Gel de retardamiento(mobility shift assay)

Dr. en C. Erwin ChiqueteMedicina InternaBiología Molecular en Medicinaerwinchiquete@runbox.com

Ensayo del cambio en la movilidadelectroforética del ADN

Sinonimia

•Gel shift assay•Gel retardation assay•Band shift assay•Mobility electrophoresis•Gel-electrophoresis DNA-bindingassay

Aspectos históricos

Esta técnica fue desarrollada en 1981 por Fried y Crothers; y Garner y Revzin, de manera independiente. Ambos grupos publicaron sus trabajos en la mismarevista: Nucleic Acids Research.

Objetivos de la técnica

Identificación de proteínas que se unen al ADN:

•Factores de transcripción.

•Proteínas que intervienen en lareparación del ADN.

•Proteínas que intervienen en el empaquetamiento del ADN.

Fundamentos

El principio en el que se basa elprocedimiento es que los complejosde ADN y proteínas tienen diferentemobilidad, con respecto al ADN queno está acomplejado con proteínas,durante la electroforesis en gel depoliacrilamida.

Procedimiento

El ensayo se divide en varias partes:

1. Preparación de una sonda de ADN. Una secuencia conocida de nucleótidos obtenidos por la digestión con enzimasde restricción de un fragmento clonadoen un plásmido (de 50-300 pb) o un fragmento sintético (de 20-50 pb) esmarcado radiactivamente.

Procedimiento

2. Preparación del gel. Un gel de poliacrilamida al 4-6% bajo en fuerzas iónicas es “precorrido” verticalmente durante 2 h a 150 V.

Procedimiento

3. Realización de la reacción de unión (fijación). Un extracto de proteínas totales o nucleares de células generalmente cultivadas son incubadas con la sondade ADN marcado. Este ADN tiene la secuencia a la que presumiblemente se unirá alguna proteína del extracto.

Procedimiento

4. Electroforesis en gel y autorradiografía. Los complejos de ADN y proteínas son separados del ADN libre mediante electroforesis en gel de poliacrilamidano desnaturalizante. Posteriormente se realiza una autorradiografía del gel y se analizan los resultados.

Procedimiento

A C

BB

Procedimiento(análisis estequiométrico)

Resultados

(B) DNA-binding activity of purified PRB. Gel retardation experiments were carried out as pre-viously described (31). Recombinant PRB was preincubated with the control buffer (lane 1), 10 27 M progesterone (P, lane 2), or R5020 (R,lane 3) for 15 min at 25°C. Labeled double-stranded PRE oligonu-cleotides were then added and the reaction mixture was incubated foran additional 15 min. Samples were analyzed on a nondenaturing 5% polyacrylamide gel.

Resultados

Variaciones: Competencia

CA B

A CB

Otras variaciones

•Super-shifting (uso de anticuerposdirigidos contra proteínas conocidas).

•Uso de marcas de fluoróforo en sustitución a las radiactivas.

Desventajas

•No es posible caracterizar la secuencia específica de la sonda que se une a laproteína (ésta debe conocerse con antelación).

•Puede haber más de una proteína quese unen formando un complejo de uniónal ADN.

•Lo que ocurre in vitro no necesariamentees una menifestación de lo que sucede in vivo.

Inmunoprecipitación

Antecedentes

Esta técnica de análisis in vitro de la interacción de un Ag con su Ac específico fuedesarrollada por Michael Heidelberger en1937.

En 1946 Oudin describió un sistema dedifusión para reacciones antígeno-anticuerpoen tubos llenos de agarosa.

Posteriormente Ouchterlony hace su clásicadescripción de la “doble difusión” en placas deagar.

Fundamento

Se basa en el principio de reacciónantígeno anticuerpo, que en un fluidoo soporte semisólido forma un precipitado.

Fundamento

Se usa un anticuerpo que va dirigido contra un antígeno protéico en una mezcla de proteínas para aislar el péptido que posee dicho antígeno.

Fundamento

Las técnicas que se basan en laprecipitación de complejos inmunes(inmunoprecipitación) son variadas.Pueden realizarse en un tubo de ensayoo en placas de agar (técnica conocidacomo inmunodifusión).

Fundamento

Fundamento

La reacción de precipitación esdependiente del pH, temperaturay concentración iónica; pero sobretodode las concentraciones relativas deAg y Ac.

Fundamento

Zona deequivalencia

Zona deexceso deanticuerpo

Zona deexceso deantígeno

INM

UN

OP

REC

IPIT

AD

O F

OR

MA

DO

CONCENTRACIÓN CRECIENTE DE ANTÍGENO

Inmunodifusión doble

REACCIÓN DEIDENTIDAD

REACCIÓN DENO IDENTIDAD

REACCIÓN DEIDENTIDAD PARCIAL

Inmunodifusión doble(semicuantitativa)

Ac

Ag X

Ag X/8

Ag X/32

Ag X/16 Ag X/4

Ag X/2

Inmunodifusión radial

Ag/4

Ag/2

Ag

Ag/8

Aplicaciones•Aislar un Ag específico (a menudo unaproteína).

•Cuantificar un determinado Ag.

•Identificación de virtualmente cualquier péptido de un extracto, generalmente en estado soluble (v.g. enzimas, factores de transcripción, receptores, etc.).

*A menudo, después de purificar una proteína, ésta es posteriormente analizada mendiante un gel de poliacrilamida y SDS.

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