohydrates

FNR

Verrous biologiques II: la machine de production d’H2 est

complexe, peu-abondante, fragile & mal alimentée en électrons

?

Analyses transcriptomiques

cadmium et h2o2

...

...

...

Selected Gene Tree: cd et h2o2 sur gn modulÈsSelected Experiment Tree: cadmium et h2o2

Colored by: N/AGene List: modulÈ 1/4 h2o2 and modulÈ 1/9 cadmium (455)

WT OM

Construction et analyse de mutants surproduisants les protéines Hox (et Hyp),

cultivés dans diverses conditions (lumière, température, minéraux, etc)

Mesures de production d’H2 Analyses

métabolomiques

Amélioration des mutants pour

optimiser la photoproduction d’hydrogène par voie biologique

Intégration des données

Identification de verrous biologiques

Stratégie du projet EngineeringH2Cyano

lexA abrB1 abrB2

hox transcription regulators

sll1222 ssl2420 sll1225

hoxE hoxF hoxU hoxY hoxH

Genes encoding the hydrogenase enzyme complex

hypF hypA1 hypB1 hypC hypD hypE

Genes encoding Hox assembly proteins

Cloning in our expression vectors

Replacement of the weak natural hox promoter

by a strong, constitutive or regulated promoter

Sequential cloning in

our replicative expression vectors

Subtask 1

Tache 1: Construction de mutants “surproducteurs” de la machine de production d’H2

Objectif: Augmentation de l’abondance de la machine de production d’H2

Subtask 3b Subtask 2

Genomic organization of the genes to be over-expressed

Subtask 3a

Résultats récents I: Identification et/ou manipulation de régulateurs

de l’opéron hox pour augmenter la production d’H2 hox

E

Travaux en cours: caractérisation du réseau

de régulation de hox

2) L’augmentation de production d’H2 dans le mutant dépourvu de R2 (x 2-3)

est renforcée ( x 2-3) par la surproduction de l’activateur A1

1) Caractérisation d'un nouveau régulateur (le répresseur “R2”) de la production d’H2

(Dutheil et al.

soumission ds 15 j)

Résultats récents II: construction d’un mutant surproduisant l’hydrogénase en

fonction de la température de croissance : remplacement du faible promoteur naturel

de l’opéron hox par notre promoteur fort et thermo-régulé

Notre système de thermo-contrôle permet:

- forte expression à 39°C

- expression modérée à 33°C-34°C

- pas d’expression à T°≤ 30°C

Synechocystis chromosome hox operon

KmR

TT cI857 pR (+RBS)

Thermoregulation

cassette

Confirmation de la thermo-régulation des gènes hox de notre mutant

hox E

hox U

hox Y

hox F

sll1222

ss2420

sll1225

hox H

Quantitative PCR of the hox genes in WT and mutant at 30°C and 39°C

Semi -quantitative PCR of the hox genes in WT and mutant at 39°C

WT TM WT TM WT TM WT TM WT TM WT TM WT TM WT TM

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

HoxE HoxF sll1222 HoxU HoxY ssl2420 sll1225 HoxH

Rel

ativ

e R

NA

(fo

ld

chan

ge)

WT 30°

WT 39°

TM 30°

TM 39°

ARNm (hoxEFUYH) : x60

Confirmation de la thermo-régulation de la production d’H2 de notre mutant

30°C 39°C

WT Mutant T° régulé Déletion hox

Expression gènes hox x 60

Activité Hox x 4

x ≥ 100

x 12

Pro

du

ctio

n H

2 e

n U

nit

és a

rbit

rair

e

L’augmentation de production d’H2 est moins importante que celle de l’expression des gènes

En plus de l’expression des gènes hox, il y a d’autres verrous biologiques à lever

Transcriptome analyses

and integrative representation of the omics data

Tache 2: Analyses des réponses globales à une meilleure production d’H2

Objectifs: Caracterisation de l’adaptation à une meilleure production d’H2

Conception de stratégies performantes pour la surproduction d’H2

cadmium et h2o2

...

...

...

Selected Gene Tree: cd et h2o2 sur gn modulÈsSelected Experiment Tree: cadmium et h2o2

Colored by: N/AGene List: modulÈ 1/4 h2o2 and modulÈ 1/9 cadmium (455)

WT OM

WT and hydrogenase overproducing mutants

(constructed in task1) growing in various conditions

In silico analysis of data

Phenotypic analysis including

H2 production assay

Résultats récents III: Développement de nouveaux outils de transcriptomique

permettant l’analyse et visualisation des réponses de la totalité des gènes

sll1222 ssl2420 sll1225

hoxE hoxF hoxU hoxY hoxH

hox encoding genes

Cloning into the BACTH system

Tache 3: Recherche d’interaction Hox/Ferrédoxine

Objectif: Identification de nouveaux acteurs de la production d’H2

Résultats récents IV: les Fed 4 & 5 intéragissent avec HoxH & HoxY

fed1 fed2 fed3 fed4 fed5 fed6 fed7 fed8 fed9

ferredoxin encoding genes

lexA abrB1 abrB2

hox transcriptional activators

sll1222 ssl2420 sll1225

hoxE hoxF hoxU hoxY hoxH Genes encoding the Hox hydrogenase complex

hypF hypA1 hypB1 hypC hypD hypE

Genes encoding Hox maturation proteins

Cloning in our expression vectors

Replacement of the weak natural hox promoter

by a strong, constitutive or regulated promoter

Sequential cloning in our

expression vectors

Subtask 1

Tache 4

Recherche de mutations permettant d’augmenter la tolérance à l’O2 de l’hydrogénase

Objectifs: Augmenter la tolerance à l’O2 et surproduire ces hydrogénases

Subtask 3b Subtask 2

Genomic organization of the genes to be over-expressed

Improvement of the Hox enzyme tolerance to oxygen

Subtask 3a

Task 4

Shewanella oneidensis

AS-52 : DhydADhyaB

Construction et sélection à haut débit de mutations augmentant la tolérance à

l’O2 de l’H2ase modèle de Shewanella oneidensis MR-1

Evolution dirigée

hydrogénases

tolérantes à l’oxygène

Transposition à

Synechocystis PCC6803

Criblage

http

://foru

m.n

atio

nsta

tes.n

et

[Ni-Fe] H2ase

Souches poussant sur H2

en présence d’O2

Purification et

caractérisation

Identification

des mutations

Les mutants de Shewanella seront

sélectionnés sur leur capacité à croitre sur

H2 et décolorer l’amaranthe, en présence

de O2 qui normalement inhibe H2ase

Am

ara

nte

En présence d’O2

H2

lm

ax 5

20

nm

Accepteur d’électrons

Amines aromatiques incolores

(H

on

g e

t al.

,20

07

)

Chaîne de transport d’électrons

2H++2e-

Donneur d’électrons

e- e-

Azoréduction H2-dépendante de l’amarante par S.oneidensis MR-1

HYDROGENASES

Bilan à mi-parcour, et échéancier prévisible

PUBLICATIONS

1) Développement d’un protocole de métabolomique (Narainsamy et al. 2011 Metabolomics) pour

analyser la reprogrammation métabolique nécessaire à l’augmentation de la photoproduction

d’H2

2) Caractérisation d'un nouveau régulateur de la production d’H2 (Dutheil et al. soumission mi-

février 2012)

3) Développement de nouveaux outils de transcriptomique pour analyser la reprogrammation

génétique nécessaire à l’augmentation de la photoproduction d’H2 (prévue en 2012)

4) Construction et analyses globales d’un mutant de surproduction thermorégulée de

l’hydrogénase (Hox) (Ortega-Ramos et al. 2012)

5) Identification et analyse de nouveaux partenaires redox de l’hydrogénase (fin 2012)

6) Construction et analyses globales d’un mutant mutant de surproduction thermorégulée de

l’hydrogénase “complète” (Hox+Hyp) (Ortega-Ramos et al. 2013)

7) Identification de mutations augmentant la tolérance de l’hydrogénase à l’O2 (2012-13)

8) Caractérisation du réseau des régulateurs transcriptionnels controlant la production d’H2 (2013)

MASTER 2 M. Ortega-Ramos (PARIS XI, juillet 2010) Construction d’un mutant de

surproduction thermorégulée de l’hydrogénase (Hox)

THÈSES

1) J. Dutheil (CEA, soutenance décembre 2012)

2) M. Ortega-Ramos (ANR-BioE09, démarrée en Nov 2010, soutenance décembre 2013)