Universidad Nacional De TrujilloFACULTAD DE MEDICINA

ESCUELA PROFESIONAL DE ESTOMATOLOGÍA

SALIVA

CURSO: Bioquímica

DOCENTE: REYES BELTRAN, MARÍA

ALUMNOS: Chacón Cruz María Isabel

Chávez Garrido Laura Sofía

Díaz Soto Dulce Daniela

Díaz Vega Laura Isabel

Trujillo – Perú2013

I. INTRODUCCION

Los organismos vivos pueden obtener y gastar la energía más rápidamente debido a la presencia de catalizadores biológicos llamados enzimas. Como sucede con los catalizadores inorgánicos, las enzimas modifican la velocidad de una reacción sin alterar el equilibrio final y solo se requieren pequeñas cantidades para efectuar la concentración de un gran número de moléculas de sustrato.

El alfa-amilasa es una enzima proteica que se encuentra en la saliva humana y cataliza la degradación del almidón, que es un polisacárido de reserva vegetal. El almidón está formado por dos tipos de moléculas: la amilasa y la amilo pectina, ambos polisacáridos de glucosa. La amilasa se conforma por cadenas lineales de glucosas unidas por enlaces a- C1-C4, mientras que la amilo pectina tiene, además de estos últimos enlaces, uniones C1 con C6, formando cadenas ramificadas. La a-amilasa rompe uniones C1-C4, tanto en la amilasa como en la amilo pectina, dejando dextrinas lineales y ramificadas (oligosacáridos) como productos.

Si bien es cierto existen evidencias de que la enzima poli-ADP ribosa polimerasa-1 (PARP) Desempeña un papel muy importante en la modulación de la expresión génica durante el desarrollo y en respuesta a señales celulares especificas, ejerciendo su acción a diferentes niveles. PARP-1 pertenece a una familia de enzimas (PARP) que usando NAD+ como sustrato, sintetizan y transfieren homopolímeros de ADH-ribosa en residuos de acido glutámico en proteínas aceptoras principalmente involucradas en el experimento a realizar como la actividad enzimática.

Para poder mostrar la actividad enzimática se debe tener presente fundamentalmente que la acción catalítica de las enzimas es de carácter especifico; o sea, cada reacción química debe ser catalizada por una determinada enzima. El reactante o sustancia química que reacciona para dar un producto en un sistema enzimático se llama SUATRATO, habría entonces tantos sistemas enzimáticos como sustratos reaccionantes existen en un organismo vivo.

Debido a que solo se necesitan muy bajas concentraciones de enzima para catalizar una reacción dada, solo muy pocas enzimas pueden medirse directamente.

¿Que es una enzima?

Las enzimas son proteínas que ayudan a que las reacciones químicas ocurran con mayor rapidez. Sin enzimas nuestros cuerpos se detendrían en seco.

En este experimento, las enzimas que estamos utilizando provienen del ablandador de carnes y cortan las proteínas tal como un par de tijeras.

El ADN en el núcleo de la célula está moldeado, doblado y protegido por proteínas. El ablandador de carne corta las proteínas separándolas del ADN.

PRÁCTICA N°1

¿Qué es el sustrato?

El sustrato es cualquier sustancia orgánica o inorgánica sobre las que actúan las enzimas produciendo su modificación en productos finales de la reacción. Cada enzima actúa sobre un sustrato en particular, ya que una de las características de las enzimas es su ESPECIFICIDAD DE SUSTRATO. Por ej., las enzimas proteasas actúan despoblando a las proteínas en cadenas polipeptídicas y luego en Aminoácidos sencillos y simples, las proteasas se especializan para desmoronar químicamente a las proteínas y no pueden catalizar la conversión de polisacáridos en monómeros de glucosa.

En general, la actividad de cualquier sistema enzimático puede ser demostrada de dos maneras:

1.-Verificado el sustrato no transformado (SUSTRATO RESIDUAL) después de un tiempo determinado de incubación en condiciones de PH y temperatura debidamente adecuada para poder llevarse a cabo las reacciones.

2.- Verificando los productos liberados después de un tiempo de incubación que este en óptimas condiciones específicas de tanto de pH como de la temperatura para que los procesos se lleven con mayor eficacia y poder obtener sustancias a partir de las reacciones.

FINALIDAD:

La finalidad de la practica es que tiene que llevarse a acabo procesos experimentales en la práctica de laboratorio es para determinar la actividad enzimática, utilizando a la enzima AMILASA SALIVAL que es una enzima que tiene la capacidad de producir degradación del almidón en maltosa que es un (disacárido reductor) y algo de glucosa como ejemplo de un sistema enzimático.

También se tiene que tener en cuenta lo factores que están involucrados en la determinación de la actividad enzimática:

FACTORES QUE AFECTAN LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS

Fuerza osmótica. La mayoría de las enzimas no pueden tolerar concentraciones de sal extremadamente altas. Los iones interfieren con los débiles enlaces iónicos de las proteínas.

Las enzimas típicas son activas en concentraciones salinas de 1 a 500 mM. Existen excepciones como las enzimas de las algas y bacterias halófilas.

Temperatura. Todas las enzimas trabajan en un rango de temperaturas específicas del organismo al que pertenecen. Los aumentos de temperatura generalmente provocan un incremento de la velocidad de reacción. Esto se debe a alteraciones de la estructura de la proteína debidas a la interrupción de uniones iónicas que resultan en la estabilización de la estructura tridimensional de la enzima. La temperatura óptima de las enzimas humanas se encuentra generalmente entre los 35 y los 40 °C; la temperatura media del organismo del ser humano es 37 °C. Así, las enzimas humanas comienzan a desnaturalizarse rápidamente a partir de los 40 °C. En cambio, las enzimas de las arqueas termófilas, que se encuentran en manantiales calientes, son estables hasta a 100 °C. Sin embargo, la idea de de una velocidad "óptima" para una reacción enzimática es engañosa, ya que la velocidad observada a cualquier temperatura es el producto de dos velocidades, la velocidad de reacción y la velocidad de desnaturalización. Si se usase un ensayo para medir esta segunda actividad por segundo, la velocidad sería alta a altas temperaturas, y usando un ensayo para cuantificar la formación de producto ésta sería baja a esas temperaturas.

pH. La mayoría de las enzimas son sensibles al pH y tiene un rango específico en el que se detecta actividad; todas tienen un pH óptimo. El pH puede detener la actividad enzimática al provocar la desnaturalización de la estructura proteica rompiendo enlaces iónicos y puentes de hidrógeno. La mayoría de las enzimas funcionan entre un pH 6 y 8; sin embargo, la pepsina estomacal tiene un pH óptimo de 2 y la tripsina de 8.

Saturación del sustrato. Aumentando la concentración de sustrato aumenta la velocidad de la reacción o actividad enzimática. Sin embargo, el límite de saturación limita la velocidad. Una enzima está saturada cuando los sitios activos de todas las moléculas están ocupados la mayoría del tiempo. A partir del punto de saturación la reacción no puede acelerarse mediante adición de sustrato, sea cual sea la cantidad añadida. En un gráfico la velocidad de reacción habría alcanzado una meseta.

I. MATERIALES Y REACTIVOS

De laboratorio tenemos:

- Tubos de ensayo - Pipetas graduadas de 1 ml, 5ml y 10ml.

- Gradilla - Frasco goteros- Pinzas para tubos de ensayo

Con respecto a los materiales que se van a emplear como reactivos tenemos:

- Solución de almidón con un PH 6.6, al 1%.- Cloruro de sodio solución al 0.1M- Enzima al 1% (AMILASA SALIVAL)- Acido clorhídrico 0.05N- Solución yodada - Reactivo folin Wu : A) Solución Cúprica alcalina

B) Solución fosfomolíbdica.

Gradilla

(Pipetas graduadas de 1ml, 5ml y 10ml)

III. PROCEDIMIENTO:

1. Primero se arma el siguiente sistema :

1.1. Preparar los tubos I y II con cada componente indicado.

1.2. Colocar los tubos al baño de agua a 37°C por 5 minutos.

1.3. Agregar 1 ml. de enzima Amilasa al 1% al tubo II.

1.4. Volverlos a colocar al baño de agua a 37°C durante 10 minutos.

Explicación: A simple vista el contenido del tubo I y II es idéntico, lo cual no es correcto, porque en el tubo II ocurrió la reacción de la enzima Amilasa con Almidón (enzima-sustrato) pero no es visible debido a que no usamos un marcador.

TUBOS

COMPONENTES I II

Solución de almidón 1% pH 6.6 5 ml. 5 ml.

Solución de cloruro de sodio 0.1M 1 ml. 1 ml.

Agua destilada 4 ml. 3 ml.

2. Luego:

2.1. Preparar los tubos III y IV con cada componente indicado.

2.2. De cada uno de los tubos de incubación transferir 0.5 ml. de su correspondientes del cuadro siguiente (contenido del tubo I al tubo III y el contenido del tubo II al tubo IV), inmediatamente de cumplidos los 10 minutos.

2.3. Mezclar, observar y anotar los resultados de cada tubo de acuerdo a la intensidad del color resultante.

Explicación: El cambio de color del tubo III de incoloro a azul-violáceo se debe a que el indicador usado (solución yodada) reacciono con la presencia del almidón (sustrato), en cambio en el tubo IV el color amarillo claro se debió a que el indicador no encontró sustrato (porque se había convertido en productos) sobre el cual actuar, manteniendo el color característico de la solución yodada.

TUBOS

COMPONENTES III IV

Ácido clorhídrico 0.05 N 5 ml. 5 ml.

De los tubos I y II (respectivamente):

Etapa 10.5 ml. 0.5 ml.

Solución yodada 0.5 ml. 0.5 ml.

3. Por último:

3.1. Preparar los tubos V y VI con cada componente indicado (de los tubos I y II de la etapa 1 y solución cúprica alcalina).

3.2. Poner los tubos a hervir en baño maría durante 8 minutos.

3.3. Luego ponerlos a enfriar.

TUBOS

COMPONENTES V VIDe los tubos I y II (respectivamente):

Etapa 11ml. 1ml.

Solución Cúprica alcalina 1ml. 1ml.

Hervir 8 minutos

Enfriar

Solución Fosfomolíbdica 1ml. 1ml.

Agua destilada 2ml. 2ml.

3.4. Por último agregar la solución fosfomolíbdica y agua destilada.

Explicación: En el tubo V se obtuvo un color celeste, distinto al tubo VI en el cual se obtuvo un color naranja, esto se debió a que la solución cúprica reacciono con los productos de la reacción enzimática que son azucares reductores como Glucosa, Maltosa, etc., los cuales actúan sobre el cobre, reduciéndolo.

Al agregar la solución fosfomolíbdica ocurren diferentes cosas en los tubos. En el tubo V no se observo ningún cambio en el color debido a que no hay ningún tipo de productos, en cambio en el

tubo VI paso del color naranja a un azul-violáceo debido a la reacción reductora de los productos sobre el molibdeno (azul de molibdeno).

IV. CONCLUSIONES

La presente práctica de laboratorio nos permitió determinar que existen reactivos llamados indicadores capaces de demostrarnos la actividad enzimática a partir de las variaciones del color que mostraban los tubos después de cada reacción.

La enzima Amilasa salival tiene la capacidad para degradar el Almidón en azúcares más simples y con carácter reductor como la Glucosa, Maltosa, etc.

V. CUESTIONARIO

1. ¿Qué métodos conoces para determinar la actividad enzimática?

Para determinar la actividad enzimática se debe tener en cuenta fundamentalmente que la acción catalítica de las enzimas es de carácter especifico como es en cada reacción debe ser catalizada por una determinada enzima. El reactante o sustancia o sustancia química que reacciona para dar un producto en un sistema enzimático se llama sustrato, habría entonces tener sistemas enzimáticos como sustratos reaccionantes existen un organismo vivo.

En esta etapa se puede determinar de dos maneras:

a) Verificando el sustrato el sustrato no transformado (sustrato residual) después de un tiempo determinado de incubación en condiciones especificas de pH y temperatura.

b) Verificando sus productos liberados después de un tiempo determinado de incubación en condiciones especificas de pH y temperatura.

2. ¿Cómo se puede objetivar la presencia del sustrato residual?

En los ensayos de aspecto fotométrico puede seguirse el curso de una reacción observando como cambia la luz absorbida por la solución en la que se esta dando la reacción, para poder utilizar un ensayo de este tipo debe haber entre los sustratos a los productos algunos que absorba luz a una longitud de onda determinado y que sea de esta forma, se puede observar el aumento o la disminución de la observación a dicha longitud de onda. Cuando la luz absorbida se muestra en el espacio visible es posible observar un cambio en el color de la muestra y entonces hablaríamos del método calorímetro.

3. ¿Cómo demostrar si se ha producido o no la reacción enzimática en el experimento realizado?

Todos los ensayos enzimáticos miden el sustrato consumido o el producto generado en la reacción durante un tiempo.

Existe un gran número de métodos diferentes para medir la concentración de sustratos y productos, y que muchas enzimas pueden ser ensayadas de diferentes maneras habitualmente en bioquímica se estudian las reacciones catalizadas por enzimas.

Tenemos 4 tipos de experimentos:

a) MEDIDA DE LA VELOSIDAD INICIAL Cuando una enzima se mezcla con un gran parte de sustrato, el complejo intermedio E-S se genera en una rápida fase inicial transitoria. Después la reacción a una cinética constante durante la cual el complejo E-S se mantiene prácticamente en cantidades invertidas en el tiempo y la detecta físicamente monitorizada.

b) MEDIDA DEL PROGRESO DE LA CURVA

Este tipo de ensayo se intenta evitar por el error matemático que se puede introducir y es cada vez menos practicado ampliamente utilizado en los primeros periodos del estudio de la cinética enzimática.

c) MEDIDA DE LA FASE TRANSITORIAEn estos experimentos se observa el compartimiento de la reacción durante la rápida fase inicial transitoria en la que el complejo molecular intermedio llega a un periodo cinético constante. Estos son los ensayos mas difíciles de realizar porque requieren uso de técnicas de mezclado y medición realmente rápidos.

d) EXPERIMENTOS EN LA FASE DE EQUILIBRIO En estos experimentos se perturba una mezcla de enzimas sustrato y productos que han alcanzado el equilibrio químico por ejemplo combinando la temperatura, la presión o el pH, el análisis de estos experimentos requiere que la reacción sea reversible.

4. ¿Cómo se puede objetivar los productos de una reacción enzimática?

Al agregar a los tubos la solución cúprica alcalina y proporcionándole un ambiente adecuado de temperatura observamos que en el TUBO I, es color celeste, mientras que en el TUBO II es color anaranjado debido a la presencia del cobre que va dar por resultado azucares reductores como la glucosa y la maltotriosa, con la que queda demostrado la acción de la enzima amilasa salival degradando al almidón.

(La observación de los colores que se forman celeste y anaranjado después de calentar a la cocina eléctrica).

(Concluyendo y demostrando los colores de los diferentes procesos realizados tomando color los tubos III, IV, V y VI)