Extraccin de
ADN
PROPIEDADES FISICOQUMICAS DE LOS CIDOS
NUCLEICOS
Gentica molecular
Es un cido capaz de formar sales con iones cargados
positivamente (cationes).
Es soluble en soluciones concentradas de sales.
Es insoluble en alcoholes (tipo etanol o isopropanol).
El ADN es destruido (depurinado) a pH cido (menor de 4,0), es
insoluble a pH 5.6, pero es soluble a pH 8,0.
PROPIEDADES FISICOQUMICAS DE LOS CIDOS
NUCLEICOS
Gentica molecular
Concentracin Salina
La mayor concentracin de iones positivos en el medio (Na+,
K+) neutraliza la carga negativa de los fosfatos del esqueleto
fosfodiester, disminuyendo las fuerzas de repulsion y
estabilizando la estructura de la doble helice.
PROPIEDADES FISICOQUMICAS DE LOS CIDOS
NUCLEICOS
Gentica molecular
Hidrolisis Quimica
La hidrlisis cida remueve todas las bases pricas
(hidrlisis de uniones N-glicosdicas entre pentosa y las
bases pricas) sin afectar las uniones fosfodister del
esqueleto nucleotdico.
A pH alcalino, el ADN es resistente, mientras que el ARN se
hidroliza completamente (presencia de OH en el C2 de la
pentosa).
Extraccin y Purificacin
de ADN
La extraccin y purificacin de cidos nucleicos constituye la
primera etapa de la mayora de los estudios de biologa molecular
y ADN recombinante.
Existen diversos mtodos de extraccin de ADN, en funcin del
tipo de muestra y del grado de pureza que se pretende obtener
Tener claros los objetivos analticos para seleccionar
correctamente el mtodo ms adecuado de extraccin. La calidad
y la pureza de los cidos nucleicos son dos de los elementos ms
importantes en este tipo de anlisis.
Extraccin y Purificacin de ADN
La eleccin de la tcnica ms adecuada suele efectuarse conforme a
los criterios siguientes:
Aislamiento de cidos Nucleicos
cido nucleico diana (ADN o ARN)
Estructura del acido nucleico (genmico, plasmdico,
mitocondrial, etc)
Organismo fuente
Material inicial (tejido, clulas en suspensin, hoja, semilla,
material transformado, etc.)
Resultados deseados (rendimiento, pureza, calidad, tiempo
que requiere la purificacin)
Uso posterior (PCR, clonacin, RFLP, transferencia, RT-PCR,
sntesis de ADNc, etc.)
Pasos generales en la Extraccin de
cidos Nucleicos
1- Homogeneizacin o lisis:
Permite la disgregacin de la estructura tisular y celular facilitando
la salida de los cidos nucleicos.
2- Separacin y purificacin:
Permite la eliminacin progresiva de protenas y otros
contaminantes celulares, y la obtencin de un material gentico
cada vez ms limpio.
3- Precipitacin:
Permite la obtencin de un cido nucleico purificado, listo para ser
almacenado o diluido en concentracin deseada para su anlisis
1- Lisis de Clulas o Tejidos
rotura mecnica (trituracin, lisis
hipotnica, etc.)
tratamiento qumico (detergentes,
agentes caotrpicos, reduccin con
tioles, etc.)
digestin enzimtica (Proteinasa K,
etc.)
Tiene que ser suficientemente fuerte para romper el material
inicial complejo (Ej: un tejido), pero suficientemente suave para
preservar el cido nucleico diana.
Una misma solucin puede contener detergentes que
solubilicen las membranas celulares y sales caotrpicas fuertes
que inactiven las enzimas intracelulares.
2- Eliminacin de protenas y restos celulares
Tras la lisis celular y la inactivacin de las nucleasas, los restos de
clulas se eliminan fcilmente por precipitacin.
DNA debe ser disociado de :
Proteinas
Ciertas enzimas (ej
nucleasas) deben ser
inactivadas por
desnaturalizacin :
Detergentes ej: Dodecil sulfato sdico (SDS)
Enzimas ej: Proteinasa K
Solventes ej: Cloroformo, Fenol
Sales ej: acetato de amonio, NaCl
3- Precipitacin del ADN
La precipitacin de los cidos nucleicos permite su purificacin y
concentracin
La precipitacin es un fenmeno reversible, mediante la
disolucin del Acido Nucleico en soluciones acuosas
Se basa en la deshidratacin de la molcula mediada por el
agregado de alcoholes, tpicamente etanol o isopropanol, lo cual
lleva a su precipitacin.
ADN
ALCOHOL
Electroforesis
Electroforesis
La electroforesis en gel es un mtodo utilizado para separar macromolculas
en funcin del tamao, la carga elctrica y otras propiedades fsicas.
El trmino electroforesis describe la migracin de las partculas cargadas
bajo la influencia de un campo elctrico, que genera la fuerza
desplazamiento de las molculas a travs de la matriz del gel.
La corriente pasa a travs del gel con la ayuda de un medio lquido (buffer).
Electroforesis
El gel acta como tamiz molecular, separando las molculas en
funcin de su tamao.
Geles de Agarosa
Electroforesis Una vez separados en
el gel, los fragmentos
de ADN de las
muestras
se detectan mediante tincin con
agentes intercalantes como el
bromuro de etidio.
COLORANTE
INTERCALANTE DE BASES
Electroforesis
Los fragmentos , una vez teidos, pueden ser visualizados utilizando
un Transiluminador de Luz Ultravioleta
FIN
