Gaceta de Ciencias Veterinarias Vol 15 N° 2 pp 49-57 20

Hallazgos Clinicos y Hematologicos en Caninos

Inmunoestimulados Sometidos a Condiciones de Campo en

una Zona Endemica de Ehrlichiosis Monocitica Canina del

Estado Lara, VenezuelaHematological and clinical finding on immunostimulated dogs submitted to field conditions at a Canine

Monocytic Ehrlichiosis endemic area on Lara State, Venezuela

1Mujica R* , 2Pérez M1Hospital Veterinario "Dr. Humberto Ramírez Daza", Decanato de Ciencias Veterinarias de la Universidad

Centroccidental "Lisandro Alvarado". Teléfono- Fax: 58-251-2592417. Dirección electrónica:

rmujicag@yahoo.com 2Laboratorio de Biotecnología del Decanato de Ciencias Veterinarias de la Universidad

Centroccidental "Lisandro Alvarado"

RESUMEN

En el presente trabajo se reportan los hallazgos clínicos y hematológicos en caninos tratados con uninmunoestimulante basado en células inactivadas de Propionibacterium granulosum y Lipopolisacáridosde Escherichia coli (Pg-LPS) en un área endémica de Ehrlichiosis monocítica canina (EMC). Se evaluarondiez caninos en el grupo control (GC) y diez caninos en el grupo experimental (GE). Se les realizó ladetección de E. canis mediante la técnica de PCR específica, al inicio y al final del estudio, así como unexamen clínico completo y una determinación de parámetros hematológicos semanales. Se observó que5 (50%) caninos del GE y 6 (60%) del GC ingresaron al estudio infectados por E. canis. Luego de nuevesemanas de exposición, el número de infectados del GE permaneció constante mientras que elGC aumentó.El GE desarrolló linfoadenomegalia como consecuencia de la infección, la cual fue descendiendo de 80 a30 %, además el 90% presentó fiebre no recurrente y se observó trombocitopenia leve (100.000-170.000x mm3) por 4 semanas. Por su parte, el GC aumentó la linfoadenomegalia de 20 a 80% y un 80%desarrollaron fiebre recurrente, además de trombocitopenia severa a las 2 semanas (< 100.000 x mm3) yleve en la cuarta semana. Estos hallazgos muestran que los caninos inmunoestimulados con Pg-LPSpresentaron una evolución positiva a la infección al no aumentar el número de infectados y presentarmejoría en el cuadro clínico y hematológico, y evitar en algunos casos la infección con E. canis o eliminarel microorganismo de la sangre en aquellos que resultaron positivos a la prueba de PCR específica alinicio del estudio y de mejorar el pronóstico de la EMC.

PALABRAS CLAVES: Ehrlichiosis, inmunoestimulante, hallazgos, evolución

ABSTRACT

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In this paper we report the clinical and hematological findings in dogs treated with an immunostimulatory cellbased inactivated Propionibacterium granulosum and Escherichia coli lipopolysaccharide (Pg-LPS) in anendemic area of canine monocytic ehrlichiosis (CME). Ten dogs were evaluated in the control group (CG)and ten dogs in the experimental group (EG). Was performed to detect E. canis by specific PCR technique atthe beginning and end of the study and a thorough clinical examination and determination of weeklyhematological parameters. It was found that 5 (50%) dogs of GE and 6 (60%) entered the study GC infectedE. canis. After nine weeks of exposure, the number of cases of GE remained constant while the GC increased.The lymphoadenomegaly GE developed as a result of infection, which was descending from 80 to 30%, and90% showed no fever was observed recurrent mild thrombocytopenia (100,000 to 170,000 x mm3) for 4weeks. In turn, the increased GC lymphoadenomegaly of 20 to 80% and 80% developed recurrent fever,severe thrombocytopenia addition at 2 weeks (<100,000 x mm3) and fourth weeks mild. These findingsshow that the canines immunostimulated with Pg-LPS showed a positive development to infection by notincreasing the number of infected and have an improvement in clinical and hematological, suggestingstimulated the immune system of the canines of GE, to avoid in some cases the infection with E. canis oreliminating the organism from the blood of those who tested positive for specific PCR test at baseline andimprove the prognosis of the EMC.

KEYWORDS: Ehrlichiosis, immunostimulant, findings, trends.

Recibido el 07 de junio de 2011 - Publicado el 21 de octubre de 2011

INTRODUCCIÓN

La Ehrlichiosis y la Anaplasmosis canina sonenfermedades de carácter febril, infecciosas y nocontagiosas, producidas por bacterias Gramnegativas, intracelulares obligadas, pleomórficas, de0,2 a 2 m de diámetro [1, 2, 3], pertenecientes a losgéneros Ehrlichia (Ehrlichia canis y Ehrlichia ewingii)y Anaplasma (Anaplasma platys), de la familiaAnaplasmataceae [4, 2].

Estas bacterias infectan a leucocitosmononucleares (E. canis), polimorfonucleares (E.ewingii), así como a plaquetas (A. platys) de caninossilvestres y domésticos de cualquier raza y edad. Otrosmiembros de la familia Anaplasmataceae que infectandiversas especies animales y al hombre también hansido reportados en los caninos Neorickettsiahelminthoeca, Neorickettsia risticii, A.phagocytophila, E. chaffeensis [2,4].

Para los géneros Ehrlichia y Anaplasma, la garrapataes el vector primario de la enfermedad. Se hademostrado que la garrapata marrón del perro, Rhipi-cephalus sanguineus, es el agente transmisor para E.canis. Recientemente se han reportado garrapatasdel género Amblyomma y Dermacentor interviniendoen la transmisión de la misma [2,4,5]. Para E. ewingiiy A. platys existen reportes que señalan a la A.americanum y R. sanguineus como sus posiblesvectores [6, 7].

La Ehrlichiosis Monocítica Canina (EMC) es unaenfermedad causada por la E. canis, descrita porprimera vez en Argelia en 1935 (8), actualmentedistribuida alrededor del mundo, principalmente enáreas tropicales y subtropicales [9].

La EMC presenta con un espectro clínico variadoque va desde una forma aguda, seguida de una fasesubclínica generalmente asintomática hasta una fasecrónica a veces mortal. La fase aguda se caracterizapor presentar cuadros de depresión, letargia, fiebre,linfadenomegalia, leve pérdida de peso, secreciónocular o nasal mucopurulenta, vómito, diarrea, anor-exia y tendencias hemorrágicas. Adicionalmente, lospacientes pueden presentar uveítis, petequiasretinales, polimiositis, poliartritis, y alteraciones delsistema nervioso central. Los principales hallazgos delaboratorio que se observan son anemia noregenerativa, trombocitopenia y leucopenia,reportándose usualmente en la bioquímica sanguíneauna hiperglobulinemia (gammapatía monoclonal opoliclonal), hipoalbuminemia y una baja en la relaciónalbúmina : globulina [3, 10]. Este espectro clínicopuede depender de la raza, estatus inmunológico,

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grado de estrés del paciente, la cepa implicada, lacoinfección con otras bacterias o parásitos y dereinfecciones constantes [11].

La respuesta humoral producida por la infecciónnatural o experimental con E. canis no es protectora ypor el contrario, existen evidencias de que ésta puedeestar envuelta en la patogenia de la enfermedad, comolo sugiere la demostración de anticuerposantiplaquetarios en perros infectadosexperimentalmente con E. canis . Se ha reportado laexistencia de un estado de premunición o inmunidadprotectora en perros infectados subclínicamente conE. canis y en perros infectados experimentalmentedespués de un tratamiento de corta duración conoxitetraciclina. Esta protección puede ser producidapor la respuesta inmune celular más que por larespuesta humoral [12, 13].

Hallazgos similares se reportaron en nuestra regiónen un estudio realizado en una unidad militar dedicadaal entrenamiento canino, ubicada en zona endémicade la Ehrlichiosis monocítica canina, en Barquisimeto,Estado Lara, en el cual se encontró que algunosejemplares infectados experimentalmente con E. canisse recuperaban espontáneamente de la enfermedad yque otros ejemplares que se recuperaron mediantetratamiento farmacológico o en forma espontánea,no se reinfectaron, aun cuando fueron reinoculadoscon sangre proveniente de un ejemplar en fase agudade la enfermedad [14]. Observaciones personales delautor señalan que algunos caninos alojados por variosaños en esta misma unidad militar, han permanecidosin infectarse con E. canis ni algún otromicroorganismo de la familia Anaplasmataceae. Estoshallazgos sugieren el desarrollo de algún tipo deresistencia o inmunidad protectora.

Existen métodos para estimular el sistema inmuneinespecífico de los individuos, los cuales se empleanpara tratar infecciones causadas por bacteriasintracelulares obligadas o facultativas, virus, hongos,parásitos metazoarios y tumores para las que noexisten vacunas o formas específicas de quimioterapia. Los microorganismos y extractos de suscomponentes son de empleo común comoinmunoestimulantes inespecíficos. Un medicamentode uso comercial con indicaciones comoinmunoestimulante está constituído por la bacteriaPropionibacterium granulosum y el Lipopolisacáridoextraído de Bacterias Gram negativas (LPS). El primeroes una bacteria Gram positiva cuyos componentesaplicados en forma de bacterina, estimulandirectamente la actividad funcional de linfocitos ymacrófagos [15, 16]. El LPS consiste en unoligosacárido unido a un lípido que forma parte de la

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membrana celular [17]. La interacción entre el LPS yun receptor de las células del sistema fagocítico mono-nuclear produce activación de los macrófagos, lo quea su vez estimula la proliferación y diferenciación delinfocitos T y B [18,19].

El objetivo del presente estudio fue detectar lainfección por E. canis mediante la técnica de PCR, loshallazgos clínicos y hematológicos de EMC en caninossusceptibles tratados con un inmunoestimulanteinespecífico basado en células inactivadas de Propi-onibacterium granulosum y lipopolisacárido (LPS)de Escherichia coli (InfervacR , Laboratorios Calier),mantenidos bajo condiciones de campo una zonaendémica de Ehrlichiosis monocítica canina, duranteun lapso preestablecido de 9 (InfervacR , LaboratoriosCalier) mantenidos bajo condiciones de campo du-rante un lapso de 9 semanas.

MATERIALES Y METODOS

Población y muestra

El estudio se realizó en el Centro de EntrenamientoCanino de la Guardia Nacional de Venezuela (CEC) elcual es una institución militar de carácter educativodonde se forma al personal que entrena y utiliza a lossemovientes caninos para la detección de drogas,sustancias explosivas y el rastreo de personasextraviadas o secuestradas, dentro del marco de lalucha del Estado Venezolano contra el tráfico y consumode drogas y el uso ilegal de sustancias explosivas. Enél se realizan dos cursos por año y en cada uno deellos se forman cincuenta (50) perros provenientesde diferentes zonas del país, los cuales fueron el objetode experimentación en el presente estudio.

Se sometieron a estudio 20 caninos (40 %) de los50 que ingresaron a uno de los cursos. Los 20 animalesfueron divididos en 2 grupos de 10 ejemplares cadauno para conformar un grupo experimental y un grupocontrol. La adjudicación de los caninos a cada grupose realizó al azar, de acuerdo al orden de llegada a launidad de entrenamiento, alternando la asignación deun ejemplar para el grupo control y uno para el grupoexperimental.

A los 10 caninos del grupo experimental se les aplicóun inmunoestimulante inespecífico basado en célulasinactivadas de Propionibacterium granulosum ylipopolisacárido (LPS) de Escherichia coli (20) y semantuvieron en condiciones de campo. Elinmunoestimulante se aplicó al momento del ingresoal estudio, a la dosis recomendada por el fabricante:dos aplicaciones vía intramuscular a cada animal, conun intervalo de 48 horas entre ambas, 1 ml para los

ejemplares con peso inferior a los 10 kg y 2 ml paralos caninos con peso superior a los 10 kg. Los 10caninos del grupo control se sometieron a idénticascondiciones de campo que el Grupo Experimental, perosin la aplicación del inmunoestimulante.

Diseño experimental

Cada ejemplar fue evaluado para detectar infeccióncon E. canis en la semana 1 y en la semana 9, mediantela técnica de Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR)"anidada" o "Nested PCR", técnica estandarizada debiología molecular de alta sensibilidad que detecta yamplifica el gen 16S rRNA de la E. canis, utilizandoiniciadores (Primers) específicos para esta especie (21)y mediante el frotis de capa blanca teñido con un Kitde coloración rápida (HemacolorR, Merck, USA).,técnica que permite la detección de mórulassugestivas de microorganismos de la familiaAnaplasmataceae, la cual tiene una sensibilidad muybaja, por lo que el porcentaje de error es alto [2,10,22]. Las pruebas Hematológicas (Hemoglobina,Hematocrito, Recuento Leucocitario y RecuentoPlaquetario) se realizaron con un equipo automatizadode hematología BECKMAN COULTER R , modeloCOULTER AcT diff.

Al finalizar el estudio, los ejemplares quepermanecieron enfermos recibieron el tratamientoespecífico contra la Ehrlichiosis canina recomendadoen la bibliografía [2,20,11]. El parámetro utilizado eneste estudio como criterio principal para determinarsi un canino está o no infectado fue la prueba de PCRpor ser de muy alta sensibilidad, ya que detecta unacélula sanguínea infectada en 3 x 10 6 células ocantidades tan bajas de ADN como 0,2 pg. Asimismose le dio valor a los hallazgos de trombocitopenia, leu-copenia, fiebre y linfoadenomegalia como altamentesignificativos de la enfermedad [21].

Análisis Estadísticos

Los datos provenientes del promedio semanalpor grupo de temperatura corporal, hematocrito,recuento de leucocitos y recuento de plaquetas paracada grupo, fueron analizados mediante el programade análisis estadístico SPSS versión 15.0. Se les aplicóuna prueba "T de student" a través de la cual secompararon estos promedios y se estableció si existíandiferencias estadísticamente significativas entreambos grupos, con una probabilidad de error inferiora 5%.

RESULTADOS

Mediante la técnica de PCR para la detección de E.canis se observó que el número de caninos del grupo

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ninguna resultó positiva a IFI (21). En Brasil, estudiosrealizados en una zona endémica de la enfermedadrevelaron un 34 % de positivos a PCR específico paraE. canis [22].

Además del ingreso de caninos previamenteinfectados con E. canis, tenemos el hecho de que elestudio se realizó en una zona endémica de ehrlichiosisy anaplasmosis canina donde las condicionesambientales facilitan la propagación de la infección[1]. Por lo tanto, esta variable facilita que encondiciones normales y sin la aplicación de ningúntratamiento preventivo, se incremente el número denuevos casos de la infección durante la estadía de loscaninos en la zona, como sucedió con el Grupo Con-trol, en el que se obtuvo como resultado que de 6(60%) caninos positivos a la prueba en la semana 1aumentaron a 8 (80%) en la semana 9 (Ver Tabla 1 yFiguras 1, 2, 3 y 4).

Adicionalmente en un estudio previo se reportó quegarrapatas Rhipicephalus sanguineus de esta zonaestán infectadas con E. canis y negativas a A. platys ,lo que apoya el incremento en el número de caninosinfectados con E. canis, debido a que existen el vec-tor y las condiciones epidemiológicas apropiadas parala dispersión de la infección [1].

Paralelamente, otro estudio señala que sitios dondeconfluyen una alta cantidad de caninos sumado acondiciones epidemiológicas apropiadas para lapropagación de la enfermedad, son variables quefacilitan el hallazgo de altos porcentajes de infecciónpor E. canis. En este estudio se evaluaron 27 muestrasprovenientes de un criadero de perros particular enCarolina del Norte, EE.UU., y se encontró 15 (56%)animales infectados con E. canis mediante la pruebade PCR específico (27). Todos estos hallazgos respaldanlos resultados obtenidos con el Grupo Control.

En el Grupo Experimental se observó uncomportamiento diferente, ya que el número decaninos infectados no aumentó durante su estadía de9 semanas en la zona, manteniéndose en 5 (50%)caninos infectados con E. canis. Este resultado puedeindicar que el tratamiento inmunoestimulante basadoen células inactivadas de Propionibacteriumgranulosum y al lipopolisacárido (LPS) de Escherichiacoli (Pg-LPS), el cual se ha reportado como potenciadorde la respuesta inmune contra bacterias intracelularesobligadas como la E. canis, influyó en que noaumentara el número de caninos infectados a pesarde existir diversas variables que favorecen la apariciónde nuevos casos de la enfermedad, la reinfección y elmantenimiento de la misma.

Del Grupo Experimental, 2 (20%) caninos PCRpositivos en la semana 1 evolucionaron a negativos

en la semana 9, y 3 (30%) permanecieron negativosambas semanas (Ver Figuras 1 y 2). Estos resultadospudiesen indicar nuevamente que el tratamientoinmunoestimulante aplicado permitió que algunos delos ejemplares que ingresaron a la zona endémica dela enfermedad, generaran una respuesta inmuneadecuada que les permitió no infectarse con E. caniso infectarse y eliminar la bacteria sin ningún otrotratamiento.

Existen estudios sobre detección de E. canismediante la técnica de PCR en sangre y tejidos queseñalan que el tratamiento con Doxiciclina elimina elmicroorganismo de la sangre, pero que permanecealojado y viable en órganos del Sistema RetículoEndotelial [28]. Posiblemente en los caninos queevolucionaron de positivos a negativos a la prueba dePCR en el transcurso de las 9 semanas del estudio, losmicroorganismos pueden estar presentando un patrónde migración a los tejidos similar al citado en elreporte.

En trabajos anteriores se ha reportado un estadode premunición en el que perros inmunocompetentesinfectados subclínicamente con E. canis o losafectados clínicamente (fase aguda) que recibierontratamiento de corta duración con Oxitetraciclina,desarrollaron una inmunidad protectora contra laenfermedad. Reportan además que esta inmunidad esmantenida principalmente por la vía de la respuestainmune celular. Por el contrario, la respuesta inmunehumoral fue relacionada con la patogenia de laenfermedad [12, 29, 30, 31]. Estos trabajos refuerzanla hipótesis de que el estímulo sobre la respuestainmune celular puede generar cambios positivos paralos caninos expuestos a la infección con E. canis.

La capacidad para defenderse de la infección conE. canis, parece ser ocasionada por la acción queejerce el tratamiento inmunoestimulante sobre larespuesta inmune celular, específicamente laactivación de los linfocitos Th1, con la consiguienteproducción de citoquinas que actúan como activadorasde otras células, según lo descrito por el manual delfabricante del producto y la descripción de la acciónde sus componentes individuales, descrita en labibliografía consultada (17,20). Entre las citoquinasproducidas por la activación de los linfocitos Th1, seencuentran el Interferón ? (IFN ?), el factor de necro-sis tumoral (TNF) y el factor de migración de lospolimorfonucleares (PNMF), que a su vez actúan sobrelos macrófagos, células natural Killer (NK) y neutrófilospara que actúen sobre las células infectadas con E.canis, y directamente sobre la bacteria. Esta acciónbactericida contra los organismos ehrlichiales seejerce principalmente, a través de mecanismos

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independientes del oxígeno, como la producción deÓxido Nítrico (NO), que a su vez inhibe la acción de latransferrina, encargada del transporte del ión hierroal interior de la célula hospedadora. Los organismosehrlichiales son reconocidos por ser muy dependientesdel hierro para su metabolismo, por lo que compitenpor él con la célula hospedadora. También estascitoquinas actúan mejorando la capacidad de lascélulas presentadoras de antígenos (CPA), ydesencadenando mecanismos adicionales como laopsonización y la vía del complemento, quecontribuyen a la eficacia de esta respuesta celular[32,33].

En base a todos estos resultados, se sugiere que eltratamiento inmunoestimulante basado en célulasinactivadas de Propionibacterium granulosum y allipopolisacárido (LPS) de Escherichia coli (Pg-LPS) esefectivo en evitar, atenuar o eliminar la infección conE. canis y se recomienda su utilización como refuerzopara el tratamiento antibiótico específico.

CONCLUSION

Los resultados del presente trabajo demostraronla atenuación de la severidad del cuadro clínicocaracterístico de la Ehrlichiosis monocítica canina, enlos caninos que recibieron una tratamientoinmunoestimulante basado en células inactivadas dePropionibacterium granulosum y al lipopolisacárido(LPS) de Escherichia coli.

RECOMENDACIONES

En zonas endémicas de Ehrlichiosis monocíticacanina, se recomienda la aplicación de uninmunoestimulante inespecífico a los caninos almomento de su ingreso a la misma, ya que el presenteestudio demostró que en los caninosinmunoestimulados experimentalmente se produjo unaatenuación de la severidad del cuadro clínico de laenfermedad. Esto conllevaría a evitar el uso deantibióticos como tratamiento preventivo y a mejorarel pronóstico de la enfermedad cuando se presente.

Realizar trabajos adicionales, ampliando el númerode muestras, y midiendo otras variables como raza,caracterización de la respuesta inmune (incluyendopoblaciones leucocitarias y citoquinas involucradas) ydetección de Ehrlichia canis en tejido para determinarsi los caninos infectados al inicio del experimento yque resultaron negativos a PCR en sangre al finalizarel mismo, realmente eliminaron al microorganismo.

AGRADECIMIENTOS

A la Dra. Mary Carmen Jiménez y al Dr. FranklinBracamonte, Médicos Veterinarios del Centro deEntrenamiento Canino de la Guardia NacionalBolivariana de Venezuela, y a la Lic. Hildamar Chaviery a la Sra. Rosa Pérez del Laboratorio de PatologíaClínica del Decanato de Ciencias Veterinarias de laUniversidad Centroccidental "Lisandro Alvarado", porsu valiosa colaboración en la obtención yprocesamiento de las muestras estudiadas.

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