HPLC-VARIAN

Curso Bsico de Cromatografa de Lquidos

de Alta ResolucinHPLC

(High Pressure Liquid Chromatography)(High Performance Liquid Chromatography)

(High Priced Liquid Chromatography!!!!)

BUAP-CUV Mar.,12, 2013

2Definicin.

Cromatografa es una tcnica analtica basada en laseparacin parcial o total de los componentes de unamezcla como consecuencia de su migracindiferencial en un sistema dinmico formado por unafase estacionaria y una fase mvil.

3Inyeccin Migracin Elucin

Separacin de los componentes de una muestra

Fase mvil

Proceso de separacin cromatogrfica

Fase estacionaria

Mezcla

4Etimologa

El botnico ruso Mikhail SemyonovichTswett (1872-1920), es conocido como elpadre de la cromatografa, comoresultado de sus experimentos en loscuales us columnas tipo gis chalk paraseparar pigmentos extrados de hojas.Tswet present los principios bsicos desu mtodo de separacin en 1902,despus public dos artculos en 1906en los cuales llam al mtodocromatografa.

5Clasificacin

De acuerdo a la naturaleza de la fase mvil, la cromatografa se clasifica en :

CROMATOGRAFIA DE GASES (Gas)

CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS (Lquido)

En ambos casos , la fase estacionaria se encuentra contenida en una tubera llamada COLUMNA.

6Cromatografa

LSC

Particin (Reparto)

Exclusin portamao.

Intercambio inico.

GSC

Empacada

Capilar

GLC

Empacada

Capilar

Clasificacin

7Mecanismos de Separacin

INTERCAMBIO INICO

EXCLUSIN

PARTICINXm

S ADSORCION

8Aplicaciones Generales

Forense

Agropecuaria

Alimentos y Bebidas

Ambiental y Forestal

Farmacutica

ClnicaBioquimica Polmeros

9Aplicaciones Generales

Insecticidas: carbamatos, organofosforadosFungicidas: benzimidazoles, carbamatosHerbicidas y reguladores del crecimiento: ureas, fenilureas, triazinas, glifosatos( diquat/paraquat)Aflatoxinas: B1, B2, G1, G2Micotoxinas: deoxinivalenol (DNO)Acidos Fenlicos, CarbohidratosProtenas, AminocidosAntocianinasVitaminas Liposolubles e HidrosolublesDrogas de Abuso

Antibiticos,Esteroides,Analgsicos

10

Sistema Cromatogrfico,

FASE MVIL

BOMBAINYECTOR

DETECTOR SISTEMA DE DATOS

11

Proceso de separacin cromatogrfica

12

Tiempo de Retencin

to= tiempo muerto

tr= tiempo de retencin absoluto

tr= tiempo de retencin relativo

tR

tr= tr-to

1 < k < 20

13

Factor de Capacidad

14

Resolucin (R)

Mide la separacin entre dos picos

Considera la distancia y el ancho entre dos picos adyacentes

15

Resolucin (R)

R = ___( tr2-tr1)___

1/2(W1 + W2)

tr2,tr1= tiempos de retencin de ambos picos

W1,W2= anchos de pico en la base

16

Resolucin (R)

Resolucin vs Concentra-cin.Para columnas nuevas es recomendable que R> 1.5

17

Resolucin (R)

La curva Gaussiana representa la distribucin estadistica resultante de las molculas en el espacio que ocupan

18

Resolucin (R)

Existen tres fuentes que contribuyen al ensanchamiento de bandas:

La eficiencia de la columna es una funcin de la longitudde la columna y del tamao y uniformidad de las partculas

19

Resolucin (R)

Existen tres fuentes que contribuyen al ensanchamiento de bandas:

20

Mide los efectos de ensanchamiento de pico que se presentan cuando un componente migra a travs de la columna

Eficiencia (N) [nmero de platos tericos]

21

Altura Equivalente de un Plato Terico (HETP)

La HETP relaciona la longitud de la columna con el nmero de platos tericos.

Valores de HETP ms pequeos -> columna ms eficiente.

22


La Ecuacin de Van Deemter es una expresin teorica que define la eficiencia de la columna. Es la suma de los tres elementos que contribuyen al ensanchamiento de las bandas

23


A = Difusin de EddyB = Difusin LongitudinalC = Resistencia a la transferencia de masa = Flujo de fase mvil

24

Eficiencia(N, Nmero de Platos tericos )

Nmero de veces que un componente presenta un estado de equilibrio entre las dos fases

Se expresa cuantitativamente como el Nmero de Platos Tericos

25

Selectividad,

Selectividad es la medida de que una columna pueda distinguir entre dos componentes

Se ajusta al hacer cambios de fase mvil y fase estacionaria

26

Resolucin vs Selectividad, Capacidad y Eficiencia

27

Resolucin vs Selectividad, Capacidad y Eficiencia

Rs = 0.8

N = 7000

= 2.1

.k~1

28

Teria en prctica

pico1 Tr=5.0 pico2 Tr=6.2 To=1.3 W1=0.13 W2=0.15 L=25cm

Calcular:.k, , R, N y HETP

29

Definiciones en Resumen

Eficiencia Cuan estrechos son los picos

Medida del desempeo de la columna/fase estacionaria

Factor de Capacidad Cuan bien es retenido un compuesto

Selectividad La retencin relativa de 2 compuestos

Resolucin La separacin relativa de 2 compuestos Evalua la separacin en su totalidad

30

Optimizacin de una Separacin Factor de Capacidad

Para optimizar el Factor de Capacidad:Ajustar la fuerza del solvente

Cambiar la fase estacionaria (columna)

31

Optimizacin de una SeparacinSelectividad

Para optimizar la Selectividad (separacin):Cambiar la composicin de la fase mvil

Usar aditivos en la fase mvil

Cambiar la fase estacionaria

Cambiar el pH y/o la temperatura

32

Optimizacin de una SeparacinEficiencia

Para optimizar la eficiencia de la columna :Disminuir el tamao de partculaEmplear el flujo acorde al mnimo de la grafica HETPEmplear un solvente menos viscosoIncrementar la temperatura de la columnaIncrementar la uniformidad de la partcula

33

II. Instrumentacin

2.1 Fase mvil

2.2 Sistema de bombeo

2.3 Inyectores

2.4 Columnas

2.5 Detectores

34

FASE MVIL

BOMBAINYECTOR

DETECTOR SISTEMA DE DATOS

SISTEMA CROMATOGRAFICO

35

Preparacin de la Fase Mvil Seleccionando la Fase mvil correcta La consideracin principal al elegir un sistema de

solventes es seleccionar uno que separe adecuadamente los analitos. Adems de la calidad en la separacin, la fase mvil debe:

No alterar la columna ni sus caractersticas Ser compatible con el detector Disolver la muestra Tener una viscosidad baja Permitir la recuperacin fcil de la muestra, si es

necesario. Ser de pureza elevada y no txico Ser comercialmente disponible a un precio razonable

2.1 Fase Mvil - Caracteristicas

36

A) FILTRACIN

MEMBRANAS

Material

Tamao de Poro

2.1 Fase Mvil - Preparacin

37

B) DESGASIFICACIN

Gas Inerte


He

Ultrasonido

Agitacin y vaco

38

B) DEGASIFICACIN


39

C) PREMEZCLADO


Es recomendable medir los volumenes individuales y mezclarlos en un reservorio comun.

Cuando se mezclan solventes orgnicos con agua siempre se obtiene un DV de mezcla negativo.

Para preparar MeOH/Agua 50/50, no se debe colocar 500 ml de metanol en el matraz aforado y aadir 500 ml de agua porque no serian suficientes para llevar al aforo.

40

D) BUFFERS


Los buffers seran necesarios cuando se analicen muestras que contengan analitos cidos o bsicos.

Las concentraciones recomendadas son del orden de 10 a 20 mM; de ser necesaria una mayor concentracin asegurarse que no se presente precipitacin.

Recordar que el intervalo de amortiguamiento es de mximo +/-1.5 unidades en torno al valor de pka (ver tabla).

El pH debera ajustarse en el buffer acuoso (teniendo considerado la modificacin del pH por el solvente orgnico).

41

D) BUFFERS


Recordar que el intervalo de amortiguamiento es de mximo +/-1.5 unidades en torno al valor de pka (ver tabla).

42

D) BUFFERS


43

ACERO INOXIDABLE

PEEK

2.1 Fase Mvil Mantenimiento Preventivo

P/N: 28-211524-00 SOLVENT BOTTLE FILTER 10 M, TITANIUM

P/N: 27-180387-00 SOLVENT RESERVOIR FILTER, 10 UM, SS

44

Pureza de disolventes

Verifique con los proveedores el rango apropiado de trabajo en UV de los disolventes

El oxgeno disuelto incrementa la abs en la regin delUV lejano.Esnecesario desgasificar para lograr altasensibilidad en esta regin.La absorcin del oxgeno causar drift y ruido.Depende de la temperatura

Las sales de par inico (TMA) pueden contenerimpurezas que absorben en la regin UV. Usar de lams alta pureza

45

Preparacin de la Fase Mvil Filtracin Mantener los reservorios tapados.

Cuidados con disolventes

46

Preparacin de la Fase Mvil Solventes para fase inversa La mayora de la LC por fase reversa utiliza agua

como el componente principal de la fase mvil El agua es el lquido polar ms comn Casi todos todos los compuestos, excepto los ms

polares o ms inicos, experimentan una fuerza hidrofbica fuerte que los conduce a la fase estacionaria y causa su retencin

Se debe utilizar siempre agua grado hplc

Solventes

47

Preparacin de la Fase Mvil Solventes para fase inversa El ajuste de la concentracin orgnica del modificador

B es el medio primario de cambiar la retencin Los tres ms comunes son acetonitrilo, metanol y

tetrahidrofurano

Solventes

48

Preparacin de la Fase Mvil Solventes para cromatografia de iones

La cromatografa en fase normal utiliza mezclas. utiliza un buffer acuoso a un pH que mantenga a los

analitos con carga. Para los cidos, el pH debe ser mayor a 5 Para las bases, el pH debe ser menor a 5 Mientras que la concentracin del buffer aumenta,

aumenta la fuerza solvente y la retencin disminuye Se puede agregar solvente orgnico para cambiar la

retencin y la selectividad El metanol se elige generalmente porque proporciona una

mejor solubilidad

Solventes

49

Preparacin de la Fase Mvil Solventes para cromatografia de iones

El reactivo de par inico es generalmente un ion de cadena corta

Para la separacin de bases protonadas se utiliza elpentan sulfonato, hexan sulfonato, o el heptan sulfonato

Para la separacin de cidos ionizados, se emplea el tetraetil-amonio o el tetrabutil-amonio

Solventes

50

Preparacin de la Fase Mvil Programacin de Solventes

Las condiciones a considerar cuando se elige la fuerza ptima de fase mvil son resolucin, duracin del anlisis y el factor de la capacidad

La resolucin debe siempre ser por lo menos 1.5 para anlisis de cuantificacin

Tiempos de anlisis ms cortos pueden ser alcanzadas usando un solvente ms fuerte para los picos suficientemente resueltos

Una buena referencia es hacer que todos los picos se eluyan con con valores de k ' entre 1-20

Solventes

51

Operar a presiones elevadas

Libre de pulsaciones

Inerte

Operar con gradiente de solventes

2.1 Bombas - Caracteristicas

52

Objetivo de la Bomba

En la cromatografa clsica, la separacin se realiza porefecto de la gravedad (Tamao de partcula 50-100micrometros, tiempo de separacin de una a variashoras)

La disminucin de tamao de partcula como soportede la fase estacionaria (3, 5 o10 micras) exige forzar allquido a cruzar a travs de la columna por medio deuna bomba.

Las bombas comerciales basan su diseo en pistonesreciprocantes

53

FASE MVIL

FASE MVIL

Funcionamiento de la Bomba

54

El disolvente es entregado por la bomba con el pistnreciprocante.(10 L/min -10 mL/min)

El diseo del pistn con un control electrnico de su movimiento(stroke) proporciona un flujo ligeramente pulsante.

Un damper reduce la pulsacin del flujo.

Una cmara de mezclado proporciona una homogenizacin de losdisolventes atras del punto de inyeccion de la muestra.

Un transductor de presin convierte la presin del sistema en unasalida elctrica que se despliega en la pantalla


55


El movimiento del pistn es controlado por la rotacin de la leva(cam).

Un ciclo completo en la bomba consiste del movimiento del pistnpara llenar el cabezal, en el cual el pistn viaja en reversa(alejandose del cabezal de la bomba) y un movimiento de entrega ,en la cual el pistn viaja en el sentido del cabezal de la bomba.

Durante el movimiento de entrega, el disolvente es descargado atravs de la vvula check.

La rotacin de la leva (cam) es determinado por un software decontrol del motor.

56

Mala repetibilidad de tiempos de reten-cin:

- Fugas (visibles o no visibles)

SELLOS

PISTN

Mantenimiento Preventivo en Bomba

Vlvulas check

Solucin: Cambio de pieza daada

57

Com

posi

cin

Tiempo

% B

Isocrtica

Gradiente

2.1 Bombas Tipos de Bombas

58

Estabilidad en la lnea base Tiempo de anlisis largo

Presin Constante

Resolucin limitada

2.1 Bombas Anlisis Isocratico

59

Preparacin de la Fase Mvil Separacin isocratica o por gradiente

La fase mvil iscratica no puede resolver todas las separaciones Algunas muestras son demasiado complejas Resolucin pobre de picos tempranos Ensanchamiento de picos y coleo de los picos finales

En la elucin por gradiente de solventes, la fuerza de la fase mvil se incrementa por cambio de la composicin de los solventes en un cierto tiempo Elegido para una amplia gama de muestras o de

biopolmeros Limpia la columna durante cada corrida Empleada para estimar condiciones isocraticas ptimas

Solventes

60

Resolucin de Mezclas Complejas

Tiempo de Anlisis Corto

Variacin de la Presin

Inestabilidad de Lnea Base

Vida til de la Columna Limitada

2.1 Bombas Anlisis con Gradiente

61

2.1 Bombas Anlisis con Gradiente

Tiempo

% B

Com

posi

cin

62

Cond. Inicial

2.1 Bombas Desarrollo de un GradienteTiempo

(min)%A %B

0 100 020 80 2030 80 2035 100 0

40 100 0

Etapa

Prerun

Gradiente

Isocratico

Cond. Inicial

Equilibrio

Isocratico

63

2.3 Inyector Manual - Caracteristicas

Vlvula de 6 puertos

2 posiciones: carga e inyeccin

Utiliza un loop / requiere cambio de loop para inyectar diferentes volumenes

Jeringa para introducir la muestra

Limpieza manual de lnea de inyeccin

64

2.3 Inyector Manual - Funcionamiento

65

Filtracin de la Muestra

Jeringa (aguja) apropiada

Loop correcto

Limpieza correcta del inyector

2.3 Inyector Manual - Mantenimiento Preventivo

66

2.3 Inyector Automatico caractersticas

Vlvula de 6 puertos / 2 posiciones

Utiliza un loop / no requiere de cambio de loop para volumenes menores

2 posiciones: carga e inyeccin

Aguja / Jeringa para introducir muestra en forma programada

Limpieza automtica de la lnea de inyeccin.

67

2.3 Inyector Automatico- Consideraciones de

Operacin Jeringa El vlumen de muestra es medido con una jeringa de 250 uL.

El interior de la jeringa debe estar libre de burbujas.

De observarse burbujas:

Verificar la degasificacin del solvente de enjuague.

Verificar el buen estado de la punta del mbolo.

Verificar que la aguja no este tapada.

Es necesario verificar que no se presenten fugas provenientes del mbolo de la jeringa.

68

2.3 Inyector Automatico- Consideraciones de

Operacin Vlvula de Inyeccin La muestra es introducida por una vlvula automtica de seis puertos.

Emplea tambien un sello/rotor que puede rallarse. (mala repetibilidad de reas)

La falla se evidencia cuando se observan gotas de lquido en la punta de la aguja, crecen y se desprenden.

Y adems, un incremento en la presin tambien incrementa la intensidad del goteo.

69

2.3 Inyector Automatico- Resumen de

funcionamiento Importante Jeringa y tuberia libre de burbujas.

No fugas en jeringa.

Presurizacin de vial solo funciona si HeadSpace Pressure esta habilitado.

Recomendado solo con septas nuevas.

La aguja de aire es insertada hasta la parte superior del vial, por lo que los viales solo llenarlos hasta 2/3 de alto (Contaminacin Cruzada). 2/3 mximo

70

Factores que afectan la Repetibilidad de Areas

A. MUESTRA

B. MODOS DE INYECCIN

C. LOOP

D. EFECTO MEMORIA (Contaminacin cruzada)

2.3 Inyector Automatico- Mantenimiento Preventivo

71

A) CONSIDERACIONES DE LA MUESTRA

Compatible (soluble) con la fase mvil.

Disuelta en un solvente de la misma polaridad (o ms debil que la fase mvil).

Libre de partculas suspendidas (Filtrada)


72

Modo ParcialHasta el 50 % del volumen del loop

Toma de 3 a 2 veces el volumen del loop

B) MODOS DE INYECCIN

Modo Total


73

C) Material y tamao del LOOP

Tamao:

5, 10, 20, 50, 100,200, 500 (ml),1, 2,5 (ml)

Material:

Acero Inoxidable, Titanio,PEEK


74

D) EFECTO MEMORIA Contaminacin cruzada


Son residuos de muestra (o estndar) de la inyeccin anterior.

Se evidencia en la inyeccin de un blanco inmediato posterior.

75

Diagrama

2.4 Columnas para HPLC

76

Cmo funcionan?


La fase estacionaria esta empacada dentro la columna no se mueve.

La fase mvil esta circulando dentro la columna a una velocidad regulada (flujo constante) arrastrando a la muestra.

77

Cmo funcionan?


Si el analito es ms soluble en la fase mvil que en la fase estacionaria, el analito migrar dentro de la columna con poca interaccin con la fase estacionaria.

78

Cmo funcionan?


Si el analito es ms soluble en la fase estacionaria, migrar ms lentamente dentro de la columna, y dependiendo de la magnitud de la interaccin, el tiempo invertido ser ms o menos grande.

79

Clasificacin por Dimensiones

Modern HPLC for Practicing Scientists, Michael W. Dong, Wiley Interscience, 2006


80

Efecto del cambio en la longitud de la columna



81

Longitud3, 5, 10, 15, 25 cm)

Dimetro Interno (1, 2, 4, 4.6 mm)

Tipo de soporte Silica, polimero.

Grupo qumico enlazado C18, C8, C4, CN, NH2, Si

Tamao de partcula 2, 3, 5, 10 um

Tamao de poro y Area Superficial(60 ~ 200 A) (100 ~ 500 m2/g)

Densidad de ligando 2 ~ 4 mmol /m2

Clasificacin por Caractersticas


82

Tipo de soporte Silica (SiO2) es el material dominante. Posee una alta

resistencia mecnica y permite fabricar partculas uniformes.



83

Tipo de soporte Silica (SiO2) posee

una superficie polar que permite ser modificada para darle propiedades no polares por tratamiento qumico.

Tiene como limitante el que se degrada fuera del intervalo de pH de 2 a 8.



84

Tipo de soporteLa Silica (SiO2) tiene como limitante el degradarse

fuera del intervalo de pH de 2 a 8.



85

Tipo de soporte Polmero. Poliestireno divinil benceno

entrecruzado, polieteres y metacrilatos son los ms comunes.

Tienen como desventaja que regularmente poseen menos eficiencia comparadas con las columnas de Si.

Tienen como ventaja la operacin en el intervalo de pH de 1 a 14.

Existen nuevos materiales como son la Zirconia que permiten operar a temperaturas elevadas.



86

Grupo qumico enlazado C18 C8 C4 CN Ph NH2 Si



No Polar Polar

Fase Reversa Fase Normal

87

Grupo qumico enlazado C18 C8 C4 CN Ph NH2 Si



C18: Muy hidrofobica, estable y primer eleccin.C8: Menos hidrofobica, requiere menos solvente orgnico.CN: La menos hidrofobica, no muy estable.Ph: Para compuestos de mediana polaridad. Recomendada para aromticos.C4: Recomendadas para anlisis de proteinas.NH2: Recomendada para carbohidratos.Si: Adecuada para compuestos orgnicos de polaridad media

88

Tamao de poro y Area Superficial 200 ~ 60 A Area Superficial (100 a 500 m2) Mayor densidad en fase enlazada Mayor retencin (ms hidrofbica) No recomendado para

biomoleculas.



89

Densidad de ligando (Carga de carbono [peso Fase Enlas/peso Silica]) 2 ~ 4 mmol/m2



90

Clasificacin por tecnologia (Pureza de SiO2)



91

Clasificacin por tecnologia(Pureza de SiO2)



92

Clasificacin por tecnologa(Fase estacionaria modificada)


93

Clasificacin por Tecnologa

(Resumen 1)


94

Resumen


95

2.4 Columna Mecanismos de Separacin Tipo de interacciones

No polares - fuerzas de van der Walls

covalentes Formacin de puentes moleculares

Polar - dipolares y puentes de hidrgeno

Ionicas - cationicas y anionicas

96

SELECCIONAR LA COLUMNA ESPECIFICA

METODO EXISTENTE SATISFACTORIO

SELECCIONAR COLUMNA NUEVA

MUESTRA

PESO MOLECULAR > 2000

SOLUBLE EN ORGNICO

SOLUBLE EN AGUA

EXCLUSIN

PERMEACINEXCLUSIN

FILTRACIN

PESO MOLECULAR < 2000

SOLUBLE EN ORGNICO

SOLUBLE EN HEXANO

SOLUBLE EN METANOL

ADSORCIN FASE ENLAZADANORMAL

FASE ENLAZADAREVERSA

SOLUBLE EN AGUA

INTERCAMBIO INICO

2.4 Columna Seleccin de Columnas

97

Mercanismos de adsorcin

Dependiente de la concentracin de soluto y la temperatura (Isotermas de adsorcin)

Retencin de Compuestos polares

Orden de elucin: menor polaridad ms rpido

Columnas: slica & alumina

98

2.4 Columna Adsorcin

99

K = CsCm

S

m

Fase enlazada

Normal

Reversa

2.4 Columna Particin

100

2.4 Columna Fase Normal enlazada

101

Caractersticas del mecanismo

Interacciones:Polares (puentes de H2, fuerzas de van Der Walls).

Retencin:Favorecida por disolventes no polares.

Elucin:Fuerza de disolvente aumenta con la polaridad(hasta disolvente medianamente polares)

Columnas : Ciano y amino

102

2.4 Columna Fase Normal

103

2.4 Columna Fase Reversa

104

Caracteristicas del mecanismo

Interacciones:No polares (induccin de dipolo, dipolo-dipolo)

Retencin:Favorecida con disolventes polares

Elucin.Fuerza de disolvente aumenta disminuyendo polaridad

105


Es la tcnica de HPLC ms popular: Las columnas son estables y de rpido equilibrio. El orden de elucin es predecible: Si ms

hidrofobico el soluto -> mayor retencin. Agua es uno de los solventes ms importantes Permite cambios en la selectividad por la adicin

de modificadores Fase reversa incluye algunas variantes: Regular, supresin de iones, ionizacin

controlada, par inico y formacin de quelatos metlicos.

106


107

Mecanismos de fase reversa: Fase reversa clsica

Los solutos no polares son retenidos por la fase estacionaria .

La elucin se logra por cambio en la polaridad de la fase mvil (disminucin de polaridad)

Fase reversa clsica

108

2.4 Columna Fase ReversaFase reversa clsica

109

Mecanismos de fase reversa: Control de la ionizacin

Algunos solutos presentan ionizacin a un valordeterminado de pH.Los solutos en forma no ionizable son retenidos por lafase estacionaria. Al cambiar a su forma ionizableeluyen de la columna.Se emplean soluciones de fosfatos, boratos, citratos.Concentracin mxima (recomendada) 0.01MCompatibilidad de solubilidad con la fase orgnicaCompatibilidad con el detector

110

carga fijaIn de la muestra

resina

+

+-

contrain

Catinico

Aninico

2.4 Columna Intercambio Ionico

111


112

Base slica

Base polmero


113

SOLUBILIDAD ENAGUA (GFC)

SOLUBILIDAD EN ORGNICO (GPC)

2.4 Columna Exclusin

114

Fase mvilBomba

Detector

Sistema de datos

Banco de columnas

2.4 Columna Exclusin

115

Uso:

Almacenar la columna en un solvente recomendado por el fabricante.

Colocar tapones durante no-uso. Siempre lavar columna con un

solvente fuerte.

Siempre utilizar guardacolumna o filtro en lnea

2.4 Columnas Uso, Mantenimiento y Cuidados

116

Precauciones:

No exceder rango de pH de la columna.

No exceder rango de temperatura de la columna.

Nunca guardar la columna con sales o buffer dentro de ella.

Permitir que la columna se enfrie antes de detener el flujo.


117

Mantenimiento y Regeneracin:

Tiempo de vida desde 3 hasta 24 meses o de 1000 a 3000 inyecciones.

El desempeo disminuye con el uso (incremento en la presin y coleo de picos).

Monitorear presin (bitacoras!!), probar invertir columna.

Regenerar la columna con una serie de solventes de dbil a fuerte y viceversa en forma gradual.


118

SILICA

50 ml de hexano 50 ml de cloruro de

metileno 50 ml de isopropanol 30 ml de cloruro de

metileno 25 ml de fase mvil Probar la columna

FASE NORMAL

50 ml de cloroformo50 ml de cloruro de

metileno50 ml de isopropanol30 ml de cloruro de

metileno25 ml de fase mvil

Probar la columna

2.4 Columnas Uso, Mantenimiento, Cuidados y Regeneracin

Consultar siempre folleto del fabricante

119

FASE REVERSA

50 ml agua caliente ( 55 C)

50 ml de metanol 50 ml de acetonitrilo 30 ml de THF 25 ml de metanol 25 ml de fase mvil

50 ml de agua caliente (55 C)

50 ml de metanol50 ml de acetonitrilo25 ml de cloruro de

metileno25 ml de metanol25 ml de fase mvil

INTERCAMBIO INICO

2.4 Columna Regeneracin

Consultar siempre folleto del fabricante

120

Fase mvil

GuardaColumna

DetectorSistema de datos

Bomba

Inyector

Col

umna

2.4 Columna Guardacolumna

121

2.4 Columna Horno

Objetivos

Aumentar la solubilidad de la muestra

Disminuir la presin de la columna

Disminuir la selectividad Disminuir el tiempo de anlisis

122

2.5 Detectores

Uv-vis (l fija)

Uv-vis (Arreglo de diodos)

Fluorescencia

Indice de Refraccin

ELSD

123

Indice de Refraccin

a) Universal

b) Mide el cambio de ndice de refraccin entre la celda de muestra y la celda de referencia.

c) No destructivo de la muestra

d) Baja sensibilidad : %w

e) No compatible con gradiente

f) Sensible a la temperatura ambiente

2.5 Detectores - ProStar 350Caractersticas

124

No recomendados Haluros , Formato de Amonio, CCl4

Utilizables abajo del 10% Acido Brico, Anhidro Acetico, KOH Sales de Formato de Amonio, perclorato, HPO42- Sales de bicarbonato, clorato y nitrato

Utilizables abajo de 30% Acido Citrico, NaOH, Sales de Citrato de Amonio, oxalato,

sulfato, H2PO4-Utilizables abajo de 50%

Acido Acetico, Acido lactico, Hidrazina, Nitrato de Amonio, K2CO3, Formato de Sodio

2.5 Detectores - Indice de RefraccinProStar 350 -Restricciones de Solventes

125

Ultravioleta Visible

a) Alta sensibilidad

b) Mide la absorcin de la luz UV o Visible en el eluyente del HPLC.


d) Selectivo

e) Rango 190-900 nm

f) Compatible con gradiente

2.5 Detectores- Ultravioleta VisiblePS-325 Caractersticas

126

2.5 Detectores-Ultravioleta VisiblePS-325 Recomendaciones de Operacin

Encender la lmpara por lo menos 15 minutos antes del anlisis. Configurar longitud de onda y tiempo de respuesta. La duracin de las lmparas es de aprox 2000 hrs, pero pueden fallar antes o despus.

127

2.5 Detectores- Arreglo de Diodos PS-335 Caractersticas

a) Sensibilidad similar a UV-VIS

b) Mide la absorcin de la luz UV o Visible en el eluyente del HPLC.


d) Selectivo

e) Rango 190-900 nm

f) Compatible con gradiente

128

Espectro de cada Compuesto, comparacin de Espectros

Parmetro de Pureza

Biblioteca de Espectros

Cromatogramas a diferentes l.

Arreglo de diodos

2.5 Detectores- PS-335 Resultados

129

2.5 Detectores - Arreglo de Diodos PS-335 Recomendaciones de Operacin

Encender la lmpara por lo menos 15 minutos antes del anlisis. Configurar longitud de onda y tiempo de respuesta. Configurar rango de longitudes de onda para desarrollo de mtodos, y porque sea necesario en trabajo de rutina. Los archivos son muy grandes. La duracin de las lmparas es de aprox 2000 hrs, pero pueden fallar antes o despus.

130

Alta sensibilidad (100 a 1000x) Compatible con gradiente Selectivo: l excitacin, l emisin Rango de ls: Ex: 200-850nm y Em:200-900 nm Formacin de derivados: Precolumna y Post

columna Puede trabajar con la lmpara apagada

(Chemiluminescencia, Bioluminescencia) GLP integradas (horas de la lampara)

2.5 Detectores- FluorescenciaPS-363 - Caractersticas

131

2.5 Detectores- Fluorescencia PS-363 Lmpara de Xe.

Duracin aprox de 500 hrs

Contiene gas Xe presurizado. Manejese con cuidado.

La radiacin emitida es muy intensa.

132

2.5 Detectores- Fluorescencia PS-363 - Areas de aplicacin

Mercado Farmaceutico / Bioquimico

Catecholes e Indoles Vitaminas Derivados OPA de amino cidos Derivados FMOC de amino cidos Marcadores Fluorescentes

Mercado Ambiental Carbamatos, GlifosatosPNAs

133

3.1 Por ciento rea

3.2 rea Normalizada

3.3 Estndar Externo

3.4 Estndar Interno

3.0 Analisis Cuantitativo

tr1

tr2 tr3

A1 A2

tr4

A4A3

Area

134

1. Inyectar la Muestra ProblemaDatos

A2

A1

A3A4

tr1

tr2 tr3

A1 A2

tr4

A4A3

3.0 Analisis Cuantitativo- Por ciento Area

2. Calcular el % A:

%A = Ai x 100SAi

135

3.0 Analisis Cuantitativo- Por Ciento Area Normalizada

1. Preparar una mezcla estndar de concentracin conocida

2. Inyectar la mezcla estndar de calibracin

3. Obtener el cromatograma , as como las reas:

tr1

tr2 tr3

A1 A2

tr4

A4A3

pico de referencia

Datos

A2

A1

A3A4

C1

C2

C3

C4

136

4. Calcular los Factores de respuesta Fr:

a) Seleccionar un pico de referencia y asignarle un valor de Fr = 1

b) Calcular los Fr de los demas Picos:

Fri = A ref x Ci

C ref x Ai

Fr i = Factor de respuesta del pico de intersA ref = Area del pico de referenciaCi = Concentracin del pico de intersAi = Area del pico de inters

C ref = Concentracin del pico de referencia


137

5. Inyectar la muestra problema, obtener el cromatograma, asi como sus reas:

tr1

tr2 tr3

A1 A2

tr4

A4A3

Datos

A2

A1

A3A4

6. Calcular las concentraciones de cada uno de los componentes, en unidades relativas: %w, %v, % mol


138

%Ci = Ai x Fri x 100S(Ai Fri)

Ci = Concentracin del pico de inters en la muestra

Ai = rea del pico de inters en la muestra

Fri = Factor de respuesta del pico de inters


139

3.0 Analisis Cuantitativo- Estandar Externo1. Preparar una mezcla de estndares de

concentracin conocida con los componentes de inters

2. Inyectar la mezcla de estndares

3. Obtener el cromatograma, as como susrespectivas reas

tr1

tr2 tr3

A1 A2

tr4

A4A3

Datos

A2

A1

A3A4

C1

C2

C3

C4

140

4. Calcular los factores de respuesta de cada uno de los picos:

Fri = CiAi

5. Inyectar la muestra problema, obtener el cromatograma , as como las reas:

3.0 Analisis Cuantitativo- Estandar Externo

141

tr1

tr2 tr3

A1 A2

tr4

A4A3

Datos

A2

A1

A3A4

6. Calcular la concentracin de cada uno de los componentes: Ci = Ai Fri

Ci = Concentracin del pico de inters en la muestra

Ai = rea del pico de inters en la muestra


3.0 Analisis Cuantitativo- Estandar Externo

142

Alta pureza Estable qumicamente y trmicamente Estructura qumica semejante a los

componentes de inters

Separado e identificado de los componentes de la muestra

3.0 Analisis Cuantitativo- Estandar Interno

Requisitos del Estndar Interno

143

1. Preparar una mezcla de calibracin que contenga los componentes de inters, asi como el componente que servir como estndar interno

2. Inyectar la mezcla de calibracin, obtener el cromatograma y las reas

tr1

tr2 tr3

A1 A2

tr4

A4A3

Datos

A2

A1

A3A4

C1

C2

C3

C4

Est. Interno


144

3. Calcular los Fr tomando como referencia el pico del estndar interno, es decir asignarle un Fr = 1

Fri = Ci X A std int

Ai X C std int


Ci = Concentracin del pico de interes

Astd int = rea del estndar interno

Ai = rea del pico de inters

C std int = Concentracin del estndar interno


145

4. Inyectar la muestra problema y obtener las reas:

tr1

tr2 tr3

A1 A2

tr4

A4A3

Datos

A2

A1

A3A4

C2

5. Calcular la concentracin de cada uno de los componentes tomando como referencia el pico del estndar interno


146

Ci= Ai Fri C std int

A std int

Ci = Concentracin del pico de inters

Ai = rea del pico de inters

Fri = Factor del pico de inters

Cstd int = Concentracin del estndar interno

Astd int = rea del estndar interno


Documents

HPLC-VARIAN