El sistema toxina-antitoxina,...2.6.2. Microscopías 30 2.6.2.1 Microscopía de fluorescencia: Visualización de nucleoides y estado de las membranas 30 2.6.2.1 Microscopía electrónica:

Universidad Autónoma de Madrid. Facultad de Ciencias. Departamento de Biología Molecular

El sistema toxina-antitoxina,

,como inhibidor de la

proliferación celular e inductor de

tolerancia

Vrginia S. Lioy Marzo, 2010

Memoria presentada por Virginia Lioy para optar al grado de

Doctor en Ciencias por la Universidad Autónoma de Madrid.

El trabajo ha sido realizado en el Centro Nacional de

Biotecnología (CNB-CSIC) bajo la dirección del Prof. Juan

Carlos Alonso Navarro y la tutela de la Dra. Sylvia Ayora Hirsch.

Abstract

The emergence and spread of pathogenic bacteria that have become resistant to multiple

antibiotics through lateral gene transfer have created the need of novel antimicrobials.

Toxin-antitoxin (TA) modules, which have been implicated in plasmid maintenance and

stress management, are ubiquitous among plasmids from vancomycin, methicillin or

erythromycin resistant bacteria. In the pSM19035-encoded TA loci, the labile antitoxin

binds to free toxin and neutralizes it phosphotranferase activity. When the toxin is freed

from the antitoxin, it induces a reversible state of growth arrest in distantly related

bacteria as Bacillus subtilis and Escherichia coli. Growth arrest is mainly due to the

inhibition of the synthesis of the nucleotide pool, especially GTP and UTP. This inhibition,

which is obtained by an unknown mechanism, leads to a drastic reduction on the rate of

replication, transcription and translation. However, upon prolonged toxin action, the cells

cannot longer be rescued from their stasis state, and the cells die by lysis. It was found that

upon induction, the repression of several essential genes involved in lipid metabolism

could be responsible for cellular lysis.

Bacterial populations contain a large fraction of cells susceptible to antibiotics and a

small fraction in stasis that are refractory to them, called persisters cells. In this work, we

have shown that toxin induces a small subpopulation that is refractory to the toxin effect.

This small subpopulation could be considered as “persisters cells”. In the presence of one

antibiotic and the toxin it was observed an increased multidrug sensitivity, suggesting that

toxin induces a different type of persisters. Furthermore, action is independent of the

culture phase. We have shown that expression of the antitoxin only reversed the

refractory cells selected by the action of toxin. Our results suggested that expression of

toxin should reversibly induce a phenomenon that mimics persistence. However, stasis or

dormancy, triggered by the expression of the toxin, per se is not sufficient for multidrug

tolerance. Indeed, expression increases multidrug sensitivity.

All these results pointed towards system as an ideal candidate for developing new

antimicrobials. If we could find a compound that disrupts the ∙ interaction, it can be

considered as an attractive antimicrobial agent. Using molecular dynamics we were able to

predict that Asp18 and in minor extent Glu22 residues might be relevant for ∙ interaction.

In order to validate the in silico predictions a mutagenesis analysis on the system was

carried out. In addition, a Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) assay was

developed for high-throughput screening (HTS). For the BRET assay, luc gene was fused

to the gene (Luc-) and to the gfp gene (-GFP). Luc- efficiently transfers the excited

energy to the fluorescent acceptor molecule (-GFP or K46A-GFP) and rendered high

bioluminescence BRET signals. The mutagenesis was performed in a variant with a

mutation in the active center (K46A-GFP) but that still formed a complex with the Luc-

antitoxin. The exchange of Asp18 to Ala from K46A-GFP (D18A) affects Luc-·D18A

K46A-GFP interaction, but exchange of Glu22 to Ala (E22A) does not. With these results,

we have validated the hypothesis that it is possible to disrupt a TA module, offering novel

and unexploited targets to fight against antibiotic-resistant strains.

Abreviaturas

A: adenina

Aa: aminoácidos

AB: antibiótico

ADN:ácido desoxirribonucleico

ADNcd: ADN cadena doble

ADP: Adenosina-5´-difosfato

ARN: ácido ribonucleico

ARNm: ácido ribonucleico mensajero

ARNt: ácido ribonucleico de transferencia

ARNtm: ácido ribonucleico de tranferencia y mensajero

ATP: Adenosina-5´-trifosfato

C: citosina

DAPI: 4',6-diamidino-2-fenilindol

DNasa I: Desoxiribonucleasa I

dNTPs: 2´-desoxirribonucleósidos-5´-trifosfato

DO: densidad óptica

dPAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante

EDF: factor de muerte extracellular, del inglés-Extracellular Death Factor

EF: factor de elongación, del inglés- Elongation factor

G: guanina

G+: Gram positiva

G-: Gram negativa

GDP: guanosina-5´-difosfato

GFP: proteína verde fluorescente, del inglés-Green Fluorescence Protein

GTP: guanosina-5´-trifosfato

His: histidina

HTH: hélice giro hélice, del inglés-Helix-Turn-Helix

HTS: del inglés-High Through Put Screening

IPTG: isopropyl -D-thiogalactósido

Kb: kilo pares de bases

LB: Medio de cultivo Luria Bertani

Luc: Renilla luciferasa

MMM9: medio mínimo M9

MMS7: medio mínimo S7

MRSA: Estafilococos aureus reisitentes a meticilina, del inglés-Methilin Resistant

Staphilococcus aureus

N: asparagina

ndPAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante

Ni-NTA: matriz de níquel

NMP: nucleosido monofosfato

nt: nucleótido

(p)ppGpp: guanosina penta o tetrafosfato

pb: pares de bases

PCR: reacción en cadena de la polimerasa (del inglés-polymerase chain reaction)

PEI: polietilénimina

Pir: pirimidinas

RF: factor de libreación, del inglés-Release Factor

RHH: lamina-hélice-hélice, del inglés-Ribbon-Helix-Helix

RMN: resonancia magnética nuclear

ROS: especies reactivas de oxigeno, del inglés-Reactive Oxiygen Species

rpm: revoluciones por minuto

SA: sulfato amónico

SDS: dodecil sulfato sódico

SDS-PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS

TA: toxina-antitoxina

TAE: Tris Acetato EDTA

UFC: unidades formadoras de colonias

UTP: uridina-5´- trifosfato

VBNC: del inglés-Viables But Non Culturables

VRE: Enterococos resistentes a Vancomicina, del inglés-Vancomycin Resistant

Enterococcus

W: triptófano

Xil: xilosa

Índice

INTRDUCCIÓN

1. EL PLÁSMIDO PSM19035 1

2. CLASIFICACIÓN DE LOS SISTEMAS DE TOXINA ANTITOXINA 3

2.1 Sistemas tipo I 3

2.2 Sistemas TA tipo II 4

3. SISTEMAS TA QUE INHIBEN LA REPLICACIÓN 4

4. SISTEMAS TA QUE INHIBEN LA TRADUCCIÓN 5

4.1 Sistema RelBE 6

4.3 Sistemas MazEF y Kid/Kis 7

4.3.1 Sistema MazEF 8

4.3.2 Sistema Kid/Kis. 9

4.4 Sistema HipBA 10

5. SISTEMAS CON MECANISMOS DE ACCIÓN DESCONOCIDOS 12

5.1 Sistemas y PezAT 12

6. REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LOS SISTEMAS TA 13

6.1 Regulación de la expresión en sistemas de 2 componentes 13

6.2 Regulación de la expresión del sistema : función y características de la proteína 2 14

7. ESTRUCTURAS CRISTALINAS DE LOS SISTEMAS TA: ANÁLISIS Y DISEÑO DE NUEVOS

ANTIMICROBIANOS 16

7.1 Estructura cristalina del complejo CcdAB 16

7.2 Estructura cristalina del complejo RelBE 17

7.3 Estructura cristalina del complejo Kid-Kis y MazEF 17

7.4 Estructura Cristalina de HipBA 18

7.5 Estructura cristalina del complejo y PezAT 19

OBJETIVOS 21

1. MATERIALES 23

1.1 Cepas 23

1.2. Reactivos y materiales 23

2. MÉTODOS 24

2.1. Manipulación de células 24

2.1.1. Obtención de células competentes. 24

2.1.2 Transformación Bacteriana. 24

2.2. Manipulación del ADN 25

2.2.1. Purificación y cuantificación del ADN 25

2.2.2. Plásmidos 25

2.2.3. Marcaje radiactivo de fragmentos de ADN. 26

2.2.3.1. Marcaje de fragmentos con extremos 5´ protuberantes 26

2.2.3.2. Obtención y purificación de los fragmentos de ADN utilizados para los ensayos de

interacción proteína-ADN. 26

2.2.4. Mutagénesis dirigida. 26

2.3. Obtención y estudio de proteínas 27

2.3.1. Sobreproducción de proteínas. 27

2.3.2. Purificación de proteínas. 27

2.3.2.1. Purificación de las proteínas 27

2.3.2.2. Purificación de -His6)2 y (D60A-His6)2. 28

2.4. Ensayos bioquímicos 28

2.4.1. Medida de interacciones proteína-ADN 28

2.4.1.1. Ensayos de retraso en gel. 28

2.4.1.2. Ensayos de protección a DNasa I. 29

2.5 Modelado Molecular 29

2.6. Ensayos in vivo 29

2.6.1 Medio de Cultivo: 29

2.6.2. Microscopías 30

2.6.2.1 Microscopía de fluorescencia: Visualización de nucleoides y estado de las membranas

30

2.6.2.1 Microscopía electrónica: Visualización del efecto de la sobre-expresión de en células

de E. coli 30

2.6.3 Estudios de viabilidad en B. subtilis y E. coli 30

2.6.3.1 Estudio del efecto de la expresión de Y83C y en la viabilidad de células de B. subtilis

30

2.6.3.2 Identificación de especies reactivas de oxigeno mediadas por en B. subtilis 30

2.6.3.3 Estudio del efecto de la expresión de en células de E. coli 31

2.6.3.4 Estudio de la toxicidad de :GFP en células de E. coli 31

2.6.3.5 Estudio del efecto de la expresión deY83C y en la generación de células persistentes

en B. subtilis 31

2.6.4 Estudio de la inhibición de la síntesis de ARN, ADN y proteínas luego de la inducción de

en B. subtilis 32

2.6.5 Geles en 2D, análisis de imágenes y identificación de proteínas 32

2.6.6 Cuantificación del pool de purinas in vivo. 32

2.6.7 Análisis del transcriptoma de B. subtilis en presencia de Y83C 33

2.6.8 Ensayo de BRET en células de E. coli 33

RESULTADOS

PARTE I: REGULACIÓN DEL SISTEMA DE TA PAPEL DE LA PROTEÍNA EN LA

MODULACIÓN DEL REPRESOR TRANSCRIPCIONAL 35

1.1 La proteína 2 forma complejos específicos y 2 y 2D60A incrementan la formación del

complejo 2·DNA 35

1.3 El aumento de la afinidad de 2 por la región promotora es independiente de la unión de 2 a

ATP y a ADN 36

PARTE II. SISTEMA TA: EL PAPEL DE EN EL SISTEMA 38

2.1. Sistemas Toxina Antitoxina: Antecedentes del tema 38

2.2 Caracterización del efecto tóxico de la proteína en B. subtilis 38

2.2.1 La expresión de la toxina Y83C inhibe la proliferación celular 38

2.2.2 La expresión de la toxina Y83C induce un efecto bacteriostático y la muerte de una

fracción de la población bacteriana 39

2.2.3 La expresión de no induce especies reactivas de oxigeno 40

2.2.4 La expresión de inhibe la replicación, transcripción y traducción in vivo. 41

2.2.5 La toxina inhibe la síntesis de purinas in vivo 42

2.2.6 Efecto de la toxina Y83C en la expresión génica de B. subtilis 44

2.2.6.1 Genes cuya expresión fue reprimida por Y83C 45

2.2.6.2 Genes cuya expresión fue inducida por Y83C 47

PARTE III. SISTEMA TA: EL PAPEL DE 2 EN EL SISTEMA 47

3.1 Según los niveles de expresión de el efecto tóxico producido en las células puede revertirse

por la expresión de la antitoxina 2 47

PARTE IV. LA TOXINA INDUCE UN AUMENTO EN LA SENSIBILIDAD DE CÉLULAS

TOLERANTES A ANTIBIÓTICOS. 50

4.1 La expresión de Y83C induce un aumento de la sensibilidad a antibióticos. 50

4.2 La expresión de no produce un aumento de células tolerantes en presencia de antibióticos.

51

PARTE V. EL SISTEMA COMO DIANA ANTIMICROBIANA. 56

5.1 Identificación de los aminoácidos esenciales para la interacción del complejo ∙ 56

5.2 Estudio in vivo de los mutantes en los residuos esenciales en la interacción ∙ 57

DISCUSIÓN

1. LA SEGREGACIÓN DEL PLÁSMIDO PSM19035 ES MUY EFICIENTE 61

2. CARACTERIZACIÓN FISIOLÓGICA DEL EFECTO TÓXICO DE 61

3. LA ANTITOXINA 2ES CAPAZ DE RECUPERAR LA ACTIVIDAD METABÓLICA DE LAS

CÉLULAS QUE ESTABAN BAJO EL EFECTO DE . 65

4. LA TOXINA PODRÍA MODIFICAR EL POOL DE NUCLEÓTIDOS INDUCIENDO UN

ESTADO BACTERIOSTÁTICO. 65

5. LA TOXINA INDUCE UN ESTADO BACTERIOSTÁTICO Y PODRIA DISPARAR LA

MUERTE DE UNA PEQUEÑA FRACCIÓN DE LA POBLACIÓN, QUE ASEGURARÁ LA

SUPERVIVENCIA DEL RESTO, PERO NO PARECE INDUCIR SENESCENCIA 66

6. LA TOXINA COMO DIANA ANTIMICROBIANA 66

6.1 La toxina aumenta la eficacia de los antibióticos sin producir células persistentes. 66

6.2 Diseño de nuevas dianas antimicrobianas. 68

CONCLUSIONES 69

BIBLIOGRAFÍA 71

ANEXO I 77

1. Genes Afectados por la expresión de Y83C 77

ANEXO II 83

Introducción

P á g i n a | 1

Los microorganismos son capaces de desarrollar resistencia a los agentes

antimicrobianos más utilizados, haciendo que los tratamientos de las infecciones

bacterianas sean cada día más difícil. Los mecanismos de adquisición de resistencias

pueden variar desde la generación de mutaciones espontaneas, que modifican la diana del

antibiótico, hasta la expresión de bombas que se encarguen de expulsar al antibiótico

fuera de la célula. Se cree que la forma más probable de adquirir resistencia a antibióticos

es a través de la transferencia de elementos genéticos móviles entre bacterias. Estos

elementos móviles incluyen a los plásmidos, que son elementos genéticos

extracromosomales que se transfieren horizontalmente dentro del mismo género o entre

géneros distintos por conjugación, transducción o transformación. Los plásmidos pueden

conferir resistencias a múltiples antibióticos, por ej.: -lactámicos, aminoglicósidos,

tetraciclinas, macrólidos y glicopeptidos. Se ha demostrado que la resistencia a

vancomicina en especies de Enterococcus o VRE (del inglés-vancomicin resistant

enterococcus) se encuentra codificada en plásmidos, y se cree que las cepas de

Staphylococcus aureus resistenes a meticilina o MRSA (del inglés-methicilin resistant

Sthapylococcus aureus) que también se hicieron resistentes a vancomicina, adquirieron la

resistencia a vancomicina a través de la transferencia de plásmidos de las especies de

enterococos resistentes (DeNap & Hergenrother, 2005, Williams & Hergenrother, 2008).

Debido a esto, el diseño de nuevas dianas antimicrobianas que permitan eliminar a los

plásmidos que portan las bacterias patógenas abre una esperanza en la lucha contra las

bacterias resistentes. Se han propuesto varias estrategias para combatir la resistencia a

antibióticos, y éstas van desde inhibir la transferencia horizontal hasta la inhibición de la

replicación de los mismos. Pocos intentos se han realizado explotando los sistemas

toxina–antitoxina (TA), que están involucrados en el mantenimiento estable del plásmido

en la célula (Williams & Hergenrother, 2008). Análisis estadísticos revelan que plásmidos

aislados de VRE tenían más de 2 sistemas TA. Entre ellos el sistema TA , identificado

por primera vez en el plásmido pSM19035, estaba presente en el 44% de los plásmidos

analizados (Moritz & Hergenrother, 2007). Este sistema se encuentra ampliamente

propagado en estreptococos, y en especial en Streptoccocus pyogenes. Por esto, el

presente trabajo se centrará en el estudio y la caracterización del sistema y su posible

uso como nueva diana antimicrobiana.

1. El plásmido pSM19035

El plásmido pSM19035 (Figura 1) tiene un tamaño de 28,9 Kb y pertenece a la familia de

plásmidos inc18, junto con los plásmidos pAM1 y pIP501. Este plásmido se aisló de

células de Streptococcus pyogenes y a pesar de sus repeticiones internas (el 80 % de su

genoma está repetido e invertido) es capaz de propagarse de manera muy estable en un

gran número (al menos 18 de las 21 especies) de especies del Filo Firmicutes sin perder

información genética (Ceglowski et al., 1993a, Brantl et al., 1990, Ceglowski et al., 1993b).

La replicación de pSM19035 está controlada por 3 mecanismos independientes: En el

primero, el producto del gen repS, que es esencial para la iniciación de la replicación, es

reprimido por el producto del gen copS (Figura 2). En el segundo, se síntetiza un ARN

antisentido que bloquea la utilización del ARNm repS (Brantl & Wagner, 1997, Heidrich &

Brantl, 2007) (Figura 2). Por último, la utilización de promotor de copS (Pcop) e

indirectamente la síntesis de CopS, está regulada por el producto del gen que está

localizado fuera del replicón mínimo.

Se vio que este plásmido era 10.000 veces más estable de lo esperado si el mecanismo

de segregación fuera al azar. Se identificaron 2 regiones discretas, SegA y SegB

responsables de la estabilidad segregacional del pSM19035, funcionando ambas

P á g i n a | 2

actividades independientemente del replicón (Ceglowski et al., 1993a, Brantl et al., 1990,

Ceglowski et al., 1993b). La región SegA codifica las proteínas y . Esta región está

implicada en la inversión de la mitad de su genoma durante la replicación y la resolución

de los multímeros que se forman tras la replicación del plásmido, optimizando la

replicación y maximizando la segregación al azar. La proteína es una recombinasa

perteneciente a la familia de invertasas-resolvasas que cataliza recombinaciones

específicas de sitio, y se une a una región de 85 pares de bases (denominada sitio six)

dividida en dos sitios adyacentes (sitios I y II) (Canosa et al., 2003, Canosa et al., 1998,

Canosa et al., 1996, Rojo & Alonso, 1994, Alonso et al., 1996). Además de incrementar el

número de moléculas monoméricas, la proteína junto con la proteína (topoisomerasa

III) ejercen control también sobre la replicación del plásmido, mediando el proceso de

inversión del ADN necesario para evitar la colisión entre las dos horquillas de replicación,

ya que el pSM19035 tiene dos orígenes de replicación enfrentados, uno en cada repetición

invertida y la replicación es unidireccional (Figura 1). La función de la proteína es

desconocida, y no presenta homología con ninguna proteína de las bases de datos.

La región SegB contiene 4 marcos abiertos de lectura (y) (Figura 1 y 2) que están

ordenados en dos unidades transcripcionales, la primera codifica la proteína y la

segunda unidad es un operón formado por los genes y (Figura 2) (Ceglowski et al.,

1993a). La proteína (o ParA), que es un dímero en solución (2, 68 kDa) pertenece a la

familia de ATPasas involucradas en partición y presenta alta homología estructural con la

proteína Soj de B. subtilis. La proteína (o ParB), que es también un dímero en solución

(2, 16 kDa), es el regulador global del plásmido, ya que además de mantener los niveles

de expresión del sistema TA, regula el número de copia (de la Hoz et al., 2000) y funciona

junto a estabilizando el plásmido. Sin embargo, la función principal de estabilización del

plásmido se debe a , sistema de TA. Los sistemas TA se clasifican en dos tipos según la

naturaleza de la antitoxina, a continuación se realizará una breve descripción de ellos.

Figura 1. Mapa físico del plásmido pSM19035. Las secuencias duplicadas están indicadas por una línea gruesa y la cabeza de flecha indica su orientación. Las zonas no repetidas (NR1 y NR2) están indicadas por una línea fina. Se muestran las regiones requeridas para la replicación (Rep) y la segregación (SegA y SegB). Las flechas en color fuera del círculo muestran los marcos abiertos de lectura más relevantes y las puntas de flecha

que sobresalen indican los subsitios de unión de , en las regiones promotoras de los genes copS, y . La

línea naranja indica los sitios six, la amarilla los oriS y la roja los sitios de unión de . Las flechas negras en los oriS indican la dirección de la replicación. Como el plásmido se encuentra duplicado, solo se ha coloreado una de las repeticiones.

P á g i n a | 3

2. Clasificación de los sistemas de toxina antitoxina

La principal característica de los sistemas de TA es que están formados por dos

componentes. Uno de ellos es una toxina de larga vida media y el otro una antitoxina, con

una vida media mucho más corta, capaz de antagonizar el efecto tóxico de la toxina. Estos

sistemas se clasifican según la naturaleza de la antitoxina. En los sistemas de tipo I la

antitoxina es un pequeño ARN antisentido, que es complementario al ARN mensajero de

la toxina. De esta forma el pequeño ARN antisentido se une al mensajero de la toxina

evitando la traducción de la misma. En los sistemas de tipo II la antitoxina es una proteína

que inhibe la acción tóxica de la toxina formando un complejo estable. Como se mencionó

anteriormente, la antitoxina tiene una vida media mucho más corta que la toxina, lo que

permite a ésta ultima quedar libre si no hay síntesis de novo y ejecutar su efecto tóxico.

Existen varias familias de TA, y se pueden agrupar según la similitud de sus toxinas. Las

toxinas de los sistemas tipo I suelen ser pequeñas e hidrofóbicas, interaccionando con la

membrana y generando una pérdida de su potencial. Las toxinas del tipo II tienen como

dianas procesos primordiales para la bacteria, como pueden ser la traducción o la

replicación (Gerdes et al., 2005, Van Melderen & Saavedra De Bast, 2009). Los sistemas

TA se pueden encontrar tanto en plásmidos de bajo número de copia como en el

cromosoma de una gran diversidad de microorganismos. Generalmente, los genes de la

toxina y la antitoxina forman un operón, en donde el gen de la antitoxina se encuentra

aguas abajo del de la toxina. Excepto para el sistema (Camacho et al., 2002, Meinhart

et al., 2003), la regulación de la expresión del operón está dada por la antitoxina y/ó por el

complejo TA. En el caso del operón la regulación se debe exclusivamente al producto

del gen . El sistema forma parte de una familia menos conocida, la cual no presenta

homología con otras descritas hasta el momento. Este sistema, se encontró entre otros,

tanto en plásmidos aislados de cepas de enterococos resistentes a vancomicina (Moritz &

Hergenrother, 2007) como en el cromosoma de bacterias patógenas como S. pneumoniae

y E. coli B7A (Khoo et al., 2007, Van Melderen & Saavedra De Bast, 2009). Su actividad

es desconocida hasta el momento, y por eso es objeto de estudio en este trabajo.

2.1 Sistemas tipo I

El sistema tipo I mejor estudiado es el sistema hok/sok del plásmido R1 de Escherichia

coli. En este sistema TA, sok es un pequeño ARN antisentido que inhibe la traducción del

mensajero de la toxina, hok. Cuando sok se encuentra unido a hok, RNasa III rápidamente

Figura 2. Regiones Rep, SegA y SegB del plásmido pSM19035. Detalle de las regiones involucradas en

replicación y segregación estable del plásmido. La proteína 2, en gris, reprime la expresión del operón formado

por y del gen y del gen copS uniéndose a una serie de repeticiones (mostradas como flechas). A su

vez, la proteína CopS, reprime la expresión de repS, cuyo producto RepS es esencial para el inicio de la

replicación del plásmido. Desde el PIII,, se sintetiza un ARN anti-sentido (ARN III) que impide la transcripción de

repS.

P á g i n a | 4

degrada el complejo sok-hok, evitando así que el ARN mensajero de la toxina se traduzca.

El ARN antisentido sok tiene una vida media muy corta (30 s) y cuando el plásmido se

pierde, hok, con vida media más larga (20 min) queda libre y puede ser traducido (Gerdes

& Wagner, 2007). Como en el caso de hok, todas las toxinas de los sistemas tipo I

descritas hasta el momento son pequeñas e hidrofóbicas y generalmente causan daños en

la membranas bacterianas. Se han descrito sistemas tipo I no solo en plásmidos de bajo

número de copia sino también en el cromosoma de E. coli, dos de ellos inducibles por el

sistema SOS. Entre ellos el más importante de destacar es el sistema SymER. La

transcripción de la toxina SymE esta reprimida por LexA, y la traducción de los mensajeros

residuales de SymE están reprimidos por la unión a los mismos de SymR, un ARN

antisentido. La toxina SymE exhibe homología con MazF, pero a diferencia de ella, co-

purifica con ribosomas lo que sugiere que su mecanismo de acción es diferente al descrito

para MazF (Gerdes & Wagner, 2007)

2.2 Sistemas TA tipo II

Los sistemas de TA tipo II se encuentran ampliamente distribuidos en plásmidos y en los

cromosomas de una gran diversidad de bacterias y arqueas. Es importante destacar, que

muchas bacterias presentan múltiples copias de los sistemas TA en sus cromosomas, ya

sea de sistemas TA homólogos o con distintas dianas celulares. Por ej., Nitrosomas

europea tiene al menos 45 sistemas TA y Mycobacterium tuberculosis 38. Sin embargo,

hasta el momento no se han descrito sistemas TA en organismos intracelulares obligados,

por ej., en el patógeno humano Mycobacterium leprae no se han encontrado sistemas TA

completos. También es importante destacar que los organismos intracelulares obligados

carecen de genes relA/spoT intactos. Estos genes, y los de TA, no serían necesarios ya

que estos microorganismos se multiplican en un ambiente constante, por lo tanto no se

beneficiarían al tener sistemas de respuesta a estrés (Gerdes et al., 2005)

Los sistemas de TA tipo II se clasifican en 9 familias, teniendo en cuenta las

características estructurales de las toxinas que conforman el sistema, ya que la naturaleza

de las antitoxinas varía aún en sistemas homólogos. Estas familias contienen tanto

sistemas TA que se encontraron en plásmidos como en cromosomas. En la tabla 1 se

detallan brevemente las características más importantes de los representantes de cada

familia. Hasta el momento, los sistemas TA se pueden dividir en dos grupos, aquellos

cuyas toxinas inhiben la replicación y aquellos cuyas toxinas inhiben la traducción. Es

sorprendente que toxinas que inhiben el mismo proceso celular (traducción) lo pueden

hacen a través de mecanismos muy distintos. Por esto, a continuación se detallarán los

sistemas TA más relevantes para este trabajo, agrupándolos según su diana molecular.

3. Sistemas TA que inhiben la replicación

De los sistemas que inhiben la replicación, CcdAB del plásmido F fue el primero en

describirse como un sistema de muerte post-segregacional, aunque luego se lo encontró

en el cromosoma de E. coli (Wilbaux et al., 2007). Más tarde se caracterizó el sistema

ParDE de RK2 (Jiang et al., 2002). Estos dos sistemas son los únicos descritos hasta el

momento que inhiben la replicación del ADN. Sorprendentemente, sistemas TA con

toxinas que presentan homología estructural a CcdB (Kid y MazF), tienen como diana

celular la degradación de ARN (Kamphuis et al., 2007a).

P á g i n a | 5

Toxina Diana Proceso celular afectado

CcdB ADN girasa Replicación

RelE ARNm unido al ribosoma

Traducción

MazF/Kis ARNs Traducción

ParE ADN girasa Replicación

VapC ARNs Traducción

Doc Ribosoma Traducción

HipA EF-Tu Traducción

HigB ARNm unido al ribosoma

Traducción

Desconocida Desconocido

3.1 Sistema CcdAB del plásmido F

El primer sistema de TA que se identificó en plásmidos fue el sistema CcdAB del

plásmido F de E. coli. Se describierón dos proteínas, CcdB (101 aa) y CcdA (72 aa), en el

locus ccd (del inglés – couple cell division) como las encargadas de mantener el plásmido

en las células (Ogura & Hiraga, 1983). De esta forma, se demostró que CcdB codificaba

una toxina de vida media larga, y CcdA una antitoxina de vida media corta, que era

degrada por la proteasa LonA (Van Melderen et al., 1994). Así, si la célula se dividía y sus

hijas no recibían al menos una copia del plásmido, CcdA era degrada y CcdB, de vida

media larga, podía inducir la muerte post-segregacional de las células sin plásmido. Esta

inhibición post-segregacional del crecimiento estaba acompañada por la inducción del

sistema SOS, la reducción de la síntesis de ADN, la filamentación celular y la formación de

células anucleadas. Gracias a que se pudieron aislar mutantes resistentes a la actividad

tóxica de CcdB, se encontró que la subunidad A de la ADN girasa era la diana molecular

de la toxina. De hecho se aislaron dos mutantes (GyrA64, en donde la arginina 462 fue

cambiada por una cisteína, R462C, y tldC15, donde la glicina 214 cambió a glutamato,

G214Q) en dos laboratorios independientes que confirmaban que CcdB interaccionaba

con esta subunidad de la ADN girasa (Bernard & Couturier, 1992, Miki et al., 1992). Se

propuso que el mecanismo molecular de la actividad de la toxina es el de estabilizar el

complejo de cortado, en donde el ADN está covalentemente unido a la subunidad A de la

girasa, causando la rotura del ADN y, a diferencia de las quinolonas, este proceso es

dependiente de ATP. La interacción CcdB-GirA, pudo ser revertida in vitro si se agregaba

al complejo la antitoxina CcdA (Bahassi et al., 1999, Bernard et al., 1993, Gerdes, 2000,

Maki et al., 1992). Esta reversión, demostró que era probable que la muerte inducida por

este sistema TA sea un evento extremo debido a la sobreproducción de CcdB, sugiriendo

que en condiciones fisiológicas, CcdB pueda inhibir la replicación del ADN pero sin inducir

muerte post-segregacional (Gerdes, 2000).

4. Sistemas TA que inhiben la traducción

Las mayorías de las familias de sistemas TA inhiben la traducción a través de

mecanismos diferentes. Entre ellas se pueden destacar los sistemas TA: RelB, MazE, Kid,

Tabla 1. Familias de toxinas

P á g i n a | 6

YoeB, HipA, HigA y Doc. De estos sistemas, el sistema MazEF y RelBE son los mejores

caracterizados, y su papel en la célula es motivo de grandes debates. De todos estos

sistemas, solo se describirán en detalle los más relevantes para este trabajo.

4.1 Sistema RelBE

El sistema RelBE se encontró en el cromosoma de E. coli y fue el primero que permitió

incluir a los sistemas de TA como moduladores del crecimiento. Este sistema también se

encuentra ampliamente extendido en Gram positivas (G+), Gram negativas (G-) y

Arqueas, tanto en plásmidos como en sus cromosomas (Gerdes et al., 2005). RelE

codifica una toxina de vida media larga y RelB una antitoxina de vida media más corta. Se

demostró que este sistema cromosomal también es capaz de estabilizar plásmidos

(Gotfredsen & Gerdes, 1998). El sistema RelBE forma parte de un operón junto con RelF,

una toxina del tipo I (Hok). La inducción de RelF produce una rápida inhibición de la

proliferación, arresto de la respiración y un colapso del potencial de membrana. Sin

embargo no se conoce el papel fisiológico de RelF, ya que parece que su síntesis se

encuentra reprimida (Gerdes et al., 1986). El operón relBEF se descubrió como resultado

de la observación de que ciertas mutaciones puntuales en el gen relB resultaban en una

respuesta retrasada relajada (del inglés- delayed relax response). Cuando células

silvestres se sometían a una falta de aminoácidos, la síntesis de ARN caía rápidamente.

Esta caída estaba mediada por la producción de (p)ppGpp (producto de RelA). Sin

embargo se vio que en mutantes en el gen relA, la síntesis de ARN era estable durante

todo el tiempo que durase la situación de estrés nutricional. Por esto, este fenotipo se

conoció como respuesta relajada. Células de E. coli con mutaciones puntuales en el gen

relB, tardaban 10 min en tener una síntesis de ARN estable luego de inducir la falta de

aminoácidos, de ahí que la respuesta se llamó “retrasada”. Otra característica de estos

mutantes, es que una vez que se acababa el estrés nutricional, es decir, se volvían a

incorporar aminoácidos al medio, los mutantes en el gen relB reiniciaban el crecimiento de

manera muy lenta, sugiriendo que existía la acumulación de algún compuesto tóxico

durante ese periodo de carencia (Gotfredsen & Gerdes, 1998). Más tarde, se demostró

que la degradación de RelB estaba mediada por la proteasa LonA y se inducía en

respuesta al estrés nutricional (Christensen et al., 2001). De esta forma RelE quedaba

libre, inhibiendo el crecimiento celular y reduciendo el número de unidades formadoras de

colonias (UFC). Este efecto se producía por medio de la inhibición de la síntesis de

proteínas, cuando la toxina degradaba al ARN mensajero unido al sitio A del ribosoma. La

degradación del ARN es dependiente de secuencia, siendo la secuencia UAG y UAA

reconocidas con más eficiencia (Pedersen et al., 2003). Cuando al ARN mensajero es

cortado en el sitio A del ribosoma, se produce una parada de la traducción, “envenenando

al ribosoma”. Este ribosoma “envenenado” es luego rescatado por un ARN que es tanto

ARN de transferencia como ARN mensajero, el ARNtm. El ARNtm permite que la

traducción continúe, colocando una secuencia específica que será reconocida por las

proteasas celulares cuando el ribosoma encuentre el codón de parada y se libere la

proteína (Figura 3). De esta forma, las proteínas cuyos ARNm fueron cortados por RelE

serán degradadas por las proteasas celulares, generando así una fuente de aminoácidos

que serán usados para la biosíntesis de proteínas esenciales para la bacteria (Pedersen et

al., 2003)

P á g i n a | 7

Se demostró que la expresión de RelE no inducía muerte celular, sino un estado

bacteriostático que podía ser revertido por la síntesis de novo de la antitoxina RelB, y que

esto era aplicable a otros sistemas de TA tales como MazEF, generando una gran

controversia (Pedersen et al., 2002, Amitai et al., 2004). De esta manera, la síntesis de

RelB era capaz de revertir la inhibición de la traducción mediada por RelE tanto in vivo

como in vitro. Gracias a estos resultados, surge una nueva teoría, en donde los sistemas

de TA se activarían en respuesta a estrés, como por ejemplo por la carencia de

aminoácidos, e inducirían un estado bacteriostático permitiendo a las células sobrevivir

hasta que esta situación de estrés se revierta.

Nieto y colaboradores fueron los primeros en caracterizar un sistema de TA en el

cromosoma de una bacteria G+, Streptococus pnemuniae. Se encontraron dos locus

cuyos genes presentaban homología con el sistema RelBE de E. coli, pero solamente uno

de ellos, RelBE2Spn resultó ser tóxica en E. coli y en S. pnemuniae (Nieto, Pellicer et al.

2006). Este sistema se encontraba en el cromosoma de las dos cepas de S. pneumoniae

secuenciadas hasta ese momento; en la cepa no patogénica R6 y en la patogénica Tigr4,

abriendo una puerta en la generación de nuevos antimicrobianos. El efecto de la

sobreproducción de la toxina RelB2Spn en S. pneumoniae era más suave si se realizaba

en la cepa silvestre, sin embargo, si la toxina era sobreexpresada en el mutante

relBE2Spn, se observó un efecto mucho más fuerte en la disminución de las UFC (1000

veces) y este efecto se pudo revertir por la expresión de la antitoxina RelE2Spn (Nieto et

al., 2006). También se demostró que la expresión de la toxina RelBE2Spn en E. coli era

tan eficaz como en S. pneumoniae, demostrando que la actividad de RelE2Spn tiene un

amplio espectro de huésped (Nieto, et al. 2006).

4.3 Sistemas MazEF y Kid/Kis

Los sistemas MazEF y Kid/Kis presentan gran homología entre sí, considerándose

sistemas TA de la misma familia. Sin embargo, el sistema Kid/Kis se encontró por primera

vez en el locus parD del plasmido R1 de E. coli (Ruiz-Echevarria et al., 1991a, Ruiz-

Echevarria et al., 1991b). El sistema MazEF se describió por primera vez en el cromosoma

de E. coli, aunque también se encuentra en plásmidos de bajo número de copia. El

sistema CcdAB también posee homología estructural con estos Kid/Kis y MazEF, pero

como la toxina CcdB tiene una diana distinta se lo considera otra familia de TA.

Figura 3. Organización genética y componentes regulatorios del sistema RelBE. Se muestra el operón

RelBE, el sitio de corte en el ARNm mediado por la toxina RelE y el rescate del ribosoma mediado por el ARNtm,

luego de que el ARNm fue cortado. Adapatado de (Pedersen et al., 2002)

P á g i n a | 8

4.3.1 Sistema MazEF

El sistema MazEF, también conocido como ChpAIK, cuando se describió por primera vez

como un sistema TA se demostró que se inducia en la respuesta estricta (del inglés -

stringent response) cuando las células crecían en ausencia de algún aminoácido o fuente

de carbono (Aizenman et al., 1996). Aizenman y colaboradores demostraron que el

producto de la proteína RelA (ppGpp), reprimía la expresión del operón MazEF, activando

a la toxina MazF, e induciendo la muerte celular programada de la población bacteriana.

En el año 2006, Gross y colaboradores encontraron que MazG era un modulador del

sistema de muerte celular programada MazEF y que el gen mazG formaba parte del

operón mazEFG. MazG resultó ser la enzima encargada de degradar el ppGpp sintetizado

por RelA en respuesta a la falta de aminoácidos. Se demostró que el complejo MazEF era

capaz interaccionar con MazG, pero cuando la célula se encontraba en una condición de

estrés nutricional, RelA sintetizaba altas cantidades de ppGpp, inhibiendo la expresión del

promotor de mazEFG (Aizenman et al., 1996). Así, MazE era degrada por ClpPA; MazG y

MazF que tenían una vida media más larga quedaban libres y cada una realizaba su

función: MazF inhibía la síntesis de proteínas y MazG degradaba ppGpp y otros

nucleótidos (Gross et al., 2006). La inducción de MazF también se producía por otros tipos

de estrés celular como pueden ser la inhibición de la transcripción, traducción o

replicación, por el daño en el ADN producido por la falta de timina, así como también por el

tratamiento de células de E. coli con radiación UV y por estrés oxidativo (H2O2) (Hazan &

Engelberg-Kulka, 2004, Hazan et al., 2001, Sat et al., 2001, Sat et al., 2003). Como se

mencionó en el apartado anterior (sistema RelBE), el grupo de Ken Gerdes cuestionó el

modelo establecido para MazEF, y demostró que la inducción de MazF generaba un

estado bacteriostático que podía ser revertido por la expresión de MazE. Sin embargo, el

grupo de Hanna Engelberg-Kulka demostró unos años después que el efecto

bacteriostático inducido por la expresión de MazF solo duraba un determinado tiempo,

luego del cual las células entraban un “punto de no retorno”, induciendo la muerte celular

de las bacterias (Pedersen et al., 2002, Amitai et al., 2004, Engelberg-Kulka et al., 2006)

MazF inhibe la síntesis de proteínas degradando el ARN mensajero en la secuencia 5´-

NCA-3´, donde N puede ser A o U, ya sea ARN de cadena simple o doble y de manera

independiente del ribosoma (Munoz-Gomez et al., 2004, Zhang et al., 2003). Este es el

único sistema TA en el que se encontró que la muerte celular esta mediada por una

molécula señal, un péptido lineal de cinco aminoácidos con la secuencia NNWNN,

conocido como “factor de muerte extracelular” o EDF (del inglés- Extracellular Death

Factor). La producción de este péptido depende de la densidad de la población bacteriana,

de la respuesta al estrés y de dos proteínas: Zwf (glucosa-6-fosfato deshidrogenasa) y

ClpXP. Si este péptido no se produce, el sistema MazEF no es capaz de inducir la muerte

celular programada en E. coli (Kolodkin-Gal & Engelberg-Kulka, 2008, Kolodkin-Gal et al.,

2007). De hecho la adición del EDF en cultivos MazEF+ tratados con rifampicina, producía

un cambio en el efecto antibacteriano del antibiótico, que pasaba de ser bacteriostático a

ser bactericida. De este modo, se propuso que los antibióticos pueden producir muerte por

dos vías distintas, una dependiente de MazEF y la otra independiente de ella (ver Figura

4) (Kohanski et al., 2007, Kolodkin-Gal et al., 2008).

Recientemente se ha demostrado que la inducción de MazF en células de E. coli inhibe

la síntesis de una gran parte de las proteínas, pero que también produce un incremento en

la síntesis de algunas proteínas de bajo peso molecular. El aislamiento y posterior análisis

de las proteínas que se sintetizaban en presencia de MazF desveló que dependían del tipo

de estrés que se utilizaba para inducir el mecanismo de muerte celular. Si este mecanismo

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era independiente de especies reactivas de oxigeno o ROS (del inglés - Reactive Oxygen

Species), se sintetizaban solo proteínas de muerte. Sin embargo, si el mecanismo de

muerte era dependiente de ROS, las proteínas que se seguían sintetizando eran tanto

proteínas de muerte como de supervivencia (Figura 4). Se cree, que la síntesis selectiva

de estas proteínas cuando se induce el sistema MazEF permite la supervivencia de una

pequeña fracción de la población, que será la que luego retomará el crecimiento cuando la

situación de estrés desaparezca. A partir de estos resultados, se propone a MazF como un

regulador de la muerte celular programada, que activa distintos mecanismos de muerte

dependiendo del estrés en el que las células se encuentren. En este modelo, el sistema

MazEF se induciría y la gran mayoría de las células entrarían en muerte celular

programada, mientras una pequeña población sobreviviría y se alimentaria de los restos

de las bacterias muertas. Cuando la situación de estrés revierta, esta pequeña fracción

permitirá la supervivencia de la población (Amitai et al., 2009)

4.3.2 Sistema Kid/Kis.

El sistema Kid/Kis se encuentra codificado en los genes del locus parD del plásmido R1 de

E. coli. También se encuentra en el plásmido R100, pero con el nombre pem, dando lugar

a la toxina pemK y a la antitoxina pemI. Al igual que MazF, la toxina Kid es una

endoribonucleasa que degrada ARN mensajero independiente del ribosoma, inhibiendo la

traducción. Existe cierta controversia sobre el sitio de corte en el ARN mensajero mediado

por Kid. Algunos autores aseguran que PemK, corta la secuencia 5´-UA(C/A/U)-

3´preferentemente entre la U y la A y en cadena sencilla (Zhang et al., 2004). Otros

experimentos demostraron que Kid cortaba en el extremo 5´ de la adenosina en la

secuencia 5´-UA(C/A)-3´ también en cadena simple aunque se observó corte en cadena

doble y en el extremo 3´ de la base adenosina (Munoz-Gomez et al., 2005, Diago-Navarro

et al., 2009b), por último se describió que in vivo Kid cortaba la secuencia 5´-UUACU-3´

con alta afinidad, entre la U y la A en el mensajero policistrónico copB-repA del plásmido

R1, disminuyendo los niveles del represor CopB. Esta disminución en los niveles de CopB,

genera un aumento en la tasa RepA/CopB y en el número de copia de R1 (Pimentel et al.,

Figura 4. Mecanismo de muerte inducido

por antibióticos. El mecanismo puede ser

MazEF dependiente cuando se encuentra

como intermediario la molécula señal EDF

(vía de color), o independiente de ella si no

se expresa (vía color gris) . En el caso de que

el mecanismo de muerte esté mediado por

MazEF éste puede ser dependiente de ROS

(muerte celular de toda la población, flechas

color azul) o independiente de ROS (muerte

de una fracción de la población, flechas color

rojo). Adapatado de (Kolodkin-Gal et al.,

2008, Amitai et al., 2009)

P á g i n a | 10

2005). El mecanismo molecular del corte del ARN mensajero mediado por Kid es el mejor

estudiado hasta el momento. Se sabe que Kid al igual que la RNasa T1 es una RNasa que

cicla el producto de degradación. En el caso de Kid, se encontró que usando el substrato

mínimo 5´-AUACA- 3´ y el di-nucleótido UpA, se producía un intermediario de fosfato

cíclico 2´:3´ a un lado y un grupo 5´-OH libre por el otro. A partir de estos estudios, y

utilizando un fragmento de ARN no degradable, se pudo por primera vez crear un modelo

en donde se identificaron los aminoácido esenciales para el corte e interacción de Kid con

el ARN mensajero (Kamphuis et al., 2006)

Recientemente, se aislaron una serie de mutantes en el gen prfA de E. coli, que

mostraban una mayor sensibilidad a la acción de la toxina RelE. El gen prfA codifica el

factor de liberación de clase I o RFI (del inglés- Release Factor I), el cual permite la

liberación del ARN mensajero del ribosoma cuando se llega a un codón de parada. En

bacterias existen dos factores de liberación el RFI y el RFII. Como se mencionó

anteriormente, la toxina RelE interacciona con el ARN mensajero en el sitio A del ribosoma

y competiría con el RFI por el mismo sitio. Un mutante de RFI que es menos eficiente en la

terminación de los ARN mensajeros explica de manera lógica la mayor sensibilidad a la

toxina, ya que en condiciones silvestres RFI podría competir con RelE por el sitio A del

ribosoma. Sin embargo, este mutante también era más sensible frente a Kid. Este

resultado no era esperado ya que Kid degrada ARN de manera independiente del

ribosoma y su estructura terciaria es distinta a la de RelE, no pudiendo interaccionar con el

sitio A del ribosoma. Una posible explicación al fenotipo observado podía ser que una

actividad reducida de RFI genera una pausa del ARN mensajero que se está traduciendo

en el ribosoma cuando se llega al codón de parada. Esta pausa produce un posterior corte

en el ARN mensajero, por lo tanto un aumento en la toxicidad de Kid puede ser debido

simplemente al aumento en el corte de ARN causado por la pausa del ribosoma en

ausencia de un RFI funcional. Estos mecanismos aún no están claros ya que el papel de

RFI en la toxicidad mediada por Kid sigue siendo objeto de estudio (Diago-Navarro et al.,

2009b).

4.4 Sistema HipBA

Las células persistentes se describieron por primera vez en 1944 por Joseph Bigger,

quien notó que existía una población de células de Staphyloccocus que sobrevivían al

tratamiento con penicilina. Estas células, a diferencia de las resistentes, son variantes

fenotípicas de la cepa silvestre que cuando son re inoculadas producen el mismo número

de células persistentes. El número de células persistentes, varía según la fase de

crecimiento, pero puede llegar a alcanzar el 1% de la población en fase estacionaria o en

biofilms (Lewis, 2007). En los años 80s Harris Moyed y colaboradores buscaban

mutaciones de genes en E. coli que produjeran un aumento en el número de células

persistentes a ampicilina. De esta forma, encontraron que células que tenían un alelo

mutante aumentaban hasta 10.000 veces la frecuencia de células sobrevivientes, y por

esto lo llamaron alelo de híper persistencia o hipA7 (del inglés- high persistance). El

número de células persistentes en la cepa hipA7 también se veía aumentado cuando las

células se trataban con agentes que inhibían la replicación del ADN como ácido nalidíxico

o quinolonas y también como respuesta a la falta de timina. (Moyed & Bertrand, 1983,

Moyed & Broderick, 1986, Scherrer & Moyed, 1988). Intentos fallidos por clonar el gen

hipA llevaron a la conclusión de que su producto era tóxico y que solo se podía clonar en

presencia de una secuencia que se encontraba aguas arriba, el gen hipB. Así, se

descubrió que hipA formaba un operón con hipB y que eran parte de un genuino sistema

de TA, en donde HipB, una proteína de unión a ADN del tipo Cro/CI, contrarrestaba los

efectos tóxicos de HipA. Los primeros ensayos realizados en células de E. coli para

P á g i n a | 11

determinar cuál era la diana de HipA demostraron que ésta inhibía la síntesis del ARN y

proteínas, y como efecto secundario, la replicación del ADN. Esta inhibición en la síntesis

de macromoléculas inducía un estado bacteriostático sin producir muerte celular, que

podía ser revertido por la antitoxina HipB. También se demostró que la toxina silvestre era

capaz de aumentar el número de células persistentes (Korch & Hill, 2006, Black et al.,

1994, Black et al., 1991). En cuanto al fenotipo observado con el alelo hipA7, se encontró

que hipA tenía dos mutaciones puntuales en su secuencia: G22S y D291A. Estudios sobre

estos mutantes demostraron que una variante de HipA conteniendo solamente la

mutación G22S generaba una proteína no tóxica sin fenotipo híper persistente. Sin

embargo, una variante conteniendo solamente el cambio D291A rendía una proteína

tóxica, capaz de producir células persistentes. Además, la generación de células

persistentes de E. coli con la mutación hipA7 sólo era posible en presencia de los genes

relA y spoT, indicando que eran necesarios altos niveles de (p)ppGpp para producir dicho

estado (Korch et al., 2003)

Estudios posteriores en células de E. coli, explicaron que las células persistentes eran

células en un estado fisiológico distinto a los descritos hasta el momento, cuyo patrón de

expresión génica podía llegar a indicar que se trataba de células “durmientes”. Análisis de

“microarrys” mostraron que estas células tenían inducidos varios de los sistemas TA de E.

coli (RelBE, MazEF, dinJ/yafQ, etc). Además se demostró que la sobreexpresión de

toxinas producían un aumento en la tolerancia a antibióticos en E. coli (Keren et al., 2004,

Shah et al., 2006). Gracias a estos resultados se propuso que el papel de las toxinas en la

formación de células persistentes sería el de inactivar las dianas de los antibióticos, de

forma tal que estos ya no puedan corromperla (Figura 5). Sin embargo, los sistemas TA no

son los únicos involucrados en la tolerancia a antibióticos, ya que recientemente se ha

descrito que el producto de los genes glpD y plsB, así como también los niveles de

glicerol-3-fosfato estarían involucrados en la formación de células persistentes (Spoering

et al., 2006).

A partir del análisis de la secuencia primaria de HipA se encontró que esta toxina, a

diferencia de las que estaban descritas hasta el momento, presentaba homología con

proteínas quinasas, conteniendo todos los residuos catalíticos de estas, especialmente el

residuo Aspartato 309 (D309). Además, se demostró que HipA era capaz de

autofosforilarse in vitro en presencia de ATP, en el residuo serina 150 (S150). Si el

residuo D309 era remplazado por glutamina (Q), la autofosforilación del residuo S150 no

se producía y se perdía la capacidad de producir células tolerantes, implicando que la

actividad kinasa era esencial para la generación de este fenotipo (Correia et al., 2006).

Recientemente, se publicó que HipA es capaz de interaccionar con el factor de elongación

Figura 5. Modelo de formación de células persistentes. Variaciones estocásticas inducen la expresión de

la toxina, que se une a su diana y no deja que al antibiótico inhiba la proliferación celular. Adaptado de (Keren

et al., 2004)

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Tu o EF-Tu (del inglés- Elongation Factor Tu). EF-Tu es una de las proteínas más

abundantes de E. coli, pertenece a la superfamilia de guanosina trisfosfatasa y juega un

papel relevante en la traducción catalizando la unión del ARNt-aminoacil al ribosoma

(Schumacher et al., 2009). Ensayos in vitro demostraron que HipA era capaz de fosforilar

a EF-Tu, y que ésta fosforilación era estimulada por GDP, bloqueando de esta forma la

unión de EF-Tu al ARNt-aminoacil. Este resultado podría explicar la toxicidad de HipA

aunque no se descartan otras dianas dado que HipA afecta no sólo la traducción, sino

también la transcripción (Schumacher et al., 2009)

5. Sistemas con mecanismos de acción desconocidos

5.1 Sistemas y PezAT

Como se mencionó en la sección 1, la principal función de estabilidad del plásmido

pSM19035 se debe al sistema . Este sistema pertenece a una familia que no presenta

homología (ni de secuencia ni estructural) con ningún otro sistema TA. A partir de la

caracterización bioquímica de los componentes del sistema se sabe que el gen codifica

una antitoxina de 10 KDa (90 aminoácidos) que forma un dímero en solución, mientras

que el de , codifica una toxina de 32 kDa (287 aminoácidos).Las proteínas2 y forman

un heterotetrámero muy estable en solución, evitando así la actividad tóxica de (Figura

12A). Estudios in vivo realizados en el laboratorio revelaron que cuando la replicación,

traducción o transcripción se detienen en células de B. subtilis que contienen un plásmido

con el sistema , se observa una disminución en las unidades formadoras de colonias

(UFC). Esta caída en las UFC coincide con la degradación de 2, con una vida media de

≈18 min, y con la persistencia de cuya vida media supera los 60 min (Camacho et al.,

2002). Ensayos realizados por otro laboratorio en el mismo sistema indicaron que el efecto

de la toxina en bacterias G+ como B. subtilis era bacteriolítico, y que en células G- (E.

coli) este efecto era bacteriostático, produciendo filamentación celular sin inducción del

sistema SOS (Zielenkiewicz & Ceglowski, 2005). Aunque hasta el momento el mecanismo

por el cual la toxina induce la inhibición de la proliferación es desconocido, postulamos

que éste debe estar relacionado con la unión a nucleótido ya que presenta un dominio

de unión a ATP/GTP y en ese sitio se encuentra plegada como algunas quinasas y

fosfotransferasas (Meinhart et al., 2003). El sistema se encuentra ampliamente

distribuido en plásmidos que otorgan resistencia a vancomicina en enterococos o en las

cepas de S. aureus resistentes a metilicina y en otros plásmidos de G+ (Moritz &

Hergenrother, 2007, Sletvold et al., 2008). Sin embargo, también se ha identificado este

sistema en el cromosoma de otras bacterias, entre ellas de S. pneumoniae y E. coli (Khoo

et al., 2007, Van Melderen & Saavedra De Bast, 2009). El sistema cromosomal mejor

caracterizado es el de S. pneumoniae, y se lo conoce como PezAT. A diferencia del

sistema plasmídico, este sistema no está formado por 3 componentes, ya que la

regulación del operón la realiza la antitoxina PezA. Como se ha mencionado

anteriormente, es muy común que la naturaleza de la antitoxina varíe entre sistemas con

toxinas homólogas y el sistema PezAT es el mejor ejemplo. En este caso, la antitoxina

PezA es más grande que (158 aa, ver Figura 6), posee dominios de unión al ADN del

tipo HTH para regular la expresión del operón (ver próxima sección), y solo presenta una

débil homología con en el extremo carboxilo terminal (Khoo et al., 2007). Estudios in

vivo permitieron determinar que al igual que , PezT era capaz de inhibir la proliferación

celular en E. coli, y que esta inhibición era revertida por la presencia de la antitoxina PezA.

P á g i n a | 13

La toxina y PezT presentan mayor homología a nivel de secuencia primaria que las

antitoxinas. (Figura 7), aunque en este caso PezT es algo más pequeña, 253 aa vs 287 aa

de . Sin embargo, los residuos que están ubicados en lugares adyacentes al sitio de

unión de ATP/GTP se encuentran estructuralmente conservados, y mutaciones en ellos

rinden proteínas no tóxicas en ambos casos. El mecanismo molecular por el cual la toxina

o PezT inhiben la proliferación celular es aún desconocido.

6. Regulación de la expresión de los sistemas TA

6.1 Regulación de la expresión en sistemas de 2

componentes

La función principal de regulación de la expresión en la mayoría de los sistemas TA, es

llevada a cabo por las antitoxinas. Generalmente son las que presentan dominios de unión

Figura 6. Alineamiento de las secuencias primarias de las antitoxinas y PezA. Los residuos idénticos se

muestran con letras blancas y fondo rojo, los residuos conservados están recuadrados en azul y en letra rojas. El

alineamiento fue hecho con el servidor T-Coffee. La identidad entre y PezA sin tener en cuenta la región amino

terminal de PezA es del 21%.

Figura 7. Alineamiento de las secuencias primarias de las toxinas y PezT. Los residuos idénticos se

muestran con letras blancas y fondo rojo, los residuos conservados están recuadrados en azul y en letra rojas. El

alineamiento fue hecho con el servidor T-Coffee. La identidad entre y PezT es del 42%

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a ADN, ya sean del tipo HTH ó RHH. Sin embargo, la toxina también actúa como co-

represor transcripcional, de forma tal que cuando se consigue un nivel determinado de

toxina y antitoxina, el complejo inocuo es capaz de auto reprimir su expresión. Por ej., en

el sistema CcdAB, la regulación está mediada por la unión de CcdA2 a través de los

dominios RHH, que se encuentran en el extremo amino terminal, a una secuencia de ADN

palindrómica de 6 pb en la región promotora del operón ccd. La antitoxina CcdA une ADN

sóla ó cuando se encuentra acomplejada con CcdB, pero se demostró que in vivo es

necesaria la presencia del complejo TA para regular la expresión del operón (Tam & Kline,

1989). Esta represión, como también sucede con Kid/Kis, depende de la concentración de

toxina (Monti et al., 2007). El complejo (CcdB2CcdA2)n con una relación CcdB:CcdA=1, se

une al ADN y reprime la transcripción. Sin embargo, si la concentración de CcdB aumenta

y sobrepasa los niveles de CcdA, no se observa unión a la región palindrómica (Madl et

al., 2006).

El sistema RelBE actúa de manera similar a CcdAB, ya que la regulación de la

transcripción del operón está dada por la unión a la secuencia palindrómica de RelB y del

complejo RelBE. En este caso, la antitoxina RelB también se une a la región promotora a

través de su extremo amino terminal, gracias a un dominio RHH y RelE actúa como un co-

represor. (Gotfredsen & Gerdes, 1998, Overgaard et al., 2009). La antitoxina HipB es

capaz de unir cooperativamente las secuencias operadoras del promotor del operón hipBA

y de esta forma regular la expresión del sistema TA (Black, Irwin et al. 1994). Como en los

sistemas TA anteriormente nombrados, el complejo HipA-HipB une las regiones

operadoras con mayor afinidad. Gracias a que la estructura cristalina del complejo HipA-

HipB se obtuvo acomplejada a una secuencia operadora, se pudo ver que HipB forma un

dímero, que interacciona específicamente a través del surco mayor de ADN a través del

motivo HTH, induciendo una curvatura de 70º en el ADN (Schumacher et al., 2009)

PezA es un represor transcripcional de la familia Xre y Cro/CI que reconoce

específicamente una secuencia palindrómica imperfecta de 56 pb que se encuentra aguas

arriba del gen pezA, llamada PS. En presencia de PezT la represión mediada por PezA es

aún mayor, lo que demuestra que al igual que en otros sistemas TA, PezT actúa como un

co-represor transcripcional (Khoo et al., 2007, de la Hoz et al., 2000). A diferencia del

sistema PezAT, no se ha demostrado hasta el momento que el sistema esté

involucrado en la regulación de la expresión, siendo la proteína 2 la encargada de dicha

tarea (Khoo et al., 2007, de la Hoz et al., 2000). La función de la proteína 2 se describirá

a continuación.

6.2 Regulación de la expresión del sistema : función

y características de la proteína 2

La proteína (7,9 KDa), que forma un dímero en solución (2), pertenece a la familia de

proteínas que presentan dominio de unión a ADN del tipo RHH. Al igual que otros

miembros de esta familia, se une al ADN como un dímero a través de dos hojas . La

estructura cristalina de una variante de 2 a la que le faltan los primeros 19 aminoácidos

(219) unida a dos repeticiones en la dirección →→ o en la dirección →← permitió

entender mejor el mecanismo de unión de esta proteína a las secuencias promotoras. A

diferencia de otras proteínas de la misma familia (Arc2, CopG2, y MetJ2), 2 no produce

curvatura en el ADN cuando se une a éste. Además en los surcos mayores del ADN, se

forman interacciones específicas con los aminoácidos treonina 29 y arginina 31

localizados en la hoja Estas uniones permiten un reconocimiento específico y de alta

afinidad del ADN consenso (Weihofen et al., 2006). Las secuencias repetidas que la

proteína 2 reconoce específicamente se encuentran en las regiones promotoras de los

P á g i n a | 15

genes involucrados en el control del número de copia del plásmido (Pcop), en partición (P)

y en el sistema TA (P) (Figura 8A). La unión de 2 a estas secuencias promotoras

reprime la transcripción de los genes a través de un mecanismo desconocido pero que no

es mero impedimento estérico. La proteína 2 reconoce un bloque compuesto por dos

repeticiones directas y una inversa

de 7 pares de bases (5´- A/T ATCAC

A/T- 3´), representado como →→←, que se repite dos

(P) o tres veces (Pcop) más una repetición inversa adicional aguas abajo del último bloque

en el P o una directa aguas abajo del último bloque de Pcop. En cambio, en P hay siete

repeticiones directas y dos invertidas(de la Hoz et al., 2000, de la Hoz et al., 2004) (Figura

8B). Estudios in vivo realizados en B. subtilis utilizando el gen de la -galactosidasa como

reportero de la actividad promotora del P y P demostraron que la proteína 2 era

responsable de la represión transcripcional de todo el operón, mientras que el P es un

promotor muy débil cuya regulación no se ve afectada ni por la presencia del gen ni por

(de la Hoz et al., 2000).

Como se mencionó anteriormente, la proteína 2 forma junto con 2 un sistema de

partición activa. En estos sistemas, la proteína ParB (en este caso 2) reconoce las

regiones centroméricas o parS del ADN y junto con la proteína ParA (2), que actúa como

proteína motora, median la segregación del plásmido (Pratto et al., 2008). En el

pSM19035, se definieron 6 regiones centroméricas, y dos de ellas son el P. Por este

motivo y tratando de encontrar un link entre los mecanismos de estabilidad presentes en el

pSM19035, se estudiará el papel de la proteína 2 en la regulación de la expresión del

sistema TA a través de 2.

Figura 8. Regiones promotoras reconocidas por la proteína 2. En la parte (A) se muestran gráficamente las

posiciones de 3 de las 6 regiones promotoras reconocidas por la proteína 2. En la parte (B) se puede observa en

detalle la las Secuencias promotoras de los genes regulados por 2 en el plásmido pSM19035. Las cajas indican

las regiones -35 y-10 de Pcop, P y P. +1 indica el sitio donde se inicia la transcripción. Las repeticiones de 7 pb y sus orientaciones relativas se muestran con flechas debajo de las secuencias. La denominación de parS1, parS2 y

parS3 hacen referencia a la utilización de estos sitios de unión de 2 como sitios centroméricos del sistema de partición activa del plásmido pSM19035

P á g i n a | 16

7. Estructuras cristalinas de los sistemas TA: análisis y diseño de nuevos antimicrobianos

Como se mencionó anteriormente los sistemas TA se encuentran presentes en plásmidos

aislados de bacterias resistentes a antibióticos. Estos plásmidos presentan varios de los

sistemas TA más representativos. Por esta razón, se podrían buscar inhibidores de la

interacción toxina-antitoxina de forma tal que la toxina quede libre y pueda detener el

crecimiento microbiano. Esto permitirá desarrollar nuevos antimicrobianos que inhibirán el

crecimiento de las bacterias resistentes, y aunque la frecuencia de mutación de la diana o

de la toxina sería muy baja, puede ayudar a la desestabilización del plásmido (ya que se

perderá la presión de selección) (Williams & Hergenrother, 2008). Por este motivo, es

importante estudiar las características estructurales de los complejos TA, de manera que

se pueda conocer el mecanismo de interacción de la antitoxina con la toxina, y se puedan

identificar los aminoácidos esenciales para la estabilidad del complejo. Así se podría

diseñar una molécula capaz de interaccionar con la antitoxina de forma tal que deje libre a

la toxina para que pueda ejecutar su acción. Por esto, a continuación se describirán las

estructuras de los sistemas TA más relevantes para este trabajo

7.1 Estructura cristalina del complejo CcdAB

La estructura cristalina de CcdB fue la primera de todos los sistemas TA en conocerse.

En la Figura 9 se puede ver que tiene una gran homología con Kid y MazF a pesar de que

las dianas son completamente distintas. Al igual que Kid y MazF, CcdB está compuesta en

el extremo amino terminal por 5 láminas antiparalelas y una hélice de 13 residuos en el

extremo carboxilo terminal que están unidas entre sí por 3 hojas anti paralelas. Se cree

que el sitio de unión de CcdA está entre las hojas 3 y 5. La estructura de CcdA se

determinó por medio de resonancia magnética nuclear y carece de similitud con las

antitoxinas Kis y MazE. La antitoxina CcdA pertenece a la familia de proteínas de unión a

ADN por medio de dominios RHH. Sin embargo, al igual que en Kis y MazE, es el

carboxilo terminal de la antitoxina el que interacciona con la toxina, formando un

heterohexámero (CcdB2CcdA2CcdB2) Según los estudios de RMN, el extremo carboxilo

terminal de CcdA carece de estructura cuando no se encuentra acomplejada con CcdB,

explicando su degradación por medio de la proteasa LonA.

La estructura cristalina de CcdB unida a un fragmento de la subunidad A de la ADN

girasa (GirA14) desveló el mecanismo de acción de la toxina. Gracias a esta estructura, se

pudo comprender por qué el mutante R462 era capaz de resistir al efecto tóxico de CcdB.

Este residuo interacciona con los residuos W99, N95 y N92 de CcdB y se encuentra en el

centro de la unión del complejo CcdB-GirA14. A partir del análisis de la estructura de

GirA14 unida a CcdB y GirA14 libre se pudo determinar que cuando CcdB interacciona

con GirA en ausencia de ADN, ésta queda congelada en un estado abierto e incapaz de

unir ADN. Sin embargo, si CcdB interacciona con GirA luego de que se forme el complejo

de cortado (cuando el segmento G del ADN ya ha sido cortado y está unido

covalentemente al complejo GirA-GirB) el segmento T ya no puede pasar a través de la

puerta G debido a que CcdB congela a GirA en la conformación abierta y su presencia

“bloquea” la salida. Así, se forma un complejo ternario Girasa:ADN:CcdB, que genera una

barrera para la replicación del ADN y la transcripción. Este complejo solo puede

desbloquearse por la presencia de CcdA, quien al interaccionar con CcdB, libera a la

girasa para que pueda seguir funcionando (Dao-Thi et al., 2005)

P á g i n a | 17

7.2 Estructura cristalina del complejo RelBE

La primer estructura cristalina de RelBE se obtuvo del sistema RelBE de la arquea

Pyrococcus horikoshii (Figura 10). Se demostró que el sistema RelBE de P. horikoshii

(RelBE) es funcional en E. coli. La estructura de RelBE es diferente a la de MazEF y

Kid/Kis, lo que podría explicar porque la toxina RelE corta el ARN de manera dependiente

del ribosoma, mientras que MazF y Kid lo hacen de manera independiente. La antitoxina

RelB presenta una estructura definida cuando está unida a RelE, pero no parece tener

estructura terciaria cuando está libre, lo que explicaría por qué es rápidamente degrada

por la proteasa LonA. Una vez acomplejada, RelB se une alrededor de la molécula de

RelE. De esta forma, RelB y RelE interaccionan formando un heterotetrámero (RelB-

RelE)2. Se identificó el residuo R85 de RelE como el más importante para la actividad

ribonucleasa de la toxina, así como también se demostró que mutaciones en los residuos

R40, L48, R58 y R65 disminuían la toxicidad de RelE. RelB no interacciona directamente

con los aminoácidos involucrados en la actividad nucleasa de RelE, lo que supone que el

mecanismo de inhibición de la actividad de la toxina mediado por RelB, esta dado por un

cambio en la conformación de la proteína RelE cuando se acompleja con RelB, de forma

tal que no pueda acceder al sitio A del ribosoma para degradar el ARN mensajero.

7.3 Estructura cristalina del complejo Kid-Kis y MazEF

Como se mencionó anteriormente los sistemas Kid/Kis y MazEF presentan una alta

homología estructural. De hecho se demostró que la MazE era capaz de inhibir hasta

cierto punto la toxicidad de Kid (Kamphuis et al., 2007b). La estructura cristalina de MazEF

fue la primera en determinarse, en donde se demostró que el complejo formado por la

toxina y la antitoxina era un heterohexámero, en donde un dímero de la antitoxina

interacciona a través del carboxilo terminal con un dímero de toxina (Figura 9).

Figura 9. Estructuras cristalinas de las toxinas CcdB, Kid y del complejo inactivo MazEF. Se muestran las estructuras de un dímero de CcdB y un dímero de Kid. En el complejo MazEF, los dímeros de toxina MazF están representados de color azul y celeste, mientras que los dímeros de la antitoxina MazE esta representados de color amarillo oscuro y claro.

P á g i n a | 18

El análisis de la estructura cristalina de Kid y de MazF acomplejada con MazE, demostró

que las antitoxinas producen un cambio en la conformación de la toxina cuando se unen a

ellas. Además, el extremo carboxilo de la antitoxina estaría desordenado en ausencia de la

toxina, siendo susceptible de degradación por la proteasa especifica (Kamada et al., 2003,

Kamphuis et al., 2007a). Tiempo después, por medio de RMN se estudió la estructura

terciaria del complejo Kid/Kis, y se observo que los sitios de interacción entre Kis y Kid

eran similares a los de MazF con MazE, confirmando que existía gran similitud estructural

entre estos complejos. Las proteínas Kid y Kis forman distintos complejos dependiendo de

la relación molar en la que se encuentren. Por ej, para relaciones Kid:Kis iguales o

superiores a 1:1, tal y como se encuentra in vivo, se forman varios complejos; desde un

tetrámero Kis2-Kid2 hasta un decámero Kis2-Kid2-Kis2-Kid2-Kis2. Sin embargo, cuando Kid

se encuentra en exceso, como cuando se pierde el plásmido en la célula, la especie más

abundante es el heterohexámero Kid2-Kis2-Kid2 (Kamphuis et al., 2007a). La forma

dimérica de Kid es la activa, ya que necesita residuos que se encuentran en los dos

monómeros para unir una molécula de ARN mensajero. Esto explica por qué el residuo

R85 era importante para la toxicidad, ya que es el encargado de formar un puente salino

con E18 conectando los dos monómeros de Kid y generando el sitio activo de la toxina. El

dímero de Kid posee dos sitios de unión a ARN, aunque sólo es capaz de unir una

molécula de ARN por dímero. Cuando Kis se une a Kid, uno de los sitios de unión de Kid

deja de estar accesible al ARN, y es ocupado por el extremo carboxilo terminal de Kis.

(Kamphuis et al., 2006). Estudios de modelado de Kid unido a un pequeño substrato de

ARN y de mutagénesis dirigida han confirmado que los residuos D75, R73 y H17 son los

residuos catalíticos de Kid, siendo responsables del corte del ARN. También se ha

determinado que el residuo H17 estabiliza el complejo Kid2-ARN, y el corte específico de

secuencia tiene lugar debido a las interacciones de los residuos T46 (altamente

conservado entre otras toxinas del mismo tipo), S47, A55, F57, T69, V71 y R73 con los

nucleótidos UA(A/C). Sin embargo a pesar de la gran homología con MazF, sólo el residuo

catalítico D75 está conservado (en MazF es D76). De manera contraria, y explicando la

diferencia en las dianas celulares, la toxina CcdB carece de muchos de los residuos

involucrados en el corte del ARN. (Kamphuis et al., 2006, Diago-Navarro et al., 2009a).

7.4 Estructura Cristalina de HipBA

Figura 10. Estructura cristalina del complejo

RelBE. En azul y verde se muestran dos

monómeros de RelE, mientras que en naranja y

verde oscuro 2 monómeros de RelB. Adapatado de

(Takagi et al., 2005)

P á g i n a | 19

Recientemente se ha obtenido la estructura cristalina de HipA-ATP y de su forma Apo

(Schumacher et al., 2009), a partir de la cristalización de un mutante de HipA que puede

ser sobre-expresado en ausencia de HipB, el mutante HipAD309Q. También se logró

obtener la estructura cristalina del complejo HipA-HipB unido a la secuencia operadora

que reconoce HipB. La estructura de HipA demuestra que tiene un plegamiento globular,

con 15 láminas y 15 hélices. La proteína HipA se divide en un dominio amino terminal

compuesto por láminas y hélices mientras que el carboxilo terminal sólo tiene

hélices. La zona entre los residuos 185-195 no se encuentra en el cristal, y corresponde

al lazo o loop de activación de las quinasas. La comparación de la estructura HipA con

otras estructuras conocidas demostró que su plegamiento es similar al de la ciclina A

quinasa CDK2, especialmente en el carboxilo terminal donde residen los aminoácidos

catalíticos de la quinasa CDK2. De la comparación de HipA-ATP y apoHipA se pudo ver

que la unión al nucleótido genera una pequeña rotación de 4º tanto del extremo amino

como del extremo carboxilo terminal, pero por homología con otras kinasas, se cree que

una vez unida a su diana se producirá un cambio mayor en la conformación. Dos

moléculas de HipA interaccionan a cada lado del dímero de HipB, a modo de sándwich

(Figura 11). A diferencia de otros sistemas TA como RelBE o Kid/Kis, el extremo amino

terminal de HipA interacciona con un monómero de HipB, mientras que el extremo

carboxilo terminal de HipA interacciona con el otro monómero (Figura 11). De esta forma,

HipB no ocluye el sitio activo de HipA, pero esta interacción la congela en una

conformación abierta, que es inactiva. Si se comparan las estructuras de HipA-ATP y

HipA-HipB, no se visualizan grandes cambios en la conformación de la toxina indicando

que HipA sería capaz de unir ATP aunque esté acomplejada a HipB. (Schumacher et al.,

2009)

7.5 Estructura cristalina del complejo y PezAT

La estructura cristalina del complejo fue la primera estructura que se conoció de un

sistema de TA perteneciente a G+. A partir de ella, se determino que y interaccionan

formando un heterotetrámero, en donde un dímero de se encuentra entre dos moléculas

de (2, Figura 12A). El análisis de la secuencia primaria de indicó que presentaba un

dominio del tipo Walker A, que es típico de proteínas que unen ATP/GTP, sugiriendo que

este dominio podría estar involucrado en la actividad de . La estructura cristalina de en

el complejo 2 demostró que el extremo amino terminal de 2 interaccionaba con ,

ocupando el sitio de unión del nucleótido, y evitando así la entrada del mismo. La

comparación de estructuras terciarias indicó que en el sitio activo la toxina adquiría el

mismo plegamiento que las quinasas de nucleósido monofosfato (quinasas NMP) y que la

Figura 11. Estructura cristalina

del complejo HipBA

interaccionando con ADN. En

amarillo se muestran los

monómeros de HipA, con la

molecula de ATP modelada y en

celeste el dimero de HipB

interaccionando con el ADN (en

rojo). Adaptado de (Schumacher et

al., 2009)

P á g i n a | 20

cloranfenicol fosfotranserasa. Además, mutaciones realizadas en los residuos que forman

parte del dominio de unión a ATP/GTP (K46A, R158A, D68T y R171S) generaron

variantes no tóxicas de sugiriendo que la actividad fosfotransferasa era la responsable

de la toxicidad de (Meinhart et al., 2003).

Años después se obtuvo la estructura cristalina del complejo PezAT, y se confirmó la

gran homología entre este sistema y . El complejo PezAT también es un heterotetrámero

donde un dímero de PezA se encuentra entre dos moléculas de PezT (PezTPezA2PezT,

Figura 12B). A pesar de que PezA2 y 2presentan una homología a nivel de secuencia

solo en el extremo carboxilo terminal, la forma de interaccionar con la toxina se encuentra

conservada. La interacción de PezA2 con PezT es similar a la de 2 con , en donde la

hélice 1 de PezA interacciona con la zona de unión a nucleótido de PezT, al igual que lo

hace 2 con , evitando que el nucleótido entre en el sitio de unión. Sin embargo, es

importante destacar que los aminoácidos involucrados en la interacción toxina-antitoxina

no están conservados, excepto aquellos que juagan un rol importante en la inactivación de

PezT ó . En cuanto a las regiones amino terminales de PezA, no se ha podido determinar

la estructura exacta, pero la densidad de electrones indicó que los dominios de unión a

ADN parecen ser flexibles y no interaccionan ni con PezT ni entre ellas (Khoo et al., 2007).

Figura 12. Comparación de la estructura cristalina de los complejos y PezAT. En (A) se muestra el heterotetrámero

compuesto por dos moléculas de (en rojo y verde) y un dimero de (amarillo). En (B) se muestra el heterotetrámero

compuesto por dos molecluas de PezT (beige y rojo) y un dímero de PezA (celeste)

Objetivos

O b j e t i v o s | 21

Objetivos

El propósito de esta tesis doctoral, fue el estudio del sistema toxina antitoxina () del

plásmido pSM19035 y el análisis detallado de sus componentes, las proteínas 2, y . Para

comprender mejor los mecanismos de estabilidad del plásmido y la función de la toxina se

propusieron los siguientes objetivos:

1. Caracterización de la interrelación entre los sistemas de partición y de muerte post-

segregacional. Se determinará el papel de la proteína 2 en la regulación de la transcripción del

operón .

2. Estudio del efecto tóxico de in vivo

3. Análisis del rol de sobre la actividad de .

4. Caracterización del proceso por el cual la toxina inhibe la proliferación celular

5. Comparación de la inducción de bacterioestasis con la de persistencia a antibióticos

6. Estudio de la tolerancia a la toxina y de la persistencia a antibióticos

7. Caracterización del sistema como una nueva diana antimicrobiana.

O b j e t i v o s | 22

Materiales y

Métodos

P á g i n a | 23

1. Materiales

1.1 Cepas

Las cepas utilizadas y construidas en este trabajo se detallan en la siguiente tabla:

CEPA GENOTIPO UTILIZACIÓN

E. coli

XL1 Blue

recA1 endA1 gyrA96 thi-1

hsdR17 supE44 relA1 lac [F' proAB

lacIqZ∆M15 Tn10 (Tet)] (Stratagene)

Células para construcción y

mantenimiento de plásmidos.

E. coli

CC118 (ara leu) araD lacX74 galE galK phoA thi-1 rpsE spoB argE recA1

Ensayos in vivo para estudiar la

toxicidad de E. coli

BL21(DE3)

pLysS B F- dcm ompT hsdS (rB- mB-)

gal (DE3) [pLysS Cat] (Stratagene)

Sobreproducción de las proteínas:

2, , 219,

-His6, 2D60A-His6

B. subtilis

BG214

trpC2, metB5, amyE, sigB37, xre1,

attSP,

attICEBs1

Cepa silvestre

B. subtilis

BG687

amyE:PxylA trpC2, metB5, sigB37, xre1,

attSP,

attICEBs1

Ensayos de proteomica para

estudiar la toxicidad de

Y83C(cepa control)

B. subtilis

BG689

amyE:PxylA Y83C, trpC2, metB5,

sigB37, xre1, attSP ,

attICEBs1


toxicidad de Y83C

B. subtilis

BG873

amyE:PxylA, trpC2, sigB37, xre1, attSP,

attICEBs1

Ensayos de proteomica para

estudiar la toxicidad de Y83C

B. subtilis

BG871

amyE:PxylA Y83C, trpC2, sigB37, xre1,

attSP,

attICEBs1


toxicidad de Y83C(cepa

control)

B. subtilis

BG1125

amyE:PHyperspank trpC2, metB5,

sigB37, xre1, attSP,

attICEBs1


toxicidad de

B. subtilis

BG1127

amyE:PHyperspank , trpC2, metB5,

sigB37, xre1, attSP,

attICEBs1


toxicidad de (cepa control)

Tabla 2. Cepas

1.2. Reactivos y materiales

En la tabla 3 se muestran los reactivos y materiales utilizados:

PRODUCTO CASA COMERCIAL

32

P- dATP Amersham Bioscience

Sepharosa G-50, Amersham Pharmacia Biotech

Columna de cromatografía Micro Bio-Spin Bio Rad

DNasa I Boheringer Mannheim

IPTG, rifampicina Calbiochem

SDS, Sulfato amónico ICN

Ascorbato Sódico. Aldrich

P á g i n a | 24

Metanol, Hidrolizado de caseína Fluka

Enzimas de restricción, fragmento klenow de ADN polimerasa I MBI Fermentas

Acetato sódico trihidrato, Ac. bórico, Ac. Clorhídrico, Ac. Fórmico,

Ac. Tricloracético, Alcohol Isoamílico, Azul de Coomassie,

Cloroformo, Cloruro magnésico hexahidratado, Etanol Absoluto,

Imidazol, Isopropanol, Hidróxido de Sodio, Hierro (II) amonio-

sulfato hexahidratado, Dimetilsulfóxido, Isopropanol, L-metionina,

Parafina, Titriplex (EDTA), Tritón-X 100, Urea, 2 nirofenil--

galactopiranósido, PEI

Merck

Filtros de 0.05 µm (tipo VM), 0.45 µm (tipo HAWP), 0.22 µm (tipo

Millex-GS)

Millipore

Glicerol MP Biomedicals

Enzimas de restricción, polinucleótido kinasa (PNK), T4 ligasa New England Biolabs

Acido Acético Glacial, Vaselina filante Panreac

Agarosa, Agar bacteriológico, extracto de levadura Pronadisa

Ni-NTA agarosa Qiagen

FastStart Taq DNA polymerase, RNasa A pancreática, DAPI Roche

Acrilamida, bisacrilamida Serva

Antibioticos, Bromuro de Etidio, Cloranfenicol, Glutaraldehído,

Lisozima, Xylene cianol, Thiourea, DSS,

Sigma

Fosfatasa alcalina (SAP), LB, Tris Ultrapuro UBS

Fosfocelulosa. Whatman

Tabla 3. Materiales y reactivos utilizados

2. Métodos

2.1. Manipulación de células 2.1.1. Obtención de células competentes.

Las células competentes en E. coli se obtuvieron creciéndolas en LB a 37ºC, y cuando

llegan a fase logarímica (DO560=0,4), se centrifugan y se tratan sucesivamente con CaCl2

0,05M, el CaCl2 hace permeable las paredes de las células, de modo que el ADN presente

en el medio, puede entrar en dichas células. Las bacterias competentes se pueden

conservar a –80ºC con glicerol al 15%. Todo el proceso debe desarrollarse a 4ºC. La

eficiencia obtenida suele ser de 106

células transformadas/g de ADN plasmídico

(Hanahan, 1983).

B. subtilis tiene competencia natural bajo determinadas condiciones de desarrollo y

nutricionales. Para obtener células competentes lo que se hace es inocular una colonia en

el medio GM1, se deja crecer durante toda la noche a 30ºC, sin agitación, a la mañana

siguiente se hace un dilución de forma que el cultivo quede a DO560=0,04, se pone a

crecer a 37ºC en agitación y una vez hayan pasado 90 min desde que el cultivo entró en

fase estacionaria, se añade el 15% de glicerol y se congelan rápidamente a -80ºC (Bott &

Wilson, 1968).

Medio GM1: Sbase 1X, glucosa 0,5%, extracto de levadura 0,1%, caseina hidroxilada

0,02%, MgSO4 0,8 mM, D/L triptofano 0.025% y L-Metionina 0,02%.

2.1.2 Transformación Bacteriana.

P á g i n a | 25

La transformación de E. coli se desarrolló siguiendo el método de choque térmico

(Hanahan, 1983). Se mezclan 200 µl de células competentes con 10-100 ng del plásmido

y se incuba a 4 ºC durante 30 min. Después se da un choque térmico a 42 ºC durante 1

min para que los poros de la membrana se abran y el ADN sea capaz de entrar al citosol.

Seguidamente se mantienen las células en hielo durante 2 min para que la membrana se

restablezca. Se plaquea en LB-Agar con el antibiótico seleccionador.

Para transformar B. subtilis se hace una dilución 1:10 de las células competentes en el

medio GM2, se dejan 1h a 37ºC en agitación, en este momento las células se encuentran

en el pico de competencia, se mezclan 200 l de las células con 100-200 ng del ADN y se

dejan 30 min a 37ºC, pasado este tiempo son tranferidas a médio LB-agar con el

antibiótico correspondiente (Bott & Wilson, 1968).

Medio GM2: GM1 más MgSO4 3,3 mM y CaCl2 0,5 mM

2.2. Manipulación del ADN 2.2.1. Purificación y cuantificación del ADN

El ADNcd plasmídico fue purificado por lisis alcalina (Birnboim & Doly, 1979) o bien

utilizando el kit para purificación de ADN de Qiagen.

La concentración del ADN fue cuantificada por absorbancia a 260 nm y su pureza

relacionando la absorbancia a 260 nm y 280 nm.

2.2.2. Plásmidos

En la tabla 4 se detallan los plásmidos utilizados y/o construidos en este trabajo.

NOMBRE DERIVADO DE DESCRIPCIÓN

pT712 Posee el promotor de 10 del fago T7 (GIBCO-

BRL)

pET21b Posee el promotor de 10 del fago T7 e introduce

una secuencia para 6 histidinas en el extremo 3´

del gen (GIBCO-BRL)

pDR111 Vector integrativo para B. subtilis, posee el

promotor Hyperspank controlado por IPTG

(Laboratorio de David Rudner)

pHP13 Vector lanzadera para E. coli y B. subtilis

pLex Posee el promotor Lac controlado por IPTG y un

origen de bajo número de copia en E. coli

(Invitrogen)

pCB30 pUC19 Secuencia promotora del gen orf, en orientación

HindIII-EcoRI. (de la Hoz y col. 2000)

pT712- pT712 Plásmido para sobre producir la proteína (de la

Hoz y col. 2000)

pT712- pT712 Plásmido para sobre producir la proteína

(Pratto et al., 2008)

pCB746 pET21b Plásmido para sobre producir la proteína is6


pCB755 pET21b Plásmido para sobreproducir la proteína D60Ahis6


P á g i n a | 26

pCB297 pLEX15A Lleva el gen bajo un promotor inducible por IPTG

(Lioy et al., 2006)

pCB298 pHP13 Lleva el promotor del gen , el gen y el gen

(Lioy et al., 2006)

pBT346 pHP13 Lleva los genes: orf, orf, orf, orf

pCB539 pHP13 Lleva el gen y el gen gfp, bajo el control del

promotor de cloramfenicol (Lioy et al., 2006)

pCB613 pHP13 Lleva el promotor del gen , el gen :Luc y el gen

z:gfp (Lioy et al., 2009)

pCB617 pHP13 Lleva el promotor del gen cloranfenicol y el gen

:gfp (Lioy et al., 2009)


D18AK46A:gfp (Lioy et al., 2009)

pCB635 pFUS2 Lleva el promotor de arabinosa y el gen


E22AK46A:gfp (Lioy et al., 2009)

pCB799 pHP13 Lleva el gen bajo el promotor de xilosa (este

trabajo)

Tabla 4. Plásmidos

2.2.3. Marcaje radiactivo de fragmentos de ADN. 2.2.3.1. Marcaje de fragmentos con extremos 5´ protuberantes

Los fragmentos de ADN, con uno de sus extremos 5´ protuberantes, fueron marcados

mediante la incubación del ADN con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E.

coli en presencia de 250de dCTP, dGTP, dTTP y [P]dATP, durante 15 min a

temperatura ambiente. El resto de nucleótidos no incorporados se eliminaron de la

muestra filtrándola a través de una columna de Sephadex G-50.

2.2.3.2. Obtención y purificación de los fragmentos de ADN utilizados

para los ensayos de interacción proteína-ADN.

Se digiere el plásmido pCB30 con las enzimas de restricción HindIII y KpnI para

obtener el fragmento de ADN con la región promotora del gen con el extremo 5´

protuberante. La digestión se carga, en un gel de agarosa al 0,8% y la banda de ADN, que

tiene un tamaño de 423 pb, se purifica y posteriormente se marca radiactivamente con

[P]dATP como se describbió en el apartado anterior.

2.2.4. Mutagénesis dirigida.

Para realizar las mutaciones puntuales (D18A y E22A) se utilizó un sistema de doble

amplificación por PCR:

- en la primera PCR se utilizó como molde la secuencia del gen en el que se quería

introducir la mutación puntual. Se hicieron dos PCR, una utilizando como cebadores un

oligonucleótido externo que anilla aguas arriba del gen y otro interno que contiene la

mutación que se desea. Para la segunda PCR se utiliza como cebadores el

P á g i n a | 27

oligonucleótido interno complementario al que tenía la mutación y otro externo que anilla

aguas abajo del gen.

- en la segunda PCR se utiliza como molde los fragmentos de ADN obtenidos con la

primera PCR y como cebadores a los oligonucleótidos externos. De esta manera se

obtuvo un gen que llevaba la mutación puntual.

2.3. Obtención y estudio de proteínas

2.3.1. Sobreproducción de proteínas.

Los genes que codifican las proteínas -His6)2 y (D60A-His6)2 se clonaron

en pT712 o pET21b (GIBCO-BRL) bajo la expresión del promotor 10 del fago T7 para su

sobreproducción. Este promotor es únicamente reconocido por la ARN polimerasa del

fago. De esta manera se pueden sobre-expresar genes y por lo tanto sobre producir las

proteínas codificadas de manera muy efectiva. (Studier y col, 1990).

El hospedador empleado para la transformación de estos plásmidos fue la estirpe E.

coli BL21(DE3)[pLysS]. El bacteriófago DE3, que es un derivado del fago que posee el

gen lacI, el promotor lacUV5, y el gen de la ARN polimerasa de T7 está integrado en el

genoma de BL21. La cepa BL21 es un derivado de E. coli que carece de la proteasa

LonA. En la cepa BL21(DE3) el gen de la ARN polimerasa se expresa a partir del promotor

lacUV5, que es inducible por IPTG (1 mM), que se añade al cultivo cuando este se

encuentra a una DO560=0,6 . Así, mediante la adición de IPTG, que se deja induciendo la

síntesis de ARN polimerasa de T7 durante 20 min y la posterior adición e incubación

durante 2 hr con Rifampicina (200 g/ml), se inhibe la transcripción de la ARN polimerasa

celular, pero no la de T7, de esta manera pueden expresarse de forma eficiente los genes

que se hayan clonado en pT712 o pET21b.

Aquellos genes cuyos productos son tóxicos para la célula no pueden ser expresados

en BL21(DE3), porque el nivel basal de la actividad de la ARN polimerasa puede promover

la transcripción en la célula no inducida. Un modo de reducir este nivel basal es

introduciendo un plásmido codificante del gen 10 de T7 (pLysS). El producto del gen 10 de

T7 secuestra selectivamente a la ARN polimerasa de T7. El plásmido pLysS lleva el gen de

resistencia a cloranfenicol (Studier y col, 1990).

2.3.2. Purificación de proteínas.

2.3.2.1. Purificación de las proteínas

Una vez obtenida masa celular en la cual las distintas proteínas habían sido sobre

producidas según el sistema, ya descrito, del promotor 10 del fago T7, las células fueron

centrifugadas durante 15 min a 9.000 rpm y posteriormente resuspendidas en el tampón A

(fosfato sódico pH 7,5 50 mM, glicerol 10%) con 100 mM de NaCl, en una proporción de 5

ml/g de biomasa húmeda. Una vez obtenida una suspensión homogénea se lisan con la

prensa de French a 1500 psi. Las células lisadas se centrifugaron, a 18000 rpm y a 4º C,

en rotor Sorvall GSA. Todas las variantes de son solubles.

Se midió la absorbancia a 260 nm del sobrenadante de la lisis y a continuación se

añadió PEI hasta una concentración final de 0,25%, cuando DO260=120, y se centrifugó a

13000 rpm, a 40

C, durante 15 min en rotor Sorvall SS-34; las proteínas de interés

permanecen en el sobrenadante.

P á g i n a | 28

Se hizo una precipitación al 50% de sulfato amónico (SA) donde precipitan las

proteínas. Se diluyó el precipitado de SA para obtener una solución con fuerza iónica

correspondiente a 50 mM NaCl. Las proteínas se cargaron en una matriz de fosfocelulosa

previamente activada y equilibrada con tampón A conteniendo 50 mM de NaCl. Las

proteínas y quedaron retenidas en la matriz, que posteriormente se lavó con

concentraciones crecientes de NaCl, en todos los casos las proteínas eluyeron a 200 mM

de NaCl. Una vez eluidas se bajó la concentración de sal hasta 100 mM para cargarlas en

una columna conteniendo la matriz SP-Sepharosa equilibrada a 100 mM de NaCl. Las

proteínas quedan retenidas y se lavó la matriz con concentraciones crecientes de sal. Las

proteínas comenzaron a eluir a 175 mM de NaCl, libres de contaminantes pero muy

diluidas por lo que hubo que pegarlas de nuevo a una matriz de fosfocelulosa, de muy

poco volumen, de nuevo a 50 mM NaCl, para concentrarlas. Una vez cargada toda la

proteína en la segunda columna de fosfocelulosa se eluyó mediante un golpe de sal a 300

mM de NaCl, se añadió glicerol al 50% y se almacenó a -20ºC.

La concentración de cada proteína fue determinada por absorbancia mediante los

coeficientes de absorción de A1%,1cm = 3,63 y 4,8 para y.

(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)

Los diferentes pasos de purificación fueron seguidos por electroforesis en geles de

SDS-PAGE al 17.5%.

2.3.2.2. Purificación de -His6)2 y (D60A-His6)2.

Las proteínas y D60Afueron sobre-expresadas en E. coli BL21(DE3) y para facilitar

su purificación, se decidió añadir a las mismas una cola de 6 histidinas (-His6 y (D60A-

His6). Las células se lisaron en tampón A. Los restos celulares fueron eliminados por

centrifugación. El sobrenadante de lisis se cargó en una columna de Ni-NTA, se lavó a

concentraciones bajas de imidazol y finalmente la proteína fue eluida a imidazol 50 mM. El

eluido de la resina de Ni de se cargó en una columna Q-Sepharosa equilibrada con

tampón A y NaCl 50 mM. Una vez lavada la columna se eluyó la proteína a 200 mM de

NaCl. La proteína pura se dializó frente a fosfato sódico pH 7,5 50 mM, 50% glicerol, NaCl

100 mM y se conservó –20 ºC.

La concentración de cada proteína fue determinada por absorbancia mediante los

coeficientes de absorción de A1%,1 cm= 0,857 y 0,858 para (-His6)2 y (D-His6)2 .

2.4. Ensayos bioquímicos 2.4.1. Medida de interacciones proteína-ADN 2.4.1.1. Ensayos de retraso en gel.

La interacción proteína-ADN fue medida por la variación de la movilidad de un ADN

marcado cuando está libre o cuando forma un complejo con una o varias proteínas. Los

fragmentos de ADN marcados radiactivamente fueron incubados con distintas

concentraciones de las proteínas en tampón B (Tris pH7,0 50mM, MgCl2 10mM, NaCl

50mM) durante 15 min a 37º en 20 µl de volumen final. En el caso de los ensayos con

se añadió ATP o ADP 1 mM.

Las mezclas de reacción con tampón de carga fueron cargadas en geles nd-PAGE del

del 4%. Los geles se corrieron en 1X TAE para los ensayos con , a 4°C, 200 V durante 2

horas y fueron secados y autoradiografiados.

P á g i n a | 29

Para obtener los valores de kd,app de los geles de retrasos y de los ensayos de

protección a DNasa I, las concentraciones del ADN libre y de los complejos ADN-proteína

fueron determinados por densitometría de las autoradigrafías. La concentración de

proteína que transfiere el 50% del [32

P]-ADN en complejos o que protege el 50% del [32

P]-

ADN de la digestión por DNasa I es aproximadamente la constante de disociación (kd,app).

2.4.1.2. Ensayos de protección a DNasa I.

En este caso la interacción ADN-proteína se mide por la capacidad de la proteína que

se una al ADN de proteger la región a la cual se une del ataque de la enzima DNasa I. La

protección se visualiza como una “huella” en el ADN que marca la zona a la que se unió la

proteína de interés.

Las condiciones de reacción para el ensayo de protección a DNasa I fueron las mismas

que para los ensayos de retraso. La concentración de ADN utilizada es de entre 0,5 y 1

nM. Luego de la incubación se añade DNasa I, previamente calibrada. Se considera como

óptima la cantidad suficiente como para que cada molécula de ADN sea cortada por

término medio una vez. Se dejó actuar 5 min a 37ºC. La reacción se paró añadiendo EDTA

hasta una concentración final de 25 mM. El ADN fue precipitado con acetato sódico 0,3 M

y etanol frío. Las muestras fueron resuspendidas en tampón de carga desnaturalizante

[80% (v/v) formamida, 0,1 % (v/v) azul de bromofenol y 0,1% (v/v) xilencianol], separadas

en un gel desnaturalizante de poliacrilamida del 6 o del 15% (dPAGE) y luego

autoradiografiados. Como marcador de tamaño, se obtuvieron patrones utilizando la

reacción química de secuenciación (G+A) con los mismos fragmentos de ADN que se

utilizaron en el experimento.

2.5 Modelado Molecular

Las simulaciones se realizaron, a temperatura y volumen constante. Los datos para la

simulación se tomaron de la estructura cristalina de 22 (PDB:1GVN). Ambas proteínas

fueron preparadas usando el XLEAP modulo para agregar átomos de hidrogeno y cargas

atómicas parciales. Se agregó una caja periódica de moléculas de agua (TIP3P) rodeando

el complejo a una distancia de 10 A de la superficie receptora. El tiempo total de las

simulaciones fue de 1 nanosegundo (ns). Se mantuvo un gradiente de temperatura

constante desde 300K a 400K durante los primeros 250 picosegundos, y luego se

mantuvo la temperatura constante a 400K. Para más detalles consultar (Lioy et al., 2009)

2.6. Ensayos in vivo 2.6.1 Medio de Cultivo:

En todos los casos las células de B. subtilis se crecieron en medio mínimo S7 (MMS7),

que está compuesto por: MOPS 50 mM, (NH4)2SO4 10 mM, Fosfato potásico 5 mM, MgCl2

2 mM, CaCl2 0,7 mM, ZnCl2 1 M, MnCl2 50 M, Fructosa 1%, glutamato 0,1%, D/L

triptofano 0.04 % y L-Metionina 0,04 %. A menos que se indique lo contrario, todos los

ensayos se realizaron a 37ºC.

Las células de E. coli CC118 se crecieron en medio mínimo M9 (MMM9), con glicerol

como fuente de carbono en lugar de glucosa. El MMM9 se preparó con los siguientes

componentes (para 0,5L): Na2HPO4∙7H2O 12,8gr, KH2PO4 3gr, NaCl 0,5gr, NH4Cl 1,0gr.

Luego agregar SO4Mg 2mM, 1% glicerol, CaCl2 0,1mM.

P á g i n a | 30

2.6.2. Microscopías 2.6.2.1 Microscopía de fluorescencia: Visualización de nucleoides y

estado de las membranas

Se utilizaron células de B. subtilis BG689 y BG687 en fase exponencial inoculando cultivos

de toda la noche en MMS7 fresco y creciéndolas luego a 37 ºC hasta una OD560 de 0,2. A

tiempo cero, se agregó xilosa 0,5%, y se tomaron muestras a los tiempos indicados. En

este caso 1 ml de células se fijaron con paraformaldehído al 2%, luego de 10 min a

temperatura ambiente, las células se centrifugaron, lavaron y resuspendieron en tampón

fosfato. Se incubaron 5 min en oscuridad con 4´,6’-diamino-2-fenilindol (DAPI, 0.2g/ml).

Para analizar la integridad de las membranas las células sin fijar fueron teñidas con Ioduro

de Propidio (IP) y SYTO9. SYTO9 es un colorante verde hidrofóbico que penetra en todas

las células, presenten o no defectos en las membranas. IP, es un colorante rojo hidrofílico

que sólo tiñe aquellas células con defectos en las membranas.

2.6.2.1 Microscopía electrónica: Visualización del efecto de la sobre-

expresión de en células de E. coli

En colaboración con el laboratorio del Dr. Rudi Lurz se estudió el efecto de en la

fisiología de E. coli. Para esto se crecieron células conteniendo el sistema en trans II

(pCB635 y pCB297) hasta 1 x 107 células/ml en MMM9 suplementado con 2% glicerol,

0,2% glucosa y 0,05mM IPTG y con los antibióticos correspondientes. Luego el cultivos se

dividió en dos partes iguales y a una de ellas se le agregó arabinosa 0,2% para inducir la

expresión de Se tomaron muestras a los 0, 30 y 60 min post inducción. Para preparar

las muestras de microscopía electrónica las células se fijaron en glutaraldehído, se

embebieron en un medio Spurr de baja viscosidad y se trataron con tetróxido de osmio.

(Lioy et al., 2006)

2.6.3 Estudios de viabilidad en B. subtilis y E. coli

2.6.3.1 Estudio del efecto de la expresión de Y83C y en la viabilidad de

células de B. subtilis

Células de B. subtilis BG687, BG689, BG1125 y BG1127 se crecieron hasta 5x107

células/ml en MMS7, suplementado con los antibióticos correspondientes, y se indujeron

con xilosa 0,5% o IPTG 2 mM según corresponda. Se tomaron muestras a distintos

tiempos y se plaquearon en LB agar para determinar el número de unidades formadoras

de colonias.

En los ensayos para determinar si el efecto de es reversible (células BG1125), se

agregó xilosa a los 30, 60 y 120 min luego de inducir la expresión de y a los tiempos

indicados se plaquearon en placas de LB suplementadas con xilosa 0,5%, mientras que

aquellas células que no habían sido expuestas a la antitoxina se plaquearon en placas de

LB sin suplementar.

2.6.3.2 Identificación de especies reactivas de oxigeno mediadas por en

B. subtilis

P á g i n a | 31

Células de B. subtilis BG1125 se crecieron hasta 5x107 células/ml en medio mínimo S7,

momento en el cual el cultivo se dividió en 4 partes iguales, a una parte se le agregó IPTG

2 mM (inducción de ), a la otra 2,2´-dipiridil 500 mM (DP), a la tercera IPTG 2mM y

500mM DP, y la ultima fracción se dejó como control. A los 120 y 240 min se tomaron

muestras y se plaquearon en placas de LB agar para determinar el número de UFC/ml.

2.6.3.3 Estudio del efecto de la expresión de en células de E. coli

Para estudiar si la toxina afectaba la proliferación células de E. coli, y ver si este efecto

era dependiente de la concentración in vivo de , se utilizaron dos estrategias. En la

primera se utilizaron células de E. coli CC118 conteniendo los plásmidos pCB298 (+) y

pCB297 (+) (sistema en trans I) y en la segunda células de E. coli CC118 conteniendo los

plásmidos pCB635 (+) y pCB297 (+) (sistema en trans II). En el caso de las células

conteniendo el sistema en trans I, se crecieron en MMM9 con los antibióticos

correspondiente, hasta llegar a 5x106 células/ml y en presencia de IPTG 1 mM (para

inducir la expresión de ). En ese momento, los cultivos se centrifugaron y se

resuspendieron en MMM9 precalentado. Luego, estos cultivos se dividieron en dos partes

iguales y a una de ellas se le agregó IPTG 1mM para inducir la expresión de la antitoxina,

mientras que a la otra no, ya que se encuentra bajo un promotor constitutivo. A los 120,

180, 240, 300 y 360 min se tomaron muestras y se agregó IPTG para inducir la expresión

de la antitoxina. Luego las células se plaquearon en LB agar sin suplementar y se

determinaron las UFC/ml. Para estudiar la viabilidad de las células conteniendo el sistema

en trans II, las células fueron crecidas hasta 1 x 107 células/ml en MMM9 suplementado

con 2% glicerol, 0,2% glucosa y 0,05mM IPTG y con los antibióticos correspondientes.

Para inducir la expresión de , se agregó arabinosa al 0,2%. A los 30, 60, 90, 120 y 180

min se agregó 1mM IPTG para inducir la expresión de . Se tomaron muestras a distintos

tiempos y se plaquearon en LB agar con 0,2% glucosa para determinar el número de

unidades formadoras de colonias.

2.6.3.4 Estudio de la toxicidad de :GFP en células de E. coli

Para determinar si la fusión del gen a el gen de la proteína verde fluorescente (gfp) era

funcional, se realizaron una serie de ensayos en E. coli, en donde se comparo la actividad

de la toxina silvestre con la de la toxina fusionada a gfp. Para esto, se crecieron células

de E. coli conteniendo los plásmidos pCB297 (+), pCB298 (+) (sistema en trans I) y

células de E. coli conteniendo el plásmidos pCB617 (:gfp) y pCB297(+) hasta llegar a

fase exponencial en medio LB, en presencia de IPTG 1 mM (para inducir la expresión de

). En ese momento, los cultivos se centrifugaron y se resuspendieron en medio LB

precalentado. Luego, estos cultivos se dividieron en dos partes iguales y a una de ellas se

le agregó IPTG 1mM para inducir la expresión de la antitoxina, mientras que la otra se

siguió creciendo, ya que se encuentra bajo un promotor constitutivo. A los 120 min se

tomaron muestras y se plaquearon en LB agar sin suplementar y se determinaron las

UFC/ml

2.6.3.5 Estudio del efecto de la expresión deY83C y en la generación de

células persistentes en B. subtilis

P á g i n a | 32

Para los ensayos realizados con células de B. subtilis BG687, BG689, BG1125 en fase

exponencial (5x107 células/ml), las células se crecieron en MMS7. Cuando se obtuvo la

DO deseada, los cultivos se dividieron en varias partes iguales, y se indujeron con xilosa

0,5% o IPTG 2 mM según corresponda. Al mismo tiempo, se agregaron los siguientes

antibióticos: Amp (3g/ml), Cip (4g/ml), Eri (20g/ml, solo BG689 y BG687) y Tri (3

g/ml). A los 120 y 240 min se tomaron muestras y se plaquearon en LB agar o en LB

agar suplentado con xilosa 0,5% (solo con la cepa BG1125 y, para permitir la expresión de

) y se determinaron el número de unidades formadoras de colonias luego de incubar las

placas durante 16 hs a 37ºC.

Para los ensayos realizados en fase estacionaria (1x109 células/ml), las células se

crecieron en MMS7 a 37ºC y cuando llegaron a la DO deseada las células se centrifugaron

y resuspendieron en el mismo volumen de MMS7 fresco pre-calentado a 37ºC. Luego, se

procedió de la misma manera que se describió en el párrafo anterior.

2.6.4 Estudio de la inhibición de la síntesis de ARN, ADN y

proteínas luego de la inducción de en B. subtilis

Células de B. subtilis BG689 y BG687 fueron crecidas a 37 ºC en MMS7 hasta una DO

de 0,2 (1x107 células/ml). Se agregó xilosa 0,5% para inducir la expresión de . Se

tomaron muestras de 1 ml en los puntos de tiempo indicados a las cuales se les agregó

2,5 Ci de [6-3H] timidina (síntesis de ADN), 2,5 Ci L-[4,5-

3H] leucina (síntesis de

proteínas) y 2,5 Ci [5-3H] uridina (síntesis de ARN). Luego de 1 min de incorporación, las

muestras fueron seguidas por 2-3 min con 10 mg/ml de timidina, uridina o leucina fría. Las

muestras fueron incubadas 2 min con 1mg/ml de lisozima y luego se agregó TCA con una

concentración final de 20% y se incubaron en hielo por 60 min. Tras la incubación, las

muestras se centrifugaron a 20.000 g por 30 min a 4 ºC. Los precipitados fueron lavados

con 200 l de TCA 20 frío y con 200 l de etanol 96%. Finalmente los precipitados fueron

transferidos a un vial y se cuantificó la radiactividad en un contador de líquido de centelleo.

2.6.5 Geles en 2D, análisis de imágenes y identificación de

proteínas

Las cepas BG873 y BG871 se crecieron medio BM (Stulke et al., 1993) hasta 1x108

células/ml. Las proteínas se marcaron con 10 Ci/ml de L-[35

S] metionina durante 5 min

antes (control) y a distintos tiempos (10, 30 y 60 min) luego de agregar xilosa 0,5%. La

incorporación de L-[35

S] metionina se detuvo con la adición de 1mg/ml de cloranfenicol y

un exceso de L-metionina fría (10 mM). Las células se lisaron y se separó la fracción

soluble de proteínas de los restos celulares a través de centrifugación. La metionina

incorporada se cuantifico por la precipitación de las muestras con 10% TCA en filtros de

papel como se describió previamente en (Bernhardt et al., 1999). Se cuantificó la

concentración total de proteínas por Bradford y 80 g de proteínas marcadas con L-[35

S]

metionina se cargaron en un gel y se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida

en 2 dimensiones (2D-PAGE), en las condiciones que se describe en (Lioy et al., 2006).

Para identificar las proteínas, se realizó el mismo ensayo pero sin incorporar radiactividad.

Los spots se cortaron del gel y se identificaron por espectroscopia de masas.

2.6.6 Cuantificación del pool de purinas in vivo.

P á g i n a | 33

Para estudiar el efecto de Y83C sobre el pool de purinas in vivo, se crecieron células de

BG687 y BG689 en MMS7 pero con 1mM de tampón Fosfato Potásico, y en presencia de

50Ci de 32

Pi. Las células se crecieron hasta DO 0,2, momento en el cual los cultivos se

dividieron en dos partes iguales y a una de ellas se le agregó xilosa 0,5% para inducir la

expresión de Y83C. A los tiempos indicados se tomaron 0,2 ml de células y se incubaron

por 30 min en hielo con 0,04 ml de ácido fórmico 2M, según (Wang et al., 2007). Luego

las muestras se centrifugaron durante 15 min a 4ºC y se cargaron en una cromatografía en

capa delgada (CCD) para separar ATP y GTP. La CCD se corrió en K2HPO4 0,85M. Luego

las placas se expusieron con una pantalla Phosphoimager y la radioactividad incorporada

se cuantificó por medio del software Quantity One de la casa comercial Bio-Rad

2.6.7 Análisis del transcriptoma de B. subtilis en presencia de

Y83C.

En colaboración con el laboratorio del Dr. J. Eduardo González-Pastor, se realizó el

análisis del transcriptoma de B. subtilis en presencia de Y83C. Para esto a cultivos en

fase exponencial de BG687 y BG689 se les agregó xilosa 0,5% para inducir la expresión

de la toxina y se tomaron muestras de 50ml a los tiempos 0, 5 y 15 min. Las muestras se

centrifugaron y se procedió a la extracción de ARN total según protocolos establecidos. El

ARN se transformó en ADNc con la superScrict III transcriptasa en reverso, usando

hexámeros random como cebadores, incluyendo amino-acil y amino-hexil nucleótidos

modificados en la muestra. Después de purificar el ADNc, los fluoróforos Cy3 y Cy5

(Amersahm Biosciences) se acoplaron únicamente a la banda de ADNc modificada en el

amino terminal. La eficiencia de marcaje se determinó utilizando un espectrofotómetro

NanoDrop ND1000 (NanoDrop Technologies. Wilmintong, DE. EE.UU.). Anteriormente a la

hibridación, los cristales del microarray (Eurogentec. Lieja, Bélgica) se bloquearon durante

45 minutos a 42ºC por inmersión en SSC 5x, SDS 0.1% (p/v), 1% (p/v) albúmina sérica

bovina. Los cristales fueron lavados brevemente en agua a temperatura ambiente, seguido

de un nuevo lavado en isopropanol, antes de que se secaran. Se mezclaron cantidades

iguales de cDNAs marcados con Cy3 o Cy5 (alrededor de 300 pM de cada uno) y se

secaron en Speed-Vac. Las muestras se disolvieron en 35 ml de formamida desionizada

50% (v/v), solución Denhardt’s 5x, SSC 6x, SDS 0.5% (p/v), dextransulfato 5% (p/v), pre-

filtrado y precalentado a 42ºC. Después de 2 minutos a 90ºC para desnaturalizar el cDNA,

se aplicó la solución a los cristales y se les cubrió con un cristal cobertor de 24 x 60 mm.

Los cristales se introdujeron en una cámara de hibridación y se incubaron a 42ºC durante

18 horas, evitando su exposición a la luz. Luego, tras quitar el cobertor, los cristales se

realizaron dos lavados de 5 minutos con agitación suave en SSPE 0.5x SDS 0.5% (p/v)

pre-calentado a 37ºC (SSPE 1x se compone 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 11.5 mM

NaH2PO4, PH 7.4). Finalmente se lavó con 0.1x SSPE a temperatura ambiente. Se dejaron

secar los cristales y se escanearon en un escáner de microarrays con láseres de 543 y

633 nm. Se tomaron imágenes a una resolución de 10 mm. La intensidad de los spots se

determinó con el programa informático Genepix Pro 5.0 (Axon. Palo Alto, CA., EE.UU.).

Los datos de intensidades se trataron estadísticamente mediante el programa LIMMA.

Para visualizar los resultados obtenidos por LIMMA se utilizó el programa FIESTA viewer.

Los ensayos para determinar qué genes eran modificados por la toxina se realizaron por

triplicado (replicas biológicas) y se consideraron aquellos genes cuyo valor P era ≤ 0,2.

2.6.8 Ensayo de BRET en células de E. coli

P á g i n a | 34

El ensayo de BRET se realizó in vivo en células de E. coli transformadas con los

distintos plásmidos descritos en la tabla 4. Las células transformadas se crecieron hasta

alcanzar la fase exponencial, a 37ºC y en LB, con los antibióticos correspondientes. La

señal de BRET se midió 10 min luego de adicionar el substrato (tiempo necesario para que

el substrato entre en las células). Los filtros de emisión utilizados para medir la señal

fueron 410 y 515 nm. La intensidad de ambas longitudes de onda se grabaron

automáticamente y la razón 515/410 (señal de BRET) se calculó como medida de BRET

(Lioy et al., 2009).

Resultados

P á g i n a | 35

Parte I: Regulación del sistema de TA papel de la proteína en la modulación del represor transcripcional

El sistema de es el único sistema TA que está formado por un tercer componente, la

proteína 2. La proteína 2 es un represor transcripcional que se une a una región aguas arriba

del promotor (P) del operón . La diana de 2 en este promotor está compuesta por 7

copias de la repetición 5´-A/TATCAC

A/T-3´ (iterones), en orientación directa o inversa. Los 7

iterones están compuestos de 2 repeticiones en orientación directa y una en orientación inversa

y ese motivo está presente dos veces, más un iterón en orientación inversa en el promotor P

(Figura 8).

Como se detalló en la sección 6.2 de introducción, las proteínas 2 o no parecen estar

involucradas en la modulación de la utilización de P, sino que es la proteína 2 la encargada

de dicha tarea. La proteína 2 además de encargarse de regular la expresión del operón, actúa

junto con la proteína 2 otorgando estabilidad al plásmido, ya que juntas componen un sistema

de partición activa. Se demostró que la proteína 2 podía modular la actividad ATPasa de 2,

actividad necesaria para la correcta partición del plásmido (Pratto et al., 2008). Por este motivo,

nos preguntamos si hay una interrelación entre los sistemas de partición y los de muerte post-

segregacional y si 2, el motor molecular del sistema de partición, era capaz de modular la

actividad represora de 2, de forma tal que aumente o disminuya la represión del sistema TA.

De esta manera, para estudiar cuál es el efecto de la proteína en la regulación

transcripcional del operón formado por los genes , y , se purificaron las proteínas y ,

así como también las variantes D60A y 19, y se analizó in vitro el efecto de y su

variante en el cargado de y 19 en la región promotora.

1.1 La proteína 2 forma complejos específicos y 2 y

2D60A incrementan la formación del complejo 2·DNA

Para estudiar el efecto de la proteína 2 en la regulación del operón se realizaron

ensayos de retraso en gel de las proteínas 2, 2 y sus variantes, con el ADN conteniendo la

región P (Figura 13). Como se muestra en la Figura 13A la proteína 2 unida a ATP

(·ATP·Mg2+

)2 se unió al ADN de manera inespecífica y con baja afinidad (Kdap 140 nM, calles

5-7), pero cuando se introduce una mutación en el dominio Walker A’ (D60A·ATP·Mg2+

)2,

dando lugar a una proteína que une ATP, pero no lo hidroliza, se incrementó la afinidad

aparente 4 veces (Kdapp 40 nM calles 8-10). Este aparente incremento de afinidad, se debe a

que se aumenta el tiempo de des-ensamblado del complejo proteína·DNA (off rate), es decir, la

hidrólisis de ATP promueve el desensamblado de 2 del ADN y al no haber hidrólisis, el

desensamblado es más lento ((Pratto et al., 2008) y resultados sin publicar de Soberón N.)

Por el contrario, 2 se une específicamente y con alta afinidad (Figura 13A, 9 nM calles 2-4 y

C1) a la región de ADN que contiene los iterones y la secuencia promotora. A concentraciones

limitantes de 2 (3 nM) y en presencia de concentraciones crecientes de las proteínas

(·ATP·Mg2+

)2 o (D60A·ATP·Mg2+

)2, se observó un aumento de la afinidad de 2 de más de 3

veces por la región promotora. También se formaron complejos de alto peso molecular (C2 y

C3). Tanto (·ATP·Mg2+

)2 como (D60A·ATP·Mg2+

)2 estimularon el cargado de 2 en su diana

P á g i n a | 36

especifica, permitiendo concluir que la hidrólisis de ATP no es requerida para esta

estimulación.

Para obtener más información sobre los diferentes complejos observados, se realizaron

experimentos de protección a DNasa I (Figura 13B) con las mismas condiciones que se

utilizaron para los ensayos de retraso. Como se demostró anteriormente (Tesis doctoral F.

Pratto y resultados sin publicar), la proteína (·ATP·Mg2+

)2 protege al ADN de manera

extensiva e inespecíficamente (calles 4-6). Sin embargo, en presencia de , (·ATP·Mg2+

)2 fue

desplazada del ADN ya que solo se observó el patrón típico de protección de 2 sobre las

repeticiones del P (calles 10-12). El patrón de protección observado con (D60A·ATP·Mg2+

)2

también fue inespecífico y extenso, aunque con un poco mas de afinidad por el ADN que la

proteína silvestre (calles 7-9). Nuevamente, cuando las proteínas (D60A·ATP·Mg2+

)2 y 2 se

encontraron juntas se observó un desplazamiento de la proteína (D60A·ATP·Mg2+

)2 del ADN,

observándose solo la protección de 2 en las secuencias repetidas. No obstante, cuando se

utilizaron concentraciones de (D60A·ATP·Mg2+

)2 por encima de la Kdap, se observó una

protección más extendida sobre la región promotora (Figura 13B, calle 15).

1.3 El aumento de la afinidad de 2 por la región

promotora es independiente de la unión de 2 a ATP y a

ADN

crecientes de 2 (6 y12 nM, calles 2 y 3), con cantidades crecientes de la proteína (70, 200 y 400nM, calles 4 a 6) y

con cantidades crecientes de 2D60A (15, 70 y 150nM, calles 7 a 9). En las calles 10 a 15 se incubaron las mismas

concentraciones crecientes de y D60A con una concentración fija de 2 (6nM). El marcador de peso molecular G + A

esta en la calle 16. La región del ADN protegida del ataque de DNasa I por 2 se indica como 2•P

Figura 13. La proteína 2 y 2D60A aumentan la afinidad

de 2 por su región promotora. A) El fragmento de ADN

conteniendo la región promotora de (0,5 nM) se incubó

durante 15 min a 37 ºC en tampón B con 1 mM ATP con

concentraciones crecientes de 2 (3, 6 y12 nM, calles 2 a 4),

con cantidades crecientes de la proteína (70, 200 y 400nM,

calles 5 a 7) y con cantidades crecientes de 2D60A (15, 70 y

150nM, calles 8 a 10). En las calles 11 a 16 se incubaron las

mismas concentraciones crecientes de y D60A con una

concentración fija de 2 (3nM). El símbolo – indica ausencia

de proteína, 2• P, indica el complejo de 2 unida al ADN, y

2•2/2D60A• P, un posible complejo ternario conteniendo

2, 2 o 2D60A y ADN. B) El fragmento de ADN conteniendo

la región promotora de (1 nM) se incubó durante 15 min

a 37 ºC en tampón B con 1 mM ATP con concentraciones

P á g i n a | 37

Para que el sistema 2∙2 de partición activa sea funcional, es esencial que la proteína 2

pueda unir e hidrolizar ATP. Por este motivo, se estudió si el aumento producido por 2 en la

afinidad de 2 por la región promotora del operón era también dependiente de la unión a

ATP, y para esto se realizó un ensayo de retraso en gel en ausencia de nucleótido. Como

muestra la Figura 14A (calles 6-8) en estas condiciones 2 no fue capaz de formar un complejo

que migre distinto al ADN libre, así como tampoco pudo hacerlo la proteína 2D60A (calles 9-

11). Sin embargo, cuando concentraciones de 2 que no eran capaces de formar un complejo

estable con el ADN (1,5 nM; calles 11-17) fueron incubadas en presencia de 2 o su variante

2D60A, se observó un aumento de más de 4 veces de afinidad por el ADN conteniendo la

región P. El aumento de afinidad de 2 por su región promotora, podría estar dado por una

interacción proteína-proteína en solución. Para confirmar esta interacción, se realizó el mismo

ensayo pero con una variante de 2 que carece de los primeros 19 residuos (219). El

extremo amino terminal de 2 es necesario para la interacción con 2, pero no lo es para ejercer

su actividad como represor de la transcripción del operón (Pratto et al., 2008, Welfle et al.,

2005). Como muestra la figura 14B, la afinidad de 219 por el ADN específico fue la misma

que su variante silvestre (Figura 14B calles 2-5). Sin embargo, no se observó un aumento de la

afinidad de la proteína 219 por la región P en presencia de 2 o 2D60A (calles 6 y 7).

Estos resultados demostraron que tanto 2 como su variante 2D60A son capaces de

aumentar la afinidad de 2 por la región promotora (independientemente de la unión a ADN y

ATP de 2), haciendo que 2 reprima la expresión de y . De esta forma, los niveles de toxina

y antitoxina se encontrarían perfectamente regulados, y esta regulación sería modulada por la

proteína ParA del sistema de partición activa. El sistema de partición activa no solo minimizaría

el coste de tener un sistema de TA (Brendler et al., 2004), sino que también aseguraría la

correcta regulación de la expresión del mismo.

Figura 14. La proteína 2 aumenta la afinidad de 2 por la región promotora independientemente de su unión a

ATP. A) El fragmento de ADN conteniendo la región promotora de (0,5 nM) se incubó durante 15 min a 37 ºC en

tampón B con concentraciones crecientes de 2 (1.5, 3, 6 y12 nM, calles 2 a 5), con cantidades crecientes de la proteína

(25, 50 y 100nM, calles 6 a 8) y con cantidades crecientes de 2D60A (25, 50 y 100nM, calles 9 a 11). En las calles 12

a 16 se incubaron las mismas concentraciones crecientes de y D60A con una concentración fija de 2 (1.5 nM). B) El

fragmento de ADN conteniendo la región promotora de (0,5 nM) se incubó durante 15 min a 37 ºC en tampón B con

concentraciones crecientes de 219 (1.5, 3, 6 y12 nM, calles 2 a 5). En las calles 6 y 7 se incubaron las proteínas

(100nM) y D60A (100nM) con 1,5 nM de 219.

El símbolo – indica ausencia de proteína, 2• P y 219• P indican el complejo de 2 o y 219 unida al ADN.

P á g i n a | 38

Parte II. Sistema TA: El papel de en el sistema

2.1. Sistemas Toxina Antitoxina: Antecedentes del tema

Actualmente la función de los sistemas de TA no es clara. Se han descrito una gran variedad

de funciones en la que estos sistemas juegan un papel relevante. Sin embargo, la hipótesis

más aceptada hasta el momento es que son elementos de respuesta a estrés capaces de

inducir en las bacterias algunos de los siguientes fenómenos:

1- Muerte celular programada

2- Bacterioestásis o células persistentes.

3- Senescencia celular

Nuestro objetivo fue analizar esas hipótesis y realizar experimentos para determinar cuál es

el rol más probable del sistema en B. subtilis.

2.2 Caracterización del efecto tóxico de la proteína en B.

subtilis

2.2.1 La expresión de la toxina Y83C inhibe la proliferación

celular

En ausencia de la antitoxina , la toxina no puede ser clonada de manera estable dando

lugar a reordenamientos genéticos o mutaciones. Una de las mutaciones aisladas de esta

manera, en donde la tirosina 83 fue reemplazada por una cisteína (Y83C), dió lugar a una

variante que todavía mantenía su actividad tóxica (Lioy et al., 2006), y por ello fue analizada en

más detalle. El gen Y83C fue clonado bajo un promotor débil e integrado como copia única en

el locus amyE del cromosoma de B. subtilis dando como resultado la cepa BG689. Como

control de todos los experimentos se construyó la cepa BG687, en donde una copia vacía del

casete de expresión bajo el promotor de xilosa fue integrada en el mismo sitio por

recombinación homóloga.

Para determinar la cinética de acción de Y83C se crecieron células de BG689 y BG687

hasta DO ≈ 0,2 a las cuales se les agregó xilosa 0.5% para inducir la expresión de la toxina.

Como se puede ver en la Figura 15 la expresión de Y83C fue capaz de reducir más de

10,000 veces la formación de colonias. Esta inhibición es constante en el tiempo, desde los 15

min de inducción hasta los 120 min. Sin embargo, si las diluciones se realizan en medio

conteniendo glucosa 2%, que actúa como represor del promotor de xilosa, se observa durante

los primeros 5 min una disminución de 50 veces en lugar de 100 en el efecto tóxico de Y83C

aunque a tiempos más tardíos ese efecto no es notable (línea punteada de la Figura 15)(Lioy et

al., 2006). Como muestra la Figura 15, en los cultivos control (BG687) inducidos con xilosa no

se produjo ningún efecto sobre las unidades formadoras de colonias, demostrando que la

inhibición del crecimiento está dada por el efecto de la toxina Y83C.

P á g i n a | 39

2.2.2 La expresión de la toxina Y83C induce un efecto

bacteriostático y la muerte de una fracción de la población

bacteriana

Se realizaron dos tipos distintos de microscopias de fluorescencia para determinar si la

inhibición de la proliferación de las células de B. subtilis en presencia de Y83C era debido a

lisis celular (muerte celular programada) o a la entrada de las células en un estado de viables

pero no cultivables (VBNC, del inglés-viable-but-nonculturable). Estos dos ensayos

microscópicos permitieron visualizar el estado de los nucleoides (tinción con DAPI) y la

integridad de la membrana (tinción con ioduro de propidio, usado como parámetro indirecto de

muerte celular). De esta manera, células de BG689 se crecieron en las mismas condiciones

que en el ensayo de viabilidad pero luego de inducir la expresión de la toxina Y83C, se

tomaron muestras, se incubaron con los distintos colorantes y se procedió a la visualización por

microscopía óptica de fluorescencia. Las células se tiñeron con DAPI en presencia y ausencia

de xilosa. Como se muestra en la Figura 16A, el 85% de las células no parecían presentar

ningún defecto después de 60 min de inducción. Sin embargo, el 15 % restante presentaba

algún defecto de segregación: el 4% de las células eran anucleadas y el 11% tenían los

nucleoides descondensados.

Para analizar la integridad de las membranas, las células fueron teñidas con SYTO9 (color

verde, tiñe todas las células); y con ioduro de propidio (IP, color rojo, solo tiñe aquellas células

cuyas membranas presenten defectos). Como se muestra en la Figura 16B, solo se observó

que alrededor del 20% de las células eran teñidas con IP en presencia de la toxina Y83C. Por

el contrario, en células de BG687 que habían sido inducidas con xilosa menos del 2 % fueron

teñidas con IP (-Y83C). En la Tabla 5 se puede ver la cuantificación de las células que se

tiñeron con IP. A partir de los 30 min de inducción de la toxina se observó un aumento gradual

en el número de células teñidas con IP, hasta alcanzar un máximo cercano al 18 % a los 120

min. Esto indicaría que en presencia de Y83C casi el 20 % de las células presentarían

defectos en las membranas y podrían lisarse. Sin embargo la gran mayoría de las células que

no eran capaces de formar colonias parecían tener su membrana intacta, indicando que la

toxina podría estar induciendo un estado bacteriostático o de VBNC.

Figura 15. La toxina Y83C inhibe la

proliferación celular en B. subtilis.

Células de BG689 se crecieron en MMS7 a

37ºC hasta fase exponencial momento en

el cual el cultivo se dividió en dos partes. A

una parte se le agregó xil 0,5% (■,

+Y83C) y mientras que la otra sirvió de

control (□), se tomaron muestras y se

plaquearon en placas de LB. El mismo

ensayo se realizó también con células de

BG687 en presencia de xil 0,5% (●) o en

ausencia de xil (○). En línea punteada se

muestra la disminución del efecto tóxico de

Y83C cuando las diluciones se realizan en

glucosa 2% .

P á g i n a | 40

Tiempo (min)

Porcentaje de células teñidas con IP

+ Y83C - Y83C

0 1,20 1,00

30 7,85 ND 60 16,50 1,40 90 19,00 ND

120 17,75 1,10

2.2.3 La expresión de no induce especies reactivas de oxigeno

La generación de especies reactivas de oxigeno (ROS) produce daños en el ADN y

proteínas (proceso conocido como senescencia), de forma tal que deterioran al

microorganismo dejándolo en un estado de arresto o llevándolo a la lisis celular (Dwyer et al.,

2007, Nystrom, 2003). Recientemente se ha implicado a los sistemas de TA en la producción

de ROS (Kolodkin-Gal et al., 2008, Amitai et al., 2009). Para determinar si la inhibición de la

proliferación causada por era debido a la producción de ROS se llevó a cabo un experimento

en presencia de un agente secuestrador del hierro, el 2,2´- dipiridil (DP). El DP secuestraria al

hierro intracelular y de esta forma se inhibiría la reacción de Fenton (Figura 17) y su

subsecuente producción de radicales hidroxilo que dañarían el ADN y las proteínas (Kohanski

et al., 2007). Para corroborar esta hipótesis, se utilizó una cepa de B subtilis en donde se clonó

la toxina silvestre bajo el control de un promotor inducible por IPTG y se la integró como copia

única, por recombinación homologa, en el locus amyE (BG1125). Como se describió

anteriormente, la toxina silvestre no es capaz de clonarse en ausencia de su antídoto, por lo

que también se clonó el gen de la antitoxina desde un promotor regulable por xilosa, en un

plásmido de bajo número de copia (pCB799). En este sistema la toxina silvestre inhibe la

proliferación celular de la misma manera que lo hace la variante Y83C (Figura 18 y 23). Esta

Figura 16. Efecto de Y83C en la fisiología de B. subtilis. Células de BG689 se crecieron en MMS7 a 37ºC hasta fase

exponencial, momento en el cual el cultivo se dividió en dos partes y a una de ellas se le agregó xil 0,5%. A tiempo 0 min

y 60 min se tomaron muestras y se tiñeron con DAPI, para estudiar la apariencia de los nucleoides (las flechas muestran

células con defectos) (A) o con IP y Syto 9 para analizar el estado de la membrana (B)

Tabla 5. Porcentaje de células teñidas con IP. Los

porcentajes se obtuvieron por citometría de flujo.(ND: no

determinado)

Fe2+

+ H2O2 → Fe3+

+ OH· + OH−

Fe3+

+ H2O2 → Fe2+

+ OOH· + H+

Figura17. Reacción de Fenton. En esta reacción el ión de hierro media la reducción del peróxido de hidrogeno dando

como productos especies reactivas de oxigeno (OH∙ y OOH∙)

P á g i n a | 41

estrategia permitió crecer las células en presencia de xilosa 0.5% (expresión de ), y así titular

los escapes existentes de la toxina minimizando la posibilidad de generar efectos

secundarios que podrían llevar a una interpretación equívocaDe esta manera, solo en

presencia de IPTG (2 mM) la toxina se expresaba y era capaz de superar los efectos

antagonistas de la antitoxina Así se crecieron células de BG1125 hasta DO≈ 0,2 momento

en el cual el cultivo se dividió en 4 partes iguales. A una de ellas se les agregó DP (500 M), a

otro DP + IPTG, a la tercera solo IPTG y la otra se dejó como control (+ xilosa 0,5%). Las

células se incubaron en agitación a 37 ºC y a los 120 y 240 min se tomaron muestras y

plaquearon en placas de LB. Como se puede ver en la Figura 18 tanto en presencia de DP

como en su ausencia, no se observó un fenotipo distinto en el efecto de la toxina sobre las

UFC. Esto significa que el estado bacteriostático inducido por la expresión de y acompañado

de la lisis celular de una pequeña fracción de la población, no se debe a la generación de

daños en el ADN ni en las carbonilación de las proteínas por medio de ROS, descartando que

la toxina induzca senescencia.

2.2.4 La expresión de inhibe la replicación, transcripción y

traducción in vivo.

El efecto bacteriostático o de VBNC producido por y su variante Y83C podría estar dado

por una inhibición en alguno de los procesos biológicos más relevantes en la célula como son

la replicación del ADN, la transcripción o la traducción. Para determinarlo, se analizó el efecto

de Y83C en células de B. subtilis por medio de experimentos de pulso y caza en donde se

cuantificó la cantidad de H3-timidina (síntesis de ADN), H

3-uracilo (transcripción) y H

3-leucina

(traducción) incorporada durante un minuto a distintos tiempos después de la adición de xilosa

Figura 18. La toxina no induce senescencia. Células de B. subtilis BG1125 se crecieron en MMS7 a 37ºC con

aireación hasta fase exponencial, momento en el cual el cultivo se dividió en 4 partes iguales, y se les añadió DP

500M o IPTG 1mM o ambos y a una parte se añadió solamente xil 0.5% y se dejó como control.Las celulas se

siguieron incubando en agitación y a los 120 min (A) o 240 min (B) se tomaron muestras y se plaquearon en placas

de LB agar.

P á g i n a | 42

(0.5%) en células que expresan (BG689) o no la toxina Y83C (BG687). Como puede verse en

la Figura 19, durante los primeros 15 min de expresión de la toxina las células incorporaron

aproximadamente un 40 % menos de uracilo-H3 y leucina-H

3 en comparación con células en

las que la toxina no fue inducida. A partir de los 30 min de expresión de Y83C la síntesis de

ADN también se vio afectada, junto con la síntesis de ARN y proteínas. Resultados similares se

obtuvieron cuando el mismo experimento se realizó en E. coli (Lioy et al., 2006). La inhibición

en la síntesis de macromoléculas puede estar dada por un efecto pleiotrópico producido por la

toxina al interaccionar con su diana, ya que, en general esta inhibición se observa a tiempos

tardíos. Para estudiar más profundamente el efecto de la expresión de la toxina Y83C sobre la

síntesis de proteínas, en colaboración con el laboratorio del Dr. Michael Hecker (Universidad de

Greiswald, Alemania), se realizó un análisis del proteoma de B. subtilis en presencia y ausencia

de Y83C. Para este experimento, se utilizaron las cepas BG689 y BG687, a las cuales se las

convirtió en autótrofas para metionina, dando origen a las cepas BG873 y BG871

respectivamente. Las células se trataron de igual manera que en el ensayo anterior, pero esta

vez se crecieron en presencia de L-[35

S] metionina. Cuando las células alcanzaron la DO

deseada (tiempo 0), se agregó xilosa para inducir la expresión de Y83C y se tomaron

muestras a los 0, 10, 30 y 60 min. El análisis del patrón de proteínas observado demostró que

luego de inducir la toxina no se modificó específicamente la síntesis de ninguna proteína en

particular. En la Figura 20 se muestra el patrón de proteínas a tiempo 0 min (imagen verde, -

xilosa 0,5%) y a tiempo 60 min (imagen roja, + xilosa 0,5%). Las proteínas que se siguen

sintetizando se verán de color amarillo (por la superposición de los dos colores), las que se

dejan de sintetizar se verán de color verde y las que tengan su síntesis aumentada se verán de

color rojo. Sorprendentemente, a pesar de que la síntesis de proteínas se encuentra disminuida

en presencia de Y83C, no se observó ninguna diferencia entre el patrón de proteínas en

presencia de la toxina o en ausencia de la misma ni a los 10, 30 min o 60 min de inducción de

la toxina (Lioy, Martin et al. 2006). Esto indicaría que la inhibición de proteínas no es específica,

sugiriendo que es un efecto secundario de la acción de la toxina.

2.2.5 La toxina inhibe la síntesis de purinas in vivo

Figura 19. Efecto de Y83C en la biosíntesis de macromoléculas de B. subtilis. Células de BG689 y BG687 se

crecieron en MMS7 a 37ºC con aireación hasta fase exponencial, momento en el cual se agregó xil 0.5%. A los

tiempos indicados se tomaron muestras y se incubaron en presencia de 3H-Timina (síntesis de ADN, barras de color

azul), 3H-Uracilo (síntesis de ARN, barras de color morado) o

3H-Leucina (síntesis de proteínas, barras de color

dorado) durante 1 min, y luego se les añadió un exceso de timidina, uracilo o leucina fría durante 2 min. Luego las

células se lisaron y se cuantificó la radiactividad incorporada. Los valores obtenidos para BG689 + xil 0.5% (+Y83C)

se normalizaron en función de los valores obtenidos con BG687 + xil 0.5% (-Y83C).

P á g i n a | 43

La naturaleza de la diana debe ser una molécula que al ser modificada genere un efecto

pleiotrópico, induciendo un estado de arresto o VBNC e inhibiendo la síntesis de

macromoléculas. Por este motivo se pensó que la síntesis de ATP y GTP podía estar siendo

modificada por la toxina, limitando el “pool” energético de la célula y de esta manera, afectando

la síntesis de ADN y ARN e indirectamente de proteínas. Para determinar esto, se cuantificó

por medio de cromatografía en capa fina (CCF) la concentración de purinas in vivo en células

BG689 y BG687 en fase exponencial, en presencia y ausencia de Y83C. Como muestra la

Figura 17, tanto los niveles de ATP (Figura 21A) como los de GTP (Figura 21B) se encuentran

disminuidos, pero es la síntesis de GTP la que se ve inhibida de manera temprana (a los 15

min post inducción de Y83C). Es probable que la caída en la síntesis de GTP se vea también

acompaña por una caída en la producción de UTP, explicando la inhibición de la síntesis de

ARN y proteínas a los 15 min de expresión de la toxina y una posterior inhibición de la

replicación del ADN (Figura 19). Lamentablemente, debido a limitaciones de la técnica utilizada

para cuantificar los nucleótidos, no se pudo determinar si la síntesis de pirimidinas también

estaba afectada por Y83C.

Figura 20. Análisis de la síntesis de proteínas en B. subtilis en presencia de Y83C. Las células de B. subtilis

BG871 (A; -Y83C) o BG873 (B; +Y83C) se crecieron en MMS7 a 37ºC con aireación en presencia de 35

S-

metionina en MMS7, cuando llegaron a fase exponencial, se agregó xil 0.5%. Se analizó el patrón de proteínas por

gel en 2 dimensiones a tiempo 0 min (imagen en color verde) y tiempo 60 min luego de agregar xil (imagen color

rojo). Aquellas proteínas que aumentaron su síntesis luego de inducir la toxina se visualizan en color rojo y las que

reprimieron su síntesis en color verde.

Figura 21. Efecto de Y83C en la síntesis de purinas en B. subtilis. Células de BG689 se crecieron en MMS7 a

37ºC con aireación y en presencia de 32

Pi. Cuando las células alcanzaron la fase exponencial el cultivo se dividió en dos

partes, a una de ellas se le agregó xil 0,5% (■, + Y83C) y a la otra no (□, -Y83C). A los tiempos indicados, se tomaron

alícuotas y se extrajeron los nucleótidos y se cuantificaron los niveles de ATP y GTP por medio de CCF.

P á g i n a | 44

2.2.6 Efecto de la toxina Y83C en la expresión génica de B.

subtilis

Para conocer más acerca del mecanismo de acción de la toxina , se analizó en

colaboración con el laboratorio del Dr. Eduardo González-Pastor (Centro de Astrobiología,

Madrid) el patrón de genes afectados por la expresión de la misma. Para esto, células de

BG689 y BG687 se crecieron hasta DO ≈ 0,2 momento en el cual se agregó xilosa 0.5% para

inducir la expresión de Y83C en BG689 y como control en BG687. A tiempos 0, 5 y 15 minutos

post-inducción se tomaron muestras y se procesaron para extraer ARN usando protocolos ya

establecidos. Los tiempos que se seleccionaron para analizar el transcriptoma de B. subtilis en

presencia de la toxina fueron tales que evitasen cualquier efecto secundario en la expresión

génica, pero suficientes para ver un efecto tóxico. De esta forma, se comparó el transcriptoma

de células de B. subtilis expresando Y83C (BG689 + xil 0,5%) con aquellas que no lo

expresaban (BG687 + xil 0.5%). Sorprendentemente, se obtuvo un número reducido de genes

afectados por la toxina (107 genes) y no se alteró la expresión de ningún otro sistema TA (por

ejemplo EndoA/YdcD, SpoIISAB) Resultados similares fueron observados cuando se analizó el

efecto de la toxina en células de E. coli (Lioy et al., 2006). Por el contrario, ensayos de

microarrays para el sistema de TA RelBE dieron como resultados más de 700 genes afectados,

datos consistentes con la actividad de RNasa de RelE (Lioy et al., 2006). Por lo tanto, este

resultado indicaría que la toxina no tiene como diana la degradación de ARN.

Los genes cuya expresión fue inducida o reprimida por la toxina Y83C se detallan en la

Tabla 1 del Anexo I, junto con una breve descripción de la función de la proteína que codifican,

la categoría a la que pertenece el gen, el nivel de modificación o “fold change“ y el valor P

(probabilidad de significancia).

De los 107 genes cuya expresión fue afectada por la expresión de la toxina, un total de 58

fueron reprimidos y 49 inducidos. De los 58 genes reprimidos, 14 de ellos se reprimieron

durante los primeros 5 min de expresión de Y83C, mientras que 46 lo hicieron a las 15 min. Es

destacable que a tiempo 15 min, existen dos genes cuya expresión se encuentra reprimida

desde tiempo 5 min (yqeC, ywcE, ver Figura 22). De los genes inducidos, 20 lo hicieron durante

los primeros 5 min y otros 32 durante los últimos 15 min de inducción de la toxina, de los cuales

3 genes mantuvieron su expresión elevada desde los 5 min hasta el final del experimento

(pyrAB, oppC y pyrP, Figura 22).

Los genes cuya expresión estaba modulada por la toxina fueron clasificados en categorías

según (Kunst et al., 1997). Como puede verse en la Tabla 1 del anexo I, existen genes que

pertenecen a diversas funciones celulares, muchas de ellas relevantes como: síntesis de

carbohidratos y moléculas relacionadas, síntesis de aminoácidos, síntesis de nucleótidos y

ácidos nucleicos o la síntesis de lípidos. La gran mayoría de los genes reprimidos a tiempo 15

min codifican proteínas que forman parte de procesos tan relevantes como la síntesis de

carbohidratos y lípidos. Sin embargo, los únicos genes esenciales afectados por la expresión

de Y83C se encuentran a los 15 min, y están reprimidos. Estos genes esenciales, son genes

que forman parte de la síntesis de lípidos de membrana (accB, accC, acpA, fabD, fabF, fabG,

yhdO y plsX) y de la pared celular (glmS).

P á g i n a | 45

Del análisis de los genes cuya expresión fue modulada por la toxina , se seleccionaron

aquellos que fueron más relevantes para explicar el fenotipo observado. Desafortunadamente,

el 18.7% de los genes afectados son desconocidos o su función lo es y no se pudieron

clasificar en ninguna categoría (Tabla 6 y Tabla 1 del Anexo I). A continuación se describirán

los genes que fueron seleccionados como relevantes.

2.2.6.1 Genes cuya expresión fue reprimida por Y83C

Tras 5 min bajo la acción de la toxina en la célula se reprimió la transcripción de 14 genes,

sin embargo sólo el producto de dos de ellos resultaron poder tener alguna relación con el

efecto tóxico de Y83C:

1. El gen yvdC: Cuando se buscó el gen yvdC en el genoma de B. subtilis 168, no se

encontró la descripción de ningún producto conocido, sin embargo, la búsqueda por BLAST de

la secuencia proteica que codifica si dio resultado positivo. El producto del gen yvdC

presentaba dominios que pertenecían a la familia MazG. La proteína YvdC (106 aa) es más

pequeña que MazG (263 aa) de E. coli (EcMazG), pero contiene los 2 dominos NTPasa que

son necesarios para degradar ppGpp o NTPs. (Lee et al., 2008). La represión del gen yvdC

podría sugerir un efecto indirecto de la toxicidad de Y83C, en donde la célula reprime la

expresión de un gen cuyo producto podría consumir nucleótidos que son necesarios para la

replicación del ADN, y de esta manera priorizar el uso de esos nucleótidos en procesos más

relevantes para el mantenimiento celular. Esta represión podría ir acompañada de un aumento

en los niveles de ppGpp ya que el producto del gen relA se ve aumentado a los 15 min de

expresión de la toxina.

2. El gen yqeC: Este gen potencialmente codifica la 6-fosfogluconato deshidrogenasa,

enzima que forma parte de la vía de las pentosas fosfato y participa en la producción de

ribulosa -5- fosfato a partir de 6- glucofosfonato. La ribulosa-5- fosfato se convierte luego en

ribosa-5-fosfato (Rib-5-P). La Rib-5-P es una de las moléculas que regula la síntesis de

nucleótidos en B. subtilis (Tozzi et al., 2006), lo que podría indicar que la síntesis de

nucleótidos este afectada y que la represión de este gen esté relacionada con esta inhibición.

La localización de esta proteína podría ser en la membrana (según:http://subtiwiki.uni-

goettingen.de/wiki/index.php/Lists_of_genes,_proteins_and_RNAs)

Cuando las células de BG689 fueron sometidas al efecto tóxico de Y83C durante 15 min,

los genes cuya expresión se vieron disminuidas fueron 46. De estos, se seleccionaron los

siguientes genes:

Figura 22. Diagrama de Venny indicando el número de genes cuya expresión se vio afectada por Y83C

P á g i n a | 46

1. Genes involucrados en la glicólisis: yqeC, mtlD, glpK, glpD, yvkC, gutP, gntK, gntR y gntZ.

El producto de estos genes codifica proteínas relevantes en el metabolismo de carbohidratos.

Con la expresión de estos genes reprimida se inhibe la vía de las pentosas fosfato, la

producción de piruvato, la síntesis de DHAP (producción de fosfolípidos) y el transporte de

azúcares como manosa, manitol o glucitol.

2. Genes esenciales cuyos productos forman parte de la biosíntesis de fosfolípidos: yhdO y

plsX

3. Genes cuya expresión producen proteínas que participan en el metabolismo de ácidos

grasos: fabI, fabHA, fabHB y los esenciales acpA,accB, accC, fabF, fabG, fabD. Los productos

de estos genes participan tanto en los pasos de iniciación como los de elongación de las

cadenas hidrocarbonadas de lípidos.

4. Un gen que es esencial, y forma parte de la biosíntesis de peptidoglicano: glmS

5. Genes que forman parte de las rutas de degradación de pirimidinas; deoR, dra, pdp, y

nupC. La proteína NupC es transportadora de nucleosidos de pirimidinas extracelulares hacia

el interior de la célula (Figura 34). La proteína Pdp es una pirimidin-fosforilasa y Dra una

deoxiribo-aldolasa. Juntas estas proteínas están involucradas en el catabolismo de pirimidinas

En condiciones normales de crecimiento el producto del gen deoR, es el encargado de regular

la transcripción del operón, utilizando deoxiRib-5-P como molécula señal para des-reprimir el

operón. (Saxild et al., 1996, Tozzi et al., 2006). Cuando la glucosa y la deoxiRib-5-P se

acumulan en la célula funcionan como señales de disponibilidad de nucleósidos, y se dispara la

expresión del operon dra-nupC-pdp. En presencia de Zy83C, tanto la expresión del operón dra-

nupC-pdp como de deoR están reprimidas, indicando que la disponibilidad de nucleosidos o de

deoxiRib-5-P son las adecuadas. Es importante señalar, que el operón dra-nupc- está sometido

a represión catabólica cuando DeoR no regula su expresión (Zeng et al., 2000).

Categoría

Genes inducidos Genes reprimidos

5 min 15 min 5 min 15 min

Adaptación a condiciones atípicas 1 - 1 -

Bioenergética de membranas - 2 - -

Censores (traducción de señales) - - 1 -

Detoxificación 2 1 2 -

Esporulación - - 1 2

Genes desconocidos 7 6 2 5

Metabolismo de aminoácidos y moléculas relacionadas

- 1 - 2

Metabolismo de carbohidratos y moléculas relacionadas

- 4 1 10

Metabolismo de coenzimas y grupos prostéticos

- - 1

Metabolismo de lípidos - 2 - 11

Metabolismo de nucleótidos y ácidos nucleídos

1 4 1 2

Producción de antibióticos - 1

Regulación 2 1 2 6

P á g i n a | 47

Síntesis de ARN - - 1 -

Transformación/competencia 2 3 - -

Transporte/proteínas de unión 5 7 1 8

Total 20 32 14 46

2.2.6.2 Genes cuya expresión fue inducida por Y83C

Durante los primeros 5 min de expresión de la toxina, solo dos genes fueron considerados

relevantes para explicar el fenotipo observado y ambos están relacionados aunque

pertenezcan a categorías distintas:

1. Los genes pyrAB y pyrP: Estos genes forman parte del operón pir, el cual está regulado

de diversas maneras. La primera es indirecta es a través de la Rib-5-P (cuya producción está

reprimida por Y83C), molécula que al unirse a DeoR, desreprime el operón dra-pdp-nupC. La

segunda etapa en la regulación del operón pir se da a través de PyrR, que deja de reprimir

transcripcionalmente al operón si los niveles de UTP y GTP son bajos en la célula. En la

sección 2.2.5 se demostró que los niveles de GTP estaban disminuidos en presencia de Y83C

Tras 15 min de expresión de la toxina, de los genes inducidos caben destacar los siguientes:

gamA, gamP, pyrB, pyrE, pyrAB, pyrR, pyRP, relA, comGF, comGD y comGC

1. Los genes gamA y gamP están involucrados en la producción de D-fructosa 6- fosfato

(Fru-6- P), que podría acoplarse a la vía de degradación de la glucosa, minimizando de esta

manera el gasto energético que se produce en otras vías.

2. Los genes pyr y relA forman parte del metabolismo de ácidos nucleídos y nucleótidos. La

inducción de los genes del operón pir podría sugerir una disminución de pirimidinas intracelular.

Sumado a esto, la inducción del gen relA da como resultado la disminución de los niveles de

GTP, acompañado de un aumento en los niveles de ppGpp. El aumento de la expresión del

producto del gen relA y su respectivo efecto en los niveles de GTP pueden explicar el fenotipo

observado en la Figura 21, donde se ve una drástica disminución de la concentración de GTP

in vivo a los 15 min de expresar la toxina Y83C.

3. Los productos de los genes comGF, comGD y comGC forman parte de un pseudopili que

permite que el ADN exógeno entre en contacto con ComEA. La inducción de estos genes se

encuentra relacionada con bajos niveles de GTP y altos niveles de RelA. Podría ser una

estrategia de B. subtlis para intentar captar ADN externo, que pueda tener una copia del

antídoto () y de esta manera revertir el efecto toxico causado por .

3.1 Según los niveles de expresión de el efecto tóxico

producido en las células puede revertirse por la

expresión de la antitoxina 2

Como se mostró en la sección anterior la gran disminución en las unidades formadoras de

colonias mediada por la toxina estaría dada por la entrada de las células en un estado

bacteriostático. Si esto es así, si se inicia la síntesis de novo de la antitoxina 2, se debería ver

Tabla 6. Número de genes afectados por la expresión de Y83C.

P á g i n a | 48

una reversión del efecto de la toxina. Para corroborar esta hipótesis, se utilizó la cepa de B

subtilis BG1125 descrita en la sección 2.2.3De esta manera, sólo en presencia de IPTG (2

mM) la toxina se expresaba y era capaz de superar los efectos antagonistas de la antitoxina 2.

Como se muestra en la Figura 23, la expresión de la toxina era capaz de reducir la formación

de colonias con la misma eficiencia que Y83C y esta reducción en las UFC se podía revertir

cuando se inducía la síntesis de la antitoxina a distintos tiempos. Estos resultados confirmaron

que la inducción de reducía las UFC más de 1000 veces a los 30 min, y la inducción de 2 era

capaz de recuperar casi toda la capacidad de las células de formar colonias. Esto permitió

asumir que las células entraban en estasis en presencia de la toxina. Sin embargo, la

reversión del estado mediada por 2 es limitada, dado que una fracción constante de la

población no es capaz de revertir el efecto tóxico deEn el sistema que utilizaba la variante

Y83C existía una población, de alrededor del 20%, que presentaba defectos en la membrana.

Es posible, que la fracción de células que no pueden revertir el efecto de la toxina silvestre sea

equivalente a esta población, no obstante esta población celular es un poco mayor cuando se

induce la toxina silvestre (ver también Figura 28). Esto podía ser debido a que los niveles de

inducción de la toxina silvestre son mucho más altos que los de la variante Y83C (5 veces

más expresión de comparada con Y83C), que la vida media de es mayor que la de su

variante Y83C o debido a la sumatoria de ambos efectos.

Para determinar si la toxina también era tóxica en células de E. coli, y confirmar si mayores

niveles de la toxina producían un mayor efecto en la inhibición de la proliferación celular, se

construyeron dos sistemas de expresión de la toxina. En el primer sistema (Sistema en trans I),

se clonó bajo un promotor constitutivo (P) el gen de la toxina , en un plásmido de alto

número de copia (pCB298). Nuevamente, los intentos por obtener la toxina en ausencia de la

antitoxina no fueron exitosos, por lo que se clonó también la antitoxina, en un plásmido

compatible de bajo número de copia y bajo la regulación del promotor Lac dando origen al

plásmido pCB297. De esta manera, las células crecían solo en presencia de IPTG 1mM, de

forma que para inducir la represión de la antitoxina el cultivo se centrifugaba y se resuspendía

en medio fresco sin IPTG y precalentado a 37ºC. En el segundo sistema (Sistema en trans II)

se clonó la toxina silvestre bajo la expresión de un promotor regulable por arabinosa, en un

plásmido de alto número de copia (pCB635). Al igual que en el sistema anterior, se utilizó el

Figura 23. Una fracción de células puede revertir la inhibición de la proliferación mediada por en presencia de

2en B. subtilis. Células de BG1125 se crecieron en MMS7 con agitación y a 37ºC hasta fase exponencial, momento

en que el cultivo se dividió en dos partes. A una parte se le agregó IPTG 2mM para inducir la expresión de la toxina

(■) mientras que la otra parte se la agregó xil 0,5% para inducir la expresión de la antitoxina 2 (□). Se tomaron muestras

a los distintos tiempos y se plaquearon en LB. Para determinar si las células podían revertir el efecto de, en los

tiempos indicados con las flechas, se les agregó xil 0,5% para inducir la expresión de 2 a los cultivos en presencia de

IPTG y luego se plaquearon en placas de LB conteniendo también xil 0,5%.

P á g i n a | 49

plásmido pCB297 como fuente de . No obstante, en este caso no fue necesario lavar el IPTG

para inducir la represión de la antitoxina , ya que al tener la toxina clonada bajo un promotor

bien regulado como es el de arabinosa, fue posible crecer el cultivo adicionando solo 50M

IPTG. Con esta pequeña cantidad de IPTG la cantidades de 2 que se expresaban desde el

promotor Lac fueron suficientes para titular los escapes mínimos que se producían de , desde

el promotor Ara. De esta manera, se obtuvieron dos sistemas que expresaban distintos niveles

de toxina. El primero (pCB298 y pCB297) expresaba menor cantidad de toxina que en el

segundo (pCB635 y pCB297). Como muestra la Figura 24, con este experimento se confirmó

que el efecto producido por dependen de la concentración de la misma. Si se utiliza un

sistema en donde la expresión de la toxina es moderada (Figura 24A), la ventana durante la

cual el efecto tóxico puede revertirse es mayor (hasta 5hs). Sin embargo, cuando se utiliza un

sistema en donde los niveles de toxina son mucho mayores (Figura 24B, más de 10 veces de

expresión en pCB635 comparados con pCB298), se observa que la inhibición de la

proliferación se puede revertir en el 100 % de las células durante los primeros 30 min. Pasado

este tiempo, nuevamente se obtiene una población que no puede escapar de los efectos

tóxicos de .

En colaboración con el laboratorio del Dr. Rudi Lurz (Max-Planck-Institut fur Molekulare

Genetik, Alemania) se analizaron por medio de microscopia electrónica las células del Sistema

en trans II para determinar porque no eran capaces de revertir el efecto de la toxina luego de

inducir la expresión de 2. Así, se crecieron células de E. coli conteniendo los plásmidos

pCB635 y pCB297 en las mismas condiciones y se tomaron muestras a los 60 min de inducir la

expresión de la toxina. Como se puede ver en la Figura 25, luego de estar 60 min bajo la

acción de más del 50% de las células se habían convertido en fantasmas (células sin

citoplasma, n=276 ) o estaban en vías de serlo, indicando que al igual que en B. subtilis una

fracción de la población muere por lisis celular. El número de células que mueren dependen de

la concentración in vivo de

Figura 24. La fracción de células que pueden revertir el efecto tóxico de es menor si la concentración de

aumenta. Células de E. coli, se crecieron a 37ºC en MMM9, hasta alcanzar la fase exponencial. (A) El cultivo

conteniendo células con el sistema en trans I se centrifugó y resuspendió en medio fresco pre-calentado. A una parte

del cultivo se le agregó IPTG para mantener la expresión de 2(□, +) y a la otra parte no (■, flecha roja). En los

tiempo indicados con flechas negras se agregó IPTG 1mM para inducir la síntesis de novo de 2. (B) El cultivo

conteniendo células con el sistema en trans II se dividió en dos partes, una de ellas se dejó como control (□, -),

mientras que a la otra se le agregó arabinosa 0,5% para inducir la expresión de (■, +). Las flechas negras indican

los tiempos en los cuales se agregó IPTG 1mM para inducir la síntesis de novo de 2. En ambos casos, se tomaron

alícuotas y luego de realizar las diluciones adecuadas se plaquearon en placas de LB suplementadas con IPTG 1mM.

P á g i n a | 50

Parte IV. La toxina induce un aumento en la sensibilidad de células tolerantes a antibióticos.

4.1 La expresión de Y83C induce un aumento de la

sensibilidad a antibióticos.

Los resultados expuestos hasta el momento han demostrado que cuando una población de

células es expuesta a la toxina , siempre existe una pequeña fracción de células que son

capaces de tolerar el efecto tóxico. Sin embargo, si estas células son diluidas en medio fresco y

puestas nuevamente en contacto con la toxina, se obtiene el mismo número de células que son

insensibles a , mostrando un fenotipo similar a las células persistentes que se describieron en

la introducción en la sección 4.4.

Para determinar si la exposición de las células a la toxina estaba acompañada de la

producción de células persistentes (o tolerantes), como ya se postuló para otros sistemas TA

como HipAB o RelBE, se llevaron a cabo una serie de experimentos en donde se evaluó la

actividad inhibidora del crecimiento producida por la toxina Y83C en presencia y ausencia de

antibióticos con distintas dianas celulares: ampicilina (inhibe la síntesis de la pared celular),

eritromicina (inhibe la traducción), ciprofloxacina (inhibe la replicación) y triclosan (inhibe la

síntesis de lípidos).

Se crecieron células de BG689 hasta OD cercana a 0,2. Se adicionó el antibiótico

correspondiente en concentraciones próximas a 3 veces la concentración mínima inhibitoria

(MIC), y se indujo la expresión de la toxina (+ xil). Como controles se realizaron cultivos a los

que o bien solo se les agregó el antibiótico o solo se les adicionó el inductor de Y83C. Como

se puede ver en la Figura 26 se tomaron muestras a los 120 (A) y 240 min (B) luego de inducir

la expresión de la toxina, de agregar el antibiótico o ambos. En todos los casos, el efecto

producido por Y83C en presencia del antibiótico (cualquiera sea su diana) es mayor que el del

Figura 25. Microscopias electrónicas de células de E. coli sobre-expresando Células de E. coli conteniendo los

plásmidos pCB635 y pCB297 se crecieron hasta fase exponencial en MMM9 a 37ºC, momento en el cual el cultivo se dividió

en partes iguales y a una parte se le agregó arabinosa 0,5% para inducir la expresión de . A los 0 (A y B) y 60 (C y D) min

se tomaron muestras y se prepararon las células para su visualización como se detalla en materiales y métodos.

P á g i n a | 51

antibiótico solo o la toxina sola. El número de células tolerantes en fase exponencial siempre

es menor que en fase estacionaria, donde llegan a formar el 1% de la población total. Por este

motivo, también se realizaron los mismos ensayos pero en células de BG689 en fase

estacionaria (Figura 27). Nuevamente, el número de células que sobrevivieron al efecto de la

toxina junto con el del antibiótico es menor que cualquiera de ellos solos. Incluso, aunque el

efecto del antibiótico sobre las UFC sea más leve en fase estacionaria, el efecto conjunto

toxina-antibiótico sobre la viabilidad es siempre mayor que el efecto sólo antibiótico o sólo

toxina.

4.2 La expresión de no produce un aumento de

células tolerantes en presencia de antibióticos.

Era posible que parte de la actividad sinérgica producida por la toxina en presencia de los

antibióticos pudiera estar dada por el tipo de sistema de expresión que se estaba empleado, en

donde la expresión de la toxina Y83C no podía ser revertida (efecto crónico). Para demostrar

que el efecto producido por la toxina no estaba enmascarando la formación de células

tolerantes, se realizó el mismo ensayo pero utilizando esta vez células BG1125 (ver sección

2.2.3). De este modo, se crecieron células hasta fase exponencial (Figura 28) o fase

estacionaria (Figura 29) (sin xilosa, para minimizar la cantidad de antitoxina en la célula)

momento en el cual el cultivo se dividió en 8 partes iguales. A cada nuevo cultivo se le

adicionó IPTG (+), xilosa (+), el antibiótico correspondiente (Amp, Cip o Tri), o según

corresponda: IPTG + antibiótico (para estudiar la expresión de en conjunto con el antibiótico)

o xilosa + Antibiótico (para estudiar solo el efecto del antibiótico) como lo indican las Figuras 28

y 29. Nuevamente, en presencia de los antibióticos junto con la toxina silvestre, se observó

mayor muerte que con cualquiera de ellas solas. Sólo una pequeña fracción de células eran

capaces de sobrevivir (< 1.10-7

células/ml). De hecho el efecto conjunto toxina-antibiótico fue

mayor de lo esperado debido a la gran expresión de toxina desde el promotor Lac. Para

determinar si la disminución en las UFC en presencia de y el antibiótico generaba células

tolerantes al mismo, una alícuota de células que habían estado en contacto con la toxina y el

antimicrobiano se plaqueó en presencia de xilosa, el inductor de la antitoxina . Como se puede

ver en las Figuras 28 y 29, tanto en fase exponencial como en fase estacionaria, las células

lograron revertir el efecto de la toxina pero no del antimicrobiano. Esto indica que tanto la

exposición prolongada, como la temporal a la toxina no produce tolerancia a los antibióticos,

sino por el contrario, aumenta la eficacia de los mismos.

P á g i n a | 52

Figura 26. La toxina Y83C aumenta la eficacia de los antibióticos. Células de BG689 se crecieron en MMS7 a

37ºC hasta fase exponencial, momento en el cual el cultivo se dividió en 10 partes iguales y a cada una de ellas se le

añadió xil 0,5%, el antibiótico correspondiente (Amp: 3g/ml; Eri: 20g/ml; Cip: 4g/ml y Tri: 3,0 g/ml) o ambos según

se muestra en la grafica, y una alícuota se reservo como control. A los 120 min (A) o 240 min (B) se tomaron muestras

y se plaquearon en placas de LB.

P á g i n a | 53

Figura 27. La toxina Y83C aumenta la eficacia de los antibióticos también en fase estacionaria. Células de BG689

se crecieron en MMS7 a 37ºC hasta fase estacionaria, momento en el cual el cultivo se centrifugó y se resuspendió en

MMS7 fresco pre calentado. Luego, el cultivo dividió en 10 partes iguales y a cada una de ellas se le añadió xil 0,5%, el

antibiótico correspondiente (Amp: 3g/ml; Eri: 20g/ml; Cip: 4g/ml y Tri: 3,5g/ml) o ambos según se muestra en la

grafica, y una alícuota se reservo como control. A los 120 min (A) o 240 min (B) se tomaron muestras y se plaquearon en

placas de LB.

P á g i n a | 54

Figura 28. La exposición temporal a la toxina no induce tolerancia. Células de BG1125 se crecieron en MMS7 a

37ºC hasta fase exponencial, momento en el cual el cultivo se dividió en 8 partes iguales y a cada una de ellas se le añadió

IPTG 1mM, el antibiótico correspondiente (Amp: 3g/ml; Cip: 4g/ml y Tri: 3,5g/ml) o ambos y xil 0.5% según se muestra

en la grafica. A una alícuota solo se le agregó xil 0.5% y se uso como control. A los 120 min (A) o 240 min (B) se tomaron

muestras y se plaquearon en placas de LB.

P á g i n a | 55

Figura 29. La exposición temporal a la toxina no induce tolerancia, incluso en fase estacionaria. Células de

BG1125 se crecieron en MMS7 a 37ºC hasta alcanzar la fase estacionaria, momento en el cual el cultivo se centrifugó

y se resuspendió en MMS7 fresco pre-calentado a 37ºC. Luego, el cultivo se dividió en 8 partes iguales y a cada una

de ellas se le añadió IPTG 1mM, el antibiótico correspondiente (Amp: 3g/ml; Cip: 4g/ml y Tri: 3,5g/ml) o ambos y

xil 0.5% según se muestra en la grafica. A una alícuota solo se le agregó xil 0.5% y se uso como control. A los 120

min (A) o 240 min (B) se tomaron muestras y se plaquearon en placas de LB.

P á g i n a | 56

Parte V. El sistema como diana antimicrobiana.

El sistema de TA se encuentra entre otros en el cromosoma de bacterias patógenas como

S. pnemoniae, E. coli A7 o en plásmidos que otorgan resistencia a vancomicina en enterococos

(Van Melderen & Saavedra De Bast, 2009, Moritz & Hergenrother, 2007). Como se demostró

en la sección anterior, a diferencia de otras toxinas como HipA o RelE, la toxina no produce

un aumento en las células tolerantes a los antibióticos, sino que por el contrario aumenta la

eficiencia de los mismos. Sumado a esto, estudios anteriores permitieron determinar que la

expresión de la toxina no incrementaba la tasa de mutación celular, y que su diana debe

tener un carácter esencial para la célula ya que no ha sido posible aislar mutantes resistentes

al efecto tóxico de . Por estos motivos se seleccionó al sistema como un firme candidato

para desarrollar nuevas dianas antimicrobianas.

5.1 Identificación de los aminoácidos esenciales

para la interacción del complejo ∙

En colaboración con el Laboratorio Salvat (Barcelona), se utilizó modelado molecular de la

estructura cristalina del complejo para buscar una molécula que fuera capaz de romper la

interacción T∙A, de forma tal que liberase a la toxina y le permitiese reconocer su diana. Para

esto primero era necesario conocer los residuos más importantes en la interacción T∙A, lo que

permitiría modelar una molécula que interaccione con esos residuos y romper así la interacción

T∙A.

El complejo forma un heterotetrámero en donde un dímero de la antitoxina se encuentra

entre dos moléculas de la toxina (Figura 12). Para determinar qué aminoácido era más

importante en la interacción ∙, se llevaron a cabo estudios de modelado molecular. El análisis

mostró un total de 32 interacciones, donde 15 residuos pertenecían a y 17 a . Se

encontraron dos de las interacciones más importantes en la hélice A de la toxina , en donde

el residuo D18 interacciona con los aminoácidos Y22, K36 y K51 de y el residuo E22

interacciona con K51 y K54 de (Figura 30). También el estudio de modelado molecular dio

como resultado otras dos interacciones posiblemente menos importantes en la -hélice G y

fueron los residuos R158 y R165 de (Lioy et al., 2009). El primer paso para estudiar la

relevancia de estos residuos fue realizar mutaciones in silico en donde los residuos

seleccionados se cambiaron por una alanina (A). Así, se obtuvieron los complejos TA en donde

los aminoácidos D18, E22, R158 y R165 fueron cambiados por una A (D18A, E22A,

R158A y R165A, respectivamente). Como se puede ver en la Figura 31, el cambio del

aminoácido D18A, generó inestabilidad en el complejo ∙. Esta inestabilidad se traduce no

solo en un incremento en la distancia entre los carbonos (C de los residuos de Y22 y

D18A (Figura 31A, línea rosa), sino también entre los C de otros residuos ubicados en la

lejanía del residuo analizado como son los residuos 27N y R15 (Figura 31B, línea rosa). Sin

embargo, si se estudian las distancias entre los C de estos residuos en una simulación con el

aminoácido D18 silvestre (Figura 31, línea azul) o en una simulación donde se cambia el

residuo no relevante S48 por una A (Figura 31, línea amarilla), se ve que no se observa un

aumento en la distancia entre el par Y22 y D18 o entre 27N y R15, indicando la relevancia

del resido D18 para la estabilidad del complejo . Los mismos estudios realizados en el

resto de residuos identificados como relevantes, indicaron que solo los residuos D18 y E22

podían llegar a ser esenciales para la estabilidad de (Lioy et al., 2009).

P á g i n a | 57

5.2 Estudio in vivo de los mutantes en los residuos

esenciales en la interacción ∙

Como siguiente paso para corroborar las predicciones in silico, se seleccionó un método que

permitiera estudiar in vivo la interacción entre 2 y . Para esto se optó por utilizar el sistema de

Figura 30. Interacción de los residuos más relevantes para la estabilidad del complejo En color celeste se

muestra la hélice de y la posición de los residuos D18 y E22, y sus interacciones con los residuos K36, K51,

Y22 y K54 de las hélices de la antitoxina (en color azul)

Figura 31. Simulaciones in silico de las distancias entre los C de los residuos de y en presencia del

mutante D18A. Por modelado molecular se estudió la distancia entre los residuos D18 y Y22 (A) y entre los

residuos N27 y R15 (B) en el complejo silvestre (línea azul), en el complejo en donde D18 fue

reemplazado virtualmente por una alanina (D18A, línea rosa) y en el complejo en donde S48 fue reemplazado

virtualmente por una alanina (S48A, línea amarilla). Las simulaciones se realizaron en condiciones constantes de

temperatura y volumen, las distancias se midieron en Å.

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transferencia de energía de bioluminiscencia (BRET). La transferencia de energía se produce

cuando una proteína bioluminiscente, en este caso la Luciferasa de Renilla (Luc), en presencia

de un substrato es capaz de generar luz que luego será utilizada por una molécula aceptora

para fluorescer, en este caso la proteína verde fluorescente o GFP (del inglés- green

fluorescence protein). Las proteínas Luc y GFP no interaccionan naturalmente a menos que se

fusionen a ellas proteínas que si lo hagan. Si las proteínas fusionadas interaccionan, y Luc y

GFP se encuentran lo suficientemente cercanas (hasta 100 Å de distancia), Luc puede excitar

a GFP y ésta ultima emitir fluorescencia. De esta forma, se realizaron fusiones

transcripcionales de la proteína GFP a , por el extremo carboxilo terminal (:GFP) y de la

proteína Luc a por el extremo amino terminal (:Luc). Para estudiar si los aminoácidos D18 y

E22 de eran relevantes en la interacción con la antitoxina , se decidió mutar estos residuos a

alanina. Para esto se seleccionó una variante no tóxica de , la K46A, en donde el residuo

lisina 46 fue cambiado por una alanina. La lisina 46 se encuentra en el motivo Walker A que es

esencial para la toxicidad de pero no para la interacción con 2 (Meinhart et al., 2003). Fue

vital realizar el estudio de las interacciones entre 2 y con esta variante no tóxica, dado que

mutaciones en los residuos relevantes para la estabilidad del complejo TA podrían dejar libre a

la toxina y ésta, inhibir el crecimiento celular. Se construyeron los mutantes D18A-K46A:GFP y

E22A-K46A:GFP, así como también :Luc, en donde tanto el gen de :luc como el de :gfp o

sus variantes estaban bajo el control del promotor de la proteína .

Como primer paso para saber si la fusión :GFP no afectaba la actividad de la proteína, se

clonó este gen bajo el control de un promotor constitutivo (Pcat, promotor de cloranfenicol), y al

gen de la antitoxina bajo el control de un promotor inducible por IPTG (Plac). Como se muestra

en la tabla 7 cuando células de E. coli en crecimiento exponencial que habían crecido en

presencia de IPTG (+), se lavaron y resuspendieron en medio fresco sin IPTG se observó que

más del 99 % de las células perdían la capacidad de formar colonias tanto si se utilizaba la

proteína silvestre o la variante :GFP. Esto demostró que la actividad de la toxina fusionada a

la proteína verde fluorescente era la misma que la de la toxina silvestre, indicando que la

fusión a GFP no afectaba el plegamiento de , ni su actividad.

A continuación se evaluó la interacción de los complejos formados por las proteínas

:Luc,:GFP (); :LucK46A:GFP(-K46A); :Luc, K46A-D18A:GFP (- D18A-K46A);

:LucE22A-K46A:GFP (-E22A-K46A) células de E. coli (Figura 32), por medio de la

cuantificación de señal de BRET (relación 515/410, ver materiales y métodos). Una mutación

en un aminoácido relevante para la interacción ∙ daría una caída en la señal de BRET. Como

se esperaba, la mutación D18A resultó en una caída dramática de la señal de BRET, sin

Genes codificados en los plásmidos

Presencia de IPTG

UFC/ml (%)

+ Si (+) 100

+ No (-) 0,04

+ :gfp Si (+) 100

+ :gfp No (-) 0,03

Tabla 7. Efecto de :GFP inhibe la proliferación celular en E. coli. Las celulas se crecieron en presencia de

IPTG (+) y cuando llegaron a fase exponencial el cultivo se lavó y resuspendió en medio fresco con o sin IPTG (+

y –). A las dos horas se tomaron muestras y se plaquearon en LB.

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embargo, el cambio del aminoácido E22 por alanina no dio una fuerte disminución en dicha

señal, lo que indicaría su poca relevancia en la estabilidad del complejo TA. Esto significa que

la molécula que se diseñe para romper la interacción entre 2 y deberá tener como diana la

zona donde se encuentra el residuo D18, secuestrando a la antitoxina 2 y dejando libre a

para que ejecute su efecto tóxico.

Figura 32. Ensayos in vitro de BRET. Se obtuvieron extractos de células de E. coli conteniendo los plásmidos: luc-gfp, -

(-luc, -gfp), -K46A (-luc, K46A-gfp), -D18A-K46A (-luc, D18A K46A-gfp) y -E22A-K46A (-luc, E22A K46A-gfp)

y se cuantificó la señal de BRET.

P á g i n a | 60

Discusión

P á g i n a | 61

1. La segregación del plásmido pSM19035 es muy eficiente

El plásmido pSM19035 es de amplio rango de hospedador dentro del Filo Firmicutes, de bajo

número de copia (1 a 3 copias por célula) y se propaga manera muy estable. Esta estabilidad

se debe al uso de 4 estrategias: (i) Control de la replicación de manera ajustada, (ii)

maximización del número de copias para su distribución al azar, (iii) utilización de un sistema

de partición activa y (iv) Utilización de un sistema de toxina antitoxina. Estas estrategias se dan

de manera organizada y coordinada en la célula, siendo la proteína 2 la coordinadora principal

de estas funciones. En la actualidad, se encuentran ampliamente documentadas las funciones

de 2 en el control de la replicación o el número de copia del plásmido, así como también el

papel en la correcta segregación del sistema de partición activa (Pratto et al., 2008, de la Hoz

et al., 2000), sin embargo, no se había caracterizado hasta el momento si existía una conexión

entre el sistema de partición activa y el sistema de TA. La idea de que los sistemas de

estabilidad de los plásmidos funcionan en conjunto minimizando el coste biológico de tener un

producto tóxico no es nueva, ya que se propuso por primera vez para el sistema de partición

activa compuesto por las proteínas ParA y ParB de P1 y el sistema de TA MvpAT aislado del

plásmido de virulencia de Shigella flexneri (Brendler et al., 2004). En este trabajo se demostró

que células de E. coli que tenían un plásmido con el sistema de TA tenían un tiempo de

duplicación más largo que aquellas que además de tener le sistema MvpAT tenían el sistema

de partición activa. Esto se debía a que el sistema de partición activa aseguraba la correcta

segregación del plásmido de manera que todas las células hijas tenían una copia del mismo y

el sistema TA no se activaba. En el presente trabajo, se ha demostrado una interacción directa

entre el sistema de partición activa, , y el de TA, En este caso, se observó que la proteína

ParA () aumentaba la afinidad de la proteína ParB (2), y que lo hacia de manera

independiente de la unión a nucleótido y ADN. El hecho de que la actividad ATPasa de la

proteína ParA sea necesaria para la correcta segregación del plásmido (Pratto et al., 2008) y

no para la interacción con la proteína ParB indica que estas dos actividades son

independientes. De esta manera, se pueden proponer 2 funciones al sistema de partición

activa. La primera, asegurando la correcta segregación del plásmido, haciendo que cada célula

hija reciba al menos una copia del mismo, y evitando así, la inhibición del crecimiento mediada

por . La segunda, asegurando un control estricto de la concentración de toxina y antitoxina de

manera que no se produzca la inhibición del crecimiento de células que tienen una copia del

plásmido. Sin embargo, a pesar de estos resultados, aun es necesario conocer más detalles

acerca de la regulación del sistema TA, entre otras cosas determinar si existe una interacción

proteína-proteína entre el complejo inocuo y 2 o 2 y determinar si el sistema de TA regula

de alguna manera el promotor P, ya que se demostró que 2 no se encarga de su regulación

(de la Hoz et al., 2000)

2. Caracterización fisiológica del efecto tóxico de

Los experimentos realizados para caracterizar la función de in vivo, demostraron que la

toxina es capaz de inhibir más de 10.000 veces la UFC, con la muerte de una fracción de la

población. Recientemente se demostró que cuando el sistema MazEF se induce como

consecuencia de la acción del antibiótico espectinomicina, no solo se inhiben la síntesis de

proteínas como consecuencia de la actividad tóxica de MazF, sino que también se induce la

síntesis de proteínas de bajo peso molecular. Entre las proteínas inducidas se encuentran

proteínas de muerte (ClpP, SlyD o YfiD) y proteínas de superviviencia (SoxS, SoxR o DeoC).

P á g i n a | 62

De esta forma se propuso que una fracción de células sobrevive a expensas de la muerte de

otra parte de la población (Amitai et al., 2009). En presencia de la toxina se observó una

disminución en la síntesis de ADN, ARN y proteínas. Sin embargo, esta disminución no fue

total, ya que en los ensayos realizados se observó que aun había incorporación de 3H-timidina,

3H-uracilo y

3H-leucina después de 60 min bajo la exposición de la toxina (Figura 19). Más aún,

el análisis del proteoma de B. subtilis no demostró la inhibición selectiva de ninguna proteína

(Figura 18). Estos resultados nos llevaron a estudiar el transcriptoma de B. subtilis, para poder

identificar si existía alguna ruta metabólica especialmente inducida o reprimida. Los resultados

obtenidos a partir del análisis de genes reprimidos en respuesta a la toxina Y83C mostraron

genes involucrados principalmente en tres tipos de rutas metabólicas: en el metabolismo de

carbohidratos, en el metabolismo de nucleótidos y en el metabolismo de lípidos. Los productos

de los genes reprimidos están involucrados en procesos esenciales para la bacteria, sin

embargo, no son suficientes para inducir muerte celular de toda la población. La represión de

genes involucrados en la glícolisis tales como yqeC, mtlD, glpK, glpD, yvkC, gutP, gntK, gntR y

gntZ (Figura 33),

podría ser una estrategia de la célula para minimizar el gasto energético que supone el

metabolismo de carbohidratos, dejando a las células con un metabolismo mínimo o de

mantenimiento hasta que la situación de estrés se revierta. Es importante destacar que el

producto del gen yqeC forma parte de la vía de las pentosas fosfato. Esta vía es esencial para

la síntesis de nucleótidos, indicando que es probable que esté reprimida. El producto de los

genes reprimidos que estaban involucrados en el metabolismo de ácidos nucleídos formaban

parte de un operón involucrado en la síntesis de pirimidinas (dra, pdp y nupC, algunos de los

productos de estos genes se puede ver en la Figura 34). Sorprendentemente, el represor de

este operón también estaba reprimido, el producto del gen deoR. La represión de DeoR no es

Figura 33. Principales vías involucradas en la glicolisis. En rojo se muestran las enzimas que son codificadas por

genes esenciales y en azul aquellas cuyos genes que las codifican no son esenciales. Con una cruz roja se

representan los productos de los genes que fueron reprimidos por la toxina Y83C

P á g i n a | 63

contradictoria con la represión del operón, ya que cuando disminuyen los niveles de DeoR, el

operón está sometido a la represión catabólica mediada por las proteínas CcpA y HPr-

fosforilada que se unen a las regiones CRE que se encuentran en el promotor del operón (Zeng

et al., 2000). Esta represión seria una manera indirecta de confirmar que los niveles de UTP, al

igual que los de GTP y ATP están disminuidos (Figura 21 y Figura 34), ya que el

producto de los genes nupC y pdp están involucrados en la síntesis de pirimidinas (la proteína

NupC se encarga de transportar timidina y uridina a la célula). Los genes involucrados en el

metabolismo de lípidos forman parte de las rutas de biosíntesis de ácidos grasos y fosfolípidos

y mucho de ellos son esenciales (Figura 35). Esto podría indicar que la muerte de una fracción

de las células se dé por medio de la pérdida del potencial de membrana, explicando así que

una parte de la población tratada con Y83C se tiña con IP (Figura 16B y Tabla 5). En cuanto a

los genes inducidos, a diferencia de MazF, no se han encontrado indicios de que sus productos

estén involucrados en la muerte celular. No se encontró aumentada la síntesis de proteínas

involucradas en ROS, lo que confirma nuevamente que a diferencia de MazF, la toxina no

induce senescencia ni inducción del sistema SOS (Lioy et al., 2006). De los genes inducidos

por la toxina los más importantes de destacar son aquellos involucrados en la síntesis de

nucleótidos pyrR, pyrP, pyrAB, pyrB y pyrE (alguno de ellos pueden verse en la Figura 34).

Según los niveles de uridina y guanosina PyrR es capaz de reprimir o des-reprimir la expresión

de los genes del operón pir. Se demostró en B. subtilis que GTP es probablemente el

modulador fisiológico más importante, seguido de UTP. De esta forma los niveles de GTP y

UTP son una señal que utiliza la célula para determinar que el resto de factores necesarios

para la síntesis del ADN y ARN se encuentran normales, es decir, que la fuente de carbono,

nitrógeno y fuentes de energía son suficientes.

Figura 34. Principales vías involucradas en la síntesis de pirimidinas. En rojo se muestran las enzimas que son

codificadas por genes esenciales y en azul aquellas cuyos genes que las codifican no son esenciales. Con una cruz roja

se representan los productos de los genes que fueron reprimidos por la toxina y con una flecha verde aquellos que

fueron inducidos por Y83C

P á g i n a | 64

Por esto, si alguna de estas dos moléculas se encuentra por debajo de los niveles normales, la

relación GTP/UTP no es la óptima, y se des-reprime el operón. Esta inducción de los genes del

operón pir se puede explicar en este caso por los bajos niveles de GTP desde momentos

tempranos en la inducción de la toxina (Figura 21). Esta reducción en los niveles de GTP

puede o no ser un efecto directo de la acción de la toxina, ya que la inducción del gen relA,

cuyo producto genera (p)ppGpp a partir de GTP, podría estar involucrado en esa disminución.

El gen relA puede inducirse en repuesta al estrés producido por la toxina , al igual que lo hace

en respuesta al estrés nutricional. Además, la inducción del gen relA también coincide con la

Figura 35. Principales vías involucradas en la síntesis de Lipidos. En (A) se muestran las vías principales de la

síntesis de fosfolipidos y en (B) de ácidos grasos. En rojo se muestran las enzimas que son codificadas por genes

esenciales y en azul aquellas cuyos genes que las codifican no son esenciales. Con una cruz roja se representan los

productos de los genes que fueron reprimidos por la toxina Y83C

A

B

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represión del gen homólogo a mazG, yvdC. La función principal de MazG en E. coli es la de

disminuir los niveles de (p)ppGpp aumentando el período de supervivencia de las células bajo

estrés nutricional. Robert Switzer y colaboradores explicaron que si los niveles de GTP están

reducidos, y no los de UTP, se produciría una mayor represión del operón pir. Por lo que estos

resultados indicarían que los niveles de UTP también se encuentran reducidos, ya que se

observa una inducción del operón (Jorgensen et al., 2008).

3. La antitoxina 2es capaz de recuperar la actividad metabólica de las células que estaban bajo el efecto de .

Si se compara el efecto de la toxina sobre las células con el que ejercen otros sistemas TA,

se puede ver que el fenotipo producido es similar al observado para las toxinas de los sistemas

RelBE y MazEF, ya que al igual que en estos sistemas, la antitoxina 2 es capaz de revertir el

efecto tóxico producido por (Pedersen et al., 2002). Esta reversión del efecto tóxico confirma

que las células se encontraban en un estado bacteriostático, a la espera de que la situación de

estrés se revierta. Estos resultados son indicativos de que la interacción de la toxina con su

diana debe ser reversible. La reversión del efecto tóxico se observo tanto en células de E. coli

como de B. subtilis. Sin embargo, el grupo de Anna Engelberg-Kulka demostró que la reversión

del efecto tóxico de MazF era limitada, llegando a un punto de no retorno en donde la toxicidad

mediada por la expresión de MazF no podía ser revertida por MazE (Amitai et al., 2004).

Resultados utilizando la cepa BG1125, que presenta alto niveles de expresión de la toxina ,

demostraronn que el efecto tóxico podía ser revertido hasta 4 hs post inducción de la toxina

(Figura 23), aunque había una fracción de la población que no podía recuperarse. En E. coli, se

demostró que esta ventana de tiempo aumentaba hasta 5 hs cuando se utilizaba un promotor

constitutivo, expresando menores niveles de la toxina (Figura 24) (Lioy et al., 2006). Todavía no

se ha demostrado, por problemas metodológicos, si ese punto de “no retorno” se puede

detectar en presencia de concentraciones fisiológicas de la toxina .

4. La toxina podría modificar el pool de nucleótidos induciendo un estado bacteriostático.

Todos los resultados expuestos en este trabajo, junto con el análisis de la estructura cristalina

de la toxina, así como también el estudio de mutantes en el sitio catalítico, indicarían que

estaría modificando el pool de nucleótidos. Esta modificación se podría dar por la fosforilación o

desfosforilación del sustrato, generando variantes de nucleótidos que sean tóxicos para la

célula. Esto, explicaría porque sucesivos intentos de encontrar la diana ya sea por medio de la

obtención de mutantes resistentes a la toxina o a través de ensayos de cross-linking no fueron

exitosos. De esta forma, la toxina modificaría los nucleótidos afectando desde la replicación

hasta la síntesis de carbohidratos, generando un efecto pleitropico en la célula. Sin embargo

esta hipótesis aun debe ser confirmada. Por lo tanto, el efecto producido por la toxina es tal

que induce un estado bacteriostático en gran parte de la población. Este estado se ve

caracterizado por una disminución en el metabolismo, priorizando solo la síntesis de rutas

metabólicas de mantenimiento. La síntesis de ADN, ARN y proteínas se encuentra detenida

esperando que la situación revierta por la síntesis de novo de 2.

P á g i n a | 66

5. La toxina induce un estado bacteriostático y podría disparar la muerte de una pequeña fracción de la población, que asegurará la supervivencia del resto, pero no parece inducir senescencia

Como se expuso en la parte II de resultados, los sistemas de TA fueron relacionados con

diversas teorías (sistemas de muerte programada, sistemas que inducen células durmientes o

persistentes o sistemas que inducen senescencia). En este trabajo se llevaron a cabo una serie

de experimentos para determinar cuál era el rol que la toxina realizaba en in vivo. Los

resultados obtenidos permitieron descartar la hipótesis de que estaba involucrada en la

generación de senescencia, ya que no se pudo demostrar que la toxina estuviera involucrada

en la formación de ROS. En cuanto a su papel como parte de un sistema de muerte celular

programada, se puede decir que si bien la toxina induce la muerte de una fracción de la

población (lisis del 20 % de las células junto con una fracción que no es capaz de revertir el

efecto tóxico), no se puede descartar que esto sea debido a los niveles de toxina con los que

se realiza el experimento, ya que por dificultades técnicas, no es posible trabajar con el sistema

en condiciones fisiológicas. Por lo tanto, es probable que el papel de dentro de la fisiología

celular es el de inducir un estado bacteriostático. Este estado, se revertiría (o al menos la

mayor parte de la población sería capaz de hacerlo) en presencia de la síntesis de novo de 2.

Fisiológicamente, esto significa que si alguno de los otros sistemas de estabilidad del plásmido

fallase, sería el sistema TA quien detendría el crecimiento celular, dejando a las bacterias en

un estado de arresto o estasis. Este estado, se perpetuará tanto como sea necesario, hasta

que luego de un tiempo en arresto inevitablemente las células morirán, si no logran recuperar el

plásmido u obtener, al menos, una fuente de síntesis de novo de 2. Este modelo contrastaría

con la idea de que los sistemas TA de plásmidos inducen la muerte post-segregacional de las

bacterias que lo pierden, aunque esto no es así. El hecho de parar el crecimiento a una célula

que ha perdido el plásmido aportará una gran ventaja al resto de células que no lo perdieron,

de forma tal que en unas pocas duplicaciones pueden llegar a colonizar el nicho. Las células

que entran en arresto y no son capaces de captar nuevo ADN que sintetice la antitoxina2 de

novo, serán utilizadas como fuente de nutrientes por el resto de bacterias que seguirán

creciendo.

6. La toxina como diana antimicrobiana

6.1 La toxina aumenta la eficacia de los antibióticos sin

producir células persistentes.

Las células persistentes son células que no crecen, ya que se encuentran en un estado

“durmiente”, y cuyo fenotipo no pasa de generación en generación. Recientemente varios

trabajos han involucrando a los sistemas TA en la generación de células persistentes o

tolerantes a los antibióticos (Keren et al., 2004). Esta hipótesis se demostró para algunas

toxinas, pero en especial para el sistema HipBA, que fue el primero en describirse como el

responsable de producir un fenotipo híper persistente en E. coli (Moyed & Bertrand, 1983,

Korch et al., 2003, Correia et al., 2006). Se propuso que el modo de generación de células

P á g i n a | 67

persistentes se producía cuando, por variaciones estocásticas, los niveles de toxina

aumentaban. De esta manera, cuando la toxina se unía a su diana, afectaba la diana del

antibiótico, de forma que se volvía no accesible al mismo. Por ej., las toxinas HipA ó RelB

inhiben la traducción, de forma que los antibióticos que también actúan sobre este proceso

celular no tendrían efecto y darían lugar a células tolerantes al antibiótico (Figura 5). Además la

inhibición de la traducción produce también una inhibición en la síntesis de ADN y en la síntesis

de la pared celular, explicando porque la gran mayoría de los antibióticos dejan de ser eficaces.

Como la inhibición de la síntesis de proteínas mediadas por la toxina no es del 100%,

nuevamente debido a un proceso estocástico, se vuelve a sintetizar la antitoxina. De esta forma

se revierte el efecto tóxico de la toxina y se logra la supervivencia de un mayor número de

células, que habían sido insensibles al efecto del antibiótico (Keren et al., 2004). Algunos años

más tarde se encontró que no solo el efecto de las toxinas producían un aumento en la

persistencia a antibióticos, sino que también la sobre-expresión del producto de otros genes

tales como plsB y glpD (síntesis de fosfolipidos), así como también los niveles de glicerol-3-

fosfato estaban involucrados en la formación de células persistentes (Spoering et al., 2006). Sin

embargo, los ensayos realizados para determinar si la toxina participaba en la producción de

este tipo de células demostraron que por el contrario, no solo no induce tolerancia a los

antibióticos sino que además aumenta la eficacia de los mismos. Estos resultados, también se

confirmaron con el patrón de genes afectado por la toxina, que fueron completamente distintos

a los que se observaron en las células persistentes. De hecho, los genes plsX (homólogo a

plsB de E. coli) y glpD se encuentran reprimidos en presencia de la toxina . Esto indica que si

bien la toxina induce un estado bacteriostático en la mayoría de la población, éste es

diferente al que manifiestan las células persistentes. Esta diferencia puede deberse a la

naturaleza de su diana, ya que los sistemas en los que se describió el fenotipo de persistentes

tienen como diana la inhibición de la síntesis de proteínas (aunque a través de mecanismos

distintos). La diana de la toxina es aun desconocida, pero gracias a los estudios realizados en

este trabajo se sabe que no es la traducción, ni la transcripción ni la replicación (al menos no

directamente). Por esto, se puede proponer que el mecanismo para el aumento de la

sensibilidad a los antibióticos mediado por se debe a que la diana de es distinta a la del

antibiótico utilizado, y por esto no genera tolerancia (Figura 36). No obstante, aunque se hayan

probado representantes de las familias más usadas de antibióticos (un inhibidor de la síntesis

de la pared celular, un inhibidor de la síntesis de lípidos, un inhibidor de la síntesis de proteínas

y un inhibidor de la replicación) no puede descartarse el hecho poco probable de que el uso de

otros antibióticos en conjunto con la toxina produzcan persistencia, ya que existe una gran

diversidad de antibióticos con distintas dianas pero que inhiben los mismos procesos

biológicos, que aun no fueron probados. Una vez que la diana de sea conocida, es necesario

volver a evaluar esta actividad, utilizando antibióticos que inhiban el crecimiento celular de la

misma manera que lo hace la toxina.

Figura 36: Modelo de sobre la generación de células sensibles a antibióticos. En condiciones normales, se

sintetizan suficientes cantidades de y , que forman un complejo inocuo muy estable. Cuando por razones estocásticas

se produce un exceso de toxina (situación señalada por un rayo), la toxina queda libre y une su diana. En presencia de

un antibiótico, el aumento de la sensibilidad al mismo puede explicarse si las dianas de y del antibiótico son

P á g i n a | 68

6.2 Diseño de nuevas dianas antimicrobianas.

Muchos autores han propuesto el uso de los sistemas TA como noveles dianas

antimicrobianas. Siempre se ha manifestado el interés de identificar los aminoácidos más

importantes en la interacción T∙A para desarrollar moléculas que sean capaces de romper

dicha interacción. La idea se basa en dejar libre a la toxina de forma que aun pueda

interaccionar con su diana y de esta forma inhibir el crecimiento de las bacterias que lleven el

plásmido. Esta estrategia también puede extenderse a aquellos sistemas TA que se

encuentran en el cromosoma (Nieto et al., 2006, Moritz & Hergenrother, 2007, Williams &

Hergenrother, 2008). En este, trabajo, a partir del modelado molecular del cristal se

identificaron las interacciones más importantes para la estabilidad del complejo. De esta

manera se predijeron 4 residuos de como los más importantes para la interacción con

(D18, E22, R158 y R165). De estas 4 interacciones se demostró por medio de ensayos de

BRET que la del residuo D18 con los aminoácidos K36 y K51 de era la más importante

(Figura 31 y 32). Este ensayo no solo permitió validar las predicciones in silico, sino que

también permitió desarrollar un sistema capaz de permitir el procesamiento y la evaluación de

un gran número de moléculas con potencial antimicrobiano usando HTS (del inglés- High

throughput screening). De esta manera, la molécula que se diseñe para inhibir la interacción de

la toxina con la antitoxina , debera “imitar” a la toxina, de forma tal que el nuevo producto

que se forme (antitoxina-molécula) deje libre a la toxina y ésta pueda ejecutar su efecto tóxico.

Para esto, la molécula deberá imitar la región cercana al resido D18 y E22, interaccionando

con los residuos de K36, K51, Y22 y K54 (Figura 30). En colaboración con el Laboratorio

Salvat (Barcelona) se evaluaron más de 49.000.000 de péptidos diseñados específicamente

para desestabilizar al complejo . Si bien el complejo pudo desestabilizarse,

lamentablemente no se logró identificar un péptido responsable de dicha desestabilización, sino

que se observó que un grupo de dos o más péptidos fueron responsables de la

desestabilización del complejo (Lioy et al., 2009). Estos resultados demostraron que aunque el

complejo puede ser desestabilizado in vitro, se necesitan evaluar aun mas compuestos

hasta que se pueda identificar una única molécula que tenga éxito en la desestabilización del

complejo TA. Una vez que se tenga esa molécula se podrá trabajar para aumentar la eficiencia

de los antibióticos.

Conclusiones

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Conclusiones

Las conclusiones que se extrajeron de este trabajo son las siguientes:

1. La proteína 2 del sistema de partición activa, trabaja en conjunto con la proteína 2 para

asegurar la correcta regulación del operón , de forma tal que la proteína 2 es capaz de

aumentar la afinidad de la proteína 2 por la región promotora del operón más de 4

veces y lo hace de manera independiente de la unión a ADN y nucleótido. Esta actividad no

solo minimiza el coste biológico de tener un sistema de TA sino que también permite una

correcta regulación de la expresión del sistema TA.

2. La expresión de la toxina en células de B. subtilis y E. coli inhibe la proliferación celular,

induciendo un estado bacteriostático, junto con la lisis de una pequeña fracción de la

población.

3. El efecto tóxico de se caracteriza por la inhibición de la síntesis ADN, ARN, proteínas y

purinas. El análisis de los genes cuya expresión se encuentran modificados por la toxina

mostró que 8 genes son esenciales y forman parte de rutas biosintéticas de lípidos. También

se encuentran modificados genes involucrados en la biosíntesis de carbohidratos y ácidos

nucleicos. Alguno de los genes inducidos por la toxina sugiere que los niveles de UTP

también se encuentran disminuidos.

4. El efecto inducido por la toxina puede ser revertido por la síntesis de novo de la

antitoxina tanto en B. subtilis como en E. coli. Esta reversión depende de la concentración

de toxina, ya que si los niveles de toxina son bajos la ventana de tiempo durante el cual el

efecto es reversible es mayor.

5. La toxina no induce un aumento de células persistentes en B. subtilis, sino por el

contrario es capaz de aumentar la sensibilidad al antibiótico.

6. Por medio de modelado molecular se identificaron los residuos D18 y E22 como los

más importantes para la estabilidad del complejo . Por medio de ensayos de BRET se

validó la predicción demostrando que los mutantes D18A y E22A forman un complejo

inestable con la antitoxina

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Bibliografía

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Bibliografía

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Anexo I

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Anexo I

1. Genes Afectados por la expresión de Y83C

A continuación se describirán los genes cuya expresión se vio afectada por la síntesis

de Y83C:

Genes cuya expresión fue reprimida 5 min después de inducir Y83C

Categoria Gen Función Fold

Change valor P

Adaptación a condiciones atipicas

yvdC Pirofosfohidrolasa

(perteneciente a la súper familia MazG)

-1,75 0,1011

Desconocida ywmF Posible proteína integral de

membrana interna -1,86 0,0610

Desconocida ypfB Desconocida -1,89 0,1656

Detoxificación yyaR Estreptotricina aceil-transferasa -1,87 0,1833

Detoxificación ygaF Proteína antioxidante

específica de tiol -1,72 0,0963

Esporulación ywcE Proteína necesaria para la correcta morfogénesis y

germinación de la espora -1,83 0,0396

Metabolismo de nucleótidos y ácidos

nucleicos pdxS

Liasa de la biosintesis de piridoxal (sintesis de vitamina

B6) -1,74 0,1290

Metabolismo de carbohidratos and moléculas

relacionadas yqeC

6-fosfogluconato deshidrogenasa (vía de las

pentosas fosfato) -1,83 0,1165

Metabolismo de coenzimas and grupos

prostéticos moaE

Factor de conversión de molibdopterina (subunidad 2)

-1,86 0,0355

Regulación rok Represor de comK -2,32 0,0209

Regulación degU

Regulador de respuesta de dos componentes involucrado en

enzimas degradativas y regulación de la competencia

(sacB, degQ, comK)

-1,95 0,2089

Sensor (traducción de señales)

yvfT Sensor histidina quinasa de 2-

componentes [YvfU] -1,78 0,0187

Síntesis de ARN ytqI Oligoribonucleasa, 3´, 5´-nucleotidasa bisfosfato

-1,89 0,0185

Transporte/proteínas de unión

yqeW Similar a un Na+/Pi co-

transportador -1,73 0,0991

Genes cuya expresión fue inducida 5 min después de inducir Y83C

Categoría Gen Función Fold

Change valor P

Adaptación a condiciones atípicas

ywtB Biosíntesis de poliglutamato

capsular 1,90 0,1361

Desconocida ysmA Similar a proteínas

desconocidas 1,78 0,0999

P á g i n a | 78

Desconocida yqgO Desconocida 2,02 0,1202

Desconocida ypzE Desconocida 2,61 0,1927

Desconocida yuxK Desconocida 1,91 0,2007

Desconocida yrpD Posible lipoproteína 2,15 0,2103

Desconocida yvbG Posible proteína integral de

membrana interna 1,80 0,2201

Desconocida ylaH Desconocida 1,92 0,0152

Detoxificación yceE Proteína de resistencia a telurio 1,87 0,0466

Detoxificación tetL Péptido líder de resistencia a

tetraciclina 1,81 0,1658

Metabolismo de nucleótidos and ácidos

nucleicos pyrAB

Carbamoil-fosfato sintetasa (subunidad

catalítica)(biosíntesis de pirimidinas)

1,82 0,2089

Regulación yisR Regulador transcripcional

familia (AraC/XylS) 1,75 0,0229

Regulación ybdJ Similar a un regulador de

respuesta de dos componentes [YbdK]

1,84 0,2124

Transformación/competencia

comGE Maquinaria de transporte de

ADN 2,34 0,1266


comGA gen de competencia tardío 2,12 0,2055

Transporte/protéinas de unión

yfiN ABC transporter (proteína de

unión a ATP) 1,84 0,0353

Transporte/protéinas de unión

ythQ Posible ABC transporter 1,73 0,0737


yfiZ Permeasa de transporte de

dicitrato de hierro(III) 1,77 0,0777


oppC

oligopeptido de transportador ABC (permeasa) (iniciación de la esporulación, desarrollo de

competencia)

1,97 0,1194


pyrP Uracil permeasa (biosíntesis de

pirimidinas) 2,20 0,2006

Genes cuya expresión fue reprimida 15 min después de inducir Y83C

Categoría Gen Función Fold

Change valor P

Metabolismo de aminoácidos y moléculas

relacionadas glmS

L-glutamina-D-fructosa-6-fosfato amidotransferasa

-1,82 0,0318

Metabolismo de aminoácidos y moléculas

relacionadas yrbE Metabolismo de opinas -1,73 0,0683


relacionadas glpK

Glicerol quinasa (utilización de glicerol)

-1,96 0,0003


relacionadas gntZ

6-fosfogluconato deshidrogenasa (utilización de

gluconato) -1,83 0,0040

P á g i n a | 79


relacionadas gntK

Gluconato quinasa (utilización de gluconato)

-3,59 0,0091


relacionadas iolC Catabolismo de mio-inositol -2,82 0,0448


relacionadas glpD

Glicerol-3- fosfato deshidrogenasa (utilización de

glicerol) -2,16 0,0953


relacionadas idh

Mio-inositol 2- deshidrogenasa (catabolismo de inositol)

-2,11 0,1175


relacionadas yqeC

6-fosfogluconato deshidrogenasa (pentosas

fosfato) -1,94 0,1317


relacionadas mtlD

manitol-1-fosfato deshidrogenasa

-1,97 0,1368


relacionadas yvkC Piruvato di-quinasa -2,40 0,1639


relacionadas acoL

Componente E3 deshidrogenasa (dihidrolipoamida deshidrogenasa)

-1,94 0,2192

Metabolismo de lípidos fabHA proteína transportadora beta-

cetoacil-acil sintasa III -3,11 0,0057

Metabolismo de lípidos yhdO 1-acilglicerol-3-fosfato O-

aciltransferasa -2,98 0,0066

Metabolismo de lípidos plsX posible glicerol-3-fosfato

aciltransferasa -1,83 0,0128

Metabolismo de lípidos fabI Proteína transportadora enoil-

acil reducatasa -2,14 0,0137

Metabolismo de lípidos accB

acetil-CoA carboxilasa(subunidad

transportadora carboxil biotin) Biosíntesis de ácidos grasos de

cadena larga

-2,74 0,0197

Metabolismo de lípidos accC

acetil-CoA carboxilasa (subunidad biotin carboxilasa) (biosisntesis de acidos grasos

de cadena larga)

-2,68 0,0219

Metabolismo de lípidos fabF Proteína transportadora 3-

oxoacil-acil sintasa II -2,23 0,0226

Metabolismo de lípidos fabHB Proteína transportadora 3-

oxoacil-acil sintasa III -2,19 0,0316

Metabolismo de lípidos fabG Proteína transportadora beta-

cetoacil-acil reducatasa -2,56 0,0631

Metabolismo de lípidos fabD Proteína tranportadora

transacilasa malonil CoA-acil (biosíntesis de acidos grasos)

-2,61 0,0953

Metabolismo de lípidos acpA Proteína acil- transportadora

(biosíntesis de acidos grasos) -1,99 0,1019

P á g i n a | 80

Metabolisimo de nucleotidos and acidos

nucleicos dra

deoxiribosa-fosfato aldolasa (nucleotido/deoxiribonucleotid0

catabolismo) -3,18 0,0972


nucleicos pdp pirimidin-nucleosido fosforilasa -3,49 0,1323

Regulación gntR Represor transcripcional del operón gluconato (gntRKPZ)

-2,93 0,0073

Regulación deoR Represor transcripcional del

operón dra-nupC-pdp (deoxiribonucleosido)

-2,47 0,0281

Regulación ylpC Regulador transcripcional de la

síntesis de ácidos grasos -2,62 0,0396

Regulación rbsR Represor transcripcional del

operon ribosa (RKDACB) -2,26 0,0761

Regulación manR Posible antiterminador

transcripcional (BgIG family) -2,22 0,1017

Regulación yulB Regulador transcripcional

(familia DeoR) -1,71 0,1145

Esporulación sspA Proteína pequeña acido

soluble de esporas (SASP

mayoritaria del tipo )

-1,86 0,0966

Esporulación ywcE Proteína necesaria para la

correcta morfogénesis de la espora y germinación

-2,16 0,1373


gutP H+-glucitol simporter -2,46 0,0234


treP

Enzima del componente IIBC del sistema fosfotransferasa

especifico de trehalosa phosphotransferase

-1,79 0,0944


gntP gluconato permeasa (utilización

de gluconato) -2,18 0,0985


mtlA Enzima del componente IICBA

del sistema fosfotransferasa especifico de manitol

-2,01 0,1041


manP Enzima del componente IICBA

del sistema fosfotransferasa especifico de manosa

-2,02 0,1366


rbsD Ribosa ABC transporter (proteína de membrana)

-4,61 0,1701


rbsC Ribose ABC transporter

(permeasa) -2,34 0,1974


nupC Proteína de transporte del

nucleosido pirimidina -2,49 0,2207

Desconocida yqhY desconocida -2,46 0,1208

Desconocida yrvI desconocida -1,79 0,1571

Desconocida ynaC desconocida -1,97 0,1602

Desconocida ydjN desconocida -1,82 0,1768

Desconocida ymzB desconocida -2,13 0,1770

Genes cuya expresión fue inducida15 min después de inducir Y83C

Categoría Gen Función Fold Change valor P

Producción de antibióticos

ppsD peptido sintetasa 1,92 0,1611

Detoxificación yxeK monoxigenasa 1,89 0,1944

P á g i n a | 81

Bioenergetica de membranas

ndhF NADH deshidrogenasa

(subunidad 5) 2,76 0,0006

Bioenergetica de membranas

yutJ NADH deshidrogenasa 1,74 0,0179

Metabolismo de aminoacidos y moleculas

relacionadas yhdZ

Deacetilasa dependiente de NAD

1,73 0,1606


relacionadas gamA

Glucosamina-6-fosfato isomerasa

3,83 0,0053


relacionadas yjeA Endo-1,4-xilanase 2,01 0,0432


relacionadas yogA Alcohol deshidrogenasa 1,73 0,0686


relacionadas yyaH

Posible liasa (metabolismo de piruvato)

2,34 0,0985

Metabolismo de lípidos cypC Acido graso beta-hydroxilador

citocromo P450 1,70 0,0873

Metabolismo de lípidos ywfC Ligasa alanina-anticapsina 1,89 0,1756


nucleicos pyrB

Aspartato carbamoiltransferasa (biosíntesis de pirimidinas)

2,70 0,0877


nucleicos pyrE

Orotato fosforibosil transferasa (biosíntesis de pirimidinas)

2,25 0,1612


nucleicos relA

GTP pirofosfokinasa (respuesta estricta)

1,81 0,1901


nucleicos pyrAB

Carbamoil-fosfato sintetasa (subunidad

catalitica)(biosíntesis de pirimidinas)

2,12 0,2401

Regulación pyrR

Atenuador transcripcional del operon pirimidina

(pirPBCADFE) / actividad uracil fosforibosiltransferasa (menor)

(biosíntesis de pirimidinas)

2,45 0,0079


comGF Maquinaria de transporte de

ADN 2,24 0,0979


comGD Maquinaria de transporte de

ADN 1,70 0,1968


comGC Union de ADN exogeno 2,02 0,2458


ybgA Regulador transcripcional

(familia GntR) 2,24 0,0027


gamP Enzima II de sistema

fosfotransferasa 3,72 0,0099


pyrP Uracil permieasa(biosíntesis de

pirimidinas) 2,90 0,0122

P á g i n a | 82


glcP glucose/manosa:H+ simporter 2,79 0,0253


oppC

Oligopeptido ABC transporter (permeasa) (inicio de la

esporulacion, desarrollo de competencia)

1,74 0,0434


rocE Aminoácido permeasa (uso de

arginina and ornitina) 1,75 0,0768


yxeO Aminoácido ABC transporter

(proteína de unión-ATP) 1,79 0,1925

Desconocida ybcH Desconocida 2,58 0,0186

Desconocida ybcF Desconocida 2,63 0,0269

Desconocida ybcI Desconocida 2,46 0,0396

Desconocida ybcD Desconocida 2,67 0,0448

Desconocida ybcC Desconocida 2,71 0,0462

Desconocida yxeL Desconocida 1,94 0,2327

Tabla 8. Genes cuya expresión fue afectada por Y83C. Los genes se seleccionaron según su valor P (<0,2). Los

experimentos de arrays se realizaron por triplicado (replicas biológicas)

Anexo II

P á g i n a | 83

Anexo II

Los resultados obtenidos durante el desarrollo de esta tesis forman parte de las

siguientes publicaciones.

Lioy, V. S., M. T. Martin, A. G. Camacho, R. Lurz, H. Antelmann, M. Hecker, E. Hitchin, Y. Ridge, J. M. Wells & J. C. Alonso, (2006) pSM19035-encoded zeta toxin induces stasis followed by death in a subpopulation of cells. Microbiology 152: 2365-2379. Lioy, V. S., O. Rey, D. Balsa, T. Pellicer & J. C. Alonso, (2009) A toxin-antitoxin module as a target for antimicrobial development. Plasmid, en prensa También formará parte de las siguientes publicaciones:

Pratto F1, Lioy VS1, Soberón NE, Volante A and Alonso JC, Molecular anatomy of the

Streptococcus pyogenes pSM19035 partition complex. (en preparación) 1 Los autores contribuyeron de igual manera al trabajo.

Lioy VS, Ayora S, González-Pastor JE and Alonso JC, The streptococcal toxin

increases multidrug sensitivity. (en preparación)

Lioy VS, Pratto F, de la Hoz A, Ayora S and Alonso JC. Stable inheritance of plasmid

pSM19035. Review. (en preparación)

Lioy VS, Soberón N, Austin S and Alonso JC. Accurate redistribution of pSM19035 by

dynamic plasmid pairing and separation. (en preparación)

P á g i n a | 84

Documents

El sistema toxina-antitoxina,...2.6.2. Microscopías 30 2.6.2.1 Microscopía de fluorescencia: Visualización de nucleoides y estado de las membranas 30 2.6.2.1 Microscopía electrónica: