INYECCIÓN INTRACITOPLÁSMATICA DE ESPERMATOZOIDES Y FERTILIZACIÓN IN VITRO EN ANIMALES DOMÉSTICOS

M.C. Graciela Calderón Mendoza Doctorado en Ciencias Biológicas

Biotecnología Molecular AgropecuariaCentro Multidisciplinario de Estudios en Biotecnología FMVZ-UMSNH

Morfología del espermatozoide y metabolismo energético que realiza esta célula a partir de glucosa en la pieza principal y en la pieza media.

Maduración espermática

EyaculaciónSeparación del

plasma seminal

Ovocito maduroHiperactivación

Exocitósis del acrosomaPenetración de la ZPFusión con el ovocito

Ep

idíd

imo

VaginaCérvix

ÚteroOviducto

Capacitación espermática

TRANSPORTE ESPERMÁTICOTestículo

Espermatozoides No capacitados

Espermatozoides Reacción Acrosomal

1 CP

Mecanismo de los eventos moleculares que inducen la activación y la hiperactivación del flagelo

Mecanismo de eventos moleculares que se suceden durante la capacitación, el reconocimiento entre los gametos y la reacción acrosomal

Fertilización: adhesión y fusión

Estado funcional del espermatozoide

No Capacitado Capacitado Reacción acrosomal

Fertilización in vitro

semen congelado

1. Swim-up

2. Incubación espermatozoides/ovocitos maduros 24 h TALP

concentración y movilidad espermática 5,000 espermas/ovocito

Ovocito Fertilizado 6 horas de incubación

2 cuerpo polar

Fertilización in vitro

Incubación de ovocitos fertilizados en SOF

ICSI

Introducción de un solo espermatozoide en el citoplasma de

un ovocito maduro70-80% ovocitos fertilizados

Fertilización in vitro

5000 espermatozoides/1 ovocito Capacitación in vitro

50-60% ovocitos fertilizados

“Animales domésticos”

Aplicaciones de ICSI

Técnica de reproducción asistida

Cuando el número de gametos disponibles se encuentra limitado

Indicada en casos de anomalías espermáticas

Obtención de descendencia a partir de animales de granja de baja capacidad fertilizante en FIV o alteraciones espermáticas, pero con elevado valor genético para la producción pecuaria.

Aspectos técnicos de ICSI

Microscopio con micromanipuladores

Fabricación de las agujas

Inmovilización del espermatozoide con PVP

La posición del cuerpo polar

Uso de agentes activadores para ovocitos: CaCl2, ionomicina, etanol, pulsos eléctricos

Activación del ovocito Membranas

de los gametos

fusionadas

Exócitosis granulo-cortical

Modifica la ZP

Reacción cortical

RE

Ca

Activación del ovocito

Reanudación de la meiosis

Inactivación MPF MAP

Extrucción 2 CPFormación

zigoto

Factor promotor de la maduración (MPF)

Ciclina B1

Ciclina B1

Ciclina B1

p34cdc2

p34cdc2

p34cdc2

P

PP

PP

P

P

P

P

Pre-MPF MPF Activo

Tyr 15

Thr 14

Thr 161

cdc25

Thr 161

Factor Citostático

CSF

RE Ca+

+

MP

FS PLC

PIP2

Ca++

IP3

InsP3-R

Modelo de activación del ovocito

Shimada y Terada, 2007

TP

Microscopio de sistema invertido conectado a los micromanipuladores y microinyectores

pipeta de sujeción “ovocitos”

pipeta para microinyección de

“espermatozoides”

Diámetro externo 120 µm Diámetro interno 15 µm

Diámetro externo 10 µmDiámetro interno 7 µm

Fabricación de pipetas

Posición del cuerpo polar12 h

6 h

3 h

Inmovilización del espermatozoide

Inmovilización del espermatozoide para aspirarlo.

PVP 10-15% para retardar la motilidad de los espermatozoides y para un buen control del fluido en el interior de la aguja de microinyección.

Procedimiento de ICSI

Ovocito maduro

Aspiración de un espermatozoide inmovilizado

Microinyeccción espermatozoide en posición

3 h

Localización del cuerpo polar 6 ó 12h

Sujeción de un ovocito maduro

Yoshida and Perry, 2007

Atraviesa membrana plasmática

Liberación del ovocito microinyectado

Ovocito fertilizado Desarrollo embrionario

Atraviesa citoplasma

Espermatozoide

Estado funcional de los espermatozoides para ICSI

Espermatozoidessin membranas

Espermatozoidescon membranas

Incubación ADN exógeno

Producción Embriones

ICSI

ICSI

Producción Embriones

Transgénicos

Agentes químicos

Agentes físicosElectroporación

REMIRetrovirus

Incubación ADN exógeno

Descendencia

Descendencia

Producción Embriones

Transgénicos

Descendencia

ICSI

Contenido acrosomal-espermaGránulos corticales -ovocitoAfectan el desarrollo embrionario

M.C. Graciela Calderón Mendoza

Doctorado Institucional en Ciencias BiológicasBiotecnología Molecular Agropecuaria

Centro Multidisciplinario de Estudios en BiotecnologíaFacultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia

Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo