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日本バイオ･ラッド ラボラトリーズ株式会社

ライフサイエンス事業本部

リアルタイムリアルタイムPCR PCR 再入門再入門

Z5255 0512A

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リアルタイムリアルタイムPCRPCR再入門再入門 概要概要

• リアルタイムPCR原理

• 蛍光検出ケミストリー

• 遺伝子発現リアルタイムPCR実験フロー

• PCR時間を短縮できるプロトコール紹介

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PCRPCRでの定量性の限界での定量性の限界

PCRでは理論上２倍づつ増幅

さまざまな要因によりPCR後半では理論通りには増幅が行われない

PCR後電気泳動での定量性には限界がある

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リアルタイムリアルタイムPCRPCRの原理の原理

リアルタイムPCRでは、

ある一定の増幅DNA量(Threshold) まで達した時点のサイクルの差を求める

達したサイクルが早ければ、それだけ初期鋳型量が多い

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蛍光増幅曲線蛍光増幅曲線

蛍光増幅曲線グラフ例（108,106,104,102 コピー、IL-1β)

Threshold Cycle = Ct

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検量線検量線

初期鋳型量Threshold Cycle

検量線

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蛍光検出ケミストリー蛍光検出ケミストリー

SYBR Green I・安価かつ簡便

蛍光プローブ・特異的な検出

・マルチプレックス可能

デメリット・非特異的な産物も検出

デメリット・蛍光プローブが高価・蛍光プローブ設計が必要

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SYBR Green I SYBR Green I

Denature

Annealing

Extension

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蛍光プローブ蛍光プローブ//TaqManTaqMan

Denature

Annealing

Extension

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蛍光プローブ蛍光プローブ//Molecular BeaconMolecular Beacon

Annealing

Extension

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遺伝子発現解析における遺伝子発現解析におけるリアルタイムリアルタイムPCRPCR実験実験フローフロー

プライマー/プローブ設計

プライマー/プローブ設計

サンプル調製サンプル調製プロトコール条件検討

プロトコール条件検討

発現解析発現解析

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プライマープライマー//プローブ設計プローブ設計

プライマー/プローブ設計

プライマー/プローブ設計

サンプル調製サンプル調製プロトコール条件検討

プロトコール条件検討

発現解析発現解析

・ Primer3プライマー/プローブ設計サイト

・ RTPrimerDBqPCRプライマー/プローブデータ

ベースサイト

・ Beacon Designer設計ソフトウェア

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サンプル調製サンプル調製

プライマー/プローブ設計

プライマー/プローブ設計

サンプル調製サンプル調製プロトコール条件検討

プロトコール条件検討

発現解析発現解析

・ 迅速なRNA精製

・ 純度の確認A260/A280=1.9-2.1

・ RNA非分解の確認18S/28S rRNAチェック

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プロトコールプロトコール条件検討条件検討

プライマー/プローブ設計

プライマー/プローブ設計

サンプル調製サンプル調製プロトコール条件検討

プロトコール条件検討

発現解析発現解析

・ まずプライマーでの増幅の確認

・ 温度グラジェント機能と融解曲線の組み合わせ

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温度グラジェント機能温度グラジェント機能

最適なアニーリング温度の検討が可能

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融解曲線機能融解曲線機能

SYBR Green Iでは副産物の有無を確認

プライマーダイマー発生例

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検量線による増幅効率検量線による増幅効率

希釈系列から検量線を作成し、相関係数（直線性）と増幅効率を確認

PCR増幅効率 = [10 (-1/slope) ] - 1

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発現解析発現解析

プライマー/プローブ設計

プライマー/プローブ設計

サンプル調製サンプル調製プロトコール条件検討

プロトコール条件検討

発現解析発現解析

・ 発現解析定量方法- 検量線法

- 比較Ct法

いずれもハウスキーピング遺伝子

をリファレンスとして目的の遺伝子の発現量比を求める

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遺伝子発現遺伝子発現 定量方法定量方法

検量線法・増幅効率が100%でなくても

定量可能

比較Ct法・検量線を毎回設定しなくも

定量可能

デメリット・毎回検量線を設定する必要あり

デメリット・増幅効率が100%近くでな

ければならない

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検量線を用いた定量検量線を用いた定量

試料Aに対して試料Bでは遺伝子発現量比が4倍

60/15 = 415 pg60 pg試料B

10/10 = 110 pg10 pg試料A

ハウスキーピング遺伝子でノーマライズしたターゲット遺伝子の相対量

ハウスキーピング遺伝子の初期鋳型量

目的の遺伝子の初期鋳型量

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検量線法でのプレートセット検量線法でのプレートセット

• プレートセットアップ例 SYBR Green検出系

スタンダード102-108コピー4段階希釈系列TGプライマーセット

試料A TGプライマーセット

試料B TGプライマーセット

HKプライマーセット=ハウスキーピング遺伝子に対するプライマーセットTGプライマーセット=目的遺伝子に対するプライマーセット

ブランク TGプライマーセット

スタンダード102-108コピー4段階希釈系列HKプライマーセット

試料A HKプライマーセット

試料B HKプライマーセット

ブランク HKプライマーセット

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比較比較CtCt法法//ΔΔΔΔCtCt法法 実例実例

DCtsampleA = CtTG_sampleA - CtHK_sampleA = 24 – 12 = 12DCtsampleB = CtTG_sampleB - CtHK_sampleB = 15 – 12 = 3

D(DCt) = DCtsampleB - DCtsampleA = 3 – 12 = - 9

発現量比 = 2-D(DCt) = 2-(-9) = 512

試料Aに対して試料Bは512倍の発現量比

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ΔΔΔΔCtCt法でのプレートセット法でのプレートセット

• プレートセットアップ例 SYBR Green検出系

試料A TGプライマーセット

試料B TGプライマーセット

ブランク TGプライマーセット

試料A HKプライマーセット

試料B HKプライマーセット

ブランク HKプライマーセット

HKプライマーセット=ハウスキーピング遺伝子に対するプライマーセットTGプライマーセット=目的遺伝子に対するプライマーセット

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比較比較CtCt法のノーマライゼーション法のノーマライゼーション

• DDCt– 100%の増幅効率が前提

– 1つのリファレンス遺伝子のみ設定可

• Pfaffl 改法– 増幅効率を考慮した算出法

– 1つのリファレンス遺伝子のみ設定可

• Vandesompele 改法– 増幅効率を考慮した算出法

– 複数のリファレンス遺伝子の設定可

Simple

Complex

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DDDDCtCt法法

発現量比 = 2-D(DCt)

D(DCt) = DCt sample - DCt control

DCt control = Ct GOI_control – Ct REF_control

DCt sample = Ct GOI_sample – C tREF_sample

目的の遺伝子(Gene of Interest）=GOIリファレンス遺伝子（Reference Gene）=REF

コントロール試料=control対象試料=sample

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PfafflPfaffl改法改法

EGOI

(Ct GOI (control) - Ct GOI (sample))

EREF

(Ct REF (control) - Ct REF (sample))=発現量比

E = 1 + (h/100) h ： 増幅効率（%）もし100%なら、E=2となり、ΔΔCt法と同じ結果になる

目的の遺伝子(Gene of Interest）=GOIリファレンス遺伝子（Reference Gene）=REF

コントロール試料=control対象試料=sample

A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.Michael W. Pfaffl. Nucleic Acids Research, 2001, Vol. 29, No. 9 e45

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VandesompeleVandesompele法法

対象試料の相対量

リファレンス遺伝子の相対量の相乗平均

E(GOI)

(Rel Quant Ref1 * Rel Quant Ref2 * . . . * Rel Quant Ref n)1/n

目的の遺伝子(Gene of Interest）=GOIリファレンス遺伝子（Reference Gene）=REF

コントロール試料=control対象試料=sample

(CtGOI(control)-CtGOI(sample))

＝

Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes.Vandesompele, J.Katleen De Preter, Filip Pattyn, Bruce Poppe, Nadine Van Roy, Anne De Paepe and Frank Speleman. Genome Biology 2002, 3:research0034.1-0034.11

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発現解析発現解析

プライマー/プローブ設計

プライマー/プローブ設計

サンプル調製サンプル調製プロトコール条件検討

プロトコール条件検討

発現解析発現解析

・ 発現解析の定量方法- 検量線法

- 比較Ct法

まずは検量線法で実験を行ってい

き、実験に慣れてきて、サンプル数が多くなってきたら比較Ct法を行うことをおすすめします

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PCRPCR時間を短縮できる時間を短縮できるプロトコールプロトコール

• 既存のサーマルサイクラーやリアルタイムPCRシステムで、PCR時間を大幅に短縮するためのプロトコール（Fast PCRプロトコール）が実行可能です

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PCRPCRのプロトコールでは何がスピードののプロトコールでは何がスピードの決め手となっているのか？決め手となっているのか？

実際のPCR実行時間は以下のものに影響されます:

• ステップおよびサイクル数

• それぞれのステップにおける時間の長さ

• それぞれのステップの温度に到達するまでの時間の長さ (ランピング時間)

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PCR実行時間を減らすには以下のことを実施します:

• ステップおよびサイクル数を最小限にする

• それぞれのステップでの時間を短くする

• ステップ間の温度差を減らし、ランピング時間を最小限にする

いかにいかにPCRPCR実行時間を短くするか実行時間を短くするか??

変性

アニーリング

伸長反応

変性

アニーリング/伸長反応

標準的なPCRプロトコール Fast PCRプロトコール

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よりより速い速いPCRPCRのためにはのためにはどのようにプロトコールを改変するのかどのようにプロトコールを改変するのか??

250 bp以下のターゲットでのFast PCRプロトコールを実行するための改変方法は:

• Tm値が64–69℃のプライマーを作製

(Tm値はSanta Lucia nearest-neighbor法にて計算します)

• 最初のテンプレート変性/酵素活性化ステップを98℃、30秒に変更

• それぞれのサイクルでの変性ステップを92℃、1秒に変更

• アニーリングと伸長反応ステップを、70℃、20秒の１つのステップに結合

* 注: プライマーのTm値が上記範囲内にはいらない場合、2-3bp長くするか、あらためて設計する必要があります。

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プロトコール変更例プロトコール変更例

短縮時間 = 54 分

95℃ 10分

72℃ 10分

95℃ 15秒

60℃ 30秒

72℃ 30秒

35 x

温度を高く、時間を短く

温度を低く、時間を短く

98℃ 30秒

92℃ 1秒

x 3570℃ 20秒

アニーリングと伸長反応ステップを70℃の一つのステップにし、時間を短く

ステップ削除（250 bp以下の短いPCR産物では通常最終伸長反応は必要ありません）

改変“Fast”プロトコール通常のプロトコール

終了までの実時間: 1 時間 28分 34 分

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Fast PCRFast PCRと標準と標準PCRPCRプロトコールのプロトコールのPCRPCR産物泳動結果産物泳動結果

ターゲットは 約150～250 bpで、Tm値は63–67℃と違いがあるもので検証し、Fastプ

ロトコール(F)と標準プロトコール(S)両方で実行しました。iCyclerサーマルサイクラーを用いて、iTaq DNAポリメラーゼにてPCRを実施し、アガロース電気泳動による結果を示します。

標準プロトコール: 95℃/3分→（95℃/15秒→62℃/30秒→72℃/30秒） x 35サイクル→72℃/10分

Fastプロトコール: 98℃/30秒→（92℃/1秒→70℃/20秒） x 35サイクル

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リアルタイムリアルタイムPCRPCRでのでの正確な定量結果正確な定量結果

MiniOpticonリアルタイムPCR解析システム用いて、リアルタイムPCRの実施結果。相関係数=0.995、増幅効率=99.3%

PCR実行時間 = 33 分

プロトコール: 98℃/ 30秒→（92℃/1秒→70℃/5秒→plate read) x 30 サイクル

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Fast PCRFast PCRプロトコールプロトコール まとめまとめ

• プロトコールを改変するだけでPCR実行時間は1.5～2.0時間から30～40分間に減少させることが可能です。

• 特殊な機器を導入しなくても、既存のサーマルサイクラーやリアルタイムPCRシステムでPCR時間を短縮することが可能です。

• より詳細な情報 -Fast PCRチュートリアル PDF版-は弊社Webサイトhttp://discover.bio-rad.co.jpよりダウンロードが可能です。