Institut für medizinische &molekulare Diagnostik AG

Falkenstrasse 14 · CH-8008 Zürich · Telefon 0041 44 250 50 20

Helicobacter pylori - Clarithromycin-Resistenz Nachweis mittels PCR und Sequenzierung 1. Bedeutung

Die Australier J.R. Warren und B.J. Marshall wurden 2005 "for their discovery of the bacterium Helicobacter pylori and its role in gastritis and peptic ulcer disease" mit dem Nobelpreis geehrt [1]. Sie haben 1983 den Mikroorganismus als erste kultiviert [1]. 1994 empfahl das NIH, alle Patienten mit peptischen Ulcera und gesicherter Helicobacter pylori Infektion antibiotisch zu behandeln [3] und die International Agency for Research on Cancer Working Group der WHO

Helicobacter pylori zum Karzinogen [4].

e empirische, auf der klinischen Erfolgsrate

einem Protonenpumpenhemmer behandelt werden. Dabei sei die regionale Resistenzlage mit

einheitlichen Methoden an einer grossen Zahl von Isolaten sind sehr selten. Im Rahmen einer solchen Studie Epsilon-Clarithromycin resistente (ClaR

zwischen Nord- (4.2%), Zentral-/Ost- auch einige Zahlen bekannt: am Kantonsspital Basel erwiesen sich 1994 3% und im Jahr 2000 7.5% der Kulturen als ClaR [8,9], im Kanton Tessin 12% im Jahr 2000 [10] und in der 2005 p R die Rede [11]. Seitdem die Experten die sogenannt "nicht invasiven Teste" als dem diagnostischen

durch den Spezialisten, der die Diagnose mittels Gastroduodenoskopie und Biopsie stellt,

verordnet werden, ist berechtigt [10]. Jedenfalls werden zunehmend klinische Misserfolge R

ansteigt. Es ist erwiesen, dass der Prozentsatz an ClaR - oder

>80% [6,7,10,12]. 1996 wurde bekannt, dass Punktmutationen im 23S rRNA Gen mit ClaR assoziiert sind [13].

R molekularbiologisch direkt an der Probe zu bestimmen [Referenzen in 6].

2. Nachweismethoden

R verantwortlichen Mutationen liegen im 23S rRNA Gen, -Zentrums

codiert, dem Angriffspunkt Bindung des Makrolids und damit zur Resistenz.

Institut für medizinische &molekulare Diagnostik AG

Falkenstrasse 14 · CH-8008 Zürich · Telefon 0041 44 250 50 20

Auf der Basis publizierter Daten haben wir im Rahmen einer Diplomarbeit eine PCR entwickelt, mit der der betreffende Abschnitt in dieser Region amplifiziert wird. Der Nachweis der Mutationen erfolgt danach durch Sequenzierung des Produkts und Vergleich der Sequenz mit der Referenzsequenz U27270 [13,14,15,16].

Helicobacter pylori bekannt positive Proben wurden auf ClaR untersucht, 26 Biopsien und 40 Stuhlproben. Ob sie von nicht oder (erfolglos) therapierten Patienten stammten, war nicht bekannt.

den lediglich 24 aus 40 Stuhlproben erzielten PCR Produkten waren dann nur 17 Sequenzen auswertbar. Demnach ist diese Methode zum Nachweis von ClaR in Stuhlproben nicht geeignet, da in weniger als 50% mit einem brauchbaren Resultat gerechnet werden kann. Die

il nur Proben auf ClaR Helicobacter pylori DNA nachgewiesen wurde. In 12 der schliesslich 42 verwertbaren Proben wurden ClaR Mutationen gefunden (28%), und

2 (A G) und in 6 die Mutation

bislang verwendeten PCR Protokollen nicht erfasst, ihre Bedeutung wird noch diskutiert [18]. Davon abgesehen, enthalten noch immer 14% unserer Proben ClaR im Kanton Aargau mit molekularauf den Nachweis von T2182C angelegt waren, wurden von 130 Magenbiopsien ClaR Mutationen in 9% der Proben von unbehandelten und in 90% von behandelten Patienten mit persistierender Infektion gefunden [19].

fft: die

resistent [8,9,10], Metronidazol sollte daher nicht zur Therapie von Helicobacter pylori Infektionen eingesetzt werden [19]. Unsere Methode beansprucht 1-2 Tage. ClaR Populationen werden erfasst, auch wenn sie in der Probe mit sensiblen gemischt vorliegen. Die Koexistenz von mutanten und Wildtyp-

Therapie"-Regeln der medizinisch mikrobiologischen Kunst entspricht.

3. Untersuchungsmaterialien

R geeignet: der Schleimhaut von Magen und Duodenum

Institut für medizinische &molekulare Diagnostik AG

Falkenstrasse 14 · CH-8008 Zürich · Telefon 0041 44 250 50 20

_______________________________________________________________________________________________ Literatur: [1] http://www.nobelprize.org/medicine/laureates/2005/ [2] J.R. Warren, B.J. Marshall. Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis. Lancet 1983, 1:1273-1275. [3] National Institute of Health 1994. NIH Consensus Conference. Helicobacter pylori in peptic ulcer disease. NIH Consensus Development Panel on Helicobacter pylori in Peptic Ulcer Disease. JAMA 1994, 272:65-69. [4] http://www.inchem.org/documents/iarc/vol61/m61-3.html

Current concepts in the management of Helicobacter pylori infection - The Maastricht 2-2000 Consensus Report. Aliment. Pharmacol. Ther. 2002, 16:167-180.

H. pylori antibiotic resistance: prevalence, importance, and advances in testing. Gut 2004, 53:1374-1384.

graud, M. Lopez-Brea, L. Andersen. European multicenter survey of in vitro antimicrobial resistance in Helicobacter pylori. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2001, 20:820-823. [8] F.S. Lehmann, J. Drewe, L. Terracciano, C. Beglinger. Effect of ornidazole and clarithromycin resistance on eradication of Helicobacter pylori in peptic ulcer disease. Aliment. Pharmacol. Ther. 2000, 14:305-309. [9] C.C. Sieber, R. Frei, C. Beglinger, S. Mossi, J. Binek, H. Schaufelberger, R. Fried, G. Stalder. Helicobacter pylori resistance against metronidazol in Switzerland: implications for eradication therapy? Schweiz. Med. Wchschr. 1994, 124:1381-1384. [10] N. Maggi- -C. Piffaretti. Prevalence of Helicobacter pylori resistant strains in the southern part of Switzerland. Clin. Microbiol. Infect. 2000, 6:38-40. [11] B. Yuen, R. Zbinden, M. Fried, P. Bauernfeind, M. Bernardi. Cultural recovery and determination of antimicrobial susceptibility in Helicobacter pylori by using commercial transport and isolation media. Infection 2005, 33:77-81.

http://www.ukl.uni-freiburg.de/microbio/nrz-helico/ [13] J. Versalovic, D. Shortridge, K. Kibler, M.V. Griffy, J. Beyer, R.K. Flamm, S.K. Tanaka, D.Y. Graham, M.F. Go. Mutations in 23S rRNA are associated with clarithromycin resistance in Helicobacter pylori. Antimicrob. Agents Chemother. 1996, 40:477-480. [14] M. Matsumura, Y. Hikiba, K. Ogura, G. Togo, I. Tsukuda, K. Ushikawa, Y. Shiratori, M. Omata. Rapid detection of mutations in the 23S rRNA gene of Helicobacter pylori that confers resistance to clarithromycin treatment to the bacterium. J. Clin. Microbiol. 2001, 39:691-695. [15] D.E. Taylor, Z. Ge, D. Purych, T. Lo, K. Hiratsuka. Cloning and sequence analysis of two copies of a 23S rRNA gene from Helicobacter pylori and association of clarithromycin resistance with 23S rRNA mutations. Antimicrob. Agents Chemother. 1997, 41:2621-2628. [16] Barbara Studler. Molekularbiologischer Nachweis von Mutationen assoziiert mit Clarithromycin-Resistenz bei Helicobacter pylori - [17] K.S. Kim, J.O. Kang, C.S. Eun, D.S. Han, T.Y. Choi. Mutations in the 23S rRNA gene of Helicobacter pylori associated with clarithromycin resistance. J. Korean Med. Sci. 2002: 17:599-603. [18] C. Burucoa, C. Landron, M. Garnier, J.-L. Fauchère. T2182C mutation is not associated with clarithromycin resistance in Helicobacter pylori. Antimicrob. Agents Chemother. 2005, 49:868-870. [19] A. Soltermann, A. Perren, S. Schmid et al. Assessment of Helicobacter pylori resistance mutations in archival gastric biopsy samples. Swiss Med. Wkly. 2005, 135:327-332.