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FRANCE cÔTÉ
Pu rification et caractérisation d'une UDP-glucose:cmcétine 8,8'-glucosykrsnsfé.rsse impliquée dans la synthèse de la crocine 1 partir de cultures cellulaires de safran
(Crocus sativus L.)
Thèse présentée
à la Faculté des études supérieures de l'université Laval
pour l'obtention du grade de Phüosophiae Doctor (Ph. D.)
Département de phyto logie FACULTÉ DES SCIENCES DE L~AGRICULTURE ET DE L'ALIMENTATION
UNIVERSITE LAVAL QUÉBEC
JANVIER 2000
O France Côté, 2000
National Library 1*1 of Canada Bibliothèque nationale du Canada
Acquisitions and Acquisitions et Bi bliographic Services services bibliographiques
395 Wellington Street 395, rue Wdlingtori OttawaON K1AûN4 OttawaON K1AON4 Canada canada
The author has granted a non- exclusive licence aliowing the National Library of Canada to reproduce, loan, distribute or sel1 copies of this thesis in microform, paper or electronic formats.
The author retains ownership of the copyright in this thesis. Neither the thesis nor substantial extracts fiom it may be printed or otherwise reproduced without the author's permission.
L'auteur a accordé une licence non exclusive pemettant à la Bibliothèque nationale du Canada de reproduire, prêter, distribuer ou vendre des copies de cette thèse sous la forme de microfiche/nlm, de reproduction sur papier ou sur format électronique.
L'auteur conserve la propriété du droit d'auteur qui protège cette thèse. Ni la thèse ni des extraits substantiels de celle-ci ne doivent être imprimés ou autrement reproduits sans son autorisation.
UNIYERSm LAVAL A T T E S T A T I O N
Faculte des B î W e a supérieures
Ce 17e jour du mois de decembre 19 99 , les personnes soussign6es . en leur qualit6 de membres du jury de la these de Hadame France c6te I
ont assiste la soutenance de cette these.
S e l i m Kermasha McGi 1 1
Lou i s-P . Vézi na Lava l
Dominique Michaud Lava 1
Claude W i l lemot Lava 1 1
François Cormier R & D, Colarôme Inc.
RÉSUMÉ COURT
Une UDP-g lucose:crocét ine 8,8'-glucosyltransférase impliquée dans la synthèse des mono-
glucosyles et diglucosyles esters de la crocétine a été purifiée et caractérisée pour la première
fois à partir de suspensions ceiIulaires de &?an (Crocus sativus L.). Le poids moléculaire,
déterminé par nItration sur gel est de 50 kD et l'enzyme pourrait être formée de 2 sous-unités
de 26 kD, déterminées par électrophorèse en conditions dénaturantes. Le point isoélectrique se
situe entre le pH 4.4 et le pH 4.6, alors que la température optimale pour l'activité de l'enzyme
a été établie a 40°C. Les valeurs Km apparentes pour 1'UDP-glucose et la crocétine sont de
0.72 mM et 0.17 mM respectivement, alors que la valeur Vmax est de 30 pkatdmg. La
préparation enzymatique purifiée est hautement spécifique à la crocétine et ne contient pas
d'activité permettant la formation des gentiobiosyles esters de la crocétine. Cette étude amène
des évidences concrètes appuyant l'hypothèse selon laquelle au moins deux glucosyltransférases
distinctes seraient impliquées dans la biosynthèse des glycosyles esters de crocétine chez le
sa&.
Claude Wiemot. directeur ' Fra'riCe Côté
RÉSUMÉ LONG
Les stigmates du safian (Crocus safivus L.) contiennent des caroténoïdes rares qui sont
solubles dans l'eau, principalement la crocine, le digentiobiosyle ester de la crocétine. En plus
de posséder un pouvoir colorant important, la crocine est un très bon antioxydant qui o£Ee une
protection contre le cancer. L'uiformation au sujet de la glycosylation des caroténoïdes est
limitée, mais des études ont indiqué qu'une serie de glucosyltransférases seraient impliquées
dans la formation des glucosyles et gentiobiosyles esters de la crocétine [Duf?esne et al., 1997,
Planta Med., 63: 150-1531. Le but de cette thèse était de véritier cette hypothèse en purifiant et
en séparant les enzymes impliquées dans la glucosylation de la crocétine en crocine. Deux
protocoles de purincation ont été mis au point, le premier utilisant une précipitation à l'acétone
suivie de chromatographies d'échange anionique et de filtration sur gel. Cette purification a
permis de caractériser Io UDP-g1ucose:crocé the 8,8'-glucosyltransférase par son poids
moléculaire (environ 50 kD), son point isoélectnque (pH 4.4-4.6)' sa température optimale
(40°C) et ses paramètres cinétiques (Km pour la crocétine = 0.17 rnM et Km pour I'UDP-
glucose = 0.72 rnM, Vmax = 30 pkatdmg).
Le deuxième protocole de purincation est une simplification du premier: seulement deux
techniques de séparation ont été utilisees afin d'obtenir un extrait enrichi 300 fois: la
c hrornatographie de filtration sur gel et I'isoélectrofocalisation préparative. Cette dernière
technique a permis d'isoler l'une des enzymes impliquées dans k formation des glycosides de la
crocétine, I'UDP-glucose:crocétiw 8,8'-glucosyitransféta~e. Une étude de spécificité a permis
de démontrer que cette enzyme est hautement spécifique envers la crocétine et qu'elle ne
catalyse que la synthèse des monoglucosyles et diglucosyles esters de la crocétine, sans
formation des gentiobiosyles esters. L'extrait enzymatique non purifié contenait également des
g lucosy ltransférases capables de glucosyler les acides abscissique et rétino ique. Les résultats
découlant de nos travaux sont les premiers qui rapportent la purification et la caractérisation de
I'UDP-glucose:crocéthe 8'8'-glucosyltransférase.
AVANT-PROPOS
A Arianne
Ce n 'est pas fini tant que ce n 'est pas fini.. . Yogi Berra
REMERCIEMENTS
La Fondation de l'université Laval Le Fonds FCAR Le Centre de Recherche et de Développement sur les Aliments de St-Hyacinthe
François Cormier Claude WiNemot
Ma famille:
Simon Claire
Mes collègues et amis..
Christine Gendron Steve Bourassa Nathalie Chartier Marie-Josée Lemay Brian Stewart Carole McKinnon Tony Savard Pierre Brouillette Danielie Leblanc Claude Champagne
Remerciements spéciaur=
Louis Vézina François Belzile
Sarah André
Claude Gagnon Marie-Claude P o u h Sébastien Soucy Richard Voisine Laurent Bazinet François St-Ge& Hélène Gagnon André Morin Nancy Gardner Claude Dannis
Daniel Dostaler
Daniel
Nicolas Chagnon Joël Girouard Denis Bélanger Ali Kademi Hélène Gaudreau Luc Lagacé Daniel Vincent Normand Robert Denise Chabot Edward Farnwort h
À Christiane Dufiesne pour son travail, sa ciisponibüité et ses précieux conseils. À François Brion pour son amitié et pour m'avoir permis de terminer mon doctorat en m'engageant comme assistante de recherche. À Yolande Lambert, ma belle-maman, pour m'avoir hébergée et gâtée de ses bons petits plats.
Page ................................................................................... RESUME COURT II
RESUMELONG ..................................................................................... III .................................................................................... AVANT.PROPOS IV
REMERCIEMENTS ................................................................................... V .......................................................................... TABLE DES MATERES VI ........................................................................... LISTE DES TABLEAUX X
............................................................................... LISTE DES FIGURES Xi
CHAPITRE 1
......................................................................................... INTRODUCTION . . ............................................................................................... 1 . 1 Introduction generaie .......................................................................... 1.2 Objectifs de ia thèse .... ..
1.3 Aperçu du contenu de la thèse ................. .. ............................................................
REVUE DE LA LITTERATURE ........... .. .................................................... 6
.................................................................................. 2.1 Les caroténoïdes .............................................................................. 2.1.1 Définition ............................................................................... 2.1.2 Structure
.................................................................... 2.1 -2.1 Diversité ............................................................................... 2.1.3 Synthèse
2.1.3.1 Voie de l'acide mévdonique: de l'acétyl-CoA a I'IPP ............... 2.1 .3.2 Conversion de l'acide mévaionique en IPP ............................. 2.1.3.3 Synthèse du géranylgéranylpyrophosphate .............................
............................................ 2.1.3.4 Biosynthèse des caroténoïdes 2.1.3.5 Voie de synthèse indépendante de l'acide mévalonique ..............
.................................................... 2.1.3.6 Biotechnologie ...... .. ................................................ 2.1.3.7 Régulation de l'expression
2.1.4 Fonctions et localisation des caroténoïdes ......................................... .................................................. 2.1.4.1 Tissus photosynthétiques
2.1 A.2 Tissus non-photosynthétiques ............................................ 2.1.4.3 Alimentation humaine .....................................................
........................................................................................... 2.2 Le s a h 2.2.1 Généralités .............................................................................
................................................... 2.2.1.1 Description de la plante ....................................................................... 2.2.1.2 Culture
........................................................... 2.2.1.3 Culture cel3ulaire .................................................................. 2.2.1.4 Utilisations .. . .
2.2.2 Composition chimique ................................................................ 2.2.3 La crocétine ............................................................................ . .
2.2.3.1 Synthèse chimique ......................................................... 2.2.3.2 Synthèse biologique .................... ,. ..................................
2.2.3 .2.1 Dégradation oxydat ive ......................................... . . 2.2.3.2.2 Dixnémation .....................................................
............................................................ 2.2.4 Glycosides de la crocét ine ......................................................... 2.2.4.1 Synthèse chimique
............................................................. 2.2.4.2 Bioconversion 2.3 Glycosyltransférases ..............................................................................
2.3.1 Définition ............................................................................... .............................................................................. 2.3.2 Spécificité
2.3.3 Rôles .................................................................................... ............................................................................. 2.3.4 Purification
2.3.5 Glucosy ltransférases catalysant la glucosy lat ion de la fonction carboxylique 2.3 .5 . 1 L'UDP-g1ucose:crocétine 8,8'-glucosyltransférase .................. 2.3 S.2 Hypothèse de la voie de biosynthèse des glycosides de la crocétine . .
2.4 Problématique et objectifs .........................................................................................
CHAPITRE III
PROPERTIES OF A GLUCOSYLTRANSFERASE INVOLVED IN CROCiN SYNTHESIS (PROPRIÉTÉS D'UNE GLUCOSYLTRANSFÉRASE IMPLIQUÉE DANS LA SYNTHÈSE DE LA CROC~NE) ....................................................................
............................................................................................... RESW ........................................................................................... AB STRACT
3.1 Introduction ....................................................................................... 3.2 Materials and methods ...........................................................................
.............................................................. 3.2.1 Chernicals and reagents 3.2.2 CeU culture ............................................................................. 3.2.3 Extraction and pudication of UDP-g1ucose:crocetin 8,8 '-
.................................................................... glucosyltransferase .............................................................. 3.2.3.1 Buffer systems
................................................................... 3.2.3.2 Extraction 3.2.3.3 Ion exchange chrornatography ...........................................
3.2.3.4 Gel permeation ............................................................. 3 .2.3.5 Glucosyltransferase assay ................................................. 3 .2.3 -6 f3-glucosidase assay ........................................................ 3.2.3.7 Protein assay ................................................................
3.2.4 Other purification methods tested .................................................. 3.2.4.1 Dye columns ................................................................ 3.2.4.2 Affinity with UDP-glucuronic acid ......................... ... .......
3.2.5 Characterization of the glucosyltransferase ........................................ 3.2.5.1 Effect of temperature ...................................................... 3.2.5.2 Isoelectric point @I) .......................................................
.......................................... 3.2.5.3 Estimation of molecular weight 3 .2.5.4 Enzyme kinetics ............................................................
3 -3 Results and discussion ........................................................................... 3.3.1 Enzyme purification ................................................................... 3.3.2 Characterization .......................................................................
3 -4 Acknowledgements .............................................................................. 3.5 References .........................................................................................
CHAPITRE IV
A HIGHLY SPECIFIC GLUCOSYLTRANSFERASE IS INVOLVED IN THE SYNTHESIS OF CROCETIN GLUCOSYL ESTERS IN CROCUS S A T ' W S CULTURED CELLS (UNE GLUCOSYLTRANSFÉRASE HAUTEMENT SPÉCIFIQUE EST IMPLIQUÉE DANS LA SYNTHÈSE DES G L U C O S ~ E S ESTERS DE LA CROCÉTTNE DANS LES CULTURES CELLULAIRES DE CROCUS
.............................................................................................. SA TI WS)
.............................................................................................. RÉsm ........................................................................................... AB STRACT
....................................................................................... 4.1 Introduction 4.2 Materials and methods ...........................................................................
........................................................ 4.2.1 Plant materials and chernicals 4.2.1 . 1 CeU culture ................................................................. 4.2.1.2 Chernicals ...................................................................
4.2 -2 Enzyme purification ................................................................... 4.2.2.1 Extraction ...................................................................
................................................................ 4.2.2.2 Gel filtration 4.2.2 -3 Preparat ive IEF .............................................................
............................................................ 4.2.3 Enzyme and protein assay . . 4.2.4 Enzyme charactemation .............................................................. 4.2.4.1 SDS-PAGE and native molecular weight deterrninat ion .............. 4.2.4.2 Isoelectnc focusing ........................................................ 4.2.4.3 Effects of the enzymatic extract on glycoside composition of
safllion pigment .............................................................
................................. ............... 4.2.4.4 Substrate spécificity .... ............................................................................................. 4.3 Results
........................................................... 4.3.1 Purification and properties 4.3.2 Specificity ..............................................................................
................ ............ 4.3.3 Separation of GTASE 1 and GTASEZ activities .... ..... 4.3.4 Glucosykting and deglucosyiating activities in the crude desalted extract
......................................................................................... 4.4 Discussion .............................................................................. 4.5 Acknowledgements
.................................................................................... 4.6 Literature cited
. . ....................................................................... CONCLUSION GENERALE 93
BIBLIOGRAPHIE ................................................................................... %
LISTE DES TABLEAUX
CHAPITRE II
Tableau 1.
Tableau 2.
Tableau 3.
CHAPITRE III
Table 1.
Table 2.
CHAPITRE IV
Table 1.
Table II.
Table III.
Table IV.
Gènes clonés codant pour des enzymes impliquées dam la biosynthèse des caroténoTdes végétaux (Bartley et al ., 1 994). .................................................................. 1 7 Composition des stigmates séchés du d a n (Crocus sativus).
................................................. (Pfander et Rychener, 1 982). -25 Liste et caractéristiques de quelques glycosyltransférases.. ........... .37
Purification of UDP-g1ucose:crocetin glucosyltransferase fiom Crocus sativus L. ceU suspension culture. Purification is as
................................. descriid in "Materials and Methods" .54 Propenies of UDP-glucose:crocetin glucosyltransferase in a
............................. Crocus sativus L. celi suspension culture. -6 1
Purification of UDP-Glc:crocetin glucosyltransferase fiom Crocus sativus L. ceil suspensions. Results are the means of dupücates. Enzyme activity was assayed with 1 .O mM crocetin
............................................. and 2.5 mM üDP-glucose.. -8 1 Substrate specificity of GTASEl purifïed 2- or 300-fold. Reactions were assayed with 2.5 rn of each glycosyl donor, and with 200 m~ of each glucosyl acceptors. Results are the
.................................................... rneans of dupîicates.. -83 Glucosylation profile foliowing 60 min incubation of crude desalted (PDIO), gel iïltration-purified and preparative enryme IEF-pded preparations with 1 .O mM crocetin and 2.5 mM UDP-Glc. Reaction products have been identined by NMR and
.................... m a s spectroscopy (Van Calsteren et al., 1997). .85 Modification of the profile of a d o n stigmata pigment extract d e r 1 and 3 hours of incubation with a crude desalted (PDIO) extract of Crocus sativus cell suspensions. Resuhs are the means
............................................................ of duplicates.. -86
LISTE DES FIGURES
CHAPITRE II
Figure 1. Figure 2. Figure 3.
Figure 4.
Figure 5.
Figure 6.
Figure 7.
Figure 8. Figure 9. Figure 10.
Figure 1 1.
Figure 12.
Figure 13.
Figure 14.
Figure 1 5.
Exemples de carotéwïdes xanthophylles retrouvés dans la nature.. ..... .7 ................................ Structure de l'unité de base des carotènes.. ..8
Voie de synthèse de l'acide mévalonique et de I'IPP ....................... ...................... (Gershenzon et Croteau, 1 993).. .. .9
Voie de synthèse des prényles pyrophosphates et des classes majeures de terpènes. (Gershemn et Croteau, 1 993). .................................. 1 2 Voie de biosynthèse des caroténoîdes d'origine végétale
....................................................... (Bariley et Scoinik, 1995) -14 Schéma de la compartimentation suggérée de la biosynthèse de I'IPP et des lipides isoprénoïdes chez les végétaux supérieurs basé sur les études de marquage au cl3. Le site d'inhibition de la formation de stérols par la mévinoiine est indiqué par une croix
.................................................... (Lichtenthaler et al., 1997) 15 Mécanisme proposé du cycle des xanthophyiles
.............................................................. (Goodwh, 1 980). .20 . . ......................................................... Forme cis de la bwne .22 ...................................................... Morphologie du crocus. .23
Conversion chimique et enzymatique de la picrocoche .............. en oxysafianol et safianal (Adapté de Lozano et al., 1999) ..26
Voie possible de la formation de la crocétine (Adapté de Pfander ..................................................... et Schurtenberger, 1982). .29
Structure chimique de la crocétine et des ses glycosyles esters retrouvés ................................................................. dans le s a h . . -3 1
Synthèse et hydrolyse des glycosides végétaux ..................................................................... (HGsel 198 1 ). .32
Profl HPLC et identification des pics des produits de glucosylation après 150 minutes d'incubation du mélange de crocétine et d'UDP- glucose avec un extrait de cals de s a h . a croche, b gentiobiosyle- glucosyle ester, e diglucosyle ester, f monogentiobiosyle ester, h mo~glucosyle ester et I crocétine. d, e, g, i, j, k et m sont les dérivés cis de la crocétine et ses glycosyles esters
........................................ (Adapté de Dufresne et al., 1997).. ..39 Voie proposée pour la biosynthèse par l'addition en plusieurs étapes de molécules de glucose a la molécule de crocétine par un extrait de cals de &an GTASE 1 est la glucosyltransférase responsable de l'addition de glucose aux groupements carboxyles terminaux et GTASE2 aux groupes glucosyle ester (Adapté de Dufiesne
..................................................................... et al., 1 997) .40
XII
CHAPITRE III
Fig. 1 Structure of crocetin and its glycosides.. .................................... 46 Fig. 2 Anion-exchange chrornatography of UDP-glucose:crocetin
glucosyltransferase using a Mono Q FPLC column. The bound proteins were eluted using a hear gradient (0-0.5 M) of NaCl (-O-). Fractions (2.5 mL) were collected and assayed for enyme activity against 1 .O mM crocetin (solid bars). The protein content (-) in each fiaction was monitored at 280 nm. ........................................ - 3 6
Fig. 3 Elution profile of proteins (-) and glucosyltransferase activity against 1 .O mM crocetin (solid bars) d e r gel permeation FPLC on a Superdex 200 prep grade column. The protein content in each 2.5 mL hct ion was rnonitored at 280 m.. ......................................................... 57
Fig. 4 SDS-PAGE of the 125-fold purifieci extract after gel permeation FPLC on Superdex 200 prep grade column (Lane 1 ) and moiecular weight markers (Lane 2). The stacking gel was 4.0%, the separating gel was 12% using Tris-HC1 b a e r at pH 8.8. The sarnple b a e r contained SDS and P-mercaptoethanol. The gel was stahed with silver nitrate.. ....... .58
Fig. 5 SDS-PAGE of the glucosyltransferase preparations fkom &on ceils after purification by afEnity with Cikcron Blue column d e r gel p e m t i o n FPLC on Superdex 200 prep grade column. The stacking gel was 4.0%, the separating gel was 10% using Tris-HC1 bufEer at pH 8.8. The sample buffer contained SDS and B-mercaptoethanol. The gel was stained with silver nitrate. .................................................... -59
Fie. 6 a) Activity of partially purified g1i;cosyltransferase &et acetone precipitation at temperatures ranging fiom 20 to 55°C. b) Activity of partially purifîed glucosyltransferase aller gel permeation FPLC at temperatures ranging fiom 30 to 4S°C. Activity was measured with 1 mM crocetin and 2.5 rnM UDP-glucose as substrates. Results are the . . .......................................................... means of tnplicates.. -62
CHAPITRE IV
Figure 1. Multi-step pathway proposed for crocet in glycoside biosynt hesis by addition of glucose moieties to crocetin: GTASE 1 and GTASE2 are responsible for the addition of glucose moieties to a terminal carboxyl group and to a glucosyl group, respectively (adapted fkom Dufiesne et al., 1997). ...................................................................... -72
Figure 2. Chemicai structure of the substrates tested wit h the g lucosy ltransferase extract. a. valeric acid, b. 4-methyl valeric acid, c. 2-methyl valeric acid, d. h-ans-2-penteno ic acid, e. pans-2,4-pentadieno ic acid, f. trans-2- methyl-Zpentenoic acid, g. ail-tram-retinoic acid, h. 1 3-cis-retinoic acid, i. ail-tram-abscisic acid, j. b i i k. norbixin, 1. crocetin ........ ..79
Figure 3. Analysis of the 300-fold purified glucosyltransferase extract fkom &on cell. A, SDS-PAGE of protein extract &er preparative IEF, stained with silver nitrate. B, IEF of highly pudïed GTASEI, stained . . wtth silver nitrate.. . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . -82
CHAPITRE 1
INTRODUCTION
1.1 Introduction générale
L'utilisation d'enzymes végétales comme biocatalyseurs trouve de plus en plus d'applications
au niveau des industries pharmaceutiques, chimiques et alimentaires. Bien que plusieurs
composés d'origine végétale puissent être produits par synthèse organique, certaines synthèses
sont d'une telle complexité (e-g. la morphine, la scopotamine, la Wiblastine. la Wicristine et la
digoxine) que la seule source économiquement rentable demeure la plante elle-même.
Toutefois, la culture des végétaux dépend de nombreux facteurs enviromementaux tels que le
climat, les insectes et les saisons. Les rendements et la qualité sont aussi très variables et des
facteurs politiques, comme l'état de guerre dans le pays producteur, peuvent rendre dacile la
culture ou la récolte de la plante recherchée (Pras et al., 1995). En revanche, la
biotransformation à l'aide d'enqmes végétales ne dépend pas de ces facteurs et elle offre, de
plus, de nombreux avantages comparés à la synthèse chimique. Les réactions catalysées par des
protéines peuvent se faire sous des conditions de température, de pH et de pression modérées
(Roberts et Turner, 1992). La plupart des biocatalyseurs effectuent des réactions stéréo- et
régiospécifiques sur des composés qui peuvent même être synthétiques ou étrangers à la plante
d'où proviennent les enzymes. Quelques-unes des ces réactions sont d'intérêt pour l'industrie
pharmaceutique, mais ne se font pas ou sont faites difncilement par synthèse organique ou à
l'aide de microorganismes (Pras et al., 1995).
L'une de ces réactions est la glycosylation et, particulièrement, la glucosylation. Cette réaction
peut être catalysée par des enzymes de la classe des transférases (EC 2.4.œ) ou des glycosidases
(EC 3.2.-), mais le transfert d'un sucre sur un substrat accepteur est généralement réservé aux
transférases telles que les glycosyItransférases. Les glucosy1transférases utilisant de ITJDP-
glucose se retrouvent presque uniquement chez les végétaux supérieurs et y jouent des rôles
physiologiques importants. Elles agissent, entre autres, au niveau de la régulation hormonale et
permettent l'entreposage, dans la vacuole, de plusieurs métabolites secondaires sous forme de
glucosides. Ces derniers dEerent de leur agiycone par leur plus faible réactivité chimique et
leur plus grande solubilité dans I'eau (HBsel, 1981), une propriété qui peut être intéressante à
exploiter dans les domaines pharmaceutique et alimentaire.
Les caroténoïdes sont des substances fipophiles généralement insolubles dans l'eau à moins
qu'un groupement fortement polaire, comme un sucre, n'y soit associé. Cette insolubilité rend
leur utilisation en industrie alimentaire diaicile. Une partie dispendieuse, mais essentiele, du
procédé industriel est la transformation du composé Lipophile en une microdispersion qui puisse
être dispersible dans les milieux aqueux tels que les jus de h i t s (Britton et al., 1995).
Quelques-uns de ces composés comme le B-carotène et la bWne (annato) ont trouvé des
applications comme colorant alirnentaire.
Le matériel colorant du safhn est composé en grande partie des formes glucosylées du
caroténoïde crocétine (Sampathu et al., 1984; Rios et al.. 1996). La forme glucosylée
principale, la crocine ou le di-(P-D-gentiobiosyle) ester de trans-crocétine, est soluble dans
I'eau ce qui est une propriété rare chez les caroténoïdes et une qualité importante pour
l'industrie alimentaire. La crocine est la remplaçante idéale du colorant artificiel tartrazine.
c'est-à-dire le FD & C Yellow No 5 (Timberlake et Henry, 1986). De plus, la crocétine et la
crocine font partie des constituants actifs des extraits de safkan au niveau pharmacologique
(Rios et al., 1996). Toutefois, le safian étant l'épice la plus dispendieuse au monde, son
utilisation comme source de crocine est peu rentable. Un procédé de bioconversion à l'aide de
celiules de d i a n pourrait diminuer les coûts et rendrait le procédé plus reproductible
comparativement à la source végétale, mais le taux de bioconversion à I'aide de suspensions
cellulaires de safian n'est pas assez élevé pour être rentable industrieliement (Dufiesne et al.,
1999). De plus, le coût du substrat, la crocétine, est trop élevé. Par contre, le clonage des gènes
impliqués dans la synthèse de la croche suivi de leur intégration au génome de
microorganismes serait une fàçon intéressante de produire efficacement la croche.
La voie de synthèse de la crocétine n'a toutefois pas encore été élucidée. Deux hypothèses ont
été proposées pour la synthèse de l'aglycone de la crocine, la crocétine. La première serait une
dégradation oxydative d'un caroténoïde à quarante carbones comme la zéaxanthine. La
dimérisation du gérany lgéranyle pyrophosphate suivi de réactions de désaturat ion et
d'oxydation sont à la base de la deuxième hypothèse ( P W e r et Schurtenberger, 1982). 11
existe peu d'études qui ont porté sur la transformation de la crocétine en crocine. De plus, les
enzymes impliquées dans la glucosylation de la crocétine en crocine n'ont jamais été purifiées ni
caractérisées.
Dufiesne et collaborateurs (1997) ont montré que la bioconversion de la crocétine peut être
faite par un extrait cellulaire de cals de safian et que le processus se fait en plusieurs étapes
pour générer plusieurs glycosides de la crocétine. Les cinétiques de formation des
monoglucosyles et diglucosyles esters sont semblables, mais dEerent de celles des
gentiobiosyles esters de la crocétine. Les extraits de cals de Vitis vinifru contie~ent une
enzyme catalysant le transfert de glucose sur les fonctions carboxyliques terminales mais non
sur les groupes glucosylee esters de la crocétine. Ces observations semblent indiquer que la
glucosylation de la crocétine serait catalysée par deux glucosyltransférases différentes; lhne
(GTASE 1 ) cataiysant l'ajout d'une molécule de glucose à chaque extrémité de la molécule de
crocétine et l'autre (GTASE2) favorisant la f o m t ion des gentiobiosyle esters (Dufiresne et al-,
1997).
1.2 Objectifs de la thèse
Afin de mieux connaître le mode d'action des glucosyltransférases qui catalysent la formation
de la crocine à partir de la crocétine, les objectifs de cette recherche sont:
1) de purifier les glucosyltransférases impliquées dans la synthèse de la croche;
2) de caractériser ces enzymes;
3) de séparer les enzymes qui catalysent k glucosylation de la crocétine en crocine.
Les résultats obtenus permettront de vérifier l'hypothèse de Ddesne et coiiaborateurs (1997):
Ia glucosylation de la crocétine en crocine est catalysée par deux glucosyltransférases
différentes; GTASEl catalysant la formation des glucosyles esters de la crocétine et la
GTASE2 favorisant la formation des gentiobiosyles esters de la crocétine.
Les glucosyltransférases végétales sont généralement reconnues comme ayant des spéciticités
de substrat variables (Hosel 1981). Nous dons vérifier la spécificité de substrat des
glucosyltransférases étudiées afin de déterminer si d'autres substrats ayant un intérêt médical ou
une similarité de structure avec la crocét ine pourraient être glucosy lés.
1.3 Aperçu du contenu de la thèse
La thèse est présentée sous la forme d'articles scientifiques.
Au chapitre II, une revue de littérature a été rédigée sur les caroténoïdes et les divers
constituents du safian. Une attention particulière a été portée à la glycosylation par les
glycosyltransférases.
Le chapitre III présente, sous k forme d'un article qui a été accepté pour publication dans la
revue Plant Science, les résultats expérimentaux concernant la purification partielle et la
caractérisation d'une glucosyltransférase impliquée dans la synthèse de la croche à partir de
suspensions cellulaires de s h (Crocus sa t iw) .
Le chapitre IV contient les résultats obtenus lors de 19étude de la spécificité de substrat de la
GTASEI pudiée et séparée de la GTASE2 à pariir de suspensions cellulaires de Crocus
sarivus. Les résultats sont présentés sous la forme d'une article qui soumis à la revue Pknt
Physiology.
Le chapitre V, en conclusion générale de la thèse, se termine pat les perspectives de la
poursuite de la recherche.
CHAPITRE II
R E W E DE LA LITTÉRATURE
2.1 Les caroténoïdes
2.1.1. Définition
Les caroténoïdes représentent l'un des plus grands groupes de pigments retrouvés dans la
nature. Ils passent par toutes les teintes entre le jaune et le rouge et 1orsqu.ils sont complexés à
des protéines, leur couleur peut devenir bleue ou verte (Goodwin, 1984). Ces molécules
appartiennent au groupe des terpénoïdes et sont synthétisées par les végétaux supérieurs, les
algues, les champignons et les bactéries. Les animaux semblent incapables de les synthétiser.
mais la coloration de certaines espèces provient des caroténoïdes contenus dans leur nourriture
(Britton et al., 1995). Dans les tissus photosynthétiques, la couleur des caroténoïdes est
masquée par la chlorophylle, mais lors des derniers stades du développement de la plante. ces
pigments vont contribuer aux couleurs vives de plusieurs fleurs et h i t s , et à l'orangé des
racines des carottes (Bartley et Scolnik, 1995).
2.1.2 Structure
2.1.2.1 Diversité
Environ 600 caroténo~des differents ont été identifiés chez une vaste gamme de végétaux, de
bactéries et d'algues. En plus d'être nombreux, ces composés possèdent une grande diversité
de structure. La figure 1 illustre quelques exemples retrouvés dans la nature. Les caroténoTdes
peuvent être séparés en deux groupes: k classe des hydrocarbones, nommés carotènes, et celle
des dérivés oxygénés, les xanthophylles (Goodwh, 1980). La plupart possèdent un squelette de
base a 40 carbones qui consiste en huit unités isoprènes dont l'mangement est renversé au
centre de la molécule (figure 2), le lycopène représentant le squelette carboné de base. Les
caroténoïdes peuvent être acycliques ou avoir une des deux ou les deux extrémités cycliques.
De plus, leur degré d'insaturation peut varier (Bartley et Scolnik, 1 995).
V Capsmot bioc
Figure1 . Exemples de caroténoïdes xanthophylles retrouvés dans la nature.
Quelques glycosides de caroténoïdes ont été identifiés, le plus connu étant la croche, le
pigment majeur des stigmates du safian (Crocus sativus). D'autres caro ténoïdes glycosy lés ont
également été isolés chez des bactéries non-photosynthétiques et les algues bleues-vertes
(Pfander, 1976). Le mono- et le di-glucoside de la zéaxanthine chez Enviniu herbicolu et
Envinia uredovora ainsi que la zéaxanthine rhamnosylée chez Corynebocteria sont des
exemples de caroténoïdes cycliques glycosylés (Hundle et al., 1992).
Des caroténoïdes associés à des protéines sont également présents dans la nature. Cette
association permet de aabiiiser le pigment, mais en change la couleur. Le caroténoïde rouge
astaxanthine, lorsqu'il est complexe à une protéine, donne k couleur bleue des carapaces de
homard. Les complexes caroténoïdes-protéines n'existent pas seulement chez les animaux
puisqu'ils sont présents chez certaines feuiles vertes, h i t s , légumes et bactéries (Francis.
1985).
Pbyrotie
Figure 2. Structure de l'unité de base des carotènes.
2.1.3 Synthèse
Les caroténoïdes sont synthétisés dans les plastides. Dans les chloroplastes, iis s'accumulent
principalement dans les membranes photosynthétiques en association avec les complexes
d'absorption de lumière et les centres réactionnels. Dans les chromoplastes des h i t s en cours
de mûrissement et des pétales des fleurs ainsi que dans les chloroplastes des feuiiies
sénescentes. les caroténoïdes peuvent se retrouver dans les membranes et les corps lipidiques
ou dans d'autres structures à l'intérieur du stroma (Cunningham et Gantt. 1998). Dans
plusieurs cas, ces structures se développent à partir des chloroplastes et ont une forme
irrégulière (Goodwin, 1980).
Les pigments caroténoïdes liposolubles font partie des nombreux composés produits par la voie
de biosynthèse des isoprénoïdes, décrite dans les pages suivantes.
2.1.3.1 Voie de l'acide mévalonique: de l'acétyl-CoA a I'IPP
La biosynthèse de tous les terpénoïdes, dont font partie les caroténoïdes, commence par la
formation de l'acide mévalonique. La figure 3 illustre la voie de synthèse de cet acide.
CH,CO-SCoA AcCtyI-CoA icy I t r i isfCrau
CoASH
CH,CO-SCOA
HMG-COA syntbalc
CoASH
ZSADPH + 2H+ H %le-COA rtdacuse 2SADP+
CoASH
M4valosrte kinase
Phospho- mCvaloaatc kinase
H O O C S O P P
- OPP H,C .
Figure 3. Voie de synthèse de l'acide mévalonique et de I'IPP (Gershenzon et Croteau, 1993).
Les premières réactions de la voie de I'acide mévalonique sont la fusion séquentielle de trois
molécules d'acétyl-CoA qui permet de produire un composé à six carbones, le 3-hydroxy-3-
methylglutaryl-CoA (HMGCoA). Ces réactions sont catalysées par deux enzymes, I'acétyl-
CoA acetyltransferase (EC 2.3.1.9) qui catalyse la condensation des deux premières unités
d'acétyl-CoA et la HMG-CoA synthase (EC 4.1.3.5) qui favorise la formation de HMG-CoA.
Ce composé, en plus d'être un intermédiaire dans la biosynthèse des terpenordes, est égaiement
formé au cours du catabolisme de la leucine (Spurgeon et Porter, 1980).
Avant la formation de I'acide mévalonique, le WG-CoA doit être réduit en deux étapes. un
processus catalysé par la HMG-CoA réductase (EC 1.1.1.34) en présence de NADPH à chaque
étape. Premièrement, le HMG-CoA est réduit en hémithioacétai qui en perdant le CoA donne
l'aldéhyde correspondant, I'acide mévaldique. Deuxièmement, la fonction aldéhydique est
réduite en fonction alcoolique avec formation d'acide mévalonique. L'hémithioacétal et
l'aldéhyde sont des intermédiaires qui demeurent liés à l'enzyme et ne se retrouvent pas sous
forme libre (Gershenzon et Croteau, 1993).
2.1.3 -2 Conversion de l'acide mévalonique en IPP
L'isopentényl pyrophosphate (IPP) est l'unité de base a cinq carbones qui sert à la construction
des terpénoïdes. Il est formé par la conversion de l'acide mévalonique en trois étapes
biosynthétiques (figure 3). En premier lieu, le mévalonate est pyrophosphorylé par l'action
successive de deux enzymes, la mévalonate kinase (EC 2.7.1 -36) et la phosphomévalonate
kinase (EC 2.7.4.2). Le mévalonate-5-pyrophosphate est ensuite décarboxylé par la
pyrophosphomévalonate décarboxylase (EC 4.1 .1.33) pour produire de I'IPP (Gershenzon et
Croteau, 1 993).
2.1 -3 -3 Synthèse du géranylgéranylpyrophosphate
La seconde phase de la formation des terpénoïdes, c'est-à-dire la formation des prényl
pyrophosphates, correspond égaiement à la seconde pbase de la biosynthèse des caroténoïdes,
la synthèse du géranylgérany lpyro phosphate (GGPP). Elle commence par 1' isomérisation de
I'IPP en diméthylailyl pyrophosphate (DMAPP), catalysée par l'enzyme IPP isomérase (EC
5.3.3.2). Cette réaction est irréversible et pourrait limiter la biosynthèse des caroténoïdes et
d'autres isoprénoïdes chez les végétaux (Cunningham et Gantt, 1998). L'PP seul n'est pas
suffisamment réactif pour permettre l'ionisation qui initie la condensation menant à la formation
des terpénoïdes de plus de cinq carbones. C'est au DMAPP que les unités IPP seront
additionnées de façon séquentielle (Gershenzon et Croteau, 1993). Tel qu'illustré à la figue 4.
la condensation du DMAPP avec une unité d'IPP forme un composé à dix carbones, le géranyl
pyrophosphate (GPP). Une autre molécule d'IPP peut se condenser au GPP et générer un autre
composé allylique, le fimésyl pyrophosphate (CI 5, FPP), alors que l'addition d'une troisième
unité d'IPP donne le GGPP (C~O). Ces molécules sont classées comme mono-, sesqui- et
diterpène, respectivement. Les réactions de condensation sont catalysées par des enzymes
nommées prényltransférases (EC 2.5.1.1) (McGarvey et Croteau, 1995). La GGPP synthase
(GGPS) forme la molécule de vingt carbones sans qu'ii y ait accumulation des intermédiaires
GPP et FPP (Gershenzon et Croteau, 1993). Le GGPP est le précurseur direct non seulement
de la biosynthèse des caroténoïdes, mais également d'autres composés végétaux comme la
chaîne p hyt 01 de la c hlorophylie, les phylloquinines, les plastoquinones, le taxo 1. l'acide
abiét iq ue, les phytoalexines diterpénoïdes et les diterpènes (McGarvey et Croteau, 1 995).
2.1.3.4 Biosynthèse des caroténoïdes
La biosynthèse du lycopène est une étape commune à la biosynthèse de presque tous les
caroténoïdes. La première étape est la condensation tête-à-tête de deux molécules de GGPP
pour mener au phytoène. La phytoène synthase (PSY) (EC 2.5.1.32) catalyse cette réaction à
deux étapes qui correspond à la conversion de deux molécules de GGPP en préphytoène
pyrophosphate, un intemiediaire instable, et ensuite en phytoène (Dogbo et al., 1988). Le
mécanisme de réaction de l'enzyme est la jonction de deux molécules de GGPP dans une
réaction de condensation avec la perte d'un hydrogène et d'un groupement diphosphate en C-1
de la même molécule. Le phytoène ainsi formé peut être 15-cis ou tout-hoans selon la
stéréochimie de la réaction. Il constitue le squelette de quarante carbones des caroténoïdes
(Bartley et Scolnik, 1995). La condensation de deux molécules de FPP qui permet de produire
le squaiène, précurseur des stérols à 30 carbones, ressemble à la formation du phytoéne à partir
de GGPP (Cunningham et Gantt, 1998).
VOIE DE L'ACIDE 1
OPP
( *C plusieurs fois )
Figure 4. Voie de synthèse des prényles pyrophosphates et des classes majeures de terpènes.
(Gershenzon et Croteau, 1993).
Le phytoène est un composé incolore à cause de l'absence d'insaturations dans sa longue
cWîe carbonée. Une série de désaturations permet de convertir cette molécule incolore en des
caroténoïdes jaunes, oranges et rouges par la création de doubles liaisons conjuguées qui
forment le chromophore (figure 5). II y a quatre étapes de déshydrogénation entre le phytoène
et le lycopène (Bartley et Scolnik, 1995). Ces étapes sont catalysées par deux désatwases, la
phytoène désatwase (PDS) et la zeta-carotène désaturase. La PDS catalyse les désaturations
1 1 - 12 et 1 1'-12', c'est-à-dire la transformation du phytoène en zeta-carotène (Schuch et al.,
1996).
La cyclisation du lycopène permet sa conversion en p-carotène, une étape catalysée par
l'enzyme lycopène cyclase (Bartley et Scolnik, 1995). Elle ouvre la voie à la formation d'autres
caroténoïdes cycliques tels la daxanthine et I'astaxanthine. Il existe de plus en plus d'évidences
qu'une autre cyclase serait impliquée dans la cyclisation du lycopène. Cette enzyme catalyserait
la formation du caroténoïde a-carotène, qui mènerait a la synthèse de xanthophylles comme la
lutéine (Schuch et al., 1996).
Lors des dernières étapes de la synthèse des carotènes, des dérivés hydroxy-, époxy-, fiiranoxy-
et oxy- peuvent être formés. Ces dérivés sont les xanthophyiles. II existe peu d'information
concernant les mécanismes enzymatiques impliqués dans la biosynthèse des xanthophylles
(Bart ley et al, 1 994).
2.1.3.5 Voie de synthèse indépendante de l'acide mévalonique
La voie acétate/mévalonate est généralement acceptée comme étant la voie de synthèse menant
a 1'IPP chez les végétaux supérieurs et les animaux. Cependant, il a été démontré que la
mévinoline, un inhibiteur de la synthèse de I'acide mévalonique, n'inhiiit pas la formation des
caroténoïdes, de la chlorophylle et de la plastoquinone-9 chez des végétaux supérieurs. Des
expériences faites sur des algues vertes et sur la plante Lernna gibba L. ont montré que les
L O P P i s o p e n t é n y l d i p h o s p h a t e
d i m C t h y l a l l y l d i p h o s p h a t e g k r a n y l d i p h o s p h a t e f a r n t s y l d i p h o s p h a t e
\ \ \ O P , I l g e r a n y l g k r a n y l d i p h o s p h a t e
a c i d e a b s c i s s i q u c - -- - -
Figure S. Voie de biosynthèse des caroténoïdes d'origine végétale.
caroténoïdes, les chaînes prényl de la chlorophylle et de k phstoquinoae-9 sont marqués via
une voie retrouvée également chez quelques eubactéties et Scenedesmus obliquus et qu'elle e n
indépendante du mévalonate pour la biosynthèse de I'IPP (Litchenthder et al., 1997). La figure
6 illustre la voie proposée par l'équipe de Lichtenthaler (1997). Ainsi, chez les végétaux
supérieurs. la biosynthèse des stérols cytoplasmiques se ferait par la voie de l'acide
mévalo nique et par une autre voie indépendante, ceiie du glycéraldéhyde phosphate/pyruvate
pour la formation de I'IPP dans les plastides.
4 + IPP
4 + IPP
Sesquiterpi X Stérols, Triterpènes
Figure 6. Schéma de la compartimentation suggérée de la biosynthèse de L'IPP et des lipides
isoprénoïdes chez les végétaux supérieurs basé sur les études de marquage au cl3. Le site
d'inhibition de la formation de stérols par la mévinoline est indiqué par une croix (Lichtenthaler
et al.. 1997).
2.1.3.6 Biotechnologie
Les connaissances actuelles de la biologie moléculaire des caroténoïdes découlent
principalement des études de ses voies de biosynthèse Eiites chez les organismes suivants: les
procaryotes photosynthétiques Rhodobacter et Synechocus, les bactéries du genre Erwinia, les
champignons Neurospora et Phycomyces et les végétaux supérieurs Zea mays (maïs),
Lycopersicum esculentum (tomate), Narcissus pseudonarcissus (narcisse) et Capsinm
annuum (poivron) (Bartley et al., 1994). Le tableau 1 présente quelques gènes impliqués dans
la biosynthèse des caroténoïdes qui ont été clonés. Les technologies de l'ADN recombinant
permettent d'augmenter la production des caroténoïdes dans les O rganisrnes qui les produisent
normalement, de favoriser la synthèse de nouveaux caroténoïdes pour des appiications
particulières et égaiement de produire des caroténoïdes chez des organismes qui n'en
produisent pas n o d e m e n t (Ausich, 1994). L'introduction d'une séquence d'ADN
recombinant contenant le gène d'une enzyme impliquée dans la biosynthèse des caroténoïdes
( C d ) a permis d'obtenir des plants de tabac résistants à certains herbicides. Un consortium de
physiologistes commandité par la Fondation Rockefeller tente de modifier le contenu en
carotène du riz sans en altérer les caractéristiques agronomiques. Cette transformation
permettrait de palier au manque en vitamine A dans la diète des populations de certains pays en
voie de développement (Bartley et Scolnik, 1995).
Des systèmes microbiens peuvent aussi servir à la production des caroténoïdes. Des organismes
CO rnme BIakesIea trispora et Phycomyces blakedeeanus, qui sont caro ténogéniques ainsi que
la levure rouge Phofla rhodoryrna ont déjà été considérés. Certaines micro-algues des genres
DunalieIZa et Haematococcus produisent de grandes quantités de caroténoïdes à l'extrérieur
des chloroplastes lorsqu'elles sont soumises à des conditions de stress (luminosité élevée,
température élevée, salinité élevé, stress minéral). Quelques bactéries sont également
considérées pour la production de caroténoïdes par fermentation et certaines, comme
Escherichia coli, sont des candidates pour l'introduction de gènes pour la biosynthèse de
caro ténoïdes qui les rendraient caroténogéniques (Britten, 1992)
2.1.3.7 Régulation de l'expression
Les premières étapes de la biosynthèse des caroténoïdes qui sont communes à celles des
terpénoïdes sont régulées par deux types de contrôle: la régulation spatiale et la régulation
temporelle au cours du développement de la plante. La biosynthèse peut être limitée à certaines
structures physiques au niveau histologique, comme c'est le cas pour certains terpénoïdes qui
sont produits et accumulés dans des structures spécialisées (McGarvey et Croteau, 1995).
Les caroténoïdes sont produits dans les chromoplastes (Bartley et Scolnik, 1995). Quant a la
localisation subceliulaire de la biosynthèse de I'IPP, il existe deux modèles, l'un suggérant que
I'IPP est synthétisé dans chacun des compartiments intracellulaires
Tableau 1. Gènes clonés codant pour des enzymes impliquées dans la biosynthèse des
caroténoïdes végétaux (Bartley et al., 1 994).
E r n e Organisme Gène Type de clone # d'accès
GGPP Fragment synt hase A. thaliana GGPS génornique L22347
GGPS 1 ADNc L258 13 C. annuum P80042
Phytoène PSY ADNc L258 12 synt hase A. haliana PSY ADNc X680 1 7
B. C. annuum PSY 1 ADNc Y0052 1 C. L. esculentum (TOM5) Mg4744
PSY 1 ADNc PSY 1 génomique X6044 1
(GTOMS) PSY2 génornique X60440
(GTOMF) PSY2 ADNc L23424
2. mays Psy ADNc ---- P hyt oène PDS ADNc L16237 désaturase A. haliana PDS ADNc X68058
B. C-annuum PDS ADNc M64704 C. G. max PDS ADNc Mg8683 D. L. esculentum PDS ADNc X59948
PDS génomique ----
dans lesquels il est utilise, l'autre proposant que I'IPP est synthétisé exclusivement dans le
cytosol et qu'il est ensuite réparti dans les autres compartiments cellulaires (McGarvey et
Croteau, 1995). Toutefois, il semble y avoir des évidences a l'effet que la biosynthèse des
caroténoïdes, incluant les premières étapes, se hse dans les plastides selon le modèle proposé
récemment par L'équipe de Lichtenthaler et collaborateurs (1997).
Au niveau de la régulation dans k temps, c'est le développement des végétaux qui contrôle la
composition qualitative et quantitative des caroténoïdes (Bart ley et al., 1 994). Ils s'accumulent
dans Ies chromoplastes des fleurs, des bits, des vieilles feuilles et de certaines racines. II existe
également une diffërence au niveau du contrôle de l'expression des gènes entre les fruts
c hc tér iques et non-climactériques. La biosynthèse dans les tissus non-photosynt hét iques est
contrôlée par des signaux développementaux qui n'ont pas encore été identifiés, alors que la
biosynthèse dans les tisdw photosynthétiques semble être sous le contrôle de signaux
environnement aux, principalement la lumière (Bartley et Sco lnik, 1 995)' mais également par le
stress photooxydatX Les chloroplastes sont les sites de synthèse des caroténoïdes qui vont
servir à la formation des complexes photosynthétiques et à l'absorption de lumière (Bartley et
al.. 1994). Les enzymes irnpiiquées dans la biosynthèse des caroténoïdes et des protéines qui
leur sont Liées sont codées par des gènes nucléaires et les protéines précurseures
correspondantes sont importées dans les plastides de façon post-traductionnelie. La
concentration finale de caroténoïdes peut être contrôlée par des mécanismes Sectant le niveau
d'enzymes et par la disponibilité des sites de liaison dans les complexes photosynthétiques.
L'induction de la formation de tels complexes induite par la lumière serait donc contrôlée aux
étapes transcriptionneiles et post-transcriptionneUes (Bartley et Scolnik, 1 995).
La réponse de la plante au stress photooxydatifcausé par la transition d'intensité lumineuse de
faible à élevée au champ se traduit par une augmentation des composants du cycle des
xanthophylles, particulièrement la zéaxanthine. Un modèle de régulation de la synthèse de la
zéaxanthine à partir de la violaxanthine a été proposé, impliquant une diminution du pH du
lumen à intensité lumineuse élevée (Demrning-Adams et Adams, 1992).
La voie de transduction de signaux au cours d'une réguiation positive ou négative de
l'expression des gènes par la photooxydation demeure inconnue, tout comme les facteurs de
régulation qui contrôlent les niveaux de caroténoïdes au cours du développement des fleurs et
des fhits (Bartley et al., 1 994).
2.1.4 Fonctions et localisation des caroténoïdes
2.1.4.1 Tissus photosynthétiques
Les caroténoïdes sont présents dans tous les tissus photosynthét iques. Ceux des plantes
supérieures contiennent généralement les caroténoïdes suivants: P-carotène, lutéine,
violaxanthine et néoxanthine (Spurgeon et Porter, 1980). Ces pigments sont localisés dans les
chloroplastes, probablement dans les grana, et peuvent être présents sous forme de
caroténoprotéines (Jones et Porter, 1 986).
Certains caroténoïdes jouent le rôle de pigments accessoires lors de la photosynthèse. Les
centres réactionnels des photosystèmes I et II sont composés de caroténoïdes, de chiorophyiles
et de diverses apoprotéines. Les caroténoïdes peuvent absorber la lumière dans la région bleue
du spectre (400 à 600 nrn). Leur poids moléculaire peu élevé leur permet d'être plus efficaces
que la chlorophylle dans l'absorption de lumière. L'énergie d'excitation absorbée est transférée
à la chlorophylle, permettant ainsi d'élargir la gamme de longueurs d'onde utilisées pour la
photosynthèse (Siefermann-Ham, 1987). Dans le complexe du photosystème II, les carotènes
sont absents, et on y retrouve seulement des xanthophylles comme la lutéine. Par contre, dans
le centre de réaction du photosystème 1, seulement le B-carotène est présent, mais iI agit de
façon similaire (Schuch et al., 1 996).
En plus de leur rôle dans la récolte d'énergie lumineuse, les caroténoïdes colorés jouent un rôle
essentiel au niveau de la photoprotection. La protection contre la photooxydation est causée
par leur capacité à absorber et transférer les électrons provenant des radicaux libres des triplets
de la chlorophylle et des singulets d'oxygène générés au cours de la photosynthèse. Ces
radicaux Libres peuvent réagir avec les lipides, les protéines et d'autres macromolécules.
causant des dommages irréparables au tissu touché (Bartley et Scolnik, 1995).
Le cycle des xanthophylies (Figure 7) jouerait un rôle important dans la photoprotection. En
condition d'excès d'énergie d'excitation, la zéaxanthine s'accumulerait à partir de la
violaxanthine au cours de deux étapes de dé-époxydation enzymatique (Demmig-Adams et
Adams. 1993). Les enzymes seraient séparées physiquement vu la différence marquée de leurs
pH optimaux et des pH à l'intérieur et à l'extérieur de la membrane des thylakoïdes (Goodwin,
Figure 7. Mécanisme proposé du cycle des xanthophyiies (Goodwin, 1 980).
2.1.4.2 Tissus non-photosynthétiques
Les chromoplastes sont des structures qui contiennent les camténoïdes responsables de la
couleur jaune, orange et rouge de certaines parties des plantes. Lorsque la chlorophylle
disparaît dans les derniers stades du développement, la fonction de photoprotection des
caroténoïdes n'est plus essentielie à la plante. Une des seules fonctions probables des
caroténoïdes à ce stade est l'attraction des insectes poUinisateurs et des animaux pour la
dispersion des semences (Bartley et Scotnik, 1995). Les caroténoïdes pourraient également
jouer un rôle au niveau de la structure du tapetum pendant le développement du poilen
(Goodwin, 1980). Les chromoplastes contiennent des structures spéciaiwes composées de
caroténoïdes, de Lipides et de protéines qui permettent de séquestrer les grandes quantités de
caro t énoïdes responsables des couleurs intenses des fleurs et des h i t s @art ley et al., 1 994).
2.1 -4.3 Atimentation et santé humaine
Les caroténoïdes sont présents dans de nombreux aliments, où ils jouent plusieurs rôIes, dont
certains essentiels à la santé. Les caroténoïdes possédant une activité provitamine A, comme le
p-carotène, sont des composants essentiels de la diète humaine. Plusieurs caroténoïdes
semblent montrer un effect protecteur contre le cancer par leurs propriétés d'antioxydantes
(Bartley et Scolnik, 1994). Une diète riche en aliments contenant une teneur élevée en
caroténoïdes est aussi associée à une réduction des risques de maladies cardiaques
(Kritchevsky, 1 999).
Certains caroténoïdes sont ajoutés aux aliments dans un but strictement visuel afin d'en ajouter,
d'en rehausser ou d'en uniformiser la couleur. Ils possèdent des qualités importantes pour
l'industrie, telles que leur origine naturelle, leurs propriétés antioxydantes, l'absence de toxicité
et leur couleur variant du jaune au rouge (Minguez-Moquera et Jaren-Galan, 1995). Le B- carotène, le P-apo-8-caroténal et la cathanxanthine sont synthétisés industriellement pour être
utilisés comme colorants alimentaires, la cathaxanthine remphçant le colorant FD & C Red No.
2 (Francis, 1985). La bixine (figure 8), constituant majeur de I'annatto qui est extrait de la
plante Bixa oreIIana, est utilisée dans i'industrie laitière pour colorer des produits comme le
beurre et le fiornage. Les caroténoïdes peuvent colorer des aliments de base lipidique tels la
margarine, le beurre et l'huile, mais également des aiiments de base aqueuse comme les
boissons et les jus de nuits, les soupes, les produits laitiers, les produits camés ou les sirops.
Dans ces cas, ils doivent être préparés de façon à les rendre dispersibles dans l'eau. Des
suspensions coiioidaies ou des microdispersions peuvent être formées. Les caroténordes
peuvent être associés à des protéines et former des caroténoprotéines qui peuvent devenu des
colorants solubles, stables et de couleur bleue, verte ou violette. Les caroténoïdes sont
également utilisés comme colorants de certaines préparations pharmaceutiques tels que les
sirops, les suppositoires et les enrobages de pilules (Britten, 1992).
Figure 8. Forme cis de la bixine.
2.2 Le safran
2.2.1 Généralités
2.2.1.1 Description de la plante
Crocus sativus est une plante vivace de ia famille des Iriduceae (Ingram, 1969). La figure 9
illustre la morphologie de la plante crocus. Eue est constituée d'un corme sous-terrain de 3 A 5
cm de diamètre et au-dessus du sol, de 6 à 9 feuilies minces ressemblant à de l'herbe et une
fleur en forme de tube long et mince composée de 6 à 8 pétales violets. Au centre de la fleur se
trouve le pistii, qui consiste en un ovaire bulbeux prolongé par une mince tige appelée style. De
couleur jaune pâle, le style se divise en trois stigmates d'un rouge orangé brillant de 2,s à 3 cm
de long. L'épice de s a h n pure est constituée des stigmates et d'une petite portion du style
séché.
2.2.1.2 Culture
Le crocus d a n est un géophyte stérile. II se propage annueiiement par le remplacement du
corme. II fleurit à l'automne peu de temps après la plantation, avant, en même temps ou après
I'apparition des feuilles. Le reste de la saison de croissance consiste en l'initiation. le
remplissage et la maturation des cormes fiiles au début de l'été (Plessner et al., 1989).
Figure 9. Morphologie du crocus.
L'Espagne est le pays qui produit le plus de s a h n et également celui de meilleure qualité. Les
autres pays exportateurs sont, en ordre d'importance de la production, l'Inde, la France,
l'Algérie et l'Italie (Ingram, 1 969).
2.2.1 -3 Culture cellulaire
La production de sah.n par des techniques de culture in viîro a permis d'induire la production
de cals rouges et globulaires et de structures rouges filamenteuses qui contiennent le pigment
jaune crocine dans des quantités inférieures a celles retrouvées daas les stigmates (Ravishankar
et Venkataraman, 1990). D'autres auteurs rapportent également la présence de faibles quantités
de crocine dans des structures ressemblant a des stigmates cultivés in vitro (Hirneno et Sano,
1987; Koyama et al., 1987).
Des cultures de cals non différenciés et de cals avec des tiges ainsi que des suspensions
celiulaires ne contenant pas le pigment crocine peuvent être produites a partir de matériel fiais
pour des besoins expérimentaux. Ces cultures sont produites en plaçant des bourgeons de
connes stérilisés en surface sur un milieu Murashige et Skoog (1962) additionné des vitamines
de More1 (1970), de 250 mgL d'hydrolysat de caséine, de 30gL de sucrose, de 2 mg/L de
kinétine, de 0,5 mg/L d'acide a-naphtalèneacétique à pH 5,8 et de 8,5 g/L de Phytagar (Gibco-
BRL). Les cultures de cals sont maintenues a l'obscurité a 25°C et repiquées aux 4 semaines
sur des d e u x fiais. Des suspensions cellulaires peuvent être produites en transférant des cals
non différenciés dans un milieu liquide sans Phytagar. Les suspensions cellulaires sont placées
sur un agitateur rotatif à une vitesse de 100 rprn à l'abri de la lumière, à 25OC et repiquées à
chaque 2 semaines (Cormier et al., 1995; Dufiesne et al., 1 997).
2.2.1.4 Utilisations
L'épice de safian (les stigmates et une petite portion du style) est la seule partie de la plante qui
semble pouvoir être utilisée. L'utilisation du sahn la plus commune est en cuisine et en
pâtisserie pour ses propriétés colorantes et aromatisantes. Il est également utilisé dans des
boissons alcoolisées et non alcoolisées. Le safian sert égaiement de colorant textile, mais de
façon moins courante (Rios et al., 1996).
Le safkm est u t W en médecine traditionnelle pour soulager les menstruations douloureuses,
les douleurs lombaires et pour soigner la dyspepsies atonique, la toux, les spasmes branchiaux,
l'asthme et les problèmes dentaires. Il est également utilisé comme excipiant dans les
préparations pharmaceutiques. Au niveau thérapeutique les constituants actifk du safhm
pourraient potentieilemnt être utilisis comme agent antitumeu, contre I'hypolipidie et au
niveau de l'augmentation de I'oxygénation des tissus (Rios et al., 1996).
2.2.2 Composition chimique
La composition des stigmates de safran séchés et purs est décrite au tableau 2. Cette
composition a été établie a h de pouvoir déterminer I'adultération du &an (Pfander et
Rychener, 1982). Le sahn contient les vitamines riboflavine et thiamine, alors que plusieurs
composés volatiles ont été détectés par exemple le safkinai, I'isophorone et six dérivés
triméthyle-cyclohexyle (Sampathu et of ., 1984). Les composés phytoène, phytofluène,
tétrahydrolycopène, p-carotène et zéaxanthine, des précurseurs possibles de la crocétine, ont
été isolés de Crocus sativus (Pfander et Schurtenberger, 1982).
Tableau 2. Composition des stigmates séchés du safran (Crocus safivus) (Pfander et Rychener,
1982).
Constituants I (%)
Matière minérale I 5-7
1
Lipides 1 5-8
Eau
Protéines l 12-13
10-12
Sucres réducteurs I 20
Pentosans I 6-7
Gommes et dextrines I 9-10
Huiles essentielles 1 0.3
Le plus important des principes amers du s h est h picrocrocine. L'hydrolyse acide de ce
glucoside permet d'obtenir le s a h d (dehydro-P-cyclocitral) et l'hydrolyse enzymatique d o ~ e
I'oxysahnol (figure 10). Ces substances sont responsables du parfum caractéristique du s a h n
(Rios et al., 1 996).
OH PICROCROCISE
b ta-glueosidrx OH- or H+ cbrleur
HO Glucose
CHO
HO CH, C II,
Figure 1 0. Conversion chimique et enzymatique de la picrocrocine en o x y ~ a n o l
et safianal (Adapté de L o m o et al., 1999).
Le matériel colorant du sahm contient des composés phannacologiquement actifs. Les
p~cipaux sont le caroténoïde a-crocétine et ses formes glucosyIées et les digentiobiosyle
(croche), diglucosyle, gentiobiosyle-glucosyle, monogentiobiosyle et monoglucosyle esters de
la crocétine. Le safian contient également d'autres caroténoïdes: la p-crocétine (monométhyle
ester), la ysrocétine (diméthyle ester), l'a-carotène, le p-carotène, le lycopène et la
zéaxant hine (Sarnpat hu et al., 1 984). L'isomère 1 3-cis-crocetine (Sperenza et al., 1 984)' de
même que le 13-cis-digentiobiosyle ester et le 13-cis-gentiobiosyle-glucosyle ester de la
crocétine (Van Calsteren et al., 1997) ont également été identifiés chez le h-
Récemment, plusieurs nouveaux constituants du sahn ont été isolés et identifiés. Straubinger
et collaborateurs (1997) ont purifié les molécules suivantes: les f3-Dglucosides de ( 4 R ) 4
hydroxy-3,5,5-triméthylcyclohex-Zenone, le (4S)4hydroxy-3,5,5-triméthyl-cyclo-hex-2-
enone et le (4S)-4-(hydroxyméthyI)-3,5,5-triméthylcycIohex-2-enone et le P-Dgentiobiosy le
ester do 2-méthyl-6-oxohepta-2,4 acide diénoïque. Un nouveau glucoside de la crocétine a
également été identifié chez le s a h n (Crocus sativus L.), le (P-gentiobiosyle) (B- nézpolitanosyle) ester de la crocétine (Pfister et al., 1996).
2.2.3 La crocétine
La crocétine est un caroténoïde a courte chaîne insoluble en milieu aqueux et soluble en milieu
alcalin. Elle possède des propriétés ami-cancer par sa structure fortement insaturée. La
crocétine peut être synthétisée par voie chimique, mais sa biosynthèse dans les tissus végétaux
n'a pas encore été élucidée.
2.2.3.1 Synthèse chimique
La synthèse chimique de la crocétine demande un matériel chimique de départ d'une grande
pureté. Quinkert et al. (1977) ont décrit deux schémas de synthèse du diméthyle ester de la
crocétine. La synthèse se fait en trois étapes, le 2-méthyle phénol ou le 4-bromo3,6-diméthyle
phénol, selon le schéma, et le (E)-1,4-dibromo-2-ène servant de matériel de départ. Le clivage
photochimique induit par la lumière du soleil p e m t les réactions de conjugaison et
d'isomérisation menant à la formation du diméthyle ester de la crocétine.
Dans un autre schéma de synthèse, le palladium sert de catalyseur (réaction de Heck) pour le
couplage d'un 6agment halogenide bivinylique central et de deux alcools tertiaires suivi d'une
déshydratation acide. Cette méthode permet d'obtenir le ficarotène, le lycopène et le diméthyle
ester de la crocétine (Bienaymé, 1994).
2.2.3.2 Synthèse biologique
Deux voies différentes ont été proposées pour la biosynthèse de la crocetine (figure 11):
1 - Une dégradation oxydative d'un caroténo'ae à quarante carbones comme la zéaxanthhe.
2- Une dimérisation de deux composés à dix carbones, comme le géranylpyrophosphate, suivie
d'une déshydrogénation et d'une oxydation.
2.2.3.2.1 Dégradation oxydative
La voie de la dégradation oxydative de la zéaxanthine en crocétine. proposée iI y a plus de
soixante ans par Kuhn et Winterstein, est appuyée par l'absence de précurseurs à 20 carbones
qui mèneraient à la voie de dimérisation. De plus, le P-carotène et la zéaxanthine. de même que
leurs précurseurs le phytoène, le phytofluène et le tétrahydrolycopène ont été isolés d'un extrait
de safian (Pfander et Schurtenberger, 1982). La dégradation oxydative de la zéaxanthine est
également supportée par la présence de deux produits de réaction, la picrocrocine et le safianal
dans le d i a n puisque la picrocrocine possède la même stéréochimie que la zéaxanthine. Par
contre, la picrocrocine et le sahnal ne semblent pas être présents chez les autres crocus
capables de synthétiser la crocétine (Dufiesne, 1998; communication personnelle). Les P-D- glucosides de (4R)-4-hydroxy-3,5,5-triméthylcyclohex-2-enone, (4s)-4-hydroxy-3,5,5-
t rirnét hylcyclohex-2-enone et (4R)-4-(hydroxymét hyI)-3,5,Strimét hylcyclo hex-2-enone
retrouvés dans le safhn par Straubinger et cokborateurs (1 997) pourraient provenir du clivage
oxydatifde la c M e de la zéaxanthine sur la double liaison en position 7'8 et 7',8'. L'enzyme
hypothétique cataiysant ce clivage serait la 7,s-caroténase. Le clivage oxydatif de la
zéaxanthine à ces positions mènerait au 8,8'-diapocarotendiale qui devrait à son tour être oxydé
pour former la crocétine (Figure 1 1).
L'absence de précurseurs C20 ainsi que de y-carotène ou de lycopène dans i'extrait de safkn
utilisé par Pfander et Schurtenberger (1982) pourrait être causée par l'âge et l'origine de
l'échantillon La dimérisation de deux géranylpyropbosphates en digéranyle subie de la
désaturation entre les carbones 4 et 5, 8 et 9, et 12 et 13 puis de l'oxydation des groupements
méthyles terminaux en intermédiaires dihydroxy de la crocétine et Wement en intermédiaires
aldéhydes pourrait être nmilaire à la réaction décrite pour la biosynthèse des carotémïdes
t rit erpénoïdes chez Strepiococcw faecium et SiaphyZococcus aureus (Davies et Taylor, 1 982).
OHC
Figure 1 1. Voie possible de la formation de la crocétine (Adapté de Pfander et Schurtenberger.
1982).
2.2.4 Giycosides de ia crocétine
Divers glycosyle esters de la crocétine (acide 8,8'-diapocarotène-8,8'-dicarboxylique) ont été
isolés des stigmates de saf ian (Crocus sutius L.) et identifiés par des méthodes
spectroxopiques. La figure 12 présente ces différents giycosyle esters. Tout-tram-croche, le
di@-D-gentiobiosyle) ester de la crocétine lc, est le pigment majeur des stigmates du Aian et
des f i t s de Gardenia jasminoides. Tout-~ns-f3-D-gentiobiosyle-~-D-glucosyk ester de la
crocétine 1 d, tout-hansdi(f3-D-glucosyle) ester de la crocétine le, tout-irans-mono(f3-D-
gentiobiosyle) ester de la crocétine If et tout-trans- mono(P-D-glucosyle) ester de la crocétine
l g ont également été identifiés chez ces deux plantes (Van Calsteren et al., 1997; Sperenza et
al., 1984; Pfmder et Wittwer, 1975). Les isomères 13-cis de la crocine 2c et du P-D-
gentiobiosyle-P-0-glucosyle ester de la crocétine ont également été identifiés (Van Calsteren et
al., 1997; Sperenza et al., 1984). Dew nouveaux glycosyle esters de la crocétine ont été
découverts chez le crocus de jardin (Crocus vemus L.). Ces glycosides possèdent un
t risacc haride rare, le néapolitanose (O-P-D-gluco pyranosyle-( 1 +2)-O-[(3-D-gluco pyranosyle-
(1 +6)]-D-glucose (Figure 12) (Ryechener et al., 1984). Un pigment mineur du s a f h a été
isolé et identifié comme étant le (3-D-néapolitanosyle-f3-D-gentiobiosyle ester de la crocétine 1 b
(Pfister et al., 1996). La voie de biosynthèse des glycosides de la crocétine n'a pas encore été
identifiée, mais une hypothèse a été proposée. Pour ce qui est de la synthèse par voie chimique
de ces glycosides, elle se fait diflicilement et demande des molécules de départ d'une grande
pureté.
2.2.4.1 Synthèse chimique
La glucosylation se fait difficilement par voie chimique. Toutefois, Pfander et Wittwer (1979)
rapportent ia synthèse du di-(B-D-glucosyle) ester de la crocétine suite a la réaction du di-
imidazolide de la crocétine ou du di-(1,2,4-triamiide) de la crocétine avec le P-D-glucose dans
la pyridine en présence d'une base. L'estérification du sucre se fait exclusivement au carbone
anornérique avec production du f3-anomère.
La synthèse chimique de la crocine n'a pas été rapportée jusqu'à maintenant.
2.2.4.2 Bioconversion
Les suspensions cellulaires de &?an sont capables de convertir la crocétine en plusieurs
glycosyle esters quand I'aglycone est ajoutée a la culture sous forme encapsuléc ( Dueesne et
a RI=FU= k t a - D acapditanosyîe b R I , R2= kt.-û-acrpditaaasylc, beta-D-geatiobiosyk e RI=IU= bcta-ü-gcatiobiosyie d R I , R2= kt.-D-geatiobiasyk, kt.-D-glucosyle
RI=== kt.-D-glacosyle f R I , RT= k t r - ~ a t i o b i o s y î e , H g R I , R2= kt.-û-glucosyîe, H b RI=R2=H
:igue 12. Structure chimique de la crocétine et de ses glycosyles esters retrouvés dans le
safian. la dinéapolitanosyle ester, 1 b néapolitanosyle-gentiobiosyle ester. l e crocine ou
digentiobiosyle ester, Id gentiobiosyle-glucosyle ester, le diglucosyle ester, 1 f
monogentiobiosyle ester, lg monoglucosyle ester, 1 b crocétine, 2 13-cis-crocétine (Adapté de
Van Calsteren et al., 1997).
al., 1999). Le pigment majeur obtenu par la bioconversion a été identifié comme le
dinéapolitanosyle ester de la crocétine (figure 1 2 1 a). Les néapolitanosy le, gentio biosyle et
glucosyle esters de la crocétine ont également été formés. Ces pigments glycosylés sont
entreposés dans la vacuole. La croissance cellulaire n'est pas affectée jusqu'à une concentration
de 30 mg/mL de crocétine ajoutée au milieu. La capacité de bioconversion de la culture était la
plus élevée à la fin de ta phase exponentielle. La culture pouvait former jusqu'à 9 mg/g (base
sèche) de glycosyle esters de la crocétine avec 30 mg de substrat par 100 mL de culture.
L'activité des glucosyltransferases était augmentée par l'ajout de glucose et de 2,4-acide
dichlorophénoxy-acétique a une culture agée de 12 jours, sans augmentation de l'efficacité de
bioconversion.
2.3 Glycosyl transférase
2.3.1 Définition
Les giycosyltransfërases font partie de la classe des enzymes catalysant le transfert de groupes
glycosyles (substrats donneurs) vers un substrat accepteur (figure 13). Le substrat accepteur
peut être un autre résidu glycosyle, un polypeptide ou un lipide selon la spécificité de l'enzyme.
Le substrat donneur est un nucléotide-sucre. La partie nucléotidique est habitueliement un
diphosphonucléoside. L'uridine diphosphate (UDP) est le nucléotide du substrat donneur de
glucose, de galactose, de N-acétylgtucosamine, de N-acétylgalactosamine, de xylose et d'acide
glucuronique le plus efficace (Beyer et al., 1 98 1 ).
S u c r e n u c l i o l i d c
transfdrisc e R-O H R-O-sucre - n ucICoride
p lycos idase a sucre
Figure 1 3. Synthèse et hydrolyse des glycosides végétaux (Hosel 19% 1 ).
Les hexosyltransférases (EC 2.4.L) sont une sous-classe des glycosyltransférases. La
subdivision se fàit sebn la nature du sucre qui est transféré au substrat accepteur
(Nomenclature Cornmittee of the International Union of Biochemistry, 1984). En générai, les
réactions de transglycosylation peuvent être catalysées par des enzymes de la classe des
transférases (E.C. 2.4.-) et des glycosidases (E.C. 3.2.9). Dans ce dernier cas, l'eau serait le
substrat accepteur. Comme toutes les réactions biosynthétiques impliquant des métabolites
secondaires étudiées jusqu'ici sont catalysées par des transférases utilisant un nucléotide-sucre,
les glycosidases peuvent être considérées comme responsables de l'hydrolyse des glycosides.
Toutefois, un cas de glucosyltransfërases catalysant l'hydroiyse de glycosides a été rapporté
(Hosel, 1981). Une activité glucosyltransférase réversible a été observée dans des cultures
cellulaires de persil (Sutter et Grisebach, 1975).
Le lien glycosidique peut se faire entre un sucre et l'atome d'oxygène, de carbone, d'azote ou
de soufie des différents aglycones (Hosel, 1981). De plus le Lien entre l'atome d'oxygène du
substrat accepteur et le sucre peut être un ester ou un éther (Nomenclature Cornmittee of the
International Union of Biochemistry, 1984).
2.3.2 Spécificité
Les glycosyltransférases d'origine animale et végétale different par leur degré de spécificité.
Celles d'origine animale possèdent un degré de spécificité remarquable vis-à-vis du substrat
accepteur et au moins une transférase semble être nécessaire pour la synthèse de chaque Lien
glycosidique retrouvé dans la nature (Beyer et al., 198 1 ). La spéciIicité des glycosyltransférases
de plantes par rapport au substrat accepteur est par contre beaucoup plus large. Plusieurs
études montrent que les glycosyltransférases végétales sont spécifiques à une classe de
molécules ou un site de liaison plutôt qu'a une molécule en particulier (Hosel, 1981).
Une galactosy lt ransférase impliquée dans la biosynthèse du mo nogalactoside de la tomat idine
dans les feuiiles de tomate peut glycosyler une gamme étendue de stéroïdes hydroxylés en
position 3 (Zimowski, 1998). Shibata et al. (1995) ont purifié des glucosyltransférases qui
catalysaient la glycosylation de steviol et de glycosides de stéviol et ont montré que ces
enzymes utilisaient certains flavonols de tàçon aussi efficace. Une glucosyltransférase purifiée
de Chrysosplenium umericanurn serait responsable de l'attaque des positions 2' ou 5' de
flavonols partiellement méthylés (Latchinian et al., 1987). Les glycosyltransférases spécifiques
aux flavonoïdes sont très spécifiques quant à la position du groupement hydroxyle sur lequel le
sucre est transféré (Hosel, 1981). Deux glucosyltransférases agissant dans la régulation de la
composition en acides gras des triacylglucoses chez la tomate montrent des spécificités
différentes concernant la longueur de la chaine d'acide gras. L'une est plus spécifique pour les
chaînes courtes (4:O) et l'autre pour les chaînes de longueur moyenne (8:O et 12:O) (Kuai er al.,
1997). Par contre, I'UDP-g1ucose:acide salicylique glucosyltransférase purinée des racines
d'avoine est l'un des rares exemples de haute spécificité envers le substrat accepteur, l'acide
salicylique (Yalpani et al., 1 992).
La spécificité des glycosylttansférases en regard du nucléotide indique que les dérivés UDP
sont utiiisés le plus efficacement. Leur spécificité par rapport au sucre transfiré semble
également être très élevée (Hosel, 1 98 1 ).
2.3.3 Rôles
Plusieurs métabolites secondaires des végétaux sont accumulés et entreposés sous forme de
glycosides. Les produits glycosylés sont souvent considérés comme des produits
d'accumulation ou comme une forme physiologique inactive, leur hydrolyse iibèrant par la suite
des aglycones physiologiquement actik La glycosylation amène deux changements majeurs au
niveau de l'aglycow: elle rend la molécule plus soluble dans l'eau et diminue sa réactivité
chimique (Hosel, 1981).
Les rôles joués par les glycosyltransférases végétales sont nombreux. Elles peuvent agir au
niveau de la régulation de la quantité relative d'hormones de croissance, telles que l'acide
abscissique et l'acide indole-3-acét que, sous forme libre ou estérifiée (Zeevaart et Creelman,
1988). La réversibilité de la glucosylation-déglucosylation des stérols membranaires aurait un
effet régulateur sur les fonctions et l'organisation des membranes celiulaires végétales
(Wojiechowski, 1983). Les glucosyltransférases sont également impliquées dans la
détoxincation de xénobiotiques comme les herbicides (Yalpani et al., 1992) alors que certains
glycosides serviraient de défense contre les insectes et seraient toxiques pour les humains et les
animaux (Zimo wski, 1 998). Les glycosyltransférases catalysent la format ion des glycoprotéines,
des glycolipides et des polysaccharides (Waish, 1979). Elles participent également à la
biosynthèse des nombreux glycosides phénoliques, particulièrement des flavonoTdes, une
fonction souvent étudiée (Hosel, 198 1 ; Cormier, 1997).
2.3.4 Purification
Les glycosyltransférases sont présentes en faibles quantités dans les tissus animaux et sont liées
aux membranes intracellulaires. Des méthodes spéciales de solubitisation et de purification
doivent donc être utilisées (Beyer et al., 1981). Par contre. la plupart des glycosyltransférases
végétales sont cytosoliques. Il existe cependant quelques exemples de glycosyItransférases
végétales associées aux membranes. Des glucosyltransférases spécitiques aux stéroïdes ont été
purifiées chez Asparagus plurnosus (Paczkowski et al., 1990) et chez Solanum ruberosim
(S tapleton et al., 199 1 ; Zimowski, 1992). Wojciechowski ( 1983) indique que les
glycosyltransférases catalysant la glycosylation des stérols sont fortement liées aux membranes
et solubilisées à l'aide de détergents comme le Triton X-100 ou le déoxycholate et qu'eues
peuvent être partiellement purifiées a t'aide de techniques usuelles teiles la filtration sur gel,
l'échange ionique ou l'électrophorèse. Ces techniques sont également couramment utilisées
pour la purifkat ion des glycosyltransférases c ytosoliques. La chromatographie d'*té a été
utilisée comme méthode rapide de séparation de deux glucosyitransférases catalysant la
glucosylat ion de flavonoïdes. Des colonnes d'agarose avec I'UDP-acide giucuronique et le
colorant Brown40 comme ligands d'afhité ont permis la séparation de glucosyltransférases
extraites de Crysosplenium arnericanum (Latchinian et al., 1 987). De teiles réactions d'affinité
ont également été utiüsées pour la séparation des glucosyltransférases impliquées dans la
production des glycosides du sophoroside acide hydroxydocosanoïque (Breit haupt et L ight,
1982).
Le tableau 3 donne quelques exemples de glycosyltransférases qui ont été purifiées ainsi que
leurs caractéristiques. Hase1 (1981) et Cormier (1997) ont passé en revue la glycosylation des
phénols, des phénylpropanes, des flavonoïdes et des anthocyanes. La réaction catalysée par ces
glycosyltransférases est la formation d'un lien éther entre la partie glucide du nucléotide-sucre
et le groupement hydroxyle du composé phénolique ou du fiavonoïde étudié. Peu d'études ont
été réalisées sur les glycosyltransférases catalysant i'additioa du sucre par estérification de la
fonction carboxylique du substrat accepteur.
2.3.5 Gtucosyltransférases cataiysant h glucosyhtion de la fonction carbo~lique
Deux glucosyltmférases (Gtase 1 et IIB) agissant sur le stéviol et ses glycosides ont été
purifiées d'un extrait de feuiiles de Stevia reborudiuna Bertoni. La Gtase IIB agit à la fois sur
les fonctions hydroxyles et carboxyles du stéviol (Shibata et al., 1995); les caractéristiques de
ces enzymes sont données au tableau 3.
L'enzyme UDP-glucose:indole-3 acide acétique glucosyltransférase a été purifiée partiellement
à partir de grains de ma& sucré selon plusieurs méthodes: précipitation au polyéthylène glycol,
chromatographies d'échange anionique, de fiitration sur gel d'affinité à 1'üDP-acide
glucuronique et chromatofocusing. L'enzyme est un monomère de 46.5 kD, son point
isoélectrique se situe à pH 5.5 et elle possède une activité optimale à des pH de 7.3 a 7.6
(Leznicki et Bandurski, 1988).
Les UDP-g1ucose:acide gras glucosyltransférases catalysent l'activation par I'UDP-glucose des
acides gras pour former des 1-O-acyl-P-glucoses. Dew de ces glucosyltransférases ont été
séparées et partiellement purifiées à partir de f e de Lycopersicum pennellii (LA1 376) par
précipitation au polyéthylène glycol suivie d'étapes chromatographiques sur les colonnes
DEAE-Sepharose et Cihcron Blue 3GA-agarose. Les deux enzymes sont des monomères de
47 kD et montrent des spécificités différentes en regard de la longueur de la chaîne de l'acide
gras (Kuai el al., 1997).
Tiüblcau 3. Liste et caractéristiques de quelques glycosylt ransfiérases.
Source 1 Groupe 1 Spécificit6 (référence) Vitis vinifera
cell suspension (Do et el,, 1 995)
Alfalfa
I - (~eah et al., 1992) - 1 6-hvdroxvbentazone 1
Q ~ U C O ~ Y ~ ~
hydroxyle
(Parry et Edwards, 1994) Glycine max
hydroxyle
UDPG
Accepteur cyanidine, delphinidine
hydroxyle
Papaya fruit (Keil et Schreier, 1989)
m I 1
Sdanum tubemsum 1 hydroxyle 1 solanidine 1 UDPG
Donneur UDPG
pelargonidine, poenidine rnalvidine
Quercetine>coumestrole>
hydroxyle
(1.2 mM)
UDPG medicarpin~fomononetin
Kaempferol UDP- al UDPG
(Stapleton et al., 1991) Brassice napus L.
seedlings(Reed et el,, 1993)
Florets de chou-fleur (Grootwassink et al., 1994)
Arabidopsis thaliana
S
(Guo et Poulton, 1994) 3at roats (Yalpani et el., 1992)
. - . - - . . - . --. - - - -, I I 1
Sdsnum tuberosum 1 hydroxyle 1 sitosterol 1 UDPG
S groupes
sulfhydryles
Lithospemum erythmrhimn (Bechthdd et al., 1 991)
Avena sative NVamecke et Heine. 19941
Sodium 2-phenylacete thiohydroximate(0.05
mMI
essentiels hydroxyle
UDPG (0.46 mM)
thiohydroximate
thiohydroximate
hydroxyle
hydroxyle
(Zimowski, 1992) 1 Stevie rebeudi8ne 8. 11- hydroxyle
Poids moléculaire pH I I pl
UDPG
UDPG
acide salicylique
(Shibata et al., 1995)
Candida bogoriensis (Breithaupt et Light, 1982)
qwrcetine, 1 56 1 8,O 1 4.55
UDPG p-hydroxybenzoate
&&OIS
solanidine steviol, steviolmonoside,
UDPG
UDPG
UDPG UDPG
I IR carboxyle, hydroxyle hydroxyle
1
1 entre 55.5 et 57.8 1 1 4.8 et
sels
UDP HgC12,H2(CN)
2
I 1 1
UDP. UTP 1 50 1 5.5 1 5
quercet ine, kaem pferol steviol, steviolmonoside, steviol bioside, stevioside quercetine, kaempferot
acide hydroxydocosanoique
47
44.6 53 (sous-unit4 de 28)
entre 56 et 61
UDPG
UDPG
UDP
9
6.3 7.5
4.6 et 5.3
56
2 forme3 4.6-4.7
7.5
Les glucosyltransférases impliquées dans la synthèse de k croche n'ont pas été purifiées
jusqu'à présent. Toutefois, Dufiesne et al. (1997) rapportent quelques paramètres associés à
ces enzymes et aux réactions qu'elles catalysent:
-Un extrait enzymatique peut être préparé en homogénéisant trois fois pendant 30 secondes 1 g
de cals de &an broyés et lyophilysés avec 10 mL de tampon Tris-HCI 200 m . , pH 73,
contenant 10 mM de polyéthylène glycol 3400, 20 rnM de diéthyldithiocatbamate de sodium et
14 m . de P-mercaptoéthanol. Le mélange est ensuite incubé pendant 20 minutes avec agitation
constant à 4°C et centrifùgé 30 minutes a 37 800 x g toujours à 4OC. Le surnageant est désalé
(PD 1 O) et l'extrait enzymatique se retrouve dans un tampon Tris-HC1 100 rnM, pH 7,4.
-Le pH optimal de la réaction de glucosylation de la crocétine par un extrait enzymatique de
cals de safian se situe entre 7'0 et 7,6. L'activité n'a pu être mesurée à un pH inférieur à 7.0
parce que la crocétine n'était pas complètement soluble dans le milieu réactionel sous cette
valeur.
-L'UDP est de loin le meilleur nucléotide donneur de glucose, comparé au TDP alors que
I'ADP en présence de la crocétine et de l'extrait enzymatique de cals de &an ne mène à la
formation d'aucun produit.
-Quand l'extrait enzymatique est incubé en absence de crocétine et en présence d'un excès
d0UDP-glucose, I'UDP-gentiobiose n'est pas formé, indiquant que I'UDP-gentiobiose n'est pas
formé avant la glucosylation de la crocétine et que les unités de glucose sont attachées au
substrat les unes après les autres.
2.3.5.2 Hypothèse de la voie de biosynthèse des glycosides de la crocétine
La synthèse in vitro des glucosyle esters peut être faite par des extraits de cais de Crocus
satiws. La tout-pans-crocétine est glucosylée suite à l'addition séquentielle d'unités glucose de
l'uridine-diphosphoglucose (UDP-glucose). La figure 14 présente le pronl HPLC et
l'identification des différents glycosyles obtenus. Ainsi l'incubation d'un extrait de cal
25 30
Temps (min)
Figure 14. Profil HPLC et identincation des pics des produits de glucosylation après 150
minutes d'incubation du mélange de crocétine et d'UDP-glucose avec un extrait de cals de
safran. a croche, b gentiobiosyle-glucosyle ester, c diplucosyle ester, f monogentiobiosyle
ester, h monoglucosyle ester et I crocétine. d, e, g, i, j. k et m sont les dérivés cis de la
crocétine et de ses glycosylse esters (Adapté de Dueesne et al., 1997).
en présence de la crocétine encapsulée et d'UDP-glucose mène à la formation du
monoglucosyle ester, du monogentiobiosyle ester, du diglucosyle ester, du glucosyle-
gentiobiosyle ester et finalement du digentiobiosyle ester, la croche, après 2, 6, 20. 30 et 70
minutes respectivement (Dufiesne et al., 1997). L'encapsulation de Ia crocétine à l'aide du
maltosyle-B-cyclodextrine permet de solubiüiser le substrat et d'éviter l'utilisation du diméthyle
sulfoxyde qui est plus couramment utiiisé, mais qui a un effet inhibiteur sur la glucosylation
(Connier et al., 1995).
Une voie de biosynthèse en plusieurs étapes pour les glycosides de la crocétine a été proposée
(Dufiesne et al., 1997). Deux glucosy1transférases distinctes seraient impliquées dans la
formation des glucosyles et gentio biosyles esters de crocétine- Une enzyme, la GTASE 1, serait
responsable de l'addition d'une unité glucose aux groupements carboxyliques terminaux de la
molécule de crocétine. L'autre enzyme, la GTASE2, catalyserait i'addition 1-6 de glucose aux
groupes glucosyle esters avec formation des gentiobiosyle esters. La GTASEl et la GTASE2
participeraient toutes deux à la formation du glucosyle-gentiobiosyle ester de la crocétine. La
figure 14 résume la voie proposée. Les structures des glycosyles esters ont été présentées à la
figure 12.
diglucosy le ITI
I ester I
Figure 15. Voie proposée pour la biosynthèse par l'addition en plusieurs étapes de molécules de
glucose à la molécule de crocétine par un extrait de cals de safian. La GTASEl est la
glucosyltransférase responsable de l'addition de glucose aux groupements carboxyles terminaux
et la GTASE2 aux groupes glucosyle ester (Adapté de Dufiesne et al., 1997).
2.4 Problématique et objectifs
Les connaissances concernant les glucosyltransférases impliquées dans la synthèse de la crocine
sont limitées aux travaux de Dufiesne et coihborateurs (1997). II existe également peu de
travaux rapportant la purification de glucosyltransférases végétales catalysant la formation de
liens esters comme ceux catalysés par le GTASE 1.
A h de mieux connaître les eozymes impliquées dans la glucosylation de la crocetine en crocine
et de vériner l'hypothèse posée par Dufksne et coüaborateurs (1997), nous avons puriné
partiellement ces enzymes à partir d'un extrait d'une suspension cellulaire de shn. Cette
purification nous a permis de détenniwr certaines caractéristiques de la GTASEl. La
comaissance du poids moléculaire, du point isoélectrique, du pH optimal et de la température
optimale a permis de mieux co-tre cette enzyme et de faciliter la mise au point d'un
protocole de purification permettant la reparation des GTASEl et GTASE2. L'hypothèse de
Dufiesne et coilaborateurs (1997) a donc pu être vérifiée et confirmée.
Les glucosyItransférases végétales sont généralement reconnues comme ayant des spécificités
de substrat variables (Hosel, 1 98 1 ). Nous avons vérifié la spécificité de substrat de la GTASE 1
a h de déterminer si elle pouvait glucosyler d'autres substrats ayant un intérêt médical ou une
similarité de structure avec la crocétine. Cette enzyme s'est révélée être hautement spécifque
contrairement à la plupart des glucosyltransférases d'origine végétale purifiées jusqu'à
maintenant.
Les chapitres III et IV sont consacrés à la purification et à la caractérisation de la GTASE 1.
CHAPITRE III
PROPERTIES OF A GLUCOSYLTRANSFERASE fNVOLVED IN CROCIN
SYNTHESIS
(PROPRIÉTÉS D'UNE GLUCOSYLTRANSFÉRASE IMPLIQUÉE DANS LA
SYNTHÈSE DE LA CROCINE)
Properties of a glucosyltmnsferase invotved in crocin synthesis
France côté", François ormier*'', Christiane ~ufkesne' and Claude ~dlemot'
I Food Research and Development Center, Agriculture and Agi-Food Canada, 3600 Casavant
Blvd. West, St. Hyacinthe (Qc), Canada J2S 8E3
'~orticulture Research Centre. Department of Plant Science, Laval University, Ste. Foy (Qc).
Canada G I K 7P4
3 Present address: Colarôme Inc., Corby Building, 950 chemin des Moulins, Montreal (Qc),
Canada H3C 3 W5
*Corresponding author
Nous décrivons les propriétés de 1'UDP-glucose:crocétine 8,8'-glucosyltransférase (EC 2.4.1 .-)
partiellement purifiée et impliquée dans la synthèse de la croche. Cette enzyme participe à la
biosynthèse de la croche en formant des liens esters entre les groupes carboxyliques terminaux
de la crocétine et la partie glucose de I'UDP-glucose. L'enzyme a été purifiée 125 fois par
précipitation a l'acétone, chromatographies d'échange anionique et filtration sur gel. Le poids
moléculaire natif est approximativement de 47 kD, tel qu'estimé par fltration sur gel
analytique. La préparation la plus purifiée contient des isoformes entre les pH 4.4 et 4.8, tel que
déterminé par I'IEF. L'enzyme possède une activité maximale a 40°C et des valeurs de Km
apparents pour I'UDP-glucose et la crocétine de 0.72 rnM et 0.17 mM respectivement, ainsi
qu'une valeur Vmax de 30 pkatdmg.
ABSTRACT
The properties of a partially purified UDP-glucose:crocetin 8,8-glucosyltransferase (EC 2.4.1 .-)
involved in crocin synthesis are descnid. ïhe enzyme participates in the biosynthesis of crocin
by forming ester bonds between the carboxyl groups of crocetin and the glucose moiety of
UDP-glucose. The enzyme has been purified 125-fold through a multi-step process of acetone
fiact ionat ion, anion-exc hange, and gel mtrat ion chromatography. The native mo lecular weight
is in the range of 47 kD, as estimated by analyticai gel fïitration. The most purified preparation
showed isoforms between pH 4.4 and 4.8 when resolved by IEF. The enzyme had maximal
activity at 40°C, apparent Km values for UDP-glucose and crocetin of 0.72 mM and 0.17 rnM,
respectively, and a Vmax of 30 pkatdmg.
Keywords
SaBon, Crocus sativus, glucosy ltransferase, crocet in, g lycosylation, caro tenoids.
3.1 Introduction
Crocus su~ivus stigmata contain unusuai carotenoid glycosides which have a strong coloring
potential. These yeilow pigments consist of glucosyl and gentiobiosyl esters of crocetin, a 20
carbon carotenoid [1,2] (Fig. 1). The major pigment, crocin, contains two gentiobiose units
iinked to the t e n d carboxylic k t i o n s , which confer its high water solubility.
The high coloring strengch and the water solubility of crocetin glycosides make them good
candidates for applications in foods and pharmaceuticais. The glycosylation potential of d û o n
celi cultures toward crocetin has been demonstrated in cell-fiee extracts and in living ce& [3,4].
Exogenously-added crocetin encapsulated in maltosyl-B-cyclodextrin is taken up by the celis,
glycosylated and stored in vacuoles [4].
Plant glucosyltransferases are found in rnany dBerent sources. They generaiiy do not share
common characteristics and most are not specific for one single substrate or reaction [5,6].
Glucosyltransferase activity for the formation of crocetin glucosyl and gentiobiosyl esters is
present in different parts of sprouting c o r n of &on and in calius culture but the enzymes
have neither been purified nor characterized. Glucosylation of crocetin into crocin is sequential
and may involve two distinct glucosyltransferases; one f o r h g ester bonds between crocet in
carboxyl groups and glucose rnoieties and the other catalyzing the format ion of glucosidic
bonds with the glucosy1 ester fùnctions at both ends of the molecule (31.
In order to better understand the glucosylation process in safion celi suspensions, a
glucosyltransferase involved in crocet in glucosides format ion was part ially purified for the fht
tirne. The present results are the fïrst report on the properties of a UDP-glucose:crocetin 8,8'-
g lucosyltransferase involved in the glucosylat ion of crocet in.
H O RI R2 Crocetia and i lvcaides HO H H craetin
kta-D-Gle H Glc moaoglucasyl ester C lc G le diglucosyl ester H geatiobiose moaogeotiobiosyl ester
Clc gentiobiose geotiobiayl-glucayl ester geatiobiose geatiobiose crocia
H O
HO H O
beta-D-gentiobiose
Fig. 1 Structure of crocetin and its glycosides
3.2 Materials and methods
3.2.1 Chernicals and reagents
Uridine-5'-diphosphoglucose (UDP-glucose) disodium salt, crocetin pyridine salt, reactive dye
ligand test kit consist ing of pre-packed 2.5 mL colurnns and uridine-5'-diphosphoglucuronic
acid cross-linked 4% beded agarose (UDP-glucuronic acid) were purchased fiom Sigma
C hemical Co. (St-Louis, Mo). Maltosyl-B-cyclodextrin was f?om Ensuiko Sugar Refining Co.
Ltd (Tokyo, Japan). Molecular weight and isoelectric markers, Ampholine PAGEplate gels (pH
4.0-6.5), PD1 O columns, Mono Q HR Y 5 colurnn and Superdex 200 prep grade gel were Eom
Pharmacia (Uppsala, Sweden). The Ci* Spherisorb-ODS2 10 pm column was purchased from
CSC (Montreai, Qc, Canada). All chemicais were analytical reagent grade.
3.2.2 Cell culture
Safion (Crocus sativus) cell suspension cultures were produced fkom weli established ceil h e s
[3]. The ceil suspension cultures were grown in Murashige and Skoog medium [7]
supplemented with More1 vitam* [8], 30 g/L sucrose, and 0.5 mg/L a-naphtaleneacetic acid
at pH 5.8. Ten-day-old cells were harvested by filtration and washed with deionized water prior
to l y o p b t i o n .
3.2.3 Extraction and purification of the UDP-glucose:crocetin 8,8'-
glucosyltransferase
The following buEers were used: A, 200 mM Tris-HCl (pH 7.4); B, 100 mM Tris-HCl pH 7.4;
C, 5 mM Bis-Tris pH 6.0; D, 20 rnM Bis-Tris pH 6.0; E, 20 mM Bis-Tris pH 6.0 + 1.0 M NaCl; F, 100 mM Tris-HC1 pH 9.0 + 1.5 M NaCl; C9 0.75M Bis-Tris propane pH 7.1. Ail
buffen used in chrornatography were filtered through a 0.45 Pm nher and degassed before use.
3.2.3.2 Extraction
Fresh c e k were fiozen in Liquid nitrogen and lyophilized. Dried ceUs were pooled, ground and,
stored at room temperature away fiom Lght and hurnidity. AU procedures for extraction and
purification were carried out at 4OC or on ice. For enzyme extraction, each gram of ground
lyophilized cells was mixed with 10 mM polyethylene glycol 3 400 and 10 mM
rthylenediarninetetraacetic acid in 15 mL of extraction buffer A. After 30 min of incubation
with continuous stirring, the mixture was centrifùged at 10,000 g for 30 min. The supernatant
was tiltered on Miracloth (Interrience, Markham, Ont, Canada) and passed thrcugh PDlO
columns (Sephadex G-25, Phamÿicia, Uppsala, Sweden) equilibrated beforehand with buffer B.
Proteins were precipitated with 20% (v/v) acetone at -10°C. The resulting pellet was
resuspended in buffer C and concentrated using a rotary vacuum evaporator foilowed by
ultrafiltration with a Mini-ultrasette unit (exclusion lirnit 30 kDa) (Filtron, Northborough, MA);
the buffer was replaced by bufler D using PDlO columns. Glycerol was added to the
concentrated enzyme extract at this and the following steps of purification to a final
concentration of 10%.
3 .2.3.3 Ion exchange chromatography
The concentrated enzyme extract wit h glucosy ltransferase act ivity was subjected to anion-
exchange chromatography on a Mono Q column using the APPS system (Waters, Mississauga,
Ont, Canada). The column was equili'brated with buffer D and 2.5 mL aiiquots of concentrated
extract containhg 3 - 3.5 mg of protein were injected ont0 the column m e r washing the
column with 10 mL of buffer D, the enzymes were eluted with a linear gradient of NaCl (O - 500 mM) with b a e r E at 1 mC/& C o k t e d hctions of eluent (2.5 mL) were immediately
desalted using PD10 columns equili'brated beforehd with b a e r A and glucosyltransferase
act ivity was tested in each hction. Fractions with glucosyltransferase act ivity of several
chromatographie nins were pooled, concentrated by u l t d ï h t i o n using the Mini-ultrasette and
assayed for protein and enzyme activity (see below).
3.2.3 -4 Gel penneation
Gel filtration chromatography on Superdex 200 prep grade column (2.6 cm X 56.5 cm) was
perfonned using the APPS System (Waters). Aliquots of 2.5 mL (0.5 - 1.5 mg of protein) of
concentrated enzyme Eom ion exchange chromatography were injected ont0 the column and
eluted with buffer A at a flow rate of 2.5 rnL/rnin. The three most active fiactions of each run
were pooled, concentrated using a Macrosep centrifuga1 concentrator (exclusion Limit 30 kDa)
(Filtron. Northborough, MA). and assayed for protein and glucosyltransferase activity.
The substrate, crocetin, was encapsulated in maltosyl-B-cyclodexttin as described by Cormier et
al [9]. Optimal conditions for enzyme activity were determined. The standard reaction mixture
consisted of 150 pL buffer G, 1 mM crocetin, 2.5 m M UDP-glucose (1 0 mM for the kinetic
study) and 50 pL (100 PL for the pdca t ion table) enzyme extract (10-15 pg protein), in a
final volume of 400 ML. The reaction was initiated by adding enzyme extract. The reaction
velocity was linear with tirne for at least 90 min. The mixtures were incubated for 60 min at
40°C. The reaction was stopped by adding 400 pL ethanol. Samples were nui in duplicate. The
reac t ion products of crocet in glucosylation were separated and quant i!ïed by reverse-phase
HPLC @eckman, San &unun, CA) on an 0DS2 ( C i g ) column eluting with a linear gradient
fiom 1% (v/v) acetic acid in water to 100% methanol (HPLC grade), at a 1 mL/min flow rate
and monitoring at 440 nrn [8]. Peaks were integrated for quantitative determination of crocetin
monoglucosy1 ester production. Reaction products were identined by cornparison with
previously identsed ones [IO]. Enzyme activity was defined as pmole of crocetin monoglucosyl
ester produced per s (pkatal) under the assay conditions.
3.2.3 -6 fbGlucosidase assay
The B-glucosidase activity was determined according to a rnethod based on those of Dekker
[ I l ] and Bergmeyer et al [12]. One hundred pL of the enzyme extract was mixed with 900 pL
of 2 mM 4-nitrophenol-P-D-glucopyranoside in water and incubated at 50°C for 10 min. The
reaction was stopped on ice by adding 4 mL of 0.25 M sodium bicarbonate. The amount of 4-
nitrophenol (PNP) formed was rnonitored at 401 nm. One unit (U) of P-glucosidase is defined
as the amount of enzyme required to produce 1 pmole of PNP per Mnute at 50°C.
3.2.3.7 Protein assays
Protein concentration was estimated according to Bradford [ 1 31 using the Bio-Rad reagent and
y-globuiin as standard protein.
3.2.4 Other purification methods tested
3.2.4. f Dye columns
Yeiiow 86, Blue 4, Blue 72, Green 19, Brown 10, Yeiiow 3, Cibacron blue, Red 120 and
Green 5 columns (2.5 mL volume) were screened to find those that gave the best purification.
Sarnpies of the crude desalted extract containing 2 mg proteins were applied on each column
equilibrated beforehand with buffer B. The columns were washed with two colurnn volumes of
buffer B and proteins with glucosyltransferase activity were eluted with buffer F. Afkity of the
anion-exchange purified extract was also tested on Cibacron blue column. Protein and
gluco sy ltransferase activity were assayed in each 5 mL fraction.
3.2.4.2 Afk i ty with UDP-glucuronic acid
A 5 mL column was prepared with UDP-glucuronic acid agarose as ligand and pre-equiiiirated
with buEer B. Ten dgrarns protein of the desaited crude extract were applied ont0 the
column After washing the column with b d e r B until no protein was detected, the column was
eluted with a step gradient fkom 0.5 M to 2.0 M NaCl in b d e r B. Fractions of 2.5 mL were
collected and tested for glucosyItransferase activity and protein content.
3.2.5 Characterization of tbe glucosyltransferase
The variation in enzyme activity with temperature was detennined with an extract partidy
purified by acetone precipitation and gel filtration chromatography. A preparation eluted fiom
anion-exchange was used to determine enzyme kinetics. Enzyme puritied by gel filtration was
used to estimate molecular weight and isoelectric point.
3.2.5.1 Effect of temperature
Glucosyltransferase activity was assayed under standard conditions at pH 7.0 and at
temperatures varyhg fiom 20 to 55°C for the acetone extract and fiom 30 to 50°C for the gel
filtration extract. Results are the means of triplicates.
3.2.5.2 Isoelectric point (pl)
The isoelectnc point of the enqme was detennined by separating the proteins fiom gel
filtration chromatography on an Ampholine PAGplate in the pH range of 4.0-6.5 (Pharmacia)
at 2000 V, 25 mA and 125 W at 18°C for 2h30 min. The portion of the gel where standards
were applied was silver stained and the rest of the gel was cut into bands of 0.5 cm. For each
portion, the gel was separated fiom the plastic backing and incubated with 500 pL of standard
reaction mixture at 4°C overnight. Glucosyltransferase activity was measured in the supernatant
incubated at 40°C for 4 h. Low pI protein standards (Pepsinogen (pI 2.80), amyloglucosidase
@I 3.50), methyl red (pI 3.73, glucose oxidase @I 4.15), soybean trypsin inhibitor (PI 4-55),
9-lactoglobulin A @I 5.20), bovine carbnic anhydrase B @I 5.85) and human carbonic
anhydrase B (pI 6.55)) were used as markers to estirnate the pI of the partiaily purified enzyme.
3.2.5.3 Estimation of molecular weight
The native molecular weight was determined by gel permeation HPLC on an Ultrahydrogel 500
column in series with an Ultrahydrogel 250 colurnn running with b a e r A, at 1 mL/min and
m o n i t o ~ g at 28OQ 10 nm. Blue dextran 2000 (2 000 kD), bovine serum albwnin (67 kD),
ovalbumine (43 kD), carbonic anhydrase (29 kD) and chymotrypsinogen A (25 kD) were used
as gel filtration low molecular weight standards.
3.2.5.4 Enzyme kinetics
Apparent K,,, and V, values were determined fiom slope and intercept replots of initial rate
data. The e-e extract was incubated with various concentrations of crocetin in ranges of
final concentration of O. 125- 1.50 rnM for crocetin and 0.25-2.5 mM for UDP-glucose.
The effect of P-mercaptoethanol additions during extraction of glucosyltransferase was
determined by comparing glucosyltransferase specific activity in crude extracts fiom 1 g of
ground lyophilized cells mixed with 10 mM P-mercaptoethanol.
3.3 Results and Discussion
3.3.1 Enzyme purification
Glucosyltransferases transfer glucosyl groups fiom the donor to hydroxyl or carboxyl fùnctions.
Whiie reports on the purification of glucosyItransfenises catalyzhg the glucosylation of
hydroxyl group of compounds like flavonoids and phenols are abundant [5,6], only few
glucosyltransferases involved in the glucosyktion on carboxyl groups were purified and
characterized [14, 151. In a previous study, it was s h o w that safEon c d u s extracts, in the
presence of UDP-glucose, convened crocetin into related glycosyl esters in the following
sequence: monoglucosyl ester, monogentiobiosyl and diglucosyl esters, gentiobiosylglucosyl
ester. and M y crocin (F-ig. 1)[3]. The formation of these glycosides involved the
glucosylation of the carboxylic groups of crocetin and of hydroxyl groups of the glucose
already Linked to the aglycone. The characterization of these enzymes has until now not been
reported.
To characterize the glucosyltransferase involved in the transfer of glucosyl moieties ont0 the
carboxyl ends, UDP-glucose:crocetin 8,8'-glucosyltransferase has k e n purified about 125-fold
fiom safion ceil suspensions. Purification was achieved by acetone precipitation anion-
exchange chrornatography on a Mono Q column, and gel permeation on a Superdex 200
column (Table 1). Desalting the crude extract doubled the specinc activity and the percentage
of recovery. This step removed inhibitors present in the crude extract. Indeed, mixing the crude
and desalted extracts gave lower glucosyltransferase activity than the surn of each extract
activity separately. Precipitation of glucosyltransferase activity in 20% acetone eliminated P- glucosidase activity which totally pecipitate in 30 % acetone and might hydrolyze newly formed
glycosides and therefore interfere with crocin synthesis (results not shown). Active fiactions
corresponding to only 0.3% of the crude extract protein were eluted fiom Mono Q column
between 0.3 and 0.4 M NaCl (Fig. 2). Fractions eluted fiam the gel filtration column between
72 and 82 minutes corresponding to molecular weights between 40 and 60 D a contained
glucosyltransferase activity (Fig. 3). At the end of the process, the enzyme preparation was
purilied -125 fold. The overail purification process led to 2% recovery. Migration of the
54
enzyme on SDS-PAGE indicated the presence of several distinct proteins (Fig. 4).
Table 1. Purification of UDP-g1ucose:crocetin glucosyltransferase fiom Crocus sativus L. ceil
suspension culture. Pudication is as described in "Materials and Methods".
Purilkat ion steps To ta1 protein Specific act ivity Purification Recovery
(mg) @kat m g ) (n- fo Id) (%)
Cnide 1040 0.48 1 1 O0
Desalted (PD 10) 1018 0.92 2 188
Acetone fiactionation 26.4 3.70 8 20
Anion-exc hange 3 -25 14.8 3 1 10
Gel filtration 0.18 59.8 125 2
Afçiity chromatography has been kluded in the purification protocol of several plant
glucosy luansferases. Latchinian et al. [ 161 used the afnnity columns UDP-glucuronic acid
agarose and Reactive Brown-IO agarose for hsî Bavonoid glucosyhransferases purification.
A£iïnity chromatography with dyes and UDP-glucuronic acid was tested and resulted in lower
purincation efficiency t han gel filtration chromatography (resuhs not shown). The UDP-
g1ucose:crocetin glucosy1transferase bound and eluted fiom al1 the dye columns tested, but
showed higher purification with the dyes Green-5, Cibcron Blue and Red-120 (results not
shown). The addition of a dye afEnity step to the purification protocol did not result in any
change in the protein band profile on SDS-PAGE gel with the exception of Cibracron blue.
When chrornatography on a Cibacron blue column was added to the purification protocol, the
band at 27 kD was eliminated, leaving the band at 26 kD as the major band, but other bands
were stih detected (Fig. 5). Elution of glucosyltransferase activity fiom the Cibacron blue
column with 10 m M UDP-glucose solution failed. Affinity chromatography d e s use of the
highiy specific binding sites of enqmes, thus ailowing their separation according to the* ability
to bind to a particular ligand. Since the target enzyme did not discriminate between the dyes.
the interactions between enzyme and dyes were probably electrostatic rather than specsc to the
binding site. The inability of UDP-glucose to release the enzyme fiom the column supports this
conclusion. Moreover the 125-fold puritied preparation did not bind to the UDP-glucuronic
acid agarose column, as shown for glucosyltransferases fiom leaves of Sievia rebaudiana using
steviol as substrate[l4], or fiom wild tomato glucosylating fatty acids [15].
ElutMo time (min)
Fig. 2 Anion-exc hange chrornatography of UDP-glucose:crocetin glucosyltransferase ushg a
Mono Q FPLC column. The bound proteins were eluted using a linear gradient (0-0.5 M) of
NaCl (----). Fractions (2.5 mL) were coiiected and assayed for enzyme activity against 1 .O m M
crocetin (solid bars). The protein content (-) in each hction was monitored at 280 nm.
O 10 20 3 0 4 0 9 60 70 80 90 F r a c t i o n n u m b e r
Fig. 3 Elution profle o f proteins (-) and glucosyltransférase activity against 1 .O rnM crocetin
(solid bars) afier gel permeation FPLC on a Superdex 200 prep grade column. The protein
content in each 2.5 rnL £+action was mnitored at 280 nm.
Fig. 4 SDS-PAGE of the 125-fold purified extract &et gel permeation FPLC on Superdex
200 prep grade column (Lane 1) and molecuiar weight markers (Lane 2). The stacking eel was
4.0%, the separating gel was 12% ushg Tris-HCl buffer at pH 8.8. The sarnple b d e r
contained SDS and P-mercaptoethawl. The gel was staiwd with silver nitrate.
Fig. 5 SDS-PAGE of the glucosyhransferase preparations From d o n ceUs afler pufication
by afhity with Cibacron Blue column after anion-exchange chromatograpgy on a Mono Q
column. The stacking gei was 4.0%, the separating gel was 10Y0 using Tris-HCI buffer at pH
8.8. The sampie b a e r contained SDS and P-mercaptoethanol. The gel was stained with silver
nitrate.
This is the first report on the characteristics of a glucosyltransferase involved in crocetin
glyco sy lat ion [3]. Numerous g luco syltransferases purified eom plant sources are acidic proteins
[15, 17, 181. The 125-fold purilied preparation is no exception to this and contains several
protein bands on IEF gel with giucosyltransferase activity between pH 4.4 and 4.8 (results not
shown), which suggests the presence of two or more isoform of UDP-g1ucose:crocetin 8,8'-
glucosyltransferase. The purified enzyme has a native molecular weight in the range of 47 kD
(Table 2 and Fig. 3). Glucosyhransferase activity could not be detected on SDS-PAGE gel
because the reducing agent B-mercaptoethanol interfered with glucosyltransferase activity
(Table 2). Plant glucosyltransferases were shown previously to consist of either one or several
subunits [5,6]. The major band at 26 kDa suggests that the enzyme is formed of two subunits
which is in agreement with the native molecular weight estimated by gel filtration
chromatography, i-e., 47 kDa.
Safion contains glucosyltransferases invo lved in the synthesis of various glycosides. CeU
cultures of Crocus sarivus contains enzymes catalyzing the formation of quercetin and
isohamnetin glucosides 1191. Another study showed crocetin glucosylation by a
glucosyltransferase extracted fiom Vitis vinijéra callus. The enzyme was able to catalyze the
glucose transfer on the carboxyl group of crocetin but not the formation of crocin [3],
suggesting that more than one glucosyltransferase may catalyze the glucose transfer on crocetin
in vitro. Two temperature optima appeared in the acetone precipitated enzyme preparation at
30°C and 40°C (Fig. 6a). The 125-fold pwified preparation had a single temperature optimum
at 40°C (Fig. 6b). The presence of two temperature optima suggests that more than one
glucosyltransferase catalyzed the glucosylation of crocetin. The purification rnay have
eliminated more labile iso f o m of UDP-glucose:crocetin 8,8'-glucosyltransferase, as O bserved
during the purification of isoperoxidase fiom oranges [SOI.
Table 2. Propert ies of the UDP-glucose:crocetin glucosyltransferase in Crocus sutivus L. ceU
suspension culture.
PI' 4.4 - 4.8
Native molecukr weight' in the range of 47 kDa
&, crocetb? 0.17 m M
K, U D P - ~ ~ U C O S ~ ~ 0.72 rnM
Relative activity m crude extract 100%
1 O mM ~-merca~toethanol~ 69%
i Determined d e r gel 6itration
' Determined afier anion-exchange; results are the mean of triplkates
Presence of the reducing agent in the extraction buffer
15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Temperature (OC)
Fig. 6 a)Act ivity o f part ially purified glucosyltransferase after acetone precipitat ion at
temperatures ranging from 20 to SS°C. b) Activity of partially purified glucosyltransferase after
gel permeation FPLC at temperatures ranghg f?om 30 to 4S°C. Activity was measured with 1
mM crocetin and 2.5 rnM UDP-glucose as substrates. Resuits are the means of triplicates.
The K, and V,, were detennined with concentrations of crocetin and UDP-glucose between
0.2- and 10-fold their K,,, [21]. The enzyme showed higher &ty for the substrate crocetin
than for UDP-glucose. For crocetin, apparent K, and V, were cdculated as 0.17 mM and 30
pkatdmg respectively. For UDf -glucose, apparent K, was calculated as 0.72 mM.
We pstrtialiy characterized for the first time a UDP-glucose:crocetin 8,8'-glucosyltransferase,
one of the few glucosyltransferases studied cataiyzing the transfer of glucose on carboql
groups. We propose that two glucosyltransferases could be involved in the glucosylat ion of
crocetin into crocin, one for the formation of glucosyl esters (glucosylation of carboxylic ends
of crocetin) and the other catalyzing the glucosylation of hydroxyl groups of the glucose
already linked to the agiycone with formation of gentiobiosyl esters; both enzymes catalyzing
the synthesis of the gentiobiosylglucosyl ester [3]. In the present study both enzymes could not
be separated even though the puritication method resulted in 125-fold enrichment.
3.4 Acknowledgements
The Canadian Department of Extemal Af%àirs and International Trade has contributed
financially to this study, within the scope of a research collaboration with San-Ei Gen F.F.1 Inc.
of Osaka, Japan. We are gratefùi to D. Bélanger for his work on gel permeation HPLC. The
financial support of F. Côté by a Fonds pour la Formation de Chercheurs et l'Aide à la
Recherche graduated student fellowship is gratefiiiiy acknowledged.
3.5 References
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CHAPITRE IV
A HIGHLY SPECIFIC GLUCOSYLTRANSFERASE IS INVOLVED IN THE
SY NTHESIS OF CROCETIN GLUCOSYL ESTERS IN Crocus sativus CULTURED
CELLS
(UNE GLUCOSYLTRANSFÉRASE HAUTEMENT SPÉCIFIQUE EST IMPLIQUÉE
DANS LA SYNTHÈSE DES GLUCOSYLES ESTERS DE LA CROCÉTINE DANS
DES CULTURES CELLULAIRES DE Crocus sativus)
A highly speeific glucosyltransferase is involveà in the syntbesis of crocetin g l u c q l esters
in Crocus safivus cultured cells
France côté? François c ormier'-", Christhe ~ u l k m e ' , and Claude wdemot2
' ~ o o d Research and Development Centre, Agriculture and Agri-Food Canada, 3600 Casavant
Blvd. West, St. Hyacinthe (Qc), Canada J2S 8E3
'~ort iculture Research Centre. Department of Plant Science, Laval University, Ste. Foy (Qc).
Canada G 1 K 7P4
'~resent address: Coiarôme inc., Corby Building, 950 chemin des Moulins. Montreal (Qc).
Canada H3C 3 WS
Les stigmates du safiran (Crocus sativus) contiennent des caroténoïdes rares qui sont solubles
dans l'eau, principalement la croche, le digentiobiosyle ester de crocétine. Des études
précédentes ont indiqué que deux glucosyltransfémses seraient impliquées dans la formation des
glucosyle et gentiobiosyle esters de la crocétine pufiesne et al., 1997, Planta Med., 63: 1 50-
1533. Une UDP-G1c:crocétine 8'8'-glucosyltransférase, impliquée dans la synthèse des
monoglucosyle et diglucosyle esters de la crocétine, a été extraite d'une culture cellulaire de
safian et purinée 300 fois par Btration sur gel et électrophorèse IEF préparative avec un
rendement de 13%. La préparation enzymatique purifiée est hautement spécifique envers la
crocétine et forme des liens esters entre la partie glucose de I'UDP-Glc et les fonctions
carboxyliques de la crocétine. L'extrait brut désalé du même matériel est moins spécifique et
forme des glucosyle esters avec d'autres composés tels l'acide abscissique et l'acide rétinoïque.
La préparation purifiée est active entre les pH 4.4 et 4.6. Une bande majeure à 26 k D apparait
sur le gel d'éIectrophorèse en conditions dénaturantes tandis que la poids moléculaire déterminé
par filtration sur gel se situe entre 49 et 55 kD. Cette étude renforce l'hypothèse que plus d'une
glucosyltransférase est impliquée dans la biosynthèse des glycosyle esters de la crocétine chez le
safan.
ABSTRACT
Safion (Crocus sativus) s t i p t a contain rare water-soluble carotenoids and the major one is
crocin, the crocet in digentiobiosy 1-ester. Previous studies indicated that two
glucosy Itransferases might be involved in the formation of crocet in glucosyi- and gentiobiosj-1-
esters pufiesne et al., 1997, Planta Med., 63: 150-1531. A UDF-G1c:crocetin 8,8'-
glucosyltransferase involved in the biosynthesis of crocetin monoglucosyl- and diglucosyl-esters
was extracted fiom &on cell cultures and was purified 300-fold by gel filtration
chromatography and preparative TEF electrophoresis, with a recovery of 13%. The purified
enzyme preparation was highly specific for crocetin and formed ester bonds between the
glucose moiety of UDP-Glc and the fiee carboxyl hct ions of crocetin. The enzyme did not
add other glucose units to the glucosyl-esters to form crocetin gentiobiosyl-esters. A crude
desalted extract of the same material was less specific and formed glucosyl-esters with several
other compounds, including abscisic and retinoic acids. The purified preparation was active
between pH 4.4 and 4.6. SDS-PAGE revealed a major band at 26 k D while the native
molecular mass detennined by gel filtration was in the range of 49 to 55 kD. The study
provides concrete evidence for the hypothesis that more than one glucosyltransferase are
involved in the biosynthesis of crocetin glycosyl-esters in di ion.
Footnotes 1 The Canadian Department of Extemal M a i r s and International Trade has contnbuted
financiaily to this study within the =ope of a research collaboration with San-Ei Gen F.F.I. Inc.
of Osaka, Japan.
Abbreviat ions: GTASE 1 and GTASE2, glucosyltransferases transfering glucose moiet ies fkom
UDP-Glc to the carboxyl ends of crocetin and to the glycosyl-esters of crocetin, respectively.
4.1 Introduction
S&on (Crocus sativus) stigmata are of great interest for the food industry because of their
unique aroma mainiy amiuted to sahnal, their bitter taste due to picrocrocin, and their
powerful coloring properties owing to hydrosoluble carotenoid pigments. These pigments are
glucosyl- and gentiobiosyl-esters of crocetin, mainly crocin, ail-pans-crocetin di (P-D-
gent io bio sy1)- ester. Crocet in g lycosides are also present in Gardenia jasminoides h i t s (Van
CaIsteren et QI., 1997), and in the stigmata of garden crocusen (Rychener et al., 1984)- Their
fiinction as an attractant for pouinating insects and anunals has been lost with tirne in some
stenle geophytes like Crocus sofiws, and their main role is probably protection against
oxidation (Bart Iey and Scolnik, 1 995).
The structure of severai crocetin glycosides has been described (Pfander, 1976; Van Calsteren
et al.. 1997). New glycosides, Le., trisaccharyl-esters, were recently produced (Dufiesne et al..
1999) and identiiied (Pfister er al,, 1996). However, little information is available about the
biosynthesis of crocetin and its glycosylated forms. Two pathways for the formation of crocetin
have been proposed: dirnerization of two C,,-terpenoid compounds, such as
gerany lpyrop hosphate foliowed by dehydrogenation and oxidat ion; and oxidat ive degradat ion
of a Ca,-carotenoid such as zeaxanthin (Pfander and Schurtenberger, 1982).
Information about carotenoid glucosylation is scarce. The formation of crocetin glycosides has
k e n studied in Crocus saiivus L. callus cultures. Dufiesne et al.. (1 997) detected glycosylation
activity in dinerent parts of sprouting c o r n of d o n . The authors proposed that crocetin was
enzymatically glucosyIated by a multi-step pathway involving two distinct glucosyltransferases
(Fig. 1). One enzyme (GTASEI) wouM cataiyze the addition of glucose rnoieties to the
terminal carboxyl ends of crocetin with formation of the monoglucosyl- and diglucosyl-esters.
The other glucosyltransferase (GTASE2) would transfer glucose moieties to glucosyl groups
forming crocetin monogentiobiosyl- and digentio biosyi-esters. Côté et uf. (submitted)
characterized a partidy purified UDP-G1c:crocetin glucosyltransferase (GTASE 1 ) fiom Crocus
sutivus ceil suspensions. The enzyme preparation showed optimal activity at 40°C and a pI in
the range of pH 4.4 and 4.8. The enzyme may consist of two subunits o f 26 kD. The
purifcat ion method did not separate GTASE 1 and GTASEZ act ivit ies.
Figure 1. Multi-step pathway proposed for crocetin glycoside biosynthesis by addition of
glucose moieties to crocetin: GTASE 1 and GTASE2 are responsible for the addition of glucose
moieties to a terminal carboxyl group and to a glucosyl group, respectively (adapted from
Dufiesne et al., 1997).
Mammalian glucosyltransferases are highly specific for the substrate accepting the sugar moiety
(Beyer et al., 198 1). Most plant glucosyltransferases which have k e n purified catalyze the
glucosyiation of hydroxyl group of flavonoid and phenolic compounds and have a broad range
of substrate specificity (Hosel, 198 1; Cormier, 1997). Few enzymes catalyzing the glucosyl
transfer on carboxylic fûnction have been studied. Shii ta et al. (1995) purified
glucosyltransferases fiom Stevia rebaudiana involved in the glycosylat ion of stevioi and
neviol-glycosides and fomiing ester and ether bonds. A glucosyltransferase purified fiom
Lycopersicum pennellii LA 1 3 76 leaves sho wed specificity to ward the carboxyiic h c t ion O f
short-chah fatty acids (Kuai et al., 1 997).
The present study airned at determinhg the substrate specificity spectrum of GTASEI. We
report on the 300-fold purification and characterization of a highly specific UDP-G1c:crocetin
8 ,8 ' - g lucosy l t r f e r and on the separation of GTASE 1 which transfers glucose to the
caboxyl ends of crocetin, fkom GTASEZ, which forms of glucosidic bonds and crocin. We bring
further evidence that the glucosylation of crocetin into crocin involves at least two enzymatic
steps.
4.2 Materials and methods
1.2.1 Plant Material and Chemicals
4.2.1.1 Ceil Culture
SafEon (Crocus sativlls) cells were produced fiom weli estabkhed ce11 suspension cultures
(Dufiesne et al., 1997). The c e k were grown in Murashige and Skoog medium (Murashige
and Skoog, 1962) supplernented with More1 vitamins (Morei, 1 WO), 30 g/L sucrose. and 0.5
mg/L a-naphtaleneacetic acid at pH 5.8. Ten-day-old celis were harvested by tiltration and
washed with deionized water prior to lyophilization.
4.2.1.2 Chemicals
UDP-Glc and UDP-Ga1 disodium saits. crocetin pyridine salt, valeric acid. 2-methyl valeric
acid. 4-met hyI valeric acid, pans-2-met hyl-2-pentenoic acid, pans-2-pentenoic acid, trans-2,4-
pentadieno ic acid, dl-tram-ret ino ic acid. 1 3 -cis-retinoic acid. and ail-trans-abscisic acid were
purchased fiom Sigma Chernical Co. (St. Louis, Mo). Bixin was f?om Extrasynthèse (Genay.
France). Maltosyl- B-cyclodextrin was fiom Ensuiko Sugar Re fining Co. Ltd (Tokyo, Japan).
All chernicals were analytical reagent grade.
4.2.2 Enzyme Purification
4.2.2.1 Extraction
AU procedures for extraction and purification were carried out at 4°C or on ice. For enzyme
extraction, each gram of ground lyophilized cells was mixed with 10 m~ PEG 3 400 and 10 nu
EDTA in 10 mL extraction buffer (200 m~ Tris-HCI pH 7.4). M e r 45 min of incubation under
continuous stirring, the mixture was centrifùged at 10,000g for 30 min. The supernatant was
fltered on Miracloth and desaited on PD10 columns (Sephadex G-25, Phannacia, Uppsala,
Sweden) pre-equilhted with the extraction buffer. Glycerol was added to the enzyme extract
at this stage and to the following steps of purification to a final concentration of 10% (v/v).
L2.2.2 Gel Filtration
Gel filtration chrornatography was performed on Superdex 200 prep grade column (2.6 X 56.5
cm) using the 650E Advanced Protein Purification System (Waters, Mississauga, Ont, Canada).
Fractions of 2.5 rnL (3540 mg of protein) of concentrated enzyme preparation were injected
onto the column and eluted with the extraction b a e r at 2.5 ml/mh flow rate. The protein
elution profile was monitored at 280 nm. The three most active hctions of each run were
pooled, concentrated using a Macrosep centrifuga1 concentrator (exclusion limit 30 kD) and
assayed for protein content and glucosyltransferase activity.
4.2.2.3 Preparat ive IEF
Preparative IEF was performed on a Multiphor II electrophoresis unit (Pharmach). The most
active fiactions isoiated fiom the gel tiltration chrornatography (2.5 mL) were applied on an 1
mm-thick Arnpholine PAGplate in the pH range of 4.0-6.5 (Phamiacia). The running conditions
were 200 V, 25- and 125 W at 18OC for 2 h 30 min. The gel was sectioned into 5 mm
bands. For e x h segment, the gel was separated fkom the plastic backing and proteins were
eluted in Tris-glycine buffer (25 m~ Tris-base + 192 m~ glycine) using an electro-eluter (Mode1
442, Bio-Rad). Fractions (600 pl each) containing GTASE 1 activity were pooled and stored at
-80°C. Protein content was rneasured as described below.
4.2.3 Enzyme and Protein Assay
GTASEl activity was routinely determined in a reaction mixture containing 75 pL reaction
buffer (0.75 M Bis-Tris propane pH 7.1 ), 1 m~ crocet in encapsulated in malto~l-P-cyclodextrin
(Cormier et al., 1995), 2.5 m~ UDP-Glc, and 25 pL enzyme extract (15-20 pg protein) in a
final volume of 200 pL. The mixtures were incubated for 60 min at 40°C. The reaction was
initiated by adding enzyme extract and was stopped by adding 200 pL ethanol. AU samples
were run in duplicate. The reaction products of crocetin glucosylation were separated and
quantified by reversephase HPLC (Beckman Gold System, San Ramon, Ca, USA) on a
SpherisorbODS2 (Cig) column (lOpm, 0.46 x 25 cm, CSC, Montreai, Que, Canada); the
products were eluted with a linear gradient fkom 1% (v/v) acetic acid in water to 100%
methanol (HPLC grade), at a 1 mL/min flow rate and monitored at 440 nm (Dufresne et al.,
1997)- Reaction products were identined by NMR and mass spectroscopy (Van Calsteren et
al.. 1997). Peak areas were integrated for quantitative determination of crocetin rnonoglucosyl
ester production Enzyme activity was defined as pmole of crocetin monoglucosyl ester
produced per s @katal) under the assay conditions.
Pro tein concentration was est imated using the Bradford dye- binding procedure (protein assay,
Bio-Rad) and y-globulin as standard protein.
4.2.4 Enzyme Characterisation
4.2.4.1 SDS-PAGE and Native Molecular Weight Determination
SDS-PAGE was carried out under reducing conditions using 10% Tris-HC1 precast gels (Ready
gel SDS, Bio-Rad) and calibrated with molecular weight standards in the range of 14.4 to 94
k D (Pharmacia). Proteins were visuaiized by silver staining. The range of native molecular mass
of GTASEl was estirnated d e r the preparative gel filtration chromatography on the Superdex
200 column using reference proteins of known molecular weights (13.7 to 2.000 kD.
P harmacia) .
4.2.4.2 I~oelectric focusing
IEF was perfonned on Ampholine gels (pH 4.0 to 6.5, Pharmacia), calibrated with standard
proteins (Low pI protein standards, pI 2.80 to 6.55, Pharmacia). The portion of the gel
containhg the standards was silver stained, and the rest of the gel was sectioned into bands of 5
77
mm. Elution of proteins was carried out as mentioned above. The GTASE1 activity and protein
content were measued in each section,
4.2.4.3 Effects of the Enzymatic Extract on Glycoside Composition of SaflEion Pigment
Safiion stigmata were ground and pigments were extracted by stirring in water at room
temperature. The extract was fltered on Whatman No 2 paper and the pigments were cleaned
uing Prep Sep Cis extraction columns (Fisher). The yeUow pigments were eluted with
rnethanol and dissolved in water d e r methanol evaporation. Fifty pL fiactions of the crude
desalted (two- fo Id purified) and preparative IEF (300-fold purified) enzymat ic extract were
incubated with 70 PL pigment extract, 75 pL 0.75 M Bis-Tris propane pH 7.1 buffer, and 5 pL
100 mi UDP-Glc at 30°C for i or 3 hours. The reaction was terminated with 200 pL ethanol.
The reaction products were separated and quantified by HPLC using the same method as
described for the enzyme assay.
4.2.4.4 Substrate Specifiçity
Substrate specificity toward the sugar donor of GTASE 1 was tested with the 300-fold p d e d
extract as described for the standard enzyme assay usine 2.5 mM UDP-Ga1 or 2.5 mM UDP-
Glc.
The GTASE 1 specificity toward the sugar acceptor was determined with the cmde desalted (2-
fold) and 300-fo1d purified extracts. The glucosylation rate of crocetin was compared with that
of other molecules. Substrates with terminal caboxylk f'unction were chosen on the basis of
structural dserences in chah length, methyl group and double bond position, and stereo-
chemistry. The chernical structures of the substrates are shown in Figure 2. Valeric acid, 4-
met hyl vaIeric acid, 2-methy l valeric acid, tram-2-pentenoic acid, frans-2-met hyl-2-pentano ic
acid, aii-tram-abscisic acid, and crocetin were solubiiized with 0.1 % CHAPS solution at 0.25
mg/mL concentration AU-~ns-retinoic acid, 1 3-cis-retinoic acid, and bixïn were solubilized in
DMSO at 2 mg/rnL concentration. Norbixin was obtained by saponincstion of bixin in CHAPS
0.1% in presence of NaOH. B k and norbixin structures were co-d by HPLC-MS.
Trans-2,4-pentadienoic acid was encapsulated in rnaltosy CB-cyclodextrin in a 1 :2 molar ratio
with a substrate concentration of 0.25 mg/mL. Preliminary experiments showed that DMSO,
CHAPS or maltosyl-fbcyclodextrin did not affect noticeably the reaction at the concentration
used. The reaction mixture consisted of 200 m~ substrate, 2.5 m~ UDP-glucose, 280 m~ Bis-
Tris propane pH 7.1 buffer, and 50 pL two-fold or 300-fold purified enzyme preparation in a
final volume of 200 PL. The mixtures were incubated at 30°C for 1 or 3 h and the reaction was
stopped by adding 200 pL ethanol. Reactions were also carried out with substrate preparations
at 5 mg/mL concentration. A 4 M substrate concentration was used for the reactions using
short-chah fatty acids as substrates. These reaction products were analyzed by TLC.
Carotenoids and neoformed reaction products were separated and analyzed by reverse-phase
HPLC on a Spherisorb-0DS2 (Cis, 10 pm) column (CSC) monitored using a diode array
detector. Products of crocetin and dl-pans-abscisic acid glucosylation were separated using a
iinear gradient fiom 1% (vlv) acetic acid in water to 100% methanol, at 1 &/min flow rate and
scanning between 250 and 500 nm for crocetin, and between 200 and 400 nrn for abscisic acid.
Quantification of crocetin and abscisic acid reaction products was carried out using peak area
integration at 440 nm and 262 nm respectively. Reaction products of bixin, n o r b m and
retinoic acid gIucosylation were separated using a iinear gradient from 1% (v/v) acetic acid in
water to 100% acetonitrile, at I W m i n flow rate monitored between 250 and 520 nm.
Quant scat ion was performed by peak area integration at 460 nrn for bixin and n o r b k and at
3 5 O for ret inoic acid. Truns-2-rnethyl-2-pentenoic acid react ion products were also separated
by HPLC with a linear water acetonitrile gradient scanning between 190 and 326 nm with
detection at 230 nm.
Short -chah fatty acids (valeric acid, 2-methyl valeric acid, 4-me thy 1 valeric acid, trans-2,4-
pentadienoic acid, irans-2-pentenoic acid, and trans-2-methyl-2-pentenoic acid) react ion
products were separated by TLC on LKSF l 5 0 k 250 Fm silica gel plates (Whatman) with
chloroform:methanol:water:acetic acid (70: 12:OS:O.S) and detected with the a-naphtol reagent
(Kates, 1986).
Figure 2. Chemicai structure of the substrates tested with the glucosyltransferase extract. a-
valeric acid, b. Cmethyl valeric acid, c. 2-methyl vaienc acid, d. îmns-2-pentenoic acid. e.
mns-2,4-pentadienoic acid f'. trons-2-metS.1-2-pentenoic acid, g. aii-trons-retinoic acid, h. 13-
cis-retinoic acid, i. all-mns-abscisic acid, j. bixin, k norbixïn, 1. crocetin.
4.3 Results
4.3.1 Purification and Properties
GTASEl was purified 300-fold fiom Crocus sativils ce11 suspension cultures using the
procedure summarized in Table 1. The initial dedting step with PD10 columns removed 49 %
of the protein fiom the crude extract. The preparative gel filtration on Superdex 200 provided
the most significant purification step and substanciaily reduced the total amount of protein
(Table 1) but both GTASE activities were stU present. M e r preparative IEF, GTASE 1 was
purified 300-fold with a recovery of 13% and separated firom GTASE2 activity. The enzyme
had a specinc activity of 180 pkatal/mg-' protein and showed a major band on SDS-PAGE in
the range of 26 kD, with three minors bands at 40,6 1, and 65 kDa (Fig 3A). Attempts to assay
g lucosyltransferase activity in SDS-PAGE gel were unsuccessful because P-mercaptoethano 1
interfers with the GTASE 1 activity assay (Côté et al., submitted). The native molecular weight
of the three most active fiactions eluted fiom Superdex 200 prep grade column was in the
range of 49 to 55 kD. The 300-fold purified extract was subjected to IEF and gave three active
GTASEl bands at pH 4.4,4.5, and 4.6 (Fig. 3B).
4.3.2 Specificity
No galactosides were formed fiom the sugar donor UDP-Ga1 (Table II). The 2-fold purified
extract reacted with several substrates, in order of decreasing affinity: trans-2-methyI-2-
pent eno ic acid, crocet in, norbixin, trans-abscisic acid, 1 3 -cis-ret inoic acid, tram-retino ic acid.
and bixin. The 300-fold purified extract was specific for crocetin (Table II).
Three different methods were used to solubilize the substrates tested in the specificity study.
Encapsulation of crocetin in cyclodextrin circwnvents the use of DMSO which inhibits
glucosyltransferase activity in a concentration dependent way (Connier et al., 1995).
Solubïiization of crocetin in 0.1% CHAPS was as efficient as encapsulation and gave simiiar
results (not shown). CHAPS solubilized some of the substrates. However, DMSO was used to
solubilize bixin and retinoic acid, which were very soluble in a minimal volume of DMSO while
Table 1. Purification of UDP-G1c:crocetin glucosyltransferase nom Crocus s a t i w L. ceU
suspensions. Resuits are the means of duplicates. Enzyme activity was assayed with 1 .O r n ~
crocetin and 2.5 m~ UDP-glucose.
Tot al To ta1 Specific
Purification step protein ac t ivity activity Purscat ion Recovery
(mg) @kat al) (pkat ailmg) (n- fo Id) (%)
Cnide extract 1130 678 0.6 1 1 O0
DesaIted (PD 1 0) 574 746 1.3 2 110
Gel filtration 9.0 243 27.0 45 36
IEF 0.5 90.1 180 300 13
Figure 3. Analysis of the 300-fold purified glucosyltransferase extract from satnon cell. A.
SDS-PAGE of protein extract afler preparative IEF, stained with silver nitrate. B, IEF of highly
purified GTASE 1, stained with silver nitrate.
Table II. Substrate specificity of GTASE 1 p d e d 2- or 300-fold.
Reactions were assayed with 2.5 m~ of each glycosyl donors, and with 200 m~ of each
glucosyl acceptors. Results are the means of duplicates.
Glucosy ltransferase relative activity (%)
2-fold purification 3 00-fo ld purification
Glucosvl donora
UDP-Glc
UDP-Ga1
crocet in
bwn
norbixin
pans-abscisic acid
rrans-ret inoic acid
1 3-cis-retinoic acid
rrans-2-methyl-2-pentenoic acid
valeric acid
2-met hy 1 valeric acid
4-methy l valeric acid
n-ans-2-pentenoic acid
rrans-2,4-pentadienoic acid
n.t. Not tested
a Glycosyl acceptor: 1 .O r m crocetin b Glucosyl donor: 2.5 m~ UDP-Glc
both other methods failed. DMSO at very low concentration did not interfere noticeably with
the reac t io n.
4.3.3 Separation o f GTASEl and GTASE2 activities
The 300-fold purified enzyme preparation catalyzed the transfer of a glucose moiety fiom
UDF-Glc to crocetin with the formation of only crocetin monoglucosyl-ester and a d
amount of crocetin diglucosyl-ester (Table III). One hour incubation of crocetin and UDP-Glc
in the presence of the crude desalted or the gel filtered extracts led to the formation of crocetin
monoglucosyl-, monogentiobiosyl-, diglucosyl-, and gentiobiosylglucosyl- esters. In
cornparison with the crude desalted preparation, the gel fiitrat ion extract catalyzed the
formation these crocetin glycosides at a slightly lower rate. Incubation at room temperature of
the IEF (300-fold) purified extract with with very low concentration of crocetin produced more
than 20% of diglucosyl-ester and more than 50% of monoglucosyl-ester of crocetin; no other
glycosides were detected, even d e r ovemight incubation. The act ivity of GTASEZ, responsible
for the synthesis of monogentiobiosyl- and digentiobiosyl-ester of crocetin, was lost during the
last purification step, preparative IEF, which separated OTASE 1 fiom GTASEZ.
4.3.4 Glucosylating and Deglucosylating Activitia in the Crude Desalted Extract
Bioconversion of encapsulated crocetin by a Crocus sarivus ceil culture produced novel
gIycosides, crocetin di-neapolitanosyl- and neapolitanosyl-gentiobiosyl-esters (Dufiesne er al..
1999). In order to determine whether an enzymatic extract fiom saftion celi suspension cultures
catalyzed the formation of these glycosides the crude desalted and the 300-fold purified
ext racts were incubateci with &on st igmata pigments. The crude desalted extract modified
the composition of safnon pigments and the most important changes occurred d e r only one
hour of incubation (Table IV). There was a 40% increase in peak area of the neapolitanosyl-
gentiobiosyl-ester of crocetin nom 2.5 to 4.2. No crocetin di-neapolitanosyl-ester was
observed. Little further modification was observed after 3 h of incubation. The peak area of
crocet in gentiobiosyl-glucosyl-ester decreased whiie tbat of crocet in gentiobiosyl-ester
increased by an equivalent amount. The &on pigment composition was not rnodifïed by 3
hours of incubation with the 300-fold purified extract.
Table III. Glucosylation proue following 60 min incubation of crude desaited (PD1 O), gel
fltration-purifed and preparative IEF-purified enzyme preparations with 1 .O rnM crocetin and
2.5 mM UDP-Glc. Reaction products have been identified by NMR and mass spectroscopy
(Van Calsteren et al., 1997).
Crocetin and its glycosyl esters (%)
enzymat ic crocetin glucosyla gentb glu-g luc gent-&"
extract
PD10 67 25 2.3 2.1 0.4
GF' 73 22 2 1.2 0.2
IEF 76 22 n-d. 0.8 nad.
b d ' Monoglucosyl. Monogentiobiosyl. ' Diglucosyl. Gentiobiosyl-glucosfi
Gel filtration
n.d. Not detected.
Table IV. Modification of the profile of a &on stigmata pigment extract d e r 1 and 3 hours
of incubation with a crude desalted (PD1 O) extract of Crocus sativus ceil suspensions. Results
are the means of duplicates.
peak areas
Incubation nea-gent' gent-gentb gent-gluc glu-glud gente glucosyl' nocetin
tirne (h)
O 2.5 89 40 1.7 1 1 0.6 0.2
1 2.8 86 7.5 0.2 39 0.7 1.2
3 4.2 83 6.0 0.2 42 0.8 1.8
'Neapolitanosyl-gentiobiosyl ester of crocetin. bDigentiobiosyl ester of crocetin or d crocin. 'Gentiobiosyl-glucosyl ester of crocetin. Diglucosyl ester of crocetin.
f 'Monogentiobiosyl ester of crocetin. Monoglucosyl ester o f crocetin.
4.4 Discussion
The present study is part of a research project aimed at elucidating the pathway leading to the
synthesis of hydrosoluble carotenoids in &on (Crocus sativus). In a previous study, Dufiesne
et al. (1997) showed that enzymatic extracts of d o n calli were able to transfonn dl-tram-
crocetin into its related glucosyl- and gentiobiosyl-esters in the presence of UDP-Glc. They
concluded that the formation of glycosides was deemed to be a step-wise addition of glucose
moieties on the fiee carboxyl functions of crocetin and on the glucosyl fiuictions of crocetin
monoglucosyl- and diglucosyl-esters. Based on dflerences in enzyme kinetics, it was suggested
that two distinct glucosyltransferases were involved in the synthesis of crocin, ie . , GTASE 1
and GTASE2 (Fig. 1). The involvement of two glucosyltransferases in crocin biosynthesis was
supported by the differential activity of the enzymes in safion plant organs. While both
enzymes were constitutive, GTASEl activity was higher in c o r n while GTASE2 was more
active in sprouts.
GTASE 1 was partialiy purified and characterized (Côté et al., submitted). However, the two
putative glucosyltransferases, GTASEl and GTASE2, could not be resolved by gel filtration
cbromatography and, therefore, substrate specificity could not be studied. The purification
method used in this new study is sirnpler and leads to more extensive purification (300-fold)
and higher recovery ( 1 3%). Moreover, the preparative IEF purification step separated
GTASEl fiom GTASES, as evidenced &y the absence of crocetin gentiobiosyl-esters. even
d e r prolonged incubation. The results are evidence that native GTASEI, with a molecular
mass of 50 kD, consists of two subunits of 26 kD (Fig. 3A), in line with o u . previous results
(Côté et al., submitted). Analyticd IEF showed three bands which might be isoforms of
GTASEl (Fig. 3B).
The specificity study demonstrates that, similady to mammalian glucosyltransferases (Beyer et
al., 1 98 1 ), GTASE 1 has strict substrate requirements. Indeed, the 300-fold purified enzyme
preparation used only UDP-Glc as the sugar donor and fded to use UDP-GaL Furthemore,
GTASEI catalyzed the transfer of the glucose moiety only to the fiee carboxyl f ic t ion of
crocet in and to the crocetin monoglucosyl-ester. It fded to glucosylate closely relat ed
substrates such as norbixin, a polyene chah extended by two carbons on each side, with the
first methyi group on carbn y rather than a (Fig. 2). This experiment demonstrates the high
specificity of GTASE 1 for crocetin A callus extract of Vitis vin@ra was also able to catalyze
the glucosylation of crocetin (Dufiesne et al., 1997). GTASEl might be responsible for that
g lucosylating activity, although other glucosyltransferases with a broader specincity spectrum
rnay be involved.
The crude desalted preparation included several glucosyltransferase activities that were
eliminated during purincation. It contained enzymes that could glucosylate crocetin, imns-2-
met hyl-2-pentenoic acid, norbixin, bixir~, h-ans-abscisic acid, pans-retinoic acid, and 1 3-cis-
retînoic acid. To our knowledge, this is the first report of retinoic acid glucosylation. The
glucosyf-ester of abscisic acid has been isolated and quantifieci in Ieaves of Xanthium and
spinach (Boyer and Zeevaart, 1982; Zeevaart, 1983); an enzyme catdyzing the glucosylation of
abscisic acid was purified fiom Macleaya microcarpa celi suspension cultures (Lehmann and
Schütte, 1980). S a o n ceU cultures cataiyze the production of quercetin and isorhamnetin
glucosides (Kokubo et al., 199 1).
The major modification of the profile of Crocus sativus stigmata pigments after incubation with
a crude desalted enzyme extract was a decrease in crocetin gentiobiosyl-glucosyl-ester, with an
equivalent increase in the monogentiobiosyl-ester (Table IV). This might be attni ted to the
hydrolytic activity of a B-glucosidase activity or of an esterase, the former having been detected
in the crude desalted enzyme extract (Côté et al., subrnitted). A reverse activity of the
glucosyltransferase, similar to that shown in parsley ceU cultures (Sutter and Grisebach, 1975),
was precluded because this conversion did not occur with the 300-foId purified safnon enzyme
preparation. The crude desalted extract also contains a glucosyltransferase adding a glucose
mo iety to C2 of a gentiobiosyl-ester group to fom a trisacchary 1 (neapoiitanosy1)-ester group.
Crocet in di-neapoütanosy 1-ester was the major product formed by incubation of &on who le
c e h with exogenous crocetin (Dufieme et al., 1999). This glucosyltransferase was absent in
the 300-fold purined d o n enzyme preparation.
In cornparison with the crude desalted extract, the 300-fold purification elirninated the enzymes
that modified the profle of d o n stigmata pigments. The concentration of crocetin in the
mixture of &on stigmata pigments, a water soluble extract, was too low for cataiytic activity
of GTASE 1 and production of crocetin monoglucosyl-ester.
In conclusion, we have dernonstrated that the glycosylation of crocetin into crocin involves
more than one glucosyltransferase. GTASE 1 catalyzes the glucose transfer on bo th carbxylic
ends of crocetin and GTASE2 catalyzes the formation of glucosidic bonds with formation of
gentiobiosyl esters. These two activities were separateci foliowing preparative IEF. GTASEI,
responsible for the formation of crocetin monoglucosyl and diglucosyl esters. has k e n
c haracterized. Unlüce rnost O ther plant glucosyltransferases, it is highly specific for crocet in and
will not accept substrates that are structurdy closely similar.
4.5 Acknowledgements
We wish to thank B. Stewart for his work on HPLC-MS. The hancial support of F. Côté by a
graduated student feiiowship of the Fonds pour la Formation de Chercheurs et l'Aide à la
Recherche is gratefùlly acknowledged.
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CHAPITRE V
5.1 Conclusion générale
Les glyco syltransférases catalysant la glycosy lation de la fonction hydroxyle de nombreux
métabolites secondaires végétaux ont été très étudiées. Par contre, l'information disponibk sur
la glycosylation enzymatique de la fonction carboxylique est peu abondante. surtout dans le cas
des caroténoïdes.
Dans cette thèse, nous nous sommes penchés sur la biosynthèse des glycosides de la crocétine
ainsi que sur l'hypothèse proposée par Dufiesne et al. (1997), à savoir que la glucosylation de
la crocétine en crocine était catalysée par deux glucosyltransférases distinctes. L'étude s'est
concentrée sur la première glucosyltransférase impliquée dans la glycosylation de la crocétine
en crocine a partir de suspensions cellulaires de &an (Crocus sativus L.), la GTASEI, qui
catalyse le transfert d'un glucose à partir d'üDP-glucose sur les fonctions carboxyüques de la
crocétine.
Les objectifs de cette thèse étaient de purifier, de séparer et de caractériser les
glucosyltransférases impliquées dans la glucosylation de la crocétine en crocine.
Les méthodes de purification par chromatographie d'échange ionique, filtration sur gel, afnnité
a divers Ligands, précipitation et électrophorèse ont été testées. La purification partielle et la
caractérisation d'une des glucosyltransférases impliquées dans la synthèse de la crocine ont
permis d'estimer la température d'activité optimale, le poids moléculaire, le pl, les valeurs Km
pour la crocétine et I'UDP-glucose ainsi que la valeur Vmax. Ces informations sur cette
enzyme sont originales et ont aidé au développement d'une nouvelle méthode de purification.
L' isoélectro focusing préparatif a permis d'isoler la glucosyltransférase qui agit sur les fonctions
carboxyliques de la crocétine et de la séparer de l'activité favorisant la formation des
gentiobiosyles esters de crocétine. Nos résultats démontrent que la glucosylation de la crocétine
en croche est catalysée par au moins deux glucosyltransférases et une différence au niveau de
leurs points isoélectriques permet la séparation de ces activités. L'étude de la spécificité de
substrat a démontré que l'UDF-glucose:crocéte 8,8'-glucosyltransférase (GTASE 1 ) était
spécifique envers la crocétine comme substrat accepteur et qu'elle utilisait uniquement I'UDP-
glucose et non I'UDP-galactose. Cette enzyme est donc un des rares exemples de
glycosyltransférases végétales hautement spécifiques retrouvées dans la littérature. La
purification et la caractérisation d'une UDP-g1ucose:crocétine 8'8'-glucosyltransférase n'avait
jamais été rapportée jusqu'a maintenant.
La spécificité de I'UDP-glucose:crocétine 8,8'-glucosyltransférase envers la crocétine est un
exemple de plus montrant que certaines glycosyltransférases sont aussi spécifiques que celles
d'origine animale. La crocétine n'est pas une molécule ubiquiste, mais ses glycosides
représentent une partie importante des caroténoïdes des stigmates du safran et des h i t s de
gardénia. Le concept d'une enzyme-un lien s'appiique probablement plus dans ce cas que dans
celui de molécules végétales ubiquistes. Cependant, plusieurs études de spécificités ont été
faites avec des extraits qui pouvaient contenir plusieurs glycosyltransférases capables de
glycosyler le substrat étudié. Certaines glycosyltransférases végétales réputées comme non
spécifiques s'avèreraient probablement spécinques à un lien ou à une molécule uniquement
après une purification plus poussée.
L'extrait enzymatique de suspensions cellulaires de d i a n , partiellement purifié, contient
d'autres activités de glucosyltransférases capable de glucosyler des acides gras à courtes
chaîîes de même que I'acide abscissique et l'acide rétinoïque. A notre connaissance, la
glucosylation de ce dernier composé n'a jamais été rapportée dans des cultures cellulaires
végétaies.
L'extrait enzymatique de suspensions ceilulaires de &?an otne donc un potentiel intéressant
pour l'industrie alimentaire ou pharmaceutique étant donné l'intérêt croissant pour les
caroténoïdes hydrosolubles. Le rôle bénéfique du rétinol (vitamine A) dans la protection contre
le cancer et d'autres maladies est bien connu. La crocétine, par ses propriétés antioxydantes, est
également reconnue comme ayant un effet ant i-cancer. La g lycosy lat ion de ces molécules
permettrait leur ajout dans des préparations aqueuses éliminant ainsi des procédés coûteux de
soIubiiisation et élargissant la gamme de produits dans lesquels elies seraient ajoutées.
Les principaux objectifs de cette thèse ont été rencontrés. L'isolation de 1'UDP:glucose:
crocétine 8.8'-glucosyltransfé~ démontre l'implication de plusieurs enzymes. Sa
caractérisation a permis de pdaire nos connaissances sur la biosynthèse des glycosides de la
crocétine.
La localisation des enzymes impliquées dans la glycosylation de la crocétine constitue une
avenue intéressante pour la poursuite de la recherche. Bien que les propriétés d'antioxydant de
la crocétine et de ses glycosides soient connues, le rôle exact de ces molécules dans le &an
demeure encore obscur. L'activité de glucosylation de la crocétine dans le safian a été détectée
ailleurs que dans les stigmates (Dufiesne et al., 1997), alors que la crocine s'y concentre
principalement. Cette activité de glucosylation de la crocétine est-elle associée a I'UDP-
gluco se:crocét ine 8'8'-glucosyltransférase seulement ou à d'autres glucosy ltrans férases
possédant une spécificité de substrat plus élargie?
Il serait intéressant de poursuivre l'étude de la glycosylation de la crocétine en isolant et en
purifiant l'enzyme qui catalyse l'addition de glucoses sur les glucosyle esters pour former les
gentiobiosyle esters de la crocétine. Le clonage des gènes codant pour ces enzymes ainsi que la
transformation d'un microorganisme ou d'une plante à l'aide de ces gènes permettrait de
produire la crocine en quantité industrielle et de façon rentable.
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