担当教員：土壌科学研究室 池永

7回目

食環境微生物学

解析対象とする植物共存微⽣物

微⽣物細菌

⽷状菌

SSU rRNA遺伝⼦

ITS領域

植物共存⽷状菌の多様性解析における問題

プラスチド 細菌

ミトコンドリア

細菌の多様性解析 SSUrRNA遺伝⼦

植物 ⽷状菌

⽷状菌の多様性解析 ITS領域

宿主植物のDNAが過剰に増幅

分⼦⽣態学的⼿法を⽤いた植物共存⽷状菌の多様性解析においては、宿主植物に由来するDNAが過剰にPCR増幅される深刻な問題が存在する

ミトコンドリアとプラスチドのDNAが過剰に増幅

⽷状菌の系統学的位置植物共存⽷状菌の群集構造解析の場合は, 宿主植物だけでなく原⽣⽣物のDNAも増幅する可能性がある。

LNAオリゴによるPCRクランプ技術だけでは不⼗分!!

植物共存⽷状菌のITS領域を選択的にPCR増幅する⽅法は？

1.⽷状菌に対して特異性の⾼いLNAプライマーを設計

2.抽出DNA中に過剰に含まれる宿主植物DNAのPCR増幅を 抑制するためにLNAオリゴによるPCRクランプ技術を適⽤

  １と２を併⽤

解決策2

⽷状菌に対して特異性の⾼いLNAプライマーを設計 解決策１

LNAプライマーによるPCR増幅⽷状菌

⽷状菌のITS領域のみが選択的に増幅される

LNAプライマー

CA

熱変性

C

A

CG

⽷状菌だけにアニーリング

LNAプライマー (A G:LNA)伸⻑

アニーリング

宿主植物・原⽣⽣物

宿主植物と原⽣⽣物のITS領域は増幅されない

宿主植物と原⽣⽣物のITS領域は増幅される

DNAプライマー LNAプライマー

C TG A

熱変性

C T

G A

C TGA

ミスマッチ

DNAプライマー伸⻑

アニーリング

C TG A

熱変性

C T

G A

C T

GA

LNAプライマー (A G:LNA)

アニーリング

TG

T

G

TAOHOH OH

アニーリングしない

LNAｵﾘｺﾞﾇｸﾚｵﾁﾄﾞによるPCRｸﾗﾝﾌﾟ技術

����2DNA�

� ��

A T

G C

A

T

G

C

LNA;B=29>DBC<�9>DBC<"�3���/ ����.45�+#�

LNA;B= LNA

����1���0�

T C A G P

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����2ITS&2 PCR��3��)87�

A G P

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C G

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LNA;B=

T C A G P

T C A G P

LNA

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C G

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設計可能な部位の検討

18S rRNA 遺伝⼦ 28S rRNA遺伝⼦5.8S rRNA遺伝⼦ITS1 ITS2

ITS1F

ITS領域

ITS5NS1ITS9mun

LNAプライマー

ITS4S ITS4 LR15ITS8mun

LNAオリゴによるPCR クランプ技術

ITS1

1: ITS1Fは⽷状菌DNAに特異的なプライマーとして設計されている

2: ITS1FとITS4は⽷状菌のITS領域にPCR増幅に⼀般的に⽤いられているプライマーセットである

ITS KU LNAプライマーの設計

CTYGGTCATTTAGAGGAASTAA

CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAACTYGGTCATTTAGAGGAASTAACTYGGTCATTTAGAGGAASTAA

担⼦菌⾨

⼦嚢菌⾨

グロムス⾨

1519 sequences

1483 sequences

317 sequences

イネ, コムギ, トモロコシ, ダオズ, タマネギメロン, コットン, トマト, ニンジン, ジャガイモ等

CTTGATCATTTAGAGGAAGGAG

CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA

CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA

100%

50%

0%

100%

50%

0%

100%

50%

0%

ITS1Fプライマー (Gardes & Bruns 1993)ITS1F KU DNAプライマーITS1F KU LNAプライマー

LNA LNA

担⼦菌⾨

⼦嚢菌⾨

グロムス⾨

1289 sequences

683 sequences

96 sequences

100%

50%

0%

100%

50%

0%

100%

50%

0%

　　　　　　　　　　　　 GCATATCAATAAGCGGAGGA

GGGACTACCCGCTGAGTTTAAGGGGACTACCCGCTGAGTTTAAGCATATAAATAAGCGGAGGA

GGGGCTACCCGCTGAGTTTAAGGGGGCTACCCGCTGAGTTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA

GGGATTACCCGCTGAGTTTAAGCGGGATTACCCGCTGAGTTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA

AGGRDTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA

RGGRYTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA

AAGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA

ITS4 LNAオリゴヌクレオチドaコムギ

ITS4 LNAオリゴヌクレオチドbダイズ

ITS4 LNAオリゴヌクレオチドcジャガイモ

ITS4プライマー

ITS4 LNAオリゴの設計

配列の違いに応じて3種類のLNAオリゴを設計

伸⻑⽅向LNA

LNAプライマーとLNAオリゴ

5´-GCTTAAACTCAGCGGGTAATCCCp-3´ Tm 69℃ITS4 LNA オリゴヌクレオチドc

ITS4 LNA オリゴヌクレオチドa 5´-CTTAAACTCAGCGGGTAGTCCCp-3´ Tm 68℃

ITS4 LNA オリゴヌクレオチドb 5´-CTTAAACTCAGCGGGTAGCCCCp-3´ Tm 72℃

プライマーと競合する塩基 リン酸化

ITS1F KU LNA プライマー

ITS1F KU DNAプライマー

Tm 59-62℃

Tm 57-59℃

5´-CTYGGTCATTTAGAGGAASTAA-3´

5´-CTYGGTCATTTAGAGGAASTAA-3´

カバー率を上げるためディジェネレート

LNAに置換

LNAオリゴが適⽤可能な植物ITS4 LNAオリゴヌクレオチドa

ITS4 LNAオリゴヌクレオチドc

ITS4 LNAオリゴヌクレオチドb

コムギ, イネ, オオムギ, トウモロコシ, サトウキビ, キビ, タケ, スイカ, ニンジン, タバコ, ヒマワリ, オクラ, レタス, メロン等

ダイズ, タマネギ, ピーナッツ, ホウレンソウ, レンコン, バナナ, イチジク等

ジャガイモ, トマト, サツマイモ, コットン, コーヒー, ミント, ジュート等

Ikenaga et al. (2016) Microbes & Environ 31: 339-348

試料・DNA抽出

コムギ, ダイズ, ジャガイモをポットで栽培

FastDNA SPIN Kit for Soilキットにフェノクロ処理を加えてDNA抽出

供試植物の使⽤部位

コムギ（幼苗期）ダイズ（幼苗期）ジャガイモ

◯

◯◯

◯

茎葉根

◯

親芋表⽪

⼦芋表⽪

◯ ◯

1000bp

500bp

1500bp

ダイズの根コムギの根

94℃ 1分60〜72℃ 1分 （2℃毎）72℃ 2分

熱変性アニーリング伸⻑反応

PCR条件40 サイクル

アニーリング温度が66℃〜72℃の時, 増幅産物は検出されなかったLNAオリゴのTm値は68℃前後になるようにLNAオリゴを設計

ジャガイモ試料においても部位に関わらず同じ結果が得られた

アニーリング温度（℃）

60 62 64 66 68 70 72M

アニーリング温度（℃）

60 62 64 66 68 70 72M

LNAオリゴのアニーリング温度の検討プライマー ITS1F KU LNA & ITS4

LNAオリゴの濃度検討プライマー ❶ ITS1F KU DNA & ITS4

❷ ITS1F KU LNA & ITS4❸ ITS1F KU LNA & ITS4 & LNAオリゴ

94℃ 1分70℃ 1分54℃ 1分72℃ 2分

熱変性LNAオリゴのアニーリングプライマーのアニーリング伸⻑反応

PCR条件40 サイクル

LNAオリゴの濃度:μM0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 6.0, 8.0                     

❶ ❷ ❸宿主 植物

コムギの根

ジャガイモの葉

0.5 1.0 2.0 3.0 4.0

1000bp

500bp

1500bp

1000bp

500bp

1500bp

宿主 植物 ❶ ❷ ❸

0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 宿主 植物6.0 8.0

LNAプライマー＋LNAオリゴ(3.0μM〜6.0μM)で選択的にPCR増幅

PCR条件と増幅領域

PCR条件： 94℃1分, 70℃1分, 54℃1分, 72℃2分 ×40サイクルプライマー： ITS1F KU LNAプライマー & ITS4プライマーLNAオリゴの濃度（μM）： 0, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 6.0, 8.0 （最大8段階）                      

ITS4 LNAオリゴヌクレオチド

18SrRNA遺伝⼦ 28SrRNA遺伝⼦5.8SrRNA遺伝⼦ITS1 ITS2

ITS1F KU LNAプライマーITS4プライマー

LNAオリゴのアニーリング プライマーのアニーリング

ITS1F KU DNAプライマー（⽐較対象）

⽐較対象：特異的な塩基をLNAに置換していないフォワードプライマー（ITS1F KU DNAプライマーとする）とITS4プライマーで、LNAオリゴを使⽤せずにPCR増幅

Nested PCRPCR増幅 (ITS領域増幅産物)無：ITS KU DNAプライマー, ITS4有：ITS KU LNAプライマー, ITS4, LNAオリゴ

PCR産物の精製

ITS1F KU GC & ITS2でITS1領域をNested PCR

18SrRNA遺伝⼦ 28SrRNA遺伝⼦5.8SrRNA遺伝⼦ITS1 ITS2

ITS1F KU LNAプライマーITS1F KU DNAプライマー

ITS4 LNAオリゴヌクレオチドITS4プライマー

ITS1F KU GCプライマー ITS2プライマー

DGGE解析に供試

DGGEパターン � ����� ���� �� � �

—� �� —� �� —� �� —� �� —� ��

�����

コムギの根+

LNAプライマーとPCRクランプ技術の適⽤  無 有 +

ダイズの根+

ジャガイモの葉と茎

+ + 葉 茎

宿主植物

1. LNAプライマーとLNAオリゴによるPCRクランプ技術の併⽤で 主要であった宿主植物DNAのPCR増幅を抑制あるいは軽減2. 新たなDGGEバンドを多数検出

by ITS1F KU GC & ITS2

⼀⽅, ジャガイモの根など⽷状菌/宿主植物DNA⽐の⼤きな試料では, ITS1F KU DNAプライマーの特異性によって, LNAプライマーとPCRクランプ技術を適⽤しなくても⽷状菌のバンドが検出

葉 茎バンド 近縁種 相同性

葉3

葉4

茎27

茎4茎5

茎42

29

18

11

19

4

3

41

8

4

5

3

2733

39

42

葉11葉41葉19

茎8

茎33

茎3

茎39

葉18葉29 Alternaria alternata, A. arborescens 100% (243/243)

Pestalotiopsis vismiae 100% (270/270)Fusarium begoniae, F. verticillioides 99% (221/223)Alternaria alternata, A. arborescens 97% (239/240)Alternaria alternata, A. arborescens 99% (242/243)Phoma muscivora 97% (215/221)Plectosphaerella cucumerina 100% (213/213)

Alternaria alternata, A. arborescens 100% (243/243)Geomyces sp. 98% (253/258)Fusarium oxysporum 99% (226/227)Gymnoascus sp. 98% (268/274)Gymnoascus sp. 95% (264/278)Alternaria alternata, A. arborescens 99% (242/243)Gymnoascus sp. 98% (253/258)Leptosphaerulina chartarum 100% (293/293)

ジャガイモ葉茎のバンドの近縁種+ +

DGGEバンドは全て⽷状菌に近縁

LNAオリゴが⽷状菌DNAのPCR増幅に影響を及ぼす可能性

ITS1F KU LNA & ITS4 1 : コントロール（LNAオリゴ無し） 2 : LNAオリゴヌクレオチドa 3 : LNAオリゴヌクレオチドb 4 : LNAオリゴヌクレオチドc

DGGE

同⼀のパターン

⿅児島⼤学圃場⼟壌からDNA抽出1 2 3 4

ITS1F KU GC & ITS2

まとめ

植物共存細菌・⽷状菌の増幅産物はDGGEや次世代シークエンスによるアンプリコン解析で群集構造が解析可能

迅速かつ簡便に植物共存細菌・⽷状菌の群集構造を解析する⽅法を確⽴!!

⽷状菌に特異的なLNAプライマーと宿主植物に特異的なLNAオリゴによるPCRクランプ技術を併⽤する事で, 宿主植物DNAのPCR増幅を抑制あるいは軽減し, ⽷状菌DNAの増幅が可能となった。