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ESTUDIO QUÍMICO DE LOS COMPUESTOS BIOACTIVOS DE HOJAS SENESCENTES DE Croton funckianus (EUPHORBIACEAE).
SONIA MILENA VEGAS MENDOZA
Código 197456
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA BOGOTÁ
2010
2
ESTUDIO QUÍMICO DE LOS COMPUESTOS BIOACTIVOS DE HOJAS SENESCENTES DE Croton funckianus (EUPHORBIACEAE).
SONIA MILENA VEGAS MENDOZA
TESIS PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL PARA OPTAR POR EL TITULO DE
MAGISTER EN CIENCIAS-QUÍMICA
DIRIGIDA POR
Dr. RODOLFO QUEVEDO PASTOR
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA BOGOTÁ
2010
3
AGRADECIMIENTOS
A Dios todo poderoso por guiarme en todo el camino de mi vida y darme la sabiduría
y a la Santísima Virgen María por su protección e intercesión.
A la Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ciencias, Departamento de
Química, por formarme como Magíster.
Al proyecto DIB 11578-2008 por el apoyo financiero.
A la Profesora BÁRBARA MORENO- MURILLO y al profesor RODOLFO QUEVEDO
por haberme dado la oportunidad de trabajar en su grupo de investigación,
“Productos Naturales Vegetales Bioactivos y Química Ecológica” por brindarme
dedicación, orientación, conocimiento, amistad y apoyo total en este proyecto de
formación.
Al Laboratorio de Entomología Médica de la Facultad de Medicina de la Universidad
Nacional de Colombia por el mantenimiento de las crianzas de los mosquitos.
Al profesor FREDDY RAMOS por las asesorías brindadas en este trabajo.
A los Laboratorios de RMN de la Universidad Nacional de Colombia ELISEO
AVELLA, Productos Naturales Vegetales LUIS ENRIQUE CUCA y WILMAN
DELGADO, LC-MS CORALIA OSORIO y a la Universidad Industrial de Santander
por los análisis realizados en cada uno de estos.
A los laboratoristas Héctor castillo, Héctor Medina por su cooperación.
A mi familia, en especial a mi mamá, hermana Jacqueline, Juan, Santiago y a mi tía
Aurora por su respaldo y ayuda invaluable.
Al padre Octavio y al padre Germán por sus oraciones, apoyo incondicional en este
proyecto que es de Dios Padre Celestial.
4
“Que al final de tu vida, nadie te recuerde por la oscuridad
en la que sumiste tu vida, sino más bien, por las razones
luminosas que llevaste a la vida de miles”.
Ricardo Castañón
5
CONTENIDO
CONTENIDO ...................................................................................................................................... 5
INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................. 13
1. ANTECEDENTES ................................................................................................................... 13
1.1 ANTECEDENTES BOTÁNICOS Y ETNOBOTÁNICOS.................................................. 13
1.2 ANTECEDENTES QUÍMICOS DEL GENERO Croton .................................................... 15
HIPÓTESIS .................................................................................................................................. 21
OBJETIVOS ................................................................................................................................. 21
2 ANÁLISIS DE RESULTADOS ................................................................................................. 22
2.1 ANÁLISIS ESTRUCTURAL DE LA FRACCIÓN F7-2 (1) ................................................ 23
2.2 ANÁLISIS DE LOS COMPUESTOS BIOACTIVOS PRESENTES EN EL EXTRACTO F5 ............................................................................................................................ 25
2.2.1 Elucidación estructural de la mezcla 2 ............................................................... 25 2.2.2 Análisis estructural de la mezcla 3 ..................................................................... 38 2.2.3 Análisis estructural de la mezcla 4 ..................................................................... 39 2.2.4 Análisis estructural de la mezcla 5 ..................................................................... 39
2.3 ANÁLISIS DE LOS COMPUESTOS BIOACTIVOS PRESENTES EN EL EXTRACTO F2 ............................................................................................................................ 43
2.3.1 Análisis estructural de los compuestos 3, 4, 5 y 6 ............................................. 44 2.3.2 Análisis estructural de la mezcla 6 ..................................................................... 48 2.3.3 Análisis estructural del compuesto 7 ................................................................. 49 2.3.4 Análisis estructural del compuesto 8 ................................................................. 56
3 CONCLUSIONES .................................................................................................................... 67
4 RECOMENDACIONES............................................................................................................ 68
5 METODOLOGÍA ...................................................................................................................... 69
5.1 GENERALIDADES.......................................................................................................... 69
5.2 MATERIAL VEGETAL..................................................................................................... 70
5.3 OBTENCIÓN DEL EXTRACTO CRUDO ........................................................................ 71 5.3.1 Fraccionamiento del extracto crudo ................................................................... 71 5.3.2 Fraccionamiento del extracto F5 ....................................................................... 72 5.3.3 Fraccionamiento del extracto F2 ........................................................................ 74
6 BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................................ 79
6
ÍNDICE DE TABLAS Y GRAFICAS
Tabla 1. Antecedentes etnobotánicos de algunas especies del género Croton ...................... 15
Tabla 2. Antecedentes de constituyentes químicos de algunas especies del género Croton 16
Tabla 3. Distribución de algunos tipos de flavonoides aislados de especies del género Crotón ................................................................................................................................................ 19
Tabla 4 y Grafica 1. Actividad larvicida (1/CE50) x 103 de los extractos F1 – F8 de las hojas senescentes de C. funckianus frente a larvas de C. quinquefasciatus. ................................. 22
Tabla 5 y Grafica 2. Actividad larvicida (1/CE50) x 103 de las fracciones F5A-1 hasta F5A-11 frente a larvas de C. quinquefasciatus. ................................................................................... 25
Tabla 6. Parámetros de RMN 1H y 13C para las mezclas 1 y 2 ............................................... 37
Tabla 7 y Grafica 3. Actividad larvicida (1/CE50) x 103 de las fracciones F5C y F5I frente a larvas de C. quinquefasciatus. ................................................................................................ 38
Tabla 8 y Grafica 4. Actividad larvicida (1/CE50) x 103 de las fracciones F5D, F y G frente a larvas de C. quinquefasciatus ................................................................................................. 39
Tabla 9 y Grafica 5. Actividad larvicida (1/CE50) x 103 de las fracciones F5E, F5J frente a larvas de C. quinquefasciatus. ................................................................................................ 40
Tabla 10. y Grafica 6. Actividad larvicida (1/CE50) x 103 de las fracciones F2A-1 a F2A-16 frente a larvas de C. quinquefasciatus. ................................................................................... 43
Tabla 11 y Grafica 7. Actividad larvicida (1/CE50) x 103 de las fracciones F2B-1 a F2B-7 frente a larvas de C. quinquefasciatus. ................................................................................... 44
Tabla 12. Parametros de RMN 1H, 13C y HMBC para el compuesto (7) .................................. 53
Tabla 13 y Grafica 8. Actividad larvicida (1/CE50) x 103 de las fracciones F2C-1 a F2C-10 frente a larvas de C. quinquefasciatus. ................................................................................... 56
Tabla 14. Parametros de RMN 1H, 13C y HMBC para el compuesto (8) .................................. 66
7
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Mapa de distribución a nivel mundial del género Croton ......................................... 14
Figura 2. Algunos compuestos aislados en el género Croton ................................................ 18
Figura 3. Componente mayoritario de la Mezcla 1 (quercetina). ............................................. 23
Figura 4. Espectro de RMN 1H de la mezcla 1 ........................................................... 24
Figura 5. Espectro de IR de la mezcla 2 en KBr .................................................................... 26
Figura 6. Análisis por CLAE UV-DAD de la mezcla 2............................................................. 27
Figura 7. Espectro de RMN 1H completo de la mezcla 2 en acetona –d6. .............................. 28
Figura 8. Espectro de la región aromática RMN 1H de la mezcla 2........................................ 29
Figura 9. Espectro de la región alifática de RMN 1H de la mezcla 2 ..................................... 30
Figura 10. Espectros de 13C de la fracción F5-H4 denominado mezcla 2 en acetona –d6. ..... 31
Figura 11. Espectro de HMQC de la mezcla 2 ...................................................................... 32
Figura 12. Espectro de HMBC de la mezcla 2 ...................................................................... 33
Figura 13. Espectro de COSY H-H de la mezcla 2 ................................................................. 34
Figura 14. Subestructuras que conforman la mezcla 2 ........................................................ 35
Figura 15. Correlaciones HMBC para la quercitrina .............................................................. 36
Figura 16. Espectro de 1H de la mezcla 3 en acetona–d6. ..................................................... 41
Figura 17. Espectro de 1H de mezcla 5 en metanol–d4 .......................................................... 42
Figura 18. Análisis por CGAR-MS de la fracción F2B-1 .......................................................... 45
Figura 19. Espectro de masas por impacto electrónico para el pico 1 (3) del perfil cromatográfico de la fracción F2B-1 ....................................................................................... 46
Figura 20. Fragmentación propuesta del compuesto 3 .......................................................... 46
Figura 21. Espectro de masas por impacto electrónico para el pico 2 (4) del perfil cromatográfico de la fracción F2B-1 ....................................................................................... 47
Figura 22. Espectro de masas por impacto electrónico para el pico 4 (5) del perfil cromatográfico de la fracción F2B-1 ....................................................................................... 47
8
Figura 22. Espectro de masas por impacto electrónico para el pico 5 (6) del perfil cromatográfico de la fracción F2B-1. ...................................................................................... 48
Figura 23. Fragmentación propuesta del compuesto 6 .......................................................... 49
Figura 24. Espectro de IR del compuesto 7 en KBr ............................................................... 50
Figura 25. Espectro de 1H del compuesto 7 en cloroformo .................................................... 51
Figura 26. Espectro de 13C del compuesto 7........................................................................... 52
Figura 29. Heneicosanol ........................................................................................................ 53
Figura 27. Espectro de HMQC del compuesto 7 .................................................................... 54
Figura 28. Espectro de HMBC del compuesto 7 .................................................................... 55
Figura 30. Espectro de IR del compuesto 8 en KBr ............................................................... 57
Figura 31. Espectro de 1H de del compuesto 8 ...................................................................... 59
Figura 32. Espectro de 13C del compuesto 8........................................................................... 60
Figura 33. Espectro de COSY 1H-1H del compuesto 8 ............................................................ 61
Figura 34. Espectro de HMQC del compuesto 8 .................................................................... 62
Figura 35. Espectro de HMBC del compuesto 8 .................................................................... 63
Figura 36. Subestructuras del compuesto 8 ............................................................................ 64
Figura 37. Subestructuras del compuesto 8 ............................................................................ 64
Figura 38. Subestructuras del compuesto 8 ............................................................................ 65
Figura 39. Cassipourol ............................................................................................................ 66
Figura 40. Diagrama de extracción líquido-líquido del extracto total Croton funckianus ......... 76
Figura 41. Diagrama del aislamiento bioguíado de las mezclas 2, 3, 4 y 5 del extracto con acetato de isopropilo (Las fracciones que contienen mezclas de compuestos se distingue en color verde) ............................................................................................................................. 77
Figura 42. Diagrama de aislamiento de la mezcla 6 y compuestos identificados 3, 4, 5, 6, 7 y 8 (Las fracciones que contienen la mezcla se distinguen en color verde y compuestos en rojo) ................................................................................................................................................ 78
9
ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS
AcOE Acetato de etilo
AcOIPr Acetato de isopropilo
APCI Ionización química a presión atmosférica
BAL-Cq Bioensayo de actividad larvicida Culex quinquefasciatus
br s Singlete ancho
CC Cromatografía en columna
CCD Cromatografía en capa delgada
CCDP Cromatografía en capa delgada preparativa
CE50 Concentración efectiva 50
CGAR-EM Cromatografía de gases de alta Resolución acoplado a
Espectrometría de Masas
CLAE Cromatografía líquida de alta eficiencia
cm Centímetro
COSY Espectroscopia de correlación exclusiva
CPG Cromatografía en Permeación en gel
CHCl3 Cloroformo
d Doblete
DAD Detector de arreglo de diodo
d.i. Diámetro interno
dd Doble doblete
dq Doble cuarteto
DEPT Distorsionless enhacement by polarization transfer
dt Doble triplete
DCM Diclorometano
DMSO Dimetilsulfoxido
EP Éter de petróleo
g Gramo
HMBC Heteronuclear correlation through multiple bond coherence
HSQC Heteronuclear single quantum correlation
10
Hz Hertz
IR Espectroscopia Infrarroja
J Constante de acoplamiento
L-L Líquido-Líquido
m Multiplete
mg miligramo
g microgramo
L microlitro
mL Mililitros
min Minutos
m/z Relación masa/carga
LC-MS Cromatografía Líquida- acoplado a Espectrometría de Masas
CH3CN Acetonitrilo
MEK Metiletilcetona
MeOH Metanol
MHZ Mega hertz
Pf. Punto de fusión
ppm Partes por millón
PR Presión reducida
Rf Distancia que recorre la muestra desde el punto de aplicación/
distancia que recorre el disolvente hasta el frente del eluyente.
RA Reactivo analítico
RMN Espectroscopía de resonancia magnética nuclear
s Singlete
S-BuOH Sec-butílico
t Triplete
TMS Trimetilsilano
tr Tiempo de retención
UV Ultravioleta
Desplazamiento (RMN)
λ Longitud de onda
11
RESUMEN
El extracto etanólico de hojas senescentes frescas de Croton funckianus se sometió
a partición líquido- líquido con disolventes de diferente polaridad. Los ensayos de
actividad larvicida frente a larvas de tercer estadío de Culex quinquefasciatus,
mostraron que los extractos en éter de petróleo (F2), acetato de isopropilo (F5) y
butanol (F7) poseen actividad prometedora. El estudio químico guiado por el
bioensayo de actividad larvicida de una de las fracciones en butanol condujo a la
obtención de quercetina (1); este compuesto presentó bioactividad. Del extracto (F5)
se obtuvieron dos mezclas conformadas por flavonoides glicosidados, sus
componentes mayoritarios se identificaron por medio de técnicas espectroscópicas
(UV, IR, HPLC, RMN 1H y 13C mono y bidimensional). El componente mayoritario de
la mezcla 1 fue identificado como 3-O- -L-rhamnopiranosil-5,7,3',4'-tetra-
hidroxiflavona conocida como Quercitrina (2). De la mezcla 2 se identificó por RMN 1H señales características de flavonoides glicosidados; esta mezcla presentó
actividad larvicida frente al mosquito C. quinquefasciatus.
De la fracción extracto (F2) por análisis en CG-EM se identificaron los compuestos
hexadecanoato de etilo (1,2%) (3), acetato de fitol (4.1%) (4), 2, 6,10,14,18,22-
tetracosahexaeno (16,1%) (5) y d-α-tocoferol (Vitamina E) (64,5%) (6). En su
conjunto estos compuestos presentaron actividad larvicida. El fraccionamiento de
este extracto condujo a la identificación de heneicosanol (7), en este trabajo se
presenta por primera vez la asignación de las señales de RMN 1H ,13C. Este
compuesto no presentó actividad larvicida. De este mismo extracto se aisló el
cassipourol (8) con base en el análisis espectroscópico (IR, RMN 1H y 13C mono y
bidimensional) y espectrometría (LC-MS). El cual, es nuevo en el género Croton y en
la especie. Además presentó actividad larvicida promisoria.
12
La actividad larvicida de las mezclas y compuestos permitió establecer que
quercetina, la mezcla de flavonoides glicosidados, cassiopurol, hexadecanoato de
etilo, fitol acetato, 2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno, d-α-tocoferol ( vitamina E) y las
fracciones F5A-3, F5A-11, F5C-1, F5C-6, F5E-3, F5E-4, F5F-3, F5G-1, F5I-2, F5J-6,
F2A-1, F2A-2, F2A-8, F2A-14, F2B-3, F2B-5, F2B-7, F2C-1, F2C-5 y F2C-9 son los
principales responsables de la actividad larvicida del extracto etanólico de las hojas
senescentes frescas de la especie Croton funckianus.
13
INTRODUCCIÓN
En zonas tropicales y subtropicales, los zancudos son considerados como los
dípteros más perjudiciales desde el punto de vista médico y veterinario. El mosquito
Culex quinquefasciatus es un díptero perteneciente a la familia Culicidae. Es un
vector patógeno que transmiten al hombre diversas enfermedades y parásitos tal
como filiaríais, virus del Nilo, dengue hemorrágico, malaria. En los animales
transfieren enfermedades como: la encefalitis equina venezolana (EEV) y encefalitis
de este (EE) entre otras1. De la gran biomasa de los insectos, alrededor del 1% de
estos se ha convertido en plaga como consecuencia del manejo cultural aplicado por
el hombre como los monocultivos extensivos y la aplicación indiscriminada de
pesticidas.
Para controlar los diferentes insectos-plaga generalmente se utilizan pesticidas de
amplio espectro, los cuales producen efectos secundarios en mamíferos, peces,
aves, entomofauna benéfica y envenenamiento humano2; adicionalmente, causan
resistencia, lo que exige la aplicación de mayores dosis, con mayor frecuencia,
favoreciendo la propagación de plagas y generando altos costos.3-5
Los serios inconvenientes mencionados, han motivado la búsqueda de insecticidas
botánicos de gran interés por ser de origen natural, biodegradables, de baja
toxicidad; además, se pueden emplear como insecticidas, larvicidas, atrayentes,
repelentes, inhibidores de oviposición y de crecimiento entre otras. 6
1. ANTECEDENTES
1.1 ANTECEDENTES BOTÁNICOS Y ETNOBOTÁNICOS
La familia Euphorbiaceae comprende alrededor de 8000 especies distribuidas en 317
géneros a nivel mundial. (Figura 1). En Colombia se encuentran 78 géneros, 390
especies, 12 subespecies y 9 variedades. Entre los géneros con mayor número de
especies están: Croton (80), Euphorbia (43), Phyllanthus (36), Acalypha (25),
14
Alchornea (19) y Mabea (18).7-8 El género Croton es ampliamente utilizado en
medicina tradicional ver Tabla 1.
La especie Croton funckianus Müller se encuentran distribuido a nivel mundial en
Venezuela y Colombia. En este último, crece en las regiones de: Antioquia
(Copacabana) altura 1.400 m, Boyacá (Guateque y Guayatá) altura 1.500 m, Cauca
(Santander de Quilichao, el Tambo) altura 1.100 m -1.200 m, Cundinamarca (La
Mesa 950 m -1.320 m, Quetame y Guayabetal 1.250 m, Santandercito 1.600 m, San
Juan de rioseco 1.650 m, Tocaima altura 380 m- 600 m, Pandi 1.100 m). Tolima
(Chicoral altura 700 m, Mariquita altura 535 m.) Valle (Hacienda el Trejo 1.050 m,
Palmira 950 m, las cruces altura de 1200 m) y Bogotá 9. Esta especie es conocida
popularmente como “sangregado” (Cundinamarca, Boyacá); “drago” (Cauca y
Tolima) y “puntalanza” (otras partes del país). Es un árbol de 3-5 m de altura, muy
ramificado; con hojas pecioladas, lobuladas, o trilobuladas, lóbulos acuminados. Por
el envés blanco céreo con tricomas ramificados, base glandulífera, y peciolo 4-11 cm.
de largo9.
Figura 1. Mapa de distribución a nivel mundial del género Croton
http://www.eol.org/pages/29223
15
1.2 ANTECEDENTES QUÍMICOS DEL GENERO Croton
Tabla 1. Antecedentes etnobotánicos de algunas especies del género Croton
ESPECIE RESULTADOS REFERENCIAS
C. macrostachyus Antidiabético y Antimalárico 10-11
C. celtidifolius Antiinflamatorio y ulcerativo 12
C. zambesicus Anticonvulsivo 13
C. lechleri Tratamiento del cáncer e inflamaciones 14
C. leptostachyus Antimalárico 15
C. linearis Efecto insecticida en adulto de Cylas formicarius elegantulus 16
C. tiglium Propiedades anti -HIV-1 17
C. antisphiliticus Enfermedades venéreas, diurético, antiofídico 18
C. bonplandiarus Antiséptico 19
C. candatus Antimalárico 20
C. glabellus Hipotensor 21
C. tiglium, C. rhamnifolius, C. sparciflorus. carcinogénicos e irritantes 22-24
Del género Croton se han aislado compuestos de tipo monoterpenoides, terpenoides,
diterpenos, ácidos grasos insaturados, alcaloides como indol aporfinas, quinoleína y
tropanos (Figura 2). Otro tipo de compuestos son los constituyentes fenólicos como
las flavonas, flavanoles, flavonoles glicósidos, canferol, miricetina y gallocatequinas
etc. En las tablas 2 y 3 se citan algunas especies químicamente estudiadas del
género Croton.
16
Tabla 2. Antecedentes de constituyentes químicos de algunas especies del género Croton
ESPECIE PARTE DE LA
PLANTA RESULTADOS REFERENCIAS
C. antosienensis, C. decary L., C. geagy L, C. saka maliensis L
raíces y corteza
Aceites esenciales monoterpenoides, sesquiterpenoides, trazas de fenilpropanoides 25
C. celtidifolius corteza Presencia de ciclitoles 1L-1-0-metil-mio-inositol, neo-inositol y sitosterol, catequinas, galocatequinas y proantocianidinas
12,26
C. zambesicus corteza Derivados labdano, diterpenoide, Crotanodiol. 13
C. hemiargyreus
hojas Tetrahidroprotoberberina 2-10 dihidroxi - 3-10 dimetoxi-8ß-metildibenzeno o quinolizidina. 27
corteza
Alcaloides tetrahidroprotoberberina 2-aporfinas, glaucina, oxoglaucina, 2-morfinadeinonas, salutaridina, norsalutaridina
C. sarcopetalus n.r diterpenoides sarcopetaloide, sarcopetaloloide, acido sarcopetalóico 28
C. macrostachyus raíz
3ß acetoxy taraxer-14-en 28 3 diterpenoide acido trachyloban 18-oico 3 acido trachyloban 19-oico, neoclerodan-5,10-en-19,6 ; 20,12-diolido, 3 ,19 di-hidroxytrachylobano, 3 , 18,19-trihydroxy-trachylobano.
29
C. oblongifolius tallo Acido crotocembraneico, A. neocrotocembraneico, cembranoide neocrotocembranal.
30-31
C. hirtus tallo 20 nuevos compuestos bis-nor dolabradanos 2,3 dolabradanos 4-7 kauran, 8 y 9 cicloptopakaurano 10-15 hirtusano, 16-18 ester germaradieno.
32
C. tiglium semillas ester forbol 17
C. kerrii hojas
secas
(E,E,Z)-11-hidroximetil-3,7,15-trimetil-2,6,10,14-hexadecatetraen1-ol y (E,E,E)-11-formil-3,7,15-trimetil 2,6,10,14-hexadecatetraen1-ol
33
C. poilanei n.r Acido poilaneico y diterpeno cembranoide 34
C. macrostachys frutos Crotepóxido 35
C. cajucara hojas crotonin y trans dehidrocrotonin, nor-clerodanos cajucarin A, cajucarin B, cajucarin-β, cajucarinolido y sacacarin
36 - 38
C. eluteria n.r Clerodanos eluterins A-J 39
C. urucurana raíces Sonderianin, 15,16-epoxy-3,13 (16)-clerodatrieno-2-ona y 12-epi-methyl-barbascoate
40 - 41
C. lechleri corteza Clerodanos Crolechinol, acido crolechinico, korberina A, korberina B
42 - 43
C. californicus n.r trans-clerodano Metil barbascoato 44
17
ESPECIE PARTE DE LA
PLANTA COMPUESTOS AISLADOS REFERENCIAS
C. schiedeanus
n.r
Cis - clerodanos (-)-metil-16-hidroxi-19-nor-2-oxo-cis-cleroda-3,13dien-15,16-olido-20-oato. y (+)-15-
methoxyfloridolido A
45
C. brasiliensis
hojas clerodanos crotobrasilins A y B 46
C .zambesicus
tallos
Clerodanos crotocorylifurano y crotozambefurano A-C, trachylobano acido 7β- acetoxy trachylobano-18-
oico y trachylobano-7β, 18-diol.
47
C. tonkinensis hojas Ent-kauranos ent-7β-acetoxy-11-α-hidroxykaur-16-en-15-ona, ent-18-acetoxy-11-α-hidroxikaur-16-en-15-ona, ácido ent-11-α-hidroxikaur-16-en-18-oico. 48
C. sublyratus y C. stellatopilosus
hojas
Diterpeno aciclico plaunotol 49-50
C. californicus, C. draco y C. aromaticus látex Acido (-)-Hardwickiic
51-53
C. insularis
hojas
Diterpenos ent-trachyloban-3-one y crotinsularin. Clerodanos furocrotinsulolidos A y B y
crotinsulactona
54-55
C. draco hojas
β - sitosterol, estigmasterol, esterol ergasterol-5α-8α-endoperoxido. 56-57
C. cajucara, C. urucana n.r
Triterpeno acido acetil aleuritolico 36,58
C. hieronymi
n.r
Triterpenos α y β-amyrin, lupeol, y hop-22(29)-en-3ßol. Esteroides: colesterol, coles-8(14)-en-3β-ol, estigmasterol, gramisterol, sitosterol, campesterol, 22-dihidrobrassicasterol, lophenol, isofucosterol,
estigmasterol, coles-4-en-3-ona, ergosta-4-22-dien-3-ona y sitostenona
59
C. stipuliformis
hojas Ent-3,4-seco-labdane and ent-labdane diterpenoids from Croton stipuliformis (Euphorbiaceae) 60
corteza 12(E)-3,4-seco-labda-4(18),8(20),12,14-tetraen-3-oato de metilo, ácidos ácido labda-8(20),12(E),14-trien-18-oico, (-)-labda-8(20),12(E),14-trien-18-oico
61
18
(1) R=COOH 11=Z
(2) R=COOH 11=E
(3) R=CHO 11=Z
7
CH3CH3
OH
OH
CH3 CH3
CH2
1
319
18
6
9
20
10
1215
16
17
1
CH3
CH3 CH3O
CH3
OH
CH3
1
4
68
19
10
18
2
O
O
CH3OCH3 CH3
CH31
3
10 8
12
17
3
O
O
OCH3
CH3
O
O
1
35
10
12
14
16
20
17
19
20
4
CH3
CH3
CH3
CH3
R
1
16
17
20
4
8
12
5
18
O OH
O
OH
O
CCH3
CH3
CH2O
R1
R3
CH3
CH3
H
R2
H1
410 8
151112
16
17
20
18
19
N CH3
H
O
OH
O
OH
CH3
CH3
1
3
5
7
9
11
13
6
Figura 2. Algunos compuestos aislados en el género Croton
(1) Clerodano C. zambesicus, (2) Diterpeno C. linearis, (3) Sarcopetaloide C. sarcopetalus (4) Diterpeno C. macrostachys neoclerodan-5,10-en-19,6 ; 20,12-diolido, (5-1) Acido Crotocembraneico, (5-2) A. Neocrotocembraneico, (5-3) Neocrotocembranal, C. oblongifolius, (6) Estructura base de ester de forbol, (7) Tetrahydroberberina C. hemiargyreus.
19
Tabla 3. Distribución de algunos tipos de flavonoides aislados de especies del género Crotón TIPO DE
FLAVONOIDES PLANTA PARTE NOMBRE QUÍMICO PAÍS PROPIEDADES REFEREN
CIAS
flavonoles quercetina
C. oblongifolius
aérea
Quercetina
Taila.
Vasorrelajante
62
C. glabellus
3,4´,7-tri-O-metilquercetina
Col.
C. schiedeanus
C. schiedeanus 3,7-di-O-metilquercetina 3-O-metilquercetina Col.
63
C. oblongifolius 3´-O-metilquercetina
n.r
62
flavonoles
glicosidados
C. glabellus
3,3-O- L-ramnosido-quercetina
C. schiedeanus
C .bonplandiarus India
C. panamensis látex
Cos.ri Antihipertensivo
C. oblongifolius
aérea
3- D-galactosido quercetina Ecu
Vasorrelajante
C. menthodorus 3-O- rutinosido quercetina 3-O-(2-0 d-apofuranosil) rutinosidoquercetina
Ecu
Kaempferol
C. cajucara 3,7-di-O-metilkanferol 3,4´7-tri-O-metilkaempferol
Bra
37
C. pyramidalis 4´,7-di-O-metilkaempferol
Mex 62
C .menthodorus 3-O-rutinosidokanferol 3-O-(2-O-trans-p-cumaroil)- d-glucopiranosidokaempferol
n.r
Miricitina C. panamensis látex
3-O-ramnosidomiricetina n.r
n.r
64
C. draco
62
flavanoles simples
C. lechleri
látex (+)-catequina
Ecu
C .panamensis n.r C. urucurana corteza Bra C. lechleri
látex
(-)-epicatequina n.r C. panamensis
C. lechleri
(+)-galocatequinas C. draconoides Per C. panamensis
n.r
C. urucurana corteza
C. lechleri
látex
(-)-epigalocatequina actividad antiviral
C. lechleri (-)-epigalocatequina actividad
antiviral
C. draconoides C. panamensis
Flavonol C. draconoides 3,3´,5,5´7-pentahidroxiflavano
20
TIPO DE FLAVONOIDES
PLANTA PARTE NOMBRE QUÍMICO PAÍS PROPIEDADES REFEREN
CIAS
Flavonol dímeros C. lechleri
látex
epicatequina- (4 8) catequina catequina- (4 8) epicatequina catequina- (4 8) galocatequina galocatequina-(4 6) epicatequina galocatequina- (4 6) epigalocatequina
n.r
antitumoral
y antibacteriana
62
Flavonol trímeros
C. lechleri
látex
catequina- (4 8) galocatequina- (4 6)-galocatequina. galocatequina- (4 8)-galocatequina- (4 8)-epigalocatequina
n.r
actividad
antitumoral y antibacteriana
62
Flavonoles oligoméricos C. lechleri
látex galocatequina y epigalocatequina n.r
Antiviral
62
Flavonas
C. hovarum
aérea Vitexina
Madag.
n.r
65
Flavonas C. betulaster
aérea 5-hidroxi-4´,7-di-metoxiflavona Bra n.r 66
n.r No reportado, Bra: BRAZIL, Madag: MADAGASCAR, Ecu: ECUADOR, Mex: MÉXICO, Cos.ric: COSTA RICA, Col: COLOMBIA, Tail: TAILANDIA.
En nuestro grupo de investigación se han venido realizando estudios de algunas
especies pertenecientes a la familia (Euforbiaceae) específicamente las especies del
género Croton (C. bogotanus y C. funckianus).
El análisis comparativo del aceite esencial de las hojas verdes de Croton bogotanus
extraídos por los métodos de fluido supercrítico CO2 (1,5%) contenían monoterpenos
(linalol), sesquiterpenos (cariofileno y germacreno D) y el método de hidrodestilación
(0.1%) condujo a compuestos mayoritarios (germacreno D y kaureno) 67. De otro
lado, se realizó un estudio de bioactividad preliminar de los extractos de las dos
especies nativas: C. bogotanus y C. funckianus frente a larvas de Artemia salina y C.
quinquefasciatus en hojas verdes y senescentes; como resultado las hojas
senescentes de la especie nativa C. funckianus presentó alta actividad tóxica frente a
larvas de Artemia salina (CE50 = 38 µL/mL) y actividad larvicida frente a larvas de 3er
instar del mosquito C. quinquefasciatus (CE50 = 181 µL/mL)68. Con base en los
antecedentes bibliográficos y resultados preliminares de nuestro grupo, se desea
continuar esta investigación. Así de este modo se contribuirá al conocimiento de los
21
compuestos químicos bioactivos de las hojas senescentes de la especie nativa C.
funckianus mediante la evaluación con el bioensayo especifico frente a larvas del
mosquito C. quinquefasciatus y determinar cual o cuales metabolitos son los
probables responsables de la actividad insecticida. Con los resultados obtenidos
también se espera proponer una alternativa como agentes de control del vector C.
quinquefasciatus.
HIPÓTESIS
De acuerdo a resultados preliminares de bioactividad, es posible proponer que al
realizar el estudio químico y biológico de los constituyentes mayoritarios de las hojas
senescentes de Croton funckianus (Euphorbiaceae) se pueda correlacionar su
presencia con la actividad larvicida observada frente a larvas de mosquito Culex
quinquefasciatus. Say (Díptera: Culicidae).
OBJETIVOS
Objetivo General Contribuir al conocimiento químico y biológico de los compuestos bioactivos
presentes en el extracto alcohólico de las hojas senescentes de la especie nativa
Croton funckianus (Euphorbiaceae).
Objetivos específicos
Evaluar las propiedades aleloquímicas (actividad larvicida) del extracto total y
fracciones obtenidas por extracción con disolventes de diferente polaridad frente
a larvas de mosquitos Culex quinquefasciatus (Díptera Culicidae).
Realizar el estudio químico de las fracciones con actividad larvicida.
Elucidar la estructura de los compuestos aislados empleando métodos
espectroscópicos (IR, UV, RMN 1H, 13C, de 1D, 2D y EM).
Determinar la actividad larvicida a los compuestos puros que hayan sido aislados
en cantidad suficiente.
22
2 ANÁLISIS DE RESULTADOS
El extracto crudo de hojas senescentes de Croton funckianus (F1) recolectadas en el
campus de la Universidad Nacional de Colombia (Bogotá), fue sometido a
fraccionamiento por partición líquido - líquido (L-L) con diferentes disolventes. La
actividad larvicida frente a larvas de C. quinquefasciatus de cada uno de los
extractos se evaluó siguiendo el método propuesto por McLaughlin et al. 70 (Figura 40,
tabla 4, grafica 1). De acuerdo a los resultados se concluye que los extractos EP (F2),
AcOIPr (F5) y BuOH (F7) son prometedores por presentar actividad larvicida. Por
esta razón y la cantidad disponible se seleccionaron los extractos (F2), (F5) y (F7)
para realizar el estudio químico. Los extractos que presentaron concentración efectiva
CE50 mayores de 1000 g/mL no son promisorios y no se continúa con el estudio
químico 69-71.
Tabla 4 y Grafica 1. Actividad larvicida (1/CE50) x 103 de los extractos F1 – F8 de las hojas senescentes de C. funckianus frente a larvas de C. quinquefasciatus.
Fracciones Peso (g)
C. quinquefasciatus
CE50 g/mL PROMEDIO
F1 100.3 105
F2 20,6 549
F3 0,5 > 1000
F4 3,2 > 1000
F5 5,8 451
F6 4,9 > 1000
F7 3,7 494
F8 4,2 > 1000
Cafeína ----- 450
23
2.1 ANÁLISIS ESTRUCTURAL DE LA FRACCIÓN F7-2 (1)
De la fracción F7-2 (1) proveniente del extracto en alcohol Sec-butílico se separó por
CCDP con el sistema (AcOIPr- MeOH 60:40) un sólido amorfo de color amarillo
denominado mezcla 1(10 mg). Esta mezcla presentó actividad larvicida frente a larvas
de C. quinquefasciatus (CE50 47 g/mL). El análisis por CCD permitió observar un
compuesto mayoritario de tipo fenólico al revelar de color azul-verdoso con FeCl3 y
amarillo con H2SO4 al 20%/vainillina. En el espectro de RMN-1H en (MeOD-d4) Figura
4 se observan 5 señales correspondientes a hidrógenos aromáticos entre 6 y 8 ppm.
La presencia de un singlete a 12,76 ppm característica de O-H fenólico que forma
puente de hidrógeno con un grupo carbonilo, permite considerar la presencia de
grupo OH en la posición C-5 o C-3 de un núcleo flavonoide; así mismo, se observan
dos dobletes a 6,46 (J =2,0 Hz) y 6,24 (J = 2,0 Hz) que integran para un
hidrógeno cada una y se pueden asignar a los hidrógenos en las posiciones C-6 y C-
8 del anillo A de un flavonoide. A 7,39 ppm, se observa un doble doblete con J =
8,40 Hz y J = 2,00 Hz, correspondiente a un H en la posición H-6'. Adicionalmente el
H-2' a 7,51 ppm con J=2,0 Hz acopla con el H-6', mostrando así la existencia de un
anillo 1',3',4' tri-sustituido. Por comparación de los datos obtenidos con los de la
literatura (tabla 6) es posible proponer que el compuesto mayoritario de la mezcla 1
corresponde a quercetina 72,73 (Figura 3). Este compuesto fue también aislado de las
partes aéreas de C. glabellus 62.
6,95 ppm
35
8
6,24ppm
6,46 ppm
2´
6´
7,37ppm
7,51 ppm
12,76 ppm
OH
OOH
O OO
H
HH
OHH
HH
H
Figura 3. Componente mayoritario de la Mezcla 1 (quercetina).
24
Figura 4. Espectro de RMN 1H de la mezcla 1
ppm (t1)6.507.007.50
0
50
100
7.537.52
7.407.397.387.37
6.986.96
6.486.48
6.266.26
1.00
1.02
1.00
1.06
1.04
ppm (t1)12.5013.00
-1.00
-0.50
0.00
0.50
12.766
25
2.2 ANÁLISIS DE LOS COMPUESTOS BIOACTIVOS PRESENTES EN EL EXTRACTO F5
2.2.1 Elucidación estructural de la mezcla 2
El fraccionamiento de F5 (4,60 g) produjo 11 fracciones mayores denominadas
desde F5A-1 hasta F5A-11. Cada una de estas fracciones fue evaluada con el
bioensayo BAL-Cq (Tabla 5 y grafica 2)
Tabla 5 y Grafica 2. Actividad larvicida (1/CE50) x 103 de las fracciones F5A-1 hasta F5A-11 frente a larvas de C. quinquefasciatus.
Los resultados de actividad larvicida muestran como promisorias a las fracciones
F5A-3, F5A-6, F5A-8, F5A-9 y F5A-11. Considerando los resultados de actividad,
cantidad de muestra y el análisis preliminar por CCD se seleccionaron las fracciones
F5A-4, F5A-6, F5A-8 y F5A-9 para continuar con el estudio. La fracción F5A-4, no
presentó actividad larvicida pero en CCD se observó un compuesto mayoritario.
El espectro IR (KBr) de la fracción F5H-4 proveniente de las fracciones F5B-2 y F5C-2 (Figura 5) muestra una banda ancha correspondiente a OH a 3394 cm-1,
1653 (C=O conjugado) 1604 y 2926 (bandas aromáticas) 1065 y 1168 (enlaces C-O
de alcoholes). El análisis preliminar por cromatografía líquida de alta eficiencia
(CLAE/UV-DAD) (Figura 6) mostró que esta fracción está conformada por un
compuesto mayoritario, con un tiempo de retención (tr) 12,19 min, y uno minoritario
de (tr) 65,69 min. El espectro UV de la señal de tr 12,19 min presentó
Fracciones Peso (mg)
CE50 g/mL
Promedio
A-1A-2 208 > 1000 A-3 27 102 A-4 172 > 1000 A-5 66 > 1000 A-6 350 196 A-7 623 > 1000 A-8 300 222 A-9 960 176
A-10 1687 > 1000 A-11 24 126
Cafeína 450
26
Figura 5. Espectro de IR de la mezcla 2 en KBr
27
dos bandas de máxima absorción, indicativo de la presencia de dos anillos
aromáticos, comportamiento característico de flavonas y flavonoles. La banda II
correspondiente al anillo A se observa a longitud de onda (λ máx.) de 271,5 nm y la
banda I del anillo B a (λ máx.) 349,4 nm 74. El espectro UV de la señal tr 65,69 min
registró una sola banda débil a (λ máx.) de 275 nm.
El espectro de RMN 1H en acetona d6, de la mezcla 2 confirma la presencia de dos
compuestos (Figura 7). El compuesto mayoritario genera 5 señales
correspondientes a hidrógenos aromáticos entre 6.0- 8.5 ppm; un singlete en
5,50 ppm correspondiente al protón anomérico de una unidad de carbohidratos y 5
señales entre 3,3 y 4,2 ppm, características de protones de oximetinos del
carbohidrato.
Figura 6. Análisis por CLAE UV-DAD de la mezcla 2
Las señales de RMN 1H (Figuras 7,8 y 9) presentan desplazamientos químicos
similares a los observados para la mezcla 1 demostrando que el componente
mayoritario es un flavonoide derivado de quercetina. Por otro lado se observan
señales en la región alifática en el rango de 3,0 a 5,6 ppm asignables a los
hidrógenos de un residuo de monosacárido, confirmado por una señal singlete
a 5,50 ppm asignada a un protón anomérico (C-1''). La señal que indica el tipo de
azúcar presente en esta estructura es un doblete en 0,91 que integra para 3H con
J= 6,2 Hz que correlaciona con el 13C a 18,8 ppm en el espectro de HMBC.
28
Figura 7. Espectro de RMN 1H completo de la mezcla 2 en acetona –d6.
ppm (t1)1.02.03.04.05.06.07.0
0.0
5.0
10.0
15.0
7.5037.4987.4007.3957.3797.3746.9996.9786.4706.4666.2616.257
5.500
4.231
3.7643.7563.7423.7333.4393.4243.4153.4003.3763.3533.330
0.9150.900
1.00
1.05
1.00
1.02
1.02
1.01
1.05
1.04
2.97
3.13
ppm (t1)12.60012.65012.70012.75012.800
-1.00
-0.50
0.00
0.50
1.00
1.50
12.716
0.52
29
Figura 8. Espectro de la región aromática RMN 1H de la mezcla 2
ppm (t1)6.507.007.50
0.0
5.0
10.0
15.0
7.5037.498
7.4007.3957.3797.374
6.9996.978
6.4706.466
6.2616.257
1.00
1.05
1.00
1.02
1.02
ppm (t1)12.60012.65012.70012.75012.800
-1.00
-0.50
0.00
0.50
1.00
1.50
12.716
0.52
30
Figura 9. Espectro de la región alifática de RMN 1H de la mezcla 2
ppm (t1)1.02.03.04.05.0
0.0
5.0
10.0
5.500
4.231
3.7643.7563.7423.7333.4393.4243.4153.4003.3763.3533.330
0.9150.900
1.01
1.05
1.04
2.97
3.13
31
Figura 10. Espectros de 13C de la fracción F5-H4 denominado mezcla 2 en acetona –d6.
ppm (t1)50100150200
0
5000
10000
15000
207.4
180.3180.2
166.0165.9159.3158.9150.0146.8
136.8136.8130.0123.8123.5121.4117.1117.0106.7106.7103.7100.595.595.595.573.072.472.3
70.8
18.8
32
Figura 11. Espectro de HMQC de la mezcla 2
ppm (t2)1.02.03.04.05.06.07.08.0
50
100
ppm (t1)
ppm (t2)3.303.403.503.603.703.803.90
70.0
75.0ppm (t1)
33
Figura 12. Espectro de HMBC de la mezcla 2
ppm (t2)1.02.03.04.05.06.07.0
50
100
150
34
Figura 13. Espectro de COSY H-H de la mezcla 2
ppm (t2)
1.02.03.04.05.06.07.08.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0ppm (t1)
35
Esta señal fue asignada a un grupo metilo en la posición C-5'' de un residuo de rhamnosa;
las señales para los H de los carbonos C-2'', C-3'' y C-4'' se encuentran en el rango de 3,0
a 4,2 ppm destacándose la señal doble en 4,23 (1H, J = 1,67 Hz) asignada al H de la
posición C-2'', este protón presenta correlación con el protón del C-1'', lo cual evidencia un
acoplamiento ecuatorial-ecuatorial característico de α-rhamnosido 74,
En el espectro de RMN 13C y HMQC (Figuras 10 y 11) se observa una señal de carbono
carbonílico en 180.3 ppm (C-4) este desplazamiento es debido a la presencia de
hidroxilos en la posición (C-3 y C-5)73 en un sistema conjugado; la señal del C-3 en los
flavonoles se presenta entre 136 a 139 ppm 73 para la mezcla 2 se le asignó 136.8
ppm, la señal del carbono anomérico en 103.7 ppm, y las otra señales del azúcar entre
70 y 75 ppm. Los espectros HMQC y HMBC (Figuras 11 y 12) permitieron asignar las
señales de RMN 13C del azúcar de la mezcla 2 como sigue; H-1'' 5,50 (s brd)
correlaciona con las señales a c 70,8, 72,4 y 136,8 ppm asignadas a los C-2'', C-3'' y C-3
del residuo de azúcar y de la aglicona de tipo flavonol respectivamente. Es así que se
concluye que la unión entre el azúcar y el flavonoide es de tipo α-L-rhamnosido ya que
ocurre en forma natural. A 7,37 ppm, se observa un doble doblete con J = 8,20 Hz y J =
2,30 Hz, correspondiente a un H en la posición H-6'. Adicionalmente el H-2' a 7,51 ppm
con J=2,3 Hz acopla con el H-6', confirmando la posición meta y la correlación que
presenta el H-5 y H-6 con el espectro en COSY H-H (Figura 13) mostrando así la
existencia de un anillo 1',3',4' tri-sustituido correspondiente al anillo B.
Es así que se propone el esqueleto básico de un flavonol glicosidado constituido por los
anillos A, B y C y una unidad de Rhamnosa (Figura 14).
6
OO
O O
H
H
R1
H
OOH
HH
R3
OR4
R2
36´
8
A C
B
O
OH H
OH
H
H
H
H OHOH
CH3
3´´
1´´
Figura 14. Subestructuras que conforman la mezcla 2
36
Con el experimento de HMBC (Figura 12) se realizó la asignación de las señales
correspondientes al compuesto mayoritario de la mezcla 2. En el anillo B, las señales de
los carbonos C-3', C-4' y C-1' (146,8, 150,0, 123,5 ppm) presentan correlación con los
protones H-2', H-5' y H-6' ( 7,51, 7,37, 6,95, ppm). En el anillo C, al C-2 se le asigno
158,9 ppm por la correlación que presenta los protones H-2' y H-6' ( 7,51, 7,37 ppm). La
señal en 106,7 ppm se asigno al C-10 con la correlaciones que se observaron con los H-
6 y H-8 ( 6,26, 6,47 ppm) y al C-9 se le asigno la señal en 159,3 ppm al presentar la
correlación con el H-8 (6,47 ppm) (Figura 15). Adicionalmente, las señales
correspondientes de la parte glicosídica confirman la presencia de una unidad de
rhamnosa con ( 0,91, 3H, d, J = 6,4 Hz) característico de la quercetina 3-O-ramnosido 74;
con respecto al sitio de glicosilación se observa una correlación entre el hidrógeno
anomérico H-1'' ( 5,50 ppm) del rhamnosido y el carbono C-3 de la aglicona del núcleo
flavonol 136,8 ppm, además este protón anomérico presenta correlación en HMBC con
el carbono C-2'' ( J= 1,6 Hz)74. Con esta correlación es posible establecer que la
estructura del compuesto mayoritario de la mezcla 2, corresponde al quercetina-3-O- -L-
rhamnopiranosido conocida como quercitrina 62,73 (Figura 15)
Este compuesto ha sido aislado de las especies C. glabellus, C. schiedeanus, C.
bonplandiarus en sus partes aéreas y en el látex C. panamensis 62. Este compuesto no
presentó actividad larvicida frente al mosquito C. quinquefasciatus. La asignación total de
las señales de RMN 1H y 13C de este compuesto se encuentra en la tabla 6.
O
OOH
OH
OH
OH
O
O
H
OH
H
H
H
H OHOH
HH
H
CH3
Figura 15. Correlaciones HMBC para la quercitrina
37
Tabla 6. Parámetros de RMN 1H y 13C para las mezclas 1 y 2
Posición
ppm] multiplicidad J (Hz)
Mezcla 1 1H
Quercetina Fossen et
al. 2006 1H 72
Mezcla 2 1H
Mezcla 2 13C
Quercitrina Curir et al.
1996 1H 73
2 -- -- -- 158,9 3 -- -- -- 136,8 4 -- -- -- 180,3 5 12.76 -- -- 165,9
6 6,24, d, J=2.0 6,27 6,26, d, J=2,0 95,5 6,24, d,
J=2,5 7 -- -- -- 166,0
8 6,46, d, J=2,0 6,47 6,47, d, J=2,0 100,5 6,41, d,
J=2,5 9 -- -- -- 159,3 10 -- -- -- 106,7 1' -- -- -- 123,5
2' 7,51, d, J=2,1 7,82 7,51, d, J=2,3 117,0 7,35, d,
J=2,0 3' -- -- -- 146,8 4' -- -- -- 150,0
5' 6,95, d, J=8.3 6,97 6,95, d, J=8,2 117,1 6,92, d, J=8
6' 7,39, dd, J=8,3;2,0 7,72 7.37, dd,
J=8,2; 2,3 123,8 7,29, dd, J=8,0 2,0
1'' -- -- 5,50, s brd 103,7 5,31 br s
2'' -- -- 4,23, d, J=1,6 73,0 4,03 br s, J=4,5
3'' -- -- 3,75, dd, J=9,2;3,2 72,4 3,58, dd,
J=9;4,5 4'' -- -- 3,35, t, J=9,2 72,3 3,21, t, J=9
5'' -- -- 3.42, dd, J=9,4;6,0 70,8 3,34, dq,
J=9,6 6'' -- -- 0,91, d, J=6,4 18,8 0,89, d, J=6
Solvente metanol-d4
400,13 MHz
metanol-d4
acetona-d6 400,13 MHz
acetona-d6 100,0 MHz
DMSO- d6
38
2.2.2 Análisis estructural de la mezcla 3
El fraccionamiento bioguíado y sucesivo de la fracción activa F5A-6 se presenta en
la figura 51. Los resultados de actividad biológica se enseñan en la Tabla 7 y grafica
3 y se observan como promisorias las fracciones F5C-1 y F5C-3. Basados en los
resultados de actividad, cantidad de muestra y el análisis preliminar por CCD se
seleccionaron las dos fracciones para continuar con el estudio. La fracción F5I-2 (6
mg) proveniente de la fracción F5C-1 se obtuvo como un sólido de color amarillo y
presentó bioactividad. El espectro RMN 1H en acetona-d6 (Figura 16) presenta 6
señales entre 6.0 y 8.0 ppm en la región aromática, se observan a campo bajo un
doblete a 12,7 ppm (d, J = 2.33 Hz) y en la región entre 3.1 y 5.8 ppm 7 señales, 2
de ellas corresponden a protones anoméricos de dos unidades de carbohidrato. A
campo alto (0.8 - 2.2 ppm) se presentan señales correspondientes a metilos de tipo
terpeno. Por la cantidad de muestra no es posible purificar la fracción mezcla 3.
Tabla 7 y Grafica 3. Actividad larvicida (1/CE50) x 103 de las fracciones F5C y F5I frente a larvas de C. quinquefasciatus.
0
10
20
30
40
50
60
70
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
INV
ER
SO
DE
LA
CE
50
1 X
10
3
FRACCIONES F5 COLUMNAS C Y I
BIOENSAYO BAL - Cq
Fracciones Peso (mg)
CE50 g/mL promedio
F5C-1 30 15 F5C-2 40 >1000 F5C-3 40 195 F5C-4 40 >1000 F5C-5 6 >1000 F5C-6 80 451 F5C-7 109 >1000
F5I-1 8 9 >1000 F5I-2 9 6 64 F5I-3 10 14 >1000
Cafeína- 11 ---- 450
39
2.2.3 Análisis estructural de la mezcla 4
La mezcla 4 proveniente de la columna D y de fraccionamientos sucesivos
bioguíados (Figura 51), condujo a la fracción F5G-1. De esta fracción se obtuvo un
sólido de color amarillo (10 mg), el cual presentó bioactividad. El análisis
espectroscópico 1H RMN permitió identificar la quercitrina como componente
mayoritario y un terpeno como componente minoritario. Por la cantidad de muestra
no fue posible continuar la purificación.
Tabla 8 y Grafica 4. Actividad larvicida (1/CE50) x 103 de las fracciones F5D, F y G frente a larvas de C. quinquefasciatus
2.2.4 Análisis estructural de la mezcla 5
El fraccionamiento bioguíado y sucesivo de la fracción activa F5A-9 se presenta en
la Figura 51. Los resultados de actividad biológica se enseñan en la Tabla 9 y
Grafica 5. Se observan como promisorias las fracciones F5E-2, F5E-3 y F5E-4. Con
estos resultados de actividad, cantidad de muestra y el análisis preliminar por CCD
se seleccionó la fracción F5E-2 para continuar con el estudio. De esta fracción se
obtuvieron dos sólidos de color amarillo bioactivos, los cuales se denominaron F5J-5 (89 mg) y F5J-6 (330 mg). Para continuar con el estudio se seleccionó la fracción
F5J-5 por ser la fracción más activa y porque en el análisis preliminar por CCD se
observa más limpio. La fracción F5J-6 se estudiará en trabajos posteriores.
Fracciones Peso (mg)
CE50 g/mL promedio
F5D-1 28 >1000 F5D-2 80 >1000 F5D-3 29 195 F5D-4 11 195 F5D-5 135 >1000 F5D-6 13 >1000
F5F-3 7 16 571 F5F-6 8 20 118 F5G-1 9 10 63
F5G-2 10 3 > 1000 F5G-3 11 5 > 1000 Cafeína- 12 ---- 450
40
Tabla 9 y Grafica 5. Actividad larvicida (1/CE50) x 103 de las fracciones F5E, F5J frente a larvas de C. quinquefasciatus.
El espectro de RMN 1H en metanol–d4 (Figura 17) de la fracción F5J-5 muestra 6
señales correspondientes a protones en la región aromática, se distinguen 4 señales
que desaparecen con la adición de agua deuterada, por lo que se deduce que el
compuesto tiene grupos O-H. En la región alifática entre 1-5,5 ppm se encuentran
12 señales; se destacan 3 señales correspondientes a protones anoméricos 5,21
ppm (0, 47 H, dd, J = 7,0; 15,6 Hz), 4,91 ppm (1H, br s) y 4,68 ppm (0,6 H, d, J =
2,3 Hz) y 3 señales de grupos metilo entre 1,25 y 1,50 ppm característico de
azúcares de tipo rhamnosa. Las señales restantes pertenecen a la parte glicosídica
entre 3,45 - 4,10 ppm. Estas señales permitieron proponer que esta fracción
presenta mezcla de compuestos flavonoides glicosidados.
Fracciones Peso (mg)
CE50 g/mL promedio
F5E-1 72 > 1000
F5E-2 800 126 F5E-3 50 450 F5E-4 15 571 F5J-5 89 31 F5J-6 330 51
Cafeína-7 ---- 450
41
Figura 16. Espectro de 1H de la mezcla 3 en acetona–d6.
ppm (t1)1.02.03.04.05.06.07.08.0
0
50
100
150
200
250
300
3508.01
7.577.567.55
7.487.477.477.467.457.45
7.016.996.496.49
6.276.27
5.905.874.554.54
4.484.474.064.054.044.024.023.593.583.563.543.433.413.393.37
0.940.920.90
0.850.830.820.80
1.00
1.19
1.32
1.27
1.16
1.23
0.70
0.45
0.71
0.54
3.04
1.39
4.49
5.32
1.79
2.32
2.31
3.64
6.39
9.22
ppm (t1)12.67012.68012.69012.70012.71012.720
0.05.010.015.020.025.030.0
12.69412.688
0.78
42
Figura 17. Espectro de 1H de mezcla 5 en metanol–d4
ppm (t1)1.02.03.04.05.06.07.08.09.0
0
50
100
150
8.7038.701
8.0337.8317.8037.7837.7797.748
7.0457.0256.5626.5586.5416.537
6.3656.3506.3465.6265.608
5.2285.208
4.9194.9154.914
4.680
4.0754.0724.0704.0684.0683.9733.952
3.8913.8863.8563.8303.798
3.742
3.6813.6743.643
3.5823.5493.5373.5363.530
1.4401.3581.342
1.2911.276
1.00
0.86
1.77
0.19
0.66
0.47
1.10
0.63
0.86
1.72
11.8
3
0.91
0.64
43
2.3 ANÁLISIS DE LOS COMPUESTOS BIOACTIVOS PRESENTES EN EL EXTRACTO F2
El extracto F2 (4,10 g), se sometió a cromatografía en columna (CC) denominada A
y se obtuvieron 16 fracciones mayores denominadas F2A-1 hasta F2A-16. Cada
una de estas fracciones fue evaluada con el bioensayo BAL-Cq (Tabla 10 y grafica
6).
Tabla 10. y Grafica 6. Actividad larvicida (1/CE50) x 103 de las fracciones F2A-1 a F2A-16 frente a larvas de C. quinquefasciatus.
En la tabla 10 y en la grafica 6 se observa que las fracciones con los mejores
valores de actividad larvicida fueron las fracciones F2A-1, F2A-2, F2A-6, F2A-8 y
F2A-14. Para continuar con este estudio fue necesario considerar la disponibilidad
de muestra y el análisis realizado por CCD para la separación y purificación de los
constituyentes mayoritarios. Es así que se selecciono las fracción F2A-6.
La fracción F2A-6 (1.2 g), se separó por CC (B) y se obtuvieron 7 fracciones a las
cuales se les evaluó la actividad larvicida. (Tabla 11 y grafica 7).
Fracciones Peso (mg)
CE50 g/mL PROMEDIO
F2A-1 214 619 F2A-2 266 353 F2A-3 48 >1000 F2A-4 46 >1000 F2A-5 100 >1000 F2A-6 1200 259 F2A-7 63 >1000 F2A-8 353 571 F2A-9 189 >1000 F2A-10 432 >1000 F2A-11 163 >1000 F2A-12 44 >1000 F2A-13 29 >1000 F2A-14 28 493 F2A-15 420 >1000 F2A-16 420 >1000
Cafeína-17 ---- 450
44
Tabla 11 y Grafica 7. Actividad larvicida (1/CE50) x 103 de las fracciones F2B-1 a F2B-7 frente a larvas de C. quinquefasciatus.
En la tabla 11 y en la grafica 7 se observa que las fracciones con valores
promisorios de actividad larvicida son las fracciones F2B-1, F2B-3, F2B-5, F2B-6 y
F2B-7. Para continuar con este estudio fue necesario considerar la disponibilidad de
muestra y el análisis realizado por CCD para la separación y purificación de los
constituyentes mayoritarios. Es así que se seleccionaron las fracciones F2B-1, F2B-3 y F2B-6.
2.3.1 Análisis estructural de los compuestos 3, 4, 5 y 6
La fraccion F2B-1, por CGAR-EM presentó 5 componentes de los cuales 4 fueron
identificados (Figura 18). Esta fracción presentó actividad larvicida frente a las larvas
de C. quinquefasciatus. (Tabla 11 y grafica 7)
Fracciones Peso (mg)
CE50 g/mL
promedio F2B-1 59 118
F2B-2 409 >1000 F2B-3 80 88
F2B-4 47 >1000 F2B-5 150 354
F2B-6 286 223
F2B-7 150 354
Cafeína-8 ---- 450
45
1
2
3
4
5
Figura 18. Análisis por CGAR-MS de la fracción F2B-1
CH3
O
O CH3
