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FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PAMPA
TESINA PRESENTADA PARA OBTENER
EL GRADO ACADÉMICO DE
LICENCIADO EN CIENCIAS BIOLOGICAS
“DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE MICOTOXINAS EN ALIMENTOS
BALANCEADOS PARA PONEDORAS”
Dieser, Marilina Anahí
SANTA ROSA (LA PAMPA) ARGENTINA
2014
PREFACIO
Esta Tesina es presentada como parte de los requisitos para optar al grado
Académico de Licenciado en Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de La Pampa
y no ha sido presentada previamente para la obtención de otro título en esta Universidad ni
en otra Institución Académica. Se llevó a cabo en el Centro de Investigación y Desarrollo
de Fármacos (CIDEF) de la Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLPam, en General Pico,
durante el período comprendido entre el 11 de enero de 2014 y el 30 de diciembre del
2014, bajo la dirección del Dr. Toso, Ricardo E. y bajo la codirección de la Dra. Bazán,
Graciela I.
30 de Diciembre de 2014 Firma:
Departamento de Ciencias Biológicas
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad Nacional de La Pampa
Dra. Silvia M. ARDOINO Dr. Ricardo E. TOSO Lic. María J. GALEA
i
AGRADECIMIENTOS
A la Universidad Nacional De La Pampa y a la Facultad de Ciencias Exactas y
Naturales por darme la oportunidad de estudiar y ser un profesional.
A la Facultad de Veterinarias por brindarme un lugar en el laboratorio, equipos y
financiamiento.
Al Dr. Ricardo Toso, mi director, y a la Dra. Graciela Bazán, mi codirectora, por
aceptarme como su tesista, por guiarme, aconsejarme, enseñarme y sobre todo por su
confianza, tiempo, amabilidad, paciencia y buen humor con el que me recibieron y
escucharon siempre. Muchas gracias.
A Dra. Silvia Ordoino por su tiempo, paciencia y enseñanza.
A mis amigos de la vida, de la facultad y de trabajo, que me acompañaron en todo
mi camino por la universidad, por su apoyo, paciencia, compañía y por permitir que los
días complicados no se vieran tan grises.
A mi familia, especialmente a mis padres, por el esfuerzo que hicieron para que
pueda estudiar y llegar a esta instancia. Por estar siempre a mi lado, apoyarme, ayudar a
que no baje los brazos, a sobrepasar cualquier obstáculo y enseñarme que sólo con
esfuerzo, paciencia y perseverancia se logra alcanzar lo que uno desea.
¡Gracias infinitas!
ii
RESUMEN
Las micotoxinas son metabolitos secundarios elaborados por los hongos
Aspergillus, Penicillium y Fusarium, en condiciones favorables de crecimiento: elevada
humedad, temperatura afectando principalmente a los cereales; pudiendo establecerse en
el campo o durante la recolección, transporte y almacenamiento. Ingresan en la cadena
alimentaria al contaminar los alimentos balanceados y las materias primas utilizadas para
su elaboración de tal forma que, al consumir dichos alimentos, provocan en el ser humano
y en los animales trastornos toxicológicos substanciales denominado micotoxicosis. Si bien
se reconocen numerosas micotoxinas sólo algunas tienen propiedades tóxicas de
importancia, entre ellas las aflatoxinas. El objetivo del presente trabajo fue analizar
muestras de alimento balanceado para ponedoras en la cuidad de General Pico, La Pampa,
y determinar en ellos la presencia de Aflatoxinas. Entre los meses de julio y septiembre de
2014 se tomaron muestras de 200 gramos de bolsas de balanceados trazables de distintos
lotes, provenientes de 3 proveedores de la ciudad. Una vez tratadas las muestras se realizó
la lectura mediante la prueba de inmunoensayos enzimáticos competitivos tipo ELISA. El
análisis de los resultados evidenció que el 77,8 % de las muestras de alimento balanceado
para ponedoras dio positivo a Aflatoxinas y el 55,6 % del total alcanzó valores superiores
al permitido comercialmente de 12 ppb. A partir de este estudio advertimos que es
indispensable alertar y concientizar a los productores y comerciantes de alimentos
balanceados sobre las normas de seguridad e higiene en recolección, transporte y
almacenamiento de cereales con destino a alimentos balanceados para evitar el desarrollo
de micotoxinas y prevenir las pérdidas en cuanto a la producción avícola como así
también, evitar los efectos adversos sobre la salud animal y humana.
ABSTRACT
Mycotoxins are produced by Aspergillus, Fusarium and Penicillium fungi under
favorable growth conditions: high humidity and temperature and mainly affect cereals
secondary metabolites, may be established in the field or during harvesting, transportation
and storage. Enter the food chain to contaminate balanced food raw materials used in their
production so that by consuming these foods, cause in humans and animals called
mycotoxicosis substantial toxicological disorders. While many mycotoxins are recognized
iii
only some have toxic properties of importance, including aflatoxins. The objective of this
study was to analyze samples of balanced feed for laying hens in the city of General Pico
(LP) and they determine the presence of Aflatoxin. Between July and September 2014
samples of 200 grams of bags of different lots traceable to balanced, 3 providers from the
city were taken. Once treated samples reading test was performed by competitive ELISA
enzyme immunoassays. The analysis of the results showed that 77.8% of the pet food
samples tested positive for laying Aflatoxins and reached 55.6 % of the total above 12 ppb
commercially allowed values. From this study we note that it is essential to internalize and
awareness among producers and traders balanced about the rules safety and hygiene in
collection, transportation and storage of cereals to balanced foods to prevent the
development of mycotoxins and thereby prevent the adverse effects on animal and human
health.
iv
ÍNDICE DE CONTENIDOS
AGRADECIMIENTOS i
RESUMEN ii
ABSTRACT ii
ÍNDICE DE CONTENIDOS iv
ÍNDICE DE TABLAS, FIGURAS Y LAMINAS v
I INTRODUCCIÓN 1
III HIPÓTESIS 13
VI MATERIALES Y MÉTODOS 14
VII RESULTADOS 16
VIII DISCUSIÓN 18
IX CONCLUSIONES 20
X RECOMENDACIONES 21
X1 INVESTIGACIONES FUTURAS 22
XII REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA 23
XIII ÍNDICE GENERAL 27
v
INDICE DE TABLAS, FIGURAS Y LÁMINAS
FIGURAS
Pág.
1 2
-Esquema del cuerpo fructífero de un hongo superior. - Fórmula estructural de la Aflatoxina.
1 4
3 4
- Aspergillus flavus. -Fórmula estructural de la Ocratoxina A.
4 5
5 6
-Fórmula estructural de la Zearalenona. -Fórmula estructural de la Fumonisina.
6 6
7 8
-Fórmula estructural del Tricoteceno. -Fórmula estructural de la Citrinina.
6 6
9 10 11 12 13 14 15 16 17
-Fórmula estructural de la Patulina. -Fórmula estructural de la Sterigmatocistina. -Fórmula estructural de la Ergotamina. -Matabolito de aflatoxina en unión con el DNA celular. -Adición de la solución stop a los pocillos. -Lectura de la muestra en ELISA. -Curva de calibración para los estándar de control -Curva de calibración de las muestras problemas. -Curva de calibración de muestras control y muestras problemas.
7 7 8 11 15 16 17 17 18
TABLAS
Pág.
1
-Valores de absorbancia y concentración de aflatoxinas registrados en los controles (Estándar) y en las muestras.
16
DIESER, Marilina “Determinación de la presencia de micotoxinas en alimentos balanceados........”
1
INTRODUCCIÓN
Los hongos configuran un grupo de organismos eucarióticos, unicelulares o
pluricelulares. Carecen de clorofila y su estructura histológica y morfológica constituye un
talo. La carencia de pigmentos fotosintéticos es una característica que distingue a los
hongos de las demás talofitas y es condicionante en su actividad biológica pues debido a
ello, estos organismos son capaces de sintetizar materia orgánica sin utilizar la luz solar
como fuente de energía. Por este motivo deben desarrollarse sobre un sustrato que
contenga materia orgánica, factor que condiciona los lugares de crecimiento (Gimeno &
Martins, 2011). La obtención de los nutrientes se lleva a cabo por digestión extracelular ya
que secretan enzimas que descomponen el material orgánico y luego absorben los
productos solubilizados. El talo está formado típicamente por filamentos microscópicos
denominados hifas que se ramifican en todas las direcciones desplegándose sobre el
substrato que le sirve de alimento o dentro de él (Alexopoulos et al., 1996) (Fig. 1). El
conjunto de hifas se denomina micelio. Estos organismos necesitan para crecer una
temperatura óptima que varía entre los 20°C a 30°C y prefieren medios ácidos con un pH
óptimo de 6.
Fig. 1: Esquema del cuerpo fructífero de un hongo superior. Detalle de estructuras reproductivas y del micelio constituido por hifas.
Se reproducen sexual o asexualmente por medio de esporas. La reproducción
asexual permite la propagación de la especie, debido a que conforma la producción de
numerosos individuos y esta se repite varias veces en el año. Se pueden originar por
fragmentación del soma, fisión de las células somáticas, gemación y producción de
esporas. El proceso de reproducción sexual presenta tres fases distintas: plasmogamia,
DIESER, Marilina “Determinación de la presencia de micotoxinas en alimentos balanceados........”
2
unión de dos protoplastos que reúne los núcleos en el interior de una misma célula;
cariogamia, fusión de los dos núcleos y meiosis, reducción del número de cromosomas
hasta el estado haploide (Alexopoulos et al., 1996).
En relación al hábitat, los hongos han conquistado un gran número de ambientes,
cumpliendo importantes roles en los diversos ecosistemas (Webster & Weber, 2011). Entre
sus hábitos de vida encontramos especies saprófitas, parásitas y simbióticas. Tienen vital
importancia ecológica, ya que junto a las bacterias son los principales descomponedores de
materia orgánica como madera, pelos, alimentos almacenados, etc. Al ser microorganismos
de gran extensión y crecer en todo tipo de materia orgánica, se encuentran frecuentemente
como contaminantes en productos alimenticios, causando pérdidas importantes. Dada su
capacidad invasiva y su gran resistencia constituyen el agente deteriorante más común de
todo tipo de alimentos (Combita Prieto & Mildenberg Ortiz, 2009).
Revisten importancia médica como generadores de antibióticos, alcanzando
notoriedad en la industria química y alimenticia (Herrera & Ulloa, 1990; Alexopoulos et
al., 1996; Martinez, 2007; Ruiz Boyer, 2014).
1- Micotoxinas
Algunos hongos pueden producir sustancias químicas conocidas como micotoxinas.
Los principales géneros de hongos productores de estas sustancias son Aspergillus,
Fusarium y Penicillium (Altolaguirre, 2006; Anguiano Cabello et al., 2012).
Las micotoxinas son “metabolitos secundarios” fúngicos cuya ingestión, inhalación
o absorción cutánea reduce la actividad de otros organismos, causando enfermedades o aún
la muerte en animales, sin excluir las aves y personas (Pitt, 1996). Diversos factores como
temperatura, pH, humedad, presencia de plagas, madurez del grano al momento de la
cosecha, daño mecánico y condiciones de almacenamiento, influyen en la producción de
micotoxinas, pudiéndoselas encontrar en diversos alimentos y forrajes, por lo que se han
relacionado con diferentes enfermedades de animales y personas (Mayer, 1953; Coker,
1997).
La exposición de animales a micotoxinas puede producir toxicidad tanto aguda
como crónica, con resultados que van desde efectos nocivos en el sistema nervioso central,
en el aparato digestivo, cardiovascular, respiratorio y problemas hepáticos, relacionados
con la formación de un hígado graso y de mayor tamaño, hasta la muerte. Todas estas
complicaciones afectan al mercado, debido a que no sólo se observa una disminución en la
productividad, sino que también se ve una baja en la calidad de los productos.
DIESER, Marilina “Determinación de la presencia de micotoxinas en alimentos balanceados........”
3
Las micotoxinas también pueden ser agentes cancerígenos, mutágenos, teratógenos
e inmunodepresores. Actualmente está muy extendida la opinión de que el efecto más
importante de las micotoxinas, particularmente en los países en desarrollo, es la capacidad
de algunas de ellas de obstaculizar la respuesta inmunitaria y por consiguiente, reducen la
resistencia a enfermedades infecciosas (FAO, 2003). La exposición a las micotoxinas se
produce principalmente por ingestión, aunque también por su inhalación y contacto
cutáneo. Los efectos producidos se conocen como micotoxicosis, cuya gravedad depende
de la toxicidad de la micotoxina, del grado de exposición, edad, estado nutricional del
individuo, tipo de producción y de los posibles efectos sinérgicos de otros agentes
químicos a los que este expuesto (Combita Prieto, 2009; Torres, 2011).
Se han identificado hasta el momento más de 200 micotoxinas, las que se pueden
encontrar de forma más frecuente como contaminantes naturales en los alimentos para
animales y para humanos son: aflatoxinas, ocratoxinas, fusariotoxinas, citrinina, patulina,
sterigmatocistina, alcaloides del Ergot (Gimeno & Martins, 2011).
· Aflatoxinas: (Fig. 2) el término fue acuñado a comienzos de 1960, cuando
miles de pavos, patos y otros animales domésticos murieron a causa de una enfermedad
conocida como "enfermedad X de los pavos" que se atribuyó a la presencia de toxinas de
Aspergillus flavus (Fig. 3) en harina de maní, importada de Sudamérica (Austwick, 1978).
Entre los hongos de importancia mundial en la producción de este tipo de toxinas
encontramos a Aspergillus parasiticus que produce aflatoxinas B1, B2, G1 y G2, y A.
flavus con aflatoxinas B1 y B2 (Miller, 1994).
El género Aspergillus fue descrito por primera vez en 1729 por P. A. Micheli, quien
comprobó que la cabeza conidial de este hongo se parecía a un "aspergillum”, (aspersor) es
un hongo filamentoso hialino, es "patógeno oportunista" que suele afectar a pacientes con
mecanismos de defensa comprometidos.
Aspergillus spp requiere determinadas condiciones para su desarrollo y producción
de toxinas. Crecen en ambientes con una humedad relativa del 80-90 % y una temperatura
que va desde los 4°C hasta 45°C. La toxina se produce entre los 11°C y hasta 35°C, siendo
la temperatura óptima 22°C. Estas especies de hongos crecen saprofíticamente y los
productos alimenticios pueden servir como sustrato. A. parasiticus se aísla principalmente
del suelo, mientras que A. flavus se lo puede encontrar en las partes aéreas de las plantas.
DIESER, Marilina “Determinación de la presencia de micotoxinas en alimentos balanceados........”
4
Fig. 2: Fórmula estructural de Fig. 3: Aspergillus flavus. la aflatoxina.
Las aflatoxinas exhiben baja solubilidad en agua y son solubles en soluciones
acuosas de metano, acetonitrilo o acetona. Son relativamente inestables a la luz y al aire en
estado puro y susceptibles a la hidrólisis alcalina; son afectadas por amoníaco o hipoclorito
de sodio (pH>10.5); termo-resistentes, estables en un rango de pH entre 3 y 10; inodoras,
incoloras e insípidas; así como químicamente estables en los alimentos y resistentes a la
degradación bajo procedimientos de cocción normales y de difícil eliminación una vez que
se producen (Guzmán-De Peña, 2007). Tienen una gran actividad cancerígena,
teratogénica y mutagénica. El principal síndrome que producen es el hepatotóxico,
pudiendo también provocar problemas renales. Los principales órganos afectados son:
hígado, riñón y cerebro. Las aflatoxinas son inmunosupresivas ya que inhiben la
fagocitosis e interrumpen la síntesis del ADN, ARN y proteínas en el ribosoma. La
absorción de los aminoácidos se ve alterada y la retención hepática de éstos aumenta. El
efecto inmunosupresivo predispone al organismo animal a que sea invadido por
microorganismos patógenos (Gimeno & Martins, 2011). Se las considerada el agente
cancerígeno más potente. Pueden desarrollar el denominado síndrome de aflacotoxicosis,
que se caracteriza por vómitos, dolor abdominal, convulsiones y, en el peor de los casos,
alteraciones en riñones y corazón (Gimferrer Morató, 2012).
El nivel máximo admisible de aflatoxinas en los alimentos para consumo humano
dado por la FAO/OMS es de 20 ppb. Niveles superiores de estas toxinas pueden causar
intoxicación que se manifiesta sobre todo en lesiones hepáticas. Por el contrario el valor
límite de estas toxinas en alimento comerciales para ponedoras varía de acuerdo a la
especie, edad, peso y producción; siendo el valor límite para ponedoras de 12 ppb (Lesson,
et at., 1996) concentraciones superiores llevan a afectar la producción y salud de las aves.
DIESER, Marilina “Determinación de la presencia de micotoxinas en alimentos balanceados........”
5
Hasta el momento han sido identificadas 20 aflatoxinas diferentes, sin embargo
únicamente las aflatoxinas B1, B2, G1 y G2 se originan de manera natural en sustratos
contaminados por Aspergillus aflatoxigénicos. Las demás aflatoxinas como M1, M2, P1,
Q1 y aflatoxicol entre otras, ocurren como productos metabólicos de sistemas microbianos
o animales (Rojas Contreras et al., 2009).
· Ocratoxinas: producidas por Aspergillus ochraceus y diversas especies del
género Penicillium (Fig. 4) (Valle Vega & Florentino, 2000). Están presente en maíz,
arroz, guisantes, café, cerveza, vino, cacao, nueces e higos (Pavón Moreno, 2007). Los
principales animales afectados son el cerdo y el ganado avícola. Son principalmente
nefrotóxicas (nefrosis tubular), hepatotóxicas, teratógenas y afectan el intestino delgado
(Altolaguirre, 2006).
Fig. 4: Fórmula estructural de la Ocratoxina A.
· Fusariotoxinas: poseen como principales representantes las fumonisinas
(Fig. 5), la zearalenona (Fig. 6) y los tricotecenos (Fig. 7), producidas por diversas especies
del género Fusarium, que forma parte de la flora de campo (sustratos fitopatógenos,
plantas vivas) y de la flora intermedia (sustratos de cereales recién recogidos y aún
húmedos). Este moho crece entre 6°C y 40ºC con un óptimo entre 18°C y 30ºC.
Los síntomas de intoxicación son taquicardia, vómitos, diarreas, hemorragia en
mucosas, edema, necrosis de piel, destrucción de tejido hematopoyético, disminución de
células blancas y plaquetas en sangre, hemorragia en meninges, desordenes nerviosos y
rechazo del alimento. No son cancerogénicas como las aflatoxinas y las ocratoxinas y su
principal efecto tóxico parece ser la inhibición de la síntesis proteica. Afectan la división
celular de mucosas del tracto gastrointestinal, piel y tejido linfoide (Perusia, 2001; Flores
Ortíz et al., 2006).
DIESER, Marilina “Determinación de la presencia de micotoxinas en alimentos balanceados........”
6
Fig. 5: Fórmula estructural de la Zearalenona. Fig. 6: Fórmula estructural de la Fumonisina.
Fig. 7: Fórmula estructural del Tricoteceno.
· Citrinina: es la única micotoxina producida por Penicillium citrinun, si
bien P. expansum y P. verrucosum también puede originarla (Fig. 8). Las fuentes más
comunes en las que se la suele encontrar son: granos molidos, harina y todos los cereales,
maní y frutas. Causa daño a los riñones y al hígado. Otros efectos incluyen la
vasodilatación, constricción de bronquios e incremento del tono muscular (Altolaguirre,
2006).
Fig. 8: Fórmula estructural de la Citrinina.
DIESER, Marilina “Determinación de la presencia de micotoxinas en alimentos balanceados........”
7
· Patulina: es producida por algunas especies fúngicas de los géneros
Penicillium, Aspergillus y Byssochlamys (Fig. 9). Crece en las frutas, incluyendo la
manzana, la pera y las uvas, causando manchas de pudrimiento color café y otras
características de podredumbre. Posee propiedades antibióticas de amplio espectro y se ha
probado para tratar el resfriado común. Sin embargo, nunca se ha demostrado su
efectividad y, a la luz de su toxicidad, no se ha insistido en el uso para tratamiento médicos
debido a que es irritante estomacal y produce nauseas y vómitos.
Entre los síntomas de toxicidad por patulina encontramos hemorragia del tracto digestivo
en ganado (Perusia, 2001; Borrell & Gimeno 2012).
Fig. 9: Fórmula estructural de la Patulina.
· Sterigmatocistina: es producida por diferentes especies de hongos,
pero Aspergillus versicolor es el más importante (Fig. 10). Se lo encuentra en granos de
trigo, maíz, arroz, harinas, granos de café verde, especias, queso y carnes. Este compuesto
puede ser un precursor en la biosíntesis de las aflatoxinas. Produce los mismos efectos, es
tóxico, carcinogénico, mutagénico y teratogénico, pero su actividad es menor que la de las
aflatoxinas (Altolaguirre, 2006).
Fig. 10: Fórmula estructural de la Sterigmatocistina.
DIESER, Marilina “Determinación de la presencia de micotoxinas en alimentos balanceados........”
8
· Alcaloides del Ergot: es producido por Claviceps purpúrea (Fig. 11). Se
encuentra en cereales como centeno, trigo, cebada, avena, mijo, sorgo y maíz. En los seres
humanos causa diversos efectos que van desde mareos, dolor de cabeza, calambres, hasta
el ergotismo gangrenoso.
Fig. 11: Fórmula estructural de la Ergotamina.
2- Factores de crecimiento
Los hongos productores de aflatoxinas están muy extendidos por todo el mundo, en
climas templados, subtropicales y tropicales. Potencialmente, pueden producir estos
metabolitos, antes o después de la cosecha, en numerosos alimentos y piensos,
especialmente semillas de oleaginosas, nueces comestibles y cereales (Coker, 1997). Si
bien las aflatoxinas están relacionadas predominantemente con productos de origen
subtropical y tropical, se ha comunicado también su presencia en climas templados en
cereales tratados con ácidos (Pettersson et al., 1989).
Para el crecimiento de los hongos y la producción de micotoxinas existen tres
factores fundamentales que son condicionantes:
a.- Factores físicos (humedad o agua libre y actividad de agua (aw); temperatura;
zonas de microflora; integridad física de los granos).
b.- Factores químicos (pH; composición del sustrato; nutrientes minerales;
potencial de oxi-reducción, O2/CO2).
c.- Factores biológicos (presencia de invertebrados; cepas específicas) (Gimeno &
Martins, 2011).
Factores climáticos y condiciones inadecuadas de almacenamiento en los alimentos
para aves, influyen sobre una gran variedad de cultivos favoreciendo la presencia de
aflatoxinas (Flores Ortiz et al., 2006; Chi & Broomhead, 2009). A su vez el tipo de
nutrientes y de sustrato son importantes para la producción de aflatoxinas, la cual puede ser
DIESER, Marilina “Determinación de la presencia de micotoxinas en alimentos balanceados........”
9
estimulada por un alto nivel de carbohidratos y un bajo nivel de proteínas; los
carbohidratos proveen los dos carbonos precursores para la síntesis de la toxina.
Algunos autores estiman que, de no controlarlos convenientemente, en algunos
años la mayoría de los alimentos presentarán indicios de aflatoxinas (Udagawa, 1988;
Alexopoulos et al., 1996).
El factor más común que produce variabilidad en el análisis de las toxinas es el
muestreo inadecuado del alimento, debido a que estas no están distribuidas uniformemente
en todo el lote de alimento para animales o para humanos. Se concentran más en áreas de
mayor humedad y/o con niveles de oxígeno más elevados (FAO, 2003).
3- Aflatoxicosis y producción avícola
Las micotoxinas usualmente ingresan al animal a través del consumo de alimento
contaminado. La importancia de las aflatoxinas en aves no sólo se debe a su presencia
frecuente, sino también, a su alto potencial tóxico en la producción de aves. Los efectos y
la susceptibilidad pueden variar dependiendo de la edad, raza, estado nutricional, dosis,
sexo, estado inmune y tratamiento con drogas. Se ha comprobado, por ejemplo, que lo
pollos jóvenes son más sensibles a las toxinas que los pollos de más edad.
La presencia silenciosa de éstas toxinas, sólo se hace evidente cuando sus
concentraciones actúan deprimiendo el crecimiento en las aves y la eficiencia alimenticia
entre un 5-8%, ya que los problemas como fragilidad folicular aviar y disminución de la
calcificación suelen pasar desapercibidos. Se puede observar también palidez en las
mucosas y en las patas de los pollos y ponedoras que reciben alimento balanceado
contaminado con aflatoxinas (Mallmann, 2007).
En brotes de aflatoxicosis, una de las características más destacadas es la mala
absorción del alimento, lo que se manifiesta por la presencia de partículas mal digeridas de
alimento balanceado en las excretas de las aves y un aumento de la excreción de lípidos.
En pollos de engorde la esteatorrea está acompañada por una reducción en la actividad de
la lipasa pancreática, principal enzima digestiva de las grasas, y una disminución de las
sales biliares necesarias tanto para la digestión como para la absorción de grasas,
ocasionando el desarrollo de hígado graso (Soria, 2013). Un hígado graso va a contener
alrededor del 55 % de grasa, en contraposición con un hígado normal que tiene 36 %. La
muerte generalmente ocurre por la ruptura del hígado junto con fuertes hemorragias.
El peso del cuerpo en los pollitos de 6 días de edad decrece significativamente al
ingerir alimentos contaminados con concentraciones de 5 ppb de aflatoxinas y, con niveles
DIESER, Marilina “Determinación de la presencia de micotoxinas en alimentos balanceados........”
10
de 2,5 ppb este efecto aparece a los 17 días de nacidos. Por otro lado a partir de los 12 días,
los valores de hematocrito y hemoglobina también se ven reducidos en los pollos que
ingieren dietas con 5 ppb de aflatoxinas (Huff et al., 1986).
Pequeñas cantidades de aflatoxinas en el alimento balanceado pueden causar una
disminución significativa en el aumento de peso, un mayor porcentaje de mortalidad,
menor producción y peso de huevos (Chi & Broomhead, 2009). Además se produce una
disminución proporcional en el tamaño de las yemas, debido a los daños causados en la
síntesis proteica y lipídica. A pesar de ello, la deposición de calcio en la cáscara de los
huevos en sí misma no se ve afectada, pero si se origina un aumento del espesor de la
cáscara, pudiendo afectar esto la eclosionabilidad, debido a una reducción de los
intercambios gaseosos entre el embrión y el medio ambiente (Mallmman et al., 2007).
La aflatoxicosis está fuertemente asociada con un aumento a la susceptibilidad de
enfermedades infecciosas, debido a la capacidad de las aflatoxinas de interferir con la
síntesis de proteínas. En pollos, estas toxinas aumentan la susceptibilidad o severidad a la
coccidiosis, salmonelosis y demás agentes patógenos.
4- Riesgos para la salud humana
El mayor peligro potencial para el hombre radica en los consumidores de carne o
huevos contaminados, ya que en éstos, pueden producir distintas patologías, algunas tan
graves como cáncer de hígado (Beardall & Miller, 1994; Arrieta Mendoza et al., 2006). El
mecanismo de acción de las aflatoxinas en el organismo toma la siguiente secuencia:
a. Penetración en las células y sus núcleos.
b. Combinación con el ADN.
c. Reducción de la síntesis de ARN, especialmente del ARNm.
d. En pocos minutos bloquean la proteosíntesis y causa la inhibición del ARNm y de la
mitosis.
e. La inhibición de la mitosis es seguida por la muerte celular (Rojas Contreras et al.,
2009).
Cuando se ingiere un alimento contaminado con aflatoxina B, ésta primero se
absorbe en el intestino delgado y luego es transportada en la sangre, donde los glóbulos
rojos y proteínas plasmáticas la conducen hacia el hígado. En las células hepáticas la
toxina se metaboliza en el retículo endoplasmático para transformarse en las aflatoxinas P,
M, Q (Martínez Padrón et al., 2013).
DIESER, Marilina “Determinación de la presencia de micotoxinas en alimentos balanceados........”
11
La capacidad de la aflatoxina para producir mutaciones se observa en la habilidad
que presenta un metabolito activado para unirse covalentemente a la guanina del ADN en
la posición N-7 (Fig. 13). Estos enlaces ocasionan disrupciones en la transcripción y
traducción, acciones que podría ser importante en el inicio del cáncer (Álvarez Bañuelos et
al., 2000; Novoa Urrego & Gonzalo, 2006)
También producen otros efectos patológicos sobre el sistema inmunitario, sobre el
metabolismo, sistema gastrointestinal, piel, sistema nervioso central. En India fallecieron
varias personas en 1974 a causa de una intoxicación aguda por aflatoxinas, cuando las
lluvias intempestivas y la escasez de alimentos impulsaron el consumo de maíz
contaminado (Krishnamachari et al., 1975).
Fig. 12: Metabolito de aflatoxina en unión con el DNA celular.
Si la acción inmunodepresora de las aflatoxinas en el ganado se manifiesta de
forma similar en las personas, es posible que tanto las aflatoxinas como otras micotoxinas,
desempeñen un papel importante en la etiología de las enfermedades que sufre la población
en ciertos países en desarrollo, en los que se ha comunicado una alta exposición a estas
toxinas (Peraica et al., 1999; Bogantes Ledezma et al., 2004; Lazo & Sierra, 2008).
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5- Estrategias de prevención y control
La prevención debe comenzar en el campo, allí se inicia uno de los focos de
contaminación de muchos suministros básicos para la elaboración tanto de los alimentos
compuestos para animales como de los alimentos para humanos.
Deben ser utilizados, fungistáticos, fungicidas e insecticidas adecuados, debiendo
cuidar en estos últimos, que los niveles de residuos estén dentro de las concentraciones no
nocivas y permitidas. Con ellos, no solo reduciremos la posibilidad de crecimiento fúngico
y proliferación sino que también mantendremos la integridad física de los granos en lo que
respecta al ataque de insectos (Gimeno & Martins, 2011).
El control biológico parece ser otro recurso para reducir la acumulación de
aflatoxinas y consiste en utilizar cepas no-toxigénicas de Aspergillus para disminuir la
incidencia de hongos productores de la toxina a través del desplazamiento competitivo
(Rubio Martínez, 2011); también se ha observado la utilización de cultivos resistentes a la
contaminación por toxinas.
Se han estudiado métodos físicos, químicos y biológicos para la prevención,
descontaminación, detoxificación o inactivación de las micotoxinas. Los estudios
efectuados con algunos de estos procedimientos están aún en la fase de planta piloto o
experimental (Gimeno & Martins, 2011). Otros son impracticables, por su elevado costo o
porque éstos dejan residuos en el alimento que pueden ser perjudiciales a la salud.
La evaluación de las pérdidas económicas derivadas de la presencia de aflatoxinas
en alimentos es compleja, debido a que son muchos los factores que hay que tener en
cuenta para poder realizar la valoración. La detección de materias primas o alimentos
contaminados puede ocasionar desde la pérdida absoluta del producto o cultivo, a la
pérdida de mercados y la consecuente disminución de ingresos por la venta de mercancías
a menor precio.
Por otro lado, es necesario considerar las pérdidas económicas que se dan ante la
aparición de brotes de intoxicación en animales de abasto, que son muy altas, sobre todo
cuando se produce la muerte de un elevado número de animales, cuando provoca en ellos
mayor susceptibilidad a los procesos infecciosos y parasitarios y cuando ocasiona una baja
en la productividad de los animales o retraso en su crecimiento (Combita Prieto et al.,
2009).
El instrumento principal para combatir a las micotoxinas la constituye la difusión
objetiva de la información a todos los integrantes de las cadenas productivas de alimentos,
DIESER, Marilina “Determinación de la presencia de micotoxinas en alimentos balanceados........”
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con las consecuentes medidas de prevención y control que se puedan aplicar a lo largo de
la misma (Requena et al., 2005).
HIPÓTESIS
- Se encontrarán alimentos balanceados con niveles de aflatoxinas superiores al valor
aceptable comercialmente de 12 ppb.
OBJETIVO GENERAL
Determinar la presencia de aflatoxinas totales; B1, B2, G1 y G2, en alimentos para
gallinas ponedoras.
IMPORTANCIA
La importancia de este proyecto se centra en conocer la calidad sanitaria del
alimento balanceado para ponedoras que se comercializa en la ciudad de General Pico, La
Pampa.
La presencia de aflatoxinas en alimentos para animales de granja causa grandes
pérdidas económicas en la producción agrícola. A esto se suma el riesgo para la salud
humana por ingesta de productos contaminados por estas toxinas, como así también por su
inhalación o contacto directo por parte de quienes manipulan los ingredientes y alimentos.
DIESER, Marilina “Determinación de la presencia de micotoxinas en alimentos balanceados........”
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MATERIALES Y MÉTODOS
Obtención de las muestras
La recolección se realizó en los meses de julio-agosto y septiembre, épocas del año
donde las condiciones climáticas (temperatura y humedad), fueron óptimas para el
desarrollo de hongos productores de micotoxinas.
Se determinaron 3 proveedores de alimentos comerciales trazables de la ciudad de
General Pico, La Pampa. Se tomaron ocho (8) muestras de bolsas de alimento balanceado
de distintos lotes, para evaluar la posible presencia de aflatoxinas. Las muestras, de 200
gramos cada una, se preservaron en bolsas de plástico, fueron rotuladas y llevadas al
Centro de Investigación y Desarrollo de Fármacos (CIDEF) de la Facultad de Veterinaria
para su conservación, aisladas de la luz y refrigeradas hasta el momento de la realización
de los ensayos.
Las muestras 1b y 2b contenían como ingredientes: granos de trigo, avena, cebada,
maíz tratado por extrusión, afrechillo de trigo, harina de carne y soja, poroto de soja
desactivada, complementos vitamínicos y macro/microminerales. Las muestras 3a y 3c
compuestas por: maíz, expeller, conchilla, harina de carne, sal, metionina y núcleo.
También se analizó una muestra de maíz que formaba parte de la formulación de las
muestras de alimentos 3a y 3c, que fue provista por el fabricante e identificada como 3b.
En total se analizaron 9 muestras, 8 pertenecieron a alimentos balanceados
preparados en formulación y la restante correspondió a la muestra de maíz (3b) que era
parte de la formulación de las muestras de alimentos 3a y 3c, anteriormente mencionada.
Cabe destacar que los proveedores fueron reticentes a entregar las muestras y datos
de las mismas, motivo por el cuál no se contó con la fórmula de elaboración de las
muestras 1a, 1c, 2a y 2c.
Preparación de la muestra / Extracción
La determinación de aflatoxinas requiere realizar una extracción metanólica. Cada
muestra por separado fue molida y tamizada. Se pesaron 20 g (10 g en el caso de muestras
de maíz). Luego se agregó 100 mililitros de una solución metanol-agua (70/30, v/v) y agitó
durante 3 minutos. Se dejó sedimentar y filtró utilizando papel de filtro Whatman grado 1
Las muestras fueron procesadas evitando la contaminación cruzada, se rotularon y controló
el pH (rango 6-8, requerido para evaluar la presencia de aflatoxinas por el test de ELISA).
DIESER, Marilina “Determinación de la presencia de micotoxinas en alimentos balanceados........”
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Determinación de aflatoxinas
El extracto metanólico de las muestras, se utilizó para realizar la prueba de
inmunoensayos enzimáticos competitivos de tipo ELISA (Fernandez-Surumay et al. 2000)
para determinar la concentración de aflatoxinas presentes en cada una de ellas.
El Kit empleado para determinar la presencia de aflatoxinas totales fue el
AgraQuant® Total Aflatoxin (COKAQ1000) con un rango de cuantificación de 4-40 ng/ml
y límite de detección de 3 ng/ml.
Las soluciones estándar y las muestras fueron añadidas a los pocillos que contienen
los anticuerpos anti-aflatoxinas. Se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Durante el período de incubación, las moléculas libres de aflatoxinas se unen a los
mencionados anticuerpos. Las sustancias que quedan sin unir se eliminan en el proceso de
lavado con agua destilada. La actividad de la enzima ligante se determina añadiendo una
enzima sustrato que da a la solución un color azul. Se lo dejó incubar 5 minutos a
temperatura ambiente y luego se añadió la solución stop, la cual frena la reacción y
produce un cambio de coloración de azul a amarillo (Fig. 13).
Fig. 13: Pocillos conteniendo estándares y muestras. Se observa la coloración azul producida por la adición de la solución stop
Los micropozos fueron medidos ópticamente usando un lector con un filtro de
absorbancia de 450 nm (OD450) (Fig. 14).
DIESER, Marilina “Determinación de la presencia de micotoxinas en alimentos balanceados........”
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Fig. 14: Lectura de las muestras en ELISA.
Las densidades ópticas de la muestra fueron comparadas con las densidades ópticas
de los estándares y se calcularon las concentraciones de aflatoxinas a través de la curva de
calibración obtenida previamente con los estándares provistos en el kit. La intensidad del
color desarrollada en el momento de la lectura es inversamente proporcional a la
concentración de aflatoxinas en la muestra.
RESULTADOS
Realizadas las lecturas de las absorbancias de los controles y de las muestras
problemas se obtuvieron los resultados detallados en la Tabla 1.
Tabla 1: Valores de absorbancia y concentración de aflatoxinas registrados en los controles (estándar) y en las muestras.
Pocillos Muestra Absorbancia
(nm) Concentración de aflatoxina (ng/g)
F1 Muestra 1.a 1.088 22.264
G1 Muestra 1.b 1.750 39.667
H1 Muestra 1.c 0.687 12.468
A2 Muestra 2.a 0.283 -1.420
B2 Muestra 2.b 0.635 11.251
C2 Muestra 2.c 1.236 26.151
D2 Muestra 3.a 0.492 6.960
E2 Muestra 3.b (Maíz) 0.834 15.991
F2 Muestra 3.c 0.302 - 0.573
A1 Estándar 1 0.302 0.000
B1 Estándar 2 0.403 4.000
C1 Estándar 3 0.583 10.000
E1 Estándar 4 1.002 20.000
D1 Estándar 5 1.763 40.000
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En la Fig. 15 se observa la curva de calibración obtenida con los cinco estándares
provistos por el kit (0; 4; 10; 20 y 40 ppb).
Fig. 15: Curva de calibración para los estándar de control
En la Fig. 16 se muestran los datos obtenidos de las muestras problema.
La comparación de datos, a través de la absorbancias medidas y expresadas en la
Tabla 1, permite cuantificar las aflatoxinas presentes en las muestras tomando como
referencia la curva de calibración (Fig. 17).
Fig. 16: Curva de calibración de las muestras problemas.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
0 10 20 30 40 50
Ab
sorb
an
cia
(n
m)
Concentración de aflatoxina (ppb)
Estándar
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
-10 0 10 20 30 40 50
Ab
sorb
an
cia
(n
m)
Concentración de aflatoxina (ppb)
Muestras
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Fig. 17: Curva de calibración de muestras control y muestras problemas.
DISCUSIÓN
En el presente estudio se determinó y cuantificó por medio de la técnica de ELISA
la concentración de aflatoxinas en diferentes lotes de alimentos balanceados para
ponedoras. La elección de esta técnica de detección de micotoxinas se fijó de acuerdo a la
disponibilidad de los kits y de la lectora, que fueron brindados por el Centro de
Investigación y Desarrollo de Fármacos (CIDEF) de la Facultad de Veterinaria (UNLPam).
Si bien Pineda Mejía et al. (2012) indican que, para la confirmación de los resultados
obtenidos aplicando ELISA, se requieren además otras técnicas, Fernández Surumay et al.
(2000) afirman que la determinación de aflatoxinas por el método espectrofotométrico
ELISA, resulta ser una técnica eficaz para la cuantificación de estas toxinas en materias
primas para alimentos balanceados, por su gran rapidez y sensibilidad, siendo capaz de
detectar niveles que oscilan entre 0,26 y 44 ppb de aflatoxinas.
Los resultados registrados en el presente trabajo evidencian la presencia de
aflatoxinas en el 77,8 % de las muestras de alimento balanceado para aves, de estas, el
71,5 % estuvo por encima del valor aceptado comercialmente, 12 ppb, según Lesson et al.
(1995).
Datos aportados para México por Flores Ortiz et al. (2006) establecen en sus
estudios que el 57 % de las muestras analizadas presentaron cantidades detectable de
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
-10 0 10 20 30 40 50
Abs
orba
ncia
(nm
)
Concentración de aflatoxina (ppb)
Estándar
Muestras
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micotoxinas y sólo el 11,2 % de las muestras revelaron niveles superiores a los
establecidos en las normas de regulación para micotoxinas.
Concentraciones de aflatoxinas por encima del valor permitido llegan a alterar en
las ponedoras la digestión de las proteínas y la absorción de los aminoácidos causando un
retraso en el crecimiento. La legislación mexicana y americana indican como nivel
máximo de tolerancia 20 ppb de aflatoxinas en alimentos para gallinas ponedoras (Verma
et al., 2003). Sin embargo Lesson et al. (1995) han descripto en su estudio que a partir de
los 8 ppb, estas toxinas producen hígado graso en ponedoras cuando se suministra por
varios días seguidos y provocan disminución de calcio, colesterol y triglicéridos
plasmáticos. Asimismo se ha observado una deficiencia en la respuesta inmunitaria,
dejando al organismo predispuesto a otras enfermedades y una disminución en la eficiencia
reproductiva, en la puesta y tamaño de los huevos, ingesta de alimento, tal como lo
detectan Chi Fang & Broomhead (2009), en USA, donde con pequeñas cantidades de
aflatoxinas en el alimento ya se ve afectado el rendimiento.
Durante el período de obtención de muestras, se observó que los sitios de
almacenamiento del balanceado que poseen los distintos proveedores de las muestras
estudiadas, no presentaban las condiciones necesarias para la conservación del alimento
tales como son baja temperatura ambiente, restricción de la humedad y buena aireación,
(Mallmann et al. 2007), situación que favorecería el desarrollo de micotoxinas (García et
al. 2012), como queda evidenciado en el presente estudio, acorde a los valores de
aflatoxinas detectados.
La suma de desaciertos ocasiona pérdidas económicas considerables a la industria
avícola, pone en riesgo la salud de los animales y constituye una preocupación para la
población consumidora de carne y huevo de pollo.
Se ha comprobado que estas toxinas se ligan al ADN, favoreciendo la aparición de
mutaciones, considerándose de esta forma a estos metabolitos secundarios como agentes
cancerígenos, teratógenos y mutagénicos. Los efectos tóxicos dependen tanto de la dosis
diaria como del tiempo de exposición a la misma.
Debido a que es imposible evitar en su totalidad la presencia de aflatoxinas, se han
desarrollado métodos físicos y químicos de detoxificación para destruir o inactivar las
aflatoxinas. Dentro de los métodos físicos se encuentran la extracción con solventes
orgánicos, la inactivación térmica, la irradiación y la adición de absorbentes. La
amoniación y el uso de peróxido de hidrógeno han sido empleados con éxito en la
destrucción química de las aflatoxinas (Dìaz, 1996).
DIESER, Marilina “Determinación de la presencia de micotoxinas en alimentos balanceados........”
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Para la adopción de medidas de control, coincidiendo con Mallmann et al. (2007),
es necesario saber con exactitud el grado de contaminación existente, siendo
imprescindible la implementación de un programa de monitoreo de materias primas
destinada al consumo.
El control futuro del problema de micotoxinas en la economía avícola, dependerá
del desarrollo y ejecución de políticas adecuadas en el ámbito del manejo agrícola, y de los
sistemas de almacenamiento, que como se observa son el meollo de la cuestión.
CONCLUSIONES
-La investigación realizada a partir del análisis de muestras de alimento balanceado
para ponedoras en la ciudad de General Pico, La Pampa y los resultados alcanzados
permitieron aceptar la hipótesis planteada en el presente trabajo:
ü Se encontrarán alimentos balanceados con niveles de aflatoxinas
superiores al valor aceptable comercialmente de 12 ppb.
-Los datos obtenidos en el presente trabajo evidencian la presencia de aflatoxinas
en el 77,8 % de las muestras de alimento balanceado para aves.
-Del total de muestras el 55,6 % estuvo por encima del valor admisible
comercialmente (12 ppb).
-En las muestras analizadas 1a, 1b, 1c, 2b y 2c la concentración de aflatoxinas
sobrepasa el límite permitido. De ellas, sólo de la 1b y 2b se pudo conocer los posibles
ingredientes: granos de trigo, avena, cebada, maíz tratado por extrusión, afrechillo de trigo,
harina de carne y soja, poroto de soja desactivada, complementos vitamínicos y
macro/microminerales.
-La presencia de micotoxinas en las dietas suministradas a las aves puede
determinar pérdidas considerables en el sistema de producción avícola, al producir el
síndrome del hígado, como resultado de una acumulación excesiva de grasas cuando el
transporte de lipoproteínas se trastorna. El hígado es el principal sitio de la síntesis de
lípidos en las especies aviares, el cual es muy activo en las hembras adultas que están
produciendo huevos. También se puede observar una reducción en el peso de las
ponedoras, una disminución o inhibición total de la puesta de huevos como también una
DIESER, Marilina “Determinación de la presencia de micotoxinas en alimentos balanceados........”
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merma en el tamaño de los mismos. Para poder evitar la presencia de estas toxinas o al
menos morigerar su desarrollo es necesario un monitoreo continuo de materias primas y
alimentos balanceados sumado a la adopción de medidas de control.
-Los resultados encontrados evidencian la necesidad de concientizar a los
productores y proveedores de alimentos balanceados a adoptar medidas en la producción y
almacenamiento de materias primas, como así también durante el proceso de elaboración y
almacenamiento del producto terminado hasta su consumo, para evitar la proliferación de
hongos productores de aflatoxinas.
-Las condiciones óptimas de transporte y almacenamiento garantizarán alimentos
libres no sólo de aflatoxinas sino también de otras micotoxinas que afectan, como hemos
descripto en esta tesina, la salud tanto de animales como de seres humanos.
RECOMENDACIONES
Es relevante aplicar programas para el control de aflatoxinas, con la finalidad de
suscitar un mayor conocimiento de la problemática originada por estos compuestos
tóxicos.
Asimismo sería importante implementar campañas para concientizar a los
proveedores de alimento balanceados y asegurarse que las instalaciones de
almacenamiento sean las adecuadas, para reducir al máximo la formación de micotoxinas.
Por último, es necesaria la realización de nuevas investigaciones que permitieran
profundizar los resultados obtenidos y progresar en el conocimiento sobre este tema en la
Pcia. de La Pampa. Es importante considerar algunas medidas a la hora de la toma de
muestras que permitan mejorar la representatividad del resultado del análisis de
micotoxinas, por ejemplo:
· Muestreos más amplios en cuanto a cantidad de muestras y departamentos
provinciales,
· Submuestreos, considerando que un gran número de productores elaboran sus propios
balanceados sin control de la materia prima.
· Análisis de un mayor número de muestras para obtener datos confiables
estadísticamente.
DIESER, Marilina “Determinación de la presencia de micotoxinas en alimentos balanceados........”
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INVESTIGACIONES FUTURAS
Es importante realizar un estudio posterior para evaluar luego, la posible presencia
de aflatoxinas en pechuga, muslo e hígado de pollos faenados destinados al consumo
humano.
Considerando que muchas veces se completa el engorde de las aves utilizando
granos, es probable que, aún cuando los estudios en alimentos resulten negativos, se
detecten concentraciones en músculo de alguna de estas toxinas, contribuyendo de esta
forma al conocimiento de la contaminación de aflatoxinas en carne de pollo destinada al
consumo humano.
DIESER, Marilina “Determinación de la presencia de micotoxinas en alimentos balanceados........”
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DIESER, Marilina “Determinación de la presencia de micotoxinas en alimentos balanceados........”
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INDICE GENERAL
Agradecimiento i
Resumen ii
Abstract ii
Índice de contenidos iv
Índice de tablas, figuras y láminas v
Introducción 1
1. Micotoxinas 2
2. Factores de crecimiento 8
3. Aflatoxicosis y la producción avícola 9
4. Riesgos para la salud humana 10
5. Estrategias de prevención y control 12
Hipótesis 13
Objetivo General 13
Importancia del estudio 13
Materiales y métodos 14
1. Obtención de la muestras 14
2. Preparación de las muestras/Extracción 14
3. Determinación de aflatoxinas 15
Resultados 16
Discusión 18
Conclusiones 20
Recomendaciones 21
Investigaciones futuras 22
Referencia Bibliográfica 23
Índice general 27