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RIS
IKO
BE
WE
RT
UN
GGerman FederalInstitute for Risk Assessment
Sicherheit verbrauchernaher Produkte
Andreas Luch
Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 2
Executive Board• Office of President
• Research Coordination
• Controlling/Audit
Departments• Department 1: Human Resources
• Department 2: Risk Communication
• Department 3: Scientific Services
• Department 4: Biological Safety
• Department 5: Food Safety
• Department 6: Chemical Safety
• Department 7: Safety of Consumer Products
• Department 8: Safety in the Food Chain
• Department 9: Experimental Toxicology and ZEBET
2
Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 3
seit 1968 als Beratungsgremium des BGA, BgVV, BfR
Mitglieder
• Wissenschaftler der Universität und der Industrie:Technologie, Toxikologie, Dermatologie
• Behörden (BMELV, BVL, Untersuchungsämter)
• ZEBET
•
Aufgabe der KoKo Beratung des BfR
Aufgabe des BfR Beratung von BMELV u.a. Behörden
Risikokommunikation
Kosmetik-Kommission am BfR
Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 4
SCCS Scientific Committee on Consumer Safety
� 76/768/EWG Kosmetik-Richtlinie Artikel 8 nennt SCC
"Scientific Committee on Cosmetics",
wissenschaftliches Beratungsgremium der EU-
Kommission
� 1978 Gründung des SCC
� 1997 Nachfolger SCCNFP
� 2004 Nachfolger SCCP
� 2009 SCCS (Scientific Committee on Consumer Safety)
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Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 5
Kosmetische Mittel
Stoffe..., die ...dazu bestimmt sind, äußerlich...zum Schutz, zur Erhaltung eines guten Zustandes, zur Parfümierung, zur Veränderung des Aussehens oder dazu angewendet zu werden den Körpergeruch zu beeinflussen...
���� Reinigung, Pflege, Verschönerung
Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 6
• Regelung europäisch: RL 76/768/EWG,→ in deutsches Recht übernommen (KVO)
• §1 Anlage 1: Verbote/Negativliste (z.B: CMR)
• §2 Anlage 2: Eingeschränkt zugelassene Stoffe(z.B. PPD, Haarfärbemittel)
• §3 Anlage 3: Farbstoffe (Max.Konz., Reinheit)
• §3a Anlage 6: Konservierungsstoffe (Max.Konz., Beschränkungen)
• §3b Anlage 7: UV-Filtersubstanzen (Höchstmengen)
• Zulassungsverfahren für Farbstoffe, Konservierungsmittel und UV-Filter(Kriterien nach Notes of Guidance for Testing of Cosmetic Ingredients for their Safety Evaluation, SCCNFP)
• Deklaration sensibilisierender Duftstoffe (26): 0,01% („rinse-off“) bzw. 0,001% („leave-on“)
Regulation bei Kosmetischen Mitteln
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Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 7
Nationale Regulation bei kosmetischen Mitteln
LFGB Kosmetische Mittel dürfen nicht geeignet sein,
die Gesundheit zu schädigen
� Täuschungsverbot
� Produktregister beim BVL
� Vergiftungsmeldungen
� Kennzeichnung
� NEU: Tattoos werden kosmetischen Mitteln gleichgestellt
Kosmetik-Verordnung
� Negativlisten
� Anwendungseinschränkungen
� Positivlisten
� Deklaration
� Produktdossier
� Inventarliste
Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 8
Notes of Guidance (SCCNFP):
Toxicological dossier
1.Toxicokinetics
� Skin absorption
� (Distribution,Metabolism)
2. Systemic Toxicity
� Acute Toxicity
� SubchronicToxicity
� (chronicToxicity)
3. CMR
� Genotoxicity
� (Reprotoxicity)
� (Carcinogenicity)
4. Dermatotoxicity
� Irritation of Skin and Mucus
Membranes
� Skin sensitization
� Phototoxicity of UV filters(Irritation, Mutagenicity,Sensitization)
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Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 9
Basisanforderungen
Die zentralen Elemente der Risikobewertung bei
Bestandteilen kosmetischer Mittel sind:
1. Toxizität auf der Haut
2. Hautresorption
3. Hautsensibilisierung
4. subchronische Toxizität
5. Genotoxizität
6. Erfahrungen beim Menschen
Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 10
1. Gefährdungspotential(Evidenz: Humandaten > in vivo > in vitro > QSAR)
2. Dosis-Wirkung: No Observed Adverse Effect Level (NOAEL)
3. Exposition: Systemic Exposure Dose (SED)
4. Risikocharakterisierung: Margin of Safety (MoS = NOAEL / SED)
Ziel: MoS > 100
Risikobewertung der Ingredienzien
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Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 11
Ermittlung des NOAEL
90-Tage (subchronische) Toxizität bei Ratten
Richtlinien: OECD 408 (1998), 96/54/EG, Anhang IV A Teil B.26
Methode• 10 Männchen + 10 Weibchen pro Dosis• 3 Dosierungen + 1 Vehikelkontrolle• dazu Satellitengruppe (Effekte reversibel, persistent oder
verzögert)• Behandlung täglich oral (Gavage, Futter, Wasser)• Limitdosis 1000 mg/kg/Tag
Ergebnis ► Informationen zur Organtoxizität► NOAEL-Wert (mg/kg KG/Tag)► Dosis-Wirkungsbeziehung
Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 12
Hautresorption
SCCP Notes of Guidance:
1. Ziel ist die Quantifizierung des Transfers durch dieHaut unter Gebrauchsbedingungen
2. Hautresorption in vitro, 2-5 mg Formulierung pro cm2 Haut,Haarfarben 20 mg/cm2
3. Messen von Mengen in Stratum corneum, Epidermis, Dermis und Rezeptorflüssigkeit
4. Addition der Mengen (außer Stratum corneum)
5. Angabe der Hautresorption in µg/cm2
6. Umrechnung in Körperdosis (SED mg/kg KG/Tag)
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Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 13
Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 14
Risikobewertung der Ingredienzien:
Toxikologische Daten (Notes of Guidance SCCP/1005/06)
1. Toxikokinetik
� Hautresorption
� (Verteilung,
Metabolismus)
2. Systemische Toxizität
� Akute Toxizität
� Subchronische
Toxizität
� (chronische Toxizität)
� Reprotox:
(Entwicklung +
Reproduktion)
3. Mutagenität / Kanzerogenität
� Genotoxizität
� (Kanzerogenität)
4. Dermatotoxizität
� Haut- und
Schleimhautirritation
� Hautsensibilisierung
� Phototoxizität bei UV-
Filtern
(Irritation, Mutagenität,
Sensibilisierung)
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Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 15
Dermale Absorption
OECD TG 428 (2004)• Empfehlung von ex vivo humaner Epidermis oder Schweinehaut
• 2002 - 2006 BMBF geförderte Validierung von RhE (EPISKIN, EpiDerm,
SkinEthic) als zusätzliche Alternativen
► keine Tierversuche für Chemikalientestungen mehr nötig !
OECD TG 428 (2004)• Empfehlung von ex vivo humaner Epidermis oder Schweinehaut
• 2002 - 2006 BMBF geförderte Validierung von RhE (EPISKIN, EpiDerm,
SkinEthic) als zusätzliche Alternativen
► keine Tierversuche für Chemikalientestungen mehr nötig !
Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 16
Risikobewertung der Ingredienzien:
Toxikologische Daten (Notes of Guidance SCCP/1005/06)
1. Toxikokinetik
� Hautresorption
� (Verteilung,
Metabolismus)
2. Systemische Toxizität
� Akute Toxizität
� Subchronische
Toxizität
� (chronische Toxizität)
� Reprotox:
(Entwicklung +
Reproduktion)
3. Mutagenität / Kanzerogenität
� Genotoxizität
� (Kanzerogenität)
4. Dermatotoxizität
� Haut- und
Schleimhautirritation
� Hautsensibilisierung
� Phototoxizität bei UV-
Filtern
(Irritation, Mutagenität,
Sensibilisierung)
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Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 17
Hautreizung und Hautätzung
HautätzungOECD TG 430 (2004)TER (transcutaneous electrical resistance)
OECD TG 431 (2004) human skin model expo 3‘, 1h, 4h, dann MTT
1993-94 Prävalidierung
1996-98 Validierung
2000 akzeptiert in der EU (B.40)
2002 akzeptiert durch die OECD (TG 431)
OECD TG 435 (2006)In vitro membrane barrier test (Corrositex)
HautätzungOECD TG 430 (2004)TER (transcutaneous electrical resistance)
OECD TG 431 (2004) human skin model expo 3‘, 1h, 4h, dann MTT
1993-94 Prävalidierung
1996-98 Validierung
2000 akzeptiert in der EU (B.40)
2002 akzeptiert durch die OECD (TG 431)
OECD TG 435 (2006)In vitro membrane barrier test (Corrositex) Hautreizung expo 1h, 42 h später MTT
OECD TG 439 (2010)
In vitro skin irritation (human skin model)
1998-2000 Prävalidierung
2001-2004 Optimierung
2004-2007 Validierung
2009 akzeptiert in der EU (B.46)
2010 akzeptiert durch die OECD (TG 439)
Hautreizung expo 1h, 42 h später MTT
OECD TG 439 (2010)
In vitro skin irritation (human skin model)
1998-2000 Prävalidierung
2001-2004 Optimierung
2004-2007 Validierung
2009 akzeptiert in der EU (B.46)
2010 akzeptiert durch die OECD (TG 439)
Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 18
Hautreizung und Hautätzung
Durch Kombination der Prüfungmethoden für Hautätzung und Hautreizung können Substanzen nach GHS klassizifiert werden
► keine Tierversuche für Chemikalientestungen mehr nötig !
NInegativnegativ
R38
(Hautreizend)negativpositiv
R34 / R35
(Hautätzend)positivpositiv
ErgebnisHautätzung
(TG 439)
Hautreizung
(TG 431)
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Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 19
Augenreizung & -ätzung
OECD TG 437 (2009)
Bovine Corneal Opacity & Permeability Test
Identifizierung von stark reizenden oder ätzenden Stoffen
Problem: Opacimeter nicht frei erhältlich
OECD TG 438 (2009)
Isolated Chicken Eye Test Method
Identifizierung von stark reizenden oder ätzenden Stoffen
Problem: Opacimeter nicht frei erhältlich
Draft TG: Cytosensor Microphysiometer Test
Identifizierung von stark reizenden oder ätzenden Stoffen
Identifizierung von schwach/nicht-reizenden wasserlöslichenTensiden und tensidhaltigen Mixturen
Problem: Microphysiometer nicht frei erhältlich
Draft TG: Fluorescein Leakage TestIdentifizierung von stark reizenden oder ätzenden Stoffen
Opacimeter (BASF)
Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 20
Risikobewertung der Ingredienzien:
Toxikologische Daten (Notes of Guidance SCCP/1005/06)
1. Toxikokinetik
� Hautresorption
� (Verteilung,
Metabolismus)
2. Systemische Toxizität
� Akute Toxizität
� Subchronische
Toxizität
� (chronische Toxizität)
� Reprotox:
(Entwicklung +
Reproduktion)
3. Mutagenität / Kanzerogenität
� Genotoxizität
� (Kanzerogenität)
4. Dermatotoxizität
� Haut- und
Schleimhautirritation
� Hautsensibilisierung
� Phototoxizität bei UV-
Filtern
(Irritation, Mutagenität,
Sensibilisierung)
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Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 21
Phototoxizität
OECD TG 432 (2004)In vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test1992-1994 Prävalidierung
1994-1996 Validierung
1996-1998 spezielle UV-Filter Studie
2000 akzeptiert in der EU (B.41)
2004 akzeptiert durch die OECD (TG 432)
OECD TG 432 (2004)In vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test1992-1994 Prävalidierung
1994-1996 Validierung
1996-1998 spezielle UV-Filter Studie
2000 akzeptiert in der EU (B.41)
2004 akzeptiert durch die OECD (TG 432)
Zur Unterscheidung von phototoxischen und
nicht-phototoxischen Substanzen ausreichend
► keine Tierversuche für Chemikalientestungen nötig!
Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 22
Risikobewertung der Ingredienzien:
Toxikologische Daten (Notes of Guidance SCCP/1005/06)
1. Toxikokinetik
� Hautresorption
� (Verteilung,
Metabolismus)
2. Systemische Toxizität
� Akute Toxizität
� Subchronische
Toxizität
� (chronische Toxizität)
� Reprotox:
(Entwicklung +
Reproduktion)
3. Mutagenität / Kanzerogenität
� Genotoxizität
� (Kanzerogenität)
4. Dermatotoxizität
� Haut- und
Schleimhautirritation
� Hautsensibilisierung
� Phototoxizität bei UV-
Filtern
(Irritation, Mutagenität,
Sensibilisierung)
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Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 23
Probleme bei der in vitro Analyse komplexer Endpunkte
Akute (orale/systemische) Toxizität
2006-2011: ACuteTox (EU FP6: € 9.000.000)57 Referenzchemikalien in funktionellen Tests (in vitro/in silico) zu … Absorption,
Distribution, Metabolismus, Exkretion, und spezifische Organtoxizität (einschl. Haemato-, Neuro-, Nephro-, und Hepatotoxizität) wurden getestet auf
• Reproduzierbarkeit
• Vorhersagekraft
• Möglichkeit der Klassifizierung von Chemikalien nach GHS und CLP
Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 24
Evaluierung von Teststrategie aus 10 potentiell geeigneten Assays
Cytotoxicity• Neutral Red Uptake in 3T3 mouse fibroblasts
• Cytomic panel measuring oxidative stress (intracellular peroxidative activity, intracellular levels of superoxide anion, oxidised DNA base 8-oxoguanine) in HepG2, SH-SY5Y, and A.704 cells
• Cytomic panel for cytotoxicity screening (intracellular Ca2+ levels, mitochondrial membrane potential, plasma membrane potential) in HepG2, SH-SY5Y and A.704 cells
Haematotoxicity• The Cytokine Release Assay using human whole blood (IL-1, IL-6, TNF)
• Inhibition of colony forming unit efficiency in human cord blood-derived cells stimulated withgranulocyte/monocyte-colony stimulating factor (CBC/CFU-GM)
Neurotoxicity• Gene expression (GFAP, HSP-32, MBP and NF-H) in primary rat brain aggregate cultures
• Uridine incorporation measuring the total mRNA synthesis in primary rat brain aggregate cultures
Metabolism• The MTT assay using primary rat hepatocytes (seems more like cytotoxicity of hepatocytes)
Biokinetics• Kinetic parameters: volume of distribution, protein binding, clearance, and intestinal absorption (Caco-
2 cells)
• The estimation of compound passage through the blood-brain barrier using neuronal networks
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Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 25
Akute Toxizität
Ergebnis:
Die zusätzlichen Endpunkte haben die Prädiktivität des 3T3 NRU Zytotoxizitätstestshinsichtlich der Klassifizierung von Substanzen für orale akute Toxizität nichtwesentlich verbessert3T3 NRU Daten sind prädiktiv für Substanzen mit niedriger / keiner Toxizität (LD50 > 200mg/kg) aber ungenau für Substanzen mit signifikanter / hoher Toxizität
► kompletter Ersatz von Tierversuche nicht absehbar
► betrifft nur einen geringen Anteil der Chemikalien
87% der Chemikalien mit LD50 > 2000mg/ml (ungiftig)
96% aller Chemikalien mit LD50 > 300mg/ml(schwach giftig)
Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 26
Risikobewertung der Ingredienzien:
Toxikologische Daten (Notes of Guidance SCCP/1005/06)
1. Toxikokinetik
� Hautresorption
� (Verteilung,
Metabolismus)
2. Systemische Toxizität
� Akute Toxizität
� Subchronische
Toxizität
� (chronische Toxizität)
� Reprotox:
(Entwicklung +
Reproduktion)
3. Mutagenität / Kanzerogenität
� Genotoxizität
� (Kanzerogenität)
4. Dermatotoxizität
� Haut- und
Schleimhautirritation
� Hautsensibilisierung
� Phototoxizität bei UV-
Filtern
(Irritation, Mutagenität,
Sensibilisierung)
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Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 27
Hautsensibilisierung/Allergische Kontaktdermatitis
• 15-20% der Bevölkerung sensibilisiert ≥1 Substanz
• >3.000 Substanzen als Auslöser bekannt
• Tierversuche zur Hautsensibilisierung/-reizung (EU-25, 2005):
ca. 60.000 Tiere
[davon für Hautsensibilisierung 22.184 Meerschweinchen und 21.350 Mäuse]
• 7. Änderung der EU-Kosmetikrichtlinie (2009/2013 „deadlines“)
• Sicherheitstoxikologische Bewertungen im Rahmen von REACH
Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 28
Tests auf Hautsensibilisierung
� Buehler Test (OECD 406)MeerschweinchenInduktion epikutan okklusiv – Auslösung epikutan okklusivAuswertung der Hautreaktion (Erythem)
� Magnusson Kligman Test (OECD 406)Meerschweinchen MaximationstestInduktion intradermal + Adjuvans - Auslösung epikutan okklusivAuswertung der Hautreaktion (Erythem)
� Local Lymph Node Assay (OECD 429)Mäuse, nur Induktion epikutan OhrAuswertung der Lymphozytenproliferation, quantifizierbar
� Epikutantests an Menschen (ethisch umstritten)Induktion mehrmalige Applikation epikutan okklusiv
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Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 29
Hautsensibilisierung
Mechanismen der Sensibilisierung:
1. Haptenisierung
2. Entzündungsmediatoren aus KC
3. DC-Reifung
4. DC-Migration
5. Proliferation Allergen-spezifischer T-Zellen
KC, KeratinozytDC, dendritische Zelle
Ep
ider
mis
Lym
ph
kno
ten
Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 30
Mechanistischer Schritt 1: Haptenisierung
- In silico Tools - OECD (Q)SAR Application Toolbox
Quantitative Struktur-Wirkungs-Beziehung: Vorhersage eines sensibilisierenden Potentials
von strukturverwandten Chemikaliengruppen; Voraussetzung: Messdaten von Chemikalien
zu Toxikokinetik und Toxikodynamik liegen vor
- Peptid-Reaktivitäts-Tests
Vorhersage eines sensibilisierenden Potentials in chemico, d.h. auf der Basis von Daten
zur chemischen Reaktivität und über Bindungsraten an nukleophile Ziele. Direkter Peptid-
Reaktivitäts-Test DPRA in Prävalidierung
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Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 31
Mechanistischer Schritt 3: Tests mit Keratinozyten und DC
KC - aktivieren Kontaktallergene metabolisch
- haptenisieren Chemikalien
- detektieren DAMPs (damage-associated), PAMPs (pathogen-associated mol patterns), Toxine, Allergene über Inflammasom
- setzen Zytokine frei: IL-1α/ β, IL-6, IL-18, TNFα
Kokultur von KC mit DC:
���� LCSA(loose-fit coculture-based sensitization assay)
CD86, IL-6, MIP-1β
• MUSST: Myeloid U937 Skin Sensitisation Test• h-CLAT: human-Cell Line Activation Test, e.g. THP-1
Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 32
Hautsensibilisierung
Mehrere vielversprechende Testmethoden sind entwickelt und befinden sich in der Prävalidierungsphase oder Validerungsphase
Risikobewertung für Hautsensibilisierung durch eine integrierte Teststrategieerscheint in absehbarer Zeit (aber erst nach 2013) möglich
Zeitrahmen ist abhängig von
► der zeitnahen Durchführung und effektiven Koordination von Validierungsstudien
► den Akzeptanzprozessen der EU und OECD(beschleunigte Verfahren wurden hier bereits implementiert)
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Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 33
Risikobewertung der Ingredienzien:
Toxikologische Daten (Notes of Guidance SCCP/1005/06)
1. Toxikokinetik
� Hautresorption
� (Verteilung,
Metabolismus)
2. Systemische Toxizität
� Akute Toxizität
� Subchronische
Toxizität
� (chronische Toxizität)
� Reprotox
(Entwicklung +
Reproduktion)
3. Mutagenität / Kanzerogenität
� Genotoxizität
� (Kanzerogenität)
4. Dermatotoxizität
� Haut- und
Schleimhautirritation
� Hautsensibilisierung
� Phototoxizität bei UV-
Filtern
(Irritation, Mutagenität,
Sensibilisierung)
Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 34
Reproduktionstoxizität
Einige Testmethoden zum Nachweis von embryotoxischen Eigenschaften sind bereits validiert
Zusätzliche Testmethoden wurden entwickelt und befinden sich in der Prävalidierungs-oder Validerungsphase
Probleme vor allem mit der
metabolischen Kompetenz der Systeme
Bestimmung der Bioverfügbarkeit der Teratogene bzw. deren Metaboliten
Grundsätzlich nur durch eine integrierte Teststrategie erfassbar
Zeitrahmen ist abhängig von:
► der zeitnahen Durchführung und effektiven Koordination von Validierungsstudien
► der Definition der Anwendung der Testsysteme
Ersatz von Generationenstudien (Reproduktionstoxizität)
Ersatz der OECD 414 (Embryotoxizität)
► kompletter Ersatz von Tierversuchen nicht absehbar!
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Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 35
Risikobewertung der Ingredienzien:
Toxikologische Daten (Notes of Guidance SCCP/1005/06)
1. Toxikokinetik
� Hautresorption
� (Verteilung,
Metabolismus)
2. Systemische Toxizität
� Akute Toxizität
� Subchronische
Toxizität
� (chronische Toxizität)
� Reprotox
(Entwicklung +
Reproduktion)
3. Mutagenität / Kanzerogenität
� Genotoxizität
� (Kanzerogenität)
4. Dermatotoxizität
� Haut- und
Schleimhautirritation
� Hautsensibilisierung
� Phototoxizität bei UV-
Filtern
(Irritation, Mutagenität,
Sensibilisierung)
Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 36
Testbatterie von 3 in-vitro Prüfungen
1. Genmutationstest in Bakterien (Ames-Test)
2. Genmutationstest in Säugerzellen (MLA, HPRT)
3. Mikrokerntest (MNT) oder Chromosomenaberration (CA)
Bei positiven Testresultaten sind weitere Tests erforderlich
Nachfolgende in-vivo Tests#
Mikrokerntest, Chromosomenaberrationstest
unplanmäßige DNA-Synthese (UDS)
COMET-Assay, u.a.
→ Prüfung von Mutagenität auf Gen-Niveau, Klastogenität und Aneugenität
# seit 03/2009 verboten für kosmetische Inhaltsstoffe,jedoch Integration in subchronische Toxizitätsprüfungenmöglich bis 03/2013
Genotoxizität/Kanzerogenität
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Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 37
Testung auf Genotoxizität ohne Tierversuche
Herausforderungen für in-vitro-Tests
● Komplexität der Krebsentstehung
● Vielzahl der Zielorgane
Vorhersagekraft der in-vitro-Tests
● gute Erkennung von Nager-Kanzerogenen (Spezifität: >80%)
● viele "Fehlalarme", d.h. falsch-positive Ergebnisse (Sensitivität: <25%)
Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 38
Optimierung der tierversuchsfreien Prüfung auf Genotoxizität
Maßnahmen zur Vermeidung falsch-positiver Ergebnisse
● Verwendung von Zelllinien mit mehr Bezug zum Risiko(humane Primärzellen mit Fähigkeit zur Entgiftung, DNA-Reparatur und p53-Zellzykluskontrolle)
● Verwendung einer proliferationsbasierten Zytotoxizitätsmessung
● Begrenzung der maximalen Testkonzentration auf 1 mM oder 0.5 mg/ml
Maßnahmen zur Verbesserung der Sicherheitsbewertung
● Optimierung der Teststrategie
● Testentwicklung (COMET und MNT in Hautmodellen, HET-MNT)(Barriere-Fkt., Metabolismus, Exkretion, DNA-Reparatur, Zellzykluskontrolle)
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Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 39
Nicht-genotoxische Kanzerogene
# nur noch möglich bis 03/2013
In-vivo Test#
subchronische Toxizitätsprüfung (90-Tage-Test) mit peroraler Verabreichungzur Detektion organtoxischer (adverser) Effekte
Bestimmung der höchsten Dosis ohnefeststellbare nachteilige Wirkung (NOAEL)
Berechnung eines Sicherheitsabstands (MoS)
In-vitro Test
Zelltransformationstest (syrischer Hamsterembryo, SHE)
Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 40
Schlussfolgerungen für Kanzerogenitätsprüfungen
SCCS-Meinung (2009)
Mit dem Verzicht auf Tierversuche wird eine abschließende Bewertung von neuen kosmetischen Inhaltsstoffen bei Vorliegen von irrelevant positiven Testergebnissen aus in-vitro Genotoxizitätsprüfungen nicht möglich sein.
Aktueller Status
• Kein vollständiger Ersatz von in-vivo Tests bis 2013
• Ersatzmethoden stehen zur Verfügung und werden weiterentwickelt;sie decken jedoch nur ein Teil des komplexen Geschehens ab.
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Luch, Alternativmethoden zum Tierversuch und Konsequenzen für die Bewertung, 24.2.2011 Seite 41
Risikobewertung der Ingredienzien:
Toxikologische Daten (Notes of Guidance SCCP/1005/06)
1. Toxikokinetik
� Hautresorption
� (Verteilung,
Metabolismus)
2. Systemische Toxizität
� Akute Toxizität
� Subchronische
Toxizität
� (chronische Toxizität)
� Reprotox
(Entwicklung +
Reproduktion)
3. Mutagenität / Kanzerogenität
� Genotoxizität
� (Kanzerogenität)
4. Dermatotoxizität
� Haut- und
Schleimhautirritation
� Hautsensibilisierung
� Phototoxizität bei UV-
Filtern
(Irritation, Mutagenität,
Sensibilisierung)
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Toxizitätsprüfungen mit wiederholter täglicher VerabreichungRepeated Dose Toxicity (RDT)
in-vivo Toxizitätsprüfungen#
subakut (28-Tage-Test)
subchronisch (90-Tage-Test)
chronisch (≥ 12 Monate)
Je nach relevantem Aufnahmeweg erfolgt eine perorale, dermale oder inhalative Applikation.# nur noch möglich bis 03/2013
Ziel und Prinzip
● Prüfung auf organtoxische (adverse) Effekte
● Bestimmung der höchsten Dosis ohnefeststellbare nachteilige Wirkung (NOAEL)
● Berechnung eines Sicherheitsabstands (MoS)
Hauptzielorgane für Prüfung
LeberNiereHerzLungeNervensystem
Laut SCCS-Statistik der letzten 10 Jahre ist die Leber das am meisten betroffene Organ, gefolgt von der Lunge (Rogiers & Pauwels, unpubl.)
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SCCS-Statistik der RDT-Studien für kosmetische Inhaltsstoffe(2002-2006)
• 113 Substanzen wurden in ein oder mehreren Assays getestet
• 50 Substanzen wurden nur in der 90-Tage-Studie mit peroraler Applikation getestet.
• 90-Tage-Studie mit peroraler Verabreichung wird am häufigsten durchgeführt
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Integrierte Teststrategien (ITS) für Repeated Dose Toxicity
• Stoffgruppierung (chemische Kategorie)
• Analogiebetrachtungen (read across)
• Struktur-Funktions-Beziehungen ([Q]SAR)
• Physiologie-basierte toxikokinetische Modellierung (PBTK)
• in-vitro-Tests
• Optimierung von in-vivo-Tests
• Expositions-basiertes Auslassen von Tests (waiving)durch Anwendung des TTC-Konzepts (toxikologische Relevanzschwelle)
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Projekte mit Entwicklung von 'omics-Technologienfür eine prädiktive Toxikologie ohne Tierversuche
PREDICTOMICSVorhersage von chronischer Leber- und Nierentoxizitätfür Pharmaka & Xenobiotika
carcinoGENOMICSVorhersage von genotoxischen und kanzerogenenSchädigungen an Leber, Lunge und Niere durch Chemikalien
Predict-IVProfiling von Pharmaka bezüglich Leber- , Nieren- undNeurotoxizität
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Schlussfolgerungen für Repeated Dose Toxicity (RDT)
SCCS-Meinung (2009)
RDT-Prüfungen zum Ausschluss systemisch-toxischer Risiken sind ein Schlüsselelement für die Sicherheitsbewertung neuer kosmetischer Inhaltsstoffe. Ohne solche Daten ist eine Risikobewertung nicht möglich.
Aktueller Status
• Kein vollständiger Ersatz für RDT-Prüfungen bis 2013 !
• bestehende Ersatzmethoden sind geeignet zur Gefahrenerkennung für bestimmte Endpunkte und liefern Informationen über Wirkmechanismenund Toxizitätspotential
• Integrierte Teststrategien statt Einzelmethodenprüfungen sind dasMittel der Wahl
• Weiterer Bedarf an Grundlagenforschung mit Fokus aufToxizitätsmechanismen und -pathways sowie auf biokinetische Modellefür eine in-vivo-in-vitro-Extrapolation
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Risikobewertung der Ingredienzien:
Toxikologische Daten (Notes of Guidance SCCP/1005/06)
1. Toxikokinetik
� Hautresorption
� (Verteilung,
Metabolismus)
2. Systemische Toxizität
� Akute Toxizität
� Subchronische
Toxizität
� (chronische Toxizität)
� Reprotox
(Entwicklung +
Reproduktion)
3. Mutagenität / Kanzerogenität
� Genotoxizität
� (Kanzerogenität)
4. Dermatotoxizität
� Haut- und
Schleimhautirritation
� Hautsensibilisierung
� Phototoxizität bei UV-
Filtern
(Irritation, Mutagenität,
Sensibilisierung)
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Toxikokinetik
Toxikokinetische Daten fürkosmetische Inhaltsstoffe werdennur unter bestimmten Umständengefordert.
Mit dem Verbot aller Tierversuchejedoch erlangen toxikokinetische Dateneine zentrale Bedeutung für diein-vitro/in-vivo-Extrapolation.
ADME:
AbsorbtionDistributionMetabolismusExkretion
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Absorption
Stratum corneum
primäre Keratinozyten
Keratinozyten-Zelllinien(HaCaT)
Vollhaut
künstliche Haut(PAMPA)
QSAR
Diffusion-Reaktions-Modelle
Co-Kultur pulmonarerZelllinien
Lungenepithel-Zelllinien(A549, Calu-3)
Lungengewebe
Primäre Lungenzellen
in-silico Modelle
in silico in vitro ex vivo
„intestinale“ epithelialeZelllinien (Caco-2)
Darmgewebe
künstliche intestinaleMembranen (PAMPA)
QSAR
Modellspektrum für tierversuchsfreie Ansätze
Dermale Aufnahme Inhalative Aufnahme Orale Aufnahme
Absorption & Metabolismus Absorption & Metabolismus Absorption, Metabolismus& Aktiver Transport
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Distribution, Metabolismus & Exkretion
Blut-Plazenta-Schranke
Blut-Hirn-Schranke
Blut/Gewebe-Verteilung
Blut-Hoden-Schranke
Plasmaprotein-Bindung
QSAR
in silico in vitro ex vivo
Distribution
Induktions-Assays
Bioaktivierungs-Assays
Metabolische Clearance
QSARExpertensysteme
Pharmacophore-Modellierung
Zielprotein-Modellierung
Metabolismus (Leber)
Metabolitenmetabolisierende EnzymeAddukteoxidativer StressCYP-Induktion
Verteilungskoeffizienten,Permeabilität
Exkretion
in vitro / in silico-Methodenfür renale Exkretion undGallenausscheidung amwenigsten entwickelt.
In-silico-Modelle für renaleExkretion schwer zu etablieren (Problem: Implementierung sekretorischer und reabsorptiver Prozesse)
Modellspektrum für tierversuchsfreie Ansätze
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Teststrategie für eine tierversuchsfreie Toxikokinetik
1. Expositionsabschätzung und in-vitro-Prüfung zur Klärung, ob eine Absorption unter dem vorgesehenen Verwendungsszenario wahrscheinlich ist
2. Im Falle einer relevanten Absorption wird die systemische Exposition über eine Physiologie-basierte toxikokinetischeModellierung abgeschätzt
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Schlussfolgerungen für Toxikokinetik
SCCS-Meinung (2009)
• validierte Ersatzmethoden für alle Bereiche der ADME noch nicht vorhanden
• geeignete in-vitro-Methoden für Absorptionstestungen über Haut und Verdaungstrakt; liefern auch nützliche Infos zur Biotransformation
• toxikokinetische Daten nur unter bestimmten Umständen gefordert;jedoch hohe Relevanz für in-vitro / in-vivo-Extrapolation
Aktueller Status
• Physiologie-basierte toxikokinetische (PBTK) Modelle sind das Mittel der Wahlzur Integration der Daten aus in-vitro / in-silico-Modellen sowie zur Extrapolation auf die in vivo-Situation
• viele Einzelmethoden bereits validiert oder in der Phase der (Prä)Validierung
• ein PBTK-basierter Ansatz könnte in 5-7 Jahren verfügbar sein
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G Danke für Ihre
Aufmerksamkeit
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Andreas Luch