Développement de biocathodes pour biopiles enzymatiques

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Deacuteveloppement de biocathodes pour biopilesenzymatiques utilisant la laccase

Mohamed Achraf Blout

To cite this versionMohamed Achraf Blout Deacuteveloppement de biocathodes pour biopiles enzymatiques utilisant la lac-case Chimie theacuteorique etou physique Universiteacute Pierre et Marie Curie - Paris VI 2017 FranccedilaisNNT 2017PA066249 tel-01695524

Universiteacute Pierre et Marie Curie

Ecole Doctorale 397

Laboratoire de Reacuteactiviteacute de Surface

Laboratoire Interfaces et Systegravemes Electrochimiques

Deacuteveloppement de biocathodes pour biopiles enzymatiques

utilisant la laccase

Par Mohamed Achraf Blout

Thegravese de doctorat en Physique et Chimie des Mateacuteriaux

Co-dirigeacutee par Claude Jolivalt et Alain Pailleret

Preacutesenteacutee et soutenue publiquement le 17 octobre 2017

Devant un jury composeacute de

Michael Holzinger Chargeacute de recherche

Universiteacute Grenoble Alpes

Rapporteur

Elisabeth Lojou Directrice de recherche CNRS

Universiteacute drsquoAix Marseille

Rapporteur

Christophe Innocent Chargeacute de recherche

ENSCM Chimie Montpellier

Examinateur

Michegravele Salmain Directrice de recherche CNRS


Examinatrice

Claude Jolivalt Professeur


Directrice de thegravese

Alain Pailleret Maitre de confeacuterences


Co-directeur de thegravese

Farzaneh Arefi-Khonsari Professeur


Inviteacutee

Remerciements

A lrsquoissue de ce travail qui a eacuteteacute exaltant en tout point de vue je tiens agrave remercier les

membres du jury de mrsquoavoir fait lrsquohonneur drsquoaccepter et drsquoexaminer ce manuscrit qui est le fruit

de trois anneacutees de recherche riches aussi bien sur le plan scientifique que sur le plan humain

Les travaux de recherche que jrsquoai meneacutes mrsquoont permis de partir agrave la deacutecouverte des piles agrave

combustible enzymatiques et drsquoacqueacuterir de nouvelles compeacutetences En plus de son aspect

innovant ce travail mrsquoa eacutegalement permis de deacutevelopper mes capaciteacutes en matiegravere de recherche

drsquoanalyse de synthegravese en plus de lrsquoesprit critique Sur le plan humain je ne remercierai jamais

assez tous ceux qui mrsquoont assisteacute et sans lesquels ce travail nrsquoaurait jamais pu aboutir

Ma gratitude va tout particuliegraverement agrave ma directrice de thegravese Madame Claude Jolivalt qui

a dirigeacute mon travail et dont lrsquoapport a eacuteteacute deacutecisif Sa confiance en mes capaciteacutes a eacuteteacute

deacuteterminante pour la suite Le savoir et lrsquoexpertise qursquoelle mrsquoa communiqueacutes mrsquoont forgeacute sur

le double plan personnel et scientifique Lrsquoaccomplissement de ce travail nrsquoa pas eacuteteacute sans

difficulteacutes et agrave chaque fois son coaching intelligent et son optimisme de tous les instants mrsquoont

eacuteteacute drsquoun tregraves grand secours ce qui mrsquoa permis agrave chaque fois de mieux rebondir et de mener agrave

son terme ce travail dans les meilleures conditions possibles

Je ne remercierai eacutegalement jamais assez mon co-directeur de thegravese Monsieur Alain

Pailleret qui mrsquoa eacuteteacute drsquoun preacutecieux concours tant au niveau de la deacutemarche suivie de la rigueur

que des connaissances acquises Sa codirection a eacuteteacute enrichissante agrave plus drsquoun titre et a permis

agrave ce travail de mieux avancer Ses qualiteacutes humaines mrsquoont eacutenormeacutement faciliteacute la tacircche

Je tiens aussi agrave exprimer ma gratitude agrave Madame Farzaneh Arefi Khonsari et agrave Monsieur

Jeacuterome Pulpytel membre de lrsquoeacutequipe encadrante qui nrsquoont meacutenageacute aucun effort pour orienter

dans la bonne direction une partie de ce travail Sans oublier bien eacutevidemment Monsieur Hubert

Perrot qui a apporteacute sa pierre agrave ce travail Que serait ce travail sans la contribution de Shinsuke

Mori Les eacutechantillons de Nanowalls de carbone qursquoil a fourni ont permis de travailler sur une

partie de ma thegravese Qursquoil en soit ici remercieacute

Je citerai eacutegalement Madame Florence Billon Madame Franccediloise Pillier Monsieur

Christophe Calers et Monsieur Christophe Meacutethivier qursquoils trouvent ici lrsquoexpression de toute

ma gratitude pour leur savoir-faire leur disponibiliteacute leur gentillesse et ce agrave chaque fois ougrave jrsquoai

eu agrave les solliciter Jrsquoadresserai une mention speacuteciale au Laboratoire de Reacuteactiviteacute de Surface et

au Laboratoire Interfaces et Systegravemes Electrochimiques qui ont accueilli les travaux de cette

recherche

Le soutien et les encouragements des membres de ma famille ont donneacute un sens

suppleacutementaire agrave ce travail A distance ou agrave chaque retour en Tunisie ils ont eacuteteacute toujours lagrave

pour me mettre dans les meilleures conditions et me rebooster avec une mention tregraves speacuteciale

agrave ma maman agrave mon papa agrave mon fregravere ainsi qursquoagrave ma tante Ahlem Je ne les remercierais jamais

assez Jrsquoai une petite penseacutee pour mon chien Micha qui vient de nous quitter apregraves avoir partageacute

notre vie 15 anneacutees durant et dont la compagnie nous a apporteacute beaucoup de joie Au cours de

ces trois anneacutees de thegravese jrsquoai eu la chance de rencontrer des gens formidables avec lesquels jrsquoai

passeacute de tregraves bons moments et qui sont devenus mes amis Je nrsquooublie pas tous mes amis ougrave

qursquoils soient qui mrsquoont permis agrave des degreacutes diffeacuterents de mrsquoeacutepanouir

Table des matiegraveres

Introduction geacuteneacuterale 1

CHAPITRE I BIBLIOGRAPHIE 7

I1 LES BIOPILES ENZYMATIQUES 9

I11 CONTEXTE GENERAL 9

I12 PRINCIPE DE FONCTIONNEMENT DrsquoUNE BIOPILE 9

I13 LES BIOPILES MICROBIENNES 11


I2 LES ENZYMES EMPLOYEES DANS LES BIOPILES ENZYMATIQUES 14

I21 GENERALITES SUR LES ENZYMES 14

I211 La structure drsquoune enzyme 14

I212 Meacutecanisme et cineacutetique des reacuteactions enzymatiques 17

I22 LES ENZYMES OXYDOREDUCTASES 18

I221 Les enzymes employeacutees dans le compartiment anodique 19

I222 Les enzymes employeacutees dans le compartiment cathodique 21

I23 LA LACCASE 24

I231 Caracteacuteristiques physico-chimiques des laccases 24

I232 Structure de la laccase B de Trametes versicolor 25

I233 Applications industrielles de la laccase 27

I3 LrsquoIMMOBILISATION DES ENZYMES 29

I31 IMMOBILISATION PAR ADSORPTION 29

I32 IMMOBILISATION PAR LIAISON COVALENTE 29

I33 IMMOBILISATION PAR ENCAPSULATION 30

I34 IMMOBILISATION PAR RETICULATION 31

I4 LES SUPPORTS EMPLOYES DANS LES BIOPILES ENZYMATIQUES 31

I41 LES MATERIAUX CARBONES 31

I42 LrsquoOR 33

I5 FONCTIONNALISATION DE LA SURFACE DES ELECTRODES 33


I511 Electroreacuteduction de sels de diazonium 34

I512 Traitement acide et oxydant 35

I513 Proceacutedeacute drsquoamination 36

I514 Fonctionnalisation par proceacutedeacute plasma 36

I515 π-stacking 37

I516 Fonctionnalisation par eacutelectropolymeacuterisation 38

I52 LES MATERIAUX CARBONES COMPOSITES 38

I53 LES ELECTRODES DrsquoOR 40

I6 BIOPILE ENZYMATIQUE VERS DES DISPOSITIFS IMPLANTABLES 40

I7 CHOIX DES SYSTEMES DrsquoETUDE ET METHODOLOGIE 422

CHAPITRE II MATERIELS ET METHODES 47

II1 PRODUCTION DE LA LACCASE 49

II11 CULTURE DE TRAMETES VERSICOLOR 49

II12 CONCENTRATION DU MILIEU DE CULTURE 50

II13 PURIFICATION DE LA LACCASE 50

II131 Chromatographie eacutechangeuse drsquoions 50

II132 Chromatographie drsquointeraction hydrophobe 52

II14 OXYDATION DE LA LACCASE 56

II2 ELABORATION DES ELECTRODES 57

II3 IMMOBILISATION DE LA LACCASE 58

II31 IMMOBILISATION COVALENTE DE LA LACCASE SUR LrsquoELECTRODE 58

II311 Formation drsquoune liaison amide 58

II312 Formation drsquoune liaison imine 59

II32 IMMOBILISATION PAR ADSORPTION 60

II4 MESURE DE LA SURFACE ELECTROACTIVE DE LrsquoELECTRODE DE GRAPHITE 61

II41 PRINCIPE 61

II42 PROTOCOLE EXPERIMENTAL 61

II5 MESURE DE LrsquoACTIVITE ENZYMATIQUE DE LA LACCASE 61

II51 PRINCIPE 61

II52 PROTOCOLE DE MESURE DE LrsquoACTIVITE ENZYMATIQUE DE LA LACCASE 62

II6 MESURE DU COURANT BIOCATALYTIQUE 63

II7 CARACTERISATION DE LA SURFACE DE LrsquoELECTRODE 63

II71 MICROSCOPIE ELECTRONIQUE A BALAYAGE (MEB) 63

II72 SPECTROMETRIE PHOTOELECTRONIQUE A RAYONS X (XPS) 64

CHAPITRE III ELABORATION DrsquoUNE CATHODE GRAPHITEA-CNXLACCASE

EFFET DE LrsquoORIENTATION DE LA LACCASE IMMOBILISEE 67

III1 MATERIELS ET METHODES 69

III11 ELABORATION DE LA BIOCATHODE DEPOT DrsquoUNE COUCHE MINCE DE NITRURE DE

CARBONE AMORPHE (A-CNX) PAR PULVERISATION CATHODIQUE REACTIVE MAGNETRON 69

III12 MESURE DE LA STABILITE DE LA BIOCATHODE PAR CHRONOAMPEROMETRIE 70

III13 CARACTERISATION DE LA SURFACE DE LA BIOCATHODE PAR AFM 71

III14 LA SPECTROSCOPIE DrsquoIMPEDANCE ELECTROCHIMIQUE (SIE) 72

III2 RESULTATS ET DISCUSSION 75

III21 CARACTERISATION MORPHOLOGIQUE ET CHIMIQUE DE LA COUCHE DrsquoA-CNX AVANT ET

APRES TRAITEMENT ANODIQUE 75

III22 MESURES DE DENSITES DE COURANT BIOCATALYTIQUES DE LrsquoORR POUR DIFFERENTES

METHODES DrsquoIMMOBILISATION DE LA LACCASE 79

III23 ACTIVITE DE LA LACCASE IMMOBILISEE VIS-A-VIS DE LrsquoABTS ET DETERMINATION DU

TAUX DE COUVERTURE EN ENZYMES ACTIVES 83

III24 DETERMINATION DU TAUX DE COUVERTURE TOTAL EN ENZYMES PAR XPS 84

III25 DETERMINATION DU TAUX DE COUVERTURE TOTAL EN ENZYMES ET DE LEUR ORIENTATION

SUR LE SUBSTRAT PAR AM-AFM ET PI-AFM 88

III26 EVALUATION DE LA STABILITE DE LrsquoACTIVITE BIOELECTROCATALYTIQUE DE LA LACCASE

IMMOBILISEE VIS-A-VIS DE LrsquoORR 91

III27 CARACTERISATION DE LrsquoACTIVITE BIO-ELECTROCATALYTIQUE DE LA LACCASE ENVERS

LrsquoORR PAR SPECTROSCOPIE DIMPEDANCE ELECTROCHIMIQUE 93

III3 CONCLUSION 98

CHAPITRE IV ELABORATION DrsquoUNE CATHODE GRAPHITENANOWALLS DE

CARBONELACCASEEFFET DE LA NANOSTRUCTURATION DE LrsquoELECTRODE

101

IV1 MATERIELS ET METHODES 103

IV11 LE PROCEDE PLASMA 104

IV111 Nanostructuration du graphite par revecirctement par des nanowalls de carbone 105

IV112 Fonctionnalisation du graphiteCNWs par plasma atmospheacuterique 106

IV12 CARACTERISATION DE LrsquoELECTRODE PAR SPECTROSCOPIE PHOTOELECTRONIQUE A

RAYONS X 106

IV121 Identification de groupements aldeacutehydes agrave la surface de lrsquoeacutelectrode 106

IV1211 Mise en eacutevidence des groupements carboxyliques agrave la surface de lrsquoeacutelectrode par une

meacutethode chimique 107

IV13 MESURE DrsquoANGLE DE CONTACT 108

IV14 LA METHODE DES PLANS DrsquoEXPERIENCES 109

IV141 Principe de la meacutethode des plans drsquoexpeacuteriences 109

IV1411 Lrsquoespace expeacuterimental 110

IV1412 Surface de reacuteponse 110

IV1413 Modeacutelisation matheacutematique 111

IV142 Plan factoriel fractionnaire du 1er degreacute 112

IV143 Plan composite 113

IV144 Plan de Doehlert 113

IV145 Deacutetermination des facteurs influents 114

IV2 RESULTATS ET DISCUSSION 114

IV21 CARACTERISATION DE LA SURFACE DrsquoUNE ELECTRODE GRAPHITECNWS 114

IV22 DETERMINATION DE LA SURFACE ELECTROACTIVE DrsquoUNE ELECTRODE GRAPHITECNWS

117

IV23 PERFORMANCES DrsquoUNE ELECTRODE GRAPHITECNWS ESSAIS PRELIMINAIRES 119

IV231 Analyse XPS apregraves traitement APPJ 119

IV232 Performances bioeacutelectrobiocatalytiques 121

IV24 OPTIMISATION DES CONDITIONS DE TRAITEMENT PLASMA PAR LA MISE EN PLACE DE PLANS

DrsquoEXPERIENCES 123

IV241 Optimisation des conditions de traitement plasma atmospheacuterique sur eacutelectrodes de

graphite nu 123

IV2411 Plan drsquoexpeacuterience factoriel fractionnaire 123

IV2412 Plan drsquoexpeacuterience composite 130

IV25 PERFORMANCES DES ELECTRODES GRAPHITECNWS DANS LES CONDITIONS DE

TRAITEMENT PLASMA OPTIMISEES 134

IV251 Electrodes graphiteCNWs60s 134

IV2511 Conditions de traitement plasma issues du plan drsquoexpeacuterience composite avec

eacutelectrodes de graphiteCNWs60s 134

IV2512 Plan Doehlert 136

IV252 Electrode graphiteCNWs120s 138

IV2521 Immobilisation de la laccase oxydeacutee 139

IV3 CONCLUSION 142

CHAPITRE V ETUDE PAR PM-IRRAS DE LrsquoIMMOBILISATION DE LA LACCASE

SUR UNE SURFACE DrsquoOR PLANE 145

V1 MATERIELS ET METHODES 147

V11 LA SPECTROSCOPIE PM-IRRAS 147

V111 La spectroscopie infrarouge 147

V112 Principe de lrsquoIRRAS 149

V113 Principe du PM-IRRAS 150

V114 Dispositif expeacuterimental 151

V115 Spectroscopie infrarouge des proteacuteines 152

V1151 Modes de vibration de la liaison peptidique 152

V1152 Modes de vibration en fonction lrsquoorientation de la proteacuteine sur la surface 153

V12 PREPARATION DES PLAQUES DrsquoOR 154

V121 Preacutetraitement des plaques drsquoor 154

V122 Greffage des SAMs (Self Assembled Monolayer) 155

V123 Immobilisation de la laccase 155

V2 RESULTATS ET DISCUSSION 157

V21 CARACTERISATION EX SITU DE LrsquoIMMOBILISATION DE LA LACCASE 157

V211 Analyse PM-IRRAS 157

V212 Analyse XPS 163

V22 ETUDE PM-IRRAS EN PHASE LIQUIDE (IN SITU) 164

V221 Etude PM-IRRAS 164

V222 Analyses XPS 170

V3 CONCLUSION 171

Conclusion geacuteneacuterale et perspectives 175

Annexes 181

Annexe 1 Production de la laccase mutante 183

Annexe 2 Saturation de la solution tampon aceacutetate en oxygegravene 187

Reacutefeacuterences 189

1

Introduction geacuteneacuterale

2


3

Les combustibles fossiles repreacutesentent actuellement 80 de la consommation eacutenergeacutetique

mondiale Ils sont responsables de 80 des eacutemissions de dioxyde de carbone et des deux tiers

des eacutemissions de gaz agrave effet de serre responsables du reacutechauffement climatique Face agrave ce

constat les socieacuteteacutes devront srsquoadapter mais aussi essayer de ralentir ce reacutechauffement par la

mise en place drsquoactions susceptibles de reacuteduire la preacutesence de gaz agrave effet de serre dans

lrsquoatmosphegravere Les piles agrave combustible (PACs) constituent une source drsquoeacutenergie eacutelectrique

renouvelable alternative aux eacutenergies fossiles Elles geacutenegraverent de lrsquoeacutelectriciteacute agrave partir de

lrsquooxydation drsquoun combustible (hydrogegravene meacutethanolhellip) et de la reacuteduction drsquoun comburant

(lrsquooxygegravene) Il est indispensable drsquoutiliser des catalyseurs pour augmenter la vitesse de ces

reacuteactions Le meilleur catalyseur agrave ce jour est agrave base de platine Toutefois les prix eacuteleveacutes et la

limitation des reacuteserves du platine ainsi que les verrous technologiques lieacutes agrave leur fabrication

font qursquoil est actuellement difficile de deacutevelopper les PACs agrave grande eacutechelle Une alternative agrave

lrsquoutilisation du platine serait de srsquoinspirer du monde vivant et drsquoeacutelaborer des piles agrave combustible

qui utilisent non pas un meacutetal noble mais des composeacutes biologiques pour catalyser les reacuteactions

mises en jeu On va srsquointeacuteresser au cours de ce travail aux piles agrave combustible enzymatiques

(biopiles enzymatiques) Ces dispositifs constituent une sous-classe des PACs

conventionnelles Elles utilisent des enzymes proteacuteines ayant des proprieacuteteacutes catalytiques pour

catalyser les reacuteactions se deacuteroulant aux eacutelectrodes Ce nrsquoest qursquoagrave partir des anneacutees 60 que les

piles agrave combustible enzymatiques ont commenceacute agrave se deacutevelopper La premiegravere biopile a eacuteteacute

eacutelaboreacutee en 1964 par Yahiro et al [1] Il srsquoagissait drsquoun dispositif hybride il utilisait une

enzyme en tant que catalyseur anodique et le platine agrave la cathode Malgreacute le fait qursquoil ne

permettait de fournir que de faibles potentiels agrave circuit ouvert ce dispositif a montreacute que les

enzymes pouvaient catalyser une demi-reacuteaction drsquoune pile agrave combustible Depuis cette

deacutecouverte plusieurs avanceacutees ont eacuteteacute reacutealiseacutees dans la conception des biopiles enzymatiques

A ce jour on est arriveacute agrave avoir des puissances de lrsquoordre du mWcm2 loin de celles fournies par

les PACs conventionnelles (10 W agrave 1 MW) Ces biopiles seraient drsquoavantage adapteacutees agrave

alimenter certains dispositifs meacutedicaux implantables tels que des pacemakers (ces appareils

consomment une puissance de 10 microW) sphincters urinaires artificiels (200 microW) ou mecircme des

organes artificiels qui seraient ainsi autonomes En effet certaines biopiles sont susceptibles de

geacuteneacuterer de lrsquoeacutelectriciteacute par la transformation du glucose et de lrsquooxygegravene deux substrats preacutesents

dans les fluides biologiques Cependant de nombreux deacutefis restent encore agrave relever pour


4

optimiser ces dispositifs Par exemple lrsquoeacutelaboration des biopiles agrave combustible enzymatiques

les plus performantes agrave ce jour neacutecessite la preacutesence drsquoun meacutediateur composeacute souvent toxique

et donc difficilement compatible avec des dispositifs implantables eacutelaborer des enzymes

reacutesistantes agrave certains composeacutes tels que lrsquoacide ascorbique lrsquoureacutee les halogeacutenures les

hydroxydes preacutesents dans le corps humain et qui inhibent lrsquoactiviteacute catalytique de certaines

enzymes Une alternative (radicale) agrave lrsquoutilisation des meacutediateurs redox serait de les supprimer

et donc de deacutevelopper le transfert direct drsquoeacutelectrons (DET) On sait que ce transfert est possible

pour certaines enzymes utiliseacutees dans les biopiles notamment la bilirubine oxydase et la

laccase deux oxydases utiliseacutees comme catalyseurs agrave la cathode On srsquoest inteacuteresseacute dans ce

travail agrave la laccase de Trametes versicolor (Tversicolor) avec comme objectif outre le fait de

la faire fonctionner en transfert direct drsquoeacutelectrons drsquooptimiser son immobilisation (covalente)

sur diffeacuterents substrats carboneacutes

Le premier chapitre de ce manuscrit est constitueacute drsquoune eacutetude bibliographique structureacutee

en six parties On se propose de preacutesenter dans un premier temps les diffeacuterentes classes de piles

agrave combustible biologiques On deacutetaillera ensuite les diffeacuterentes enzymes employeacutees dans ces

piles Une attention particuliegravere sera porteacutee aux enzymes de type oxydase et plus

particuliegraverement agrave la laccase de Tversicolor Les diffeacuterentes meacutethodes drsquoimmobilisation des

enzymes seront par la suite deacutecrites Dans les quatriegraveme et cinquiegraveme parties les supports

employeacutes pour lrsquoimmobilisation enzymatique sont tout drsquoabord exposeacutes ensuite

lrsquoimmobilisation des enzymes via la modification de surface de ces diffeacuterents supports ainsi

que les performances des biocathodes sont preacutesenteacutees Enfin des exemples de biopiles

glucoseoxygegravene implantables sont exposeacutes

Apregraves un chapitre consacreacute aux meacutethodes de caracteacuterisation et drsquoeacutelaboration communes

aux trois chapitres de reacutesultats deux mateacuteriaux de cathode de biopiles seront eacutetudieacutes dans les

troisiegraveme et quatriegraveme chapitres Dans le troisiegraveme chapitre le graphite a eacuteteacute recouvert par un

film mince de nitrure de carbone amorphe (a-CNx) Ce film possegravede la caracteacuteristique de

preacutesenter des groupements fonctionnels agrave sa surface Diffeacuterentes techniques ont eacuteteacute mises en

œuvre (XPS AFM et MEB) pour caracteacuteriser la surface de la biocathode Les performances de

la biocathode ont eacuteteacute eacutevalueacutees par voie eacutelectrochimique et spectroscopique Une eacutetude par

spectroscopie drsquoimpeacutedance eacutelectrochimique (SIE) a eacuteteacute reacutealiseacutee afin de modeacuteliser le rocircle et la

reacutepartition des enzymes sur la cineacutetique de lrsquoORR (Oxygen Reduction Reaction) Le deuxiegraveme


5

mateacuteriau de biocathode utiliseacute sont les nanowalls de carbone (CNWs) Ce mateacuteriau formeacute

directement sur le graphite par deacutepocirct chimique en phase vapeur assisteacute par plasma (PECVD)

permet de nanostructurer sa surface Les CNWs ont eacuteteacute par la suite fonctionnaliseacutes par un jet

plasma agrave la pression atmospheacuterique (APPJ) Dans ce quatriegraveme chapitre on a chercheacute agrave

optimiser ces conditions de fonctionnalisation plasma en ayant recourt agrave des plans

drsquoexpeacuteriences

Enfin le dernier chapitre est consacreacute agrave lrsquoeacutetude en phase liquide (in situ) et agrave lrsquoair (ex situ)

de lrsquoorientation de la laccase sur des plaques drsquoor par spectroscopie infrarouge de reacuteflexion-

absorption agrave modulation de phase (PM-IRRAS) Pour lrsquoeacutetude ex situ lrsquoenzyme est immobiliseacutee

agrave la surface des plaques drsquoor puis ces derniegraveres sont analyseacutees par PM-IRRAS tandis que pour

lrsquoeacutetude in situ les analyses sont effectueacutees en mecircme temps que lrsquoimmobilisation de la laccase

(suivi en temps reacuteel du greffage) Une analyse XPS a aussi eacuteteacute reacutealiseacutee afin de quantifier

lrsquoenzyme agrave la surface des plaques

6

7

Chapitre IBibliographie

8

Chapitre I Bibliographie

9

I1Les biopiles enzymatiques

I11Contexte geacuteneacuteral

La diminution des stocks drsquoeacutenergies fossiles la demande eacutenergeacutetique croissante et le

reacutechauffement climatique obligent agrave trouver de nouveaux modes de production eacutenergeacutetique

Parmi les nouvelles sources alternatives les piles agrave combustible biologiques (communeacutement

appeleacutees biopiles) suscitent un fort inteacuterecirct Drsquoune faccedilon geacuteneacuterale une pile permet de convertir

lrsquoeacutenergie chimique en eacutenergie eacutelectrique Les biopiles constituent une sous-classe des piles agrave

combustible conventionnelles Elles utilisent des composeacutes biologiques pour catalyser les

reacuteactions se deacuteroulant aux eacutelectrodes [2]

I12Principe de fonctionnement drsquoune biopile

Par deacutefinition une biopile est une pile agrave combustible dont au moins un des catalyseurs

anodique ou cathodique est drsquoorigine biologique (enzyme micro-organisme) [3] Elles peuvent

ecirctre classeacutees selon le type de biocatalyseur utiliseacute On distingue les biopiles microbiennes les

biopiles agrave mitochondries et les biopiles enzymatiques Ces biopiles renferment les mecircmes

composants qursquoune pile agrave combustible conventionnelle agrave savoir une anode siegravege de lrsquooxydation

drsquoun combustible une cathode siegravege de la reacuteduction drsquoun comburant geacuteneacuteralement lrsquooxygegravene

et un eacutelectrolyte (Figure I1)

Figure I1 Comparaison entre une pile agrave combustible conventionnelle et une biopile

Le potentiel agrave circuit ouvert (PCO) ainsi que les courbes de polarisation et de puissance

permettent drsquoeacutevaluer les performances drsquoune biopile [4] Le PCO repreacutesente la diffeacuterence de


10

potentiel thermodynamique aux bornes des deux eacutelectrodes agrave courant nul La courbe de

polarisation nous informe que les pertes ou polarisation proviennent principalement de trois

sources la polarisation drsquoactivation due agrave la barriegravere drsquoactivation que doivent deacutepasser les

reacuteactifs pour qursquoune reacuteaction puisse deacutemarrer la polarisation ohmique due agrave la reacutesistance que

rencontre le flux drsquoions en traversant lrsquoeacutelectrolyte et agrave la reacutesistance que rencontrent les eacutelectrons

dans les eacutelectrodes et le circuit eacutelectrique et la polarisation de diffusion due agrave la formation drsquoun

gradient de concentration des reacuteactifs La courbe de puissance indique la puissance maximale

pouvant ecirctre geacuteneacutereacutee par la biopile Un effondrement de la puissance deacutebiteacutee est observeacute lorsque

la cineacutetique est limiteacutee par le transport de matiegravere (Figure I2)

Figure I2 Scheacutema des courbes intensiteacute-potentiel (agrave droite) et variations de la tension et de

la densiteacute de puissance drsquoune pile agrave combustible en fonction de la densiteacute de courant (agrave

gauche)

Ces performances deacutependent consideacuterablement du transfert drsquoeacutelectrons susceptible de se

deacuterouler selon deux meacutecanismes distincts (Figure I3) le transfert drsquoeacutelectrons direct (DET) et

le transfert drsquoeacutelectrons meacutedieacute (MET) Dans le transfert drsquoeacutelectrons direct (DET) les eacutelectrons

transitent directement de lrsquoeacutelectrode au substrat enzymatique via le site actif du biocatalyseur

Dans ce type de meacutecanisme le transfert est eacutetroitement lieacute agrave la distance entre le biocatalyseur

et lrsquoeacutelectrode Cela signifie que le DET ne peut ecirctre efficace que lorsque lrsquoeacutelectrode est situeacutee

agrave une distance infeacuterieure agrave la distance permettant lrsquoeffet tunnel qui est drsquoenviron 15 nm [5]

Dans le transfert drsquoeacutelectrons meacutedieacute (MET) de petites espegraveces chimiques agrave faible poids

moleacuteculaire appeleacutees meacutediateurs redox sont introduites dans le systegraveme pour transfeacuterer les


11

eacutelectrons du site actif du biocatalyseur geacuteneacuteralement difficilement accessible et diffusant

librement en solution agrave lrsquoeacutelectrode (Figure I3)

Figure I3 Scheacutema repreacutesentant les transferts drsquoeacutelectrons direct et meacutedieacute sur une eacutelectrode

I13Les biopiles microbiennes

Les Piles agrave Combustible Microbiennes (PCM) sont des dispositifs qui utilisent des biofilms

bacteacuteriens pour catalyser les reacuteactions se deacuteroulant aux eacutelectrodes Par deacutefinition un biofilm

est un amas structureacute de cellules bacteacuteriennes enrobeacutees drsquoune matrice de bio-polymegraveres et

attacheacutees agrave une surface Cette matrice est responsable des proprieacuteteacutes physiques et physico-

chimiques du biofilm

Dans la majoriteacute des cas une PCM est constitueacutee drsquoune anode biologique et drsquoune cathode

abiotique seacutepareacutees physiquement par une membrane eacutechangeuses de protons Les bacteacuteries

preacutesentes dans le compartiment anodique catalysent lrsquooxydation de la matiegravere organique

produisant ainsi les eacutelectrons et les protons neacutecessaires agrave la reacuteduction du dioxygegravene dans le

compartiment cathodique (les catalyseurs sont de type meacutetallique tel que le platine) [6] Les

eacutelectrons sont transfeacutereacutes depuis des donneurs drsquoeacutelectrons vers des accepteurs drsquoeacutelectrons au

cours de reacuteactions drsquooxydoreacuteduction successives jusqursquoagrave atteindre la membrane externe de la

bacteacuterie et ainsi ecirctre transporteacutes vers la cathode agrave travers le circuit eacutelectrique Les bacteacuteries

utiliseacutees sont dites exo-eacutelectrogegravenes car elles sont capables de transfeacuterer les eacutelectrons hors de

leurs cellules Comme le dioxygegravene reacuteagit avec les protons produits agrave lrsquoanode et inhibe par

conseacutequent la production drsquoeacutelectriciteacute il est neacutecessaire que ce compartiment fonctionne dans

des conditions anaeacuterobies Le compartiment cathodique est exposeacute agrave lrsquoair La membrane quant

agrave elle a pour objectif de permettre le transfert des protons mais aussi drsquoempecirccher la diffusion

de lrsquooxygegravene dans le compartiment anodique (Figure I4)


12

Figure I4 Scheacutema drsquoune biopile microbienne A lrsquoanode une bacteacuterie oxyde un substrat

pour produire des eacutelectrons et des protons et agrave la cathode le dioxygegravene est reacuteduit [7]

Contrairement aux piles agrave combustible conventionnel les PCMs peuvent fonctionner agrave des

tempeacuteratures comprises entre 15degC et 45degC agrave des pH neutres et catalyser lrsquooxydation de

substrats complexes (diffeacuterents types de deacutechets ou drsquoeffluents) [8] Neacuteanmoins un temps de

latence est neacutecessaire pour pouvoir fonctionner En raison de la nature vivante des

biocatalyseurs les PCMs ont besoin drsquoune peacuteriode de croissance pour former le biofilm Les

PCMs sont geacuteneacuteralement destineacutees agrave ecirctre employeacutees pour le traitement des eaux useacutees ougrave la

matiegravere organique est deacutecomposeacutee par les bacteacuteries en concomitance avec la production

drsquoeacutelectriciteacute [9] Elles peuvent aussi ecirctre utiliseacutees pour faire fonctionner des dispositifs de taille

reacuteduite en tant que biocapteurs ou pour la production drsquohydrogegravene [10] Actuellement la

performance des PCMs (pour des volumes de reacuteacteur de 1 L) est encore infeacuterieure agrave lrsquoobjectif

de 1 kWcm3 puissance neacutecessaire pour produire de lrsquoeacutenergie agrave partir de matiegraveres organiques

pour des applications industrielles [11] Afin donc drsquoaugmenter la puissance deacutelivreacutee il est

neacutecessaire drsquoapporter des ameacuteliorations technologiques (mateacuteriaux drsquoeacutelectrodes) et de mieux

comprendre les processus biologiques [12]

Les biopiles agrave mitochondries utilisent en tant que biocatalyseur agrave lrsquoanode des mitochondries

pour fonctionner [13 14] Ces derniegraveres sont constitueacutees drsquoune membrane externe et drsquoune

membrane interne formeacutee de crecirctes augmentant sa surface (Figure I5)


13

Figure I5 Scheacutema de la mitochondrie

Elles sont le siegravege du cycle de Krebs Les mitochondries constituent des organelles (ce

terme deacutesigne des structures speacutecialiseacutees contenues dans le cytoplasme et deacutelimiteacutees du reste

de la cellule par une membrane phospholipidique) inteacuteressantes en raison du fait qursquoelles sont

capables de meacutetaboliser complegravetement le pyruvate qui est le produit final de la deacutegradation du

glucose et les acides gras en dioxyde de carbone Elles peuvent aussi deacutegrader les proteacuteines en

acides amineacutes Ces biopiles constituent des dispositifs prometteurs du fait qursquoelles renferment

quelques-unes des proprieacuteteacutes attrayantes des biopiles microbiennes (oxydation de substrats

organiques complexes) et enzymatiques (puissances du mecircme ordre de grandeur) Minteer et

al ont eacuteteacute les premiers agrave montrer expeacuterimentalement que des mitochondries pouvaient oxyder

un carburant agrave lrsquoanode (la puissance fournie est de 0203 mWcm2) Ils ont observeacute lrsquooxydation

complegravete du pyruvate et une viabiliteacute du dispositif durant soixante jours En outre les

mitochondries ont montreacute une capaciteacute agrave effectuer un transfert drsquoeacutelectrons non meacutedieacute agrave travers

leurs cytochromes de surface [15]


Au cours de ce travail on srsquoest inteacuteresseacute aux biopiles enzymatiques Ces derniegraveres utilisent

une enzyme et plus particuliegraverement une enzyme drsquooxydo-reacuteduction pour catalyser la reacuteaction

drsquooxydation du glucose agrave lrsquoanode et de reacuteduction du dioxygegravene en eau agrave la cathode (Figure I6)

Il srsquoagit drsquoune reacuteaction de reacuteduction agrave quatre eacutelectrons Les enzymes possegravedent la particulariteacute

drsquoecirctre speacutecifiques vis-agrave-vis de leur substrat


14

Figure I6 Scheacutema de principe drsquoune pile agrave combustible enzymatique

I2Les enzymes employeacutees dans les biopiles enzymatiques Avant de deacutecrire les enzymes employeacutees dans les biopiles enzymatiques et plus

particuliegraverement la laccase B de Trametes versicolor on va tout drsquoabord srsquoattarder sur la

structure drsquoune enzyme et sur son principe de fonctionnement

I21Geacuteneacuteraliteacutes sur les enzymes

I211La structure drsquoune enzyme

A lrsquoexception de quelques enzymes composeacutees drsquoARN les enzymes sont des proteacuteines

ayant des proprieacuteteacutes catalytiques Elles se composent drsquoune partie proteacuteique appeleacutee apoenzyme

(elle forme le corps de lrsquoenzyme) constitueacutee drsquoun enchainement drsquoacides amineacutes (moleacutecule

organique composeacutee drsquoun atome de carbone asymeacutetrique qui porte une fonction acide amine

et une chaine lateacuterale appeleacutee reacutesidu) lieacutes entre eux par des liaisons amides (liaisons

peptidiques) (Figure I7) Une liaison amide reacutesulte de la condensation du groupe α-carboxyle

drsquoun acide amineacute avec le groupe α-amineacute de lrsquoacide amineacute suivant dans la chaine On lrsquoappelle

la chaine peptidique

Figure I7 Liaison peptidique entre deux acides amineacutes dans une chaine peptidique


15

Lrsquoextreacutemiteacute drsquoun polypeptide comportant un groupement amine libre srsquoappelle lrsquoextreacutemiteacute

amino-terminale (N-terminale) et celle comportant un groupement carboxylique libre

lrsquoextreacutemiteacute carboxy-terminale (C-terminale) Par convention la numeacuterotation des reacutesidus

commence agrave lrsquoextreacutemiteacute N-terminale La liaison peptidique est plane Une rotation est possible

autour du carbone alpha qui porte le reacutesidu de lrsquoacide amineacute

On distingue quatre niveaux structuraux chez les enzymes (proteacuteines) La structure

primaire correspond agrave la seacutequence en acides amineacutes de la proteacuteine (Figure I8)

Figure I8 Structure primaire drsquoune enzyme

La structure secondaire est relative au premier niveau de compaction Elle consiste en un

repliement des acides amineacutes en heacutelices alpha ou en feuillets beacuteta dont il existe deux formes

les feuillets parallegraveles et antiparallegraveles (Figure I9) Lrsquoheacutelice alpha est constitueacutee par

lrsquoenroulement reacutegulier drsquoune chaine polypeptidique sur elle-mecircme Elle reacutesulte de la formation

drsquoune liaison hydrogegravene entre des groupements C=O et N-H proches lrsquoun de lrsquoautre dans la

chaine Dans une heacutelice alpha lrsquoatome drsquooxygegravene du carbonyle de chaque reacutesidu (acide amineacute)

forme une liaison hydrogegravene (qui va stabiliser la structure) avec lrsquoazote du groupement amide

situeacute quatre reacutesidus plus loin dans la chaine Le reacutesultat est une structure cylindrique ougrave les

reacutesidus sont situeacutes agrave lrsquoexteacuterieur de lrsquoheacutelice Elles deacutetermineront les interactions de lrsquoheacutelice alpha

avec les autres parties de lrsquoenzyme Dans les feuillets beacuteta (brins beacuteta) deux chaines srsquoassocient

entre elles via des liaisons hydrogegravenes Ces chaines peuvent ecirctre orienteacutees dans le mecircme sens

(feuillet beacuteta parallegravele) crsquoest-agrave-dire par numeacuterotation croissante des reacutesidus des deux chaines ou


16

en sens inverse (feuillet antiparallegravele) agrave savoir par ordre croissant pour lrsquoune des chaines et

deacutecroissant pour lrsquoautre Il existe aussi des feuillets mixtes

Figure I9 Structure secondaire drsquoune enzyme agrave gauche lrsquoheacutelice alpha et agrave droite un feuillet

β

La structure tertiaire correspond agrave la compaction des structures secondaires entre elles et

enfin la structure quaternaire correspond agrave lrsquoassemblage de plusieurs sous-uniteacutes proteacuteiques

ayant une structure tertiaire

La partie proteacuteique (apoenzyme) est parfois preacutesente seule dans ce cas il srsquoagit drsquoune

enzyme purement proteacuteique (holoenzyme) Certaines enzymes sont constitueacutees drsquoune partie non

proteacuteique appeleacutee cofacteur lorsque celle-ci nrsquoest pas lieacutee de faccedilon covalente agrave la chaine

peptidique ou groupement prostheacutetique dans le cas inverse Ce complexe apoenzyme-cofacteur

forme ce que lrsquoon appelle une heacuteteacuteroenzyme Cette partie non proteacuteique est primordiale pour

lrsquoactiviteacute catalytique de lrsquoenzyme En effet les heacuteteacuteroenzymes ne peuvent pas fonctionner en

lrsquoabsence de leur cofacteur (il constitue une des parties actives de lrsquoenzyme)

Une enzyme nrsquoest pas seulement caracteacuteriseacutee par sa structure primaire ou sa configuration

dans lrsquoespace (structure secondaire agrave tertiaire) Elle a aussi des caracteacuteristiques qui lui sont

confeacutereacutees au cours de son processus de synthegravese On parle de modifications post-

traductionnelles Ces modifications consistent agrave modifier la nature chimique drsquoacides amineacutes

ce qui a pour effet drsquoen modifier les proprieacuteteacutes physiques et chimiques La glycosylation

constitue une modification post traductionnelle qui joue un rocircle important dans le repliement

de lrsquoenzyme sa stabiliteacute ou certains pheacutenomegravenes de signalisation cellulaires Elle consiste agrave lier

un sucre (glucide) agrave une proteacuteine Les chaines polysaccharides sont souvent ramifieacutees Les


17

chaines glucidiques sont lieacutees aux proteacuteines par des liaisons O-glycosidiques ou N-

glycosidiques selon leur site drsquoancrage Les chaines lieacutees par des liaisons O-glycosidiques sont

plus courtes ne contiennent que un agrave trois reacutesidus glucidiques La liaison est eacutetablie entre la N-

aceacutetyl galactosamine (GalNAc) et les reacutesidus OH des acides amineacutees seacuterines (Ser) et threacuteonines

(Thr) Les chaines N-glycosidiques sont ancreacutees sur lrsquoazote du groupement amide de

lrsquoasparagine Le sucre qui est lieacute agrave lrsquoasparagine est le N-acetylglucosamine (GlcNAc) Ils

peuvent former des arborescences Le site drsquoattachement des chaines lieacutees en N est situeacute dans

la zone consensus N-X-SerThr de la seacutequence en acides amineacutes de la proteacuteine Ces chaines

contiennent toutes une structure constitueacutee de deux GlcNAc et de trois mannoses auxquels

viennent se greffer drsquoautres glucides

I212Meacutecanisme et cineacutetique des reacuteactions enzymatiques

Les enzymes sont des catalyseurs biologiques speacutecifiques crsquoest-agrave-dire qursquoune enzyme

donneacutee ne peut catalyser qursquoun seul type de reacuteaction chimique On distingue six grandes classes

selon le type de reacuteactions catalyseacutees

-Les oxydoreacuteductases catalysent les reacuteactions drsquooxydoreacuteduction

-Les transfeacuterases transfert un groupement fonctionnel drsquoune moleacutecule agrave une autre

-Les hydrolases catalysent la coupure de liaisons par hydrolyse

-Les lyases catalysent la coupure de liaisons par eacutelimination

-Les isomeacuterases catalysent les reacuteactions de changement dans la configuration du substrat

-Les ligases catalysent la condensation de deux moleacutecules

La vitesse de reacuteaction drsquoune reacuteaction enzymatique deacutefinit lrsquoactiviteacute enzymatique Celle-ci

est exprimeacutee en quantiteacute de substrat transformeacutee par uniteacute de temps par quantiteacute drsquoenzyme Le

meacutecanisme le plus couramment utiliseacute pour expliquer le processus catalytique est celui de

Michaelis-Menten Il a proposeacute que la reacuteaction globale soit composeacutee de deux reacuteactions

eacuteleacutementaires le substrat forme drsquoabord un complexe avec lrsquoenzyme puis ce complexe se

deacutecompose en produit La reacuteaction suivante reacutesume ces diffeacuterentes eacutetapes

Ougrave E S ES et P symbolisent lrsquoenzyme le substrat le complexe enzyme-substrat et le

produit respectivement


18

Il deacutecoule drsquoapregraves cette reacuteaction que la vitesse de formation du produit peut srsquoeacutecrire selon

lrsquoEquation I1 suivante

V=kcat k1[E]totale [S]

k1 [S] + (k-1 + kcat) harr V=

Vm [S]

[S] + KM (Eq I1)

Vm vitesse maximale de la reacuteaction catalytique KM=k-1+ kcat

k1

(mM) constante de Michaelis [S]

concentration en substrat k1 constante de vitesse de la formation du complexe k-1 constante

de vitesse de disparition du complexe et kcat (s-1) constante catalytique de lrsquoenzyme

La constante de Michaelis (KM) et la constante de vitesse (kcat) sont les deux constantes

permettant de caracteacuteriser la cineacutetique drsquoune reacuteaction enzymatique kcat est une constante de

vitesse du premier ordre Elle repreacutesente la freacutequence agrave laquelle lrsquoenzyme accomplit lrsquoacte

catalytique crsquoest-agrave-dire en anglais son turnover La valeur de kcat donne la mesure de lrsquoefficaciteacute

de la catalyse du substrat par lrsquoenzyme KM repreacutesente lrsquoaffiniteacute du substrat pour lrsquoenzyme

Lrsquoaffiniteacute de ce dernier est drsquoautant plus grande que la valeur de la constante de Michaelis est

petite Le Tableau I1 preacutesente des exemples de KM et kcat pour certaines enzymes

Tableau I1 Exemples de constantes de Michaelis et de vitesses pour diffeacuterentes enzymes

Enzyme substrat KM kcat kcat KM

Aceacutetylcholinesteacuterase Aceacutetylcholine 95times10-5 14times104 15times108

Anhydrase

carbonique

CO2

HCO3-

12times10-2

26times10-2

10times106

40times105

83times107

15times107

Catalase H2O2 25times10-2 10times107 40times108

Fumarase Fumarate

Malate

50times10-6

25times10-5

80times102

90times102

16times108

36times107

Ureacutease Ureacutee 25times10-2 10times104 40times105

Laccase ABTS (pH = 3) 60times10-5 22times102 37times106

I22Les enzymes oxydoreacuteductases

Les enzymes utiliseacutees dans les piles agrave combustible enzymatiques appartiennent agrave la famille

des oxydoreacuteductases Elles sont constitueacutees par une partie proteacuteique (apoenzyme) et une partie

non proteacuteique (cofacteurmeacutetal) Elles catalysent les reacuteactions drsquooxydoreacuteduction On distingue


19

-Les oxydases elles catalysent une reacuteaction drsquooxydoreacuteduction impliquant une moleacutecule de

dioxygegravene Dans ces reacuteactions lrsquooxygegravene est reacuteduit en eau ou en peroxyde drsquohydrogegravene

-Les reacuteductases elles diminuent lrsquoeacutenergie drsquoactivation drsquoune reacuteaction drsquooxydoreacuteduction

-Les peroxydases elles catalysent la reacuteaction drsquooxydation de substrats speacutecifiques agrave lrsquoaide du

peroxyde drsquohydrogegravene

-Les oxygeacutenases elles oxydent un substrat en y transfeacuterant un atome drsquooxygegravene issu du

dioxygegravene

-Les dioxygeacutenases elles assurent lrsquoincorporation de deux atomes drsquooxygegravene dans une

moleacutecule

-Les hydrogeacutenases elles catalysent la conversion des protons en dihydrogegravene (reacuteaction

reacuteversible) Les sites actifs de ces enzymes sont de nature organomeacutetallique

-Les deacuteshydrogeacutenases elles oxydent un substrat par le transfert drsquoun ou plusieurs protons agrave un

accepteur geacuteneacuteralement un coenzyme tel que la pyrroloquinoleacuteine quinone (PQQ) ou la flavine

adeacutenine dinucleacuteotide (FAD)

I221Les enzymes employeacutees dans le compartiment anodique

Dans le compartiment anodique les enzymes utiliseacutees peuvent ecirctre classeacutees en trois

groupes selon le cofacteur auquel elles sont associeacutees [16] Le premier groupe est formeacute par les

enzymes utilisant comme cofacteur la pyrroloquinoleacuteine quinone (PQQ) telles que la glucose

deacuteshydrogeacutenase (GDH) lrsquoalcool deacuteshydrogeacutenase et la glyceacuterol deacuteshydrogeacutenase eacutetant signaleacute

que le cofacteur PQQ est lieacute agrave lrsquoenzyme Le deuxiegraveme groupe comprend les enzymes utilisant

comme cofacteur soit le nicotinamide adeacutenine dinucleacuteotide (NADHNAD+) ou le nicotinamide

adeacutenine dinucleacuteotide phosphate (NADPHNADP+) On peut citer aussi comme enzyme la

glucose deacuteshydrogeacutenase et lrsquoalcool deacuteshydrogeacutenase Dans ce type drsquoenzyme le cofacteur

centre redox nrsquoest que faiblement lieacute agrave la structure proteacuteique de lrsquoenzyme Cette caracteacuteristique

permet agrave lenzyme de transfeacuterer des eacutelectrons agrave leacutelectrode par diffusion du cofacteur Les

enzymes appartenant agrave la troisiegraveme cateacutegorie ont comme cofacteur la flavine adeacutenine

dinucleacuteotide (FAD) Ce cofacteur est eacutetroitement lieacute agrave la structure proteacuteique de lrsquoenzyme de

faccedilon covalente ou non Il est geacuteneacuteralement enfouit profondeacutement dans la structure de

lrsquoenzyme Lenzyme agrave FAD la plus couramment utiliseacutee dans le domaine des biopiles est la


20

glucose oxydase (GOx) Il a eacuteteacute reacutecemment eacutetablit que la GOx ne peut eacutetablir de transfert

eacutelectronique direct avec lrsquoeacutelectrode son utilisation dans les biopiles requiert donc un meacutediateur

Trois carburants sont principalement utiliseacutes pour le fonctionnement de lrsquoanode

lrsquohydrogegravene les alcools (meacutethanol eacutethanol) et les sucres (glucose lactose fructose) La glucose

oxydase drsquoAspergillus niger est lrsquoenzyme la plus largement utiliseacutee dans les biopiles

enzymatiques pour reacuteduire le glucose [2] Il srsquoagit drsquoune enzyme homodimeacuterique crsquoest-agrave-dire

qursquoelle est formeacutee de deux sous-uniteacutes polypeptidiques identiques A lrsquointeacuterieur de chacune de

ces sous-uniteacutes est enfoui le cofacteur responsable de lrsquooxydation du glucose agrave savoir la FAD

Ce biocatalyseur possegravede une speacutecificiteacute une activiteacute et une stabiliteacute tregraves eacuteleveacutees vis-agrave-vis du

beta-d-glucose preacutesent dans les fluides biologiques par comparaison agrave drsquoautres enzymes

employeacutees pour lrsquooxydation du glucose Le glucose srsquooxyde en gluconolactone (ce dernier

srsquohydrolyse ensuite en acide gluconique) par un processus agrave deux eacutelectrons et deux protons La

GOx est ensuite reacutegeacuteneacutereacutee en reacuteagissant avec lrsquooxygegravene Cette enzyme preacutesente certains

inconveacutenients En effet sa grande taille et le fait que son site actif soit enfoui dans sa structure

rendent difficile le transfert drsquoeacutelectrons direct en raison de la longue distance (supeacuterieure agrave

lrsquoeffet tunnel) et augmentent les contraintes steacuteriques Par ailleurs lrsquooxygegravene eacutetant un substrat

de la GOx une compeacutetition entre les reacuteactions drsquooxydation du substrat et de reacuteduction du

dioxygegravene peuvent entraicircner une baisse des performances de la biopile enzymatique [17] Une

autre enzyme pouvant ecirctre employeacutee pour lrsquooxydation du glucose est la cellobiose

deacuteshydrogeacutenase (CDH) Cette derniegravere a susciteacute une attention croissante durant ces derniegraveres

anneacutees en tant qursquoenzyme utiliseacutee pour effectuer le transfert drsquoeacutelectrons direct dans les biopiles

enzymatiques La CDH se compose de deux domaines distincts un domaine contenant une

FAD et un autre domaine contenant un hegraveme La FAD est responsable de lrsquooxydation du

substrat Elle est par la suite reacutegeacuteneacutereacutee en transfeacuterant successivement les deux eacutelectrons agrave

lrsquohegraveme Lrsquohegraveme facilite le couplage eacutelectrique avec le mateacuteriau drsquoeacutelectrode Il faut savoir que

le glucose nrsquoest pas le substrat (cible) de la CDH Lrsquoefficaciteacute catalytique de cette enzyme nrsquoest

donc pas aussi eacuteleveacutee que celle de la GOx Le substrat natif de la CDH est la cellobiose mais

lrsquoenzyme est capable drsquooxyder aussi le lactose avec un fort rendement Les glucoses

deacuteshydrogeacutenases (GDH) sont aussi ces derniegraveres anneacutees tregraves utiliseacutees pour oxyder le mecircme

substrat Le fructose constitue aussi un carburant glucidique pour les biopiles enzymatiques La

fructose deacuteshydrogeacutenase se composant aussi de deux domaines (un domaine contenant un DFC


21

et un autre un hegraveme) est utiliseacutee pour oxyder ce carburant La GDH et la FDH preacutesentent

lrsquoavantage de ne pas reacuteduire lrsquooxygegravene contrairement agrave la GOx Pour les alcools et lrsquohydrogegravene

on peut utiliser comme enzyme lrsquoalcool deacuteshydrogeacutenase et les hydrogeacutenases respectivement

I222Les enzymes employeacutees dans le compartiment cathodique

Au cours de ce travail on srsquoest inteacuteresseacute au compartiment cathodique de la biopile

enzymatique Les enzymes les plus largement utiliseacutees appartiennent agrave la famille des oxydases

multi-cuivres (MCOs) Elles constituent une famille drsquoenzymes capables drsquooxyder divers

substrats concomitamment avec la reacuteduction de lrsquooxygegravene en eau Elles peuvent ecirctre diviseacutees

en deux cateacutegories On distingue les MCOs capables drsquooxyder des substrats organiques

(oxydases organiques) tels que les pheacutenols Dans cette cateacutegorie on retrouve les laccases les

bilirubines oxydases et lrsquoascorbate oxydase Le deuxiegraveme type de MCOs est capable drsquooxyder

des ions meacutetalliques (meacutetalloxydases) [18] Les meacutetalloxydases sont speacutecifiques vis-agrave-vis de

leur substrat tandis que les oxydases organiques preacutesentent une large varieacuteteacute de substrats Le

bilan de la reacuteaction enzymatique est le suivant

4 H+ + 4 substrats + O2 2 H2O + 4 produits

Les MCOs contiennent quatre atomes de cuivre pouvant ecirctre classeacutes en trois cateacutegories

selon leurs caracteacuteristiques spectroscopiques On distingue le cuivre T1 caracteacuteriseacute par une

absorption intense agrave lrsquoorigine de la coloration bleue dans le domaine du visible (600 nm) en

raison de la liaison covalente entre le cuivre et le ligand histidine Il possegravede aussi un signal en

reacutesonance magneacutetique nucleacuteaire (RMN) Ce cuivre constitue le site drsquoentreacutee des eacutelectrons agrave

partir de divers substrats (il srsquoagit du site ougrave se deacuteroule la reacuteaction drsquooxydation du substrat) Le

cuivre T2 ne preacutesente aucune bande drsquoabsorption mais preacutesente des proprieacuteteacutes paramagneacutetiques

Le centre cuivrique bi-nucleacuteaire T3 preacutesente quant agrave lui une absorption intense agrave 330 nm ducirce

au pont hydroxyde reliant les deux atomes de cuivre Les sites de cuivre T2 et bi-nucleacuteaire T3

forment ce que lrsquoon appelle un cluster trinucleacuteaire La reacuteaction de reacuteduction de lrsquooxygegravene en

eau srsquoeffectue au niveau de ce cluster (Figure I10) [19]

Figure I10 Reacuteactions catalyseacutees par les MCOs


22

Sur la base des eacutetudes cristallographiques lrsquoenvironnement des cuivres a eacuteteacute deacutetermineacute Le

cuivre T1 est coordonneacute au minimum par deux ligands histidines et un ligand cysteacuteine Dans de

nombreux MCOs un quatriegraveme ligand en position axiale (la meacutethionine) peut ecirctre coordonneacute

agrave lrsquoatome de cuivre La coordinence du cuivre est eacutegale agrave quatre Cette structure a eacuteteacute retrouveacutee

chez certaines varieacuteteacutes de laccases issues des veacutegeacutetaux Lorsque le cuivre est seulement

coordonneacute agrave 3 ligands il possegravede une geacuteomeacutetrie trigonale plane Un reacutesidu hydrophobe

(pheacutenylalanine ou leucine) non coordonneacute est situeacute en position axial On retrouve cette structure

dans les laccases issues de champignons Le cluster tri-nucleacuteaire est situeacute agrave une distance de 13

Å environ du cuivre T1 Le cuivre T1 est connecteacute au cluster par un tri-peptide histidine-

cysteacuteine-histidine Le cuivre T2 du cluster est coordonneacute agrave deux ligands histidines et un ligand

aqueux (H2O) situeacute en dehors du cluster Les deux cuivres formant le centre bi-nucleacuteaire sont

coordonneacutes chacun agrave trois ligands histidines A lrsquoeacutetat oxydeacute ils sont relieacutes par un pont

hydroxyde [20]

Figure I11 Meacutecanisme de reacuteduction du dioxygegravene [21]


23

Le meacutecanisme catalytique de reacuteduction du dioxygegravene par les MCOs a eacuteteacute largement eacutetudieacute

dans la litteacuterature (Figure I11) Il est constitueacute de deux eacutetapes de reacuteduction agrave deux eacutelectrons Il

implique un transfert intramoleacuteculaire rapide de quatre eacutelectrons du cuivre T1 au cluster tri-

nucleacuteaire Tout drsquoabord la forme reacuteduite de lrsquoenzyme va reacuteagir avec le dioxygegravene avec une

constante de vitesse de 17times106 M-1 s-1 pour former un intermeacutediaire peroxyde Au sein de cet

intermeacutediaire le dioxygegravene gagne deux eacutelectrons et est coordineacute avec les trois atomes de cuivre

formant le cluster tri-nucleacuteaire Le cuivre T2 et lrsquoun des cuivres du centre bi-nucleacuteaire sont agrave

lrsquoeacutetat oxydeacute La liaison O-O de cet intermeacutediaire suite agrave un transfert drsquoun eacutelectron et drsquoun proton

du cuivre T1 va se cliver afin de former lrsquointermeacutediaire natif dans lequel lrsquoensemble des cuivres

sont agrave lrsquoeacutetat oxydeacute Les atomes drsquooxygegravene totalement reacuteduits restent lieacutes en tant que ligand

(pontant) au cluster tri-nucleacuteaire Cette eacutetape de clivage est cineacutetiquement deacuteterminante La

constante de vitesse est supeacuterieure agrave 350 s-1 La reacuteduction rapide agrave quatre eacutelectrons des centres

cuivriques de lrsquointermeacutediaire natif conduit par la suite agrave la libeacuteration de deux moleacutecules drsquoeau

et agrave la reacutegeacuteneacuteration de lrsquoenzyme (enzyme reacuteduite) En lrsquoabsence de substrat reacuteducteur

lrsquointermeacutediaire natif se transforme lentement en une enzyme oxydeacutee ougrave les trois atomes de

cuivre constituant le cluster sont agrave lrsquoeacutetat oxydeacute Une moleacutecule drsquoeau situeacutee agrave lrsquointeacuterieur du

cluster est libeacutereacutee tandis que les autres forment un pont hydroxyde entre les centres cuivriques

T3 Bien que le meacutecanisme de reacuteduction du dioxygegravene soit tregraves bien deacutecrit dans la litteacuterature

lrsquoeacutetape dans laquelle le substrat est oxydeacute et le cluster tri-nucleacuteaire est reacuteduit est moins connue

Dans cette eacutetape quatre eacutelectrons successifs reacuteduisent le Cu(I) au site T1 en concomitance avec

le transfert intramoleacuteculaire des eacutelectrons entre le cuivre du site T1 et le cluster T2T3 [19-21]

Il faut savoir que le substrat reacuteducteur peut ecirctre remplaceacute par une eacutelectrode Pour cette

raison en plus du fait que les MCOs sont capables de reacuteduire lrsquooxygegravene les MCOs ont eacuteteacute

utiliseacutees en tant que catalyseur cathodique dans les biopiles enzymatiques La laccase et la

bilirubine oxydase sont geacuteneacuteralement utiliseacutees dans ce dispositif (pour la reacuteduction du

dioxygegravene) Dans une moindre mesure la cytochrome oxydase et le cytochrome c deux

enzymes dont le site actif est composeacute drsquoun centre heacutemique ont eacutegalement eacuteteacute utiliseacutees [22]

Dans le cas de la reacuteduction de H2O2 la micropeacuteroxydase [23 24] et la peroxydase de raifort

[25] sont couramment utiliseacutees Le Tableau I2 regroupe les principales enzymes utiliseacutees dans

le compartiment cathodique des biopiles On va srsquointeacuteresser ci-apregraves agrave la laccase B de Trametes

versicolor


24

Tableau I2 Enzymes utiliseacutees dans le compartiment cathodique drsquoune biopile [22]

Oxydant Enzyme MeacutetalCofacteur Demi-reacuteaction

Oxygegravene

laccase

bilirubine oxydase

cytochrome oxydase

cytochrome c

Cu

Cu

Cu Fehegraveme

Fehegraveme

O2 +4H+ + 4e- 2H2O

peroxyde

drsquohydrogegravene

micropeacuteroxydase-11

peroxydase de Raifort

Fehegraveme

Fehegraveme

H2O2 + 2H+ + 2e-

2H2O

I23La laccase

La laccase a eacuteteacute deacutecouverte pour la premiegravere fois en 1883 par Yoshida chez une varieacuteteacute

drsquoarbre le Rhus vernifica Depuis cette deacutecouverte elle a eacuteteacute identifieacutee dans dautres veacutegeacutetaux

(mangue pecircchehellip) dans des bacteacuteries (Azospirillum lipoferum) chez certains insectes

(Bombyx calliphora) et surtout chez un grand nombre de champignons Plus de soixante espegraveces

de champignons producteurs de laccase ont eacuteteacute deacutecrites agrave ce jour Les plus importants sont

essentiellement des basidiomycegravetes tels que le Trametes versicolor (T versicolor) un

champignon de la pourriture blanche (observeacutee au cours de la deacutegradation du bois)

I231Caracteacuteristiques physico-chimiques des laccases

La laccase est en fait un meacutelange de plusieurs isoformes Pour un champignon donneacute la

production de laccases deacutepend de la souche utiliseacutee de la preacutesence ou non drsquoinducteur et de la

dureacutee de la culture du microorganisme Le champignon Trametes versicolor sur lequel on srsquoest

focaliseacute lors de ce travail produit principalement la laccase dite A en lrsquoabsence drsquoinducteur

alors qursquoen preacutesence drsquoinducteur la laccase B est majoritaire

En geacuteneacuteral les laccases ont une masse molaire moleacuteculaire comprise entre 60 et 100 kDa

dont environ 10 agrave 50 sont attribueacutes agrave la glycosylation Les points isoeacutelectriques (pI) des

laccases des champignons sont situeacutes entre 3 et 7 tandis que ceux des laccases produites par les

plantes sont environ de 9 Les laccases ont une bonne stabiliteacute thermique entre 5 et 55degC et sont

relativement solubles dans lrsquoeau Le Tableau I3 donne les caracteacuteristiques de laccases issues

de diffeacuterents organismes


25

Tableau I3 Exemples de quelques laccases et leurs caracteacuteristiques [26]

Champignons Masse moleacuteculaire

(kDa)

pI Glycosylation ()

Phlebia radiata 64 35 2

Pleurotus ostreatus 64 29 134

Rhus vernicifera 110 86 45

Trametes villosa 63 35-65 05

Trametes versicolor 67 32 14

Les laccases ont des potentiels drsquooxydoreacuteduction variables (04 agrave 08 VENH) selon les

espegraveces qui les produisent La laccase B de Trametes versicolor qui nous inteacuteresse est une

laccase bleue de poids moleacuteculaire de 60 agrave 70 kDa et de pI eacutegal agrave 35 Elle possegravede un potentiel

drsquooxydoreacuteduction autour de 078 VENH Lrsquoactiviteacute catalytique des laccases est souvent inhibeacutee

par les halogeacutenures les hydroxydes et les ions urates Ters et al suggegravere que les halogeacutenures

par exemple se lient au cluster ce qui restreint son accegraves [27]

I232Structure de la laccase B de Trametes versicolor

La laccase B T versicolor a pour dimensions 70times50times50 Å Elle est constitueacutee drsquoheacutelices

alpha en rouge et essentiellement de feuillets beacuteta antiparallegraveles en vert [28] (Figure I12A)

Lrsquoeacutetude cristallographique de sa structure a permis de preacuteciser lrsquoenvironnement des quatre ions

cuivriques (Figure I12B) qui avaient preacuteceacutedemment eacuteteacute eacutetudieacutes par des meacutethodes

spectroscopiques

Figure I12 Scheacutema A) de la laccase B de Trametes versicolor En vert les feuillets beacuteta et

en rouge les heacutelices alpha et B) de lrsquoenvironnement des centres cuivriques (Scheacutemas obtenus

agrave lrsquoaide du logiciel Rasmol v 26)

A B


26

Le cuivre T1 (Figure I13) possegravede une geacuteomeacutetrie bipyramidale trigonale il est coordonneacute

agrave deux ligands histidines (His 395 et 458) un ligand cysteacuteine (Cys 453) situeacute en position

eacutequatoriale et un ligand pheacutenylalanine (Phe 463) en position axiale (liaison non covalente

lrsquoautre position axiale nrsquoeacutetant pas occupeacutee elle est donc libre drsquoaccueillir le substrat) Le cuivre

T1 se situe agrave une distance de 65 Å de la surface de lrsquoenzyme On note la preacutesence drsquoune caviteacute

assez large proche de ce cuivre permettant lrsquoaccegraves agrave plusieurs types de substrats Cette caviteacute a

pour dimension 10times10times20 Ȧ

Figure I13 Structure du centre cuivrique T1 de la laccase B de Tversicolor

Le centre T2 possegravede une geacuteomeacutetrie teacutetraeacutedrique deacuteformeacutee (Figure I14A) Il est coordonneacute

agrave deux ligands histidines et un ligand aqueux (H2O ou OH-) Concernant le centre bi-nucleacuteaire

T3 composeacute de deux cuivres (Cua et Cub) chaque cuivre est coordonneacute agrave trois ligands

histidines histidines 66 109 et 454 pour Cua (Figure I14B) et histidines 111 400 et 452 pour

Cub (Figure I14B et Figure I14C) Le Cuivre T2 est plus exposeacute et plus labile que le centre

T3 La distance seacuteparant le site T1 au centre T2T3 est de 12 Ȧ [29]

Figure I14 Structure du cluster tri-nucleacuteaire de la laccase B de T versicolor A) cuivre T2

B) cuivre T3a et C) cuivre T3b

A B C


27

Le point isoeacutelectrique de la laccase B est drsquoenviron 3 lrsquoenzyme contient donc plus drsquoacides

amineacutes de type acide que de type basique 45 acides aspartiques et glutamiques (dont la chaicircne

lateacuterale porte une fonction acide carboxylique) reacutepartis de maniegravere aleacuteatoire agrave la surface de

lrsquoenzyme contre seulement cinq lysines (71 174 194 59 et 157) La laccase contient

eacutegalement six sites potentiels de N-glycosylation ayant un consensus N-X-Thr Les asparagines

(Asn) concerneacutees sont les Asn 51 54 208 217 333 et 436 Lrsquoeacutetude cristallographique a

clairement mis en eacutevidence la glycosylation de quatre de ces asparagines (Asn 54 217 333 et

436) (Figure I15)

Figure I15 Scheacutema repreacutesentant les lysines (en bleu) les acides aspartiques et glutamiques

(en jaune) et les sites de glycosylation (en azur) de la laccase B de T versicolor En vert la

xylidine (inducteur) proche du cuivre T1

I233Applications industrielles de la laccase

La laccase peut ecirctre utiliseacutee dans une large gamme drsquoapplications industrielles du fait de

sa speacutecificiteacute relativement faible Dans lrsquoindustrie du papier par exemple elle peut ecirctre utiliseacutee

pour remplacer les composeacutes chloreacutes utiliseacutes dans lrsquoeacutetape de blanchiment de la pacircte agrave papier

(deacutelignification) Lrsquoutilisation de composeacutes chloreacutes preacutesente en effet plusieurs

inconveacutenients tels que le rejet drsquoeffluents toxiques pour lrsquoenvironnement Bourbonnais et al

ont deacutemontreacute que la laccase pouvait constituer une alternative agrave lrsquoutilisation de ces reacuteactifs [30]

LYS 59

LYS 157

LYS 71

LYS 174

LYS 194

Asn 54

Asn 333

Asn 436


28

Car elle permet de deacutelignifier de maniegravere efficace la pacircte agrave papier Or crsquoest la preacutesence de

reacutesidus de lignine qui provoque le jaunissement du papier La laccase peut ecirctre eacutegalement

utiliseacutee dans le domaine de la deacutepollution environnement Les hydrocarbures aromatiques

polycycliques (HAP) constituent des composeacutes toxiques largement preacutesents dans les milieux

aquatiques La laccase est capable de les oxyder en des moleacutecules moins dangereuses Pour

pouvoir les transformer un meacutediateur redox est neacutecessaire Dans le domaine cosmeacutetique la

teinture des cheveux neacutecessite lrsquoutilisation drsquoagents chimiques assez agressifs pouvant

endommager les cheveux Les preacutecurseurs de colorants peuvent ecirctre oxydeacutes dans la teinture

souhaiteacutee en utilisant la laccase comme solution de remplacement

La stabilisation du vin est lrsquoune des principales applications de la laccase dans lrsquoindustrie

alimentaire Le vin constitue un meacutelange assez complexe de composeacutes chimiques (il contient

de lrsquoeacutethanol des acides organiques des sels et des composeacutes pheacutenoliques) Il est primordial que

ses caracteacuteristiques gustatives restent constantes jusqursquoagrave la consommation (suffisamment

stables au moins durant la premiegravere anneacutee de stockage) Dans certaines conditions fortement

lieacutees agrave la preacutesence de polypheacutenols le vin srsquooxyde et il en reacutesulte un changement de couleur et

drsquoarocircmes Diffeacuterentes meacutethodes ont eacuteteacute employeacutees afin drsquoeacuteviter la deacutecoloration et lrsquoalteacuteration

de la saveur dans les vins tels que lrsquoeacutelimination des groupements pheacutenoliques avec la

polyvinylpolyrrolidone (PVPP polymegravere organique) Le PVPP possegravede une forte affiniteacute vis-

agrave-vis des polypheacutenols Il faut savoir que lrsquoeacutelimination des polypheacutenols doit ecirctre seacutelective afin

drsquoeacuteviter toute alteacuteration indeacutesirable des caracteacuteristiques du vin Une alternative aux adsorbants

physico-chimiques pourrait ecirctre lrsquoutilisation de la laccase qui ciblerait les polypheacutenols durant

le processus de fabrication Ces substances polypheacutenoliques seraient ainsi oxydeacutees par

lrsquoenzyme polymeacuteriseacutees puis eacutelimineacutees par clarification La laccase nrsquoeacutetant pas consideacutereacutee

comme un additif alimentaire elle est utiliseacutee sous forme immobiliseacutee ce qui permet son

eacutelimination du vin et donc sa reacuteutilisation Le deacuteveloppement de troubles dans les biegraveres lors

du stockage est un problegraveme persistant dans lrsquoindustrie brassicole La formation de troubles

dans les biegraveres est le reacutesultat de la preacutecipitation de proteacuteines sous lrsquoeffet de polypheacutenols Ces

derniers sont traditionnellement eacutelimineacutes comme dans le cas du vin par traitement avec la

PVPP La laccase constitue donc une alternative de choix Pour les jus de pomme et de raisin

lrsquooxydation des composeacutes pheacutenoliques a toujours poseacute un problegraveme quant agrave la qualiteacute

organoleptique du jus


29

I3Lrsquoimmobilisation des enzymes Lrsquoune des difficulteacutes dans lrsquoeacutelaboration drsquoune biopile enzymatique repose sur

lrsquoimmobilisation de lrsquoenzyme avec lrsquoeacutelectrode [31] Les techniques de connexion utiliseacutees pour

immobiliser les enzymes entraicircnent la creacuteation drsquointeractions entre les enzymes et les mateacuteriaux

drsquoeacutelectrodes Classiquement quatre meacutethodes peuvent ecirctre employeacutees pour immobiliser

lrsquoenzyme agrave lrsquoeacutelectrode On distingue lrsquoadsorption le greffage covalent la reacuteticulation et

lrsquoencapsulation

I31Immobilisation par adsorption

Lrsquoadsorption (physisorption) constitue la technique drsquoimmobilisation la plus simple

Lrsquoenzyme est retenue agrave la surface gracircce agrave des interactions faibles de type hydrophobe (comme

dans le cas de la caviteacute hydrophobe proche du site T1 de la laccase lrsquoenzyme) eacutelectrostatique

ou Van der Waals [32] Les enzymes non adsorbeacutees sont eacutelimineacutees par lavage (Figure I16)

Figure I16 Scheacutema illustrant lrsquoimmobilisation des enzymes par interaction eacutelectrostatique agrave

la surface de lrsquoeacutelectrode

I32Immobilisation par liaison covalente

Il est possible drsquoimmobiliser de maniegravere covalente lrsquoenzyme agrave la surface de lrsquoeacutelectrode La

surface de lrsquoeacutelectrode doit ecirctre fonctionnaliseacutee ceci afin de pouvoir greffer lrsquoenzyme La

technique consiste agrave effectuer une reacuteaction chimique entre les groupements fonctionnels libres

drsquoune enzyme et un groupement reacuteactif du support sur lequel lrsquoenzyme pourra ecirctre greffeacutee Les

groupements reacuteactifs drsquoune enzyme peuvent ecirctre des groupements amineacutes carboxyliques ou

des carbonyles (aldeacutehydes) (Figure I17)


30

Figure I17 Scheacutema des diffeacuterents types drsquoimmobilisation enzymatique covalente dans les

biopiles A et B) formation drsquoune liaison amide entre une amine et un acide carboxylique et

C) formation drsquoune base de Schiff entre une amine et un aldeacutehyde

I33Immobilisation par encapsulation

Lrsquoencapsulation eacutevite la perte des enzymes tout en laissant aux petites moleacutecules la

possibiliteacute de diffuser agrave travers la matrice Il srsquoagit drsquoune meacutethode qui lie les enzymes de

maniegravere non pas chimique mais physique seulement Les polymegraveres les plus couramment

utiliseacutes pour lrsquoencapsulation enzymatique sont les ionomegraveres Un ionomegravere constitue un

copolymegravere thermoplastique reacuteticuleacute ioniquement Ces mateacuteriaux possegravedent de larges pores

permettant ainsi la peacuteneacutetration de la solution environnante Les interactions eacutelectrostatiques

entre les groupements chargeacutes des ionomegraveres et ceux des enzymes permettent drsquoavoir une

meilleure stabiliteacute Parmi les ionomegraveres les polypyridines drsquoosmium ou de rutheacutenium sont tregraves

utiliseacutes pour lrsquoencapsulation de la laccase et de la bilirubine oxydase [32] Ces polymegraveres

constituent des hydrogels redox hydrosolubles avec un degreacute de reacuteticulation moyen Un

hydrogel redox consiste en un reacuteseau tridimensionnel de chaines polymegraveres hydrophiles

renfermant des meacutediateurs redox On peut aussi encapsuler lrsquoenzyme dans du Nafion Ce

polymegravere possegravede des chaines lateacuterales termineacutees par une fonction acide sulfonique qui lui

confegravere un caractegravere acide ce qui limite son emploi en tant que matrice drsquoimmobilisation

enzymatique Lrsquoeacutechange des protons de lrsquoacide sulfonique du Nafion avec du

tetraalkylammonium permet de reacuteduire cette aciditeacute et induit un eacutelargissement des pores

permettant la diffusion de larges moleacutecules dans la matrice Le chitosan un

polyaminosaccharide naturel deacuteriveacute de la chitine est aussi employeacute comme matrice

drsquoencapsulation enzymatique Il est biocompatible peu couteux et possegravede une bonne reacutesistance

meacutecanique Son caractegravere hydrophobe peut ecirctre modifieacute par amination ce qui permet drsquoavoir un

A B C


31

environnement favorable agrave lrsquoenzyme Le proceacutedeacute sol-gel est aussi souvent utiliseacute pour ce type

drsquoimmobilisation Ce type de matrice inorganique agrave base de silice est avantageux en raison du

fait qursquoil permet drsquoavoir des structures et des proprieacuteteacutes varieacutees en fonction des conditions de

synthegravese Il est biocompatible mais possegravede une faible reacutesistance meacutecanique [33]

I34Immobilisation par reacuteticulation

Cette technique permet de lier entre elles les enzymes formant ainsi des agreacutegats par

reacuteaction intermoleacuteculaire avec un agent bi- ou multifonctionnel appeleacute agent de couplage

Lrsquoagent de couplage le plus utiliseacute est le glutaraldeacutehyde Les enzymes sont tout drsquoabord

adsorbeacutees sur un support puis traiteacutees par lrsquoagent de couplage On forme ainsi un reacuteseau

enzymatique tridimensionnel Les enzymes sont par la suite encapsuleacutees dans un gel [34]

I4Les supports employeacutes dans les biopiles enzymatiques Le choix du mateacuteriau repose principalement sur sa conductiviteacute sa surface speacutecifique

(grande porositeacute) et la preacutesence de groupements fonctionnels afin de pouvoir immobiliser

lrsquoenzyme [3]

I41Les mateacuteriaux carboneacutes

Les mateacuteriaux carboneacutes sont les plus utiliseacutes en raison de leur faciliteacute drsquoeacutelaboration de leur

prix relativement faible par comparaison aux autres matiegraveres premiegraveres et de leur

biocompatibiliteacute Parmi les mateacuteriaux carboneacutes on distingue le graphite le graphite pyrolytique

similaire au graphite mais avec des liaisons covalentes entre les couches de graphegravene le carbone

vitreux Une attention particuliegravere ces derniegraveres anneacutees srsquoest porteacutee sur les mateacuteriaux carboneacutes

nanostructureacutes (nanotubes de carbone CNTs) (Figure I18) On peut citer les nanotubes de

carbone multi-paroi (MWCNT) ayant un diamegravetre compris entre 14 et plus de 100 nm et les

nanotubes de carbone mono-paroi (SWCNT) ayant un diamegravetre compris entre 04 et plus de 3

nm [35] Ces mateacuteriaux carboneacutes deacutecouverts par Iijima et al [36] au deacutebut des anneacutees 1990

sont composeacutes de plusieurs feuillets de graphegravene enrouleacutes sur eux-mecircmes La nanostructuration

de la surface induite par le deacutepocirct de ces CNTs permet drsquoaugmenter la surface speacutecifique de

lrsquoeacutelectrode et donc la densiteacute drsquoenzymes immobiliseacutees agrave la surface La plupart des biopiles

enzymatiques les plus performantes ont eacuteteacute fabriqueacutees en utilisant des CNTs [34] En plus de


32

leur grande surface speacutecifique les CNTs peuvent ecirctre facilement modifieacutes par des groupements

fonctionnels permettant ainsi le greffage du biocatalyseur

Figure I18 Repreacutesentation des carbones mono-parois (SWCNT) agrave gauche et multi-parois

(MWCNT) agrave gauche [34]

Les proprieacuteteacutes des CNTs deacutependent majoritairement de leur architecture Lrsquoorientation

selon laquelle lrsquoenroulement du feuillet de graphegravene srsquoeffectue deacutefinit les proprieacuteteacutes des

nanotubes En effet lrsquoangle drsquoenroulement deacutetermine la chiraliteacute du tube et dicte ses proprieacuteteacutes

eacutelectriques et meacutecaniques Ces derniegraveres deacutependent aussi des conditions de synthegravese Les CNTs

peuvent ecirctre syntheacutetiseacutes directement sur le support par deacutecharge eacutelectrique ablation laser pulseacutee

et par deacutepocirct chimique en phase vapeur (CVD) La CVD reste la meacutethode la plus utiliseacutee pour

la croissance directe des films minces de CNTs sur un support Cette meacutethode neacutecessite

lrsquoutilisation de catalyseurs meacutetalliques afin de permettre la croissance des CNTs Les

paramegravetres cleacutes permettant le controcircle de la cineacutetique de croissance sont la nature du gaz

contenant la source de carbone le temps de croissance la tempeacuterature et la composition du

catalyseur Les CNTs formeacutes par CVD sur le support peuvent ecirctre reacutepartis de faccedilon aleacuteatoire

ou aligneacutes Ce proceacutedeacute conduit agrave la formation de CNTs avec des quantiteacutes significatives de

catalyseur reacutesiduel (une eacutetape de purification apregraves synthegravese est neacutecessaire) ainsi qursquoagrave un

meacutelange de CNTs et il ne permet pas de travailler sur certains supports (plastique) En outre la

CVD requiert de travailler sous vide et agrave de fortes tempeacuteratures

Lrsquoeacutelaboration de films de CNTs peut ecirctre aussi reacutealiseacutee par le deacutepocirct drsquoune phase liquide

sur le support Par comparaison agrave la meacutethode de croissance directe ce proceacutedeacute permet de

travailler agrave basse tempeacuterature ne neacutecessite pas drsquoecirctre sous vide reacuteduisant ainsi

consideacuterablement les couts drsquoeacutelaboration et permet de travailler avec des supports en plastique

Afin drsquoobtenir ces films plusieurs facteurs doivent ecirctre pris en consideacuteration tels que la

dispersion des CNTs (les CNTs ont tendance agrave former des agglomeacuterats ducircs aux interactions de


33

Van der Waals il est neacutecessaire drsquoajouter un tensio-actif) le choix du support les conditions de

revecirctementhellip Le principe de la meacutethode de deacutepocirct drsquoune phase liquide sur un support consiste agrave

fixer la solution de CNTs puis agrave la seacutecher Dans certains cas une eacutetape suppleacutementaire

drsquoeacutelimination du surfactant est neacutecessaire Il existe de nombreuses meacutethodes de deacutepocirct de films

minces de CNTs telles que la meacutethode de laquo Langmuir Blodgett raquo baseacutee sur le caractegravere

hydrophobe des CNTs lrsquoauto-assemblage baseacutee sur les interactions entre les CNTs et la surface

le laquo dip coating raquo ou encore le laquo drop coating raquo [37]

Le graphegravene constitueacute drsquoune monocouche de carbone a attireacute aussi une attention

particuliegravere et pourrait ecirctre consideacutereacute comme un mateacuteriau prometteur drsquoeacutelectrode Il preacutesente

une bonne conductiviteacute ainsi qursquoune reacutesistance meacutecanique et une surface speacutecifique assez

importantes Il peut ecirctre eacutelaboreacute suivant diffeacuterents proceacutedeacutes exfoliation par voie liquide du

graphite deacutecomposition thermique deacutepocirct en phase vapeur sur un substrat meacutetallique ou

reacuteduction de lrsquooxyde de graphegravene (GO) Chacune de ces strateacutegies permet drsquoobtenir un graphegravene

avec des caracteacuteristiques diffeacuterentes Il peut ecirctre fonctionnaliseacute de la mecircme faccedilon que les autres

mateacuteriaux carboneacutes

I42Lrsquoor

Lrsquoor preacutesente des proprieacuteteacutes inteacuteressantes pour lrsquoeacutelaboration drsquoeacutelectrodes [38] Sa surface

peut ecirctre fonctionnaliseacutee facilement afin drsquoavoir les fonctions chimiques drsquointeacuterecirct Cette

fonctionnalisation est geacuteneacuteralement effectueacutee par des monocouches auto assembleacutees (Self

Assembled Monolayer SAMs) de thiol ou par des sels de diazonium ayant la terminaison

deacutesireacutee Lrsquoensemble de ces caracteacuteristiques fait que lrsquoor est utiliseacute en tant que mateacuteriau

drsquoeacutelectrode

I5Fonctionnalisation de la surface des eacutelectrodes Diffeacuterentes meacutethodes de fonctionnalisation ont eacuteteacute utiliseacutees pour modifier chimiquement

la surface des eacutelectrodes (Figure I19) Lrsquoobjectif est drsquointroduire des groupements fonctionnels

agrave la surface de lrsquoeacutelectrode afin de pouvoir ensuite immobiliser les enzymes


34

Figure I19 Scheacutema de diffeacuterents types de fonctionnalisation [35]


I511Electroreacuteduction de sels de diazonium

La reacuteduction des deacuteriveacutes de sels de diazonium benzeacuteniques constitue lrsquoune des strateacutegies

de fonctionnalisation des mateacuteriaux carboneacutes pour lrsquoimmobilisation enzymatique (Figure I20)

Cette meacutethode permet drsquoavoir des noyaux benzeacuteniques avec diffeacuterents substituants (amines

carboxyliques hydrocarbures aromatiques polycycliques) En fonction de la nature de ces

substituants diffeacuterentes meacutethodes drsquoimmobilisation enzymatique peuvent ecirctre envisageacutees

Figure I20 Meacutecanisme drsquoeacutelectro-greffage de sels de diazonium benzeacuteniques [39]

Armstrong et al ont proposeacute une alternative agrave lrsquoimmobilisation de lrsquoenzyme par la

formation de liaisons amides et imines [40-42] en tirant avantage de la caviteacute hydrophobe de la

laccase de Trametes versicolor proche du cuivre T1 afin de lrsquoimmobiliser Ils ont modifieacute pour

cela du graphite pyrolytique par des sels de diazonium ayant une terminaison chrysegravene (2-

chrysegravenediazonium) [43] Ils ont mesureacute un courant de lrsquoordre de -20 microA Ils ont aussi greffeacute

sur ce mecircme type de surface [44] du 2-anthracegravenediazonium Ils ont mesureacute une densiteacute de

courant de -550 microAcm2 (utilisation drsquoune eacutelectrode tournante 2500 rpm) On aura dans ces cas

une interaction -stacking entre la caviteacute de la laccase et les hydrocarbures aromatiques

polycycliques Cette meacutethode drsquoimmobilisation a eacuteteacute par la suite transposeacutee sur les nanotubes


35

de carbone (SWCNTs et MWCNTs) qui offrent une plus grande surface speacutecifique Lalaoui et

al [45] ont ainsi immobiliseacute un deacuteriveacute du sel de diazonium (2-diazonium anthraquinone) sur

des MWCNTs Ils ont obtenu une densiteacute de courant de -09 mAcm2 Bielewiz et al [46] ont

quant agrave eux fonctionnaliseacute tout drsquoabord des SWCNTs par geacuteneacuteration de sels de diazonium agrave

partir drsquoaniline substitueacutee par de lrsquoanthracegravene ou de lrsquoanthraquinone puis immobiliseacute la laccase

Lrsquoenzyme a eacuteteacute par la suite pieacutegeacutee dans une matrice de Nafion diminuant ainsi les pertes suite

au lavage Ils ont mesureacute respectivement une densiteacute de courant de -2158 et -1872 microAcm2

pour lrsquoanthracegravene et lrsquoanthraquinone

Di bari et al [47] ont eacutelectrodeacuteposeacute des feuillets de graphegravene sur du carbone vitreux Ces

feuillets ont eacuteteacute par la suite fonctionnaliseacutes par du 4-aminoaryl diazonium dans le cas de

lrsquoimmobilisation la laccase (formation drsquoune base de Schiff entre les groupements amines du

support et les sites de glycosylation de lrsquoenzyme) et par du 2-carboxy-6-naphtol diazonium dans

le cas de lrsquoimmobilisation de la bilirubine oxydase (formation drsquoune liaison amide entre les

groupements carboxyliques du support et les amines de lrsquoenzyme) Ils ont mesureacute

respectivement des densiteacutes de courant de -1 mAcm2 et -04 mAcm2

I512Traitement acide et oxydant

Des fonctions oxygeacuteneacutees (carboxyles carbonyles et hydroxyles) peuvent ecirctre creacuteeacutes agrave la

surface des mateacuteriaux carboneacutes sous des conditions acides et oxydantes [48] Dans le cas des

CNTs lors de lrsquoeacutelimination des impureteacutes meacutetalliques des fonctions reacuteactives telles que des

carbonyles ou des acides carboxyliques sont geacuteneacutereacutees Ces groupements peuvent ecirctre utiliseacutes

pour lrsquoimmobilisation enzymatique Meredith et al ont fonctionnaliseacute des MWCNTs avec du

chlorure 2-anthracegravene carbonyle (Figure I21) pour immobiliser la laccase via sa caviteacute

hydrophobe Ils ont obtenu une densiteacute de courant de -155 microAcm2

Figure I21 Fonctionnalisation des CNTs par des groupements anthracegravenes [49]

Bielewiz et al [46] ont aussi utiliseacute les fonctions carboxyliques preacutesentes sur les CNTs


36

Les groupements carboxyliques ont eacuteteacute modifieacutes avec de lrsquoanthracegravene et de lrsquoanthraquinone

afin drsquoimmobiliser la laccase Ils ont mesureacute des densiteacutes de courant (mecircme ordre de grandeur)

de -938 et -1517 microAcm2 respectivement

I513Proceacutedeacute drsquoamination

On peut aussi fonctionnaliser les CNTs par amination Il srsquoagit drsquoune reacuteaction au cours de

laquelle un groupement amine est greffeacute agrave la surface drsquoun mateacuteriau par voie eacutelectrochimique

Sosna et al [50] ont eacutelectro-oxydeacute des amines primaires modifieacutees par de lrsquoanthracegravene et de

lrsquoanthraquinone sur du carbone vitreux Les amines ont eacuteteacute proteacutegeacutes en utilisant le groupe

fonctionnel tert-butoxycarbonyl (Boc) afin drsquoeacuteviter la formation de plusieurs couches Bartlett

et al [51] ont quant agrave eux mesureacute sur des nanotubes de carbone fonctionnaliseacutes par une diamine

proteacutegeacutee (C6H4CH2NHBoc) puis modifieacutee par du 2-anthraquinone carboxylique une densiteacute de

courant de -35 mAcm2 sur eacutelectrode tournante (Figure I22)

Figure I22 Fonctionnalisation de nanotubes de carbone par une diamine suivie de sa

deacuteprotection et sa modification par du 2-anthraquinone carboxylique [51]

I514 Fonctionnalisation par proceacutedeacute plasma

Dans le cas de la fonctionnalisation par eacutelectroreacuteduction de sels de diazonium il est

difficile de controcircler lrsquoeacutepaisseur de la couche On observe la formation de multicouches qui

entravent le transfert des eacutelectrons Quant agrave lrsquooxydation elle peut parfois deacutetruire la structure

de surface du mateacuteriau Pour surmonter ces limitations lieacutees agrave la fonctionnalisation des

mateacuteriaux carboneacutes le proceacutedeacute plasma peut constituer une alternative (le principe du proceacutedeacute

plasma sera deacutecrit dans le chapitre IV) Un plasma drsquoazote permet drsquoavoir une large gamme de

fonctions azoteacutees agrave la surface du mateacuteriau (amines imines nitriles) tandis qursquoun plasma

drsquooxygegravene permet drsquoavoir des groupements oxygeacuteneacutes (hydroxyles carbonyles et


37

carboxyliques) Selon les paramegravetres du plasma on peut controcircler la densiteacute des groupements

fonctionnels De plus le proceacutedeacute plasma est non polluant rapide et de faible cout La meacutethode

plasma la plus utiliseacutee est le jet plasma agrave la pression atmospheacuterique (APPJ) en raison de sa

faciliteacute drsquoutilisation Dans le cas de la fonctionnalisation des mateacuteriaux carboneacutes seulement

une publication a utiliseacute ce proceacutedeacute [52] Reacutecemment lrsquoimmobilisation de la laccase sur des

membranes agrave base de polymegraveres traiteacutes par plasma pour une utilisation en tant que biocapteur

a eacuteteacute eacutetudieacutee [53 54] Dans le cas des biopiles enzymatiques Ardhaoui et al [3] ont

fonctionnaliseacute du graphite par APPJ en eacutetudiant lrsquoinfluence de plusieurs paramegravetres (type

drsquoimmobilisation nature du plasmahellip) Ils ont obtenu une densiteacute de courant de reacuteduction du

dioxygegravene maximale de -108 microAcm2 apregraves immobilisation de la laccase par voie covalente

I515π-stacking

Les diffeacuterentes fonctionnalisations de la surface preacutesenteacutees ci-dessus constituent des

meacutethodes impliquant la formation drsquoune liaison covalente entre le groupement fonctionnel et

le support carboneacute On peut aussi fonctionnaliser les mateacuteriaux carboneacutes de maniegravere non

covalente Une technique possible se base sur des interactions entre des moleacutecules

aromatiques polycycliques (Figure I23) et les parois des CNTs [55 56] En 2001 Dai et al

[57] ont deacutemontreacute la possibiliteacute drsquoimmobiliser des proteacuteines sur des CNTs fonctionnaliseacutes par

un deacuteriveacute du pyregravene (acide-1-pyregravene-butanoiumlque)

Figure I23 Interaction π-stacking entre des composeacutes aromatiques et la paroi des CNTs

Comme pour les sels de diazonium la possibiliteacute de faire varier les groupements

fonctionnels du deacuteriveacute permet drsquoavoir un large spectre drsquoimmobilisation enzymatique Minteer

et al [58] ont immobiliseacute la laccase sur des nanotubes de carbone fonctionnaliseacutes avec du 1-

amino pyregravene ou du 1-pyregravene meacutethanol Ils ont mesureacute des densiteacutes de courant de -625 et -814

microAcm2 respectivement Ils [58] ont aussi tireacute avantage de la caviteacute de la laccase en

fonctionnalisant les CNTs par du 1-amino pyregravene ou du 1-pyregravene meacutethanol modifieacute avec de


38

lrsquoanthracegravene Ils ont mesureacute des densiteacutes de courant de -186 et -153 microAcm2 respectivement

Bourourou et al [59] ont utiliseacute sur des MWCNTs des deacuteriveacutes du pyregravene ayant un ou deux

groupements anthraquinones Ils ont mesureacute des densiteacutes de courant de -035 et -1 mAcm2

Lrsquoaugmentation de la densiteacute de courant dans le 2egraveme type de fonctionnalisation est ducirce au fait

qursquoil y a plus de points drsquoancrage pour lrsquoenzyme (la laccase) Lrsquoensemble des exemples citeacutes

preacuteceacutedemment ont utiliseacute la laccase comme enzyme pour la reacuteduction de lrsquooxygegravene Drsquoautres

eacutequipes de recherche ont immobiliseacute la bilirubine oxydase [60]

I516Fonctionnalisation par eacutelectropolymeacuterisation

Une autre meacutethode de fonctionnalisation non covalente est lrsquoutilisation de polymegraveres

Lalaoui et al [61] ont tout drsquoabord eacutelectropolymeacuteriseacute du pyrrole-pyregravene ou du pyrrole-NHS sur

nanotubes de carbone puis immobiliseacute la laccase Ils ont mesureacute une densiteacute de courant de -185

mAcm2 et -077 mAcm2 respectivement On peut voir que lrsquoimmobilisation de la laccase via

sa caviteacute hydrophobe permet drsquoavoir de meilleurs reacutesultats que lorsqursquoelle est immobiliseacutee via

la formation drsquoune liaison amide entre ses groupements amines et les groupements

carboxyliques activeacutes du polymegravere

I52Les mateacuteriaux carboneacutes composites

On peut aussi ajouter des nanoparticules drsquoor agrave la surface des mateacuteriaux carboneacutes Les

nanoparticules drsquoor ayant la particulariteacute drsquoavoir une bonne conductiviteacute permettent drsquoameacuteliorer

le transfert drsquoeacutelectrons et ainsi favoriser les DET

Figure I24 Scheacutema de principe de la fonctionnalisation drsquoune surface de graphite par des

nanoparticules drsquoor et immobilisation de la laccase [62]


39

Gutierrez-Sanchez et al [62] ont modifieacute du graphite agrave faible densiteacute (LDG) avec des

nanoparticules drsquoor (Figure I24) Ils ont tout drsquoabord fonctionnaliseacute le graphite par

eacutelectroreacuteduction de 4-nitrobenzegravenediazonium Les groupements 4-aminophenyl vont ensuite

reacuteagir avec du nitrure de sodium pour former des fonctions diazonium qui apregraves une seconde

eacutetape drsquoeacutelectroreacuteduction permettent drsquoancrer les nanoparticules drsquoor Les nanoparticules ont

enfin eacuteteacute fonctionnaliseacutees par formation de SAMs mixtes constitueacutees de 6-mercapto-1-hexanol

et de 4-aminophenyl La laccase a eacuteteacute immobiliseacutee via la formation drsquoune base de Schiff entre

les groupements amines et les sites de glycosylation ou via la formation drsquoune liaison amide

entre les groupements carboxyliques activeacutes de la laccase et les amines de surfaces Ils ont

obtenu des densiteacutes de courant de -15 mAcm2 sur une eacutelectrode tournante (500 rpm)

Une autre approche utilisant des NPs drsquoor a consisteacute agrave immobiliser les NPs drsquoor agrave la surface

de lrsquoeacutelectrode et lrsquoenzyme via des interactions non covalentes selon le scheacutema de principe

(Figure I25) Dans un premier temps les MWCNTs sont fonctionnaliseacutes par -stacking avec

du 1-pyrenebutyrique adamantyl amide (pyrene-adamantane) Le groupement adamantane a

une forte affiniteacute pour la cyclodextrine qui a eacuteteacute greffeacutee sur les nanoparticules drsquoor ce qui

permet lrsquoimmobilisation des NPs Une laccase mutante ayant une seule lysine proche du cuivre

T1 a ensuite eacuteteacute immobiliseacutee sur les nanoparticules drsquoor modifieacutees Ils ont mesureacute pour ce type

drsquoeacutelectrode une densiteacute de courant de 3 mAcm2 Il srsquoagit ici de la plus forte densiteacute de courant

obtenue jusquagrave ce jour Cependant la reacutealisation drsquoun tel systegraveme reste assez complexe On

pourrait srsquointerroger ici car avec ce type drsquoarchitecture moleacuteculaire le site T1 est bien loin de


Figure I25 (agrave gauche) voltampeacuterogrammes de la reacuteduction de lrsquooxygegravene sur lrsquoeacutelectrode

eacutetudieacutee sous oxygegravene (rouge) en preacutesence drsquoargon (pointilleacutes noirs) et sur une eacutelectrode

MWCNTs en absence de nanoparticules drsquoor (agrave droite) scheacutema de principe de la

fonctionnalisation des CNTs par des nanoparticules drsquoor et immobilisation de la laccase [38]


40

Le groupe de Di Bari [63] quant agrave lui a deacuteposeacute des nano-tiges drsquoor sur du graphite et

immobiliseacute la laccase en suivant le mecircme protocole expeacuterimentale que Gutierrez-Sanchez et al

[62] Ils ont obtenu des densiteacutes de courant de 05 mAcm2

I53Les eacutelectrodes drsquoor

Dans le cas des surfaces drsquoor la formation de SAMs par chimisorption de groupements

thiols fournit des monocouches ordonneacutees de longueur et de fonctions terminales modulables

Pita et al [41] ont immobiliseacute la laccase via ses groupements carboxyliques et ses reacutesidus

oxydeacutes Ils ont obtenu une densiteacute de courant de -40 microAcm2 Gupta et al [64] ont montreacute

qursquoune fonctionnalisation par des SAMs (4-aminopheacutenol) permettait drsquoavoir la meilleure

configuration pour le transfert drsquoeacutelectrons par la formation drsquoune base de Schiff entre lrsquoenzyme

et les amines de surfaces Afin drsquoaugmenter la surface speacutecifique Sipenkoetter et al [65] ont

eacutelaboreacute une eacutelectrode agrave base de nanoparticules drsquoor fonctionnaliseacutees par des SAMs et des sels

de diazonium ayant une terminaison carboxylique Ils ont mesureacute une densiteacute de courant de -

800 microAcm2

I6Biopile enzymatique vers des dispositifs implantables Geacuteneacuteralement les biopiles enzymatiques geacutenegraverent de lrsquoeacutelectriciteacute par la transformation du

glucose et de lrsquooxygegravene deux substrats preacutesents dans les fluides biologiques Le glucose

constitue la source drsquoeacutenergie la plus importante pour plusieurs organismes Il est produit

constamment par le meacutetabolisme suite agrave la deacutegradation de moleacutecules organiques (glucides) Sa

concentration dans les fluides extracellulaires est de 45 microM Lrsquooxygegravene quant agrave lui est apporteacute

continuellement par les voies respiratoires Sa concentration dans les fluides extracellulaires est

de 5 mM Il serait ainsi possible drsquoeacutelaborer des biopiles enzymatiques pouvant ecirctre implanteacutees

dans des organismes vivants tels que lrsquohomme De tels dispositifs constituent une alternative

attrayante pour remplacer par exemple les piles agrave combustible utiliseacutees pour faire fonctionner

des pacemakers (ces appareils consomment une puissance de 10 microW) robotiser les sphincters

urinaires artificiels (200 microW) ou mecircme faire fonctionner un rein artificiel (20 mW) Jusquagrave

preacutesent ils nrsquoont jamais eacuteteacute implanteacutes dans un corps humain Ils ont cependant eacuteteacute testeacutes in vitro

(examens pratiqueacutes en dehors de lrsquoorganisme vivant) dans divers milieux biologiques tels que

le seacuterum le plasma la salive et lrsquourine Les puissances des biopiles enzymatiques obtenues sont

de lrsquoordre des microWcm2 ce qui est suffisant pour faire fonctionner un pacemaker Contrairement


41

aux biopiles enzymatiques fonctionnant ex-situ plusieurs barriegraveres sont agrave surmonter pour

pouvoir fonctionner dans des milieux biologiques En 2007 Gao et al [66] ont eacutelaboreacute une

biopile enzymatique en combinant un glucose deacuteshydrogeacutenase NADHNAD+ deacutependante agrave

lrsquoanode et une bilirubine oxidase agrave la cathode immobiliseacutees sur des MWCNTs dans une matrice

polymeacuterique Ils ont observeacute une baisse significative de la puissance geacuteneacutereacutee par la biopile

probablement ducirce agrave la preacutesence drsquoespegraveces chimiques dans le seacuterum Pour essayer de palier agrave ce

problegraveme Li et al [67] ont proposeacute en 2008 drsquoassocier agrave la glucose deacuteshydrogeacutenase et agrave la

bilirubine oxydase une enzyme lrsquoascorbate oxidase capable drsquooxyder lrsquoacide ascorbique en

preacutesence drsquooxygegravene et ainsi diminuer sa concentration dans les fluides biologiques Lrsquoacide

ascorbique constitue lrsquoune des principales espegraveces eacutelectroactive parasites Il existe de maniegravere

significative dans les systegravemes biologiques Sa concentration chez certains mammifegraveres est

comprise entre 40 et 120 microM Gobel et al [68] ont quant agrave eux montreacute en plus de lrsquoeffet neacutegatif

de lrsquoacide ascorbique celui de lrsquoacide urique et de lrsquoureacutee preacutesents dans lrsquourine et la salive sur

les performances des biopiles enzymatiques Les enzymes utiliseacutees sont la glucose

deacuteshydrogeacutenase PQQ deacutependante et la bilirubine oxydase agrave lrsquoanode et agrave la cathode

respectivement Ils ont observeacute que de fortes concentrations en ureacutee diminuaient lrsquoactiviteacute de

lrsquoanode dans lrsquourine (la concentration en ureacutee dans lrsquourine est de 250 mM) Le compartiment

cathodique nrsquoest pas affecteacute par la preacutesence drsquoureacutee dans le milieu de fonctionnement La

preacutesence drsquoacide urique a pour effet de deacutecaler la reacuteaction de reacuteduction de lrsquooxygegravene vers des

potentiels plus cathodiques

En plus de ces espegraveces chimiques il est neacutecessaire de prendre en consideacuteration les

conditions environnementales (pH et tempeacuterature) dans lesquelles la biopile fonctionne Shleev

et al [69] ont opteacute pour la cellobiose deacuteshydrogeacutenase de Corynascus thermophilus et la

bilirubine oxydase en tant que catalyseur enzymatique Ces enzymes possegravedent la particulariteacute

de conserver leur activiteacute catalytique agrave des pH neutres (pH des milieux biologiques)

Concernant la tempeacuterature Milton et al [70] ont observeacute une diminution de la stabiliteacute agrave la

tempeacuterature corporelle La viscositeacute du milieu pourrait aussi constituer un eacuteleacutement neacutegatif pour

les performances de la biopile enzymatique

Par ailleurs les biopiles enzymatiques ont eacuteteacute aussi implanteacutees dans des mammifegraveres Les

animaux verteacutebreacutes constituent des modegraveles ideacuteaux pour la recherche biomeacutedicale Les

puissances obtenues sont aussi de lrsquoordre des microWcm2 Cinquin et al [71] ont implanteacute en 2010


42

la premiegravere biopile enzymatique implantable dans lrsquoespace reacutetropeacuteritoneacuteal drsquoun rat Zebda et

al [72] ont ameacutelioreacute ce dispositif en augmentant la surface speacutecifique des eacutelectrodes constituant

la biopile Pour cela ils ont utiliseacute des MWCNTs Certaines eacutequipes ont effectueacute des tests sur

drsquoautres mammifegraveres tels que des lapins [73]

En plus des applications biomeacutedicales une autre application pour les biopiles enzymatiques

est lrsquoalimentation de biocapteurs afin de surveiller de maniegravere continue les conditions chimiques

et physiques externes environnementales Pour ce type drsquoapplication les biopiles pourraient

ecirctre implanteacutes dans des petits organismes vivants tels que des insectes [74-76] des palourdes

[77] et mecircme des escargots [78] Il est agrave noter que les conditions de fonctionnement dans ce

type drsquoorganisme sont totalement diffeacuterentes de celles dans les fluides biologiques humains

I7Choix des systegravemes drsquoeacutetude et meacutethodologie Le deacuteveloppement des biopiles enzymatiques srsquoaccompagne de la recherche de conditions

optimales de fonctionnement Outre le choix du biocatalyseur la maicirctrise du transfert drsquoeacutelectron

entre lrsquoenzyme et lrsquoeacutelectrode drsquoune part et lrsquoeacutelaboration de mateacuteriaux drsquoeacutelectrode avec une

surface speacutecifique eacuteleveacutee drsquoautre part constituent deux voies de recherche majeures pour le

deacuteveloppement des biopiles auxquelles on peut rajouter leur dureacutee de vie et leur puissance

deux critegraveres qui ne seront pas abordeacutes dans ce travail

Durant ces derniegraveres anneacutees une attention particuliegravere srsquoest porteacutee sur lrsquoimplication des

nanotubes de carbone Ces mateacuteriaux en plus drsquoecirctre biocompatibles offrent une excellente

conductiviteacute eacutelectronique et une grande surface speacutecifique permettant ainsi drsquoimmobiliser une

grande quantiteacute drsquoenzyme Il est eacutegalement neacutecessaire drsquoassurer une bonne communication

entre le biocatalyseur et lrsquoeacutelectrode car les performances drsquoune biopile enzymatique deacutependent

fortement du transfert drsquoeacutelectrons entre ces deux entiteacutes Dans ce travail on srsquointeacuteresse aux

biopiles fonctionnant par transfert drsquoeacutelectrons direct entre lrsquoenzyme et son support solide Ce

dernier doit donc offrir une topographie et une chimie de surface ideacuteales pour les enzymes afin

de garantir leur connexion eacutelectronique une activiteacute bioeacutelectrocatalytique efficace et une

grande stabiliteacute dans le temps Selon la nature de lrsquoimmobilisation (greffage covalent

interactions eacutelectrostatiques) lrsquoorientation de lrsquoenzyme est controcircleacutee par la position des

groupements fonctionnels pouvant intervenir dans lrsquoimmobilisation de lrsquoenzyme Par exemple

la preacutesence drsquoacides amineacutes proches du site actif permet une orientation favorable ougrave la distance


43

entre le site actif de lrsquoenzyme et lrsquoeacutelectrode est minimale Dans ce contexte notre objectif est

de deacutevelopper de nouvelles architectures de biocathodes utilisant comme enzyme la laccase de

Trametes versicolor afin drsquooptimiser son activiteacute bioeacutelectrocatalytique envers la reacuteduction de

lrsquooxygegravene Drsquoune part on propose ici pour la premiegravere fois lrsquoimplication du nitrure de carbone

amorphe dans la reacutealisation de telles biocathodes Lrsquoobjectif est ici drsquoapprofondir la maicirctrise et

la compreacutehension de lrsquoimpact de lrsquoorientation des enzymes greffeacutees sur le transfert eacutelectronique

direct enzyme-eacutelectrode et donc sur les proprieacuteteacutes bioeacutelectrocatalytiques des enzymes greffeacutees

envers la reacuteaction de reacuteduction de lrsquooxygegravene (ORR) Selon nous cette proposition repose drsquoune

part sur la chimie de surface de cette famille de mateacuteriaux conducteurs eacutelectroniques

parfaitement adapteacutee au greffage drsquoenzyme ainsi que sur sa topographie extrecircmement lisse qui

donne accegraves agrave des techniques expeacuterimentales incompatibles avec des bioeacutelectrodes

nanostructureacutees Preacutecisons ici que des biocathodes graphitea-CNxlaccase ont eacuteteacute deacuteveloppeacutees

en parallegravele de biocathodes Sia-CNxlaccase initialement pressenties dans cette partie de notre

eacutetude car ces derniegraveres ne produisent aucun courant cathodique deacutetectable pour lrsquoORR dans

nos conditions expeacuterimentales Drsquoautre part on preacutesente eacutegalement et lagrave-encore pour la

premiegravere fois la nanostructuration de biocathodes agrave lrsquoaide de nanowalls de carbone (CNWs)

Nous espeacuterons ainsi cumuler la tregraves grande surface speacutecifique ainsi produite avec une bonne

maicirctrise de lrsquoorientation des enzymes greffeacutees issue de nos observations acquises sur a-CNx

dans la perspective drsquoobtenir des densiteacutes de courant tregraves compeacutetitives par rapport agrave celles

publieacutees dans la litteacuterature Gracircce agrave lrsquoexpertise pour cette technique deacuteveloppeacutee au laboratoire

on envisage eacutegalement drsquoeacutetudier lorientation et la cineacutetique de greffage de lenzyme en utilisant

la technique PM-IRRAS en reacutealisant lrsquoanalyse post-immobilisation de lrsquoenzyme sur le support

mais eacutegalement pendant lrsquoimmobilisation crsquoest-agrave-dire in situ en phase liquide donc dans des

conditions les plus proches possibles des conditions reacuteelles Plusieurs eacutetudes ont eacuteteacute effectueacutees

pour eacutetudier lrsquoorientation de lrsquoenzyme notamment la bilirubine oxydase en utilisant cette

technique de caracteacuterisation mais aucune nrsquoa eacuteteacute faite en phase liquide en eacutetudiant la cineacutetique

drsquoimmobilisation de la laccase concomitamment aux mesures PM-IRRAS (eacutetude in situ)

Lrsquoobjectif ici est non seulement drsquoeacutetudier lrsquoorientation de la laccase sur les surfaces drsquoor en

effectuant une eacutetude in situ et ex situ mais aussi drsquoeacutevaluer le temps de greffage

Le premier type de mateacuteriau deacuteveloppeacute au cours de ce travail est le nitrure de carbone

amorphe deacuteposeacute sous forme de couche mince sur graphite Les premiegraveres tentatives de synthegravese


44

de ces couches remontent agrave 1979 par Cuomo et al [1] Ce type de mateacuteriau appartient agrave la

famille des laquo Diamond-like carbon raquo (DLC) Les DLCs constituent des formes meacutetastables de

carbone amorphe Ils sont constitueacutes drsquoatomes de carbones hybrideacutes sp2 (de type graphite) et

sp3 (de type diamant) La structure peut ecirctre deacutecrite comme un reacuteseau amorphe plus ou moins

hydrogeacuteneacute drsquoatomes de carbone lieacutes de faccedilon covalente sous diffeacuterentes hybridations Les

proprieacuteteacutes des DLCs deacutependent donc de la proportion en carbone sp2sp3 et de la quantiteacute

drsquohydrogegravene On distingue les carbones amorphes noteacutes a-C et a-C H Ils sont essentiellement

composeacutes drsquoatomes de carbone ayant une hybridation sp2 La deuxiegraveme famille est celle des

carbones amorphes teacutetraeacutedriques (ta-C et ta-C H) Ils sont essentiellement constitueacutes drsquoatomes

de carbone en configuration sp3 [79] Lrsquoincorporation drsquoazote dans les carbones amorphes

permet au carbone drsquoeacutetablir diffeacuterents types de liaison chimique Plusieurs meacutethodes ont eacuteteacute

employeacutees pour deacuteposer les films de nitrure de carbone amorphe Il srsquoagit essentiellement de

techniques de deacutepocirct sous vide (deacutepocircts physiques en phase vapeur deacutepocircts chimiques en phase

vapeur assisteacutes par plasma) Les a-CNx ainsi formeacutes constituent une famille de mateacuteriau dont

les proprieacuteteacutes sont diverses On a choisi de travailler avec ce mateacuteriau en raison de ses proprieacuteteacutes

eacutelectrochimiques inteacuteressantes Il offre une fenecirctre de potentiel une conductiviteacute eacutelectronique

et une reacuteactiviteacute eacutelectrochimique qui sont modulables en fonction du contenu en azote atomique

de ces mateacuteriaux Il possegravede aussi la particulariteacute de preacutesenter en surface des groupements

amines produits naturellement au cours de son exposition agrave lrsquoair immeacutediatement apregraves la phase

de deacutepocirct ce qui permettra le greffage drsquoenzymes agrave sa surface [80] sans eacutetape preacutealable de

fonctionnalisation de surface

Le deuxiegraveme type de mateacuteriau envisageacute les CNWs permet de nanostructurer la surface de

lrsquoeacutelectrode Il srsquoorganise sous la forme drsquoun empilement de feuillets de graphegravene en position

verticale sur le substrat sur lequel ils sont deacuteposeacutes [81] Contrairement au nitrure de carbone

amorphe les nanowalls de carbone comme les nanotubes de carbones permettent drsquoaugmenter

consideacuterablement la surface speacutecifique de lrsquoeacutelectrode mais ils ne preacutesentent aucun groupement

fonctionnel Au cours de ces derniegraveres anneacutees plusieurs proceacutedeacutes de synthegravese des nanowalls

ont eacuteteacute eacutetudieacutes (deacutecharge micro-onde en utilisant comme gaz un meacutelange de CH4H2 [82-84]

plasma geacuteneacutereacute par radiofreacutequence [84] deacutecharge eacutelectrique en courant continue en utilisant

comme gaz un meacutelange CH4H2Ar [85] deacutepocirct chimique en phase vapeur agrave haute freacutequence

9en utilisant un CH4H2Ar [86]) On a utiliseacute dans ce travail pour la formation de nanowalls de


45

carbone par deacutepocirct chimique en phase vapeur assisteacute par plasma agrave excitation micro-onde

(PECVD) en utilisant comme gaz plasmagegravene un meacutelange de monoxyde de carbone (CO) et de

dihydrogegravene (H2) Lrsquoobjectif est de transposer sur ce nouveau mateacuteriau (nanowalls de carbone)

la meacutethode de fonctionnalisation de surface par plasma agrave la pression atmospheacuterique

preacuteceacutedemment deacuteveloppeacutee et utiliseacutee sur du graphite au sein du laboratoire [3] en proceacutedant agrave

lrsquoidentification et agrave lrsquooptimisation agrave lrsquoaide de plans drsquoexpeacuterience des paramegravetres deacuteterminants

de traitement plasma Nous exploiterons eacutegalement les conclusions obtenues sur a-CNx et lieacutees

agrave lrsquooptimisation du transfert eacutelectronique direct entre les enzymes greffeacutees et leur support

carboneacute dans lrsquoobjectif drsquoobtenir des densiteacutes de courants eacuteleveacutees pour lrsquoORR

46

47

Chapitre IIMateacuteriels et meacutethodes

48

Chapitre II Mateacuteriels et meacutethodes

49

II1Production de la laccase

II11Culture de Trametes versicolor

La laccase est produite par Trametes versicolor (Tversicolor) un champignon de la

pourriture blanche selon un protocole deacutecrit dans la litteacuterature [87] La souche ATCC 32745 de

T versicolor est cultiveacutee steacuterilement sur boicircte de Peacutetri sur milieu geacuteloseacute (composition deacutecrite

dans le Tableau II1) et conserveacutee agrave 4degC lorsque le myceacutelium a recouvert la surface de la boicircte

de Peacutetri Elle est repiqueacutee tous les mois Pour la production de la laccase le champignon est

cultiveacute dans un milieu liquide contenant du maltose et du tartrate drsquoammonium comme sources

de carbone et drsquoazote respectivement [88] La composition de ce milieu est deacutecrite dans le

Tableau II1 Six preacutelegravevements de myceacutelium (10 mm de diamegravetre) sont inoculeacutes steacuterilement

dans un Erlenmeyer de 2 L contenant 500 mL de milieu de culture

Tableau II1 Composition du milieu de culture solide

Composition Concentration (gL)

Extrait de levure 5

Malt 20

Agar 15

Tableau II2 Composition du milieu de culture liquide


Maltose 20

Sels

Tartrate drsquoammonium

KH2PO4

NaH2PO4

4

09

018

Oligo-eacuteleacutements

MgSO47 H2O

CaCl22 H2O

CuSO45 H2O

ZnSO47 H2O

FeSO47 H2O

05

0006

001

00005

0005

Thiamine 000001

25-Xylidine 03 mM

22-dimeacutethyl acide succinimide 20 mM


50

Les oligo-eacuteleacutements la thiamine la 25-xylidine ainsi que lrsquoacide succinimide ont eacuteteacute

ajouteacutes steacuterilement par filtration sur un filtre de type Whatman de porositeacute 02 microm agrave la solution

de maltose et de sels preacutealablement steacuteriliseacutee en autoclave (121degC pendant 20 min)

La culture est reacutealiseacutee sous agitation agrave 25degC dans lrsquoobscuriteacute pendant une semaine Des

aliquots sont preacuteleveacutes toutes les 24 heures pour suivre lrsquoeacutevolution de la production de laccase

II12Concentration du milieu de culture

Apregraves une semaine de culture lrsquoactiviteacute du milieu de culture est de 85 UmL (voir

deacutefinition paragraphe II5) Cette derniegravere est arrecircteacutee Apregraves une premiegravere filtration du milieu

de culture (400 mL) sur gaze pour eacuteliminer le myceacutelium 10 (vv) drsquoaceacutetone agrave 4degC ont eacuteteacute

ajouteacutes au milieu afin de preacutecipiter les polysaccharides produits par les champignons Des

filtrations sous pression reacuteduite successives sont ensuite effectueacutees sur des filtres (Amicon) de

porositeacute deacutecroissante (27 microm 16 microm 07 microm) Le milieu de culture est ensuite concentreacute dans

une cellule drsquoultrafiltration Amicon sur une membrane agrave base de cellulose Millipore (type YM

10) ayant un seuil de coupure de 10 kDa Lrsquoultrafiltration est reacutealiseacutee sous pression agrave 1 bar

drsquoazote et sous agitation magneacutetique douce afin drsquoeacuteviter tout pheacutenomegravene de colmatage de la

membrane par formation agrave sa surface drsquoune couche de proteacuteines Lrsquoactiviteacute du filtrat est

controcircleacutee tout au long de lrsquoultrafiltration afin de srsquoassurer que la cellule ne fuit pas Une fois

lrsquoeacutetape de concentration reacutealiseacutee (Vfinal = 10 mL) le retentat est dialyseacute dans la cellule

drsquoultrafiltration avec une solution tampon phosphate (20 mM) agrave pH 7 Ces conditions

permettent drsquooptimiser la stabiliteacute de la laccase La solution est par la suite reacutecupeacutereacutee et la

membrane laveacutee avec le tampon phosphate La solution de lavage est rajouteacutee au retentat Au

final on a 13 mL de surnageant de culture brut concentreacute agrave 200 UmL soit un rendement de

76 que lrsquoon conserve agrave 4degC avant de proceacuteder aux eacutetapes de purification par chromatographie

II13Purification de la laccase

II131Chromatographie eacutechangeuse drsquoions

Apregraves cette premiegravere eacutetape de concentration et de dialyse le surnageant de culture est

purifieacute en utilisant une colonne eacutechangeuse drsquoanions (Q Sepharose Hiload 1610 Pharmacia)

Cette premiegravere eacutetape de purification va permettre de seacuteparer les diffeacuterentes proteacuteines selon leur

eacutetat de charge global La colonne utiliseacutee est constitueacutee drsquoune phase stationnaire (-


51

CH2N+(CH3)3) associeacutee agrave des contre-ions Les proteacuteines chargeacutees positivement crsquoest-agrave-dire

celles dont le point isoeacutelectrique est supeacuterieur au pH du tampon utiliseacute pour eacutequilibrer la

colonne ne seront pas retenues sur celle-ci tandis que les proteacuteines chargeacutees neacutegativement

seront eacutechangeacutees contre les contre-ions et donc retenues sur la colonne Un gradient de chlorure

de sodium permettra dans un second temps de les eacuteluer Lrsquoappareil de chromatographie utiliseacute

est un Biologic Duoflow Bio Rad avec un collecteur de fraction Biologic Biofrac La

purification est programmeacutee agrave lrsquoaide du logiciel Biologic Duoflow La deacutetection en sortie de

colonne se fait par deacutetection UV agrave 280 nm et par mesure de conductiviteacute eacutelectrique agrave lrsquoaide drsquoun

deacutetecteur Biologic QuadTec UV-Vis Bio Rad Le deacutebit est maintenu constant agrave 1 mLmin La

colonne est dans un premier temps eacutequilibreacutee avec une solution tampon phosphate citrate (CPB

50 mM) de pH 5 Lorsque la fraction proteacuteique non retenue a eacuteteacute eacutelueacutee un gradient de NaCl

est programmeacute Lorsque la totaliteacute des proteacuteines a eacuteteacute eacutelueacutee la colonne est agrave nouveau eacutequilibreacutee

avec du tampon CPB 50 mM pH 5

La seacuteparation a eacuteteacute reacutealiseacutee en utilisant diffeacuterents programmes afin drsquooptimiser sa qualiteacute

Le chromatogramme suivant (Figure II1) met en eacutevidence la preacutesence de plusieurs formes

proteacuteiques dans la solution preacutealablement concentreacutee Lrsquoactiviteacute des diffeacuterentes fractions est

mesureacutee afin de veacuterifier la preacutesence ou non de laccase

Figure II1 Chromatogramme de la purification du surnageant de culture de T versicolor par

eacutechange drsquoanion En rouge la conductiviteacute en noir le de tampon CPB + 1 M NaCl et en

vert le spectre UV-visible agrave 280 nm de la phase mobile

Laccase A

Laccase B

Laccase X

70

2 U

mL

40

6 U

mL

26

Um

L

70

8 U

mL

17

41

Um

L


52

Une premiegravere fraction proteacuteique non retenue ayant une coloration jaunacirctre (le premier pic)

est eacutelueacutee dans le tampon CPB pH 5 seul Outre les proteacuteines preacutesentes dans le milieu de culture

et dont le point isoeacutelectrique est supeacuterieur agrave 5 cette fraction contient de la laccase comme le

montre la mesure de lrsquoactiviteacute Toutes les fractions correspondant agrave ce pic sont rassembleacutees

concentreacutees et ne seront pas purifieacutees plus avant Ces fractions contiennent une forme de laccase

noteacutee A dont le point isoeacutelectrique est estimeacute autour de 7 ce qui explique qursquoelle ne soit pas

retenue sur la colonne drsquoeacutechange drsquoanions car sa charge globale est positive au pH de la phase

mobile utiliseacutee (pH 5) La laccase A est conserveacutee dans du glyceacuterol (15 wv) agrave -20degC On a

obtenu un rendement de 20 Le second massif de pics eacutelueacute agrave une concentration en NaCl

drsquoenviron 01 M contient eacutegalement une laccase noteacutee B Crsquoest cette isoforme de laccase (point

isoeacutelectrique eacutegal agrave 3) dont la structure cristallographique a eacuteteacute reacutesolue [28 87] qui a eacuteteacute

utiliseacutee dans ce travail La fraction est bleue ce qui est un indice de lrsquoefficaciteacute de cette premiegravere

eacutetape de purification

Les fractions contenant la laccase B sont rassembleacutees puis immeacutediatement dialyseacutees dans

un tampon phosphate citrate (50 mM) agrave pH 5 afin drsquoeacuteviter la deacutenaturation de lrsquoenzyme en

preacutesence des chlorures Apregraves dialyse une eacutetape de concentration dans une cellule

drsquoultrafiltration est reacutealiseacutee Finalement 5 mL de solution concentreacutee de laccase B avec une

activiteacute de 1575 UmL est obtenue soit un rendement de 30 On observe eacutegalement qursquoune

troisiegraveme fraction de couleur jaune contenant de la laccase est eacutelueacutee Cette forme noteacutee laccase

X ne sera pas utiliseacutee dans ce travail

II132Chromatographie drsquointeraction hydrophobe

A lrsquoissue de la premiegravere eacutetape de purification par eacutechange drsquoions les fractions contenant la

laccase B ont eacuteteacute purifieacutees par chromatographie drsquointeraction hydrophobe (Hytrap Phenyl HP

1 mL Pharmacia) La colonne est eacutequilibreacutee avec 5 mL de solution de sulfate drsquoammonium

(SA) agrave 30 (wv) 2 ou 3 mL de la solution contenant la laccase B dilueacutee deux fois dans une

solution de SA agrave 60 sont deacuteposeacutes sur la colonne (la purification sur colonne drsquointeraction des

5 mL de laccase obtenus agrave lrsquoissue de la purification par chromatographie drsquoeacutechange drsquoanions a

eacuteteacute reacutealiseacutee en deux fois) Les proteacuteines non retenues sont ensuite eacutelueacutees avec 5 mL de SA agrave

30 puis la laccase B est eacutelueacutee avec successivement 5 mL de SA agrave 20 puis 5 mL de SA agrave

10 Lrsquoactiviteacute des diffeacuterentes fractions collecteacutees en sortie de colonne est mesureacutee afin de


53

repeacuterer les fractions contenant la laccase La Figure II2 montre les activiteacutes des diffeacuterentes

fractions reacutecupeacutereacutees

Figure II2 Activiteacute des fractions collecteacutees agrave la sortie de la colonne de chromatographie

drsquointeraction hydrophobe pour un volume de laccase introduit de 2 mL (agrave gauche) et 3 mL (agrave

droite)

Une fois collecteacutees les solutions contenant lrsquoenzyme sont regroupeacutees dialyseacutees et

concentreacutees dans un tampon phosphate citrate 50 mM agrave pH 5 afin drsquoeacuteliminer le SA puis dans

un tampon phosphate agrave pH 7 pour conservation agrave -20degC Du glyceacuterol 15 (wv) est ajouteacute aussi

avant congeacutelation de lrsquoeacutechantillon Le reacutesumeacute des quantiteacutes de laccase purifieacutees apregraves chaque

eacutetape est donneacute dans le Tableau II2 Le rendement est calculeacute par rapport au milieu de culture

Tableau II2 Reacutecapitulatif des quantiteacutes de laccase produites et purifieacutees

Solution de laccase Volume

(mL)

Activiteacute

(UmL)

Quantiteacute de

laccase (U)

Rendement

()

Milieu de culture 400 85 3400

Milieu de culture concentreacute

(ultrafiltration) 13 200 2600 76

Purification de la laccase par chromatographie eacutechangeuse drsquoions

Laccase A (pic 1) 20 511 10226 30

Laccase A concentreacutee et

conditionneacutee 45 1526 6867 20

Laccase B (pic 2) 20 421 842 248

Laccase B concentreacutee puis

dialyseacutee dans tampon

phosphate et conserveacutee

5 1575 7877 30

Purification de la laccase par chromatographie hydrophobe

Laccase B conditionneacutee 75 4015 30113

0 2 4 6 8 10 12 14 16

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Acti

vit

eacute (

Um

L)

Fractions

2 4 6 8 10 12 14

0

20

40

60

80

100

120

Act

ivit

eacute (U

mL

)

Fractions

30

SA

20

SA

10

SA

30

SA

20

S

A

10

SA


54

La perte drsquoactiviteacute de la laccase A entre lrsquoeacutetape drsquoeacutelution et celle de concentrationdialyse

pourrait srsquoexpliquer par le fait que quelques jours se sont eacutecouleacutes entre lrsquoeacutetape de purification

et lrsquoeacutetape de concentration ou par le fait qursquoune portion de laccase a eacuteteacute perdue lors de lrsquoeacutetape

de lavage de la membrane drsquoultrafiltration Lrsquoaugmentation de lrsquoactiviteacute de la laccase B apregraves

dialyse pourrait etre expliqueacute par le fait que les ions chlorures qui inhibent lrsquoactiviteacute de la

laccase on eacuteteacute retireacutes par ultrafiltration

La solution de laccase B purifieacutee et concentreacutee est finalement analyseacutee par eacutelectrophoregravese

sur gel de polyacrylamide formeacute par reacuteticulation drsquoun meacutelange drsquoacrylamide et de bis-

acrylamide Plus le pourcentage de ce dernier est eacuteleveacute plus la densiteacute de chaines sera eacuteleveacutee

et plus les mailles du reacuteseau seront serreacutees et en conseacutequence plus les proteacuteines seront ralenties

Leur vitesse de deacuteplacement sous lrsquoeffet drsquoun champ eacutelectrique deacutepend en effet agrave la fois de leur

charge et de leur taille On utilise un gel agrave 115 dont la composition est deacutecrite dans le

Tableau II3 Un volume drsquoeacutechantillon agrave 4015 UmL est deacuteposeacute dans chaque puits Les

eacutechantillons deacuteposeacutes ne contiennent pas de dodeacutecyl sulfate de sodium (SDS) et nrsquoont pas subi

de traitement thermique agrave 100degC afin de conserver intacte lrsquoactiviteacute des proteacuteines

Tableau II3 Composition des milieux pour la reacutealisation de lrsquoeacutelectrophoregravese

Gel de reacutesolution (quantiteacute pour une plaque) agrave 115

Acryl acryl bis (solution commerciale agrave 40 ) 143 mL

Tampon A (TrisHCl agrave 2269 gL pH 89)

Eau

SDS 10

PSA 10 (persulfate drsquoammonium)

Temed

1 mL

248 mL

50 microL

375 microL

4 microL

Gel de stacking agrave 4 (quantiteacute pour une plaque)

Acryl acryl bis 03 mL

Solution D (TrisHCl 90 gL pH 68 SDS 10 )

Eau

PSA 10

Temed

05 mL

214 mL

60 microL

4 microL

On a reacutealiseacute deux gels sur lesquels on a deacuteposeacute les mecircmes eacutechantillons Sur le premier gel

on reacutevegravele la preacutesence de proteacuteines apregraves migration avec du nitrate drsquoargent tandis que lrsquoactiviteacute


55

laccase est deacutetecteacutee sur le second par impreacutegnation dans une solution de guaiumlcol un substrat de

la laccase qui produit une quinone coloreacutee en preacutesence de laccase (Figure II3)

Figure II3 Electrophoregravese sur gel apregraves reacuteveacutelation au nitrate drsquoargent (puits 1 agrave 6) et au

guaiumlcol (puits 7 agrave 10)

Les puits 1 et 6 contiennent des marqueurs de masse moleacuteculaire

Les puits 2 et 7 contiennent les surnageants de culture apregraves concentration et dialyse

Les puits 3 et 8 contiennent la laccase A apregraves eacutechange drsquoanion

Les puits 4 et 9 contiennent la laccase B apregraves eacutechange drsquoanion

Les puits 5 et 10 contiennent la laccase X apregraves eacutechange drsquoanion

Les laccases A et B ont des masses moleacuteculaires similaires de lrsquoordre de 60 kDa Or on

observe et cette constatation est reporteacutee eacutegalement dans la litteacuterature sans qursquoil soit donneacute

drsquoexplication que les laccases A et B migrent agrave des masses molaires diffeacuterentes respectivement

100 et 45 kDa Il est agrave noter toutefois que lorsqursquoon chauffe les eacutechantillons agrave 100degC avant de

les deacuteposer sur le gel drsquoeacutelectrophoregravese les deux proteacuteines migrent agrave la masse attendue soit 60

kD Cette laquo anomalie raquo de migration peut srsquoexpliquer par le fait que le tampon de preacuteparation

de lrsquoeacutechantillon ne contient pas de SDS La proteacuteine migre donc non seulement en fonction de

son poids moleacuteculaire mais eacutegalement de sa charge Dans les conditions expeacuterimentales

utiliseacutees ici on observe que la proteacuteine majoritaire du surnageant de culture (puits 2) est la

laccase B La fraction non retenue par chromatographie par eacutechange drsquoions contient

majoritairement de la laccase A ainsi que de nombreuses autres proteacuteines Par coloration au

45 kDa

66 kDa

97 kDa

116 kDa


56

guaiumlcol on ne deacutetecte pas la preacutesence de laccase B Le puits 4 contient la laccase B purifieacutee

On peut estimer la pureteacute de la laccase agrave au moins 95 sur la base de lrsquointensiteacute des bandes

On a aussi essayeacute de produire sans reacuteussite dans la levure Yarrowia lipolytica des laccases

recombinantes muteacutees Le protocole de production est deacutecrit en annexe (Annexe 1)

II14Oxydation de la laccase

La laccase produite par Trametes versicolor est une proteacuteine glycosyleacutee Ainsi 4 sites de

glycosylation ont eacuteteacute reacuteveacuteleacutes par la reacutesolution de sa structure par cristallographie [28] alors que

la seacutequence de la laccase comprend 7 sites putatifs de N-glycosylation (seacutequence Asn-X-

seacuterinethreacuteonine) Les sucres preacutesents sur ces sites de glycosylation sont susceptibles drsquoecirctre

oxydeacutes en preacutesence de periodate qui conduit agrave une coupure oxydante et agrave la formation de

groupements aldeacutehyde (Figure II4) Ce nouveau type de groupement fonctionnel sur la laccase

permettra de lrsquoimmobiliser sous forme covalente par formation drsquoune base de Schiff avec une

fonction amine du support de lrsquoeacutelectrode (voir chapitres III et IV) Le protocole drsquooxydation de

la laccase srsquoeffectue en deux temps Dans un premier temps on eacutelimine le glyceacuterol (qui permet

de conserver lrsquoenzyme mais serait oxydeacute par le periodate au deacutetriment de lrsquoenzyme) par

chromatographie drsquoexclusion sur une colonne PD10 (Millipore) avec une phase mobile

constitueacutee de tampon de phosphate 50 mM pH 7 On deacutepose agrave la surface de la colonne un

volume (V) de laccase eacutegal agrave environ 1 mL Apregraves avoir collecteacute les fractions drsquoeacutelution on

mesure lrsquoactiviteacute pour deacuteterminer les fractions contenant la laccase purifieacutee

La seconde eacutetape consiste agrave oxyder les fractions eacutetudieacutees contenant la laccase en preacutesence

de 200 microL de periodate de sodium 01 M (NaIO4) durant 30 minutes agrave lrsquoobscuriteacute sous agitation

continue La solution est ensuite purifieacutee par chromatographie drsquoexclusion (mecircme protocole

que la premiegravere eacutetape) afin drsquoeacuteliminer le periodate de sodium La laccase ainsi oxydeacutee est

concentreacutee par ultrafiltration Le rendement obtenu est de 24

Figure II4 Scheacutema du meacutecanisme drsquooxydation des sucres de la laccase par du periodate de

sodium


57

II2Elaboration des eacutelectrodes Les eacutelectrodes utiliseacutees dans ce travail ont eacuteteacute preacutepareacutees agrave partir de tiges de graphite

spectrographique commerciales (Mersen France) de diamegravetre 07 cm Dans un premier temps

la tige de graphite est deacutecoupeacutee en disques de 02 cm drsquoeacutepaisseur agrave lrsquoaide drsquoune scie meacutecanique

Chaque disque est ensuite abraseacute avec du papier de verre P80 durant 1 minute afin drsquouniformiser

sa surface (le deacutecoupage agrave la scie conduit agrave des rugositeacutes diffeacuterentes drsquoun disque agrave lrsquoautre)

Chaque disque est par la suite plongeacute dans une solution drsquoeacutethanol puis soumis aux ultrasons

pendant 5 minutes afin de laver la surface et enfin seacutecheacute agrave lrsquoazote Le disque de graphite ainsi

preacutepareacute sera ensuite fonctionnaliseacute soit par deacutepocirct drsquoun film mince de nitrure de carbone

amorphe (voir chapitre III) soit nanostructureacute par le deacutepocirct de nanowalls de carbone produits par

une meacutethode plasma sous vide Le graphite nanostructureacute sera dans ce cas fonctionnaliseacute agrave

lrsquoaide drsquoun proceacutedeacute plasma agrave la pression atmospheacuterique (voir chapitre IV) Une fois la

fonctionnalisation effectueacutee le disque est monteacute en eacutelectrode Pour cela on deacutecoupe tout

drsquoabord agrave lrsquoaide drsquoune scie meacutecanique une plaque de verre agrave microscope de 08 cm de largeur

et 5 cm de longueur Ensuite on colle une bande de scotch de cuivre sur toute la longueur drsquoune

face du verre On deacutepose ensuite une goutte drsquoalliage indium-galium liquide agrave tempeacuterature

ambiante sur une extreacutemiteacute de la bande de scotch afin drsquoassurer un bon contact eacutelectrique au

niveau de la jonction avec le disque de graphite deacuteposeacute agrave son aplomb On isole eacutelectriquement

la peacuteripheacuterie du disque de graphite ainsi que la quasi-totaliteacute de la bande de scotch de cuivre agrave

lrsquoaide drsquoune reacutesine eacutepoxy agrave prise rapide (RS) afin drsquoassurer lrsquoeacutetancheacuteiteacute de lrsquoeacutelectrode de

graphite (Figure II5) On veille agrave ne pas recouvrir lrsquoextreacutemiteacute de la bande de scotch de cuivre

opposeacutee agrave celle portant le disque de graphite car elle servira agrave prendre le contact avec le

potentiostat agrave lrsquoaide drsquoune pince

Figure II5 Electrode de graphite


58

II3Immobilisation de la laccase

II31Immobilisation covalente de la laccase sur lrsquoeacutelectrode

II311Formation drsquoune liaison amide

Deux protocoles ont eacuteteacute utiliseacutes pour immobiliser la laccase sur la surface des eacutelectrodes

par formation drsquoune liaison amide selon le type de groupement fonctionnel preacutesent agrave la surface

Dans le cas drsquoune eacutelectrode fonctionnaliseacutee avec des groupements carboxyliques celle-ci

est dans un premier temps activeacutee en deacuteposant une goutte drsquoun meacutelange de N-

hydroxysuccinimide (NHS 5 mM) et de 1-Ethyl-(3-dimeacutethylaminopropyl)-carbodiimide

(EDC 5 mM) durant 20 minutes sous cloche La goutte drsquoEDC-NHS est ensuite retireacutee puis on

rajoute entre 10 microL et 15 microL de laccase contenant 2 UmL (oxydeacutee ou non) agrave la surface du

graphite Ce meacutelange est maintenu sur lrsquoeacutelectrode durant 2 heures agrave tempeacuterature ambiante et

sous cloche afin de former la liaison amide entre lrsquoenzyme et la surface de lrsquoeacutelectrode (Figure

II6)

Figure II6 Scheacutema du meacutecanisme drsquoimmobilisation covalente de la laccase en preacutesence

drsquoEDC-NHS sur du graphite fonctionnaliseacute avec des groupements carboxyliques

Pour rappel la laccase de Trametes versicolor renferme cinq lysines (Figure II7) La

chaine lateacuterale de ces lysines renferme des amines permettant lrsquoimmobilisation de la laccase


59

On lave ensuite lrsquoeacutelectrode dans 10 mL de solution de tampon phosphate 50 mM agrave pH 7 pendant

30 minutes sous agitation afin drsquoeacuteliminer les enzymes non lieacutees de maniegravere covalente agrave

lrsquoeacutelectrode Ce lavage est reacutepeacuteteacute trois fois (agrave chaque lavage la solution tampon est renouveleacutee

et on veacuterifie que lrsquoactiviteacute enzymatique est nulle dans le surnageant apregraves le dernier rinccedilage)

Lrsquoeacutelectrode est finalement conserveacutee dans une solution tampon de phosphate 50 mM (pH 7) agrave

4degC pour une utilisation ulteacuterieure

Dans le cas drsquoune surface contenant des groupements amines on active tout drsquoabord les

groupements carboxyliques de la laccase et par la suite on deacutepose durant 2 heures sous cloche

agrave tempeacuterature ambiante le meacutelange EDC-NHSenzyme agrave la surface de lrsquoeacutelectrode On a la

formation drsquoune liaison amide entre les 45 acides aspartiques et glutamiques dont la chaine

lateacuterale contient des groupements carboxyliques activeacutes et les amines du support Ces acides

amineacutes sont reacutepartis sur lrsquoensemble de la structure de lrsquoenzyme On a ainsi un site drsquoaccrochage

plus aleacuteatoire lors de son immobilisation agrave la surface du support que dans le cas ougrave la laccase

est immobiliseacutee via ses reacutesidus lysines

Figure II7 Scheacutema repreacutesentant les lysines (en bleu) et les acides aspartiques et glutamiques

(en jaune) de la laccase B de T versicolor En vert la xylidine substrat lieacute au cuivre T1

II312Formation drsquoune liaison imine

Dans le cas de la laccase oxydeacutee on deacutepose directement lrsquoenzyme (2 UmL) sur lrsquoeacutelectrode

fonctionnaliseacutee avec des groupements amine Une liaison imine (Figure II8) se forme entre les

groupements aldeacutehyde de la laccase et les groupements amine preacutesents agrave la surface de


60

lrsquoeacutelectrode Lrsquoeacutelectrode est ensuite rinceacutee suivant le mecircme protocole que pour la formation des

liaisons amides La laccase renferme quatre sites de glycosylation mis en eacutevidence par lrsquoeacutetude

cristallographique (Figure II9)

Figure II8 Scheacutema du meacutecanisme drsquoimmobilisation covalente de la laccase oxydeacutee sur du

graphite fonctionnaliseacute avec des groupements amines

Figure II9 Scheacutema repreacutesentant les sites de glycosylation (en azur) de la laccase B de T

versicolor En vert la xylidine substrat lieacute au cuivre T1

II32Immobilisation par adsorption

Un volume compris entre 10 et 15 microL de laccase contenant 2 UmL est deacuteposeacute agrave la surface

de lrsquoeacutelectrode Ce volume est maintenu sur lrsquoeacutelectrode durant 2 heures agrave tempeacuterature ambiante

et sous cloche Lrsquoeacutelectrode est ensuite laveacutee trois fois durant 30 minutes dans une solution

tampon de phosphate pH 7

Dans le cas de lrsquoimmobilisation de la laccase naturelle en preacutesence drsquoune surface contenant

des groupements amines agrave pH 7 ces derniers sont chargeacutes positivement tandis que les

groupements carboxyliques de la laccase sont chargeacutes neacutegativement On a ainsi majoritairement


61

des interactions favorables Si la surface est fonctionnaliseacutee par des groupements carboxyliques

les interactions eacutelectrostatiques sont deacutefavorables entres les COO- de surface du support et

lrsquoenzyme chargeacutee neacutegativement

II4Mesure de la surface eacutelectroactive de lrsquoeacutelectrode de graphite

II41Principe

La surface eacutelectroactive de lrsquoeacutelectrode est deacutetermineacutee en eacutetudiant le comportement

eacutelectrochimique du couple Fe(CN)63-Fe(CN)6

4- par voltampeacuteromeacutetrie cyclique agrave diffeacuterentes

vitesses de balayage en utilisant la relation de Randles-Sevcik

ip = (269times105) times α12 times n32 times S times D12 times C times vfrac12

ip courant de pic anodique ou cathodique (en ampegravere (A))

α coefficient de transfert de charge (consideacutereacute eacutegal agrave 05)

n nombre drsquoeacutelectrons eacutechangeacutes au cours de la reacuteaction n = 1 pour le couple ferricyanurefer-

rocyanure

S surface eacutelectroactive de lrsquoeacutelectrode (en cm2)

D coefficient de diffusion du ferricyanure D = 632 times 10-6 cm2s

C concentration de lrsquoespegravece eacutelectroactive (en moLcm3)

v vitesse de balayage (en Vs)

La valeur de la surface eacutelectroactive S est calculeacutee agrave partir de la pente de la droite ip = f(vfrac12)

II42Protocole expeacuterimental

On deacutetermine la surface eacutelectroactive de lrsquoeacutelectrode de graphite en eacutetudiant le

comportement eacutelectrochimique du couple Fe(CN)63-Fe(CN)6

4- 5 mM dans du KCl 01 M par

voltampeacuteromeacutetrie cyclique entre -05 VECS et 06 VECS agrave diffeacuterentes vitesses de balayage

(20 mVs-1 30 mVs-1 40 mVs-1 50 mVs-1 60 mVs-1 et 100 mVs-1)

II5Mesure de lrsquoactiviteacute enzymatique de la laccase

II51Principe

Lrsquoactiviteacute enzymatique (A) drsquoune solution drsquoenzyme est calculeacutee par rapport agrave un substrat

donneacute Elle est exprimeacutee en uniteacute UmL drsquoenzyme sachant que U est le nombre de micromoles de

substrat transformeacute par minute par lrsquoenzyme (micromolemin) Le substrat de reacutefeacuterence utiliseacute pour


62

deacuteterminer lrsquoactiviteacute enzymatique de la laccase est lrsquoacide 2 2rsquo-azino-bis (3-

eacutethylbenzothiazoline-6-sulfonique) (ABTS) LrsquoABTS2- est un composeacute incolore mais son

oxydation (par la laccase) en un radical stable provoque lrsquoapparition drsquoune coloration verte

permettant ainsi drsquoeffectuer des mesures de spectrophotomeacutetrie UV-visible agrave 420 nm Les

reacuteactions mises en jeu sont

ABTS2- rarr ABTS- + e-

O2 + 4 H+ + 4 e- rarr 2 H2O

4 ABTS2- + O2 + 4 H+ rarr 4 ABTS- + 2 H2O

En mesurant lrsquoabsorbance en fonction du temps nous pouvons deacuteterminer la vitesse de

formation du radical et donc par conseacutequent deacuteterminer lrsquoactiviteacute enzymatique de la laccase En

effet drsquoapregraves la loi de Beer-Lambert

DO = ε l C

harr DO = ε times l times n

V harr n =

DO timesV

ε timesl harr

∆n

∆t =

∆DO

∆t times

V

ε timesl

rarr A = ∆n

∆t = [

∆DO

∆ttimes

V

ε timesl] times

1

Vlaccase

DO lrsquoabsorbance

A activiteacute enzymatique (en UmL)

ε 36 000 (en (Lmol-1cm-1 ) agrave 420 nm

C concentration (en M) du radical ABTS-

n nombre de moles de radical ABTS-formeacute (en mole)

V volume de la solution analyseacutee par UV-visible (en mL)

Vlaccase volume de laccase introduit dans la cuve (mL)

l longueur trajet optique dans la cuve de spectrophotomeacutetrie = 1 cm

II52Protocole de mesure de lrsquoactiviteacute enzymatique de la laccase

-Mesure de lrsquoactiviteacute de la laccase en solution

Dans une cuve preacutealablement chauffeacutee agrave 30 degC sont introduits (la cuve est aussi chauffeacutee

au cours de la mesure)

-940 microL de tampon citratephosphate 50 mM (pH 3) preacutealablement satureacute en oxygegravene par

bullage drsquoair


63

-50 microL drsquoune solution drsquoABTS agrave 20 mM

-10 microL de solution de laccase

Drsquoapregraves lrsquoeacutequation ci-dessous lrsquoactiviteacute totale de la laccase se calcule agrave partir de la pente

de la droite DO = f(t) selon lrsquoeacutequation ci-dessous

Atotale = 277 times ∆DO

∆t (UmL)

-Mesure de lrsquoactiviteacute de la laccase immobiliseacutee agrave la surface de lrsquoeacutelectrode de graphite

Lrsquoeacutelectrode est plongeacutee dans une cuve de 3 mL preacutealablement chauffeacutee agrave 30degC contenant

150 microL drsquoABTS 20 mM (V = 150 microL) et un volume (285 mL) de tampon phosphate citrate 50

mM (pH 3) satureacute en oxygegravene La solution tampon a eacuteteacute preacutealablement aeacutereacutee durant 15 minutes

Lrsquoactiviteacute de la laccase greffeacutee agrave la surface de lrsquoeacutelectrode se deacuteduit de lrsquoeacutequation ci-dessous

A = 0083 times ∆DO

∆t (U)

II6 Mesure du courant biocatalytique Le courant de reacuteduction de lrsquooxygegravene est mesureacute par voltampeacuteromeacutetrie cyclique gracircce agrave un

balayage (aller-retour) du potentiel entre 09 VECS et -03 VECS dans un tampon aceacutetate 50

mM pH 42 Deux mesures sont systeacutematiquement effectueacutees une premiegravere mesure apregraves

avoir deacutegazeacute durant 15 minutes la solution avec de lrsquoazote et ce afin de deacuteterminer le courant

capacitif Une deuxiegraveme mesure apregraves avoir oxygeacuteneacute sous O2 la solution durant 40 min et ce

afin de deacuteterminer le courant total (le courant faradique ducirc agrave la reacuteduction drsquooxygegravene

biocatalyseacutee et le courant capacitif) Les valeurs de courants de reacuteduction biocatalyseacutee du

dioxygegravene ont eacuteteacute deacutetermineacutees agrave un potentiel eacutegal agrave 02 VECS apregraves soustraction du courant

capacitif mesureacute au mecircme potentiel Le montage est constitueacute drsquoune contre-eacutelectrode en platine

drsquoune eacutelectrode de reacutefeacuterence au calomel satureacutee (ECS) et de lrsquoeacutelectrode de travail testeacutee

Lrsquoappareil de mesure utiliseacute est un potentiostat VSP (Bio-logic)

II7Caracteacuterisation de la surface de lrsquoeacutelectrode

II71Microscopie eacutelectronique agrave balayage (MEB)

Lrsquoappareil utiliseacute pour observer les surfaces des eacutelectrodes est le modegravele Ultra 55 de ZEISS

eacutequipeacute de lrsquoanalyse eacuteleacutementaire par spectromeacutetrie de rayons X (EDS) La surface des eacutelectrodes

nrsquoa pas eacuteteacute meacutetalliseacutee Elles ont eacuteteacute directement introduites dans la chambre


64

II72Spectromeacutetrie photoeacutelectronique agrave rayons X (XPS)

Le principe de lrsquoXPS repose sur la mesure de lrsquoeacutenergie cineacutetique des eacutelectrons de cœur eacutemis

par un mateacuteriau sous lrsquoimpact drsquoun faisceau monochromatique de photons X drsquoeacutenergie hύ

Connaissant lrsquoeacutenergie cineacutetique il est possible de calculer lrsquoeacutenergie de liaison des eacutelectrons et

ainsi drsquoacceacuteder agrave la composition chimique de la surface du mateacuteriau Lrsquoappareil XPS utiliseacute est

un Physical Electronics Type 5600 Les spectres ont eacuteteacute collecteacutes en utilisant un

spectrophotomegravetre photo-eacutelectronique agrave rayons X de type Omicron (ESCA+) Les eacutenergies de

liaison sont calibreacutees par rapport au pic du carbone C1s (eacutenergie de liaison eacutegale agrave 2846 eV)

Lrsquoensemble des spectres a eacuteteacute deacutecomposeacute en utilisant le logiciel Casa XPS Les analyses XPS

ont permis de calculer le taux de recouvrement de la laccase sur lrsquoeacutelectrode et de quantifier les

groupements fonctionnels (groupements carboxyliques amines et aldeacutehydes) agrave la surface du

graphite Lrsquoexpression de la deacuteriveacute de lrsquointensiteacute du signal XPS est la suivante (Equation II1)

dI= ϕn (A

cosθ) dzσΩ exp (-

z

λcosθ) T(EC) (Eq II1)

De cette eacutequation deacutecoulent plusieurs expressions qui font intervenir lrsquoeacutepaisseur de la

couche eacutetudieacutee Dans le cas ougrave lrsquoon est en preacutesence drsquoune couche semi-infinie non recouverte

(Figure II10) (par exemple une eacutelectrode de graphite drsquoeacutepaisseur infinie non recouverte par

lrsquoenzyme) on integravegre lrsquoEquation II1 entre zeacutero et lrsquoinfini ce qui conduit agrave lrsquoexpression suivante

de lrsquointensiteacute (Equation II2)

Figure II10 Couche semi-infinie non recouverte

I(infin)= ϕn (A

cosθ) σΩT(EC)λcosθ (Eq II2)


65

Dans le cas ougrave une couche finie drsquoeacutepaisseur d recouvre une couche semi-infinie (Figure

II11) (une eacutelectrode de graphite recouverte drsquoenzyme) lrsquointensiteacute drsquoun eacuteleacutement contenu dans

la couche drsquoeacutepaisseur d est obtenue en inteacutegrant lrsquoEquation II1 entre zeacutero et d (Equation II3)

Figure II11 Couche finie drsquoeacutepaisseur d

I(d)= ϕn (A

cosθ) σΩT(EC)λcosθ(1-exp(-

d

λcosθ)) (Eq II3)

Dans le cas ougrave une couche drsquoeacutepaisseur semi-infinie est recouverte drsquoune couche drsquoeacutepaisseur

d (Figure II12) lrsquointensiteacute drsquoun eacuteleacutement de la couche drsquoeacutepaisseur semi-infinie par la couche

drsquoeacutepaisseur d est obtenue en inteacutegrant lrsquoEquation II1 entre d et lrsquoinfini (Equation II4)

Figure II12 Couche semi-infinie sous une couche drsquoeacutepaisseur d

I(d-infin)= ϕn (A

cosθ) σΩT(EC)λcosθexp(-

d

λcosθ) (Eq II4)

T(Ec) facteur de sensibiliteacute de lrsquoappareil

λ chemin parcouru par les eacutelectrons du composeacute eacutetudieacute agrave travers une couche

α section efficace de lrsquoeacuteleacutement consideacutereacute

Θ angle entre le faisceau incident de deacutetection et le faisceau reacutefleacutechi (cosθ est eacutegal agrave 07)

66

67

Chapitre IIIElaboration drsquoune cathode graphitea-

CNxlaccase effet de lrsquoorientation de la laccase

immobiliseacutee

68

Chapitre III Elaboration drsquoune cathode graphitea-CNxlaccase effet de lrsquoorientation de la laccase immobiliseacutee

69

Dans ce chapitre la surface drsquoune eacutelectrode de graphite a eacuteteacute recouverte par un film mince

de nitrure de carbone amorphe (a-CNx) potentiellement tregraves lisse (rugositeacute RMS lt 1 nm) ayant

lrsquoavantage de surcroit de preacutesenter agrave lrsquoeacutetat natif des groupements amines en surface qui sont

neacutecessaires pour certains modes de greffage enzymatique Ce type de mateacuteriau apparaicirct donc

adapteacute pour la conception drsquoeacutelectrodes planes de biopiles deacutedieacutees agrave des techniques drsquoanalyse

non applicables ou difficilement exploitables sur des eacutelectrodes constitueacutees de mateacuteriaux

nanostructureacutes Il semble donc plus pertinent pour la reacutealisation drsquoeacutetudes fondamentales et ce

non seulement du fait de la preacutesence de groupements fonctionnels intrinsegraveques de surface mais

aussi en raison drsquoun domaine eacutetendu drsquoeacutelectroactiviteacute Au cours de ce chapitre ce mateacuteriau sera

utiliseacute comme support pour eacutetudier lrsquoinfluence de lrsquoorientation de la laccase greffeacutee sur son

comportement bioeacutelectrocatalytique vis-agrave-vis de la reacuteduction de lrsquooxygegravene par transfert

eacutelectronique direct

III1Mateacuteriels et meacutethodes Des eacutelectrodes graphitea-CNx ont eacuteteacute preacutepareacutees par deacutepocirct drsquoun film de nitrure de carbone

amorphe sur une eacutelectrode de graphite eacutelaboreacutee selon le protocole deacutecrit dans la section II2

Elles ont ensuite eacuteteacute caracteacuteriseacutees par voltampeacuteromeacutetrie cyclique chronoampeacuteromeacutetrie et

spectroscopie UV-visible afin drsquoeacutevaluer les performances bioeacuteelectrocatalytiques des enzymes

greffeacutees puis par XPS AFM et MEB afin de caracteacuteriser la topologie et la composition

eacuteleacutementaire de la surface des biocathodes et enfin par spectroscopie drsquoimpeacutedance

eacutelectrochimique (SIE) afin de mieux comprendre lrsquoinfluence des enzymes et de leur orientation

sur la cineacutetique de lrsquoORR (Oxygen Reduction Reaction) On ne deacutetaillera ici que les protocoles

de revecirctement du graphite par le nitrure de carbone amorphe de chronoampeacuteromeacutetrie de

spectroscopie drsquoimpeacutedance eacutelectrochimique et de microscopie agrave force atomique Les autres

meacutethodes de caracteacuterisation ont deacutejagrave eacuteteacute deacutecrites dans le chapitre II

III11Elaboration de la biocathode deacutepocirct drsquoune couche mince de nitrure de

carbone amorphe (a-CNx) par pulveacuterisation cathodique reacuteactive magneacutetron

Le nitrure de carbone amorphe est deacuteposeacute par pulveacuterisation cathodique reacuteactive magneacutetron

Avant de deacutetailler le protocole utiliseacute pour deacuteposer ce film nous allons tout drsquoabord deacutecrire

briegravevement le principe de cette meacutethode La pulveacuterisation cathodique reacuteactive magneacutetron est

une meacutethode de deacutepocirct de couches minces sous vide utilisant un plasma [79] Le mateacuteriau de


70

deacutepart est issu de la cathode (la cible) chargeacutee neacutegativement (dans notre cas il srsquoagit drsquoune

cathode de graphite) et le substrat est quant agrave lui positionneacute agrave lrsquoanode Le plasma arrache des

atomes de carbone de la cible On forme alors des clusters de carbone qui vont reacuteagir avec

lrsquoazote du meacutelange de gaz plasmagegravene ArN2 puis se deacuteposer sur le substrat sous forme de

couches minces drsquoa-CNx dont la simple exposition agrave lrsquoair conduit agrave lrsquoamination de leur surface

Le reacuteacteur utiliseacute pour le deacutepocirct drsquoa-CNx agrave la surface de nos eacutelectrodes de graphite est le

modegravele MP 300S de PLASSYS SA Le deacutepocirct srsquoeffectue en plusieurs eacutetapes Le disque de

graphite est tout drsquoabord fixeacute au centre drsquoun porte-eacutechantillon afin drsquoavoir un deacutepocirct homogegravene

Lrsquoensemble est par la suite introduit dans la chambre de deacutepocirct via un sas afin de maintenir

constamment lrsquoenceinte de deacutepocirct sous ultravide La pression au sein du sas est de 42 mTorr au

maximum [80] La pression dans la chambre de deacutepocirct est maintenue agrave une valeur eacutegale agrave 1 Pa

pendant la phase de deacutepocirct Elle est alimenteacutee en argon et en azote (P(N2)Ptot = 003) A

lrsquointeacuterieur de la chambre la surface du graphite est deacutecapeacutee agrave lrsquoaide drsquoun plasma ArN2 dans

une eacutetape preacuteliminaire (plasma etching) afin drsquoenlever la couche drsquooxyde puis une couche

mince drsquoa-CNx est deacuteposeacutee agrave la surface Des groupements carboxyliques de surface sur la

couche drsquoa-CNx ont eacuteteacute creacuteeacutes en effectuant un traitement anodique par chronopotentiomeacutetrie

selon le protocole utiliseacute par Madeiros et al [89] Ce type drsquoeacutelectrode sera noteacute graphitea-CNx

AT Pour cela lrsquoeacutelectrode est polariseacutee dans une solution aqueuse drsquohydroxyde de potassium agrave

01 M durant une minute en appliquant une densiteacute de courant de 3 mAcm2 Pour rappel les

mesures eacutelectrochimiques sont effectueacutees en utilisant une eacutelectrode au calomel satureacutee en tant

qursquoeacutelectrode de reacutefeacuterence ainsi qursquoune grille de platine comme contre-eacutelectrode

III12Mesure de la stabiliteacute de la biocathode par chronoampeacuteromeacutetrie

La stabiliteacute de lrsquoactiviteacute biocatalytique de la laccase immobiliseacutee sur lrsquoeacutelectrode graphitea-

CNx selon les protocoles deacutecrits dans le chapitre II a eacuteteacute eacutetudieacutee par chronoampeacuteromeacutetrie sur

une dureacutee de 24 heures Le montage eacutelectrochimique est le mecircme que pour les mesures de

voltampeacuteromeacutetrie cyclique la biocathode est plongeacutee dans une solution aqueuse de tampon

aceacutetate (50 mM) pH 42 Le milieu est tout drsquoabord satureacute en oxygegravene par bullage drsquoO2 (Annexe

2) Durant lrsquoacquisition du chronoampeacuterogramme une couverture drsquooxygegravene est maintenue au-

dessus de la solution afin de garder une concentration constante en oxygegravene dans le milieu Les

mesures de courants de palier de lrsquoORR sont effectueacutees agrave un potentiel eacutegal agrave 02 VECS pour


71

lequel le courant atteint preacuteciseacutement la valeur du courant de palier Preacutecisons que les densiteacutes

de courant rapporteacutees dans la litteacuterature sont souvent mesureacutees agrave ce potentiel [42]

III13Caracteacuterisation de la surface de la biocathode par AFM

La microscopie agrave force atomique (AFM) est une technique qui permet de cartographier la

topographie de surface drsquoun mateacuteriau biologique ou autre avec une reacutesolution nanomeacutetrique

voir atomique sous certaines conditions [79] pourvu que sa rugositeacute le permette Il srsquoagit drsquoune

meacutethode non destructrice Cette technique est baseacutee sur lrsquointeraction entre une sonde se

comportant comme un capteur de force et la surface drsquoun mateacuteriau Le principe de lrsquoAFM

repose sur la mesure ou lrsquoexploitation des diffeacuterentes forces drsquointeraction (force de reacutepulsion

force drsquoattraction) entre les atomes de la surface du mateacuteriau agrave analyser et les atomes de lrsquoapex

de la pointe AFM Cette derniegravere est souvent constitueacutee de nitrure de silicium (Si3N4) et possegravede

une forme pyramidale Elle est positionneacutee agrave lrsquoextreacutemiteacute drsquoune face drsquoun micro-levier flexible

ou cantilever de raideur donneacutee Lrsquoensemble pointe-cantilever forme la sonde AFM capable de

se deacuteplacer dans les trois directions (x y et z) de lrsquoespace Le mateacuteriau agrave analyser est immobiliseacute

quant agrave lui sur un porte-eacutechantillon Lorsque lrsquoeacutechantillon est approcheacute de la pointe les forces

drsquointeraction pointe-eacutechantillon provoquent la deacuteflexion du cantilever Le contact est eacutetabli

lorsque cette derniegravere atteint la valeur de consigne fixeacutee par lrsquoexpeacuterimentateur Un faisceau

laser reacutefleacutechi par la face arriegravere meacutetalliseacutee du cantilever vers une photodiode composeacutee de

quatre quadrants permet de mesurer cette deacuteflexion On peut citer les trois modes de

fonctionnement de lrsquoAFM

- le mode contact ougrave la pointe est en contact permanent avec la surface de lrsquoeacutechantillon

pendant lrsquoimagerie

- le mode non-contact ougrave la pointe subit continuellement agrave distance les forces

drsquoattraction de la surface

- le mode tapping ougrave le contact entre la pointe et la surface est intermittent en raison

du placement du levier en situation drsquooscillation agrave une freacutequence bien deacutetermineacutee gracircce agrave une

excitation drsquoorigine acoustique

LrsquoAFM eacutetant une technique drsquoimagerie de tregraves haute reacutesolution elle est mal adapteacutee aux

surfaces fortement rugueuses crsquoest pourquoi nous avons opteacute pour lrsquoutilisation du silicium dopeacute

au bore comme substrat de deacutepart car il a la particulariteacute drsquoavoir une surface lisse (RMS (Root


72

Mean Square) lt 1 nm) Les mecircmes protocoles ont eacuteteacute utiliseacutes pour deacuteposer le film drsquoa-CNx sur

Si (silicium) dopeacute B (bore) et le graphite et pour immobiliser la laccase agrave la surface des

eacutelectrodes graphitea-CNx et Sia-CNx Lrsquoappareil AFM utiliseacute est le modegravele Molecular

Imaging (base Pico SPM-LE) Il est constitueacute drsquoun nez AFM adapteacute au mode de fonctionnement

envisageacute drsquoun scanner et drsquoun controcircleur (Picoscan SPM 2100) Lrsquoensemble est dirigeacute par le

logiciel Picoscan 532 Cet eacutequipement AFM est eacutegalement accompagneacute drsquoune cameacutera geacutereacutee

par ordinateur qui facilite les eacutetapes de positionnement de la sonde AFM au-dessus de

lrsquoeacutechantillon Elle permet aussi de veacuterifier le reacuteglage du laser en srsquoassurant que le faisceau du

laser tape sur lrsquoextreacutemiteacute du cantilever

III14La spectroscopie drsquoimpeacutedance eacutelectrochimique (SIE)

La spectroscopie drsquoimpeacutedance eacutelectrochimique permet drsquoeacutetudier les pheacutenomegravenes

eacutelectrochimiques se deacuteroulant agrave lrsquointerface eacutelectrolyteeacutelectrode [90] Le principe de

lrsquoimpeacutedance eacutelectrochimique est drsquoimposer un potentiel ΔE(t) (perturbation sinusoiumldale) de

faible amplitude (afin de conserver la reacuteponse lineacuteaire du systegraveme) superposeacute agrave un potentiel

constant E et drsquoenregistrer la reacuteponse en courant du systegraveme (Figure III1) Inversement un

courant ΔI(t) variant de faccedilon sinusoiumldale en fonction du temps peut ecirctre imposeacute au courant I0

et le potentiel enregistreacute La reacuteponse ainsi obtenue est fonction de la freacutequence du signal

drsquoexcitation appliqueacutee au courant (impeacutedance galvano-statique) ou au potentiel (impeacutedance

potentio-statique)

Figure III1 Scheacutema drsquoun systegraveme eacutelectrochimique non lineacuteaire soumis agrave une perturbation

sinusoiumldale


73

La perturbation imposeacutee eacutetant sinusoiumldale (potentiel ou courant) elle est donc de la forme

x(t)=Asin(ωt) et la reacuteponse mesureacutee du systegraveme est y(t)=Bsin(ωt+ϕ) avec une freacutequence f une

pulsation ω=2πf et un deacutephasage ϕ Lrsquoimpeacutedance eacutelectrochimique est un nombre complexe noteacute

Z(ω) qui a pour expression (Equation III1)

Z(ω)=ΔE(ω)

ΔI(ω)= Zr(ω) + j Z

j(ω)=|Z|ejφ=|Z| (cosφ + j sinφ) (Eq III1)

j2 = -1 Zr est la partie reacuteelle Zj la partie imaginaire de lrsquoimpeacutedance |Z| son module et φ la

phase ΔE(ω) et ΔI(ω) correspondent aux transformeacutees de Fourier des grandeurs ΔE(t) et ΔI(t)

respectivement

Les donneacutees drsquoimpeacutedance peuvent ecirctre repreacutesenteacutees en coordonneacutees carteacutesiennes par leur

partie imaginaire en fonction de leur partie reacuteelle ce qui conduit agrave des graphes appeleacutes

diagrammes de Nyquist Ces derniers sont le plus souvent utiliseacutes en tant que premiegravere

repreacutesentation des reacutesultats Ils permettent drsquoavoir une premiegravere analyse qualitative du systegraveme

Les donneacutees drsquoimpeacutedance peuvent aussi ecirctre repreacutesenteacutees en coordonneacutees logarithmiques par

leur module et leur phase en fonction de la freacutequence (diagramme de Bode) Cette

repreacutesentation permet drsquoavoir une visualisation complegravete des reacutesultats drsquoimpeacutedance sur tout le

domaine de freacutequence (Figure III2)

Figure III2 A gauche diagramme de Nyquist et agrave droite diagramme de Bode

Les diffeacuterents processus ayant lieu agrave lrsquointerface eacutelectrodeeacutelectrolyte peuvent ecirctre

modeacuteliseacutes en ayant recourt agrave des composants eacutelectriques eacuteleacutementaires (reacutesistance condensateur

etchellip) Le circuit eacutelectrique formeacute par lrsquoassociation de ces eacuteleacutements et repreacutesentant le systegraveme


74

eacutelectrochimique est appeleacute circuit eacutelectrique eacutequivalent A titre drsquoexemple il faut citer le circuit

de Randles composeacute drsquoune reacutesistance drsquoeacutelectrolyte drsquoune reacutesistance de transfert de charge

drsquoune impeacutedance de Warburg et drsquoun CPE (constant phase element) qui est lrsquoun des tout

premiers utiliseacutes Il est impeacuteratif que les eacuteleacutements constituant le circuit proposeacute aient un sens

physique et puissent ecirctre associeacutes agrave un processus chimique ou eacutelectrochimique preacutecis se

produisant effectivement au sein du systegraveme eacutetudieacute Par ailleurs un spectre obtenu

expeacuterimentalement peut souvent ecirctre ajusteacute agrave lrsquoaide de plusieurs circuits eacutequivalents et il

convient alors de seacutelectionner le plus pertinent

Lors de la mise en contact drsquoune eacutelectrode et drsquoun eacutelectrolyte plusieurs pheacutenomegravenes

deacutependant du potentiel peuvent avoir lieu Les variations de potentiel et de courant dans

lrsquoeacutelectrolyte conduisent agrave une chute ohmique deacutecrite comme eacutetant une reacutesistance drsquoeacutelectrolyte

Re Un autre pheacutenomegravene observeacute agrave lrsquointerface eacutelectrodeeacutelectrolyte est celui de la formation

drsquoune double couche drsquoions Lrsquoapplication drsquoune perturbation sinusoiumldale lors de la mesure

drsquoimpeacutedance entraicircne la charge et la deacutecharge de cette couche qui se comporte alors comme un

condensateur eacutelectrique Lrsquoimpeacutedance drsquoun condensateur de capaciteacute C a pour expression Z(ω)

= 1

jCω La capaciteacute est souvent remplaceacutee par un CPE (constant phase element) de maniegravere agrave

rectifier les deacuteviations qui peuvent ecirctre dues agrave une inhomogeacuteneacuteiteacute de surfaces telle qursquoune

rugositeacute Il peut aussi se produire des processus faradiques Deux cas sont agrave prendre en

consideacuteration Soit la cineacutetique de reacuteaction est strictement controcircleacutee par le transfert de charge

et dans ce cas lrsquoimpeacutedance comprendra une contribution de Rtc (Rtc repreacutesente la reacutesistance de

transfert de charges) soit la cineacutetique est controcircleacutee par la diffusion et il faut alors prendre en

compte en plus les variations de concentrations des espegraveces eacutelectroactives Lrsquoimpeacutedance de

diffusion est appeleacutee impeacutedance de Warburg Signalons ici que certains pheacutenomegravenes

eacutelectrochimiques conduisent agrave des spectres drsquoimpeacutedance qui ne peuvent ecirctre ajusteacutes agrave lrsquoaide de

circuits eacutelectriques eacutequivalents Dans ce cas des modegraveles analytiques fondeacutes sur un jeu

drsquoeacutequations peuvent ecirctre utiliseacutes

Les mesures eacutelectrochimiques sont reacutealiseacutees agrave lrsquoaide du potentiostat Bio-Logic modegravele

VSP Une eacutelectrode de platine a eacuteteacute connecteacutee en parallegravele de lrsquoeacutelectrode de reacutefeacuterence (ECS)

afin drsquoeacuteviter tout arteacutefact en haute freacutequence ducirc agrave lrsquoeacutelectrode de reacutefeacuterence Les expeacuteriences

drsquoimpeacutedance sont reacutealiseacutees dans le mecircme milieu (tampon aceacutetate 50 mM pH 42 dans 01 M


75

NaClO4) que les expeacuteriences de chronoampeacuteromeacutetrie et de voltampeacuteromeacutetrie cyclique (satureacute

en oxygegravene) Les diagrammes dimpeacutedance eacutelectrochimique sont traceacutes dans un domaine de

freacutequence compris entre 105 Hz et 10-2 Hz agrave un potentiel eacutegal agrave 06 VECS avec 10 points par

deacutecade et une amplitude crecircte-crecircte de 10 mV Dans ce travail lrsquoajustement des spectres

drsquoimpeacutedance obtenus expeacuterimentalement a eacuteteacute reacutealiseacute agrave lrsquoaide du logiciel Simad deacuteveloppeacute au

sein du LISE

III2Reacutesultats et discussion

III21Caracteacuterisation morphologique et chimique de la couche drsquoa-CNx avant et

apregraves traitement anodique

Avant drsquoeacutevaluer les performances des biocathodes les eacutelectrodes de graphite graphitea-

CNx et graphitea-CNx AT ont tout drsquoabord eacuteteacute caracteacuteriseacutees par MEB (Figure III3) La

structure du graphite srsquoorganise sous forme drsquoun empilement de feuillets (Figure III3A) On

constate que le graphite possegravede une structure eacuteclateacutee ce qui lui confegravere une surface speacutecifique

supeacuterieure agrave la surface geacuteomeacutetrique Lrsquoeacutetude du comportement eacutelectrochimique du couple

(Fe(CN)63-Fe(CN)6

4-) sur lrsquoeacutelectrode de graphite par voltampeacuteromeacutetrie cyclique agrave diffeacuterentes

vitesses de balayage montre que la surface eacutelectroactive obtenue en utilisant la relation de

Randles-Sevcik (deacutetailleacutee dans le chapitre II section II4) est eacutegale agrave 080 cm2 (Figure III4)

Pour rappel la relation de Randles-Sevcik permet drsquoexprimer les courants de pic drsquoun couple

oxydo-reacuteducteur rapide comme dans notre cas le couple Fe(CN)63-Fe(CN)6

4- en fonction de la

surface eacutelectroactive et de la vitesse de balayage Ce reacutesultat est deux fois supeacuterieur agrave la surface

geacuteomeacutetrique de lrsquoeacutelectrode de graphite qui est de 038 cm2 Apregraves deacutepocirct drsquoune couche mince de

nitrure de carbone amorphe la topographie de surface du graphite a totalement changeacute Les

feuillets de graphite ont eacuteteacute totalement recouverts par un film drsquoa-CNx ayant une morphologie

granulaire Le diamegravetre drsquoun granule est drsquoenviron 100 nm (Figure III3B) Lrsquoeacutetude du couple

Fe(CN)63-Fe(CN)6

4- apregraves deacutepocirct montre que la couche drsquoa-CNx nrsquoabaisse que tregraves leacutegegraverement

lrsquoaire de la surface eacutelectroactive de lrsquoeacutelectrode On calcule en effet une surface de 07 cm2


76

Figure III3 Images MEB de disques A) de graphite B) de graphitea-CNx C) de

graphitea-CNx AT et D) de siliciuma-CNx

Le traitement anodique de surface de la couche drsquoa-CNx reacutealiseacute par chronopotentiomeacutetrie

(Figure III5) nrsquoaltegravere pas la structure de ce dernier et ne modifie pas lrsquoaire de sa surface

eacutelectroactive (Figure III3C) de faccedilon significative On observe drsquoapregraves la Figure III5A que

lrsquoessentiel du traitement anodique srsquoeffectue agrave un potentiel de 155 VECS qui drsquoapregraves la courbe

de voltampeacuteromeacutetrie cyclique montreacutee sur la Figure III5B se situe dans une gamme de potentiel

ougrave lrsquoon procegravede agrave la fois agrave lrsquooxydation de lrsquoeau et vraisemblablement agrave celle de la surface de la

couche drsquoa-CNx

Lrsquoeacutepaisseur du film a eacuteteacute mesureacutee par MEB apregraves creacuteation drsquoune rainure dans la couche

drsquoa-CNx en utilisant du silicium (surface lisse) comme support pour deacuteposer la couche drsquoa-

CNx Drsquoapregraves la Figure III3D on mesure une eacutepaisseur de 90 nm De preacuteceacutedentes eacutetudes

reacutealiseacutees au sein du LISE ont montreacute que pour une pression P(N2)Ptot = 003 lrsquoeacutepaisseur du

film est de 120 nm [80]


77

Figure III4 A gauche voltampeacuterogrammes pour diffeacuterentes vitesses de balayage sur

une eacutelectrode de graphite nue dans une solution aqueuse de ferricyanureferrocyanure (5 mM)

en utilisant comme sel de fond KCl (01 M) et agrave droite graphe Ip = f(v12) correspondant

Figure III5 A) chronopotentiogramme lors du traitement anodique drsquoune eacutelectrode

graphitea-CNx effectueacute dans une solution aqueuse de KOH (01 M) agrave lrsquoaide drsquoune densiteacute de

courant appliqueacutee de 3 mAcm2 et B) voltampeacuterogrammes drsquoune eacutelectrode de graphitea-CNx

obtenues dans une solution aqueuse de KOH (01 M) dix cycles conseacutecutifs

Lrsquoeacutelectrode graphitea-CNx a eacuteteacute caracteacuteriseacutee eacutegalement par XPS (Tableau III1 Figure

III6) Les spectres obtenus avant et apregraves deacutepocirct de la couche drsquoa-CNx montrent clairement des

environnements chimiques diffeacuterents pour le carbone On observe un eacutelargissement du pic C1s

apregraves deacutepocirct de la couche mince drsquoa-CNx Le pic agrave 2846 eV est caracteacuteristique des atomes de

carbone hybrideacutes sp2 Lrsquoaire du pic agrave 2853 eV caracteacuteristique des atomes de carbone sp3 a eacuteteacute

doubleacutee apregraves deacutepocirct drsquoa-CNx par traitement plasma Sachant que lrsquoanalyse XPS est une

meacutethode de caracteacuterisation permettant lrsquoanalyse chimique des mateacuteriaux jusqursquoagrave une

profondeur de 10 nm et connaissant lrsquoeacutepaisseur de notre couche drsquoa-CNx nous pouvons dire

que les reacutesultats obtenus apregraves deacutepocirct sont caracteacuteristiques de cette derniegravere

-02 00 02 04 06-08

-06

-04

-02

00

02

04

06

08

i (m

A)

E (VECS)

20 mVs

30 mVs

40 mVs

50 mVs

60 mVs

100 mVs

002 003 004 005 006

-60x10-4

-40x10-4

-20x10-4

00

20x10-4

40x10-4

60x10-4

anodique

cathodique

i (A

)

V12

0 10 20 30 40 50 60

02

04

06

08

10

12

14

16

18

E (

VE

CS

)

Temps (s)

00 05 10 15 20

0

2

4

6

8

10

i (m

A)

E (VECS)

A B


78

Tableau III1 Spectres XPS C1s et leur deacutecomposition pour les eacutelectrodes graphite a-CNx et

graphitea-CNx AT

2846 eV 2857 eV 2866 eV 2877 eV 2888 eV

OC NC C=C(CH) sp2 C-(CH) sp3 C-(ON) C=(ON) O-C=O

Graphite 756 156 60 28 002 -

graphitea-CNx 498 297 133 52 21 007 017

graphitea-CNx AT 431 279 148 90 52 017 012

Figure III6 Spectre XPS et deacutecomposition du pic C1s drsquoune eacutelectrode de A) graphite B)

graphitea-CNx et C) graphitea-CNx AT

Le film de nitrure de carbone amorphe renferme 137 drsquoazote atomique ce qui

correspond agrave un ratio NC eacutegal agrave 017 De plus S Jribi et al [80] ont montreacute par deacutetection

eacutelectrochimique drsquoune sonde redox ferrocegravene greffeacutee speacutecifiquement sur les amines que

seulement 65 de lrsquoazote atomique preacutesent en surface sur a-CN012 est impliqueacute dans des

groupements amines La densiteacute de groupements amines a ainsi eacuteteacute eacutevalueacutee agrave 141013

groupementscm2 dans le cas drsquoune couche a-CN012 Ce nombre de groupements est supeacuterieur

agrave celui neacutecessaire pour recouvrir lrsquoensemble de la surface par une monocouche de laccase En

300 295 290 285 280 275

0

20

40

60

80

100

Inte

nsi

teacute (

10

3)

Energie de liaison (eV)

spectre C1s

C sp2

C sp3

C-N C-O

C=N C=O

ligne de base

enveloppe

300 295 290 285 280 275

0

5

10

15

20

25

30

Inte

nsi

teacute (

10

3)


spectre C1s

C sp2

C sp3

C-N C-O

C=N C=O

COOH

ligne de base

enveloppe

300 295 290 285 280 275

0

5

10

15

20

25

30

Inte

nsi

teacute (

10

3)


spectre C1s

C sp2

C sp3

C-N C-O

C=N C=O

COOH

ligne de base

enveloppe

A B

C


79

effet connaissant les dimensions de la laccase (5times7times5 nm) [28] on peut estimer la surface

maximale occupeacutee par une enzyme agrave 35 nm2 La quantiteacute drsquoenzyme pouvant ecirctre immobiliseacutee

agrave la surface de lrsquoeacutelectrode graphitea-CN017 en prenant en compte son aire geacuteomeacutetrique est donc

de 111012 enzymescm2

Dans le cadre des travaux drsquoArdhaoui et al sur des eacutelectrodes de graphite fonctionnaliseacutees

par traitement plasma agrave la pression atmospheacuterique il a eacuteteacute deacutemontreacute que la laccase immobiliseacutee

sur des surfaces fonctionnaliseacutees par des groupements carboxyliques permet drsquoavoir des

courants catalytiques de reacuteduction plus importants que lorsqursquoelle est greffeacutee sur des surfaces

fonctionnaliseacutees par des groupements amines [3] Dans lrsquoobjectif de veacuterifier cette conclusion

un traitement anodique a donc eacuteteacute reacutealiseacute sur lrsquoeacutelectrode graphitea-CN017 afin drsquointroduire des

groupements acide carboxylique On observe que suite au traitement anodique du a-CN017 le

ratio OC a augmenteacute (Tableau III1) Il est passeacute de 0074 agrave 017 La preacutesence de groupements

carboxyliques agrave la surface de lrsquoeacutelectrode a eacuteteacute deacutemontreacutee par la preacutesence drsquoun pic agrave 2888 eV

Le traitement anodique a permis drsquoaugmenter la proportion de groupements carboxyliques de

21 agrave 52 des atomes de carbone de la couche sondeacutee par lrsquoXPS ce qui implique

vraisemblablement une forte sous-estimation de la densiteacute surfacique de groupements

carboxyliques creacuteeacutee par le traitement anodique (Figure III6C) La densiteacute de ces groupements

a eacuteteacute eacutevalueacutee par XPS sur la base de la modeacutelisation du ratio ICOOHIC1s (meacutethode deacutecrite dans

le chapitre Mateacuteriels et Meacutethodes) agrave 141014 moleacuteculescm2 agrave la surface de lrsquoeacutelectrode

graphitea-CN017 AT ce qui drsquoune part constitue un nombre de groupements fonctionnels

supeacuterieur agrave celui requis pour immobiliser de faccedilon covalente une monocouche drsquoenzyme et est

dix fois supeacuterieur agrave la densiteacute de groupements amine en surface de graphitea-CN017

III22Mesures de densiteacutes de courant biocatalytiques de lrsquoORR pour diffeacuterentes

meacutethodes drsquoimmobilisation de la Laccase

Une fois la surface de nos biocathodes graphitea-CN017 et graphitea-CN017 AT

caracteacuteriseacutee leurs performances envers lrsquoeacutelectrocatalyse de la reacuteduction de lrsquooxygegravene ont eacuteteacute

eacutevalueacutees par voltampeacuteromeacutetrie cyclique apregraves greffage de la laccase La mesure des courants

de reacuteduction de lrsquooxygegravene a eacuteteacute reacutealiseacutee dans un tampon aceacutetate posseacutedant un pH eacutegal agrave 42 en

utilisant comme sel de fond 01 M de NaClO4 et agrave un potentiel eacutegal agrave 02 VECS (Figure III7)

auquel aucun courant faradique ne peut ecirctre deacutetecteacute en lrsquoabsence drsquooxygegravene dans la solution


80

Figure III7 Voltampeacuterogrammes drsquoune eacutelectrode graphitea-CN017laccase obtenus dans

une solution satureacutee en oxygegravene (courbe rouge) et en lrsquoabsence drsquooxygegravene sous N2 (courbe

noire)

Figure III8 Densiteacutes de courants pour les diffeacuterentes strateacutegies drsquoimmobilisation de la

laccase

Diffeacuterentes meacutethodes drsquoimmobilisation de la laccase ont eacuteteacute eacutevalueacutees sur les deux types

drsquoeacutelectrodes (graphitea-CN017 et graphitea-CN017 AT) au cours de ce travail (Figure III8

Tableau III2) Signalons que les mesures de densiteacutes de courant ont eacuteteacute reacutepeacuteteacutees pour chaque

meacutethode drsquoimmobilisation sur trois eacutelectrodes diffeacuterentes dans le cadre drsquoun controcircle de la

reproductibiliteacute On constate que pour les deux types drsquoeacutelectrodes lrsquoimmobilisation de la

laccase par adsorption fournit les densiteacutes de courants les plus faibles On mesure des densiteacutes

de courants de -35 12 microAcm2 et de -131 plusmn 28 microAcm2 pour des eacutelectrodes graphitea-CN017

et graphitea-CN017 AT respectivement Lrsquoimmobilisation par greffage covalent (formation

drsquoune liaison amide) avec activation a permis drsquoaugmenter consideacuterablement les densiteacutes de

courants En effet dans le cas drsquoune eacutelectrode graphitea-CN017 on a multiplieacute par deux les

densiteacutes de courant (-7 14 microAcm2 au lieu de -35 12 microAcm2) Dans le cas drsquoune eacutelectrode

-04 -02 00 02 04 06 08 10

-100

-80

-60

-40

-20

0

20

40

60

J (micro

Ac

m2)

E (VECS)

adsorption liaison amide liaison imine liaison imine+amide0

10

20

30

40

50

60

-J (

microA

cm

2)

graphitea-CNx

graphitea-CNx AT


81

graphitea-CN017 AT les courants ont eacuteteacute multiplieacutes par trois (-396 66 microAcm2 au lieu de -

131 plusmn 28 microAcm2) On remarque aussi que lrsquoimmobilisation covalente de la laccase par la

formation drsquoune liaison amide sur une eacutelectrode graphitea-CN017 AT permet drsquoavoir de

meilleurs reacutesultats que sur une eacutelectrode graphitea-CN017 On retrouve les mecircmes reacutesultats que

ceux de la litteacuterature [3] A ce stade deux hypothegraveses pourraient expliquer ce reacutesultat soit la

quantiteacute drsquoenzyme immobiliseacutee est plus eacuteleveacutee (gracircce agrave la plus forte densiteacute des groupements

carboxyliques) soit lrsquoorientation de lrsquoenzyme est plus favorable au transfert des eacutelectrons dans

le cas drsquoune surface fonctionnaliseacutee avec des groupements COOH Pour rappel afin drsquooptimiser

le transfert drsquoeacutelectrons entre la surface de lrsquoeacutelectrode et la laccase une hypothegravese largement

reprise dans la litteacuterature est qursquoil est preacutefeacuterable que le cuivre T1 soit le plus proche possible de

la surface de lrsquoeacutelectrode Dans le cas des eacutelectrodes posseacutedant des groupements carboxyliques

agrave la surface la laccase va srsquoimmobiliser majoritairement via ses groupements amines dont deux

sont sur la mecircme face que le site T1 et trois sur la face opposeacutee Par opposition dans le cas

drsquoune surface avec des groupements amines (cas de graphitea-CN017) la laccase va

srsquoimmobiliser via lrsquoun (ou plusieurs) de ses groupements carboxyliques reacutepartis aleacuteatoirement

sur lrsquoenzyme On aura alors une orientation aleacuteatoire moins beacuteneacutefique pour la communication

eacutelectronique entre lrsquoenzyme et lrsquoeacutelectrode

Une meacutethode alternative agrave la formation drsquoune liaison amide entre lrsquoeacutelectrode et lrsquoenzyme

consiste agrave immobiliser la laccase par la formation drsquoune liaison imine entre les groupements

amines de lrsquoeacutelectrode et les sites de glycosylation de la laccase Pour cela lrsquoenzyme a eacuteteacute

preacutealablement oxydeacutee afin de creacuteer des sites aldeacutehyde sur ses sites de glycosilation Deux des

quatre sites de glycosylation de la laccase (cf Figure I15) eacutetant du mecircme cocircteacute que le cuivre T1

ce type de greffage peut permettre drsquoavoir une orientation favorable de lrsquoenzyme Dans ce type

de greffage aucun agent de couplage nrsquoest neacutecessaire Toutefois on a reacutealiseacute lrsquoimmobilisation

de la laccase oxydeacutee agrave la fois en absence et en preacutesence du meacutelange EDC-NHS agent de

couplage neacutecessaire agrave la formation de la liaison amide afin de pouvoir comparer

lrsquoimmobilisation de la laccase oxydeacutee ou non toutes choses eacutegales par ailleurs On observe

qursquoen preacutesence comme en absence drsquoEDC-NHS les densiteacutes de courant mesureacutees pour des

eacutelectrodes graphitea-CN017 ou graphitea-CN017 AT sont quasiment identiques Une

explication pourrait ecirctre que la vitesse de reacuteaction de la formation de la base de Schiff est plus

rapide que celle de la formation de la liaison amide La densiteacute de courant la plus importante a


82

eacuteteacute obtenue dans le cas drsquoune eacutelectrode graphitea-CN017 AT sur laquelle la forme oxydeacutee de la

laccase a eacuteteacute immobiliseacutee en preacutesence de lrsquoagent de couplage On a mesureacute une densiteacute de

courant eacutegale agrave -446 99 microAcm2 Mais si on tient compte de lrsquoerreur expeacuterimentale le courant

obtenu nrsquoest pas significativement plus eacuteleveacute que celui obtenu avec la laccase oxydeacutee sans le

meacutelange EDC-NHS) Ce reacutesultat pourrait srsquoexpliquer par le fait que dans ce cas lrsquoenzyme est

immobiliseacutee agrave la surface de lrsquoeacutelectrode soit via ses groupements amines soit via ses sites de

glycosilation suivant une orientation favorable dans les deux cas au transfert drsquoeacutelectrons

(formation de liaisons imine ou amide gracircce respectivement aux fonctions aldeacutehydes et amines

de la laccase)

Tableau III2 Activiteacute enzymatique et taux de couverture de la laccase sur les eacutelectrodes

graphitea-CN017 and graphitea-CN017 AT

graphitea-CN017 graphite a-CN017 AT

Adsorption Liaison

amide

Liaison

imine

Liaison

amide+imine

Adsorption Liaison

amide

Liaison

imine

Liaison

amide+imine

Taux de couverture en enzymes eacutelectrocatalytiquement actives calculeacutes agrave partir des densiteacutes de courant mesureacutees pour lrsquoORR

-J (microAcm2) 35 12 7 14

255

08 298 17 131 plusmn 28

396

66 379 446 99

Taux de

couverture

05 11 40 47 21 63 60 71

Taux de couverture en enzymes actives vis-agrave-vis de lrsquoABTS calculeacutes agrave partir de lrsquoactiviteacute

Activiteacute mU 218 plusmn04 38 plusmn2 32 plusmn2 344 plusmn02 82 plusmn04 25 plusmn2 8 plusmn4 24 plusmn1

Taux de

couverture

64 112 105 101 24 74 24 69

Taux de couverture en enzymes calculeacutes agrave partir des reacutesultats XPS

Modegravele A heacutemispheacuterique

denzyme= 5 nm 9 20 76 32 73

denzyme= 7 nm 8 17 64 28 61

Modegravele B rectangulaire

denzyme= 5 nm 6 13 45 20 43

denzyme= 7 nm 6 13 44 20 42

Il peut ecirctre deacutemontreacute par le calcul suivant que la densiteacute de courant attendue pour lrsquoORR

sur une monocouche continue drsquoenzymes est de -6310 microAcm2 En effet lrsquoimmobilisation


83

drsquoune monocouche de laccase sur une eacutelectrode plane conduit agrave des densiteacutes de courant dont la

limite supeacuterieure theacuteorique srsquoexprime selon lrsquoeacutequation suivante (Equation III1)

Jmax = kcat times n times F times Γmax (Eq III1)

kcat repreacutesente la constante catalytique de la reacuteaction enzymatique (350 s-1 pour lrsquoO2 en tant que

substrat [20]) n le nombre drsquoeacutelectrons mis en jeu lors de la reacuteaction de reacuteduction de lrsquooxygegravene

(4 eacutelectrons) F la constante de Faraday (965times104 Cmol) et Γmax la concentration superficielle

maximale de laccase pouvant ecirctre immobiliseacutee agrave la surface de lrsquoeacutelectrode Elle est exprimeacutee

selon lrsquoEquation III2

Γmax = nmax enzyme

Seacutelectrode (Eq III2)

nmax enzyme le nombre maximal drsquoenzymes dans une monocouche de laccase agrave la surface

lrsquoeacutelectrode (18times10-12 moles) et Seacutelectrode la surface geacuteomeacutetrique de lrsquoeacutelectrode (038 cm2)

Lrsquoexpression de nmax enzyme est deacutecrite selon lrsquoEquation III3

nmax enzyme = Seacutelectrode

NA times Slaccase

(Eq III3)

NA la constante drsquoAvogadro Slaccase la surface occupeacutee par une enzyme (35 10-13 cm2)

La densiteacute de courant maximale a donc pour expression (Equation III4)

Jmax = kcat times n times F times 1

NA times Slaccase

= 6310 microAcm2 (Eq III4)

Par comparaison avec cette valeur il apparaicirct que nos densiteacutes de courant sont toutes

nettement plus faibles que Jmax Ceci pourrait ecirctre expliqueacute soit par le fait qursquoune partie des

enzymes nrsquoest pas active soit que la surface de lrsquoeacutelectrode nrsquoest pas totalement recouverte Les

taux de couverture en enzymes preacutesentant une activiteacute bio-eacutelectrocatalytique vis-agrave-vis de la

reacuteduction de lrsquooxygegravene sont rapporteacutees dans le Tableau III2

III23Activiteacute de la laccase immobiliseacutee vis-agrave-vis de lrsquoABTS et deacutetermination du

taux de couverture en enzymes actives

Une autre meacutethode permettant drsquoeacutevaluer les performances catalytiques des biocathodes

consiste agrave deacuteterminer lrsquoactiviteacute enzymatique de la laccase une fois immobiliseacutee (Tableau III2)

Le substrat de reacutefeacuterence utiliseacute pour deacuteterminer lrsquoactiviteacute enzymatique de la laccase est lrsquoacide

22rsquo-azino-bis (3-eacutethylbenzothiazoline-6-sulfonique) (ABTS) Les mesures drsquoactiviteacute ont eacuteteacute

reacutepeacuteteacutees pour chaque meacutethode drsquoimmobilisation sur trois eacutelectrodes diffeacuterentes distinctes de

celles utiliseacutees pour la mesure du courant afin drsquoeacutevaluer leur reproductibiliteacute On observe que


84

lrsquoimmobilisation de la laccase par adsorption conduit agrave mesurer des activiteacutes plus faibles (agrave une

exception pregraves) que le greffage covalent En comparant lrsquoactiviteacute pour un type drsquoimmobilisation

donneacutee sur les eacutelectrodes graphitea-CN017 et graphitea-CN017 AT on remarque que lrsquoactiviteacute

est toujours plus faible pour une eacutelectrode graphitea-CN017 AT Ceci est agrave lrsquoinverse des

reacutesultats de densiteacute de courant de reacuteduction de lrsquooxygegravene (Tableau III2) Cette observation est

compatible avec lrsquohypothegravese formuleacutee au paragraphe preacuteceacutedent drsquoune orientation preacutefeacuterentielle

de lrsquoenzyme En effet si le site T1 est proche de la surface de lrsquoeacutelectrode la reacuteduction de

lrsquooxygegravene est favoriseacutee alors que lrsquoaccegraves de lrsquoABTS agrave T1 est difficile Les variations de courants

et drsquoactiviteacutes sont donc inverses suivant le type drsquoimmobilisation Une deuxiegraveme explication

pourrait ecirctre que dans le cas drsquoune surface fonctionnaliseacutee avec des groupements carboxyliques

deacuteprotoneacutes les interactions eacutelectrostatiques entre lrsquoABTS chargeacute neacutegativement et la surface de

lrsquoeacutelectrode sont deacutefavorables

Le taux de couverture de la laccase peut ecirctre calculeacute agrave partir des mesures drsquoactiviteacute en

utilisant lrsquoEquation III5 suivante

Γ= NAtimesSlaccasetimesActiviteacutetimes10

-6

MlaccasetimesSeacutelectrodetimesAspeacutecifique (Eq III5)

Aspeacutecifique lrsquoactiviteacute speacutecifique de la laccase (300 Umg) Mlaccase sa masse molaire (63 kDa)

Slaccase la surface occupeacutee par une enzyme (35 10-13 cm2) NA le nombre drsquoAvogadro

(6021023) et Seacutelectrode la surface geacuteomeacutetrique de lrsquoeacutelectrode (038 cm2)

On peut noter drsquoapregraves le Tableau III2 que les valeurs de taux de recouvrement en enzymes

actives vis-agrave-vis de lrsquoABTS sont tregraves nettement supeacuterieures agrave celles relatives agrave lrsquoactiviteacute

eacutelectrocatalytique vis-agrave-vis de lrsquoORR deacutetermineacutees agrave lrsquoaide des densiteacutes de courant De plus

certaines valeurs de taux de couverture calculeacutes agrave partir de lrsquoactiviteacute enzymatique deacutepassent les

100 ce qui pourrait suggeacuterer que la laccase deacuteveloppe une hyper-activiteacute vis-agrave-vis de lrsquoABTS

en conseacutequence de son immobilisation agrave la surface drsquoun support solide conformeacutement agrave ce qui

a deacutejagrave eacuteteacute mentionneacute dans la litteacuterature [91]

III24Deacutetermination du taux de couverture total en enzymes par XPS

Nous avons eacutegalement chercheacute agrave calculer le taux de recouvrement de la laccase agrave partir des

reacutesultats XPS A lrsquoinverse des deux meacutethodes preacuteceacutedentes celle-ci preacutesente lrsquoavantage de

prendre en compte toutes les enzymes immobiliseacutees qursquoelles soient actives ou non Le spectre


85

XPS (Figure III9) obtenu apregraves immobilisation de la laccase montre clairement la preacutesence

drsquoenzyme agrave la surface de lrsquoeacutelectrode par lrsquoaugmentation des pics repreacutesentatifs des groupements

preacutesents sur la proteacuteine Par comparaison avec les spectres obtenus avant immobilisation de la

laccase (Figure III9A et B) on note eacutegalement une augmentation significative de lrsquointensiteacute du

pic agrave 288 eV repreacutesentatif des groupements carboxyliques ainsi que des groupements amides

Figure III9 Spectre XPS et deacutecomposition du pic C1s drsquoune eacutelectrode A) graphitea-CN017

en preacutesence de laccase et B) en absence de laccase

Pour le calcul du taux de recouvrement de la laccase agrave partir des donneacutees XPS on pourrait

se baser sur les intensiteacutes de trois eacuteleacutements lrsquooxygegravene le carbone ou le cuivre tous trois

preacutesents dans lrsquoenzyme Cependant le carbone et lrsquooxygegravene sont preacutesents eacutegalement dans le

support ce qui complique les calculs On a donc deacutecideacute de baser nos calculs sur lanalyse

quantitative du cuivre eacuteleacutement preacutesent uniquement dans la laccase Lanalyse quantitative du

taux de couverture de la laccase agrave partir des donneacutees XPS repose sur la comparaison du rapport

dintensiteacute du signal ICuIC1s expeacuterimental avec celui calculeacute pour diffeacuterents taux de

recouvrement agrave laide de deux modegraveles de reacutepartition de lrsquoenzyme en surface (Scheacutema III1)

Scheacutema III1 Repreacutesentation scheacutematique drsquoune surface de a-CNx recouverte par une

couche discontinue de laccase en supposant que lrsquoenzyme a une forme heacutemispheacuterique

(modegravele A chaque heacutemisphegravere repreacutesente une enzyme) ou rectangulaire (modegravele B couche

discontinue drsquoeacutepaisseur d un rectangle peut repreacutesenter plusieurs enzymes regroupeacutees)

300 295 290 285 280 275

0

2

4

6

8

10

12

14

Inte

nsi

teacute (

10

3)


C1s spectre

C sp2

C sp3

C-N C-O

COOH O=C-N

ligne de base

enveloppe

300 295 290 285 280 275

0

5

10

15

20

25

30

Inte

nsi

teacute (

10

3)


spectre C1s

C sp2

C sp3

C-N C-O

C=N C=O

COOH

ligne de base

enveloppe

A B


86

Le premier modegravele A suppose que la geacuteomeacutetrie de lenzyme deacuteposeacutee est une demi-sphegravere

et conduit agrave lexpression suivante pour le rapport ICuIC1s (Equation III6) [92]

ICu

IC1s=

γnCuenzyme

σCuT(ECu)λCuenzyme

[1-Λ]

γnC1sCNxσC1sT(EC1s)λC1s

CNxΛ+(1-γ)nC1s

CNxσC1sT(EC1s)λC1sCNx

+γnC1s

enzymeσC1sT(EC1s)λC1s

enzyme[1-Λ]

(Eq III6)

Avec Λ facteur drsquoatteacutenuation du signal ducirc agrave la preacutesence drsquoune couche deacuteposeacutee

Λ= (8λ

2

denzyme2) [1- (

denzyme

2λ+1) exp (-

denzyme

2λ)] (Eq III7)

Le deuxiegraveme modegravele B repose sur lhypothegravese que lrsquoenzyme recouvre la surface sous la

forme drsquoune couche discontinue drsquoeacutepaisseur laquo d raquo uniforme (Equation III8)

ICu

IC1s=

γnCuenzyme


[1-exp(-denzyme

λCuenzyme

cosΘ)]


CNxexp(-

denzyme

λC1sCNx

cosΘ)+(1-γ)nC1s


+γnC1senzyme

σC1sT(EC1s)λC1senzyme

[1-exp(-denzyme

λC1senzyme

cosΘ)]

(Eq III8)

γ la fraction de la surface recouverte par lrsquoenzyme nCu

enzyme nC1s

enzymerepreacutesentent les

concentrations de cuivre et de carbone dans lrsquoenzyme et nC1sCNx la concentration de carbone dans

la couche mince drsquoa-CNx Pour celle-ci la concentration a eacuteteacute calculeacutee agrave partir du ratio des

densiteacutes ρa-CNx=ρgraphite=21 Pour lrsquoenzyme la concentration drsquoun eacuteleacutement a eacuteteacute calculeacutee agrave partir

de lrsquoeacutequation suivante

nenzyme

=ρenzymetimesN

enzyme

MWenzyme (Eq III9)

ρenzyme=14 gcm3 et MWlaccase = 63 kDa Le nombre drsquoatomes de carbone dans la laccase

(structure primaire) est de 2399 La formule de la chaine peptidique de la laccase est

C2399H3600N638O729S9 La laccase renferme aussi dans sa structure quatre chaines glycosydiques

[4] formeacutees chacune de 11 mannoses et de 2 N-acetyl glucosamines On doit donc rajouter 328

atomes de carbone Au total on a donc NCenzyme

= 2727 Par ailleurs NCuenzyme

= 4

σCu et σC1s repreacutesentent les sections efficaces de lrsquoazote et du carbone respectivement

T(ECu) et T(EC1s) repreacutesentent les facteurs de sensibiliteacute de lrsquoinstrument pour le cuivre (635) et

le carbone (10) respectivement

λCu

enzyme (15 nm) λC1s

CNx (33 nm) et λC1s

enzyme (33 nm) repreacutesentent les libres parcours moyens des

eacutelectrons du cuivre agrave travers la couche drsquoenzyme et des eacutelectrons du carbone dans la couche

drsquoa-CNx et de lrsquoenzyme respectivement

La laccase a pour dimensions 5times5times7 nm Pour la suite des calculs on a supposeacute que la

couche discontinue drsquoenzymes recouvrant la surface de lrsquoeacutelectrode pouvait avoir une eacutepaisseur


87

de 5 nm ou de 7 nm Lrsquointensiteacute du signal du carbone est deacutecrite comme eacutetant la somme de la

contribution de trois termes le signal de la couche drsquoa-CNx recouverte par la laccase le signal

de la partie drsquoa-CNx non recouvert par la couche drsquoenzyme et le signal du carbone preacutesent dans

la structure de la laccase Deux modegraveles ont eacuteteacute utiliseacutes pour le calcul des taux de recouvrement

On observe drsquoune maniegravere geacuteneacuterale pour les deux modegraveles consideacutereacutes que les taux de

recouvrement les plus bas ont eacuteteacute obtenus lorsque la laccase est simplement adsorbeacutee On

observe aussi que les valeurs des taux de recouvrement calculeacutees agrave partir du modegravele A sont

environ 50-60 supeacuterieures agrave celles du modegravele B Par exemple dans le cas drsquoune eacutelectrode

graphitea-CN017 sur laquelle de la laccase oxydeacutee a eacuteteacute immobiliseacutee en preacutesence drsquoun agent de

couplage le taux de couverture est de 45 pour le modegravele B et de 76 pour le modegravele A On

constate aussi que pour un modegravele donneacute la taille de lrsquoenzyme (5 ou 7 nm) nrsquoa pas une grande

influence sur les reacutesultats de taux de recouvrement En comparant les modes drsquoimmobilisation

de la laccase on constate que les taux de recouvrement sont plus eacuteleveacutes dans le cas drsquoun

greffage covalent et lorsque la laccase est immobiliseacutee par la formation drsquoune liaison amide et

imine que lorsqursquoelle est simplement greffeacutee via la formation drsquoune liaison imine uniquement

Ce reacutesultat est en accord avec les reacutesultats de courants obtenus Par ailleurs le taux de

couverture deacutetermineacute agrave partir des donneacutees XPS est toujours plus faible que celui calculeacute agrave partir

de lrsquoactiviteacute mais permet une estimation plus preacutecise de la quantiteacute drsquoenzyme preacutesente agrave la

surface de lrsquoeacutelectrode Ce dernier ne prend pas en compte lrsquoorientation que peut avoir la laccase

agrave la surface de lrsquoeacutelectrode et donc ne permet pas drsquoavoir une sursous-eacutevaluation de la quantiteacute

drsquoenzyme immobiliseacutee Il permet drsquoavoir une analyse quantitative et non qualitative

En comparant les valeurs de taux de couverture soit de lrsquoactiviteacute enzymatique soit des

donneacutees XPS on remarque que dans le cas drsquoune eacutelectrode graphitea-CN017 AT les reacutesultats

sont assez semblables lorsqursquoon suppose que la laccase a une forme heacutemispheacuterique et une taille

de 7 nm Le taux de couverture calculeacute agrave partir de lrsquoactiviteacute est de 24 (liaison imine) et de 69

(liaison imine et amide) Les valeurs preacutedites agrave partir des donneacutees XPS sont de 28 (liaison

imine) et 61 (liaisons imine et amide) Cependant dans le cas drsquoune eacutelectrode graphitea-

CN017 on observe un eacutecart entre les deux meacutethodes de calcul Le taux de couverture calculeacute agrave

partir de lrsquoactiviteacute enzymatique est environ de 100 quelle que soit la meacutethode de greffage

alors que pour les mesures XPS les valeurs deacutependent du type drsquoimmobilisation et du modegravele

On a calculeacute par exemple pour une taille de 7 nm un taux de couverture de 17 (modegravele A) et


88

13 (modegravele B) lorsqursquoon a une liaison imine uniquement et 64 (modegravele A) et 44 (modegravele

B) lorsqursquoon a deux types de liaisons agrave la surface (imine et amide) On peut dire agrave ce stade que

le modegravele heacutemispheacuterique est le plus repreacutesentatif sur la base de la comparaison de lrsquoactiviteacute et

des donneacutees XPS

III25Deacutetermination du taux de couverture total en enzymes et de leur orientation

sur le substrat par AM-AFM et PI-AFM

Afin drsquoavoir de plus amples informations sur lrsquoorientation de lrsquoenzyme agrave la surface du

support des eacutetudes par microscopie agrave force atomique (AFM) en modulation drsquoamplitude (AM-

AFM) et en imagerie de phase (PI-AFM) ont eacuteteacute reacutealiseacutees (Figure III10 Figure III11)

Figure III10 Images obtenues par AFM (20times20 microm2) (gauche topographie (AM-AFM)

droite phase (PI-AFM)) drsquoune eacutelectrode Sia-CN017 avec la laccase naturelle immobiliseacutee en

preacutesence drsquoEDC-NHS Sur les profils 1) 2) et 3) ___ pour la topographie et hellip pour la

phase


89

Figure III11 Image de topographie obtenue par AM-AFM (20times20 microm2) drsquoune eacutelectrode

Sia-CN017 sur laquelle de la laccase oxydeacutee a eacuteteacute immobiliseacutee apregraves un test de nano-grattage

effectueacute en mode contact b) profil de topographie traceacute selon la ligne noire apparaissant sur

lrsquoimage

On a deacuteposeacute une couche mince de nitrure de carbone amorphe sur une plaque de silicium

seacutelectionneacutee pour son caractegravere extrecircmement lisse Ensuite la laccase a eacuteteacute immobiliseacutee de

maniegravere covalente par la formation soit drsquoune liaison amide dans le cas de la laccase naturelle

(Figure III10) soit par la formation drsquoune liaison imine dans le cas de la laccase oxydeacutee (Figure

III11) Lrsquoobservation des images AFM obtenues en mode tapping (AFM en modulation

drsquoamplitude ou AM-AFM) montre que la laccase naturelle immobiliseacutee en preacutesence drsquoun agent

de couplage sur une eacutelectrode Sia-CNx ne forme pas une couche continue (Figure III10 agrave

gauche) On remarque eacutegalement que cette derniegravere semble preacutesenter diffeacuterentes conformations

agrave la surface du support En effet drsquoapregraves lrsquoimage de phase (Figure III10 agrave droite) on observe

une diffeacuterence de contraste au niveau de la surface (variation de couleur) qui est confirmeacutee par

les profils de topographie obtenus Sur lrsquoimage de phase on observe trois types de zones Celles

qui sont noires (11 ) correspondent agrave des zones dures attribueacutees agrave la couche drsquoa-CNx nu

Celles qui sont blanches (33 ) ou marron-beige (56 ) et donc plus molles peuvent quant agrave

elles ecirctre attribueacutees agrave la couche drsquoenzyme La recherche de correacutelation entre les profils de

topographie et de phase (voir les superpositions des profils 1 2 et surtout 3 dans la Figure

III10) permet de constater que les zones blanches sur lrsquoimage de phase correspondent toujours

agrave des zones plus creuses sur lrsquoimage de topographie Par ailleurs lrsquoexamen notamment du profil

1 permet drsquoestimer lrsquoeacutepaisseur de la couche drsquoenzyme apparaissant en marron clair sur lrsquoimage

de topographie et en marron sur lrsquoimage de phase agrave 5 nm environ En conseacutequence les zones

5 nm


90

blanches apparaissant sur lrsquoimage de phase pourraient correspondre agrave de lrsquoenzyme deacutenatureacutee et

donc plus molle que lrsquoenzyme non-deacutenatureacutee qui elle serait donc orienteacutee agrave plat sur la couche

drsquoa-CNx compte-tenu de son eacutepaisseur Drsquoapregraves les donneacutees AFM pour une eacutelectrode Sia-

CN017 sur laquelle de la laccase a eacuteteacute immobiliseacutee on peut dire que la surface du silicium est

recouverte agrave 89 de laccase En comparant ce reacutesultat au taux de recouvrement obtenu par

XPS (70 ) dans le cas du modegravele heacutemispheacuterique on peut dire que les reacutesultats se rejoignent

La diffeacuterence peut ecirctre expliqueacutee par la nature du support utiliseacute (silicium pour lrsquoAFM et

graphite pour lrsquoXPS)

Dans le cas du greffage de la forme oxydeacutee de la laccase on a observeacute toujours agrave lrsquoaide du

mode tapping de lrsquoAFM la formation drsquoune couche drsquoenzyme couvrant complegravetement la surface

du graphite On a ensuite proceacutedeacute agrave un test de nanograttage afin de deacuteterminer lrsquoeacutepaisseur de la

couche drsquoenzyme Pour cela on a balayeacute en mode contact une zone de 500x500 nm2 agrave une

vitesse de 1991 nms et en appliquant une force normale drsquoappui de 05 microN Ces conditions de

nanograttage sont seacutelectives vis-agrave-vis de la couche drsquoenzymes car il a eacuteteacute veacuterifieacute dans une

expeacuterience preacuteliminaire qursquoelles ne permettent pas drsquoendommager la couche drsquoa-CNx nu Sur

lrsquoimage AFM de lecture obtenue en mode tapping du test de nanograttage de la surface qui est

repreacutesenteacutee sur la Figure III11 on constate que cette couche possegravede une eacutepaisseur de 50 Aring ce

qui connaissant la geacuteomeacutetrie de la laccase confirme la preacutesence drsquoune monocouche drsquoenzyme

complegravete

Plusieurs eacutetudes par AFM de la laccase immobiliseacutee sur la surface drsquoune eacutelectrode ont eacuteteacute

preacuteceacutedemment deacutecrites dans la litteacuterature Ainsi Pankratov et al [93] ont immobiliseacute par

adsorption deux oxydases multi-cuivres (la laccase Trametes hirsuta (dimension 45times55times65 Ȧ)

et la bilirubine oxydase de Myrothecium verrucaria (dimension 40times50times60 Ȧ) sur une surface

drsquoor polycristallin Ils observent par imagerie par AFM en mode tapping apregraves adsorption de

lrsquoenzyme agrave partir drsquoune solution concentreacutee ou dilueacutee une structure granuleuse similaire agrave celle

caracteacuteristique de lrsquoor nu dont les grains ne sont cependant plus aussi lisses Drsquoapregraves les auteurs

la surface drsquoor semble ecirctre recouverte par une sorte de structure globuleuse ayant pour largeur

moyenne 20 nm ce qui est nettement supeacuterieur agrave la dimension drsquoune laccase ou drsquoune

bilirubine Ils ont par ailleurs mesureacute drsquoapregraves les images AFM pour les deux enzymes une

eacutepaisseur entre 4-6 nm et une hauteur de 29 plusmn 06 nm et de 30 plusmn 08 nm pour la laccase et la

bilirubine respectivement Ils estiment que pour les deux types drsquoenzymes un recouvrement


91

total est observeacute Selon eux il est normal drsquoobserver des hauteurs drsquoenzyme infeacuterieures agrave leurs

dimensions car la valeur de la hauteur drsquoun mateacuteriau mou tel qursquoune couche drsquoenzyme mesureacutee

par AFM est toujours infeacuterieure agrave celle attendue agrave cause de la compression de la matiegravere par la

pointe AFM Arzola et al [94] ont aussi essayeacute de caracteacuteriser un film de laccase par AFM en

mode tapping sur une surface drsquoor ainsi que sur du graphite HOPG Les films de laccase ont eacuteteacute

obtenus par immersion des eacutelectrodes dans une solution drsquoenzymes agrave diffeacuterents temps

drsquoincubation Les reacutesultats AFM montrent que dans le cas drsquoune eacutelectrode drsquoor la surface est

totalement recouverte par un film uniforme compact ayant une structure globuleuse Dans le

cas drsquoune surface de graphite HOPG lrsquoadsorption de la laccase agrave la surface de lrsquoeacutelectrode

srsquoeffectue de maniegravere plus lente que sur une surface drsquoor avec aussi une forte tendance des

moleacutecules de laccase agrave former des agglomeacuterats La surface du graphite nrsquoest pas totalement

recouverte par de lrsquoenzyme La laccase forme des agglomeacuterats drsquoune largeur variant entre 50 et

70 nm et drsquoune hauteur de 3-5 nm Pita et al [41] ont quant agrave eux fonctionnaliseacute une surface

drsquoor par des sels de diazonium puis immobiliseacute la laccase de Trametes Hirsuta Apregraves

immobilisation de la laccase ils observent lrsquoapparition de structures globuleuses reacuteparties de

maniegravere aleacuteatoire agrave la surface qui peuvent ecirctre attribueacutees agrave de la laccase Traunsteiner et al [95]

ont immobiliseacute de la laccase de Trametes versicolor sur une surface drsquoor fonctionnaliseacutee par

des SAMs (laquo Self Assembled Monolayer raquo) Ils observent que la laccase couvre lrsquoensemble de

la surface Lrsquoeacutepaisseur de la couche est drsquoenviron 9 nm ce qui est supeacuterieur au plus grand

diamegravetre de la laccase de Trametes versicolor

III26Evaluation de la stabiliteacute de lrsquoactiviteacute bioeacutelectrocatalytique de la laccase

immobiliseacutee vis-agrave-vis de lrsquoORR

La stabiliteacute de la laccase immobiliseacutee agrave la surface des eacutelectrodes a eacuteteacute eacutevalueacutee par

chronoampeacuteromeacutetrie durant 24h sur diffeacuterents types drsquoeacutelectrodes et meacutethodes drsquoimmobilisation

(Figure III12)


92

Figure III12 Stabiliteacute de la laccase immobiliseacutee (adsorption et covalent) agrave la surface des

eacutelectrodes graphitea-CN0 17 et graphite a-CN017 AT durant 24 h

On note drsquoune maniegravere geacuteneacuterale une deacutecroissance progressive du courant de reacuteduction de

lrsquooxygegravene pour les diffeacuterents modes drsquoimmobilisation La diminution est rapide durant les trois

premiegraveres heures et ralentit par la suite Le niveau initial du courant pour les diffeacuterentes

eacutelectrodes est en coheacuterence avec le Tableau III2 Dans le cas drsquoune immobilisation par

adsorption cette diminution pourrait ecirctre expliqueacutee par le fait que la laccase nrsquoest lieacutee au

support qursquoagrave travers de simples interactions eacutelectrostatiques En conseacutequence au fur et agrave mesure

que le temps avance lrsquoenzyme aurait tendance agrave se deacutecrocher Pour le greffage covalent cette

perte de courant pourrait ecirctre aussi expliqueacutee par un deacutecrochage de lrsquoenzyme En effet le

graphite a une structure sous forme de feuillets eacuteclateacutes Certaines enzymes pourraient ecirctre

simplement emprisonneacutees au sein de certaines caviteacutes Une autre explication possible pour la

chute progressive du courant pourrait ecirctre une baisse de lrsquoactiviteacute catalytique de la laccase apregraves

un certain temps En effet des mesures drsquoactiviteacute enzymatique ont eacuteteacute effectueacutees agrave lrsquoaide de

lrsquoABTS agrave la suite de cette eacutetude de stabiliteacute et aucune activiteacute nrsquoa eacuteteacute observeacutee Les mecircmes

reacutesultats sont obtenus dans le cas drsquoune eacutelectrode graphitea-CN017 AT Pour un greffage

covalent de lrsquoenzyme on atteint des courants de 3 microA apregraves 24 heures ce qui correspond agrave une

diminution de 50 du courant initial

0 5 10 15 20 25-7

-6

-5

-4

-3

-2

-1

i (micro

A)

Temps (h)

graphitea-CNx ATlaccase

graphitea-CNx ATlaccase EDC-NHS

graphitea-CNxlaccase

graphitea-CNxlaccase EDC-NHS


93

III27Caracteacuterisation de lrsquoactiviteacute bio-eacutelectrocatalytique de la laccase envers

lrsquoORR par spectroscopie dimpeacutedance eacutelectrochimique

La technique de spectroscopie dimpeacutedance eacutelectrochimique (SIE) a eacuteteacute utiliseacutee dans ce

travail afin de caracteacuteriser la cineacutetique de la reacuteaction de reacuteduction de lrsquooxygegravene catalyseacutee par la

laccase Il faut noter que la litteacuterature contient peu drsquoarticles relatant lrsquoexploitation de cette

technique pour lrsquoeacutetude du transfert direct drsquoeacutelectrons

On observe sur la Figure III13 la preacutesence drsquoune boucle agrave haute freacutequence et le deacutebut drsquoune

boucle agrave basse freacutequence Ceci pourrait nous amener agrave supposer qursquoon a deux types de transferts

de charges et donc deux constantes de temps correspondantes

Figure III13 Spectres drsquoimpeacutedance eacutelectrochimique selon la repreacutesentation de Nyquist pour

les diffeacuterentes eacutelectrodes eacutetudieacutees Les ajustements ont eacuteteacute effectueacutes en utilisant le modegravele du

Scheacutema III4

Afin de valider cette hypothegravese on a traceacute la phase en fonction du logarithme de la

freacutequence (Figure III14) On peut observer la preacutesence de deux pics un premier tregraves intense agrave

basse freacutequence et un autre agrave haute freacutequence de faible intensiteacute (voir flegraveches noires sur la Figure

III14) Ceci nous amegravene agrave dire qursquoon a bien deux constantes de temps

0 4000 8000 12000 16000 200000

4000

8000

12000

16000

20000

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 2000

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

-Im

(Z

) (

Re (Z) (

graphitea-CN017

laccase EDC-NHS reacutesultat

graphitea-CN017

laccase EDC-NHS ajustement

graphitea-CN017

laccase reacutesultat

graphitea-CN017

laccase ajustement

graphitea-CN017

ATlaccase EDC-NHS reacutesultat

graphitea-CN017

ATlaccase EDC-NHS ajustement

graphitea-CN017

ATlaccase reacutesultat

graphitea-CN017

ATlaccase ajustement

-Im

(Z

) (

100 mHz

100 kHz 100 kHz

Re (Z) (Ω)


94

Figure III14 Diagramme de Bode pour une eacutelectrode de graphitea-CN017laccase en

preacutesence drsquoEDC-NHS

On a aussi traceacute le logarithme de la partie imaginaire en fonction du logarithme de la

freacutequence (Figure III15) On observe un comportement CPE agrave basse freacutequence avec un

exposant alpha (deacutetermineacute en effectuant une reacutegression lineacuteaire) eacutegal environ agrave 08 pour

chacune des eacutelectrodes

Figure III15 Variation du logarithme de la partie imaginaire en fonction du logarithme de la

freacutequence pour une eacutelectrode de graphitea-CN017laccase eacutelaboreacutee en preacutesence drsquoEDC-NHS

Par ailleurs drsquoapregraves nos reacutesultats de taux de recouvrement de lrsquoenzyme active vis-agrave-vis

de la reacuteduction de lrsquooxygegravene on peut supposer qursquoagrave la surface de lrsquoeacutelectrode il est possible de

-1 0 1 2 3 4 5-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Phas

e

log(freacutequence)

-1 0 1 2 3 4 5-1

0

1

2

3

4

log(-

im Z

)

log(freacutequence)


95

distinguer deux types de zones celles avec des icirclots drsquoenzymes actives et celles drsquoenzymes

inactives (Scheacutema III2) Ceci laisse agrave penser en conseacutequence que la biocathode pourrait ecirctre

repreacutesenteacutee par un reacuteseau de microeacutelectrodes constitueacutees par quelques icirclots drsquoenzymes actives

disseacutemineacutes au sein drsquoune couche drsquoenzyme principalement inactive et donc passivante

Scheacutema III2 Scheacutema repreacutesentant des icirclots de laccases actives et inactives pour la reacuteduction

de lrsquooxygegravene en eau Lrsquoheacutemisphegravere bleu repreacutesente une enzyme active et lrsquoheacutemisphegravere gris

une enzyme inactive pour la reacuteduction de lrsquooxygegravene

Partant de ces hypothegraveses et en se basant sur les reacutesultats drsquoimpeacutedance effectueacutes par

Gabrielli et al [96] sur des microeacutelectrodes de platine dans une solution de Fe(CN)63-Fe(CN)6

4-

on peut assimiler notre systegraveme agrave un circuit eacutequivalent (CE) (Scheacutema III3) dans lequel

lrsquoimpeacutedance de diffusion a pour expression lrsquoeacutequation III9

ZM(ω) = RM

1+(jωτM)αM (EqIII9)

RM la reacutesistance Cole-Cole et αM la freacutequence indeacutependante de lrsquoimpeacutedance Cole-Cole

Lrsquoimpeacutedance globale a pour expression (Equation III10)

Z(ω) = Reacutel+Rct+ZM

1+jCdlω(Rct+ZM EqIII10)

Reacutel la reacutesistance de lrsquoeacutelectrolyte Rct la reacutesistance de transfert de charge ZM lrsquoimpeacutedance de

diffusion Cole-Cole et Cdl la capaciteacute de double couche Elle peut ecirctre repreacutesenteacutee selon le

circuit eacutelectrique eacutequivalent suivant (Scheacutema III3)

Scheacutema III3 Circuit eacutequivalent proposeacute

Mano et al [97] ont reacutecemment deacutecrit le meacutecanisme de transfert drsquoeacutelectrons des oxydases

multi-cuivres lorsqursquoelles sont immobiliseacutees agrave la surface drsquoune eacutelectrode (Figure III16)


96

Drsquoapregraves eux lrsquoeacutetape limitante est le transfert drsquoeacutelectrons entre lrsquoeacutelectrode et le cuivre T1 des

MCOs dans le cas ougrave les enzymes ont une orientation deacutefavorable (Etape 1) Le transfert

drsquoeacutelectrons intramoleacuteculaire entre le cuivre T1 et le cluster T2T3 pourrait ecirctre aussi limitant

(Etape 2) Lrsquoeacutetape 3 de reacuteduction du dioxygegravene au niveau du cluster tri-nucleacuteaire est toujours

une eacutetape rapide On peut preacuteciser agrave ce stade que la SIE est susceptible de mieux reacuteveacuteler le

processus eacutelectronique cineacutetiquement deacuteterminant agrave savoir le transfert drsquoeacutelectron le plus lent

du processus cineacutetiquement rapide La diffusion du dioxygegravene dans la solution peut ecirctre aussi

une eacutetape limitant ce(s) transfert(s) (Etape 4)

Figure III16 Diffeacuterentes eacutetapes de transfert drsquoeacutelectrons direct lorsque une MCO est

immobiliseacutee sur une eacutelectrode [97]

Drsquoapregraves ces hypothegraveses et compte-tenu du fait que nous sommes tregraves vraisemblablement

en preacutesence drsquoun reacuteseau de microeacutelectrodes plusieurs circuits eacutequivalents (agrave partir du Scheacutema

III3) peuvent ecirctre proposeacutes Chacun de ces circuits permet de reproduire de maniegravere tregraves

satisfaisante apregraves ajustement des paramegravetres les spectres drsquoimpeacutedance obtenus

expeacuterimentalement Lrsquooption agrave un seul circuit eacutequivalent de type Scheacutema III3 a cependant eacuteteacute

eacutelimineacutee en raison du fait de la mise en eacutevidence de deux constantes de temps et donc de deux

transferts drsquoeacutelectrons (Figure III14)

Une autre option consiste agrave mettre deux circuits en seacuterie (Scheacutema III4) ce qui

correspondrait par exemple agrave une situation ougrave le transfert drsquoeacutelectrons entre lrsquoeacutelectrode et le

cuivre T1 constituerait lrsquoeacutetape limitante (qui serait alors repreacutesenteacutee par la grande boucle

observeacutee agrave basse freacutequence) et ougrave la reacuteduction de lrsquooxygegravene serait lrsquoeacutetape rapide (qui serait alors

repreacutesenteacutee par la petite boucle du spectre drsquoimpeacutedance)


97

Scheacutema III4 Deux circuits eacutequivalents en seacuterie pour les systegravemes graphitea-CN017 et

graphitea-CN017 AT recouverts drsquoune couche drsquoenzymes immobiliseacutees de faccedilon covalent ou

par adsorption

On peut aussi proposer deux circuits en parallegravele (Scheacutema III5) Dans ce cas on eacutemet

lrsquohypothegravese qursquoil y a plusieurs orientation de lrsquoenzyme agrave la surface une orientation qui pourrait

ecirctre favorable qui permettrait drsquoavoir un transfert drsquoeacutelectrons optimal (dans ce cas le centre

cuivrique T1 devrait ecirctre proche de la surface de lrsquoeacutelectrode) et une orientation moins favorable

lorsque le cuivre T1 est loin de la surface de lrsquoeacutelectrode

Scheacutema III5 Deux circuits eacutequivalents en parallegravele pour les systegravemes graphitea-CN017

Afin de valider ou non ces deux modegraveles on a compareacute les reacutesistances au transfert de

charge (Tableau III3)

Tableau III3 Reacutesistances de transfert (Rct) de charge pour les eacutelectrodes graphitea-CN017 et

graphitea-CN017 AT apregraves immobilisation covalente ou adsorption de la laccase

Reacutesistance au transfert de charge (Ω)

Type drsquoeacutelectrodes CE en seacuterie CE en parallegravele

Rct1 Rct2 Rct1 Rct2

graphitea-CN017laccaseEDC-NHS 587 27 159 42

graphitea-CN017laccase 566 49 390 778

graphitea-CN017 ATlaccaseEDC-NHS 497 31 333 1560

graphitea-CN017 ATlaccase 471 214 192 1750


98

Drsquoapregraves le tableau ci-dessus on constate que dans le cas drsquoun circuit eacutequivalent en seacuterie

quelle que soit la meacutethode drsquoimmobilisation et le type drsquoeacutelectrode la reacutesistance au transfert de

charge Rct1 est plus de dix fois supeacuterieure agrave la reacutesistance de transfert de charge Rct2 On a ainsi

deux transferts un lent et un rapide On peut eacutemettre lrsquohypothegravese que Rct1 est repreacutesentatif du

transfert de charge de lrsquoeacutelectrode vers le cuivre T1 cette eacutetape constituerait donc lrsquoeacutetape

limitante du systegraveme et que Rct2 est relative agrave la reacuteduction de lrsquooxygegravene par la laccase (eacutetape

rapide) En effet on constate une diffeacuterence dans les valeurs de Rct1 selon le type drsquoeacutelectrode

Dans le cas drsquoune eacutelectrode graphitea-CN017 AT la reacutesistance au transfert de charge Rct1 est

moins importante que pour une eacutelectrode graphiteACN017 Ceci pourrait eacuteventuellement dire

que nous avons plus de probabiliteacute drsquoavoir une orientation favorable lorsque la surface contient

majoritairement des groupements carboxyliques que des groupements amines Concernant

Rct2 elle est relativement constante quel que soit le type drsquoimmobilisation et sa valeur est

autour de 32 Ω Drsquoapregraves ces constations on pourrait dire que les deux circuits en seacuterie

pourraient repreacutesenter le systegraveme eacutetudieacute

Concernant la deuxiegraveme proposition de circuit (deux circuits type scheacutema III 5 en

parallegravele) qui suppose qursquoon a diffeacuterentes orientations possibles drsquoenzyme on observe que Rct1

et Rct2 varient de maniegravere aleacuteatoire et ce quel que soit le type de greffage Ceci pourrait ecirctre

coheacuterent avec le fait que la laccase contient de nombreux groupements fonctionnels soit COOH

soit NH2 (150 en tout) Finalement nous nrsquoavons pas une orientation unique de lrsquoenzyme mais

plusieurs orientations possibles Cette hypothegravese viendrait eacuteventuellement contredire les

observations des deux circuits eacutequivalents en seacuterie qui supposait qursquoon avait une orientation

favorable ou deacutefavorable en fonction de la nature des groupements fonctionnels du support A

ce stade on peut dire que les deux modegraveles peuvent ecirctre valables

III3Conclusion Limmobilisation de la laccase a eacuteteacute reacutealiseacutee pour la premiegravere fois sur du graphite recouvert

dune couche de a-CN017 deacuteposeacutee en utilisant la technique de pulveacuterisation cathodique reacuteactive

magneacuteton Ce mateacuteriau a la particulariteacute drsquoavoir des groupements amines agrave la surface permettant

ainsi lrsquoimmobilisation covalente de lrsquoenzyme Les courants cathodiques obtenus sur la

biocathode sont assez faibles autour de -7 microAcm2 mais ont eacuteteacute ameacutelioreacutes de plus drsquoun facteur

cinq apregraves un traitement anodique drsquoa-CN017 conduisant agrave la formation de groupes


99

carboxyliques reacuteactifs agrave la surface Les courants les plus eacuteleveacutes ont eacuteteacute obtenus sur une eacutelectrode

graphitea-CN017 AT avec la laccase oxydeacutee immobiliseacutee en preacutesence drsquoun agent de couplage

(formation agrave la fois de liaisons amide et imine) On a mesureacute alors une densiteacute de courant de

-446 microAcm2 Les mesures de taux de recouvrement agrave partir des densiteacutes de courant ont permis

de mettre en eacutevidence la preacutesence de fractions drsquoenzymes actives et inactives agrave la surface des

eacutelectrodes eacutetudieacutees

Lanalyse AFM a montreacute que sur une eacutelectrode Sia-CN017 la surface est entiegraverement

recouverte dune monocouche denzyme dans le cas de lrsquoimmobilisation de la laccase oxydeacutee et

partiellement pour lrsquoimmobilisation covalente de la laccase naturelle Dans ce dernier cas on a

mesureacute agrave partir de lrsquoimage de phase un taux de recouvrement de 89 En comparant ce reacutesultat

au taux de recouvrement obtenu par XPS (70 ) dans le cas du modegravele heacutemispheacuterique on peut

dire que les reacutesultats se rejoignent La diffeacuterence peut ecirctre expliqueacutee par la nature du support

utiliseacute En effet pour les analyses AFM un support lisse a eacuteteacute utiliseacute (silicium) tandis que pour

les mesures XPS on a utiliseacute du graphite qui preacutesente une surface rugueuse

En comparant les valeurs de taux de couverture calculeacutes agrave partir de lrsquoactiviteacute enzymatique

ou des donneacutees de XPS on remarque que dans le cas drsquoune eacutelectrode graphitea-CN017 AT les

reacutesultats sont assez semblables lorsqursquoon suppose que la laccase a une forme heacutemispheacuterique et

une taille de 7 nm Ceci pourrait valider le modegravele heacutemispheacuterique comme eacutetant plus

repreacutesentatif que le modegravele drsquoune couche discontinue drsquoenzymes Cependant dans le cas drsquoune

eacutelectrode graphitea-CN017 on observe un eacutecart entre les deux meacutethodes de calcul Le taux de

couverture calculeacute agrave partir de lrsquoactiviteacute enzymatique est environ de 100 quelle que soit la

meacutethode de greffage alors que pour les mesures XPS les valeurs deacutependent du type

drsquoimmobilisation ce qui pourrait suggeacuterer que la laccase deacuteveloppe une hyper-activiteacute vis-agrave-

vis de lrsquoABTS en conseacutequence de son immobilisation agrave la surface drsquoun support solide

Les mesures de spectroscopie drsquoimpeacutedance eacutelectrochimique ont mis en eacutevidence que le

transfert de charge fait intervenir deux constantes de temps Cependant les deux modegraveles

proposeacutes de transferts drsquoeacutelectrons repreacutesenteacutes par un circuit eacutequivalent constitueacute de deux

transferts de charge soit en seacuterie soit en parallegravele sont compatibles avec les reacutesultats

expeacuterimentaux de SIE obtenus A ce stade on ne peut donc pas trancher entre les deux

hypothegraveses agrave savoir deux populations de laccase dont lrsquoune agrave une orientation favorable sur

lrsquoeacutelectrode et lrsquoautre une orientation deacutefavorable ou un systegraveme toujours repreacutesenteacute par deux


100

orientations de la laccase mais qui varieraient suivant la meacutethode drsquoimmobilisation ou le type


101

Chapitre IVElaboration drsquoune cathode

graphitenanowalls de carbonelaccase effet de la

nanostructuration de lrsquoeacutelectrode

102

Chapitre IV Elaboration drsquoune cathode graphitenanowalls de carbonelaccase effet de la nanostructuration de lrsquoeacutelectrode

103

Plusieurs types de support ont eacuteteacute eacutetudieacutes au cours de ce travail Dans le chapitre preacuteceacutedent

la surface du graphite a eacuteteacute recouverte par un film mince de nitrure de carbone amorphe ayant

la particulariteacute de preacutesenter des groupements amines de surface qui permettent le greffage

covalent de lrsquoenzyme Des groupements carboxyliques peuvent eacutegalement ecirctre introduits par

un traitement eacutelectrochimique Les reacutesultats obtenus sur a-CNx ont montreacute que les courants

catalytiques les plus eacuteleveacutes sont mesureacutes lorsque la laccase est immobiliseacutee de faccedilon covalente

sur des surfaces riches en groupements carboxyliques Cependant ce type de support ne permet

pas de preacutesenter une grande surface speacutecifique et en conseacutequence drsquoavoir des courants

catalytiques eacuteleveacutes On srsquoest donc tourneacutes avec lrsquoobjectif drsquoameacuteliorer les performances de la

cathode en terme de densiteacute de courant produit vers la nanostructuration de la surface de

graphite La technique choisie consiste agrave former des nanowalls de carbone (CNWs) agrave la surface

du graphite augmentant ainsi sensiblement la surface disponible et donc la surface

eacutelectroactive Ces surfaces ont eacuteteacute eacutelaboreacutees par lrsquoeacutequipe de Shinsuke Mori au sein du

deacutepartement drsquoingeacutenierie chimique du Tokyo Institute of Technology Ce type drsquoeacutelectrode sera

noteacute graphiteCNWs Une fois les nanowalls de carbone formeacutes sur la surface du graphite ces

derniers ont eacuteteacute fonctionnaliseacutes par un jet plasma agrave la pression atmospheacuterique (APPJ) au LISE

en collaboration avec Arefi-Khonsari Farzaneh et Jeacuterocircme Pulpytel On a dans un premier temps

effectueacute les mesures de performances catalytiques sur les eacutechantillons de graphiteCNWs Dans

un second temps on a chercheacute agrave optimiser ces conditions de fonctionnalisation plasma en ayant

recourS agrave des plans drsquoexpeacuteriences Le nombre drsquoeacutechantillons de graphiteCNWs agrave notre

disposition eacutetant limiteacute on a deacutecideacute drsquoeffectuer lrsquoeacutetude drsquooptimisation tout drsquoabord sur du

graphite nu (sans nanowalls de carbone) Les paramegravetres de traitement plasma ainsi optimiseacutes

ont ensuite eacuteteacute utiliseacutes pour fonctionnaliser les eacutelectrodes graphiteCNWs

IV1Mateacuteriels et meacutethodes On ne deacutetaillera ici que les protocoles de revecirctement du graphite par les nanowalls de

carbone effectueacutes par lrsquoeacutequipe de SMori au Japon ainsi que ceux de leur fonctionnalisation par

plasma drsquoidentification des groupements aldeacutehydes agrave la surface des eacutelectrodes par XPS et de

mesures drsquoangle de contact Les autres meacutethodes de caracteacuterisation ont eacuteteacute deacutecrites

preacuteceacutedemment dans le manuscrit


104

Les disques de graphiteCNWs ont eacuteteacute preacutepareacutes sous forme de pastille suivant le protocole

deacutecrit dans le chapitre II mateacuteriels et meacutethodes section II2 Apregraves le deacutepocirct des CNWs la pastille

a eacuteteacute monteacutee en eacutelectrode Une fois eacutelaboreacutees les eacutelectrodes ont eacuteteacute caracteacuteriseacutees par

voltampeacuteromeacutetrie cyclique afin drsquoeacutevaluer la surface eacutelectroactive et les courants de reacuteduction

de lrsquooxygegravene par spectroscopie UV-visible pour mesurer lrsquoactiviteacute enzymatique par XPS pour

identifier et quantifier les groupements fonctionnels preacutesents agrave la surface de lrsquoeacutelectrode apregraves

fonctionnalisation et par mesure drsquoangle de contact afin drsquoeacutevaluer la mouillabiliteacute de la surface

de la biocathode

IV11Le proceacutedeacute plasma

Le plasma est un gaz partiellement ioniseacute eacutelectriquement neutre Il constitue le quatriegraveme

eacutetat de la matiegravere Il est formeacute drsquoun ensemble de particules neutres ou exciteacutees drsquoions et

drsquoeacutelectrons Le passage drsquoun gaz agrave lrsquoeacutetat plasma neacutecessite une eacutenergie suffisante pour que les

eacutelectrons libres constituant le gaz entrent en collision avec les particules neutres du gaz et

provoquent lrsquoionisation de ces moleacutecules Cependant eacutelectrons et atomes ioniseacutes srsquoattirent et

ils peuvent alors se recombiner pour former des atomes Pour atteindre lrsquoeacutetat plasma il faut que

lrsquoionisation soit plus freacutequente que la recombinaison Cette eacutenergie peut ecirctre apporteacutee sous

lrsquoeffet drsquoun champ eacutelectrique ou par simple chauffage

Les plasmas peuvent ecirctre classeacutes en fonction de leur densiteacute de leur tempeacuterature et de leur

degreacute drsquoionisation Ainsi on distingue tout drsquoabord le plasma froid Ce gaz est tregraves faiblement

ioniseacute et donc constitueacute essentiellement drsquoatomes et de moleacutecules neutres Il possegravede une faible

densiteacute drsquoeacutenergie Par opposition le plasma chaud est totalement ioniseacute crsquoest-agrave-dire formeacute

uniquement drsquoions et drsquoeacutelectrons Il possegravede une densiteacute drsquoeacutenergie eacuteleveacutee Dans lrsquoindustrie les

technologies plasma peuvent ecirctre utiliseacutees pour nettoyer des surfaces effectuer des deacutepocircts de

couches minces et confeacuterer des groupements fonctionnels agrave la surface drsquoun mateacuteriau Au cours

de ce travail on srsquointeacuteressera au plasma froid La freacutequence drsquoexcitation de la source eacutelectrique

est tregraves importante puisqursquoelle influe sur le comportement des eacutelectrons et des ions On

distingue trois groupes les deacutecharges continues (DC) et basse freacutequence les plasmas initieacutes

par radiofreacutequence et les deacutecharges micro-ondes Nous avons utiliseacute deux sortes de plasma

froid un jet plasma agrave la pression atmospheacuterique (APPJ) a permis de fonctionnaliser la surface

du substrat carboneacute Ce proceacutedeacute suscite un fort inteacuterecirct industriel du fait qursquoil fonctionne agrave


105

pression atmospheacuterique et que aucun reacuteacteur (enceinte fermeacutee) nrsquoest neacutecessaire dans le cas

drsquoun traitement agrave lrsquoair libre Le dispositif se compose de deux eacutelectrodes agrave travers lesquelles

circule le gaz plasmagegravene On applique une freacutequence drsquoexcitation dans le domaine des

radiofreacutequences afin de creacuteer le plasma entre les deux eacutelectrodes

Un deuxiegraveme type de plasma a eacuteteacute utiliseacute pour former les nanowalls de carbone il srsquoagit

drsquoun plasma induit par micro-ondes agrave basse pression pour le deacutepocirct chimique en phase vapeur

(Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition PECVD) Le principe de cette technique

consiste agrave deacuteposer un mateacuteriau solide sous forme de couche mince dont lrsquoeacutepaisseur et la

topographie varient selon le temps de deacutepocirct sur le substrat En CVD thermique classique (deacutepocirct

chimique en phase vapeur) le substrat est chauffeacute pour fournir lrsquoeacutenergie drsquoactivation neacutecessaire

au deacuteclenchement de la reacuteaction chimique La reacuteduction de lrsquoeacutenergie thermique neacutecessaire peut

ecirctre obtenue par le proceacutedeacute CVD assisteacute par plasma On creacutee une vapeur reacuteactive (plasma) par

application drsquoun champ eacutelectrique agrave un gaz dans une enceinte fermeacutee Les espegraveces reacuteactives et

radicaux formeacutes reacuteagissent entre eux et agrave lrsquointerface plasmasurface pour former le deacutepocirct La

reacuteactiviteacute du plasma froid permet de deacutecomposer les preacutecurseurs gazeux agrave plus basse

tempeacuterature Ce type de proceacutedeacute est geacuteneacuteralement utiliseacute sous pression reacuteduite mais peut ecirctre

aussi reacutealiseacute agrave pression atmospheacuterique

IV111Nanostructuration du graphite par revecirctement par des nanowalls de carbone

Une fois deacutecoupeacutees sous forme de pastilles (diamegravetre de 07 cm) les eacutechantillons de

graphite ont eacuteteacute envoyeacutes au Japon afin de former les nanowalls de carbone (CNWs) selon un

protocole mis au point par lrsquoeacutequipe de S Mori Lrsquoappareil utiliseacute est le modegravele ASTeX DPA25

Les conditions de traitement sont les suivantes un deacutebit total de 50 sccm (46 cm3min) pour

CO et 4 sccm pour H2 une pression de travail de 250 Pa une tempeacuterature de 700degC et une

puissance de 60 W Le substrat est chauffeacute par deacutecharge micro-onde et sa tempeacuterature est

deacutetermineacutee par un pyromegravetre infrarouge (Japan Sensor TMZ9) Au cours de ce travail trois

dureacutees diffeacuterentes de deacutepocirct ont eacuteteacute effectueacutes (30 s 60 s et 120 s) Les eacutelectrodes graphiteCNWs

selon la dureacutee de traitement seront noteacutees graphiteCNWs30s graphiteCNWs60s et

graphiteCNWs120s


106

IV112Fonctionnalisation du graphiteCNWs par plasma atmospheacuterique

Une torche agrave plasma atmospheacuterique de type Plasmatreat (Figure IV1) a eacuteteacute utiliseacutee pour

fonctionnaliser la surface des eacutelectrodes de graphite et de graphiteCNWs en ayant recours soit

agrave lrsquoazote soit agrave lrsquoair en tant que gaz plasmagegravene Plusieurs paramegravetres que lrsquoon a fait varier au

cours de ce travail doivent ecirctre fixeacutes pour un traitement donneacute On distingue le Plasma Cycle

Time (paramegravetre permettant la mesure de lrsquointensiteacute du plasma et qui repreacutesente sa dureacutee de

fonctionnement efficace) la distance entre la torche et les disques de graphiteCNWs la vitesse

de deacuteplacement de la torche sur les disques de graphiteCNWs le nombre de passage de la

torche et enfin le deacutebit du gaz drsquoionisation

Figure IV1 Torche plasma agrave la pression atmospheacuterique de type Plasmatreat

IV12Caracteacuterisation de lrsquoeacutelectrode par spectroscopie photoeacutelectronique agrave

rayons X

IV121Identification de groupements aldeacutehydes agrave la surface de lrsquoeacutelectrode

Lrsquoanalyse XPS ne permet pas de diffeacuterencier certains groupements fonctionnels

notamment les aldeacutehydes les ceacutetones et les imines Dans notre cas ce problegraveme srsquoest poseacute pour

la quantification des fonctions aldeacutehydes Afin de le reacutesoudre on a deacuteriveacute chimiquement les

aldeacutehydes en ayant recours agrave une moleacutecule sonde Les aldeacutehydes reacuteagissent avec les hydrazides


107

pour former des hydrazones dont la liaison imine peut ecirctre ensuite reacuteduite pour eacuteviter la reacuteaction

inverse drsquohydrolyse Lrsquoideacutee est drsquoutiliser un hydrazide posseacutedant un eacuteleacutement caracteacuteristique qui

pourra ecirctre deacutetecteacute par XPS et attribueacute sans ambiguiumlteacute agrave la moleacutecule sonde qui sera la seule agrave

contenir cet eacuteleacutement La sonde utiliseacutee est le 2-chlorobenzohydrazide (Figure IV2)

Figure IV2 Formule chimique du 2-chlorobenzohydrazide

Elle est de petite taille ce qui limite le risque drsquoencombrement steacuterique agrave la surface des

eacutechantillons et contient du chlore qui fait office de sonde pour lrsquoXPS Chaque disque de

graphite est immergeacute dans un beacutecher contenant 5 mL de solution drsquohydrazide (01 mgmL) avec

une leacutegegravere agitation pendant 4 h agrave tempeacuterature ambiante Lrsquohydrazide 2-chlorobenzoique est en

large excegraves par rapport au nombre de groupements aldeacutehydes 50 microL drsquoune solution de

NaCNBH3 (2 molL) sont ensuite ajouteacutes Les eacutechantillons sont ensuite placeacutes durant une nuit

agrave 4degC pour reacuteduire lrsquoimine puis rinceacutes pendant 5 minutes dans de lrsquoeacutethanol puis dans lrsquoeau le

tout sous agitation meacutecanique afin drsquoeacuteliminer lrsquohydrazide nrsquoayant pas reacuteagi sur la surface Enfin

les eacutechantillons sont analyseacutes par XPS

IV1211Mise en eacutevidence des groupements carboxyliques agrave la surface de lrsquoeacutelectrode

par une meacutethode chimique

La deacutetermination du nombre de groupements carboxyliques preacutesents agrave la surface a eacuteteacute

effectueacutee agrave lrsquoaide drsquoune meacutethode spectroscopique en utilisant du bleu de toluidine (TBO) Il

srsquoagit drsquoun colorant avec un maximum drsquoabsorption agrave une longueur drsquoonde eacutegale agrave 633 nm

Apregraves fonctionnalisation par traitement plasma les disques sont immergeacutes pendant 6h dans 1

mL drsquoune solution de TBO (5times10-4 M) preacutepareacutee dans de la soude agrave pH 10 sous agitation

continue Le TBO (Figure IV3) moleacutecule chargeacutee positivement se lie avec les fonctions

carboxyliques de surface deacuteprotoneacutees par interaction eacutelectrostatique Les disques sont ensuite

laveacutes avec de la soude agrave pH 10 et deux fois avec de lrsquoeau distilleacutee 100 microL drsquoune solution drsquoacide

aceacutetique agrave 50 sont par la suite ajouteacutes afin de protoner les fonctions carboxyliques de surface

ce qui entraicircne le relargage en solution du TBO adsorbeacute en surface Cette eacutetape est reacutealiseacutee


108

pendant 10 minutes La densiteacute optique de cette solution de relargage a eacuteteacute par la suite mesureacutee

par spectroscopie UV-visible agrave 633 nm (ε = 26400 Lmolcm) La densiteacute des groupements

carboxyliques preacutesents agrave la surface a eacuteteacute deacutetermineacutee en se basant sur lrsquohypothegravese que 1 mole de

TBO complexe 1 mole de groupements carboxyliques

Figure IV3 Formule chimique du bleu de toluidine

IV13Mesure drsquoangle de contact

La mesure drsquoangle de contact est une technique permettant drsquoeacutevaluer lrsquoaffiniteacute drsquoun liquide

par rapport agrave une surface La meacutethode consiste agrave mesurer lrsquoangle que forme une goutte de

liquide poseacutee sur la surface drsquoun solide et la surface de ce dernier Dans le cas drsquoune goutte

drsquoeau et puisque lrsquoon compare des surfaces de rugositeacute eacutequivalente ainsi qursquoen attestent les

images de microscopie agrave balayage (Figure IV11) on peut consideacuterer que la valeur de lrsquoangle

permet drsquoestimer le caractegravere hydrophobe ou hydrophile de la surface Lorsque lrsquoangle

augmente la surface devient moins hydrophile et sa mouillabiliteacute diminue Une surface

hydrophobe sera caracteacuteriseacutee par un grand angle θ et une faible eacutenergie de surface tandis qursquoune

surface hydrophile sera caracteacuteriseacutee par un faible angle de contact et une grande eacutenergie de

surface ce qui correspond agrave une forte mouillabiliteacute (Figure IV4)

Figure IV4 Scheacutema de lrsquoangle de contact drsquoun liquide avec un solide

Le dispositif expeacuterimental est composeacute drsquoune micro-seringue permettant de deacuteposer un

volume preacutecis de liquide drsquoune source de lumiegravere et drsquoune cameacutera (TELI CCD) relieacutee agrave un

ordinateur qui permet via un logiciel de traiter les images obtenues et de calculer lrsquoangle de


109

contact Pour chaque mesure une goutte drsquoeau distilleacutee drsquoun volume eacutegal agrave 1 microL a eacuteteacute deacuteposeacutee

agrave la surface des eacutechantillons quelques minutes apregraves fonctionnalisation par APPJ

IV14La meacutethode des plans drsquoexpeacuteriences

IV141Principe de la meacutethode des plans drsquoexpeacuteriences

La meacutethode intuitive traditionnelle nrsquoest pas souvent le meilleur choix pour reacutealiser une

seacuterie drsquoexpeacuteriences Elle consiste agrave fixer un paramegravetre et agrave mesurer la reacuteponse du systegraveme pour

plusieurs grandeurs drsquointeacuterecirct Si plusieurs paramegravetres doivent ecirctre eacutetudieacutes il faudrait reacutepeacuteter

cette meacutethode sur chaque paramegravetre eacutetudieacute ce qui amegravene agrave reacutealiser un nombre eacuteleveacute

drsquoexpeacuteriences Afin de diminuer ce nombre on pourrait reacuteduire le nombre de paramegravetres mais

cela reacuteduirait la pertinence des reacutesultats obtenus Une alternative serait de reacutealiser des plans


La meacutethode des plans drsquoexpeacuteriences permet drsquoorganiser au mieux les essais Les plans

drsquoexpeacuteriences permettent de deacuteterminer et drsquooptimiser les paramegravetres deacuteterminants drsquoun

systegraveme ou encore de preacutedire par modeacutelisation le comportement drsquoun proceacutedeacute en minimisant le

nombre drsquoexpeacuteriences Cette meacutethode eacutetablit un lien entre deux types de grandeurs la reacuteponse

qui constitue la grandeur physique mesureacutee dont on souhaite comprendre le comportement

(dans notre cas il peut srsquoagir du courant catalytique de reacuteduction drsquoO2 par exemple) et les

facteurs (paramegravetres) qui repreacutesentent les grandeurs physiques modifiables par

lrsquoexpeacuterimentateur et ayant une influence sur la variation de la reacuteponse Elle vise donc agrave eacutetudier

les relations qui lient la reacuteponse aux facteurs (on utilise pour cela un modegravele matheacutematique de

type polynocircmial) La meacutethode des plans drsquoexpeacuteriences peut ecirctre utiliseacutee avec deux diffeacuterentes

approches la technique de screening (ou criblage) qui permet de deacuteterminer les facteurs ayant

une influence significative sur les variations de la reacuteponse et dans laquelle il est aussi possible

drsquoidentifier les correacutelations eacuteventuelles entre les paramegravetres ayant une importance sur la

reacuteponse La seconde meacutethode est celle des surfaces de reacuteponse Dans ce type drsquoeacutetude les

variations de la reacuteponse sont calculeacutees en fonction des paramegravetres preacuteceacutedemment jugeacutes

importants Elle vient en compleacutement agrave une eacutetude de type screening La compreacutehension des

plans drsquoexpeacuteriences srsquoappuie ainsi sur deux notions celle drsquoespace expeacuterimental et celle de la

modeacutelisation matheacutematique des grandeurs physiques eacutetudieacutees Ces deux notions sont

expliqueacutees ci-apregraves


110

IV1411Lrsquoespace expeacuterimental

La reacuteponse deacutepend de un ou plusieurs facteurs Chaque facteur peut ecirctre repreacutesenteacute sur un

axe La valeur donneacutee agrave un facteur est appeleacute niveau Geacuteneacuteralement lorsqursquoon eacutetudie un facteur

on limite ses variations entre deux bornes une borne infeacuterieure appeleacutee niveau bas noteacutee par -

1 et une borne supeacuterieure appeleacute niveau haut noteacutee 1 (Figure IV5) Si les seules valeurs des

facteurs sont ses bornes on est en preacutesence de plans drsquoexpeacuteriences agrave deux niveaux

Figure IV5 Domaine drsquoun facteur

Les valeurs que peut prendre un facteur entre le niveau bas et le niveau haut constituent le

domaine de variation du facteur Chaque facteur eacutetudieacute est repreacutesenteacute par un axe orthogonal

aux autres axes et est deacutefini par son niveau haut son niveau bas et son domaine de variation

Le regroupement des domaines constitue ce que lrsquoon appelle le domaine drsquoeacutetudes qui repreacutesente

lrsquoespace expeacuterimental dans lequel les expeacuteriences doivent ecirctre reacutealiseacutees La Figure IV6

repreacutesente le domaine drsquoeacutetude pour deux facteurs

Figure IV6 Domaine drsquoeacutetude pour un espace agrave deux dimensions

IV1412Surface de reacuteponse

A chaque point du domaine drsquoeacutetude est associeacutee une reacuteponse Lrsquoensemble de ces points

correspond agrave un ensemble de reacuteponses qui se situe sur une surface que lrsquoon appelle surface de


111

reacuteponse (Figure IV7) On ne connait que les points expeacuterimentaux de cette surface Les points

inconnus sont deacutetermineacutes agrave lrsquoaide drsquoun modegravele matheacutematique

Figure IV7 Surface de reacuteponse pour un espace agrave deux dimensions dans le cas drsquoune eacutetude

avec deux facteurs

IV1413Modeacutelisation matheacutematique

La meacutethode des plans drsquoexpeacuteriences utilise un modegravele matheacutematique simple reliant la

reacuteponse aux facteurs (ces facteurs constituent les variables sur lesquelles on compte agir) Il

srsquoagit drsquoun modegravele polynomial La formule de ce modegravele dans le cas de deux facteurs est une

eacutequation du second degreacute (Equation IV1)

Y = b0 + Σ biXi + Σ Σ bijXiXj + Σ biiXi2 + ε (Eq IV1)

bi bii bij repreacutesentent les coefficients du polynocircme Y la reacuteponse et Xi le facteur i

Une fois les niveaux des facteurs agrave eacutetudier fixeacutes soit expeacuterimentalement soit en se basant

sur une eacutetude bibliographique lrsquoobjectif est de calculer les coefficients du modegravele polynomial

Plus la valeur absolue du coefficient sera importante plus le terme correspondant aura une

influence sur le systegraveme Les plans drsquoexpeacuteriences neacutecessitent lrsquoutilisation de la technique de

reacutegression multilineacuteaire par la meacutethode des moindres carreacutes pour la deacutetermination des

coefficients du modegravele polynomial Cette meacutethode utilise le calcul matriciel (Equation IV2)

(XtX)-1XtY = b (Eq IV2)

X repreacutesente la matrice drsquoexpeacuterience Xt sa transposeacutee (XtX)-1 lrsquoinverse du produit matriciel

Y la reacuteponse et b la matrice des coefficients du polynocircme

i inej


112

Les plans drsquoexpeacuteriences sont caracteacuteriseacutes par une reacutepartition des points dans le domaine

expeacuterimental qui soit laquo matheacutematiquementraquo optimale Il existe de nombreux plans drsquoexpeacuterience

dans la litteacuterature tels que les plans factoriels et les plans de surface de reacuteponse

IV142Plan factoriel fractionnaire du 1er degreacute

Dans un plan factoriel complet du 1er degreacute (les interactions drsquoordre 2 ou plus sont souvent

neacutegligeables) il y a au moins autant drsquoexpeacuteriences agrave reacutealiser que de coefficients agrave deacuteterminer

Le nombre drsquoexpeacuteriences agrave reacutealiser augmente significativement avec le nombre de facteurs

(paramegravetres) eacutetudieacutes En effet pour n paramegravetres le plan neacutecessiterait 2n expeacuteriences agrave reacutealiser

Cela signifie que dans le cas ougrave lrsquoon a 8 facteurs agrave faire varier il faudra effectuer 256

expeacuteriences sans compter les reacutepeacutetitions afin de consolider le modegravele On peut reacuteduire le

nombre drsquoexpeacuteriences par la reacutealisation drsquoun plan factoriel fractionnaire construit sur le modegravele

drsquoun plan factoriel complet Ainsi un plan factoriel fractionnaire du 1er degreacute permet de ne

reacutealiser que 2n-1 expeacuteriences pour deacuteterminer les coefficients du modegravele Ce type de plan

constitue un bon choix lorsque les ressources sont limiteacutees ou que le nombre de facteurs agrave faire

varier est important comme dans notre cas La Figure IV8 scheacutematise pour un systegraveme

constitueacute de trois facteurs la diffeacuterence entre ces deux types de plan factoriel et deacutetaille le

modegravele polynomial pour chaque plan

Y = b0 + b1X1 + b2X2 + b3X3 + b12X1X2 + b13X1X3 + b23X2X3 + b123X1X2 X3 (plan complet)

Y = b0rsquo + b1rsquoX1 + b2rsquoX2 + b3rsquoX3 (plan fractionnaire)

Figure IV8 Comparaison entre un plan factoriel complet et un plan factoriel

fractionnaire

Chaque coefficient du modegravele fractionnaire (birsquo) est une combinaison des coefficients

aliaseacutes (regroupeacutes) du plan complet En geacuteneacuteral on suppose que les effets les plus eacuteleveacutes

(interaction entre trois facteurs) sont neacutegligeables


113

IV143Plan composite

Un plan composite est un plan de surface Il est le plus souvent utiliseacute suite agrave la

deacutetermination des facteurs importants agrave lrsquoaide des plans factoriels Il est deacutecrit par un domaine

spheacuterique Le plan composite est constitueacute de la combinaison drsquoun plan factoriel (complet ou

fractionnaire) auquel on ajoute un groupe de points situeacutes sur les axes de chacun des facteurs

(Figure IV9) Ces points sont appeleacutes les points en eacutetoile

Figure IV9 Scheacutema montrant la diffeacuterence entre un plan factoriel et un plan de surface

composite pour deux facteurs

IV144Plan de Doehlert

Le plan de Doehlert est aussi un plan de surface Dans ce cas les points forment un

hexagone reacutegulier dans lrsquoespace expeacuterimentale Lrsquoavantage de ce type de plan par rapport au

plan composite deacutecrit ci-dessus est qursquoil permet drsquoeacutetendre le domaine drsquoeacutetude si neacutecessaire (par

exemple dans le cas ougrave les reacutesultats rechercheacutes ne sont pas dans le domaine drsquoeacutetude hexagonale

initial) par une simple translation qui ne modifie pas la reacutepartition des points dans lrsquoespace

expeacuterimental Par exemple sur la Figure IV11 en ajoutant les trois points en jaune on forme

un nouvel hexagone en les associant aux points 1 2 3 et 7 On peut par la suite encore eacutetendre

le plan drsquoexpeacuteriences dans drsquoautres directions (Figure IV10)

Figure IV10 Scheacutema drsquoun plan de Doehlert Les boules rouges repreacutesentent le plan initial et

les boules jaunes les expeacuteriences suppleacutementaires pour lrsquoobtention du nouveau plan


114

IV145Deacutetermination des facteurs influents

La meacutethode utiliseacutee afin de deacuteterminer les facteurs ayant un impact important est celle de

Pareto Cette meacutethode permet de classer les facteurs par ordre croissant drsquoimportance Elle a

eacuteteacute introduite agrave la fin du XIXe siegravecle par lrsquoeacuteconomiste italien Vilfredo Pareto qui a constateacute que

drsquoune maniegravere geacuteneacuterale dans les plans de criblage comprenant un grand nombre de paramegravetres

expeacuterimentaux 20 de ces paramegravetres controcirclent 80 des reacuteponses La meacutethode est la

suivante pour chaque coefficient bi on calcule un Pi qui a pour expression lrsquoeacutequation

suivante (Equation IV3)

Pi() = 100bi

2

Σbi2 (Eq IV3)

On classe les valeurs de Pi calculeacutees par ordre croissant on les additionne jusqursquoagrave ce que

leur somme soit supeacuterieure agrave 80 Les coefficients bi dont les Pi entrent dans cette somme

sont les coefficients influents du modegravele

IV2Reacutesultats et discussion

IV21Caracteacuterisation de la surface drsquoune eacutelectrode graphiteCNWs

La surface des disques de graphiteCNWs a eacuteteacute caracteacuteriseacutee par microscopie eacutelectronique

agrave balayage (MEB) Les nanowalls de carbone srsquoorganisent sous forme de feuillets en position

verticale Ils forment un assemblage de murs enchevecirctreacutes entre eux On peut observer drsquoapregraves

la Figure IV11 que lrsquoaugmentation du temps de formation a pour effet drsquoaugmenter la densiteacute

des CNWs Ainsi pour un temps de formation eacutegal agrave 30 s (Figure IV11A) la surface du graphite

nrsquoest pas totalement recouverte par les nanowalls Pour la suite des expeacuteriences les nanowalls

formeacutes avec un temps de traitement eacutegal agrave 30s ont eacuteteacute abandonneacutes Lorsqursquoon augmente le

temps de traitement agrave 60 s la surface du graphite est entiegraverement recouverte de CNWs Pour

une dureacutee de synthegravese de 120 s le graphite est totalement recouvert et les CNWs sont plus fins

et plus denses Ils forment une sorte de choux fleurs de taille variable (Figure IV11D)


115

Figure IV11 Images MEB de CNWs pour diffeacuterents temps de traitement A)

graphiteCNWs30s B) graphiteCNWs60s C et D) graphiteCNWs120s

SMori et al [81] ont montreacute qursquoapregraves un temps de croissance de 1 minute sur du silicium

les CNWs ont une hauteur de 1microm (Figure IV12) La largeur drsquoun nanowall (seul) est comprise

entre 100 et 300 nm et son eacutepaisseur est de quelques dizaines de nanomegravetres Lrsquoaugmentation

du temps de formation rend les CNWs plus onduleacutes fins et hauts Ils observent eacutegalement que

lrsquoespacement entre deux nanowalls de carbone adjacents diminue lorsque le temps de croissance

augmente Ils ont aussi caracteacuteriseacute les CNWs par spectroscopie Raman pour diffeacuterentes dureacutees

de formation (Figure IV12) Les spectres montrent la preacutesence de deux pics caracteacuteristiques

des mateacuteriaux carboneacutes un pic agrave 1590 cm-1 (bande G) qui indique la preacutesence de feuillets de

graphegravene cristallin et un pic agrave 1350 cm-1 (bande D) lieacute au deacutesordre ducirc agrave la taille des cristaux

fins En plus de ces deux principaux pics srsquoajoute un pic agrave 1650 cm-1 (bande Drsquo) associeacute aussi

au deacutesordre structural La preacutesence de bandes intenses D et Drsquo suggegravere la preacutesence drsquoune

structure plus nanocristalline et la preacutesence de deacutefauts au niveau du graphegravene On remarque

aussi que lorsque le temps de croissance augmente lrsquointensiteacute de la bande Drsquo diminue et celle

de la bande G srsquoeacutelargit Cela signifie que la cristalliniteacute du graphite diminue lors de la croissance

A B

C D


116

des CNWs ce qui est conforme aux images MEB dans lesquels les CNWs paraissent plus

onduleacutes

Figure IV12 A gauche images MEB de CNWs produits sur du silicium pour un temps

de traitement de A) 30s B) 60 s C) 90 s et D) 120s (vue du dessus et coupe transversale)

et agrave droite spectres Raman de CNWs pour les diffeacuterents temps de deacutepocirct [81]

On a aussi effectueacute des analyses XPS sur les disques de graphiteCNWs La Figure IV13

repreacutesente la deacutecomposition du pic C1s drsquoune eacutelectrode graphiteCNWs60s La preacutesence

drsquoazote agrave la surface des disques graphiteCNWs nrsquoest pas deacutetecteacutee (Tableau IV1) Par ailleurs

on note une leacutegegravere augmentation du ratio Csp3Csp2 avec la dureacutee de formation des CNWs

Cette observation est en adeacutequation avec les reacutesultats obtenus en spectroscopie Raman par

SMori sur le fait que la cristalliniteacute du graphite diminue avec la croissance des CNWs

A

B

C

D


117

Figure IV13 Spectre XPS et deacutecomposition du pic C1s drsquoune eacutelectrode graphiteCNWs60s

Tableau IV1 Spectres XPS C1s et leur deacutecomposition pour les eacutelectrodes graphiteCNWs60s

et graphiteCNWs120s

C1s

O1s OC N1s C sp2 C sp3 Csp3Csp2

graphiteCNWs60s 74 165 022 2 0022 -

graphiteCNWs120s 702 18 025 19 0021 -

IV22Deacutetermination de la surface eacutelectroactive drsquoune eacutelectrode graphiteCNWs

On a deacutetermineacute la surface eacutelectroactive des eacutelectrodes graphiteCNWs en eacutetudiant le

comportement eacutelectrochimique du couple [Fe(CN)6]3-[Fe(CN)6]

4- par voltampeacuteromeacutetrie

cyclique agrave diffeacuterentes vitesses de balayage (Figure IV14) La surface eacutelectroactive de

lrsquoeacutelectrode a eacuteteacute deacutetermineacutee en utilisant la relation de Randles-Sevcik Ainsi en traccedilant ip = f

(v12) on obtient une droite dont la pente permet de deacuteterminer la surface eacutelectroactive de

lrsquoeacutelectrode Pour les eacutelectrodes graphiteCNWs120s et graphiteCNWs60s on mesure une

surface de 025 cm2 et 018 cm2 respectivement Ces reacutesultats sont infeacuterieurs agrave la surface

geacuteomeacutetrique du graphite qui est de 038 cm2 Cette sous-estimation manifeste de la surface de

lrsquoeacutelectrode peut reacutesulter de lrsquohydrophobiciteacute de la surface On a donc traiteacute la surface de

lrsquoeacutelectrode graphiteCNWs60s par jet plasma agrave la pression atmospheacuterique dans des conditions

de traitement plasma utiliseacutees dans le cadre drsquoun travail anteacuterieur de fonctionnalisation de la

surface du graphite nu (sans nanowalls de carbone) [3] afin de rendre la surface des nanowalls

300 295 290 285 280 2750

10

20

30

40

50

60

70

80

Inte

nsi

teacute


spectre C1s

C sp2

C sp3

C-O

C=O

ligne de base

enveloppe


118

de carbone hydrophile Apregraves ce traitement on a mesureacute une surface eacutelectroactive de 12 cm2

qui est certes trois fois supeacuterieure agrave la surface geacuteomeacutetrique mais ne semble pas ecirctre en

adeacutequation avec les images obtenues par MEB

Figure IV14 A gauche voltampeacuterogrammes drsquoune eacutelectrode A) graphiteCNWs60s B)

graphiteCNWs120s et C) graphiteCNWs60s fonctionnaliseacutee par traitement plasma agrave

pression atmospheacuterique dans une solution 5 mM de [Fe(CN)6]3-[Fe(CN)6]

4- en utilisant

comme sel de fond 01 M de KCl et agrave droite les droites anodiques et cathodiques ip = f (v12)

correspondantes

A

B

C


119

IV23Performances drsquoune eacutelectrode graphiteCNWs essais preacuteliminaires

Ardhaoui et al [3] ont fonctionnaliseacute par jet plasma agrave la pression atmospheacuterique des

eacutelectrodes de graphite en utilisant comme gaz plasmagegravene de lrsquooxygegravene de lrsquoair ou de lrsquoazote

Le dispositif expeacuterimental de traitement plasma APPJ est identique au notre Ils ont immobiliseacute

sur ces eacutelectrodes la laccase de Trametes versicolor et ont eacutetudieacute lrsquoeffet de la variation de divers

paramegravetres de traitement plasma tels que le Plasma Cycle Time (100 50 ou 30 ) le nombre

de passage de la torche sur lrsquoeacutechantillon (1 ou 3 passages) et le type de gaz plasmagegravene

(oxygegravene air ou azote) La distance torche-eacutechantillon la freacutequence de pulsation et la vitesse

de deacuteplacement de la torche eacutetant eacutegales agrave 1 cm 21 kHz et 15 mmin respectivement Ils ont

obtenu des densiteacutes de courants maximales de lrsquoordre de -100 microAcm2 apregraves lrsquoimmobilisation

covalente de la laccase pour un PCT de 100 et un seul passage de la torche ou un PCT de 30

et trois passages de la torche sur le graphite Dans notre travail on a deacutecideacute de fixer le PCT

agrave 80 la distance entre la torche et lrsquoeacutechantillon agrave 1 cm la vitesse de deacuteplacement de la torche

agrave 10 mmin le deacutebit de gaz agrave 2000 Lh la freacutequence agrave 21 kHz et le nombre de passages de la

torche agrave 1 ou 2 passages Deux types de gaz plasmagegravene ont aussi eacuteteacute utiliseacutes (azote ou air)

Lrsquoenzyme a eacuteteacute immobiliseacutee agrave la surface de lrsquoeacutelectrode soit par adsorption soit par greffage

covalent en utilisant lrsquoagent de couplage EDC-NHS quelques minutes apregraves la

fonctionnalisation des eacutelectrodes par plasma agrave la pression atmospheacuterique

IV231Analyse XPS apregraves traitement APPJ


ayant subi un traitement APPJ avec un seul passage de la torche A) agrave lrsquoair et B) agrave N2

On observe drsquoapregraves les spectres XPS (Figure IV13 et Figure IV15) un eacutelargissement du

pic C1s apregraves traitement plasma (azote ou air) avec notamment lrsquoapparition drsquoun pic agrave 2884 eV

300 295 290 285 280 275

0

10

20

30

40

50

60

Inte

nsi

teacute (

10

3)


spectre C1s

C sp2

C sp3

C-N C-O

C=N C=O

COOH

ligne de base

enveloppe

300 295 290 285 280 275

0

10

20

30

40

50

60

Inte

nsi

teacute (

10

3)


spectre C1s

C sp2

C sp3

C-N C-O

C=N C=O

COOH

ligne de base

enveloppe

A B


120

caracteacuteristique des groupements carboxyliques Le traitement plasma (azote ou air) a aussi

permis de creacuteer des groupements azoteacutes agrave la surface des eacutelectrodes Drsquoapregraves le Tableau IV2

on observe que le ratio OC a eacuteteacute multiplieacute par environ dix pour les deux types de traitement et

que ce ratio est dix fois supeacuterieur au ratio NC Ceci laisse agrave penser que nous avons agrave la surface

des eacutelectrodes graphiteCNWs majoritairement des groupements oxygeacuteneacutes

Dans le cas de la variation du nombre de passage de la torche sur lrsquoeacutechantillon on note une

augmentation du ratio Csp3Csp2 et du pourcentage en groupements carboxyliques lorsque le

nombre de passages augmente pour les deux types de gaz plasmagegravene Le ratio NC est constant

et assez faible

Les groupements carboxyliques ont eacuteteacute quantifieacutes par XPS (Tableau IV3) Les reacutesultats

montrent que le plasma agrave lrsquoazote permet drsquoavoir une plus grande densiteacute en groupements

carboxyliques que le plasma agrave lrsquoair Ce reacutesultat est contre intuitif Certes le gaz plasmagegravene est

de lrsquoazote mais le traitement plasma srsquoeffectue agrave lrsquoair agrave la pression atmospheacuterique drsquoougrave la

preacutesence drsquooxygegravene qui permet de former des groupements oxygeacuteneacutes Par ailleurs on observe

que lrsquoaugmentation du nombre de passage srsquoaccompagne par une augmentation de la densiteacute

des COOH

Tableau IV2 Spectres XPS C1s et leur deacutecomposition pour les diffeacuterentes conditions de

traitement plasma (pourcentages et ratios)

Energie de liaison (eV) 2846 2854 2863 2872 2884 OC NC

Csp3

Csp2 Composition C sp2 C sp3 C-O C=O COOH

Traitement plasma agrave lrsquoazote

graphiteCNWs60s 1p 665 163 81 58 30 015 8610-3 024

graphiteCNWs120s 1p 658 157 86 70 29 015 0011 023

2p 640 164 98 65 31 016 0011 025

Traitement plasma agrave lrsquoair

graphiteCNWs60s 1p 715 132 74 57 20 012 001 018

2p 669 149 84 69 30 014 0011 022

graphiteCNWs120s 1p 680 142 75 80 23 014 8410-3 020

2p 642 165 86 78 30 016 0011 025

1p = 1 passage 2p = 2 passages


121

Tableau IV3 Quantification des groupements carboxyliques preacutesents agrave la surface des

eacutelectrodes graphiteCNWs pour les diffeacuterentes conditions de traitement plasma (APPJ)

COOH (10-9 molcm2) COOH (1014 moleacuteculescm2)


graphiteCNWs60s 1p 17 102


2p 18 109



2p 17 102


2p 17 102

IV232Performances bioeacutelectrobiocatalytiques

La quantification du courant de reacuteduction du dioxygegravene biocatalyseacutee par la laccase sur les

eacutelectrodes graphiteCNWs a eacuteteacute effectueacutee agrave un potentiel eacutegal agrave 02 VECS un potentiel ougrave aucun

courant faradique ne peut ecirctre observeacute en lrsquoabsence drsquooxygegravene dans la solution (Figure IV16)

On a aussi effectueacute les mesures de courants sur du graphite nu (sans nanowalls de carbone) afin

de pouvoir comparer les reacutesultats entre une surface nanostructureacutee et une surface eacutelectroactive

de graphite eacutegale agrave 080 cm2 (Chapitre III) On constate tout drsquoabord que les eacutelectrodes

graphiteCNWs120s permettent geacuteneacuteralement drsquoobtenir des densiteacutes de courants plus

importantes que les eacutelectrodes graphiteCNWs60s La densiteacute de courant la plus importante a

eacuteteacute observeacutee dans le cas drsquoune eacutelectrode graphiteCNWs120s ayant subi un traitement plasma

agrave lrsquoazote et sur laquelle la torche nrsquoa effectueacute qursquoun seul passage On a mesureacute une densiteacute de

courant eacutegale agrave -4334 plusmn 219 microAcm2 On a reacuteussi agrave multiplier par huit la densiteacute de courant par

comparaison agrave une surface de graphite nu Concernant le type de gaz plasmagegravene on observe

qursquoun plasma azote permet drsquoobtenir de meilleures densiteacutes de courant qursquoun plasma air Ceci

peut ecirctre expliqueacute par la preacutesence drsquoune plus grande densiteacute de groupements carboxyliques agrave la

surface des eacutelectrodes Dans le cas de la variation du nombre de passage on remarque qursquoun

deuxiegraveme passage de la torche plasma sur les deux types drsquoeacutelectrodes (graphiteCNWs60s et

graphiteCNWs120s) diminue les courants de reacuteduction mis agrave part dans le cas de lrsquoeacutelectrode

graphiteCNW120s ayant subi avant greffage de la laccase un traitement plasma drsquoair en 2

passages (-4895 plusmn 70 microAcm2) Cette diminution geacuteneacuterale des densiteacutes de courant mesureacutees


122

peut ecirctre expliqueacutee par lrsquoaugmentation du ratio Csp3Csp2 La preacutesence drsquoune quantiteacute plus

importante de carbone sp3 induit une baisse de la conductiviteacute du mateacuteriau de lrsquoeacutelectrode et peut

ainsi expliquer cette baisse de courant Concernant le type drsquoimmobilisation on constate que

quelles que soient les conditions de traitement plasma lrsquoimmobilisation de la laccase par

adsorption fournit les densiteacutes de courants les plus faibles La plus faible densiteacute de courant (-

239 microAcm2) a eacuteteacute mesureacutee pour une eacutelectrode graphiteCNWs120s ayant subi un traitement

plasma azote et sur laquelle la torche a effectueacutee deux passages

Figure IV16 Densiteacutes de courant obtenues pour les diffeacuterentes conditions de traitement

APPJ formation des CNWs et drsquoimmobilisation de la laccase

1 passage 2 passages0

50

100

150

200

250

300

350

-J (

microA

cm

2)

CNWs 60s plasma air

covalent

adsorption


50

100

150

200

250

300

350

-J (

microA

cm

2)

CNWs 60s plasma azote

covalent

adsorption


100

200

300

400

500

600

-J (

microA

cm

2)

CNWs 120s plasma air

covalent

adsorption


100

200

300

400

500

600

-J (

microA

cm

2)


covalent

adsorption

0

100

200

300

400

500

600

adsorption

2 passages

adsorption

1 passage

liaison amide

2 passages

liaison amide

1 passage

Plasma air

-J (

microA

cm

2)

graphiteCNWs120s

graphiteCNWs60s

graphite

0

100

200

300

400

500

600

adsorption

2 passages

adsorption

1 passage

liaison amide

2 passages

-J (

microA

cm

2)

Plasma azote

graphiteCNWs120s

graphiteCNWs60s

graphite

liaison amide

1 passage


123

IV24Optimisation des conditions de traitement plasma par la mise en place de

plans drsquoexpeacuteriences

Lrsquoobjectif ultime de cette eacutetude est drsquooptimiser les paramegravetres de fonctionnalisation des

eacutelectrodes graphiteCNWs Pour rappel les conditions de traitement plasma des expeacuteriences

preacuteliminaires dont les reacutesultats sont exposeacutes dans les paragraphes preacuteceacutedents de ce chapitre

sont une distance entre la torche et le support eacutegale agrave 1 cm une vitesse de deacuteplacement de la

torche de 10mmin un PCT de 80 et une freacutequence de pulsation de la deacutecharge de 21kHz

et un deacutebit de gaz de 2000 Lh On a fait varier le nombre de passages de la torche sur

lrsquoeacutechantillon (un ou deux passages) ainsi que le type du gaz introduit dans la torche plasma (air

ou azote) Suite agrave cette eacutetude on a conclu que lrsquoutilisation de lrsquoazote comme gaz plasmagegravene et

un seul passage de la torche permettaient drsquoobtenir des courants catalytiques de reacuteduction du

dioxygegravene plus importants Globalement ces reacutesultats nous ont ameneacutes agrave dire que les conditions

de traitement plasma laquo douces raquo conduisent agrave de meilleurs reacutesultats en termes de courant

Dans une recherche de ce type de traitement plasma on a tout drsquoabord essayeacute drsquoutiliser une

torche agrave buse rotative Ce type de torche geacutenegravere un plasma moins agressif qursquoune torche agrave buse

fixe et nous a permis drsquoobtenir de meilleurs reacutesultats en terme de courant de reacuteduction du

dioxygegravene On a mesureacute une densiteacute de courant eacutegale agrave -3005 microAcm2 en utilisant lrsquoazote en

tant que gaz plasma et en effectuant deux passages sur lrsquoeacutechantillon (les autres paramegravetres eacutetant

identiques agrave ceux utiliseacutes pour la torche agrave buse fixe) Cependant le risque drsquoun traitement non

homogegravene du support par une torche agrave buse rotative est grand En effet cette derniegravere effectue

des mouvements circulaires lors de son deacuteplacement et certaines zones risquent drsquoecirctre non

traiteacutees sur lrsquoeacutechantillon On a donc choisi de continuer agrave utiliser la torche agrave buse fixe mais en

modifiant les conditions expeacuterimentales du traitement plasma Etant limiteacutes en terme de nombre

drsquoeacutechantillons (les CNWs sont fabriqueacutes au Japon) on a deacutecideacute drsquoeffectuer dans un premier

temps lrsquoeacutetude drsquooptimisation sur du substrat graphitique nu

IV241Optimisation des conditions de traitement plasma atmospheacuterique sur eacutelectrodes

de graphite nu

IV2411Plan drsquoexpeacuterience factoriel fractionnaire

Dans un premier temps on a mis en œuvre un plan drsquoexpeacuterience factoriel fractionnaire

Lrsquoobjectif est de deacuteterminer les facteurs influents de fonctionnalisation des eacutelectrodes graphite

nu parmi les principaux paramegravetres expeacuterimentaux deacuteterminant le traitement plasma Les


124

facteurs susceptibles drsquoavoir une influence sur le traitement plasma sont au nombre de quatre

(on garde la freacutequence de pulsation constante et eacutegale agrave 21 kHz) On aura donc un plan faisant

intervenir quatre facteurs prenant chacun deux niveaux (un niveau bas et un niveau haut) crsquoest-

agrave-dire un plan agrave 24-1 (huit expeacuteriences) On distingue

-Le Plasma Cycle Time (PCT) Lrsquoappareil laquo plasmatreat raquo permet de produire deux reacutegimes de

puissance bien distincts un reacutegime agrave faible puissance (PCT entre 10 et 40) et un reacutegime agrave

haute puissance (PCT entre 70 et 100 ) On a choisi deux valeurs chacune repreacutesentatives

drsquoun des reacutegimes (30 et 80 )

-La distance seacuteparant la torche du substrat permet de controcircler drsquoune part lrsquoeffet thermique du

plasma sur lrsquoeacutechantillon et drsquoautre part de modifier la fonctionnalisation de surface Elle a eacuteteacute

seacutelectionneacutee suite agrave des mesures drsquoangle de contact en faisant varier cette distance entre 05 cm

et 20 cm en gardant comme conditions de traitement un PCT de 80 une vitesse de 10 mmin

un deacutebit de 2000 Lh et de lrsquoazote en tant que gaz plasmagegravene (Figure IV17) On a observeacute

que lorsque la distance entre la torche et le substrat augmente la surface devient de moins en

moins hydrophile (Figure IV18 Tableau IV4) puisque lrsquoangle θ augmente en fonction de la

distance Les expeacuterimentations reacutealiseacutees sur les eacutelectrodes graphiteCNWs dans la partie

preacuteceacutedente ont eacuteteacute effectueacutees agrave une distance de 1 cm On a fixeacute comme niveau bas une distance

eacutegale agrave 1 cm et choisi comme niveau haut une distance eacutegale agrave 15 cm pour ne pas avoir une

surface drsquohydrophobiciteacute trop eacuteleveacutee comme le montrent les reacutesultats drsquoangle de contact

Lrsquohypothegravese que lrsquoon fait agrave ce stade de lrsquoeacutetude drsquoavoir une surface assez hydrophile afin de

pourvoir par la suite y greffer lrsquoenzyme

Figure IV17 Clicheacutes obtenus lors de la mesure drsquoangles de contact Une goutte drsquoeau (V =

1microL) est deacuteposeacutee agrave la surface du substrat pour une distance de traitement plasma entre la

torche et lrsquoeacutechantillon eacutegale agrave 10 cm agrave gauche et 20 cm agrave droite


125

Tableau IV4 Variation de lrsquoangle θ en fonction de la distance de traitement plasma APPJ sur

graphite nu

Ndeg d (cm) Angle θ (deg)

1 05 165 plusmn 23

2 07 280 plusmn 30

3 10 248 plusmn 02

4 12 391 plusmn 13

5 15 590 plusmn 13

6 17 751 plusmn 11

7 2 966 plusmn 10

Figure IV18 Evolution de lrsquoangle de contact eausubstrat graphitique en fonction de la

distance de la torche

-La vitesse de deacuteplacement de la torche deacutetermine la dureacutee de contact entre le plasma et

lrsquoeacutechantillon Plus elle est grande plus la dureacutee de traitement sera faible On a fixeacute comme

niveau bas une vitesse de 10 mmin et comme niveau haut une vitesse de 20 mmin

-Le deacutebit du gaz plasmagegravene caracteacuterise aussi la puissance du plasma A puissance constante

le fait drsquoaugmenter le deacutebit diminue lrsquointensiteacute du plasma Lrsquoeacutenergie disponible est distribueacutee

entre un plus grand nombre de moleacutecules On a choisi un deacutebit de 1000 Lh (niveau bas) et de

2000 Lh (niveau haut)

Le tableau ci-dessous reacutesume les niveaux de variation fixeacutes pour chaque facteur (Tableau IV5)

04 08 12 16 200

20

40

60

80

100

distance torche plasma-eacutechantillon (cm)


126

Tableau IV5 Niveaux et valeurs de chaque facteur eacutetudieacute

Variables (facteurs) Niveaux

-1 1

1 Plasma Cycle Time (PCT) 30 80

2 Distance torche substrat (d) cm 1 15

3 Vitesse de la torche (V) mmin 10 20

4 Deacutebit du gaz plasma (D) Lh 1000 2000

Les conditions expeacuterimentales des huit expeacuteriences du plan factoriel fractionnaire ont eacuteteacute

deacutetermineacutees gracircce agrave un calcul matriciel Elles sont regroupeacutees dans le tableau ci-dessous

(Tableau IV6)

Tableau IV6 Conditions expeacuterimentales du plan drsquoexpeacuteriences factoriel fractionnaire

Ndeg PCT () d (cm) V (mmin) D (Lh)

1 30 1 10 1000

2 80 1 10 2000

3 30 15 10 2000

4 80 15 10 1000

5 30 1 20 2000

6 80 1 20 1000

7 30 15 20 1000

8 80 15 20 2000

Pour chaque combinaison une mesure drsquoangle de contact et une analyse XPS qui a permis

de calculer le taux de recouvrement de la surface par les groupements carboxyliques avant

greffage de lrsquoenzyme ont eacuteteacute reacutealiseacutees Apregraves immobilisation de la laccase des mesures de

courants de reacuteduction du dioxygegravene et drsquoactiviteacute enzymatique de la laccase immobiliseacutee ont eacuteteacute

effectueacutees afin de deacuteterminer les facteurs du traitement plasma les plus significatifs parmi les

quatre testeacutes Comme preacuteciseacute dans le chapitre II la laccase a eacuteteacute greffeacutee de maniegravere covalente

Pour rappel les mesures de courant sont reacutealiseacutees dans un tampon aceacutetate 50 mM pH = 42


127

avec 01 M de NaClO4 Le courant est calculeacute en soustrayant le courant mesureacute dans une

solution satureacutee en oxygegravene au courant mesureacute en absence drsquooxygegravene agrave un potentiel de 02

VECS Lrsquoactiviteacute enzymatique est deacutetermineacutee en utilisant comme substrat lrsquoABTS

Le Tableau IV7 regroupe lrsquoensemble des reacutesultats obtenus Concernant les reacutesultats de

densiteacute de courant on observe que la densiteacute de courant la plus eacuteleveacutee a eacuteteacute obtenue pour

lrsquoexpeacuterience 7 crsquoest-agrave-dire pour un PCT de 30 une distance torche-eacutechantillon eacutegale agrave 15

cm une vitesse de 20 mmin et un deacutebit de 1000 Lh On a mesureacute une densiteacute de courant eacutegale

-1026 microAcm2 Cette densiteacute est deux fois plus eacuteleveacutee que la valeur de reacutefeacuterence (~-537

microAcm2) crsquoest-agrave-dire les densiteacutes de courant mesureacutees sur graphite avant lrsquoeacutelaboration du plan

drsquoexpeacuterience (PCT = 80 d = 1 cm V = 10 mmin et D = 2000 Lh) La densiteacute de courant la

plus faible lors de la reacutealisation de ce plan drsquoexpeacuteriences a eacuteteacute obtenue pour lrsquoexpeacuterience 1

(PCT = 30 d = 1 cm V = 10 mmin et D = 1000 Lh) Ce reacutesultat pourrait ecirctre expliqueacute par

le caractegravere fortement hydrophobe de la surface du graphite

On observe par ailleurs que plus lrsquohydrophobiciteacute de la surface est eacuteleveacutee plus les courants

obtenus sont importants (en ne prenant pas en consideacuteration lrsquoexpeacuterience 1) Le traitement

plasma doit permettre de fonctionnaliser la surface du graphite qui est tregraves hydrophobe avant

traitement (angle θ eacutegale agrave 100deg) en introduisant des groupements fonctionnels hydrophiles

Donc agrave priori on pourrait penser que plus le traitement plasma est efficace crsquoest-agrave-dire plus la

surface traiteacutee est hydrophile et moins lrsquoenzyme adsorbeacutee en surface serait deacutenatureacutee et donc

pourrait donner de forts courants Or les reacutesultats expeacuterimentaux montrent la tendance inverse

Deux hypothegraveses peuvent lrsquoexpliquer le lien nrsquoest pas forceacutement direct entre lrsquoactiviteacute de la

laccase et le courant on peut supposer que lrsquoorientation de lrsquoenzyme agrave la surface a eacutegalement

un rocircle ce qui relativise le raisonnement preacuteceacutedent Drsquoautre part le traitement plasma srsquoil est

trop pousseacute peut conduire agrave des pheacutenomegravenes de gravure de la surface avec pour conseacutequence

une diminution de la conductiviteacute du mateacuteriau drsquoeacutelectrode Ainsi les reacutesultats de lrsquoanalyse XPS

avant et apregraves traitement plasma APPJ montrent une augmentation du pourcentage de carbone

sp3 au deacutetriment du carbone sp2 (Tableaux IV1 et IV2) Concernant lrsquoactiviteacute enzymatique et

le taux de recouvrement aucune correacutelation ne peut ecirctre deacutegageacutee avec les densiteacutes de courant

mesureacutees Dans le cas de la quantification des groupements carboxyliques par la meacutethode

chimique les taux de recouvrement sont assez proches quel que soit le type de traitement On

note de plus que les valeurs de densiteacute des groupements carboxyliques toujours supeacuterieures agrave


128

10-8 molcm2 sont tregraves eacuteleveacutees Des reacutesultats similaires ont eacuteteacute rapporteacutes dans le travail de M

Zheng dans le cas de graphite fonctionnaliseacute par electroreacuteduction du 4-carboxybenzegravene

diazonium [42] A titre de comparaison la densiteacute atomique des atomes de carbone graphite est

eacutegale agrave 73 10-9 molcm2 sur le plan basal Il parait peu vraisemblable que le traitement plasma

ait pu conduire agrave une densiteacute de groupements fonctionnels supeacuterieure agrave cette valeur On peut

donc penser que la densiteacute de groupements carboxyliques deacutetermineacutee par la meacutethode au TBO

est largement surestimeacutee

Tableau IV7 Caracteacuterisation des eacutelectrodes de graphite fonctionnaliseacutees en fonction des

conditions de traitement par plasma APPJ fixeacutees selon le plan drsquoexpeacuterience fractionnaire

Ndeg Angle θ (deg) -J (microAcm2) Activiteacute

(microUcm2)

Recouvrement

COOH

(times10-8 molcm2)

1 97 361 11 3 422

2 248 638 105 394

3 557 648 129 390

4 381 633 61 330

5 351 796 45 417

6 457 829 53 435

7 709 1026 32 436

8 684 975 168 485

La meacutethode de Pareto a eacuteteacute ensuite utiliseacutee afin de classer les facteurs par ordre croissant

drsquoinfluence (Figure IV19) Pour le courant les facteurs les plus significatifs (coefficients dont

la somme des Pi est supeacuterieure agrave 80 ) sont la distance torche-eacutechantillon (brsquo2) et la vitesse de

deacuteplacement de la torche (brsquo3) Plus ils augmentent plus le courant est eacuteleveacute Pour lrsquoactiviteacute

enzymatique le deacutebit de gaz plasma est lrsquounique facteur fort (brsquo4) Le temps de traitement

intervient aussi dans deux interactions fortes Le PCT (brsquo1) nrsquoest jamais un facteur fort (sauf

dans le cas de lrsquoactiviteacute enzymatique (brsquo13) mais il est cependant difficile drsquointerpreacuteter des

interactions aliaseacutees entre elles) Pour les mesures drsquoangle de contact les facteurs forts sont


129

aussi la distance et la vitesse de traitement Plus ils augmentent meilleur est le courant On peut

donc conclure que ces deux facteurs sont les plus importants

Figure IV19 Pi calculeacutes par la meacutethode Pareto et classeacutes par ordre deacutecroissant pour

diffeacuterentes caracteacuteristiques cible A) le courant catalytique de reacuteduction B) lrsquoactiviteacute

enzymatique C) angle de contact et D) le taux de recouvrement en COOH

En conclusion ce plan factoriel fractionnaire nous a permis de deacuteterminer les facteurs ayant

une influence sur les performances des eacutelectrodes Ce sont la distance et la vitesse de la torche

plasma On a dans un deuxiegraveme temps deacutecideacute drsquoeffectuer un nouveau type de plan drsquoexpeacuterience

dans lequel nous ferons varier uniquement ces deux facteurs tout en gardant les autres fixes

ceci afin drsquoaffiner les paramegravetres de fonctionnalisation par plasma et de consolider les reacutesultats

obtenus

A B

C D


130

IV2412Plan drsquoexpeacuterience composite

Le plan drsquoexpeacuterience choisi est de type composite Il permet drsquoaffiner les reacutesultats obtenus

avec le plan fractionnaire en explorant un espace expeacuterimental proche des conditions

expeacuterimentales les plus favorables mises en eacutevidence par le plan fractionnaire et plus dense afin

drsquoespeacuterer localiser un optimum On a fixeacute un deacutebit de gaz agrave 2000 Lh et un PCT agrave 80 On a

obtenu les meilleurs reacutesultats en densiteacute de courant avec un PCT agrave 30 mais cette option a eacuteteacute

eacutecarteacutee En effet drsquoune part lrsquoanalyse Pareto a montreacute que le PCT nrsquoest pas un facteur

deacuteterminant ce que lrsquoon observe notamment en comparant les expeacuteriences 7 et 8 qui conduisent

agrave une densiteacute de courant du mecircme ordre aux erreurs expeacuterimentales pregraves Drsquoautre part on a

estimeacute qursquoil est preacutefeacuterable pour lrsquoeacutetape drsquoimmobilisation de lrsquoenzyme de ne pas avoir une

surface trop hydrophobe qui risque de conduire agrave une deacutenaturation de lrsquoenzyme On a fait varier

la distance entre la torche et lrsquoeacutechantillon (facteur 1) et la vitesse de deacuteplacement de la torche

(facteur 2) dans des intervalles [1 2] et [20 50] respectivement Le Tableau IV8 regroupe les

diffeacuterentes combinaisons des conditions expeacuterimentales du plan composite pour les deux

facteurs testeacutes

Tableau IV8 Conditions expeacuterimentales du plan drsquoexpeacuterience composite

Ndeg d (cm) V (mmin)

1 120 240

2 160 240

3 120 420

4 160 420

5 112 330

6 168 330

7 140 203

8 140 457

9 140 330

On a mesureacute pour chacune des expeacuteriences deacutecrites dans le Tableau IV7 les densiteacutes de

courant de reacuteduction du dioxygegravene par la laccase immobiliseacutee de faccedilon covalente quelques

minutes apregraves la fonctionnalisation du graphite (Tableau IV9)


131

Tableau IV9 Performances eacutelectrocatalytiques des eacutelectrodes graphite preacutepareacutees selon le plan

drsquoexpeacuterience composite

Expeacuterience d (cm) V (mmin) -J (microAcm2)

1 12 240 1044

2 16 240 947

3 12 420 959

4 16 420 1151

5 11 330 182

6 17 330 1097

7 14 203 977

8 14 457 824

9 14 330 407

La densiteacute de courant la plus importante -1151 microAcm2 a eacuteteacute obtenue pour une vitesse de

420 mmin et une distance de 16 cm On remarque par ailleurs que mis agrave part les expeacuteriences

5 et 9 les densiteacutes de courant mesureacutees sont assez proches les unes des autres quelles que soit

la valeur de la vitesse et la distance de la torche au substrat Ceci pourrait laisser agrave penser qursquoon

aurait atteint les limites drsquooptimisation du systegraveme La Figure IV21 compare les valeurs

expeacuterimentales des courants catalytiques drsquoORR (valeurs en vert) avec celles calculeacutees agrave partir

du modegravele polynomial (valeurs en noir) dont les paramegravetres ont eacuteteacute deacutetermineacutes gracircce au plan

drsquoexpeacuterience On observe que si certains points sont bien preacutedits par le modegravele avec un eacutecart

relatif entre 1 et 6 (les points noirs) drsquoautres (les points rouges) ont un eacutecart assez important

Par ailleurs on constate que dans la partie droite de la Figure IV20 entoureacutee drsquoun trait bleu le

courant varie peu quelles que soient les conditions opeacuteratoires de la fonctionnalisation plasma

Cette zone peut ecirctre qualifieacutee de robuste


132

Figure IV20 Comparaison entre les courants catalytiques de reacuteduction de lrsquooxygegravene

(microAcm2) expeacuterimentaux (valeurs en vert) et les reacutesultats preacutedits par le modegravele (valeurs en

noir) dans le domaine expeacuterimental

On a aussi chercheacute agrave identifier par analyse XPS les groupements fonctionnels preacutesents agrave la

surface des eacutechantillons graphite apregraves leur fonctionnalisation par plasma APPJ selon le plan

composite On observe apregraves deacutecomposition du pic C1s des spectres drsquoXPS (Figure IV21)

lrsquoabsence de pic agrave 2885 eV caracteacuteristique des groupements carboxyliques et ce quelles que

soit la vitesse et la distance de la torche Le pic agrave 2875 eV reacutevegravele la preacutesence de groupements

carbonyles mais ne permet pas de distinguer srsquoil srsquoagit de ceacutetones ou de groupements aldeacutehydes

Figure IV21 Spectre XPS et deacutecomposition du pic C1s pour les conditions de traitement

plasma d = 16 cm et V = 24 mmin (agrave partir du plan composite)

11 12 13 14 15 16 17

20

25

30

35

40

45

50

808 1011

64 1132

521 1013

1044

1011

407

1044 946

959 1151

182 1097

977

824

407

Vite

sse

(m

min

)

Distance (cm)

300 295 290 285 280 275-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Inte

nsi

teacute (

10

3)


spectre C1s

C sp2

C sp3

C-O

C=O

ligne de base

enveloppe


133

Figure IV22 Spectre XPS et deacutecomposition du pic Cl2p drsquoune eacutelectrode de graphite

issu du plan composite (expeacuterience 7) apregraves greffage de la moleacutecule (hydrazide)

On a donc essayeacute de mettre en eacutevidence et de quantifier ce dernier type de groupements

fonctionnels en ayant recours agrave une moleacutecule sonde (2-chlorobenzohydrazide) Celle-ci apregraves

reacuteaction sur les groupements aldeacutehydes de surface srsquoils existent forme une hydrazone qui

pourra ecirctre deacutetecteacutee par XPS gracircce au signal du chlore eacuteleacutement uniquement preacutesent sur la

moleacutecule sonde La Figure IV22 preacutesente un extrait du spectre XPS du support fonctionnaliseacute

par plasma apregraves reacuteaction avec la moleacutecule sonde autour de 200 eV lrsquoeacutenergie repreacutesentative de

Cl2p Cette figure montre que le pic Cl2p preacutesente deux pics agrave 2006 eV et 2022 eV qui sont

caracteacuteristiques du chlore organique La preacutesence de ces deux pics permet de confirmer que la

sonde a bien eacuteteacute greffeacutee agrave la surface du substrat et qursquoil existe donc des fonctions aldeacutehydes agrave

la surface apregraves fonctionnalisation dans les conditions preacutesenteacutees dans le Tableau IV9 Le

Tableau IV10 regroupe la densiteacute de groupements aldeacutehydes de surface deacuteduite des taux de

recouvrement de lrsquohydrazide chlorobenzoiumlque

Tableau IV10 Taux de recouvrement des groupements aldeacutehydes pour les diffeacuterentes

conditions de traitement plasma

d (cm) V (mmin) ICl2pIC1s nCl2ptimesd (times10-9 molcm2)

16 24 00467 625

14 203 00396 522

15 20 00387 490

16 42 00370 452

1 10 00459 608

215 210 205 200 195 19000

01

02

03

04

05

06

07

08

Inte

nsi

teacute (

10

3)



134

La preacutesence de groupements aldeacutehydes agrave la surface du support permettrait drsquoimmobiliser

lrsquoenzyme par formation drsquoune liaison covalente entre les amines de la laccase et les

groupements aldeacutehydes du support

En conclusion lrsquoutilisation du plan drsquoexpeacuterience composite a permis drsquoidentifier cinq

conditions expeacuterimentales du traitement APPJ du graphite dans lesquelles on a obtenu des

courants catalytiques supeacuterieurs agrave -95 microAcm2 contre deux conditions dans le plan

drsquoexpeacuteriences factoriel fractionnaire Adoucir les conditions de traitement allait donc bien dans

le bon sens On a donc choisi pour la suite des expeacuteriences de travailler dans la zone dite robuste

et de tester ces conditions sur les eacutechantillons de graphiteCNWs

IV25Performances des eacutelectrodes graphiteCNWs dans les conditions de

traitement plasma optimiseacutees

IV251Electrodes graphiteCNWs60s

On a dans un premier temps travailleacute avec les eacutechantillons graphiteCNWs formeacutes en 60 s

de traitement plasma afin de veacuterifier que les conditions drsquooptimisation deacutetermineacutees avec le plan

drsquoexpeacuterience composite sur des surfaces de graphite laquo nu raquo sont transposables aux surfaces

nanostructureacutees de type CNWs

IV2511Conditions de traitement plasma issues du plan drsquoexpeacuterience composite avec

eacutelectrodes de graphiteCNWs60s

On a choisi de garder les quatre conditions opeacuteratoires les plus robustes parmi celles des

plans drsquoexpeacuteriences reacutealiseacutees sur les eacutelectrodes de graphite Les conditions du traitement plasma

ulteacuterieur de fonctionnalisation agrave pression atmospheacuterique sont reacutepertorieacutees dans le Tableau

IV11 A titre de comparaison on a eacutegalement traiteacute des eacutechantillons de graphiteCNWs60s

selon les paramegravetres des expeacuteriences preacuteliminaires agrave savoir d=1 cm et V= 10 mmin Lrsquoenzyme

a ensuite eacuteteacute immobiliseacutee agrave la surface des eacutelectrodes graphiteCNWs60s fonctionnaliseacutees en

utilisant le meacutelange drsquoagent de couplage (EDC-NHS) bien qursquoil ait eacuteteacute montreacute au paragraphe

preacuteceacutedent que les surfaces fonctionnaliseacutees dans les conditions optimales de traitement plasma

(d=16 cm et V=24 mmin) ne permettent pas de former des groupements carboxyliques en

surface ce qui devrait rendre inutile lrsquoutilisation drsquoagent de couplage EDC-NHS dans ce cas

Ce choix des conditions expeacuterimentales drsquoimmobilisation de la laccase a eacuteteacute retenu afin de


135

pouvoir comparer entre elles les diffeacuterentes conditions de traitement plasma avec dans chaque

cas une immobilisation covalente de la laccase en surface

Tableau IV11 Conditions de traitement plasma retenues pour les eacutelectrodes

graphiteCNWs60s


1 16 240

2 14 203

3 15 200

4 16 420

5 1 10

Nous avons comme pour les eacutelectrodes de graphite nu mesureacute pour chacune des

expeacuteriences deacutecrites dans le Tableau IV12 les densiteacutes de courant de reacuteduction de lrsquooxygegravene

et reacutealiseacute une analyse XPS afin de caracteacuteriser la chimie de surface de lrsquoeacutelectrode apregraves

traitement plasma de fonctionnalisation et avant immobilisation de lrsquoenzyme

Tableau IV12 Performances eacutelectrocatalytiques des eacutelectrodes graphiteCNWs60s

Ndeg d (cm) V (mmin) -J (microAcm2)

1 16 240 4404

2 14 203 3688

3 15 200 2163

4 16 420 2769

5 1 10 3122

La densiteacute de courant la plus eacuteleveacutee (-4404 microAcm2) a eacuteteacute mesureacutee avec des conditions de

traitement plasma de 16 cm pour la distance torchesubstrat et une vitesse de la torche de 24

mmin Il faut rappeler qursquoavant la reacutealisation des plans drsquoexpeacuteriences (crsquoest-agrave-dire pour une

distance de 1 cm et une vitesse de 10 mmin) une densiteacute de courant eacutegale agrave -3122 microAcm2

avait eacuteteacute obtenue Le courant apregraves optimisation nrsquoa eacuteteacute multiplieacute que par 14 contrairement au

cas des eacutelectrodes de graphite dit laquo nu raquo pour lequel il est passeacute dans les mecircmes conditions de


136

traitement de -410 agrave plus de -947 microAcm2 On remarque drsquoautre part que comme dans le cas

du graphite laquo nu raquo lrsquoanalyse XPS du pic C1s du carbone montre qursquoil nrsquoy a pas de composante

agrave 288 eV significative pouvant indiquer la preacutesence de groupements carboxyliques en surface

et ce dans aucune des conditions de traitement retenues (Figure IV23) Lrsquoutilisation de

lrsquohydrazide 4-chlorobenzoiumlque suivie drsquoune analyse XPS de la surface ainsi traiteacutee a permis de

mettre en eacutevidence sur les disques de graphite nu (sans nanowalls de carbone) la preacutesence de

groupements aldeacutehydes On a donc supposeacute que lrsquoimmobilisation covalente de la laccase peut

avoir lieu via la formation drsquoune liaison imine entre ces groupements de surface et les lysines

de lrsquoenzyme Ces expeacuteriences de veacuterification de la preacutesence de groupements aldeacutehydes de

surface nrsquoont pas eacuteteacute reacutealiseacutees dans le cas des CNWs60s mais on peut eacutemettre lrsquohypothegravese que

les conditions de traitement plasma APPJ eacutetant identiques agrave celles utiliseacutees sur le graphite nu

les groupements aldeacutehydes sont eacutegalement formeacutes dans ce cas conduisant agrave lrsquoimmobilisation

de la laccase via les groupements amine de ses cinq reacutesidus lysine

Figure IV23 Spectre XPS et deacutecomposition du pic C1s sur graphiteCNWs60s apregraves

fonctionnalisation par traitement plasma APPJ

IV2512Plan Doehlert

On a deacutecideacute drsquoeffectuer un plan drsquoexpeacuterience de Doehlert afin de veacuterifier qursquoon est proche

des conditions de traitement optimales Le Tableau IV13 regroupe les diffeacuterentes combinaisons

testeacutees La Figure IV25 montre les courants bioeacutelectrocatalytiques obtenus dans ces conditions

300 295 290 285 280 275

00

02

04

06

08

10

Inte

nsi

teacute (

10

3)


non traiteacute

d = 10 cm V = 10 mmin

d = 14 cm V = 203 mmin

d = 16 cm V = 42 mmin

d = 15 cm V = 200 mmin

d = 16 cm V = 240 mmin


137

Tableau IV13 Conditions expeacuterimentales du plan de Doehlert


1 16 24

2 16 34

3 18 29

4 18 19

5 16 14

6 14 19

7 14 29

Figure IV24 Repreacutesentation sheacutematique des reacutesultats de courant catalytique de reacuteduction

de lrsquooxygegravene suite agrave la reacutealisation du plan Doehlert

On constate (Figure IV24) que les courants mesureacutes dans les conditions retenues pour le

plan drsquoexpeacuterience de type Doehlert sont toutes tregraves significativement infeacuterieures agrave celles

obtenues dans les conditions dites laquo robustes raquo qui ne sont pourtant pas si diffeacuterentes (excepteacute

pour d=1 cm et V=10 mmin) Ainsi dans les mecircmes conditions de traitement plasma APPJ on

est passeacute drsquoun courant de -4409 microAcm2 agrave -1823 microAcm2 Cette baisse significative reste

inexpliqueacutee Cela nrsquoempecircche pas de pouvoir comparer les reacutesultats obtenus On observe

qursquoavec les plans Doehlert et composite les conditions optimales de traitement plasma sont

identiques agrave savoir une distance de d=16 cm et une vitesse V=24 mmin

10 15 20 25 30 35

14

15

16

17

18

1823 1024

802404

654

885 1053

Vit

esse

(m

min

)

Distance (cm)


138

IV252Electrode graphiteCNWs120s

Les conditions dites laquo robustes raquo et conduisant aux courants les plus eacuteleveacutes qui ont eacuteteacute

deacutetermineacutees par mise en œuvre drsquoun plan drsquoexpeacuterience composite sur des eacutelectrodes de graphite

nu srsquoeacutetant aveacutereacutees optimales eacutegalement pour des eacutelectrodes nanostructureacutees de type

graphiteCNWs60s les mecircmes conditions ont eacuteteacute utiliseacutees pour traiter les eacutelectrodes

graphiteCNWs120s (Tableau IV14)

Tableau IV14 Performances eacutelectrocatalytiques des eacutelectrodes preacutepareacutees selon les conditions

robustes retenues agrave partir du plan drsquoexpeacuterience composite pour les eacutelectrodes

graphiteCNWs120s


1 16 240 1930 plusmn 1019

2 14 203 3805 plusmn 324

3 15 200 4258 plusmn 575

4 16 420 2274 plusmn 1052

5 1 10 4334plusmn 219

On observe sur la base des courants mesureacutes que les conditions optimales du traitement

plasma APPJ sont une distance de 15 cm et une vitesse de 20 mmin On a mesureacute dans ce cas

une densiteacute de courant eacutegale agrave -4258 microAcm2 soit un courant plus de deux fois plus eacuteleveacute que

dans les conditions qui ont permis drsquoobtenir un courant maximum dans le cas du

graphiteCNWs60S agrave savoir d=16 cm et V=24 mmin Pour chacun des types de nanowalls

eacutetudieacutes le courant maximal obtenu est similaire agrave savoir de lrsquoordre de -400 microAcm2 bien que

ce courant ait eacuteteacute mesureacute dans des conditions de traitement plasma leacutegegraverement diffeacuterentes De

plus et de faccedilon encore plus affirmeacutee que dans le cas du graphiteCNWs60s lrsquooptimisation des

conditions de traitement par plasma APPJ via la mise en œuvre drsquoun plan drsquoexpeacuteriences nrsquoa pas

permis drsquoameacuteliorer le courant de faccedilon significative

Dans le cas des eacutelectrodes nanostructureacutees que ce soit graphiteCNWs120s ou

graphiteCNWs60s on observe que contrairement agrave ce qui a eacuteteacute obtenu avec le graphite nu

des courants significativement diffeacuterents sont obtenus dans les quatre conditions fixeacutees On ne

peut donc plus parler dans ce cas dlsquoune zone laquo robuste raquo de traitement plasma Toutefois si on


139

tient compte des erreurs expeacuterimentales mesureacutees on pourrait eacutevaluer agrave environ -300 microAcm2

le courant laquo moyen raquo obtenu

IV2521Immobilisation de la laccase oxydeacutee

Lrsquoeacutetude des surfaces de type a-CNx a montreacute au chapitre II que les courants

eacutelectrocatalytiques les plus eacuteleveacutes ont eacuteteacute obtenus avec une laccase oxydeacutee Comme drsquoautre

part les analyses XPS ont montreacute que les surfaces de graphite nanostructureacutees contiennent

apregraves fonctionnalisation par plasma APPJ de lrsquoazote (en moyenne un rapport molaire NC de

10-2) on peut de plus eacutemettre lrsquohypothegravese que la laccase oxydeacutee pourrait ecirctre immobiliseacutee de

faccedilon covalente par formation drsquoune liaison imine entre ses groupements glycosidiques oxydeacutes

et les amines en surface des nanowalls de carbone ce qui pourrait conduire agrave une orientation

diffeacuterente de lrsquoenzyme en surface et peut-ecirctre plus favorable agrave lrsquoeacutelectrocatalyse Nous avons

donc compareacute les performances drsquoune eacutelectrode nanostructureacutee puis fonctionnaliseacutee et enfin

bioeacutelectroactive par immobilisation soit de laccase naturelle soit oxydeacutee Dans les deux cas

lrsquoazote constitue le gaz plasmagegravene le deacutebit du gaz est de 2000 Lh le PCT est eacutegal agrave 80 et

la torche nrsquoeffectue qursquoun seul passage sur lrsquoeacutechantillon Dans la premiegravere seacuterie drsquoexpeacuteriences

(set de conditions 1) on fixe une distance torchesubstrat eacutegale agrave 16 cm et une vitesse de la

torche de 24 mmin Ce sont les conditions de traitement plasma deacutetermineacutees avec le plan

drsquoexpeacuterience composite qui permettent drsquoobtenir le plus fort courant sur les eacutelectrodes

graphiteCNWs60s Le deuxiegraveme groupe de conditions est une distance de 1 cm et 10 mmin

(set de condition 2) crsquoest-agrave-dire les valeurs des paramegravetres du plasma utiliseacutees lors des essais

preacuteliminaires avec le graphite

Dans le cas des eacutelectrodes graphiteCNWs60s on constate (Figure IV 25) que le set de

conditions 1 permet drsquoavoir les meilleurs courants catalytiques et ce quelle que soit la forme de

la laccase Par ailleurs on observe que pour un mecircme set de conditions de traitement laccase

oxydeacutee ou non les courants sont assez proches Ceci pourrait ecirctre expliqueacute par le fait que dans

les deux sets de conditions de traitement plasma APPJ les groupements fonctionnels preacutesents

agrave la surface sont soit des groupements carboxyliques (set de conditions 2) soit des groupements

aldeacutehydes (set de conditions 1) Dans les deux cas la laccase sera donc potentiellement

immobiliseacutee uniquement via le groupement amine de ses reacutesidus lysines soit par formation

drsquoune liaison amide lorsque la laccase est non oxydeacutee (set de conditions 2) soit par formation


140

drsquoune liaison imine lorsque lrsquoenzyme est sous forme oxydeacutee (set de conditions 1) Ces deux

scheacutemas drsquoimmobilisation conduisent agrave une mecircme orientation de lrsquoenzyme ce qui conduirait agrave

des courants du mecircme ordre de grandeur

Figure IV25 Densiteacutes de courant obtenues pour les diffeacuterents sets de conditions de

traitement plasma des eacutelectrodes graphiteCNWs60s apregraves avoir immobiliseacute la laccase oxydeacutee

ou la laccase naturelle

Dans le cas du graphiteCNWs120s on a eacutelargi la comparaison entre laccase naturelle et

oxydeacutee agrave plusieurs types drsquoimmobilisation agrave savoir par adsorption ou par greffage covalent

avec ou sans agent de couplage On remarque que quelles que soient les conditions de traitement

plasma APPJ lrsquoimmobilisation de la laccase (oxydeacutee ou non) par adsorption uniquement fournit

les densiteacutes de courants les plus faibles (Figure IV26) La plus faible densiteacute de courant est de

-2731 microAcm2 La plus forte densiteacute de courant a eacuteteacute mesureacutee agrave environ -1 mAcm2 dans le cas

drsquoune eacutelectrode graphiteCNWs120s traiteacutee par plasma APPJ agrave une distance de 1 cm et une

vitesse de 10 mmin sur laquelle de la laccase oxydeacutee a eacuteteacute immobiliseacutee de maniegravere covalente

en preacutesence du meacutelange EDC-NHS (le support a eacuteteacute activeacute) On observe par ailleurs que

contrairement aux eacutelectrodes graphiteCNWs60s lrsquoimmobilisation de la laccase oxydeacutee permet

drsquoavoir de meilleurs courants catalytiques que la laccase non oxydeacutee Or les eacutelectrodes

graphiteCNWs120s et graphiteCNWs60s traiteacutes agrave d=1 cm et V=10 mmin possegravedent les

mecircmes rapports molaires OC et NC et les mecircmes types de groupements de surface drsquoapregraves les

analyses XPS (Tableau IV2) Comment donc expliquer le fait que la laccase oxydeacutee conduise

d = 1 cm V = 10 mmin d = 16 cm V = 24 mmin0

100

200

300

400

500

-J (

microA

cm

2)

laccase

laccase oxydeacutee


141

agrave des courants plus eacuteleveacutes sur graphiteCNWs120s que sur graphiteCNWs60s Cela pourrait

ecirctre ducirc au fait que vu la structure (sous forme de chou-fleur) des nanowalls de carbone la

laccase a tendance en plus de srsquoimmobiliser de maniegravere covalente agrave la surface agrave ecirctre pieacutegeacutee au

sein de caviteacutes La laccase oxydeacutee ayant une taille plus petite que la laccase non oxydeacutee elle

aura plus de faciliteacute drsquoaccegraves aux espaces confineacutes

Afin de confirmer cette hypothegravese on a chercheacute agrave quantifier la laccase immobiliseacutee agrave la

surface des eacutelectrodes agrave partir des reacutesultats de lrsquoanalyse XPS en utilisant le modegravele

matheacutematique deacutetailleacute dans le chapitre a-CNx baseacute sur lrsquoutilisation du rapport des intensiteacutes

entre le signal du cuivre et celui du carbone On a eacutegalement utiliseacute le rapport IN1sIC1s car il nrsquoa

pas eacuteteacute possible de deacutetecter le signal du cuivre sur lrsquoensemble des eacutelectrodes analyseacutees


traitement plasma des eacutelectrodes graphiteCNWs120s apregraves avoir immobiliseacute la laccase

oxydeacutee ou la laccase naturelle en preacutesence ou non drsquoagent de couplage (EDC-NHS)

Le Tableau IV15 regroupe lrsquoensemble des reacutesultats Les taux de recouvrement ont eacuteteacute

calculeacutes en supposant que la laccase prend une forme heacutemispheacuterique agrave la surface de lrsquoeacutelectrode

Si on raisonne par rapport agrave lrsquointensiteacute du pic de lrsquoazote aucune conclusion claire ne peut ecirctre

deacutegageacutee Dans le cas par exemple drsquoune distance de 1 cm et drsquoune vitesse de 10 mmin on

0

200

400

600

800

1000

d = 15 cm V = 20 mmin

avec EDC-NHS

d = 15 cm V = 20 mmin

sans EDC-NHS

d = 1 cm V = 10 mmin

avec EDC-NHS

-J(micro

Ac

m2)

laccase

laccase oxydeacutee


sans EDC-NHS


142

obtient pour lrsquoimmobilisation de la laccase naturelle des taux de recouvrement tregraves comparables

et pour lrsquoimmobilisation de la laccase oxydeacutee des reacutesultats qui ne vont pas dans le mecircme sens

que le courant Par contre si on calcule le taux de recouvrement agrave partir du ratio ICuIC1s on

observe que dans le cas drsquoun traitement plasma avec une distance de 15 cm et une vitesse de

20 mmin le taux de recouvrement de la laccase oxydeacutee est deux fois supeacuterieur agrave celui de la

laccase non oxydeacutee dans le cas drsquoune immobilisation covalente Ce reacutesultat est coheacuterent avec

les courants mesureacutes

Tableau IV15 Taux de couverture de la laccase agrave la surface des eacutelectrodes calculeacute agrave partir du

ratio IN1sIC1s et ICuIC1s extrait des reacutesultats XPS

Conditions de traitement plasma

d = 1 cm et V = 10 mmin d = 15 cm et V = 20 mmin

Laccase non oxydeacutee Laccase oxydeacutee Laccase non oxydeacutee Laccase oxydeacutee

Immobilisation Adsorption covalent Adsorption covalent Adsorption covalent Adsorption covalent

Taux de couverture agrave partir du pic XPS N1s

Modegravele heacutemispheacuterique

denzyme = 5 nm 09 09 08 06 07 10 10

denzyme = 7 nm 11 11 10 08 09 12 12

Taux de couverture agrave partir du pic XPS Cu2p


denzyme = 5 nm 05 04 08

denzyme = 7 nm 04 05 1

IV3Conclusion Au cours de ce travail nous avons utiliseacute comme mateacuteriau drsquoeacutelectrode du graphite recouvert

de nanowalls de carbone qui srsquoorganisent sous forme drsquoun enchevecirctrement de feuillets de

graphegravene en position verticale La surface du substrat est ainsi nanostructureacutee ce qui permet

drsquoaugmenter de faccedilon consideacuterable sa surface geacuteomeacutetrique Ce type de mateacuteriau est attractif en

raison des nombreuses applications dans lesquelles il peut ecirctre utiliseacute (eacutelectrodes pour piles agrave

combustible [98] capteurs chimiques batteries lithium-ion [99]) Par ailleurs le graphegravene

constitue un mateacuteriau conducteur et constitue un mateacuteriau prometteur pour la fabrication

drsquoeacutelectrode Les nanowalls de carbone ont eacuteteacute utiliseacutes dans ce travail pour la premiegravere fois en

tant que mateacuteriau drsquoeacutelectrode pour une cathode de biopile enzymatique et ce contrairement aux

nanotubes de carbone qui ont fait lrsquoobjet de plusieurs eacutetudes Lrsquoinconveacutenient des CNTs


143

contrairement aux nanowalls est la preacutesence drsquoune grande quantiteacute drsquoimpureteacutes [100] Une

eacutetape de purification des CNTs est donc neacutecessaire apregraves leur synthegravese

On a utiliseacute dans ce travail pour la formation des nanowalls de carbone le deacutepocirct chimique

en phase vapeur assisteacute par plasma agrave excitation micro-onde (PECVD) en utilisant comme gaz

plasmagegravene un meacutelange de monoxyde de carbone (CO) et de dihydrogegravene (H2) Diffeacuterentes

dureacutees de formation ont eacuteteacute testeacutees Une fois eacutelaboreacutes les nanowalls de carbone ont subi un

traitement plasma agrave jet atmospheacuterique afin de les fonctionnaliser Le traitement plasma

constitue une alternative aux traitements chimiques pour la geacuteneacuteration de groupements

fonctionnels agrave la surface de mateacuteriaux On srsquoest inteacuteresseacute au cours de ce travail au plasma

atmospheacuterique Il faut savoir que tregraves peu drsquoeacutetudes concernant lrsquoutilisation des plasmas ont eacuteteacute

reacutealiseacutees pour geacuteneacuterer des groupements fonctionnels sur des mateacuteriaux afin drsquoimmobiliser des

enzymes agrave la surface Labus et al [53] ont immobiliseacute de maniegravere covalente la laccase et la

tyrosinase sur des membranes drsquoultrafiltration agrave base de cellulose et de polyamide en creacuteant des

groupements carboxyliques amines hydroxyle par plasma Tastan et al [54] ont quant agrave eux

immobiliseacute la laccase de Trametes versicolor sur des membranes de polytreacutetrafluoroeacutethylegravene

fonctionnaliseacutees par plasma initieacute par radiofreacutequence Ardhaoui et al [3] ont fonctionnaliseacute du

graphite par jet de plasma atmospheacuterique pour une utilisation en tant que mateacuteriau drsquoeacutelectrode

pour une cathode de biopile enzymatique

Lrsquoobjectif de cette eacutetude eacutetait drsquooptimiser les conditions de fonctionnalisation de ces

surfaces nanostructureacutees par traitement plasma agrave la pression atmospheacuterique en mettant en place

des plans drsquoexpeacuteriences et ainsi augmenter les performances catalytiques de la cathode On a

dans un premier temps deacutecideacute drsquoeffectuer les mesures de performances catalytiques sur les

eacutechantillons de graphiteCNWs (graphiteCNWs60s et graphiteCNWs120s) dans des

conditions de traitement plasma fixeacutees agrave partir des preacuteceacutedents reacutesultats obtenus au sein du

laboratoire pour la fonctionnalisation des biocathodes [3] Suite agrave cette eacutetude on a conclu que

lrsquoutilisation de lrsquoazote comme gaz plasmagegravene et des conditions plus douces de

fonctionnalisation de surface permettraient drsquoobtenir des courants catalytiques de reacuteduction du

dioxygegravene plus importants Afin drsquooptimiser les conditions de fonctionnalisation plasma on a

reacutealiseacute une seacuterie de plans drsquoexpeacuteriences Etant limiteacutes en terme de nombre drsquoeacutechantillons on a

deacutecideacute drsquoeffectuer dans un premier temps lrsquoeacutetude drsquooptimisation sur du substrat graphitique nu

(sans nanowalls de carbone) On a effectueacute tout drsquoabord un plan drsquoexpeacuterience fractionnaire afin


144

de deacuteterminer les facteurs (distance torche-substrat vitesse de deacuteplacement de la torche PCT

et le deacutebit de gaz plasmagegravene) ayant une influence sur les performances des eacutelectrodes de

graphite Suite agrave cette eacutetude on a conclu que la distance et la vitesse de la torche plasma

constituent les paramegravetres influents Par la suite on a deacutecideacute drsquoeffectuer un deuxiegraveme plan

drsquoexpeacuterience composite (toujours sur les eacutelectrodes de graphite) afin drsquoaffiner les paramegravetres

de fonctionnalisation par plasma et consolider les reacutesultats obtenus Ce plan drsquoexpeacuterience a

permis drsquoatteindre des densiteacutes de courant supeacuterieures agrave -95 microAcm2 et drsquoidentifier une zone

dite robuste Il faut savoir que dans cette zone on ne forme que des groupements aldeacutehydes

Ceci nrsquoest pas eacutetonnant vu que les conditions de traitement sont plus douces On oxyde moins

la surface (on reste au degreacute drsquooxydation deux du carbone) alors qursquoavec des conditions plus

dures on va jusqursquoagrave lrsquoacide carboxylique (degreacute drsquooxydation quatre) On a par la suite effectueacute

les expeacuteriences sur les eacutelectrodes graphiteCNWs60s et graphiteCNWs120s afin de veacuterifier

que les conditions drsquooptimisation deacutetermineacutees avec le plan drsquoexpeacuterience composite sur les

eacutelectrodes de graphite nu sont transposables aux surfaces nanostructureacutees de type CNWs On a

eacutelargi la comparaison entre laccase naturelle et oxydeacutee agrave plusieurs types drsquoimmobilisation agrave

savoir par adsorption ou par greffage covalent avec ou sans agent de couplage La densiteacute de

courant maximale obtenue a eacuteteacute de lrsquoordre de -1 mAcm2 dans le cas drsquoune eacutelectrode

graphiteCNWs120s traiteacutee par plasma agrave une distance torche-substrat de 1 cm un PCT de 80

un deacutebit de 2000 Lh et une vitesse de 10 mmin sur laquelle la laccase oxydeacutee a eacuteteacute immobiliseacutee

de maniegravere covalente La preacutesence de nanowalls en surface du graphite a donc permis

drsquoaugmenter la densiteacute de courant bioeacutelectrocatalytique drsquoun facteur 10 par rapport agrave lrsquoeacutetude

drsquoArdhaoui et al

145

Chapitre VEtude par PM-IRRAS de

lrsquoimmobilisation de la laccase sur une surface drsquoor

plane

146

Chapitre V Etude par PM-IRRAS de lrsquoimmobilisation de la laccase sur une surface drsquoor plane

147

Ce chapitre est consacreacute au suivi par spectroscopie infrarouge de reacuteflexion-absorption agrave

modulation de phase (PM-IRRAS) de lrsquoimmobilisation de la laccase sur des plaques drsquoor

preacutealablement fonctionnaliseacutees par un deacutepocirct drsquoune monocouche de thiols auto-assembleacutee

(SAM) et termineacutee par une fonction acide carboxylique ou amine Dans une premiegravere partie

lrsquoenzyme est immobiliseacutee agrave la surface des plaques drsquoor fonctionnaliseacutees par trempage dans une

solution de laccase puis les plaques sont analyseacutees par PM-IRRAS agrave lrsquoair On appellera ce type

drsquoanalyse ex situ Dans le cas de lrsquoeacutetude in situ lrsquoanalyse par PM-IRRAS de la plaque drsquoor

fonctionnaliseacutee est effectueacutee en phase liquide concomitamment agrave lrsquoimmobilisation de

lrsquoenzyme On effectue ainsi un suivi en temps reacuteel du greffage Une analyse XPS a eacutegalement

eacuteteacute reacutealiseacutee apregraves immobilisation

V1Mateacuteriels et meacutethodes

On ne deacutetaillera ici que le principe de la spectroscopie infrarouge de reacuteflexion-absorption

agrave modulation de phase (PM-IRRAS) et le mode de preacuteparation des plaques drsquoor

V11La spectroscopie PM-IRRAS

V111La spectroscopie infrarouge

La spectroscopie infrarouge (IR) est une technique spectroscopique vibrationnelle non

destructrice permettant drsquoidentifier la nature des liaisons chimiques de la moleacutecule eacutetudieacutee Elle

utilise une source de rayonnement eacutelectromagneacutetique afin drsquoexciter les vibrations internes des

moleacutecules Les liaisons chimiques se comportent comme des oscillateurs qui vibrent en

permanence agrave des freacutequences deacutependant de la nature de ces liaisons Les regravegles de seacutelection des

vibrations actives en Infrarouge stipulent que seules les vibrations impliquant une variation du

moment dipolaire de la moleacutecule sont observeacutees En pratique les spectrophotomegravetres IR

mesurent lrsquoeacutenergie transmise ou reacutefleacutechie en fonction du nombre drsquoonde (en cm-1) le nombre

drsquoonde eacutetant proportionnel agrave la freacutequence des vibrations selon lrsquoeacutequation =c avec c la

vitesse de la lumiegravere

Les vibrations simples peuvent ecirctre classeacutees en deux grands groupes (Figure V1) les

vibrations de deacuteformation angulaire (bending) et les vibrations de valence ou drsquoeacutelongation

(stretching) qui se deacuteclinent en fonction de leur symeacutetrie Une vibration de valence ou

drsquoeacutelongation est un mouvement des atomes le long de lrsquoaxe de la liaison Elle est repreacutesenteacutee


148

par laquoυraquo Elle peut ecirctre symeacutetrique (υs) ou asymeacutetrique (υas) Ce type de vibration se situe dans

un intervalle de nombre drsquoonde allant de 4000 agrave 1000 cm-1 Une vibration de deacuteformation est

un mouvement des atomes en dehors de lrsquoaxe de la liaison Les vibrations de deacuteformation sont

repreacutesenteacutees par laquoδraquo Ces vibrations peuvent se reacutealiser dans le plan cisaillement laquoδraquo

(scissoring) et rotation plane laquoρraquo (rocking) Elles peuvent aussi se reacutealiser hors au plan

balancement laquoωraquo (wagging) et torsion laquoτraquo (twisting) Les vibrations de deacuteformation sont

drsquointensiteacute plus faible que celles de vibration de valence Elles constituent la reacutegion du spectre

dite empreinte digitale (1000 agrave 600 cm-1)

Figure V1 Scheacutema des diffeacuterents modes de vibrations dans une moleacutecule C-H

La grande diversiteacute des montages expeacuterimentaux permet la caracteacuterisation par IR

drsquoeacutechantillons solides ou liquides sur tout type de surface Cependant lrsquoanalyse de couches

tregraves minces (eacutepaisseur lt 500 A) par spectroscopie IR pose des problegravemes de sensibiliteacute Dans

le cas des substrats meacutetalliques il est alors possible drsquoutiliser une meacutethode IR fondeacutee sur la

reacuteflexion de lrsquoonde eacutelectromagneacutetique incidente et qui permet drsquoaugmenter la sensibiliteacute de la

deacutetection lrsquoInfraRed Reflexion Absorption Spectroscopy ou IRRAS


149

V112Principe de lrsquoIRRAS

La spectroscopie infrarouge de reacuteflexion-absorption agrave modulation de phase (IRRAS) est un

type de spectroscopie infrarouge permettant lrsquoanalyse de la structure et de lrsquoorientation de

moleacutecules adsorbeacutees en surface

Figure V2 Reacuteflexion du champ eacutelectrique E du faisceau IR agrave linterface drsquoun substrat

meacutetallique θ est appeleacute langle dincidence

Dans le cas des surfaces meacutetalliques les interactions entre la composante eacutelectrique de

lrsquoonde incidente le moment dipolaire des vibrations des moleacutecules et les proprieacuteteacutes de reacuteflexion

du support conditionnent lrsquoabsorption du faisceau Le travail de Greenler a montreacute lrsquoimportance

de lrsquoangle drsquoincidence θ entre le faisceau et la surface meacutetallique et de lrsquoeacutetat de polarisation de

la lumiegravere sur le spectre de reacuteflexionabsorption [101]Quand une onde eacutelectromagneacutetique est

reacutefleacutechie agrave la surface du meacutetal les composantes parallegravele et perpendiculaire au plan drsquoincidence

du vecteur champ eacutelectrique noteacutees Ep et Es respectivement (figure V2) subissent un

changement de phase qui deacutepend de lrsquoangle drsquoincidence La figure V3 montre que ce

changement de phase varie selon la composante du champ eacutelectrique consideacutereacutee La

composante du champ eacutelectrique perpendiculaire au plan drsquoincidence Es subit un deacutephasage

drsquoenviron 180deg peu influenceacute par la valeur de lrsquoangle drsquoincidence Par contre la composante

parallegravele au plan drsquoincidence dont le changement de phase est faible pour un angle drsquoincidence

infeacuterieur agrave 45deg subit un deacutephasage croissant lorsque lrsquoangle drsquoincidence deacutepasse 45deg Ainsi agrave

un angle drsquoincidence proche de 80deg dit rasant le deacutephasage est proche de 90deg et conduit agrave une

exaltation du champ eacutelectrique reacutesultant perpendiculaire agrave Ep


150

Figure V3 Deacutephasages subis par les champs eacutelectriques polariseacutes p et s agrave la surface

drsquoun substrat meacutetallique

De plus lorsque le faisceau incident est reacutefleacutechi agrave angle rasant seules les vibrations des

moleacutecules ayant une variation de moment dipolaire non parallegravele agrave la surface seront deacutetecteacutees

en IRRAS Ces regravegles de seacutelection particuliegraveres vont ainsi pouvoir donner des informations sur

lrsquoorientation des groupes moleacuteculaires en surface

Lorsqursquoon travaille en lumiegravere polariseacutee le spectre de lrsquoeacutechantillon est obtenu en

enregistrant successivement le spectre de reacuteflectiviteacute perpendiculaire au plan drsquoincidence

appeleacute Rs qui contient des informations sur le volume de lrsquoeacutechantillon mais pas sur sa surface

puis le spectre de reflectiviteacute parallegravele au plan drsquoincidence appeleacute Rp qui contient des

informations agrave la fois sur le volume et la surface Le spectre correspondant aux moleacutecules de

surface est obtenu en normalisant Rp par Rs Lrsquoinconveacutenient de cette technique est qursquoil faut

reacutealiser un spectre de reacutefeacuterence pour srsquoaffranchir de lrsquoenvironnement (gazeux ou liquide)

V113Principe du PM-IRRAS

La technique PM-IRRAS combine les trois techniques suivantes

-La reacuteflectiviteacute en lumiegravere polariseacutee et sous incidence quasi-rasante (IRRAS) Les regravegles de

seacutelection inheacuterentes agrave la spectroscopie IRRAS sont encore vraies en PM-IRRAS

-La modulation rapide de la polarisation du faisceau incident entre les polarisations p et s au

moyen drsquoun modulateur photoeacutelastique

-Le filtrage la deacutemodulation et le traitement matheacutematique de lrsquointensiteacute deacutetecteacutee afin drsquoobtenir

les signaux (Rp-Rs) et (Rp+Rs) puis le signal de reacuteflectiviteacute diffeacuterentielle normaliseacute (Equation

V1) Ce signal est uniquement repreacutesentatif du voisinage de la surface


151

∆R

R=

Rp-Rs

Rp+Rs (Eq V1)

V114Dispositif expeacuterimental

Le dispositif expeacuterimental utiliseacute au cours de ce travail comprend un spectrophotomegravetre

NICOLET 5700 et un montage optique de modulation-polarisation A la sortie du

spectrophotomegravetre le faisceau infrarouge incident est tout drsquoabord focaliseacute sur lrsquoeacutechantillon agrave

lrsquoaide drsquoun miroir agrave un angle optimal Entre ce miroir et lrsquoeacutechantillon le faisceau est polariseacute

par un polarisateur agrave grille (ZnSe) puis passe agrave travers un modulateur photoeacutelastique en ZnSe

(Hinds Instruments PEM 90 freacutequence de modulation eacutegale agrave 37 kHz) Le faisceau reacutefleacutechi

par lrsquoeacutechantillon est par la suite focaliseacute sur un deacutetecteur au tellurure de mercure et de cadmium

agrave large bande refroidi Les spectres infrarouges ont eacuteteacute enregistreacutes avec une reacutesolution de 8 cm-

1 en reacutealisant 128 scans

Le dispositif a aussi eacuteteacute utiliseacute pour effectuer des analyses en phase liquide in situ Pour cela

lrsquoeacutechantillon agrave analyser est introduit dans une cellule inspireacutee de celle reacutealiseacutee par le groupe de

Tadjeddine (Figure V4) La partie supeacuterieure de cette cellule est composeacutee drsquoune fenecirctre semi-

cylindrique agrave base de CaF2 Son volume total est de 10 mL Les solutions sont introduites dans

cette cellule agrave lrsquoaide drsquoune pompe peacuteristaltique La circulation de la solution est interrompue

lors de lrsquoanalyse PM-IRRAS et lrsquoeacutechantillon est plaqueacute contre la fenecirctre Il est seacutepareacute de cette

fenecirctre par un film liquide drsquoune eacutepaisseur estimeacutee agrave 1 μm Il peut ecirctre eacutegalement retireacute agrave

quelques mm de la fenecirctre de sorte que ladsorption ne soit pas limiteacutee par la quantiteacute de

moleacutecules preacutesentes dans la couche mince de liquide Langle dincidence optimal a eacuteteacute fixeacute agrave

70deg

Figure V4 Scheacutema de la cellule contenant lrsquoeacutechantillon pour des mesures in situ [102]


152

Les analyses PM-IRRAS sont reacutealiseacutees en utilisant de lrsquoeau deuteacutereacutee en tant que solvant

Ce dernier possegravede la particulariteacute de ne pas avoir de bandes de vibrations dans le domaine de

vibration des bandes amides I et II et ce contrairement agrave lrsquoeau qui empecircche une analyse preacutecise

dans cette reacutegion drsquointeacuterecirct (Figure V5) La preacutesence de bande drsquoabsorption dans cette reacutegion

dans le cas de lrsquoeau peut ecirctre attribueacutee soit agrave une orientation de la moleacutecule deau soit agrave une

certaine heacuteteacuterogeacuteneacuteiteacute du champ eacutelectrique au voisinage de la surface

Figure V5 Spectres PM-IRRAS drsquoune plaque drsquoor fonctionnaliseacutee par un SAM de

cysteacuteamine obtenus dans lrsquoeau ou lrsquoeau deuteacutereacutee [102]

V115Spectroscopie infrarouge des proteacuteines

V1151Modes de vibration de la liaison peptidique

Pour rappel une proteacuteine est un biopolymegravere constitueacute de lrsquoenchainement drsquoacides amineacutes

lieacutes entre eux par des liaisons peptidiques Ces liaisons donnent des bandes drsquoabsorption

caracteacuteristiques qursquoon nomme bandes amides Les bandes les plus intenses sont la bande amide

I et la bande amide II Le mode de vibration de la bande amide I est essentiellement ducirc agrave

lrsquoeacutelongation de la liaison C=O Cette bande se situe entre 1600 et 1700 cm-1 Le mode de

vibration de la bande amide II est essentiellement ducirc agrave la deacuteformation de la liaison N-H coupleacutee

agrave lrsquoeacutelongation de la liaison C-N La bande amide II se situe entre les nombres drsquoondes 1510 et

1580 cm-1 Les nombres drsquoondes de ces bandes ainsi que leur description sont reacutepertorieacutes dans

le Tableau V1


153

Tableau V1 Repreacutesentation des modes de vibration amide I et II de la liaison peptidique

Bandes de vibration Description Nombre drsquoondes (cm-1)

Amide I

1700-1600

Amide II

1580-1510

V1152Modes de vibration en fonction lrsquoorientation de la proteacuteine sur la surface

En IRRAS seules les vibrations des moleacutecules ayant une variation de moment dipolaire

non parallegravele agrave la surface sont deacutetecteacutees Drsquoapregraves son eacutetude cristallographique on sait que la

structure secondaire de la laccase B de Tversicolor est essentiellement constitueacutee de feuillets

antiparallegraveles orienteacutes selon un axe commun et dont les plans sont dans la mecircme direction (cf

Figure V 7 qui explicite les plans des feuillets ainsi que leur axe) en lrsquooccurrence verticaux

sur la figure V6 dans au moins 2 des 3 domaines de lrsquoenzyme (Figure V6) Dans un feuillet

antiparallegravele les liaisons hydrogegravene entre les NH de lrsquoun des brins et le C=O de la liaison

peptidique de lrsquoautre brin sont parallegraveles et dans le mecircme plan de sorte que les contributions

au moment dipolaire du feuillet de toutes ses liaisons C=O est maximale dans le plan du

feuillet et perpendiculairement agrave son axe

Figure V 6 Scheacutema de la laccase B de Trametes versicolor [28]


154

Si la laccase est immobiliseacutee sur un support horizontal avec une orientation telle que lrsquoaxe

de ses feuillets soit parallegravele agrave la surface du support et que leurs plans soient verticaux les

vibrations de valence des groupements C=O seront donc perpendiculaires agrave cette surface La

bande amide I sera plus intense sur le spectre PM-IRRAS qui exalte le signal des vibrations

perpendiculaires agrave la surface exploreacutee que la bande amide II Inversement si lrsquoaxe des feuillets

est perpendiculaire agrave la surface ou si les plans des feuillets ne sont pas verticaux les

contributions des vibrations de C=O vont diminuer tandis que les vibrations de deacuteformation des

liaisons N-H caracteacuteristiques de la bande amide II seront plus intenses Le ratio de lrsquointensiteacute

des bandes amide I et amide II est donc sensible agrave lrsquoorientation de lrsquoenzyme agrave la surface et peut

permettre de deacuteterminer si la meacutethode drsquoimmobilisation ou le type de fonctionnalisation de la

surface influent sur lrsquoorientation de lrsquoenzyme

Figure V7 Feuillet antiparallegravele drsquoune enzyme Les flegraveches repreacutesentent lrsquoaxe du

feuillet Ses plans laquo plisseacutes raquo sont figureacutes en violet clair et fonceacute

V12Preacuteparation des plaques drsquoor

V121Preacutetraitement des plaques drsquoor

Les surfaces utiliseacutees sont des plaques de verre (11 mm x 11 mm) recouvertes

successivement drsquoune couche de chrome de 50 Aring et drsquoune couche drsquoor de 200 nm drsquoeacutepaisseur

(Arrandee Werther Allemagne) Les plaques sont recuites au moyen drsquoune flamme pour

garantir une bonne cristalliniteacute de la couche superficielle drsquoor (reconstruite en Au (111)) puis

traiteacutees par UV-ozone durant 20 minutes avant drsquoecirctre rinceacutees successivement 5 minutes dans

lrsquoeacutethanol absolu et 5 minutes dans lrsquoeau deacutemineacuteraliseacutee pour eacuteliminer les traces drsquoeacutethanol Elles

sont enfin seacutecheacutees sous un flux drsquoazote Pour controcircler que lrsquoon a bien eacutelimineacute un maximum de

pollution organique les plaques sont analyseacutees par PM-IRRAS


155

V122Greffage des SAMs (Self Assembled Monolayer)

Les plaques drsquoor (Au) sont immergeacutees dans une solution drsquoacide thioglycolique (AT) ou

de cysteacuteamine (Figure V8) agrave 10-3 M dans lrsquoeacutethanol absolu pendant une nuit sous agitation agrave

tempeacuterature ambiante avant drsquoecirctre rinceacutees pendant 15 minutes dans lrsquoeacutethanol absolu pour

eacuteliminer lrsquoexcegraves drsquoacide thioglycolique ou de cysteacuteamine non greffeacutes de maniegravere covalente

(Figure V9) Les plaques sont ensuite rinceacutees dans lrsquoeau deacutemineacuteraliseacutee (MilliQ) pendant 10

minutes pour eacuteliminer les traces drsquoeacutethanol puis seacutecheacutees sous un flux drsquoazote

Figure V8 Formules des moleacutecules A) acide thioglycolique et B) cysteacuteamine

Figure V9 Scheacutema greffage sur une plaque drsquoor de A) acide thioglycolique et B) cysteacuteamine

V123Immobilisation de la laccase

Une fois les plaques drsquoor recouvertes par lrsquoacide thioglycolique ou la cysteacuteamine on a

immobiliseacute la laccase selon deux protocoles en fonction du type de groupements fonctionnels

preacutesents agrave la surface des plaques Les plaques drsquoor fonctionnaliseacutees par la cysteacuteamine sont

plongeacutees dans un tampon phosphate 50 mM (V = 5mL) contenant de la laccase (2 UmL) et le

meacutelange EDC-NHS (5mM) pendant 2 heures Lrsquoactivation a eacuteteacute reacutealiseacutee agrave un pH 5 car il est

preacutefeacuterable que les groupements carboxyliques soit protoneacutes tandis que lrsquoimmobilisation a eacuteteacute

faite agrave un pH 7 afin de deacuteprotoner les groupements amines Dans le cas des plaques drsquoor

fonctionnaliseacutees par lrsquoacide thioglycolique lrsquoimmobilisation est reacutealiseacutee en deux eacutetapes

drsquoabord lrsquoactivation des groupements carboxyliques de lrsquoacide thioglycolique par le meacutelange

EDC-NHS (5 mM) pendant 20 minutes puis le rinccedilage de la plaque et enfin son immersion

A B

A B


156

dans une solution de laccase (tampon phosphate 50 mM pH 7 2 UmL) Quatre types de plaques

drsquoor ont eacuteteacute eacutelaboreacutes selon les conditions reacutesumeacutees dans le Tableau V2

Tableau V2 Conditions drsquoimmobilisation de la laccase sur plaques drsquoor pour analyse PM-

IRRAS ex situ

Type de

fonctionnalisation

de la plaque

Activation avec

EDC-NHS

pH du tampon

phosphate lors des

eacutetapes drsquoactivation

immobilisation

Au1 cysteacuteamine oui 55

Au2 cysteacuteamine non 7

Au3 acide thioglycolique non 7

Au4 acide thioglycolique oui 57

Dans le cas de lrsquoeacutetude PM-IRRAS dite in situ crsquoest-agrave-dire en phase liquide le protocole

de fonctionnalisation des plaques drsquoor par formation de SAMs reste inchangeacute Les plaques

fonctionnaliseacutees sont par la suite placeacutees dans la cellule de PM-IRRAS Dans le cas drsquoune

plaque fonctionnaliseacutee avec la cysteacuteamine (Au1rsquo) on fait circuler dans la cellule un meacutelange

de laccase (2 UmL) et drsquoEDC-NHS 5 mM dans D2O agrave pH 7 (ajusteacute avec NaOD) Dans le cas

de la plaque fonctionnaliseacutee avec lrsquoacide thioglycolique (Au2rsquo) on fait circuler successivement

dans la cellule de PM-IRRAS une solution drsquoEDC-NHS 5 mM dans D2O puis une solution de

laccase (2UmL) dans D2O (pH 7) (Tableau V3)


IRRAS in situ

Type de

fonctionnalisation

de la plaque

Activation avec

EDC-NHS

pH de la solution

lors de lrsquoactivation

immobilisation

Au1rsquo cysteacuteamine oui 7

Au2rsquo Acide thioglycolique oui 57


157

V2Reacutesultats et discussion

V21Caracteacuterisation ex situ de lrsquoimmobilisation de la laccase

V211Analyse PM-IRRAS

Avant drsquoimmobiliser la laccase agrave la surface des plaques drsquoor une analyse systeacutematique par

PM-IRRAS des plaques drsquoor est reacutealiseacutee afin de veacuterifier le succegraves de chacune des eacutetapes

preacuteceacutedant le greffage de lrsquoenzyme (les eacutetapes de preacutetraitement et de fonctionnalisation des

plaques drsquoor) Un spectre repreacutesentatif de ceux obtenus apregraves assemblage drsquoun SAM de

cysteacuteamine agrave la surface de lrsquoor est preacutesenteacute dans la Figure V10

Figure V10 Spectre PM-IRRAS drsquoune plaque drsquoor fonctionnaliseacutee par un SAM de

cysteacuteamine

Les surfaces drsquoor fonctionnaliseacutees par un SAM de cysteacuteamine preacutesentent quatre vibrations

caracteacuteristiques des chaines aliphatiques lrsquoune vers 2966 cm-1 qui peut ecirctre attribueacutee agrave la

vibration de valence asymeacutetrique (υSCH3) des liaisons CH3 Deux autres agrave 2856 et 2926 cm-1

[103 104] sont attribueacutees respectivement aux vibrations de valences symeacutetrique (υsCH2) et

asymeacutetrique (υasCH2) des liaisons CH2 La derniegravere vers 1400 cm-1 (large pic) est caracteacuteristique

des vibrations de deacuteformation des CH2 Deux autres pics centreacutes autour de 1534 et 1639 sont

attribueacutes aux vibrations de deacuteformation (δ) symeacutetrique et asymeacutetrique des liaisons amines On

note aussi la preacutesence drsquoun pic agrave 1741 cm-1 qui est attribueacute aux vibrations des fonctions COO-

3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200 1000

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1)

28

56

29

66

2926

1741 16

38

153

9

1400

-145

0


158

Les groupements carboxyliques sont en effet deacuteprotoneacutes car le rinccedilage final des plaques

srsquoeffectue dans lrsquoeau agrave pH 5 Ces groupements carboxyliques pourraient provenir de traces de

glycine lrsquoacide amineacute utiliseacute comme reacuteactif dans la synthegravese de la cysteacuteamine et qui ne serait

pas complegravetement transformeacute Lrsquoanalyse du spectre PM-IRRAS permet ainsi de confirmer la

fonctionnalisation de la surface par la cysteacuteamine

Le spectre PM-IRRAS des surfaces drsquoor fonctionnaliseacutees par un SAM drsquoacide

thioglycolique (Figure V11) preacutesente quant agrave lui aussi les quatre vibrations caracteacuteristiques des

chaines aliphatiques agrave 2966 2926 2856 et 1420 cm-1 On observe aussi la preacutesence de deux

pics agrave 1716 et 1735 cm-1 attribueacutes aux vibrations de valences (υ) des groupements carboxyliques

protoneacutes et non protoneacutes [102] Le pic agrave 1539 cm-1 est caracteacuteristique des vibrations

asymeacutetriques (υas) des groupements carboxyliques deacuteprotoneacutes (COO-) [105 106] Ces

diffeacuterents pics permettent ainsi de confirmer la fonctionnalisation de la surface par lrsquoacide

thioglycolique

Figure V11 Spectre PM-IRRAS drsquoune plaque drsquoor fonctionnaliseacutee par un SAM drsquoacide

thioglycolique

Une fois la fonctionnalisation de la surface des plaques drsquoor veacuterifieacutee la laccase y a eacuteteacute

immobiliseacutee La figure suivante (Figure V12) preacutesente les diffeacuterents spectres PM-IRRAS

obtenus suite agrave lrsquoimmobilisation de la laccase sur une plaque drsquoor fonctionnaliseacutee par la

cysteacuteamine

3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200 1000

00

1 u

a


296

6

2856

1716

2926

1735

1539

1420


159

Figure V12 Spectres PM-IRRAS obtenus apregraves immobilisation de la laccase sur les plaques

drsquoor fonctionnaliseacutees avec un SAM de cysteacuteamine A) laccase immobiliseacutee de maniegravere

covalente et B) laccase adsorbeacutee

On observe pour les deux types drsquoimmobilisation (covalent et adsorption) lrsquoapparition de

deux pics intenses autour de 1657 et 1546 cm-1 attribueacutes aux bandes amide I et amide II de la

chaine peptidique La bande amide I correspond principalement aux vibrations de valence des

liaisons C=O tandis que la bande amide II est repreacutesentative de la vibration de deacuteformation des

liaisons N-H mais aussi dans une moindre mesure des vibrations de valence des liaisons C-N

Le pic agrave 1739 cm-1 est attribueacute aux vibrations de valence des liaisons C=O des groupements

carboxyliques deacuteprotoneacutes On note par ailleurs sur le spectre A un pic agrave 1830 cm-1 qui peut ecirctre

attribueacute agrave la vibration drsquoun groupement NHS-ester [103 107] Ce pic confirme donc lrsquoactivation

de la laccase par lrsquoagent de couplage EDC-NHS (Figure V17) La preacutesence de ce pic reacutevegravele

que certains des groupements carboxyliques de la laccase sont encore activeacutes et donc que tous

les groupements activeacutes de lrsquoenzyme nrsquoont pas reacuteagi avec la cysteacuteamine sans doute pour des

raisons steacuteriques Ce pic nrsquoest logiquement pas observeacute lorsque la laccase est adsorbeacutee agrave la

surface des plaques drsquoor et donc nrsquoa pas eacuteteacute activeacutee

La figure V13 preacutesente les spectres PM-IRRAS de la laccase immobiliseacutee sur des plaques

drsquoor fonctionnaliseacutees avec un SAM drsquoacide thioglycolique On observe comme sur les surfaces

fonctionnaliseacutees par un SAM de cysteacuteamine lrsquoapparition des bandes amides I et II Lorsque

lrsquoacide thioglycolique a eacuteteacute activeacute par formation de lrsquoester N-hydroxysuccinimique aucun pic

nrsquoest observeacute vers 1800 cm-1 ce qui laisse supposer que tous les groupements ester de surface

ont soit eacuteteacute coupleacutes de faccedilon covalente avec la laccase soit ont eacuteteacute hydrolyseacutes en preacutesence drsquoeau

3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200 1000

00

1 u

a


Au + cysteacuteamine

Au + cysteacuteamine + laccase activeacutee agrave pH 5-6

3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200 1000

00

1 u

a

nombre donde (cm-1

)


Au + cysteacuteamine + laccase adsorbeacutee pH 7

1658

15

48

18

30

A B

1656

15

44


160


drsquoor fonctionnaliseacutees par un SAM drsquoacide thioglycolique A) acide thioglycolique activeacutee agrave pH

5 (immobilisation covalente) et B) laccase adsorbeacutee agrave pH 7

Par ailleurs on a reacutealiseacute un spectre ATR de la laccase de Rhus vernifira libre (non

immobiliseacutee) afin de veacuterifier que la structure secondaire de la laccase nrsquoa pas eacuteteacute modifieacutee apregraves

son immobilisation sur les plaques drsquoor fonctionnaliseacutees avec un SAM de cysteacuteamine ou

drsquoacide thioglycolique (Figure V14)

Figure V14 Spectre ATR de la laccase de Rhus vernifira

On observe un shift de la bande I par rapport agrave la laccase de Rhus vernifira de 17 cm-1 et

15 cm-1 pour un SAM de cysteacuteamine et drsquoacide thioglycolique respectivement Cela pourrait

supposer un changement de la structure secondaire cependant lrsquoenzyme eacutetudieacutee nrsquoest pas celle

de Trametes versicolor Aucune conclusion ne peut ecirctre tireacutee

3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200 1000

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)

Au + acide thioglycolique

Au + acide thioglycolique activeacutee + laccase

3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200 1000

00

1 u

a

nombre donde (cm-1

)


Au + acide thioglycolique + laccase adsorbeacutee pH 7

2000 1800 1600 1400 120040

60

80

100

120

T

ransm

issi

on


B A 1656

1654

15

42

1542

1640


161

On a donc essayeacute de deacuteterminer lrsquoorientation de la laccase B de Tversicolor sur les plaques

drsquoor fonctionnaliseacutees Puisque lrsquoeacuteleacutement deacuteterminant des spectres de PM-IRRAS qui permet

drsquoobtenir des informations sur lrsquoorientation de lrsquoenzyme agrave la surface est le rapport drsquointensiteacute

des pics amide I et amide II on a deacutecomposeacute les spectres et plus particuliegraverement la reacutegion

contenant les bandes amides gracircce au logiciel Origin (Figure V15)

Figure V15 Deacutecomposition du spectre PM-IRRAS drsquoune plaque drsquoor fonctionnaliseacutee par de

la cysteacuteamine et apregraves immobilisation de la laccase par greffage covalent

Le Tableau V4 regroupe les aires de chaque pic (amide I et II) de lrsquoensemble des reacutesultats

pour les diffeacuterentes meacutethodes drsquoimmobilisation

Tableau V4 Aires des bandes amide I et II pour les diffeacuterentes immobilisations de la laccase

Amide I Amide II Ratio amideIamideII

Aucysteacuteaminegreffage

covalent de la laccase 693 254 27

Aucysteacuteaminelaccase

adsorbeacutee 65 316 2

AuATlaccase adsorbeacutee 61 34 18

AuAT activeacute greffage


Pour les deux types de fonctionnalisation des surfaces drsquoor on observe que la bande amide

I est plus intense que la bande amide II quel que soit le type drsquoimmobilisation (covalent ou

adsorption) Les groupements C=O eacutetant situeacutes sur le plan des feuillets ceci nous amegravene agrave

dire drsquoapregraves la regravegle de seacutelection du PM-IRRAS et la structure des feuillets antiparallegraveles

2000 1800 1600 1400 1200

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)

spectre IR

bande amide II

bande amide I

vibration COOH

enveloppe et ligne de base


162

qursquoon devrait observer une contribution maximale du moment dipolaire des groupements C=O

lorsque les feuillets sont perpendiculaires agrave la surface des plaques et que leur axe est parallegravele

agrave la surface de la plaque Inversement si la laccase est immobiliseacutee sur la surface de telle sorte

que lrsquoaxe des feuillets est perpendiculaire agrave la surface ou que lrsquoaxe et le plan des feuillets

est parallegravele la contribution des vibrations de la liaison C=O sera minimale et lrsquointensiteacute de la

bande amide I va diminuer ainsi que le ratio AmideIamide II (Figure V16)

Figure V16 Orientation de la laccase B Tversicolor sur une plque drsquoor A) de

cysteacuteamine et B) drsquoacide thioglycolique

Or on constate une diffeacuterence entre les ratios en fonction de la meacutethode de

fonctionnalisation de la surface On note que le ratio amide Iamide II est infeacuterieur lorsque la

laccase est immobiliseacutee sur une surface fonctionnaliseacutee par lrsquoacide thioglycolique Toutefois

la diffeacuterence est tregraves faible et vraisemblablement de lrsquoordre de lrsquoerreur expeacuterimentale entre les

deux types de surface dans le cas drsquoune immobilisation par adsorption 18 pour la plaque avec

lrsquoacide thioglycolique et 2 avec la cysteacuteamine On pourrait interpreacuteter ce reacutesultat en concluant

que dans ces deux cas lrsquoorientation de la laccase est la mecircme malgreacute le fait que la charge de la

surface drsquoor fonctionnaliseacutee est opposeacutee positive en preacutesence de cysteacuteamine et neacutegative en

preacutesence drsquoacide thioglycolique alors que le potentiel eacutelectrostatique de la laccase (calculeacute avec

le logiciel pdbviewer est neacutegatif sur toute sa surface agrave pH 7 du fait de la surrepreacutesentation des

acides amineacutes acides ( 45 acides aspartiques et glutamiques) par rapport agrave la lysine (5 reacutesidus)

dans la seacutequence primaire de lrsquoenzyme

Par contre on observe que le ratio amideIamide II est plus que double entre une

immobilisation covalente sur acide thioglycolique et cysteacuteamine passant de 13 agrave 27 Cela

suggegravere que lrsquoorientation de la structure secondaire de lrsquoenzyme est diffeacuterente pour les deux

types de support Sur une surface fonctionnaliseacutee avec des groupements cysteacuteamine la

A B


163

contribution des vibrations des C=O est importante on pourrait supposer que les feuillets de

lrsquoenzyme sont orienteacutes avec leur axe parallegravele agrave la surface et leurs plans verticaux dans le cas

drsquoune surface drsquoor horizontale (Figure V15A) Par comparaison sur une surface

fonctionnaliseacutee par lrsquoacide thioglycolique la baisse du ratio amideIamide II pourrait ecirctre

repreacutesentative drsquoun pivotement de 90deg de lrsquoenzyme (Figure V15B) Cette orientation pourrait

ecirctre compatible avec la formation covalente de la laccase via ses 5 groupements lysines dont

deux sont situeacutes sur la face de lrsquoenzyme qui serait alors au contact de la surface et 3 sur la face

opposeacutee

V212Analyse XPS

Afin drsquoeacutevaluer le taux de recouvrement de lrsquoenzyme immobiliseacutee selon le type de

fonctionnalisation de surface ou de meacutethode drsquoimmobilisation des analyses XPS ont eacuteteacute

reacutealiseacutees sur les plaques drsquoor Au1 (Aucysteacuteaminegreffage covalent de la laccase) et Au3

(AuATlaccase adsorbeacutee) On observe un pic caracteacuteristique du cuivre Cu2p32 (Figure V17) et

on confirme ainsi la preacutesence de la laccase agrave la surface de ces plaques drsquoor

Figure V17 Spectres XPS C1s apregraves deacutecomposition (agrave gauche) et Cu2p32 (agrave droite) drsquoune

plaque drsquoor en preacutesence de laccase A) Au1 et B) Au3

296 294 292 290 288 286 284 282 280 278

6000

7000

8000

9000

10000

11000

12000

Inte

nsi

teacute


C1s spectre

C sp2

C-O C-N

COOH O=C-N

ligne de base

enveloppe

940 938 936 934 932 930 92812000

12100

12200

12300

12400

12500

12600

inte

nsiteacute


296 294 292 290 288 286 284 282 280 2786000

7000

8000

9000

10000

11000

Inte

nsi

teacute


C1s spectre

C sp2

C-O C-N

COOH O=C-N

ligne de base

enveloppe

938 936 934 932 930 92813400

13600

13800

14000

14200

14400

14600

inte

nsi

teacute


A

B


164

Lanalyse quantitative du taux de couverture de la laccase agrave partir du signal XPS repose sur

la comparaison du rapport dintensiteacute ICuIAu mesureacute par XPS agrave ce mecircme rapport calculeacute selon

deux modegraveles de recouvrement de la surface par la laccase deacutecrits dans le chapitre III

Tableau V5 Taux de couverture de la laccase calculeacutes agrave partir du ratio ICuIAu

Au1 Au3

Modegravele A (heacutemispheacuterique)

denzyme= 5 nm 13 14

denzyme= 7 nm 11 12

Modegravele B (rectangulaire)

denzyme= 5 nm 13 14

denzyme= 7 nm 11 12

On constate tout drsquoabord drsquoapregraves le Tableau V5 que pour les deux eacutechantillons le taux de

recouvrement calculeacute est supeacuterieur agrave 1 La laccase formerait donc agrave la surface des plaques au

moins une monocouche Par ailleurs chacun des modegraveles utiliseacutes conduit au mecircme reacutesultat La

topologie de la couche de proteacuteine nrsquoa donc pas une influence sur le taux de recouvrement

V22Etude PM-IRRAS en phase liquide (in situ)

Suite agrave la reacutealisation des expeacuteriences de PM-IRRAS agrave lrsquoair (ex situ) on a deacutecideacute drsquoeffectuer

une eacutetude in situ permettant de suivre lrsquoeacutevolution de lrsquoimmobilisation de la laccase en fonction

du temps et en phase liquide On a utiliseacute pour cela comme solvant pour la preacuteparation des

solutions (solution contenant la laccase et lrsquoagent de couplage) de lrsquoeau deuteacutereacutee (D2O) Ce

dernier possegravede la particulariteacute de ne pas avoir de bandes de vibrations dans le domaine de

vibration des bandes amides I et II Deux types de plaques drsquoor ont eacuteteacute eacutelaboreacutes

Au1rsquo Aucysteacuteaminegreffage covalent de la laccase

Au2rsquo Auacide thioglycolique activeacuteegreffage covalent de la laccase

V221Etude PM-IRRAS

Dans le cas drsquoune plaque drsquoor fonctionnaliseacutee par de lrsquoacide thioglycolique on a dans un

premier temps effectueacute le suivi de lrsquoactivation des groupements carboxyliques de lrsquoacide par le

meacutelange EDC-NHS Cette activation srsquoeffectue en deux eacutetapes Les fonctions carboxyliques de

lrsquoacide thioglycolique reacuteagissent dans un premier temps avec lrsquoEDC Le composeacute formeacute est une


165

O-acylureacutee Dans une deuxiegraveme eacutetape le NHS va reacuteagir avec cet intermeacutediaire afin de former

un ester succinimidique [108] (Figure V18)

Figure V18 Scheacutema deacutetaillant les eacutetapes drsquoactivation drsquoune plaque fonctionnaliseacutee par des

acides carboxyliques par de lrsquoEDC-NHS [108]

On remarque tout drsquoabord drsquoapregraves les spectres PM-IRRAS ci-dessous (Figure V19)

qursquoapregraves 15 minutes de circulation de la solution contenant lrsquoagent de couplage au voisinage de

la plaque drsquoor fonctionnaliseacutee par de lrsquoacide thioglycolique que les fonctions carboxyliques

sont partiellement activeacutees En effet si on note toujours la preacutesence drsquoun pic agrave 1715 cm-1

attribueacute aux vibrations de valence des liaisons C=O des fonctions carboxyliques un pic agrave 1736

cm-1 ainsi que deux eacutepaulements agrave 1815 et 1777 cm-1 attribueacutes respectivement aux vibrations

asymeacutetriques (υasC=O) des liaisons C=O cycle du succinimide de valence symeacutetriques (υsC=O)

des liaisons N-C=O et aux vibrations de valence symeacutetriques (υsC=O) confirme lrsquoactivation

partielle de la plaque drsquoor par le NHS [108] Le pic agrave 1736 cm-1 peut ecirctre aussi caracteacuteristique

des vibrations de valences des groupements carboxyliques non activeacutes [103] Un pic agrave 1377 cm-

1 attribueacute aux vibrations de valence asymeacutetriques des liaisons C-N-C du cycle du succinimide

confirme aussi lrsquoactivation partielle des COOH On observe par ailleurs un pic agrave 1700 cm-1 dont

lrsquointensiteacute diminue en fonction du temps Ce pic est caracteacuteristique de la formation de

lrsquointermeacutediaire reacuteactionnel (O-acylureacutee) suite agrave la reacuteaction de lrsquoEDC avec les fonctions

carboxyliques de la surface des plaques drsquoor [108] Le pic agrave 1584 cm-1 le plus important dans

lrsquointervalle 1400-1800 cm-1 est sans doute ducirc agrave la preacutesence de traces drsquoeau dans la solution

La surface drsquoor activeacutee preacutesente aussi quatre vibrations caracteacuteristiques de la chaine

aliphatique lrsquoune vers 1467 cm-1 pouvant ecirctre attribueacutee aux vibrations de deacuteformation (δCH2)


166

des liaisons CH2 les deux autres agrave 2924 et 2851 cm-1 sont attribueacutes respectivement aux

vibrations de valences symeacutetrique (υsCH2) et asymeacutetrique (υasCH2) des liaisons CH2 et une agrave 2957

cm-1 affecter agrave la vibration de valence asymeacutetrique (υSCH3) des liaisons CH3 [108 109] On

nrsquoobserve pas de correacutelation entre lrsquointensiteacute de ces bandes avec la dureacutee de la circulation de

la solution du meacutelange EDC-NHS au voisinage de la surface drsquoor fonctionnaliseacutee Les deux

pics larges vers 3400 et 3800 cm-1 sont attribueacutes aux vibrations de valences des liaisons O-H

probablement du NHS ou de H2O preacutesent dans la solution

Figure V19 Spectres PM-IRRAS in situ drsquoune plaque drsquoor fonctionnaliseacutee par de lrsquoacide

thioglycolique en fonction de la dureacutee de lrsquoactivation par EDC-NHS A) spectre complet B)

entre 2100 et 1350 cm-1 et C) entre 4100 et 2800 cm-1

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)

dans D2O avant ajout EDC-NHS

0 min

5 min

15 min

2100 2000 1900 1800 1700 1600 1500 1400 1300

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)


0 min

5 min

15 min

4000 3800 3600 3400 3200 3000 2800

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)


0 min

5 min

15 min

18

15

17

36

1715

1700

14

67

15

84

2957

2924

2851

13

77

17

77

A B

C


167

Figure V20 Spectres PM-IRRAS en phase liquide drsquoune plaque drsquoor fonctionnaliseacutee par un

SAM drsquoacide thioglycolique activeacute avec EDC-NHS en fonction de la dureacutee du greffage

covalent de la laccase A) spectre complet B) entre 2100 et 1350 cm-1 C) entre 4100 et 2800

cm-1 et D) agrave lrsquoair suite agrave lrsquoeacutetude in situ

Une fois lrsquoacide thioglycolique activeacute on a fait circuler un volume V= 50 mL drsquoune

solution de laccase dilueacutee (2 UmL pH 7) dans de lrsquoeau deuteacutereacutee afin drsquoimmobiliser cette

enzyme de maniegravere covalente par la formation drsquoune liaison amide Les spectres PM-IRRAS

(Figure V20) preacutesentent le suivi de lrsquoimmobilisation de lrsquoenzyme sur la plaque durant 1h15

On observe une augmentation avec le temps de lrsquointensiteacute des trois pics caracteacuteristiques des

chaicircnes aliphatiques ce qui serait coheacuterent avec lrsquoimmobilisation de lrsquoenzyme qui elle-mecircme

contient des chaines carboneacutees Dans la reacutegion spectrale allant de 2100 agrave 1300 cm-1 on constate

eacutegalement une augmentation de lrsquointensiteacute en fonction de la dureacutee de circulation de la solution

de laccase de quatre vibrations Lrsquoune vers 1467 cm-1 est attribueacutee aux vibrations de

deacuteformation (δCH2) des liaisons CH2 celle vers 1733-1736 cm-1 est caracteacuteristique des

vibrations de valence des groupements carboxyliques et la bande amide I vers 1630-1633 cm-1

correspondant au vibrations de valence des liaisons C=O caracteacuteristiques de lrsquoenzyme On

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000

00

1 u

a


dans D2O apregraves activation

15 min

45 min

1h15

arret pompe peristaltique

30 min apregraves arret

2000 1900 1800 1700 1600 1500 1400

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)


15 min

45 min

1h15



4000 3800 3600 3400 3200 3000 2800

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)


15 min

45 min

1h15



3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200

00

1 u

a


2959 2

92

4

2856

29

64

29

25

28

46 1642

1736

15

59

1733

14

67

1630

A B

C D

15

55


168

observe un leacuteger pic (1555 cm-1) caracteacuteristique de la bande amide II Ce dernier est masqueacute

par les vibrations de deacuteformation des liaisons O-H des moleacutecules drsquoeau (qui proviennent

notamment de la solution megravere de laccase conserveacutee agrave -80degC et utiliseacutee pour preacuteparer la solution

dilueacutee drsquoenzyme circulant dans la cellule) Apregraves 1h15 de circulation de la solution de laccase

et 30 minutes apregraves lrsquoarrecirct de la circulation on a reacutealiseacute un spectre PM-IRRAS de la plaque

drsquoor agrave lrsquoair (Figure V20D) On peut observer dans ce cas clairement les deux bandes amides

caracteacuteristiques de lrsquoenzyme


SAM de cysteacuteamine en fonction de la dureacutee de circulation drsquoune solution drsquoenzyme activeacutee

A) spectre complet B) entre 2100 et 1350 cm-1 C) entre 4100 et 2800 cm-1 et D) agrave lrsquoair suite

agrave lrsquoeacutetude in situ

Dans le cas drsquoune plaque drsquoor fonctionnaliseacutee par un SAM de cysteacuteamine les spectres PM-

IRRAS (Figure V21) obtenus au cours de lrsquoimmobilisation in situ de la laccase preacutealablement

activeacutee montrent eux aussi une augmentation de lrsquointensiteacute des pics caracteacuteristiques des chaines

aliphatiques en fonction du temps On observe de faccedilon tregraves claire apregraves seulement 5 minutes

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)

dans D2O avant greffage de la laccase

5 min

15 min

30 min

1h

1h30

2100 2000 1900 1800 1700 1600 1500 1400 1300

00

1 u

a


dans D2O avant greffage laccase

5 min

15 min

30 min

1h

1h30

4000 3800 3600 3400 3200 3000 2800

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)


5 min

15 min

30 min

1h

1h30

3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200 1000

00

1 u

a


1649

1735 1556

2924

2959

2851

2852 2

925

2962

1736

1467 1632

A B

C D

1553


169

de circulation la preacutesence et lrsquoaugmentation au cours du temps de lrsquointensiteacute drsquoune bande amide

I agrave 1632 cm-1 drsquoune bande agrave 1736 cm-1 attribuable soit agrave lrsquoester succinimique soit aux

groupements carboxyliques de lrsquoenzyme ainsi qursquoune bande agrave 1467 cm-1 attribuable aux

groupements CH2 Comme sur les plaques fonctionnaliseacutees avec lrsquoacide thioglycolique on note

la preacutesence de la bande amide II vers 1556 cm-1 masqueacutee par la preacutesence drsquoeau Un spectre IR

agrave lrsquoair a eacuteteacute par ailleurs reacutealiseacute apregraves lrsquoeacutetude in situ On observe comme pour la plaque

fonctionnaliseacutee par un acide thioglycolique les deux bandes amides confirmant ainsi

lrsquoimmobilisation de la laccase On note aussi un shift (environ 14 cm-1) de la bande amide I (par

rapport aux expeacuteriences ex situ) vers des nombres drsquoondes moins eacuteleveacutes pour les deux types de

fonctionnalisation Ceci srsquoexplique par le fait que les expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees dans de lrsquoeau

deuteacutereacutee [110]

La deacutecomposition des spectres reacutealiseacutes agrave lrsquoair agrave lrsquoissue des expeacuteriences reacutealiseacutees dans la

cellule de circulation en phase liquide (Figures V20D et 21D) dans la reacutegion 1400-1800 cm-1

(figure V22) permet de calculer les ratios de lrsquointensiteacute des bandes amide I et II

Figure V22 Deacutecomposition du spectre PM-IRRAS agrave lrsquoair drsquoune plaque drsquoor fonctionnaliseacutee

par de lrsquoacide thioglycolique apregraves son activation et le greffage de la laccase reacutealiseacutes dans la

cellule de circulation

Tableau V6 Aires des bandes amide I et II de la laccase immobiliseacutee de faccedilon covalente sur

SAM cysteacuteamine ou acide glycolique dans la cellule agrave circulation

Amide I Amide II ratio amideIamideII

Au1rsquo 738 118 62

Au2rsquo 757 154 49

2000 1800 1600 1400 1200

spectre IR

bande amide II

bande amide I

vibration COOH


00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)

Peak Analysis

BaselineLine

Adj R-Square=970255E-001 of Data Points=181

Degree of Freedom=172SS=567668E-005

Chi^2=330040E-007

Date11082017Data Set[Book4]Sheet1001 ua

Fitting Results

Max Height

000388

001334

000411

Area IntgP

1435122

7386503

1178376

FWHM

4569932

6844208

3545522

Center Grvty

157243484

164796144

173599132

Area Intg

018878

097164

015501

Peak Type

Gaussian

Gaussian

Gaussian

Peak Index

1

2

3


170

On observe drsquoapregraves le Tableau V6 une diffeacuterence au niveau des ratios selon le type de

groupements fonctionnels (acide thioglycolique ou cysteacuteamine) qui suggegravere que lrsquoorientation

de la structure secondaire de lrsquoenzyme est diffeacuterente pour les deux types de support Les ratios

amide Iamide II sont supeacuterieurs dans le cas drsquoune surface recouverte par la cysteacuteamine Ceci

reflegravete une contribution au signal des vibrations des liaisons C=O qui serait donc plus

importante que celle des liaisons N-H On pourrait donc conclure que les plans des feuillets

de la laccase sont perpendiculaires agrave la surface de la plaque tandis que leur axe est parallegravele agrave

celle-ci Ce reacutesultat rejoint celui des analyses PM-IRRAS effectueacutees agrave lrsquoair apregraves

immobilisation de la laccase par immersion des plaques drsquoor ce qui est rassurant et gage de la

reproductibiliteacute de lrsquoorientation de lrsquoenzyme pour une meacutethode donneacutee

V222Analyses XPS

Figure V23 Spectres XPS du pic C1s apregraves deacutecomposition (agrave gauche) et Cu2p32 (agrave droite)

drsquoune plaque drsquoor en preacutesence de laccase A) Au1rsquo et B) Au2rsquo

Des analyses XPS ont eacuteteacute reacutealiseacutees sur les surfaces drsquoor fonctionnaliseacutees et celles sur

lesquelles la laccase a eacuteteacute immobiliseacutee Les donneacutees XPS (Figure V23) confirment

300 295 290 285 280 275

10

11

12

13

14

15

16

17

inte

nsiteacute

(1

03)

energie de liaison (eV)

C1s spectre

C sp2

C sp3

C-O C-N

COOH O=C-N

ligne de base

enveloppe

940 938 936 934 932 930 928200

205

210

215

220

225

230

235

240

inte

nsiteacute

(1

03)

energie liaison (eV)

300 295 290 285 280 275

10

12

14

16

18

20

inte

nsiteacute

(1

03)


C1s spectre

C sp2

C sp3

C-O C-N

COOH O=C-N

ligne de base

enveloppe

928 930 932 934 936 938 940192

194

196

198

200

202

204

inte

nsi

teacute (

10

3)


A

B


171

lrsquoimmobilisation de lrsquoenzyme agrave la surface des plaques et ce gracircce agrave la preacutesence du pic

caracteacuteristique de lrsquoeacuteleacutement cuivre sur chacune des plaques

Tableau V7 Taux de couverture de la laccase des plaques drsquoor calculeacute agrave partir de lrsquoactiviteacute

enzymatique et des reacutesultats XPS agrave partir du ratio ICuIAu

Au1rsquo Au2rsquo

Taux de couverture agrave partir des reacutesultats XPS

Modegravele A (heacutemispherique)

denzyme= 5 nm 12 14

denzyme= 7 nm 1 12


denzyme= 5 nm 12 14

denzyme= 7 nm 1 12

On a aussi comme pour les expeacuteriences reacutealiseacutees agrave lrsquoair deacutetermineacute le taux de recouvrement

de la laccase agrave la surface des plaques drsquoor en utilisant les mecircmes modegraveles matheacutematiques

(Tableau V7) Drsquoapregraves ce tableau on obtient plus drsquoune monocouche de laccase agrave la surface

des plaques Par ailleurs on obtient les mecircmes reacutesultats que pour les expeacuteriences reacutealiseacutees agrave lrsquoair

pour le mecircme type de configuration Ceci permet de montrer qursquoon immobilise la mecircme

quantiteacute de laccase en faisant circuler lrsquoenzyme dans la cellule de PM-IRRAS pendant un temps

beaucoup plus court que celui utiliseacute dans le protocole habituel En effet lrsquoimmobilisation de la

laccase a eacuteteacute effectueacutee durant 1h15-1h30 alors que dans le protocole drsquoimmobilisation par

trempage ou deacutepocirct drsquoune goutte de laccase sur une eacutelectrode de graphite la dureacutee de mise en

contact de la solution enzymatique avec la surface est de 2 heures

V3Conclusion Dans la litteacuterature peu drsquoeacutetudes ont eacuteteacute reacutealiseacutees afin de deacuteterminer lrsquoorientation de

laccase agrave la surface drsquoun mateacuteriau en utilisant la technique de PM-IRRAS Olejnik et al [111]

ont immobiliseacute par adsorption la laccase Cerrena unicolor sur une surface drsquoor fonctionnaliseacutee

soit par de lrsquoaminoethylphenyl chargeacute positivement (-C6H4(CH2)2NH3+) soit par de lrsquoacide

ethyl-benzoiumlque chargeacute neacutegativement (-C6H4(CH2)2COO-) Ils ont remarqueacute que dans le cas

drsquoune fonctionnalisation de la surface drsquoor par des groupements chargeacutes positivement

lrsquointensiteacute des bandes amide I et II est significativement moins importante que pour une surface

fonctionnaliseacutee avec (-C6H4(CH2)2COO- Par ailleurs ils ont constateacute un shift vers des nombres


172

drsquoondes plus importantS des bandes amide I et II qui pourrait ecirctre expliqueacute selon eux non pas

par la deacutenaturation de la structure enzymatique (elle est toujours une activiteacute catalytique apregraves

immobilisation) mais par un changement de lrsquoeacutetat drsquooxydation et une relaxation de la structure

tertiaire

Gutierrez-Sanchez et al [112] ont immobiliseacute la bilirubine oxydase Myrothecium

verrucaria sur une surface drsquoor fonctionnaliseacutee par des SAMs chargeacutes positivement (ATP) ou

neacutegativement (MHA) Ils ont aussi eacutetudieacute lrsquoorientation de cette enzyme par PM-IRRAS Ils ont

tout drsquoabord deacutemontreacute en eacutetudiant la structure cristallographique de la bilirubine oxydase que

34 des liaisons amides sont localiseacutes dans les feuillets 19 dans les heacutelices α et 23

reacutepartis de maniegravere aleacuteatoire Les reacutesultats de PM-IRRAS ont montreacute que les heacutelices α de la

bilirubine sont disposeacutees verticalement par rapport agrave la surface drsquoor (Figure V24) Le ratio des

bandes amides I et II est identique et ce quelle que soit la meacutethode de fonctionnalisation de la

surface Cela indique que lrsquoorientation de la structure secondaire de lrsquoenzyme est identique mais

avec une rotation de 180deg par rapport agrave la surface

Figure V24 Scheacutema de lrsquoorientation de la bilirubine en fonction de son dipocircle et de la

charge de surface des SAMs A) MHA et B) ATP [112]

Ciaccafava et al [113] ont immobiliseacute par adsorption une hydrogenase [NiFe] sur une

surface drsquoor fonctionnaliseacutee par des SAMs ayant un caractegravere hydrophile (S(CH2)nCOOH) ou

hydrophobe (S(CH2)nCH3) Ils ont observeacute que lrsquoimmobilisation de la proteacuteine sur la surface ne

modifiait pas la structure secondaire de lrsquoenzyme car la forme de la bande amide I reste


173

identique agrave celle mesureacutee par ATR-IR de lrsquoenzyme deacuteposeacutee sur le cristal de Germanium du

spectrophotomegravetre Cependant lrsquoorientation de lrsquoenzyme est diffeacuterente suivant le caractegravere

hydrophile ou hydrophobe de la surface Ils ont mesureacute un ratio amide Iamide II de 65 et 4

pour une plaque drsquoor hydrophile et hydrophobe respectivement En supposant que lrsquoenzyme est

uniquement composeacutee drsquoheacutelices α (en reacutealiteacute 40 drsquoheacutelices α et 15 de feuillets β) et que

lrsquoangle avec la surface est le mecircme pour toutes les heacutelices ils ont pu calculer un angle des

heacutelices de 20deg sur des surfaces hydrophobes et de 40deg sur des surfaces hydrophiles

En prenant en consideacuteration la litteacuterature et les reacutesultats que nous avons obtenus il est

difficile en se basant sur les feuillets β de la laccase de deacuteterminer une orientation particuliegravere

de lrsquoenzyme On peut simplement supposer la position des feuillets β sur le support Neacuteanmoins

on a pu mettre en eacutevidence que lrsquoorientation de la structure secondaire de lrsquoenzyme est

diffeacuterentes pour les deux types de support (cysteacuteamine ou acide thioglycolique) Sur une surface

fonctionnaliseacutee avec des groupements cysteacuteamine la contribution des vibrations des C=O est

importante on pourrait supposer que les feuillets de lrsquoenzyme sont orienteacutes avec leur axe

parallegravele agrave la surface et leurs plans verticaux Sur une surface fonctionnaliseacutee avec de lrsquoacide

thioglycolique on aurait drsquoun pivotement de 90deg de lrsquoenzyme Lrsquoaxe des feuillets serait

perpendiculaire Lrsquoeacutetude in situ par PM-IRRAS nous a permis drsquoeacutevaluer le temps drsquoactivation

des groupements carboxyliques et de mettre en eacutevidence la preacutesence de groupements non

activeacutes sur une plaque drsquoor fonctionnaliseacutee par un SAM drsquoacide thioglycolique Elle nous a

aussi permis de voir que lrsquoimmobilisation sous cloche ou en flux continu de la laccase conduit

agrave la mecircme orientation des feuillets β Il srsquoagit ici de la premiegravere eacutetude sur le suivi de

lrsquoimmobilisation de la laccase in situ reacutealiseacutee par PM-IRRAS Lrsquoeacutetude XPS quant agrave elle a

montreacute que la laccase forme une monocouche agrave la surface des plaques drsquoor quel que soit le type

de fonction (amine ou carboxylique)

174

175

Conclusion geacuteneacuterale et perspectives

176


177

Dans ce travail on srsquoest inteacuteresseacute au compartiment cathodique drsquoune biopile enzymatique

utilisant comme enzyme la laccase une oxydase multi-cuivres en tant que biocatalyseur pour

la reacuteaction de reacuteduction de lrsquooxygegravene La particulariteacute de cette cathode est que les enzymes sont

directement greffeacutees sur le mateacuteriau drsquoeacutelectrode Au deacutepart de ce travail plusieurs strateacutegies

ont eacuteteacute exploiteacutees pour immobiliser lrsquoenzyme agrave la surface de lrsquoeacutelectrode en modifiant la

proceacutedure de greffage en oxydant la laccase ou le mateacuteriau drsquoeacutelectrode en vue drsquoune part

optimiser la reacuteaction de reacuteduction de lrsquooxygegravene et drsquoautre part comprendre lrsquoimpact de

lrsquoorientation des enzymes greffeacutees sur le transfert drsquoeacutelectrons On srsquoest proposeacute drsquoutiliser deux

types de mateacuteriau agrave savoir le nitrure de carbone amorphe (a-CNx) et les nanowalls de carbone

tous deux deacuteposeacutes sur du graphite Les mateacuteriaux carboneacutes offrent lrsquoavantage drsquoecirctre

biocompatibles peu coucircteux et ont drsquoexcellentes proprieacuteteacutes eacutelectroniques

Le choix srsquoest porteacute sur le deacutepocirct drsquoa-CNx car on peut controcircler la couche deacuteposeacutee

(composition et eacutepaisseur) sa surface contient des groupements fonctionnels adapteacutes au

greffage de lrsquoenzyme et sa topographie permet drsquoavoir accegraves agrave des techniques expeacuterimentales

inapproprieacutees pour des eacutelectrodes preacutesentant une surface nanostructureacutee Les courants

cathodiques obtenus en utilisant comme eacutelectrode un disque de graphite recouvert de a-CN017

crsquoest-agrave-dire drsquoun rapport molaire NC=017 eacutetaient assez faibles autour de -7 microAcm2 mais ont

eacuteteacute ameacutelioreacutes de plus drsquoun facteur six apregraves un traitement anodique drsquoa-CNx conduisant agrave la

formation de groupes carboxyliques reacuteactifs agrave la surface On a alors mesureacute une densiteacute de

courant maximale de -446 microAcm2 Signalons que la forme oxydeacutee de la laccase permet drsquoavoir

de meilleurs reacutesultats pour lrsquoORR Lanalyse AFM a montreacute que la surface a-CNx non traiteacutee

est entiegraverement recouverte dune monocouche denzyme dans le cas de lrsquoimmobilisation de la

laccase oxydeacutee et partiellement pour la meacutethode drsquoimmobilisation avec la laccase naturelle Les

taux de recouvrement calculeacutes agrave partir des donneacutees XPS AFM et de lrsquoactiviteacute enzymatique vis-

agrave-vis de lrsquoABTS ont permis drsquoavoir une estimation de la quantiteacute drsquoenzyme preacutesente agrave la

surface Le regroupement de lrsquoensemble de ces reacutesultats a permis drsquoeacutemettre lrsquohypothegravese que

notre eacutelectrode se comporte comme un systegraveme de microeacutelectrodes crsquoest-agrave-dire qursquoil y a agrave la

surface de la cathode des enzymes actives et drsquoautres inactives et ainsi de proposer plusieurs

modegraveles permettant de rendre compte de faccedilon satisfaisante des mesures drsquoimpeacutedances

Cependant plusieurs hypothegraveses ont eacuteteacute eacutemises quant agrave la nature du transfert et agrave lrsquoorientation

de lrsquoenzyme sans que les donneacutees dont on dispose agrave ce jour permettent de trancher


178

A travers la nanostructuration de lrsquoeacutelectrode de graphite via la formation de nanowalls de

carbone (CNWs) par deacutepocirct chimique en phase vapeur assisteacute par plasma nous espeacuterions

augmenter de maniegravere significative la surface speacutecifique de la cathode avec un controcircle de

lrsquoorientation de lrsquoenzyme issu de nos observations acquises sur a-CNx afin drsquoobtenir des

densiteacutes de courant pouvant rivaliser avec celles mesureacutees dans la litteacuterature Un autre objectif

de cette eacutetude a eacuteteacute drsquooptimiser les conditions de traitement ulteacuterieur de fonctionnalisation de

la surface par APPJ en mettant en place des plans drsquoexpeacuteriences Suite agrave la reacutealisation de ces

plans on a mesureacute la plus forte densiteacute de courant environ -1 mAcm2 Ces reacutesultats sont

compeacutetitifs par rapport aux reacutesultats obtenus sur des nanotubes de carbone On a mis en

eacutevidence que les courants plus eacuteleveacutes ont eacuteteacute mesureacutes sur des eacutelectrodes fonctionnaliseacutees par

traitement plasma APPJ dans des conditions douces Or dans ces conditions lrsquooxydation du

carbone est limiteacutee les analyses XPS ont montreacute qursquoil nrsquoy a pas de groupements carboxyliques

en surface mais elles ont permis de mettre en eacutevidence la preacutesence de groupements aldeacutehydes

Crsquoest sans doute via la formation drsquoune liaison imine entre ces groupements et ses propres

fonctions amines que la laccase est immobiliseacutee de faccedilon covalente agrave la surface

Lrsquoeacutetude PM-IRRAS de lrsquoorientation et de la cineacutetique de greffage de la laccase sur des

surfaces drsquoor par PM-IRRAS a permis drsquoacceacuteder agrave la cineacutetique de greffage et drsquoaborder la

probleacutematique de lrsquoorientation de la laccase sous un angle original Ainsi on a pu mettre en

eacutevidence que lrsquoorientation de la structure secondaire de lrsquoenzyme est diffeacuterente en fonction de

la nature des groupements fonctionnels preacutesents sur les surfaces drsquoor (cysteacuteamine ou acide

thioglycolique) Lrsquoeacutetude in situ par PM-IRRAS nous a permis quant agrave elle drsquoeacutevaluer le temps

drsquoactivation des groupements carboxyliques et de mettre en eacutevidence la preacutesence de

groupements non activeacutes sur une plaque drsquoor fonctionnaliseacutee par un SAM drsquoacide

thioglycolique Elle nous a aussi permis de voir que lrsquoimmobilisation sous cloche ou en flux

continu de la laccase conduit agrave la mecircme orientation des feuillets β Il srsquoagit ici de la premiegravere

eacutetude sur le suivi de lrsquoimmobilisation de la laccase in situ reacutealiseacutee par PM-IRRAS On a pu

aussi deacutemontrer par XPS que la laccase forme une monocouche agrave la surface de ces surfaces

En reacutesumeacute ce travail a permis de deacutemontrer le potentiel de deux types de mateacuteriaux (a-

CNx et les nanowalls de carbone) pour la conception drsquoune cathode de biopile Il nous a aussi

permis drsquoeacutevaluer lrsquoorientation et la cineacutetique drsquoimmobilisation de la laccase Ces travaux

mettent aussi en eacutevidence les aspects agrave ameacuteliorer et agrave eacutetudier pour la conception drsquoune biopile


179

enzymatique performante et ainsi pouvoir utiliser ces derniegraveres dans des dispositifs

implantables Les perspectives srsquoarticulent autour de plusieurs axes la chimie de surface la

stabiliteacute et lrsquoingeacutenierie de lrsquoenzyme ainsi que la compreacutehension du transfert drsquoeacutelectrons

Pour ameacuteliorer le premier point de nouvelles meacutethodes de fonctionnalisation peuvent ecirctre

testeacutees afin de mieux controcircler lrsquoorientation de lrsquoenzyme agrave la surface On peut immobiliser la

laccase par π-stacking en utilisant des deacuteriveacutes du pyregravene de lrsquoanthracegravene en fonctionnalisant

les nanowalls de carbone afin drsquoimmobiliser la laccase via sa caviteacute hydrophobe qui se situe

proche du cuivre T1 On peut aussi ajouter sur ces nanowalls des nanoparticules drsquoor Les

nanoparticules drsquoor ayant la particulariteacute drsquoavoir une bonne conductiviteacute elles permettent

drsquoameacuteliorer le transfert drsquoeacutelectrons et ainsi favoriser le DET [38 62 63] La surface des

nanoparticules drsquoor peut ecirctre facilement fonctionnaliseacutee par plasma afin drsquoavoir des

groupements fonctionnels ou on peut utiliser des moleacutecules polycycliques

Lrsquoameacutelioration de la stabiliteacute des eacutelectrodes neacutecessite de comprendre les pheacutenomegravenes agrave

lrsquoorigine de la diminution des courants catalytiques On a noteacute une diminution progressive du

courant durant 24 heures A titre drsquoexemple pour une eacutelectrode graphitea-CN017 on a observeacute

une baisse de 50 du courant Cette diminution est-elle due agrave des proprieacuteteacutes propres agrave lrsquoenzyme

ou agrave son immobilisation agrave la surface des eacutelectrodes

On pourrait aussi augmenter les densiteacutes de courant en modifiant la seacutequence de lrsquoenzyme

par la creacuteation de mutants dont on pourra ensuite mieux controcircler lrsquoorientation Une tentative a

eacuteteacute effectueacutee durant la thegravese dans laquelle des points drsquoancrage de la laccase proches du cuivre

T1 ont eacuteteacute creacuteeacutes Malheureusement la production des souches contenant les gegravenes mutants est

tregraves faible et nrsquoa pas permis drsquoobtenir une quantiteacute de mutants suffisantes pour mener agrave bien

des tests drsquoimmobilisation sur eacutelectrode Il serait neacutecessaire drsquooptimiser les conditions de

culture

Enfin la compreacutehension du transfert drsquoeacutelectrons pourrait ecirctre effectueacutee par une meilleure

compreacutehension de lrsquoorientation en combinant la technique de spectroscopie drsquoimpeacutedance

eacutelectrochimique et de PM-IRRAS en utilisant aussi des enzymes mutantes ayant un site

drsquoaccroche

180

181

Annexes

182

Annexes

183

Annexe 1 Production de la laccase mutante

On a essayeacute au cours de la thegravese drsquoimmobiliser des enzymes mutantes afin drsquoameacuteliorer

lrsquoorientation agrave la surface des eacutelectrodes La laccase produite par Trametes versicolor renferme

dans sa seacutequence cinq lysines Ces lysines sont noteacutees LYS71 LYS174 LYS194 LYS59

LYS157 selon leur position dans la chaicircne peptidique Sept plasmides ont eacuteteacute syntheacutetiseacutes par

Eurogentech lrsquooption 1 (OPT1) dans laquelle trois lysines (LYS 71 LYS 174 et LYS194) ont

eacuteteacute muteacutees en alanine Il ne reste plus dans cette option que deux lysines (LYS59 et LYS157)

La laccase ne pourra donc avoir que deux orientations possibles dans le cas drsquoune eacutelectrode

avec des amines de surface voire une seule si on suppose que lrsquoenzyme srsquoaccroche par ces deux

lysines simultaneacutement puisqulsquoelles sont situeacutees sur la mecircme face Lrsquooption 2 (OPT2) et lrsquooption

3 (OPT3) ne renferment plus qursquoune seule lysine (LYS157 et LYS59 respectivement) Dans les

options 4 (OPT4) et 5 (OPT5) toutes les lysines natives de la laccase ont eacuteteacute muteacutees en alanine

Une nouvelle lysine a eacuteteacute creacuteeacutee en position 334 (GLY334LYS) pour lrsquooption 4 et en position

161 (ALA161LYS) pour lrsquooption 5 Quant agrave lrsquooption 6 (OPT6) plus aucune lysine nrsquoest

preacutesente dans la structure de la laccase Dans ce cas un greffage covalent nrsquoest plus possible

lorsque la surface des eacutelectrodes preacutesente des groupements carboxyliques

Production des laccases mutantes

Tableau A1 Composition du milieu YNB 5000

Concentration (gL)

Yeast nitrogen base 17

Sulfate drsquoammonium 5

Glucose 10

Agar 15

Eau 1 L

Sulfate de cuivre apregraves steacuterilisation 0025

ABTS apregraves steacuterilisation 20 mM

La premiegravere eacutetape avant production est de veacuterifier si les levures sont capables de syntheacutetiser

la laccase Cette veacuterification srsquoeffectue sur boite de peacutetri dans un milieu YNB 5000 dont la

composition (V = 1 L) est deacutecrite dans le Tableau A1 La steacuterilisation du sulfate de cuivre et

Annexes

184

de lrsquoABTS srsquoeffectuent agrave lrsquoaide drsquoune seringue ayant un filtre Whatman Le deacuteveloppement

drsquoune coloration verte au niveau des boites de peacutetri au bout drsquoune semaine de culture confirme

que les clones sont capables de produire une laccase mutante active (Figure A1)

Figure A1 Production de laccase dans un milieu YNB 5000

Pour entretenir la souche les levures sont cultiveacutees sur boite de peacutetri dans un milieu YPD

Le piquage est reacutealiseacute en moyenne chaque semaine Les cultures sont par la suite entreposeacutees

au reacutefrigeacuterateur agrave une tempeacuterature eacutegale agrave 4degC La composition du milieu est deacutecrite dans le

Tableau A2

Tableau A2 Composition du milieu YPD

Concentration gL

Extrait de levure 10

Glucose 10

Bactopeptone 10

Agar (culture sur boite de peacutetri) 15

Les levures ayant produit la laccase sont par la suite cultiveacutees dans un milieu de culture

liquide PPB durant 7 agrave 10 jours (Tableau A3) sous agitation vigoureuse agrave une tempeacuterature de

28degC Une preacute-culture avant inoculation des clones a eacuteteacute tout drsquoabord reacutealiseacutee dans un milieu

YPD sous agitation durant 24 heures agrave 28degC Ensuite un certain volume de cette solution a eacuteteacute

preacuteleveacute et ajouteacute au milieu de culture PPB de faccedilon agrave avoir une densiteacute optique initiale (DO) de

Annexes

185

01 agrave 600 nm Durant la culture le pH est veacuterifieacute quotidiennement et ajusteacute avec de la soude agrave

01 M de faccedilon agrave rester constant et eacutegal agrave 7 Cette culture a eacuteteacute tout drsquoabord reacutealiseacutee dans de

faibles volumes avant de passer agrave une production plus importante Un teacutemoin positif appeleacute

YL4 a eacuteteacute utiliseacute afin de veacuterifier le rendement de la culture La Figure A2 montre lrsquoeacutevolution

de lrsquoactiviteacute enzymatique des milieux de culture pour les diffeacuterents clones seacutelectionneacutes

Figure A2 Evolution de lrsquoactiviteacute enzymatique des laccases mutantes

Tableau A3 Composition du milieu PPB

Concentration gL

Glucose 20


NH4Cl 132

Na K phosphate 50 mM

MgSO4 7 H2O 024

CuSO4 0025

Thiamine 1 microM

Afin de stocker de maniegravere deacutefinitive les levures et ne pas avoir agrave effectuer des piquages

chaque semaine ces derniegraveres sont conserveacutees dans du glyceacuterol agrave -80degC Un milieu YPD est

tout drsquoabord preacutepareacute selon le protocole habituel (Tableau A2) On ajoute agrave ce milieu 25 de

glyceacuterol et on steacuterilise le meacutelange On preacutepare aussi dans des boites de peacutetri avec YPD une

culture des diffeacuterentes levures On preacutelegraveve ensuite agrave lrsquoaide drsquoune ose steacuterile la levure qursquoon

3 4 5 6 7 8000

005

010

015

020

025

030

035

Act

ivit

eacute (U

mL

)

Jours

YL4

OPT3-2

OPT7-7

OPT6-3

OPT5-4

1 2 3 4 5 6

000

002

004

006

008

010

Act

ivit

eacute (U

mL

)

Jours

OPT3-2

OPT7-7

Annexes

186

disperse dans le milieu YPD + glyceacuterol On congegravele lrsquoensemble dans de lrsquoazote liquide puis

dans un congeacutelateur agrave -80degC

Annexes

187

Annexe 2 Saturation de la solution tampon aceacutetate en oxygegravene

La Figure A1 montre les courbes de voltampeacuteromeacutetrie cyclique obtenues sur Pt et sur a-

CNx nu dans une solution de tampon aceacutetate 50 mM (pH = 42) satureacutee en oxygegravene Le temps

de bullage drsquooxygegravene neacutecessaire pour atteindre la saturation a eacuteteacute deacutetermineacute en utilisant comme

eacutelectrode de travail du platine et en se placcedilant agrave une valeur du potentiel de reacuteduction de

lrsquooxygegravene sur le platine qui a eacuteteacute fixeacutee agrave -05 VECS agrave lrsquoaide de la Figure A1A La Figure A2

preacutesente les courbes de chronoampeacuteromeacutetrie obtenues pour diffeacuterents temps de bullage On

observe qursquoapregraves un temps de bullage entre 30 et 40 min le courant de reacuteduction de lrsquooxygegravene

ne varie plus On a donc opteacute pour un temps de bullage de 40 min

Figure A1 Voltampeacuterogrammes obtenus dans une solution satureacutee en oxygegravene dans un

tampon aceacutetate 50 mM (pH = 42) drsquoune eacutelectrode A) de platine et B) graphitea-CN017

Figure A2 Courbe de chronoampeacuteromeacutetrie de reacuteduction de lrsquooxygegravene sur une eacutelectrode de

platine dans un tampon aceacutetate 50 mM (pH = 42) agrave diffeacuterents temps de bullage

-14 -12 -10 -08 -06 -04 -02 00 02 04 06

-04

-03

-02

-01

00

01

i (m

A)

E (VECS)

-15 -10 -05 00 05 10

-300

-250

-200

-150

-100

-50

0

50

100

i (m

A)

E (VECS)

-20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180-0025

-0020

-0015

-0010

-0005

0000

0005

i (m

A)

Temps (s)

0 min

20 min

30 min

40 min

A B

Annexes

188

On a eacutegalement confirmeacute la stabiliteacute du courant drsquoORR dans une solution satureacutee en

oxygegravene sur une dureacutee minimale de 5 minutes supeacuterieure donc aux 4 minutes neacutecessaires pour

effectuer la CV et donc la mesure de densiteacute de courant

189

Reacutefeacuterences

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Abstract

Enzymatic biofuel cells are an attractive alternative for renewable electricity generation In this

work we are focusing on the cathodic compartment of a biofuel cell using laccase a multi-copper

oxidase as biocatalysts for the oxygen reduction reaction (ORR) by direct electron transfer of electrons

Several strategies have been used to optimize the kinetic of ORR on graphite electrode One strategy

was to deposit thin film of amorphous carbon nitride (a-CNx) on graphite The presence of surface amine

groups then allowed the covalent grafting of the laccase Carboxylic groups can also be produced by an

electrochemical treatment By combining several characterisation techniques especially impedance

measurements we have demonstrated that our system behaves like microelectrodes network For this

type of electrode we have measured a maximal current density equal to -446 microAcm2 In another

strategy the surface of graphite was nanostructured by forming carbon nanowalls (CNWs) using the

plasma-enhanced chemical vapour deposition technique in a COH2 microwave discharge We have

optimized then the APPJ functionalization conditions using experiments design We reached current

densities of the order of -1 mAcm2 We have also studied the orientation and the kinetic of enzyme

immobilisation on gold surface using PM-IRRAS technique

Key-words enzymatic biofuel cell laccase graphite amorphous carbon nitride carbon nanowalls

control of the orientation

Reacutesumeacute

Les biopiles enzymatiques constituent une alternative inteacuteressante de production drsquoeacutelectriciteacute

renouvelable On srsquoest inteacuteresseacute dans ce travail au compartiment cathodique drsquoune biopile utilisant la

laccase une oxydase multi-cuivres comme biocatalyseur pour la reacuteduction de loxygegravene (ORR) par

transfert direct des eacutelectrons Plusieurs strateacutegies ont eacuteteacute mises en œuvre afin drsquooptimiser la cineacutetique

de lORR sur eacutelectrode de graphite Une des strateacutegies a consisteacute agrave deacuteposer un film mince de nitrure de

carbone amorphe (a-CNx) sur le graphite La preacutesence de groupements amines de surface a ensuite

permis le greffage covalent de la laccase Des groupements carboxyliques peuvent eacutegalement ecirctre

introduits par un traitement eacutelectrochimique En alliant plusieurs techniques de caracteacuterisation

notamment des mesures drsquoimpeacutedance on a deacutemontreacute que notre systegraveme se comporte comme un reacuteseau

de microeacutelectrodes Pour ce type drsquoeacutelectrode on a mesureacute une densiteacute de courant maximale de -446

microAcm2 Dans une autre strateacutegie la surface du graphite a eacuteteacute nanostructureacutee par formation de nanowalls

de carbone (CNWs) par deacutepocirct chimique en phase vapeur assisteacute par plasma On a optimiseacute les conditions

du traitement ulteacuterieur de fonctionnalisation de la surface par APPJ en ayant recours agrave des plans

drsquoexpeacuteriences ce qui a permis drsquoatteindre des densiteacutes de courants de lrsquoordre de -1 mAcm2 On a

eacutegalement eacutetudieacute lorientation et la cineacutetique de greffage de lenzyme sur une surface dor en utilisant la

technique PM-IRRAS

Mots-cleacutes biopile enzymatique laccase graphite nitrure de carbone amorphe Nanowalls de carbone

controcircle de lrsquoorientation


Ecole Doctorale 397

Laboratoire de Reacuteactiviteacute de Surface

Laboratoire Interfaces et Systegravemes Electrochimiques

Deacuteveloppement de biocathodes pour biopiles enzymatiques

utilisant la laccase

Par Mohamed Achraf Blout

Thegravese de doctorat en Physique et Chimie des Mateacuteriaux

Co-dirigeacutee par Claude Jolivalt et Alain Pailleret

Preacutesenteacutee et soutenue publiquement le 17 octobre 2017

Devant un jury composeacute de

Michael Holzinger Chargeacute de recherche

Universiteacute Grenoble Alpes

Rapporteur

Elisabeth Lojou Directrice de recherche CNRS

Universiteacute drsquoAix Marseille

Rapporteur

Christophe Innocent Chargeacute de recherche

ENSCM Chimie Montpellier

Examinateur

Michegravele Salmain Directrice de recherche CNRS


Examinatrice

Claude Jolivalt Professeur


Directrice de thegravese

Alain Pailleret Maitre de confeacuterences


Co-directeur de thegravese

Farzaneh Arefi-Khonsari Professeur


Inviteacutee

Remerciements































recherche

























I23 LA LACCASE 24











I42 LrsquoOR 33







I515 π-stacking 37





















II41 PRINCIPE 61



II51 PRINCIPE 61




























III3 CONCLUSION 98



101






RAYONS X 106

















117







graphite nu 123











IV3 CONCLUSION 142























V3 CONCLUSION 171


Annexes 181




1


2


3

































4

































5














6

7


8


9






















10












gauche)











11

























12





















13






















14

















15






















16




β




















17






























18





Vm [S]

[S] + KM (Eq I1)


k1














Anhydrase

carbonique

CO2

HCO3-

12times10-2

26times10-2

10times106

40times105

83times107

15times107


Fumarase Fumarate

Malate

50times10-6

25times10-5

80times102

90times102

16times108

36times107








19







dioxygegravene


moleacutecule






















20

































21





























22













hydroxyde [20]



23































versicolor


24



Oxygegravene

laccase

bilirubine oxydase

cytochrome oxydase

cytochrome c

Cu

Cu

Cu Fehegraveme

Fehegraveme

O2 +4H+ + 4e- 2H2O

peroxyde




Fehegraveme

Fehegraveme

H2O2 + 2H+ + 2e-

2H2O

I23La laccase





















25



(kDa)

pI Glycosylation ()

















spectroscopiques




A B


26

















A B C


27








436) (Figure I15)











LYS 59

LYS 157

LYS 71

LYS 174

LYS 194

Asn 54

Asn 333

Asn 436


28

































29






lrsquoencapsulation
















30

























A B C


31













lrsquoenzyme [3]
















32



























33
















I42Lrsquoor











34




















35



























36

























37











I515π-stacking
















38























39



























40














800 microAcm2

















41

































42































43

































44

































45










46

47


48


49














Extrait de levure 5

Malt 20

Agar 15



Maltose 20

Sels


KH2PO4

NaH2PO4

4

09

018


MgSO47 H2O

CaCl22 H2O

CuSO45 H2O

ZnSO47 H2O

FeSO47 H2O

05

0006

001

00005

0005

Thiamine 000001

25-Xylidine 03 mM



50































51





















Laccase A

Laccase B

Laccase X

70

2 U

mL

40

6 U

mL

26

Um

L

70

8 U

mL

17

41

Um

L


52
































53





droite)








(mL)

Activiteacute

(UmL)

Quantiteacute de

laccase (U)

Rendement

()





Laccase A (pic 1) 20 511 10226 30



Laccase B (pic 2) 20 421 842 248




5 1575 7877 30



0 2 4 6 8 10 12 14 16

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Acti

vit

eacute (

Um

L)

Fractions

2 4 6 8 10 12 14

0

20

40

60

80

100

120

Act

ivit

eacute (U

mL

)

Fractions

30

SA

20

SA

10

SA

30

SA

20

S

A

10

SA


54




















Eau

SDS 10


Temed

1 mL

248 mL

50 microL

375 microL

4 microL




Eau

PSA 10

Temed

05 mL

214 mL

60 microL

4 microL




55





















45 kDa

66 kDa

97 kDa

116 kDa


56


























sodium


57

























58













II6)






59






















60

















61





II41Principe









rocyanure













II51Principe





62







O2 + 4 H+ + 4 e- rarr 2 H2O





DO = ε l C


V harr n =

DO timesV

ε timesl harr

∆n

∆t =

∆DO

∆t times

V

ε timesl

rarr A = ∆n

∆t = [

∆DO

∆ttimes

V

ε timesl] times

1

Vlaccase

DO lrsquoabsorbance













bullage drsquoair


63






∆t (UmL)







∆t (U)


















64













dI= ϕn (A


z








I(infin)= ϕn (A



65





I(d)= ϕn (A


d

λcosθ)) (Eq II3)





I(d-infin)= ϕn (A


d

λcosθ) (Eq II4)





66

67



immobiliseacutee

68


69































70
































71
































72



















potentio-statique)


sinusoiumldale


73





Z(ω)=ΔE(ω)





respectivement














74
















= 1

















75






sein du LISE









(Fe(CN)63-Fe(CN)6












Fe(CN)63-Fe(CN)6




76









couche drsquoa-CNx







77

















-02 00 02 04 06-08

-06

-04

-02

00

02

04

06

08

i (m

A)

E (VECS)

20 mVs

30 mVs

40 mVs

50 mVs

60 mVs

100 mVs

002 003 004 005 006

-60x10-4

-40x10-4

-20x10-4

00

20x10-4

40x10-4

60x10-4

anodique

cathodique

i (A

)

V12

0 10 20 30 40 50 60

02

04

06

08

10

12

14

16

18

E (

VE

CS

)

Temps (s)

00 05 10 15 20

0

2

4

6

8

10

i (m

A)

E (VECS)

A B


78


graphitea-CNx AT

2846 eV 2857 eV 2866 eV 2877 eV 2888 eV


Graphite 756 156 60 28 002 -

graphitea-CNx 498 297 133 52 21 007 017

graphitea-CNx AT 431 279 148 90 52 017 012










300 295 290 285 280 275

0

20

40

60

80

100

Inte

nsi

teacute (

10

3)


spectre C1s

C sp2

C sp3

C-N C-O

C=N C=O

ligne de base

enveloppe

300 295 290 285 280 275

0

5

10

15

20

25

30

Inte

nsi

teacute (

10

3)


spectre C1s

C sp2

C sp3

C-N C-O

C=N C=O

COOH

ligne de base

enveloppe

300 295 290 285 280 275

0

5

10

15

20

25

30

Inte

nsi

teacute (

10

3)


spectre C1s

C sp2

C sp3

C-N C-O

C=N C=O

COOH

ligne de base

enveloppe

A B

C


79
































80



noire)


laccase












-04 -02 00 02 04 06 08 10

-100

-80

-60

-40

-20

0

20

40

60

J (micro

Ac

m2)

E (VECS)


10

20

30

40

50

60

-J (

microA

cm

2)

graphitea-CNx

graphitea-CNx AT


81

































82









de la laccase)




Adsorption Liaison

amide

Liaison

imine

Liaison

amide+imine

Adsorption Liaison

amide

Liaison

imine

Liaison

amide+imine


-J (microAcm2) 35 12 7 14

255

08 298 17 131 plusmn 28

396

66 379 446 99

Taux de

couverture

05 11 40 47 21 63 60 71



Taux de

couverture

64 112 105 101 24 74 24 69



denzyme= 5 nm 9 20 76 32 73

denzyme= 7 nm 8 17 64 28 61


denzyme= 5 nm 6 13 45 20 43

denzyme= 7 nm 6 13 44 20 42




83









Γmax = nmax enzyme






NA times Slaccase

(Eq III3)




NA times Slaccase
















84
















-6

















85




















300 295 290 285 280 275

0

2

4

6

8

10

12

14

Inte

nsi

teacute (

10

3)


C1s spectre

C sp2

C sp3

C-N C-O

COOH O=C-N

ligne de base

enveloppe

300 295 290 285 280 275

0

5

10

15

20

25

30

Inte

nsi

teacute (

10

3)


spectre C1s

C sp2

C sp3

C-N C-O

C=N C=O

COOH

ligne de base

enveloppe

A B


86



ICu

IC1s=

γnCuenzyme


[1-Λ]


CNxΛ+(1-γ)nC1s


+γnC1s


enzyme[1-Λ]

(Eq III6)


Λ= (8λ

2

denzyme2) [1- (

denzyme

2λ+1) exp (-

denzyme

2λ)] (Eq III7)



ICu

IC1s=

γnCuenzyme


[1-exp(-denzyme

λCuenzyme

cosΘ)]


CNxexp(-

denzyme

λC1sCNx

cosΘ)+(1-γ)nC1s


+γnC1senzyme


[1-exp(-denzyme

λC1senzyme

cosΘ)]

(Eq III8)


enzyme nC1s






nenzyme

=ρenzymetimesN

enzyme

MWenzyme (Eq III9)







= 4




λCu









87

































88













phase


89




lrsquoimage




















5 nm


90



















complegravete














91

























(Figure III12)


92



















0 5 10 15 20 25-7

-6

-5

-4

-3

-2

-1

i (micro

A)

Temps (h)






93












Scheacutema III4





0 4000 8000 12000 16000 200000

4000

8000

12000

16000

20000

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 2000

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

-Im

(Z

) (

Re (Z) (

graphitea-CN017


graphitea-CN017


graphitea-CN017


graphitea-CN017

laccase ajustement

graphitea-CN017


graphitea-CN017


graphitea-CN017


graphitea-CN017


-Im

(Z

) (

100 mHz

100 kHz 100 kHz

Re (Z) (Ω)


94











-1 0 1 2 3 4 5-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Phas

e

log(freacutequence)

-1 0 1 2 3 4 5-1

0

1

2

3

4

log(-

im Z

)

log(freacutequence)


95










4-



ZM(ω) = RM













96
























97



par adsorption













Rct1 Rct2 Rct1 Rct2






98































99

































100



101




102


103






























104








de la biocathode
























105




























graphiteCNWs120s


106












rayons X







107




























108






















109
































110



















111




avec deux facteurs

















i inej


112





















fractionnaire





113

IV143Plan composite




















114









Pi() = 100bi

2

Σbi2 (Eq IV3)

















115

















A B

C D


116


onduleacutes










A

B

C

D


117



et graphiteCNWs120s

C1s


graphiteCNWs60s 74 165 022 2 0022 -

graphiteCNWs120s 702 18 025 19 0021 -















300 295 290 285 280 2750

10

20

30

40

50

60

70

80

Inte

nsi

teacute


spectre C1s

C sp2

C sp3

C-O

C=O

ligne de base

enveloppe


118







4- en utilisant


correspondantes

A

B

C


119
























300 295 290 285 280 275

0

10

20

30

40

50

60

Inte

nsi

teacute (

10

3)


spectre C1s

C sp2

C sp3

C-N C-O

C=N C=O

COOH

ligne de base

enveloppe

300 295 290 285 280 275

0

10

20

30

40

50

60

Inte

nsi

teacute (

10

3)


spectre C1s

C sp2

C sp3

C-N C-O

C=N C=O

COOH

ligne de base

enveloppe

A B


120









et assez faible







des COOH




Csp3



graphiteCNWs60s 1p 665 163 81 58 30 015 8610-3 024

graphiteCNWs120s 1p 658 157 86 70 29 015 0011 023

2p 640 164 98 65 31 016 0011 025


graphiteCNWs60s 1p 715 132 74 57 20 012 001 018

2p 669 149 84 69 30 014 0011 022

graphiteCNWs120s 1p 680 142 75 80 23 014 8410-3 020

2p 642 165 86 78 30 016 0011 025



121







2p 18 109



2p 17 102


2p 17 102






















122











50

100

150

200

250

300

350

-J (

microA

cm

2)

CNWs 60s plasma air

covalent

adsorption


50

100

150

200

250

300

350

-J (

microA

cm

2)


covalent

adsorption


100

200

300

400

500

600

-J (

microA

cm

2)


covalent

adsorption


100

200

300

400

500

600

-J (

microA

cm

2)


covalent

adsorption

0

100

200

300

400

500

600

adsorption

2 passages

adsorption

1 passage

liaison amide

2 passages

liaison amide

1 passage

Plasma air

-J (

microA

cm

2)

graphiteCNWs120s

graphiteCNWs60s

graphite

0

100

200

300

400

500

600

adsorption

2 passages

adsorption

1 passage

liaison amide

2 passages

-J (

microA

cm

2)

Plasma azote

graphiteCNWs120s

graphiteCNWs60s

graphite

liaison amide

1 passage


123



























de graphite nu






124


























125


graphite nu


1 05 165 plusmn 23

2 07 280 plusmn 30

3 10 248 plusmn 02

4 12 391 plusmn 13

5 15 590 plusmn 13

6 17 751 plusmn 11

7 2 966 plusmn 10











04 08 12 16 200

20

40

60

80

100



126



-1 1







(Tableau IV6)



1 30 1 10 1000

2 80 1 10 2000

3 30 15 10 2000

4 80 15 10 1000

5 30 1 20 2000

6 80 1 20 1000

7 30 15 20 1000

8 80 15 20 2000









127

































128











(microUcm2)

Recouvrement

COOH

(times10-8 molcm2)

1 97 361 11 3 422

2 248 638 105 394

3 557 648 129 390

4 381 633 61 330

5 351 796 45 417

6 457 829 53 435

7 709 1026 32 436

8 684 975 168 485










129











obtenus

A B

C D


130


















1 120 240

2 160 240

3 120 420

4 160 420

5 112 330

6 168 330

7 140 203

8 140 457

9 140 330





131




1 12 240 1044

2 16 240 947

3 12 420 959

4 16 420 1151

5 11 330 182

6 17 330 1097

7 14 203 977

8 14 457 824

9 14 330 407














132












11 12 13 14 15 16 17

20

25

30

35

40

45

50

808 1011

64 1132

521 1013

1044

1011

407

1044 946

959 1151

182 1097

977

824

407

Vite

sse

(m

min

)

Distance (cm)

300 295 290 285 280 275-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Inte

nsi

teacute (

10

3)


spectre C1s

C sp2

C sp3

C-O

C=O

ligne de base

enveloppe


133


















16 24 00467 625

14 203 00396 522

15 20 00387 490

16 42 00370 452

1 10 00459 608

215 210 205 200 195 19000

01

02

03

04

05

06

07

08

Inte

nsi

teacute (

10

3)



134































135




graphiteCNWs60s


1 16 240

2 14 203

3 15 200

4 16 420

5 1 10







1 16 240 4404

2 14 203 3688

3 15 200 2163

4 16 420 2769

5 1 10 3122








136
















IV2512Plan Doehlert




300 295 290 285 280 275

00

02

04

06

08

10

Inte

nsi

teacute (

10

3)


non traiteacute

d = 10 cm V = 10 mmin

d = 14 cm V = 203 mmin

d = 16 cm V = 42 mmin

d = 15 cm V = 200 mmin

d = 16 cm V = 240 mmin


137



1 16 24

2 16 34

3 18 29

4 18 19

5 16 14

6 14 19

7 14 29











10 15 20 25 30 35

14

15

16

17

18

1823 1024

802404

654

885 1053

Vit

esse

(m

min

)

Distance (cm)


138









graphiteCNWs120s


1 16 240 1930 plusmn 1019

2 14 203 3805 plusmn 324

3 15 200 4258 plusmn 575

4 16 420 2274 plusmn 1052

5 1 10 4334plusmn 219
















139
































140






















100

200

300

400

500

-J (

microA

cm

2)

laccase

laccase oxydeacutee


141


















0

200

400

600

800

1000

d = 15 cm V = 20 mmin

avec EDC-NHS

d = 15 cm V = 20 mmin

sans EDC-NHS


avec EDC-NHS

-J(micro

Ac

m2)

laccase

laccase oxydeacutee


sans EDC-NHS


142
















denzyme = 5 nm 09 09 08 06 07 10 10

denzyme = 7 nm 11 11 10 08 09 12 12



denzyme = 5 nm 05 04 08













143

































144























145



plane

146


147































148

















149























150
























151

∆R

R=

Rp-Rs

Rp+Rs (Eq V1)




















70deg



152



















le Tableau V1


153



Amide I

1700-1600

Amide II

1580-1510














154

























155





















A B

A B


156




IRRAS ex situ

Type de

fonctionnalisation

de la plaque

Activation avec

EDC-NHS

pH du tampon

phosphate lors des


immobilisation














IRRAS in situ

Type de

fonctionnalisation

de la plaque

Activation avec

EDC-NHS

pH de la solution


immobilisation




157










cysteacuteamine









3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200 1000

00

1 u

a


28

56

29

66

2926

1741 16

38

153

9

1400

-145

0


158













thioglycolique


thioglycolique




cysteacuteamine

3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200 1000

00

1 u

a


296

6

2856

1716

2926

1735

1539

1420


159























3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200 1000

00

1 u

a




3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200 1000

00

1 u

a

nombre donde (cm-1

)



1658

15

48

18

30

A B

1656

15

44


160













3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200 1000

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)



3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200 1000

00

1 u

a

nombre donde (cm-1

)



2000 1800 1600 1400 120040

60

80

100

120

T

ransm

issi

on


B A 1656

1654

15

42

1542

1640


161























2000 1800 1600 1400 1200

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)

spectre IR

bande amide II

bande amide I

vibration COOH



162

























A B


163








opposeacutee

V212Analyse XPS








296 294 292 290 288 286 284 282 280 278

6000

7000

8000

9000

10000

11000

12000

Inte

nsi

teacute


C1s spectre

C sp2

C-O C-N

COOH O=C-N

ligne de base

enveloppe

940 938 936 934 932 930 92812000

12100

12200

12300

12400

12500

12600

inte

nsiteacute


296 294 292 290 288 286 284 282 280 2786000

7000

8000

9000

10000

11000

Inte

nsi

teacute


C1s spectre

C sp2

C-O C-N

COOH O=C-N

ligne de base

enveloppe

938 936 934 932 930 92813400

13600

13800

14000

14200

14400

14600

inte

nsi

teacute


A

B


164





Au1 Au3


denzyme= 5 nm 13 14

denzyme= 7 nm 11 12


denzyme= 5 nm 13 14

denzyme= 7 nm 11 12














V221Etude PM-IRRAS






165
























166











4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)


0 min

5 min

15 min

2100 2000 1900 1800 1700 1600 1500 1400 1300

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)


0 min

5 min

15 min

4000 3800 3600 3400 3200 3000 2800

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)


0 min

5 min

15 min

18

15

17

36

1715

1700

14

67

15

84

2957

2924

2851

13

77

17

77

A B

C


167

















4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000

00

1 u

a



15 min

45 min

1h15



2000 1900 1800 1700 1600 1500 1400

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)


15 min

45 min

1h15



4000 3800 3600 3400 3200 3000 2800

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)


15 min

45 min

1h15



3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200

00

1 u

a


2959 2

92

4

2856

29

64

29

25

28

46 1642

1736

15

59

1733

14

67

1630

A B

C D

15

55


168
















4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)


5 min

15 min

30 min

1h

1h30

2100 2000 1900 1800 1700 1600 1500 1400 1300

00

1 u

a



5 min

15 min

30 min

1h

1h30

4000 3800 3600 3400 3200 3000 2800

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)


5 min

15 min

30 min

1h

1h30

3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200 1000

00

1 u

a


1649

1735 1556

2924

2959

2851

2852 2

925

2962

1736

1467 1632

A B

C D

1553


169





















Au1rsquo 738 118 62

Au2rsquo 757 154 49

2000 1800 1600 1400 1200

spectre IR

bande amide II

bande amide I

vibration COOH


00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)

Peak Analysis

BaselineLine



Chi^2=330040E-007


Fitting Results

Max Height

000388

001334

000411

Area IntgP

1435122

7386503

1178376

FWHM

4569932

6844208

3545522

Center Grvty

157243484

164796144

173599132

Area Intg

018878

097164

015501

Peak Type

Gaussian

Gaussian

Gaussian

Peak Index

1

2

3


170











V222Analyses XPS





300 295 290 285 280 275

10

11

12

13

14

15

16

17

inte

nsiteacute

(1

03)


C1s spectre

C sp2

C sp3

C-O C-N

COOH O=C-N

ligne de base

enveloppe

940 938 936 934 932 930 928200

205

210

215

220

225

230

235

240

inte

nsiteacute

(1

03)


300 295 290 285 280 275

10

12

14

16

18

20

inte

nsiteacute

(1

03)


C1s spectre

C sp2

C sp3

C-O C-N

COOH O=C-N

ligne de base

enveloppe

928 930 932 934 936 938 940192

194

196

198

200

202

204

inte

nsi

teacute (

10

3)


A

B


171





Au1rsquo Au2rsquo



denzyme= 5 nm 12 14

denzyme= 7 nm 1 12


denzyme= 5 nm 12 14

denzyme= 7 nm 1 12




















172




tertiaire


















173

























174

175


176


177

































178

































179
























culture




drsquoaccroche

180

181

Annexes

182

Annexes

183



















Concentration (gL)



Glucose 10

Agar 15

Eau 1 L






Annexes

184








Tableau A2


Concentration gL


Glucose 10

Bactopeptone 10







Annexes

185








Concentration gL

Glucose 20


NH4Cl 132


MgSO4 7 H2O 024

CuSO4 0025

Thiamine 1 microM






3 4 5 6 7 8000

005

010

015

020

025

030

035

Act

ivit

eacute (U

mL

)

Jours

YL4

OPT3-2

OPT7-7

OPT6-3

OPT5-4

1 2 3 4 5 6

000

002

004

006

008

010

Act

ivit

eacute (U

mL

)

Jours

OPT3-2

OPT7-7

Annexes

186



Annexes

187














-14 -12 -10 -08 -06 -04 -02 00 02 04 06

-04

-03

-02

-01

00

01

i (m

A)

E (VECS)

-15 -10 -05 00 05 10

-300

-250

-200

-150

-100

-50

0

50

100

i (m

A)

E (VECS)

-20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180-0025

-0020

-0015

-0010

-0005

0000

0005

i (m

A)

Temps (s)

0 min

20 min

30 min

40 min

A B

Annexes

188




189




375-383



Power Sources 325 (2016) 252-263













745-756








Publications 2006



1533-1543













190



Research 40 (2007) 445-452



Soc 137 (2015) 8783-8794


Life Sci 72 (2015) 869-883
















(1997) 163-202



261-267







(1990) 99-102



3576




Reviews 37 (2008) 1188-1196




191



(2014) 104-114













(2008) 531-537























Reviews 38 (2009) 2214-2230







192









(2012) 228-235












Society 123 (2001) 3838-3839



160







Chemistry 21 (2015) 16868-16873






17212-17220








193



(2007) 989-996








(2016) 60-67




















(2016) 390-395



8895



5040-5043



(2012)




482

194



(2011) 1129-1132










094306



815-819










Chim Acta 797 (2013) 30-39





209-222














(2006) 20478-20485

195



36-40



144-152



State Ionics 180 (2009) 381-385








Langmuir 19 (2003) 8807-8812












141-149










Chemistry C 112 (2008) 7158-7167








196







Abstract

















Reacutesumeacute
















technique PM-IRRAS



Remerciements































recherche

























I23 LA LACCASE 24











I42 LrsquoOR 33







I515 π-stacking 37





















II41 PRINCIPE 61



II51 PRINCIPE 61




























III3 CONCLUSION 98



101






RAYONS X 106

















117







graphite nu 123











IV3 CONCLUSION 142























V3 CONCLUSION 171


Annexes 181




1


2


3

































4

































5














6

7


8


9






















10












gauche)











11

























12





















13






















14

















15






















16




β




















17






























18





Vm [S]

[S] + KM (Eq I1)


k1














Anhydrase

carbonique

CO2

HCO3-

12times10-2

26times10-2

10times106

40times105

83times107

15times107


Fumarase Fumarate

Malate

50times10-6

25times10-5

80times102

90times102

16times108

36times107








19







dioxygegravene


moleacutecule






















20

































21





























22













hydroxyde [20]



23































versicolor


24



Oxygegravene

laccase

bilirubine oxydase

cytochrome oxydase

cytochrome c

Cu

Cu

Cu Fehegraveme

Fehegraveme

O2 +4H+ + 4e- 2H2O

peroxyde




Fehegraveme

Fehegraveme

H2O2 + 2H+ + 2e-

2H2O

I23La laccase





















25



(kDa)

pI Glycosylation ()

















spectroscopiques




A B


26

















A B C


27








436) (Figure I15)











LYS 59

LYS 157

LYS 71

LYS 174

LYS 194

Asn 54

Asn 333

Asn 436


28

































29






lrsquoencapsulation
















30

























A B C


31













lrsquoenzyme [3]
















32



























33
















I42Lrsquoor











34




















35



























36

























37











I515π-stacking
















38























39



























40














800 microAcm2

















41

































42































43

































44

































45










46

47


48


49














Extrait de levure 5

Malt 20

Agar 15



Maltose 20

Sels


KH2PO4

NaH2PO4

4

09

018


MgSO47 H2O

CaCl22 H2O

CuSO45 H2O

ZnSO47 H2O

FeSO47 H2O

05

0006

001

00005

0005

Thiamine 000001

25-Xylidine 03 mM



50































51





















Laccase A

Laccase B

Laccase X

70

2 U

mL

40

6 U

mL

26

Um

L

70

8 U

mL

17

41

Um

L


52
































53





droite)








(mL)

Activiteacute

(UmL)

Quantiteacute de

laccase (U)

Rendement

()





Laccase A (pic 1) 20 511 10226 30



Laccase B (pic 2) 20 421 842 248




5 1575 7877 30



0 2 4 6 8 10 12 14 16

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Acti

vit

eacute (

Um

L)

Fractions

2 4 6 8 10 12 14

0

20

40

60

80

100

120

Act

ivit

eacute (U

mL

)

Fractions

30

SA

20

SA

10

SA

30

SA

20

S

A

10

SA


54




















Eau

SDS 10


Temed

1 mL

248 mL

50 microL

375 microL

4 microL




Eau

PSA 10

Temed

05 mL

214 mL

60 microL

4 microL




55





















45 kDa

66 kDa

97 kDa

116 kDa


56


























sodium


57

























58













II6)






59






















60

















61





II41Principe









rocyanure













II51Principe





62







O2 + 4 H+ + 4 e- rarr 2 H2O





DO = ε l C


V harr n =

DO timesV

ε timesl harr

∆n

∆t =

∆DO

∆t times

V

ε timesl

rarr A = ∆n

∆t = [

∆DO

∆ttimes

V

ε timesl] times

1

Vlaccase

DO lrsquoabsorbance













bullage drsquoair


63






∆t (UmL)







∆t (U)


















64













dI= ϕn (A


z








I(infin)= ϕn (A



65





I(d)= ϕn (A


d

λcosθ)) (Eq II3)





I(d-infin)= ϕn (A


d

λcosθ) (Eq II4)





66

67



immobiliseacutee

68


69































70
































71
































72



















potentio-statique)


sinusoiumldale


73





Z(ω)=ΔE(ω)





respectivement














74
















= 1

















75






sein du LISE









(Fe(CN)63-Fe(CN)6












Fe(CN)63-Fe(CN)6




76









couche drsquoa-CNx







77

















-02 00 02 04 06-08

-06

-04

-02

00

02

04

06

08

i (m

A)

E (VECS)

20 mVs

30 mVs

40 mVs

50 mVs

60 mVs

100 mVs

002 003 004 005 006

-60x10-4

-40x10-4

-20x10-4

00

20x10-4

40x10-4

60x10-4

anodique

cathodique

i (A

)

V12

0 10 20 30 40 50 60

02

04

06

08

10

12

14

16

18

E (

VE

CS

)

Temps (s)

00 05 10 15 20

0

2

4

6

8

10

i (m

A)

E (VECS)

A B


78


graphitea-CNx AT

2846 eV 2857 eV 2866 eV 2877 eV 2888 eV


Graphite 756 156 60 28 002 -

graphitea-CNx 498 297 133 52 21 007 017

graphitea-CNx AT 431 279 148 90 52 017 012










300 295 290 285 280 275

0

20

40

60

80

100

Inte

nsi

teacute (

10

3)


spectre C1s

C sp2

C sp3

C-N C-O

C=N C=O

ligne de base

enveloppe

300 295 290 285 280 275

0

5

10

15

20

25

30

Inte

nsi

teacute (

10

3)


spectre C1s

C sp2

C sp3

C-N C-O

C=N C=O

COOH

ligne de base

enveloppe

300 295 290 285 280 275

0

5

10

15

20

25

30

Inte

nsi

teacute (

10

3)


spectre C1s

C sp2

C sp3

C-N C-O

C=N C=O

COOH

ligne de base

enveloppe

A B

C


79
































80



noire)


laccase












-04 -02 00 02 04 06 08 10

-100

-80

-60

-40

-20

0

20

40

60

J (micro

Ac

m2)

E (VECS)


10

20

30

40

50

60

-J (

microA

cm

2)

graphitea-CNx

graphitea-CNx AT


81

































82









de la laccase)




Adsorption Liaison

amide

Liaison

imine

Liaison

amide+imine

Adsorption Liaison

amide

Liaison

imine

Liaison

amide+imine


-J (microAcm2) 35 12 7 14

255

08 298 17 131 plusmn 28

396

66 379 446 99

Taux de

couverture

05 11 40 47 21 63 60 71



Taux de

couverture

64 112 105 101 24 74 24 69



denzyme= 5 nm 9 20 76 32 73

denzyme= 7 nm 8 17 64 28 61


denzyme= 5 nm 6 13 45 20 43

denzyme= 7 nm 6 13 44 20 42




83









Γmax = nmax enzyme






NA times Slaccase

(Eq III3)




NA times Slaccase
















84
















-6

















85




















300 295 290 285 280 275

0

2

4

6

8

10

12

14

Inte

nsi

teacute (

10

3)


C1s spectre

C sp2

C sp3

C-N C-O

COOH O=C-N

ligne de base

enveloppe

300 295 290 285 280 275

0

5

10

15

20

25

30

Inte

nsi

teacute (

10

3)


spectre C1s

C sp2

C sp3

C-N C-O

C=N C=O

COOH

ligne de base

enveloppe

A B


86



ICu

IC1s=

γnCuenzyme


[1-Λ]


CNxΛ+(1-γ)nC1s


+γnC1s


enzyme[1-Λ]

(Eq III6)


Λ= (8λ

2

denzyme2) [1- (

denzyme

2λ+1) exp (-

denzyme

2λ)] (Eq III7)



ICu

IC1s=

γnCuenzyme


[1-exp(-denzyme

λCuenzyme

cosΘ)]


CNxexp(-

denzyme

λC1sCNx

cosΘ)+(1-γ)nC1s


+γnC1senzyme


[1-exp(-denzyme

λC1senzyme

cosΘ)]

(Eq III8)


enzyme nC1s






nenzyme

=ρenzymetimesN

enzyme

MWenzyme (Eq III9)







= 4




λCu









87

































88













phase


89




lrsquoimage




















5 nm


90



















complegravete














91

























(Figure III12)


92



















0 5 10 15 20 25-7

-6

-5

-4

-3

-2

-1

i (micro

A)

Temps (h)






93












Scheacutema III4





0 4000 8000 12000 16000 200000

4000

8000

12000

16000

20000

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 2000

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

-Im

(Z

) (

Re (Z) (

graphitea-CN017


graphitea-CN017


graphitea-CN017


graphitea-CN017

laccase ajustement

graphitea-CN017


graphitea-CN017


graphitea-CN017


graphitea-CN017


-Im

(Z

) (

100 mHz

100 kHz 100 kHz

Re (Z) (Ω)


94











-1 0 1 2 3 4 5-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Phas

e

log(freacutequence)

-1 0 1 2 3 4 5-1

0

1

2

3

4

log(-

im Z

)

log(freacutequence)


95










4-



ZM(ω) = RM













96
























97



par adsorption













Rct1 Rct2 Rct1 Rct2






98































99

































100



101




102


103






























104








de la biocathode
























105




























graphiteCNWs120s


106












rayons X







107




























108






















109
































110



















111




avec deux facteurs

















i inej


112





















fractionnaire





113

IV143Plan composite




















114









Pi() = 100bi

2

Σbi2 (Eq IV3)

















115

















A B

C D


116


onduleacutes










A

B

C

D


117



et graphiteCNWs120s

C1s


graphiteCNWs60s 74 165 022 2 0022 -

graphiteCNWs120s 702 18 025 19 0021 -















300 295 290 285 280 2750

10

20

30

40

50

60

70

80

Inte

nsi

teacute


spectre C1s

C sp2

C sp3

C-O

C=O

ligne de base

enveloppe


118







4- en utilisant


correspondantes

A

B

C


119
























300 295 290 285 280 275

0

10

20

30

40

50

60

Inte

nsi

teacute (

10

3)


spectre C1s

C sp2

C sp3

C-N C-O

C=N C=O

COOH

ligne de base

enveloppe

300 295 290 285 280 275

0

10

20

30

40

50

60

Inte

nsi

teacute (

10

3)


spectre C1s

C sp2

C sp3

C-N C-O

C=N C=O

COOH

ligne de base

enveloppe

A B


120









et assez faible







des COOH




Csp3



graphiteCNWs60s 1p 665 163 81 58 30 015 8610-3 024

graphiteCNWs120s 1p 658 157 86 70 29 015 0011 023

2p 640 164 98 65 31 016 0011 025


graphiteCNWs60s 1p 715 132 74 57 20 012 001 018

2p 669 149 84 69 30 014 0011 022

graphiteCNWs120s 1p 680 142 75 80 23 014 8410-3 020

2p 642 165 86 78 30 016 0011 025



121







2p 18 109



2p 17 102


2p 17 102






















122











50

100

150

200

250

300

350

-J (

microA

cm

2)

CNWs 60s plasma air

covalent

adsorption


50

100

150

200

250

300

350

-J (

microA

cm

2)


covalent

adsorption


100

200

300

400

500

600

-J (

microA

cm

2)


covalent

adsorption


100

200

300

400

500

600

-J (

microA

cm

2)


covalent

adsorption

0

100

200

300

400

500

600

adsorption

2 passages

adsorption

1 passage

liaison amide

2 passages

liaison amide

1 passage

Plasma air

-J (

microA

cm

2)

graphiteCNWs120s

graphiteCNWs60s

graphite

0

100

200

300

400

500

600

adsorption

2 passages

adsorption

1 passage

liaison amide

2 passages

-J (

microA

cm

2)

Plasma azote

graphiteCNWs120s

graphiteCNWs60s

graphite

liaison amide

1 passage


123



























de graphite nu






124


























125


graphite nu


1 05 165 plusmn 23

2 07 280 plusmn 30

3 10 248 plusmn 02

4 12 391 plusmn 13

5 15 590 plusmn 13

6 17 751 plusmn 11

7 2 966 plusmn 10











04 08 12 16 200

20

40

60

80

100



126



-1 1







(Tableau IV6)



1 30 1 10 1000

2 80 1 10 2000

3 30 15 10 2000

4 80 15 10 1000

5 30 1 20 2000

6 80 1 20 1000

7 30 15 20 1000

8 80 15 20 2000









127

































128











(microUcm2)

Recouvrement

COOH

(times10-8 molcm2)

1 97 361 11 3 422

2 248 638 105 394

3 557 648 129 390

4 381 633 61 330

5 351 796 45 417

6 457 829 53 435

7 709 1026 32 436

8 684 975 168 485










129











obtenus

A B

C D


130


















1 120 240

2 160 240

3 120 420

4 160 420

5 112 330

6 168 330

7 140 203

8 140 457

9 140 330





131




1 12 240 1044

2 16 240 947

3 12 420 959

4 16 420 1151

5 11 330 182

6 17 330 1097

7 14 203 977

8 14 457 824

9 14 330 407














132












11 12 13 14 15 16 17

20

25

30

35

40

45

50

808 1011

64 1132

521 1013

1044

1011

407

1044 946

959 1151

182 1097

977

824

407

Vite

sse

(m

min

)

Distance (cm)

300 295 290 285 280 275-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Inte

nsi

teacute (

10

3)


spectre C1s

C sp2

C sp3

C-O

C=O

ligne de base

enveloppe


133


















16 24 00467 625

14 203 00396 522

15 20 00387 490

16 42 00370 452

1 10 00459 608

215 210 205 200 195 19000

01

02

03

04

05

06

07

08

Inte

nsi

teacute (

10

3)



134































135




graphiteCNWs60s


1 16 240

2 14 203

3 15 200

4 16 420

5 1 10







1 16 240 4404

2 14 203 3688

3 15 200 2163

4 16 420 2769

5 1 10 3122








136
















IV2512Plan Doehlert




300 295 290 285 280 275

00

02

04

06

08

10

Inte

nsi

teacute (

10

3)


non traiteacute

d = 10 cm V = 10 mmin

d = 14 cm V = 203 mmin

d = 16 cm V = 42 mmin

d = 15 cm V = 200 mmin

d = 16 cm V = 240 mmin


137



1 16 24

2 16 34

3 18 29

4 18 19

5 16 14

6 14 19

7 14 29











10 15 20 25 30 35

14

15

16

17

18

1823 1024

802404

654

885 1053

Vit

esse

(m

min

)

Distance (cm)


138









graphiteCNWs120s


1 16 240 1930 plusmn 1019

2 14 203 3805 plusmn 324

3 15 200 4258 plusmn 575

4 16 420 2274 plusmn 1052

5 1 10 4334plusmn 219
















139
































140






















100

200

300

400

500

-J (

microA

cm

2)

laccase

laccase oxydeacutee


141


















0

200

400

600

800

1000

d = 15 cm V = 20 mmin

avec EDC-NHS

d = 15 cm V = 20 mmin

sans EDC-NHS


avec EDC-NHS

-J(micro

Ac

m2)

laccase

laccase oxydeacutee


sans EDC-NHS


142
















denzyme = 5 nm 09 09 08 06 07 10 10

denzyme = 7 nm 11 11 10 08 09 12 12



denzyme = 5 nm 05 04 08













143

































144























145



plane

146


147































148

















149























150
























151

∆R

R=

Rp-Rs

Rp+Rs (Eq V1)




















70deg



152



















le Tableau V1


153



Amide I

1700-1600

Amide II

1580-1510














154

























155





















A B

A B


156




IRRAS ex situ

Type de

fonctionnalisation

de la plaque

Activation avec

EDC-NHS

pH du tampon

phosphate lors des


immobilisation














IRRAS in situ

Type de

fonctionnalisation

de la plaque

Activation avec

EDC-NHS

pH de la solution


immobilisation




157










cysteacuteamine









3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200 1000

00

1 u

a


28

56

29

66

2926

1741 16

38

153

9

1400

-145

0


158













thioglycolique


thioglycolique




cysteacuteamine

3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200 1000

00

1 u

a


296

6

2856

1716

2926

1735

1539

1420


159























3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200 1000

00

1 u

a




3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200 1000

00

1 u

a

nombre donde (cm-1

)



1658

15

48

18

30

A B

1656

15

44


160













3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200 1000

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)



3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200 1000

00

1 u

a

nombre donde (cm-1

)



2000 1800 1600 1400 120040

60

80

100

120

T

ransm

issi

on


B A 1656

1654

15

42

1542

1640


161























2000 1800 1600 1400 1200

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)

spectre IR

bande amide II

bande amide I

vibration COOH



162

























A B


163








opposeacutee

V212Analyse XPS








296 294 292 290 288 286 284 282 280 278

6000

7000

8000

9000

10000

11000

12000

Inte

nsi

teacute


C1s spectre

C sp2

C-O C-N

COOH O=C-N

ligne de base

enveloppe

940 938 936 934 932 930 92812000

12100

12200

12300

12400

12500

12600

inte

nsiteacute


296 294 292 290 288 286 284 282 280 2786000

7000

8000

9000

10000

11000

Inte

nsi

teacute


C1s spectre

C sp2

C-O C-N

COOH O=C-N

ligne de base

enveloppe

938 936 934 932 930 92813400

13600

13800

14000

14200

14400

14600

inte

nsi

teacute


A

B


164





Au1 Au3


denzyme= 5 nm 13 14

denzyme= 7 nm 11 12


denzyme= 5 nm 13 14

denzyme= 7 nm 11 12














V221Etude PM-IRRAS






165
























166











4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)


0 min

5 min

15 min

2100 2000 1900 1800 1700 1600 1500 1400 1300

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)


0 min

5 min

15 min

4000 3800 3600 3400 3200 3000 2800

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)


0 min

5 min

15 min

18

15

17

36

1715

1700

14

67

15

84

2957

2924

2851

13

77

17

77

A B

C


167

















4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000

00

1 u

a



15 min

45 min

1h15



2000 1900 1800 1700 1600 1500 1400

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)


15 min

45 min

1h15



4000 3800 3600 3400 3200 3000 2800

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)


15 min

45 min

1h15



3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200

00

1 u

a


2959 2

92

4

2856

29

64

29

25

28

46 1642

1736

15

59

1733

14

67

1630

A B

C D

15

55


168
















4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)


5 min

15 min

30 min

1h

1h30

2100 2000 1900 1800 1700 1600 1500 1400 1300

00

1 u

a



5 min

15 min

30 min

1h

1h30

4000 3800 3600 3400 3200 3000 2800

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)


5 min

15 min

30 min

1h

1h30

3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200 1000

00

1 u

a


1649

1735 1556

2924

2959

2851

2852 2

925

2962

1736

1467 1632

A B

C D

1553


169





















Au1rsquo 738 118 62

Au2rsquo 757 154 49

2000 1800 1600 1400 1200

spectre IR

bande amide II

bande amide I

vibration COOH


00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)

Peak Analysis

BaselineLine



Chi^2=330040E-007


Fitting Results

Max Height

000388

001334

000411

Area IntgP

1435122

7386503

1178376

FWHM

4569932

6844208

3545522

Center Grvty

157243484

164796144

173599132

Area Intg

018878

097164

015501

Peak Type

Gaussian

Gaussian

Gaussian

Peak Index

1

2

3


170











V222Analyses XPS





300 295 290 285 280 275

10

11

12

13

14

15

16

17

inte

nsiteacute

(1

03)


C1s spectre

C sp2

C sp3

C-O C-N

COOH O=C-N

ligne de base

enveloppe

940 938 936 934 932 930 928200

205

210

215

220

225

230

235

240

inte

nsiteacute

(1

03)


300 295 290 285 280 275

10

12

14

16

18

20

inte

nsiteacute

(1

03)


C1s spectre

C sp2

C sp3

C-O C-N

COOH O=C-N

ligne de base

enveloppe

928 930 932 934 936 938 940192

194

196

198

200

202

204

inte

nsi

teacute (

10

3)


A

B


171





Au1rsquo Au2rsquo



denzyme= 5 nm 12 14

denzyme= 7 nm 1 12


denzyme= 5 nm 12 14

denzyme= 7 nm 1 12




















172




tertiaire


















173

























174

175


176


177

































178

































179
























culture




drsquoaccroche

180

181

Annexes

182

Annexes

183



















Concentration (gL)



Glucose 10

Agar 15

Eau 1 L






Annexes

184








Tableau A2


Concentration gL


Glucose 10

Bactopeptone 10







Annexes

185








Concentration gL

Glucose 20


NH4Cl 132


MgSO4 7 H2O 024

CuSO4 0025

Thiamine 1 microM






3 4 5 6 7 8000

005

010

015

020

025

030

035

Act

ivit

eacute (U

mL

)

Jours

YL4

OPT3-2

OPT7-7

OPT6-3

OPT5-4

1 2 3 4 5 6

000

002

004

006

008

010

Act

ivit

eacute (U

mL

)

Jours

OPT3-2

OPT7-7

Annexes

186



Annexes

187














-14 -12 -10 -08 -06 -04 -02 00 02 04 06

-04

-03

-02

-01

00

01

i (m

A)

E (VECS)

-15 -10 -05 00 05 10

-300

-250

-200

-150

-100

-50

0

50

100

i (m

A)

E (VECS)

-20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180-0025

-0020

-0015

-0010

-0005

0000

0005

i (m

A)

Temps (s)

0 min

20 min

30 min

40 min

A B

Annexes

188




189




375-383



Power Sources 325 (2016) 252-263













745-756








Publications 2006



1533-1543













190



Research 40 (2007) 445-452



Soc 137 (2015) 8783-8794


Life Sci 72 (2015) 869-883
















(1997) 163-202



261-267







(1990) 99-102



3576




Reviews 37 (2008) 1188-1196




191



(2014) 104-114













(2008) 531-537























Reviews 38 (2009) 2214-2230







192









(2012) 228-235












Society 123 (2001) 3838-3839



160







Chemistry 21 (2015) 16868-16873






17212-17220








193



(2007) 989-996








(2016) 60-67




















(2016) 390-395



8895



5040-5043



(2012)




482

194



(2011) 1129-1132










094306



815-819










Chim Acta 797 (2013) 30-39





209-222














(2006) 20478-20485

195



36-40



144-152



State Ionics 180 (2009) 381-385








Langmuir 19 (2003) 8807-8812












141-149










Chemistry C 112 (2008) 7158-7167








196







Abstract

















Reacutesumeacute
















technique PM-IRRAS




recherche

























I23 LA LACCASE 24











I42 LrsquoOR 33







I515 π-stacking 37





















II41 PRINCIPE 61



II51 PRINCIPE 61




























III3 CONCLUSION 98



101






RAYONS X 106

















117







graphite nu 123











IV3 CONCLUSION 142























V3 CONCLUSION 171


Annexes 181




1


2


3

































4

































5














6

7


8


9






















10












gauche)











11

























12





















13






















14

















15






















16




β




















17






























18





Vm [S]

[S] + KM (Eq I1)


k1














Anhydrase

carbonique

CO2

HCO3-

12times10-2

26times10-2

10times106

40times105

83times107

15times107


Fumarase Fumarate

Malate

50times10-6

25times10-5

80times102

90times102

16times108

36times107








19







dioxygegravene


moleacutecule






















20

































21





























22













hydroxyde [20]



23































versicolor


24



Oxygegravene

laccase

bilirubine oxydase

cytochrome oxydase

cytochrome c

Cu

Cu

Cu Fehegraveme

Fehegraveme

O2 +4H+ + 4e- 2H2O

peroxyde




Fehegraveme

Fehegraveme

H2O2 + 2H+ + 2e-

2H2O

I23La laccase





















25



(kDa)

pI Glycosylation ()

















spectroscopiques




A B


26

















A B C


27








436) (Figure I15)











LYS 59

LYS 157

LYS 71

LYS 174

LYS 194

Asn 54

Asn 333

Asn 436


28

































29






lrsquoencapsulation
















30

























A B C


31













lrsquoenzyme [3]
















32



























33
















I42Lrsquoor











34




















35



























36

























37











I515π-stacking
















38























39



























40














800 microAcm2

















41

































42































43

































44

































45










46

47


48


49














Extrait de levure 5

Malt 20

Agar 15



Maltose 20

Sels


KH2PO4

NaH2PO4

4

09

018


MgSO47 H2O

CaCl22 H2O

CuSO45 H2O

ZnSO47 H2O

FeSO47 H2O

05

0006

001

00005

0005

Thiamine 000001

25-Xylidine 03 mM



50































51





















Laccase A

Laccase B

Laccase X

70

2 U

mL

40

6 U

mL

26

Um

L

70

8 U

mL

17

41

Um

L


52
































53





droite)








(mL)

Activiteacute

(UmL)

Quantiteacute de

laccase (U)

Rendement

()





Laccase A (pic 1) 20 511 10226 30



Laccase B (pic 2) 20 421 842 248




5 1575 7877 30



0 2 4 6 8 10 12 14 16

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Acti

vit

eacute (

Um

L)

Fractions

2 4 6 8 10 12 14

0

20

40

60

80

100

120

Act

ivit

eacute (U

mL

)

Fractions

30

SA

20

SA

10

SA

30

SA

20

S

A

10

SA


54




















Eau

SDS 10


Temed

1 mL

248 mL

50 microL

375 microL

4 microL




Eau

PSA 10

Temed

05 mL

214 mL

60 microL

4 microL




55





















45 kDa

66 kDa

97 kDa

116 kDa


56


























sodium


57

























58













II6)






59






















60

















61





II41Principe









rocyanure













II51Principe





62







O2 + 4 H+ + 4 e- rarr 2 H2O





DO = ε l C


V harr n =

DO timesV

ε timesl harr

∆n

∆t =

∆DO

∆t times

V

ε timesl

rarr A = ∆n

∆t = [

∆DO

∆ttimes

V

ε timesl] times

1

Vlaccase

DO lrsquoabsorbance













bullage drsquoair


63






∆t (UmL)







∆t (U)


















64













dI= ϕn (A


z








I(infin)= ϕn (A



65





I(d)= ϕn (A


d

λcosθ)) (Eq II3)





I(d-infin)= ϕn (A


d

λcosθ) (Eq II4)





66

67



immobiliseacutee

68


69































70
































71
































72



















potentio-statique)


sinusoiumldale


73





Z(ω)=ΔE(ω)





respectivement














74
















= 1

















75






sein du LISE









(Fe(CN)63-Fe(CN)6












Fe(CN)63-Fe(CN)6




76









couche drsquoa-CNx







77

















-02 00 02 04 06-08

-06

-04

-02

00

02

04

06

08

i (m

A)

E (VECS)

20 mVs

30 mVs

40 mVs

50 mVs

60 mVs

100 mVs

002 003 004 005 006

-60x10-4

-40x10-4

-20x10-4

00

20x10-4

40x10-4

60x10-4

anodique

cathodique

i (A

)

V12

0 10 20 30 40 50 60

02

04

06

08

10

12

14

16

18

E (

VE

CS

)

Temps (s)

00 05 10 15 20

0

2

4

6

8

10

i (m

A)

E (VECS)

A B


78


graphitea-CNx AT

2846 eV 2857 eV 2866 eV 2877 eV 2888 eV


Graphite 756 156 60 28 002 -

graphitea-CNx 498 297 133 52 21 007 017

graphitea-CNx AT 431 279 148 90 52 017 012










300 295 290 285 280 275

0

20

40

60

80

100

Inte

nsi

teacute (

10

3)


spectre C1s

C sp2

C sp3

C-N C-O

C=N C=O

ligne de base

enveloppe

300 295 290 285 280 275

0

5

10

15

20

25

30

Inte

nsi

teacute (

10

3)


spectre C1s

C sp2

C sp3

C-N C-O

C=N C=O

COOH

ligne de base

enveloppe

300 295 290 285 280 275

0

5

10

15

20

25

30

Inte

nsi

teacute (

10

3)


spectre C1s

C sp2

C sp3

C-N C-O

C=N C=O

COOH

ligne de base

enveloppe

A B

C


79
































80



noire)


laccase












-04 -02 00 02 04 06 08 10

-100

-80

-60

-40

-20

0

20

40

60

J (micro

Ac

m2)

E (VECS)


10

20

30

40

50

60

-J (

microA

cm

2)

graphitea-CNx

graphitea-CNx AT


81

































82









de la laccase)




Adsorption Liaison

amide

Liaison

imine

Liaison

amide+imine

Adsorption Liaison

amide

Liaison

imine

Liaison

amide+imine


-J (microAcm2) 35 12 7 14

255

08 298 17 131 plusmn 28

396

66 379 446 99

Taux de

couverture

05 11 40 47 21 63 60 71



Taux de

couverture

64 112 105 101 24 74 24 69



denzyme= 5 nm 9 20 76 32 73

denzyme= 7 nm 8 17 64 28 61


denzyme= 5 nm 6 13 45 20 43

denzyme= 7 nm 6 13 44 20 42




83









Γmax = nmax enzyme






NA times Slaccase

(Eq III3)




NA times Slaccase
















84
















-6

















85




















300 295 290 285 280 275

0

2

4

6

8

10

12

14

Inte

nsi

teacute (

10

3)


C1s spectre

C sp2

C sp3

C-N C-O

COOH O=C-N

ligne de base

enveloppe

300 295 290 285 280 275

0

5

10

15

20

25

30

Inte

nsi

teacute (

10

3)


spectre C1s

C sp2

C sp3

C-N C-O

C=N C=O

COOH

ligne de base

enveloppe

A B


86



ICu

IC1s=

γnCuenzyme


[1-Λ]


CNxΛ+(1-γ)nC1s


+γnC1s


enzyme[1-Λ]

(Eq III6)


Λ= (8λ

2

denzyme2) [1- (

denzyme

2λ+1) exp (-

denzyme

2λ)] (Eq III7)



ICu

IC1s=

γnCuenzyme


[1-exp(-denzyme

λCuenzyme

cosΘ)]


CNxexp(-

denzyme

λC1sCNx

cosΘ)+(1-γ)nC1s


+γnC1senzyme


[1-exp(-denzyme

λC1senzyme

cosΘ)]

(Eq III8)


enzyme nC1s






nenzyme

=ρenzymetimesN

enzyme

MWenzyme (Eq III9)







= 4




λCu









87

































88













phase


89




lrsquoimage




















5 nm


90



















complegravete














91

























(Figure III12)


92



















0 5 10 15 20 25-7

-6

-5

-4

-3

-2

-1

i (micro

A)

Temps (h)






93












Scheacutema III4





0 4000 8000 12000 16000 200000

4000

8000

12000

16000

20000

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 2000

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

-Im

(Z

) (

Re (Z) (

graphitea-CN017


graphitea-CN017


graphitea-CN017


graphitea-CN017

laccase ajustement

graphitea-CN017


graphitea-CN017


graphitea-CN017


graphitea-CN017


-Im

(Z

) (

100 mHz

100 kHz 100 kHz

Re (Z) (Ω)


94











-1 0 1 2 3 4 5-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Phas

e

log(freacutequence)

-1 0 1 2 3 4 5-1

0

1

2

3

4

log(-

im Z

)

log(freacutequence)


95










4-



ZM(ω) = RM













96
























97



par adsorption













Rct1 Rct2 Rct1 Rct2






98































99

































100



101




102


103






























104








de la biocathode
























105




























graphiteCNWs120s


106












rayons X







107




























108






















109
































110



















111




avec deux facteurs

















i inej


112





















fractionnaire





113

IV143Plan composite




















114









Pi() = 100bi

2

Σbi2 (Eq IV3)

















115

















A B

C D


116


onduleacutes










A

B

C

D


117



et graphiteCNWs120s

C1s


graphiteCNWs60s 74 165 022 2 0022 -

graphiteCNWs120s 702 18 025 19 0021 -















300 295 290 285 280 2750

10

20

30

40

50

60

70

80

Inte

nsi

teacute


spectre C1s

C sp2

C sp3

C-O

C=O

ligne de base

enveloppe


118







4- en utilisant


correspondantes

A

B

C


119
























300 295 290 285 280 275

0

10

20

30

40

50

60

Inte

nsi

teacute (

10

3)


spectre C1s

C sp2

C sp3

C-N C-O

C=N C=O

COOH

ligne de base

enveloppe

300 295 290 285 280 275

0

10

20

30

40

50

60

Inte

nsi

teacute (

10

3)


spectre C1s

C sp2

C sp3

C-N C-O

C=N C=O

COOH

ligne de base

enveloppe

A B


120









et assez faible







des COOH




Csp3



graphiteCNWs60s 1p 665 163 81 58 30 015 8610-3 024

graphiteCNWs120s 1p 658 157 86 70 29 015 0011 023

2p 640 164 98 65 31 016 0011 025


graphiteCNWs60s 1p 715 132 74 57 20 012 001 018

2p 669 149 84 69 30 014 0011 022

graphiteCNWs120s 1p 680 142 75 80 23 014 8410-3 020

2p 642 165 86 78 30 016 0011 025



121







2p 18 109



2p 17 102


2p 17 102






















122











50

100

150

200

250

300

350

-J (

microA

cm

2)

CNWs 60s plasma air

covalent

adsorption


50

100

150

200

250

300

350

-J (

microA

cm

2)


covalent

adsorption


100

200

300

400

500

600

-J (

microA

cm

2)


covalent

adsorption


100

200

300

400

500

600

-J (

microA

cm

2)


covalent

adsorption

0

100

200

300

400

500

600

adsorption

2 passages

adsorption

1 passage

liaison amide

2 passages

liaison amide

1 passage

Plasma air

-J (

microA

cm

2)

graphiteCNWs120s

graphiteCNWs60s

graphite

0

100

200

300

400

500

600

adsorption

2 passages

adsorption

1 passage

liaison amide

2 passages

-J (

microA

cm

2)

Plasma azote

graphiteCNWs120s

graphiteCNWs60s

graphite

liaison amide

1 passage


123



























de graphite nu






124


























125


graphite nu


1 05 165 plusmn 23

2 07 280 plusmn 30

3 10 248 plusmn 02

4 12 391 plusmn 13

5 15 590 plusmn 13

6 17 751 plusmn 11

7 2 966 plusmn 10











04 08 12 16 200

20

40

60

80

100



126



-1 1







(Tableau IV6)



1 30 1 10 1000

2 80 1 10 2000

3 30 15 10 2000

4 80 15 10 1000

5 30 1 20 2000

6 80 1 20 1000

7 30 15 20 1000

8 80 15 20 2000









127

































128











(microUcm2)

Recouvrement

COOH

(times10-8 molcm2)

1 97 361 11 3 422

2 248 638 105 394

3 557 648 129 390

4 381 633 61 330

5 351 796 45 417

6 457 829 53 435

7 709 1026 32 436

8 684 975 168 485










129











obtenus

A B

C D


130


















1 120 240

2 160 240

3 120 420

4 160 420

5 112 330

6 168 330

7 140 203

8 140 457

9 140 330





131




1 12 240 1044

2 16 240 947

3 12 420 959

4 16 420 1151

5 11 330 182

6 17 330 1097

7 14 203 977

8 14 457 824

9 14 330 407














132












11 12 13 14 15 16 17

20

25

30

35

40

45

50

808 1011

64 1132

521 1013

1044

1011

407

1044 946

959 1151

182 1097

977

824

407

Vite

sse

(m

min

)

Distance (cm)

300 295 290 285 280 275-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Inte

nsi

teacute (

10

3)


spectre C1s

C sp2

C sp3

C-O

C=O

ligne de base

enveloppe


133


















16 24 00467 625

14 203 00396 522

15 20 00387 490

16 42 00370 452

1 10 00459 608

215 210 205 200 195 19000

01

02

03

04

05

06

07

08

Inte

nsi

teacute (

10

3)



134































135




graphiteCNWs60s


1 16 240

2 14 203

3 15 200

4 16 420

5 1 10







1 16 240 4404

2 14 203 3688

3 15 200 2163

4 16 420 2769

5 1 10 3122








136
















IV2512Plan Doehlert




300 295 290 285 280 275

00

02

04

06

08

10

Inte

nsi

teacute (

10

3)


non traiteacute

d = 10 cm V = 10 mmin

d = 14 cm V = 203 mmin

d = 16 cm V = 42 mmin

d = 15 cm V = 200 mmin

d = 16 cm V = 240 mmin


137



1 16 24

2 16 34

3 18 29

4 18 19

5 16 14

6 14 19

7 14 29











10 15 20 25 30 35

14

15

16

17

18

1823 1024

802404

654

885 1053

Vit

esse

(m

min

)

Distance (cm)


138









graphiteCNWs120s


1 16 240 1930 plusmn 1019

2 14 203 3805 plusmn 324

3 15 200 4258 plusmn 575

4 16 420 2274 plusmn 1052

5 1 10 4334plusmn 219
















139
































140






















100

200

300

400

500

-J (

microA

cm

2)

laccase

laccase oxydeacutee


141


















0

200

400

600

800

1000

d = 15 cm V = 20 mmin

avec EDC-NHS

d = 15 cm V = 20 mmin

sans EDC-NHS


avec EDC-NHS

-J(micro

Ac

m2)

laccase

laccase oxydeacutee


sans EDC-NHS


142
















denzyme = 5 nm 09 09 08 06 07 10 10

denzyme = 7 nm 11 11 10 08 09 12 12



denzyme = 5 nm 05 04 08













143

































144























145



plane

146


147































148

















149























150
























151

∆R

R=

Rp-Rs

Rp+Rs (Eq V1)




















70deg



152



















le Tableau V1


153



Amide I

1700-1600

Amide II

1580-1510














154

























155





















A B

A B


156




IRRAS ex situ

Type de

fonctionnalisation

de la plaque

Activation avec

EDC-NHS

pH du tampon

phosphate lors des


immobilisation














IRRAS in situ

Type de

fonctionnalisation

de la plaque

Activation avec

EDC-NHS

pH de la solution


immobilisation




157










cysteacuteamine









3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200 1000

00

1 u

a


28

56

29

66

2926

1741 16

38

153

9

1400

-145

0


158













thioglycolique


thioglycolique




cysteacuteamine

3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200 1000

00

1 u

a


296

6

2856

1716

2926

1735

1539

1420


159























3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200 1000

00

1 u

a




3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200 1000

00

1 u

a

nombre donde (cm-1

)



1658

15

48

18

30

A B

1656

15

44


160













3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200 1000

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)



3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200 1000

00

1 u

a

nombre donde (cm-1

)



2000 1800 1600 1400 120040

60

80

100

120

T

ransm

issi

on


B A 1656

1654

15

42

1542

1640


161























2000 1800 1600 1400 1200

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)

spectre IR

bande amide II

bande amide I

vibration COOH



162

























A B


163








opposeacutee

V212Analyse XPS








296 294 292 290 288 286 284 282 280 278

6000

7000

8000

9000

10000

11000

12000

Inte

nsi

teacute


C1s spectre

C sp2

C-O C-N

COOH O=C-N

ligne de base

enveloppe

940 938 936 934 932 930 92812000

12100

12200

12300

12400

12500

12600

inte

nsiteacute


296 294 292 290 288 286 284 282 280 2786000

7000

8000

9000

10000

11000

Inte

nsi

teacute


C1s spectre

C sp2

C-O C-N

COOH O=C-N

ligne de base

enveloppe

938 936 934 932 930 92813400

13600

13800

14000

14200

14400

14600

inte

nsi

teacute


A

B


164





Au1 Au3


denzyme= 5 nm 13 14

denzyme= 7 nm 11 12


denzyme= 5 nm 13 14

denzyme= 7 nm 11 12














V221Etude PM-IRRAS






165
























166











4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)


0 min

5 min

15 min

2100 2000 1900 1800 1700 1600 1500 1400 1300

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)


0 min

5 min

15 min

4000 3800 3600 3400 3200 3000 2800

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)


0 min

5 min

15 min

18

15

17

36

1715

1700

14

67

15

84

2957

2924

2851

13

77

17

77

A B

C


167

















4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000

00

1 u

a



15 min

45 min

1h15



2000 1900 1800 1700 1600 1500 1400

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)


15 min

45 min

1h15



4000 3800 3600 3400 3200 3000 2800

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)


15 min

45 min

1h15



3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200

00

1 u

a


2959 2

92

4

2856

29

64

29

25

28

46 1642

1736

15

59

1733

14

67

1630

A B

C D

15

55


168
















4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)


5 min

15 min

30 min

1h

1h30

2100 2000 1900 1800 1700 1600 1500 1400 1300

00

1 u

a



5 min

15 min

30 min

1h

1h30

4000 3800 3600 3400 3200 3000 2800

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)


5 min

15 min

30 min

1h

1h30

3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200 1000

00

1 u

a


1649

1735 1556

2924

2959

2851

2852 2

925

2962

1736

1467 1632

A B

C D

1553


169





















Au1rsquo 738 118 62

Au2rsquo 757 154 49

2000 1800 1600 1400 1200

spectre IR

bande amide II

bande amide I

vibration COOH


00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)

Peak Analysis

BaselineLine



Chi^2=330040E-007


Fitting Results

Max Height

000388

001334

000411

Area IntgP

1435122

7386503

1178376

FWHM

4569932

6844208

3545522

Center Grvty

157243484

164796144

173599132

Area Intg

018878

097164

015501

Peak Type

Gaussian

Gaussian

Gaussian

Peak Index

1

2

3


170











V222Analyses XPS





300 295 290 285 280 275

10

11

12

13

14

15

16

17

inte

nsiteacute

(1

03)


C1s spectre

C sp2

C sp3

C-O C-N

COOH O=C-N

ligne de base

enveloppe

940 938 936 934 932 930 928200

205

210

215

220

225

230

235

240

inte

nsiteacute

(1

03)


300 295 290 285 280 275

10

12

14

16

18

20

inte

nsiteacute

(1

03)


C1s spectre

C sp2

C sp3

C-O C-N

COOH O=C-N

ligne de base

enveloppe

928 930 932 934 936 938 940192

194

196

198

200

202

204

inte

nsi

teacute (

10

3)


A

B


171





Au1rsquo Au2rsquo



denzyme= 5 nm 12 14

denzyme= 7 nm 1 12


denzyme= 5 nm 12 14

denzyme= 7 nm 1 12




















172




tertiaire


















173

























174

175


176


177

































178

































179
























culture




drsquoaccroche

180

181

Annexes

182

Annexes

183



















Concentration (gL)



Glucose 10

Agar 15

Eau 1 L






Annexes

184








Tableau A2


Concentration gL


Glucose 10

Bactopeptone 10







Annexes

185








Concentration gL

Glucose 20


NH4Cl 132


MgSO4 7 H2O 024

CuSO4 0025

Thiamine 1 microM






3 4 5 6 7 8000

005

010

015

020

025

030

035

Act

ivit

eacute (U

mL

)

Jours

YL4

OPT3-2

OPT7-7

OPT6-3

OPT5-4

1 2 3 4 5 6

000

002

004

006

008

010

Act

ivit

eacute (U

mL

)

Jours

OPT3-2

OPT7-7

Annexes

186



Annexes

187














-14 -12 -10 -08 -06 -04 -02 00 02 04 06

-04

-03

-02

-01

00

01

i (m

A)

E (VECS)

-15 -10 -05 00 05 10

-300

-250

-200

-150

-100

-50

0

50

100

i (m

A)

E (VECS)

-20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180-0025

-0020

-0015

-0010

-0005

0000

0005

i (m

A)

Temps (s)

0 min

20 min

30 min

40 min

A B

Annexes

188




189




375-383



Power Sources 325 (2016) 252-263













745-756








Publications 2006



1533-1543













190



Research 40 (2007) 445-452



Soc 137 (2015) 8783-8794


Life Sci 72 (2015) 869-883
















(1997) 163-202



261-267







(1990) 99-102



3576




Reviews 37 (2008) 1188-1196




191



(2014) 104-114













(2008) 531-537























Reviews 38 (2009) 2214-2230







192









(2012) 228-235












Society 123 (2001) 3838-3839



160







Chemistry 21 (2015) 16868-16873






17212-17220








193



(2007) 989-996








(2016) 60-67




















(2016) 390-395



8895



5040-5043



(2012)




482

194



(2011) 1129-1132










094306



815-819










Chim Acta 797 (2013) 30-39





209-222














(2006) 20478-20485

195



36-40



144-152



State Ionics 180 (2009) 381-385








Langmuir 19 (2003) 8807-8812












141-149










Chemistry C 112 (2008) 7158-7167








196







Abstract

















Reacutesumeacute
















technique PM-IRRAS


















I23 LA LACCASE 24











I42 LrsquoOR 33







I515 π-stacking 37





















II41 PRINCIPE 61



II51 PRINCIPE 61




























III3 CONCLUSION 98



101






RAYONS X 106

















117







graphite nu 123











IV3 CONCLUSION 142























V3 CONCLUSION 171


Annexes 181




1


2


3

































4

































5














6

7


8


9






















10












gauche)











11

























12





















13






















14

















15






















16




β




















17






























18





Vm [S]

[S] + KM (Eq I1)


k1














Anhydrase

carbonique

CO2

HCO3-

12times10-2

26times10-2

10times106

40times105

83times107

15times107


Fumarase Fumarate

Malate

50times10-6

25times10-5

80times102

90times102

16times108

36times107








19







dioxygegravene


moleacutecule






















20

































21





























22













hydroxyde [20]



23































versicolor


24



Oxygegravene

laccase

bilirubine oxydase

cytochrome oxydase

cytochrome c

Cu

Cu

Cu Fehegraveme

Fehegraveme

O2 +4H+ + 4e- 2H2O

peroxyde




Fehegraveme

Fehegraveme

H2O2 + 2H+ + 2e-

2H2O

I23La laccase





















25



(kDa)

pI Glycosylation ()

















spectroscopiques




A B


26

















A B C


27








436) (Figure I15)











LYS 59

LYS 157

LYS 71

LYS 174

LYS 194

Asn 54

Asn 333

Asn 436


28

































29






lrsquoencapsulation
















30

























A B C


31













lrsquoenzyme [3]
















32



























33
















I42Lrsquoor











34




















35



























36

























37











I515π-stacking
















38























39



























40














800 microAcm2

















41

































42































43

































44

































45










46

47


48


49














Extrait de levure 5

Malt 20

Agar 15



Maltose 20

Sels


KH2PO4

NaH2PO4

4

09

018


MgSO47 H2O

CaCl22 H2O

CuSO45 H2O

ZnSO47 H2O

FeSO47 H2O

05

0006

001

00005

0005

Thiamine 000001

25-Xylidine 03 mM



50































51





















Laccase A

Laccase B

Laccase X

70

2 U

mL

40

6 U

mL

26

Um

L

70

8 U

mL

17

41

Um

L


52
































53





droite)








(mL)

Activiteacute

(UmL)

Quantiteacute de

laccase (U)

Rendement

()





Laccase A (pic 1) 20 511 10226 30



Laccase B (pic 2) 20 421 842 248




5 1575 7877 30



0 2 4 6 8 10 12 14 16

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Acti

vit

eacute (

Um

L)

Fractions

2 4 6 8 10 12 14

0

20

40

60

80

100

120

Act

ivit

eacute (U

mL

)

Fractions

30

SA

20

SA

10

SA

30

SA

20

S

A

10

SA


54




















Eau

SDS 10


Temed

1 mL

248 mL

50 microL

375 microL

4 microL




Eau

PSA 10

Temed

05 mL

214 mL

60 microL

4 microL




55





















45 kDa

66 kDa

97 kDa

116 kDa


56


























sodium


57

























58













II6)






59






















60

















61





II41Principe









rocyanure













II51Principe





62







O2 + 4 H+ + 4 e- rarr 2 H2O





DO = ε l C


V harr n =

DO timesV

ε timesl harr

∆n

∆t =

∆DO

∆t times

V

ε timesl

rarr A = ∆n

∆t = [

∆DO

∆ttimes

V

ε timesl] times

1

Vlaccase

DO lrsquoabsorbance













bullage drsquoair


63






∆t (UmL)







∆t (U)


















64













dI= ϕn (A


z








I(infin)= ϕn (A



65





I(d)= ϕn (A


d

λcosθ)) (Eq II3)





I(d-infin)= ϕn (A


d

λcosθ) (Eq II4)





66

67



immobiliseacutee

68


69































70
































71
































72



















potentio-statique)


sinusoiumldale


73





Z(ω)=ΔE(ω)





respectivement














74
















= 1

















75






sein du LISE









(Fe(CN)63-Fe(CN)6












Fe(CN)63-Fe(CN)6




76









couche drsquoa-CNx







77

















-02 00 02 04 06-08

-06

-04

-02

00

02

04

06

08

i (m

A)

E (VECS)

20 mVs

30 mVs

40 mVs

50 mVs

60 mVs

100 mVs

002 003 004 005 006

-60x10-4

-40x10-4

-20x10-4

00

20x10-4

40x10-4

60x10-4

anodique

cathodique

i (A

)

V12

0 10 20 30 40 50 60

02

04

06

08

10

12

14

16

18

E (

VE

CS

)

Temps (s)

00 05 10 15 20

0

2

4

6

8

10

i (m

A)

E (VECS)

A B


78


graphitea-CNx AT

2846 eV 2857 eV 2866 eV 2877 eV 2888 eV


Graphite 756 156 60 28 002 -

graphitea-CNx 498 297 133 52 21 007 017

graphitea-CNx AT 431 279 148 90 52 017 012










300 295 290 285 280 275

0

20

40

60

80

100

Inte

nsi

teacute (

10

3)


spectre C1s

C sp2

C sp3

C-N C-O

C=N C=O

ligne de base

enveloppe

300 295 290 285 280 275

0

5

10

15

20

25

30

Inte

nsi

teacute (

10

3)


spectre C1s

C sp2

C sp3

C-N C-O

C=N C=O

COOH

ligne de base

enveloppe

300 295 290 285 280 275

0

5

10

15

20

25

30

Inte

nsi

teacute (

10

3)


spectre C1s

C sp2

C sp3

C-N C-O

C=N C=O

COOH

ligne de base

enveloppe

A B

C


79
































80



noire)


laccase












-04 -02 00 02 04 06 08 10

-100

-80

-60

-40

-20

0

20

40

60

J (micro

Ac

m2)

E (VECS)


10

20

30

40

50

60

-J (

microA

cm

2)

graphitea-CNx

graphitea-CNx AT


81

































82









de la laccase)




Adsorption Liaison

amide

Liaison

imine

Liaison

amide+imine

Adsorption Liaison

amide

Liaison

imine

Liaison

amide+imine


-J (microAcm2) 35 12 7 14

255

08 298 17 131 plusmn 28

396

66 379 446 99

Taux de

couverture

05 11 40 47 21 63 60 71



Taux de

couverture

64 112 105 101 24 74 24 69



denzyme= 5 nm 9 20 76 32 73

denzyme= 7 nm 8 17 64 28 61


denzyme= 5 nm 6 13 45 20 43

denzyme= 7 nm 6 13 44 20 42




83









Γmax = nmax enzyme






NA times Slaccase

(Eq III3)




NA times Slaccase
















84
















-6

















85




















300 295 290 285 280 275

0

2

4

6

8

10

12

14

Inte

nsi

teacute (

10

3)


C1s spectre

C sp2

C sp3

C-N C-O

COOH O=C-N

ligne de base

enveloppe

300 295 290 285 280 275

0

5

10

15

20

25

30

Inte

nsi

teacute (

10

3)


spectre C1s

C sp2

C sp3

C-N C-O

C=N C=O

COOH

ligne de base

enveloppe

A B


86



ICu

IC1s=

γnCuenzyme


[1-Λ]


CNxΛ+(1-γ)nC1s


+γnC1s


enzyme[1-Λ]

(Eq III6)


Λ= (8λ

2

denzyme2) [1- (

denzyme

2λ+1) exp (-

denzyme

2λ)] (Eq III7)



ICu

IC1s=

γnCuenzyme


[1-exp(-denzyme

λCuenzyme

cosΘ)]


CNxexp(-

denzyme

λC1sCNx

cosΘ)+(1-γ)nC1s


+γnC1senzyme


[1-exp(-denzyme

λC1senzyme

cosΘ)]

(Eq III8)


enzyme nC1s






nenzyme

=ρenzymetimesN

enzyme

MWenzyme (Eq III9)







= 4




λCu









87

































88













phase


89




lrsquoimage




















5 nm


90



















complegravete














91

























(Figure III12)


92



















0 5 10 15 20 25-7

-6

-5

-4

-3

-2

-1

i (micro

A)

Temps (h)






93












Scheacutema III4





0 4000 8000 12000 16000 200000

4000

8000

12000

16000

20000

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 2000

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

-Im

(Z

) (

Re (Z) (

graphitea-CN017


graphitea-CN017


graphitea-CN017


graphitea-CN017

laccase ajustement

graphitea-CN017


graphitea-CN017


graphitea-CN017


graphitea-CN017


-Im

(Z

) (

100 mHz

100 kHz 100 kHz

Re (Z) (Ω)


94











-1 0 1 2 3 4 5-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Phas

e

log(freacutequence)

-1 0 1 2 3 4 5-1

0

1

2

3

4

log(-

im Z

)

log(freacutequence)


95










4-



ZM(ω) = RM













96
























97



par adsorption













Rct1 Rct2 Rct1 Rct2






98































99

































100



101




102


103






























104








de la biocathode
























105




























graphiteCNWs120s


106












rayons X







107




























108






















109
































110



















111




avec deux facteurs

















i inej


112





















fractionnaire





113

IV143Plan composite




















114









Pi() = 100bi

2

Σbi2 (Eq IV3)

















115

















A B

C D


116


onduleacutes










A

B

C

D


117



et graphiteCNWs120s

C1s


graphiteCNWs60s 74 165 022 2 0022 -

graphiteCNWs120s 702 18 025 19 0021 -















300 295 290 285 280 2750

10

20

30

40

50

60

70

80

Inte

nsi

teacute


spectre C1s

C sp2

C sp3

C-O

C=O

ligne de base

enveloppe


118







4- en utilisant


correspondantes

A

B

C


119
























300 295 290 285 280 275

0

10

20

30

40

50

60

Inte

nsi

teacute (

10

3)


spectre C1s

C sp2

C sp3

C-N C-O

C=N C=O

COOH

ligne de base

enveloppe

300 295 290 285 280 275

0

10

20

30

40

50

60

Inte

nsi

teacute (

10

3)


spectre C1s

C sp2

C sp3

C-N C-O

C=N C=O

COOH

ligne de base

enveloppe

A B


120









et assez faible







des COOH




Csp3



graphiteCNWs60s 1p 665 163 81 58 30 015 8610-3 024

graphiteCNWs120s 1p 658 157 86 70 29 015 0011 023

2p 640 164 98 65 31 016 0011 025


graphiteCNWs60s 1p 715 132 74 57 20 012 001 018

2p 669 149 84 69 30 014 0011 022

graphiteCNWs120s 1p 680 142 75 80 23 014 8410-3 020

2p 642 165 86 78 30 016 0011 025



121







2p 18 109



2p 17 102


2p 17 102






















122











50

100

150

200

250

300

350

-J (

microA

cm

2)

CNWs 60s plasma air

covalent

adsorption


50

100

150

200

250

300

350

-J (

microA

cm

2)


covalent

adsorption


100

200

300

400

500

600

-J (

microA

cm

2)


covalent

adsorption


100

200

300

400

500

600

-J (

microA

cm

2)


covalent

adsorption

0

100

200

300

400

500

600

adsorption

2 passages

adsorption

1 passage

liaison amide

2 passages

liaison amide

1 passage

Plasma air

-J (

microA

cm

2)

graphiteCNWs120s

graphiteCNWs60s

graphite

0

100

200

300

400

500

600

adsorption

2 passages

adsorption

1 passage

liaison amide

2 passages

-J (

microA

cm

2)

Plasma azote

graphiteCNWs120s

graphiteCNWs60s

graphite

liaison amide

1 passage


123



























de graphite nu






124


























125


graphite nu


1 05 165 plusmn 23

2 07 280 plusmn 30

3 10 248 plusmn 02

4 12 391 plusmn 13

5 15 590 plusmn 13

6 17 751 plusmn 11

7 2 966 plusmn 10











04 08 12 16 200

20

40

60

80

100



126



-1 1







(Tableau IV6)



1 30 1 10 1000

2 80 1 10 2000

3 30 15 10 2000

4 80 15 10 1000

5 30 1 20 2000

6 80 1 20 1000

7 30 15 20 1000

8 80 15 20 2000









127

































128











(microUcm2)

Recouvrement

COOH

(times10-8 molcm2)

1 97 361 11 3 422

2 248 638 105 394

3 557 648 129 390

4 381 633 61 330

5 351 796 45 417

6 457 829 53 435

7 709 1026 32 436

8 684 975 168 485










129











obtenus

A B

C D


130


















1 120 240

2 160 240

3 120 420

4 160 420

5 112 330

6 168 330

7 140 203

8 140 457

9 140 330





131




1 12 240 1044

2 16 240 947

3 12 420 959

4 16 420 1151

5 11 330 182

6 17 330 1097

7 14 203 977

8 14 457 824

9 14 330 407














132












11 12 13 14 15 16 17

20

25

30

35

40

45

50

808 1011

64 1132

521 1013

1044

1011

407

1044 946

959 1151

182 1097

977

824

407

Vite

sse

(m

min

)

Distance (cm)

300 295 290 285 280 275-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Inte

nsi

teacute (

10

3)


spectre C1s

C sp2

C sp3

C-O

C=O

ligne de base

enveloppe


133


















16 24 00467 625

14 203 00396 522

15 20 00387 490

16 42 00370 452

1 10 00459 608

215 210 205 200 195 19000

01

02

03

04

05

06

07

08

Inte

nsi

teacute (

10

3)



134































135




graphiteCNWs60s


1 16 240

2 14 203

3 15 200

4 16 420

5 1 10







1 16 240 4404

2 14 203 3688

3 15 200 2163

4 16 420 2769

5 1 10 3122








136
















IV2512Plan Doehlert




300 295 290 285 280 275

00

02

04

06

08

10

Inte

nsi

teacute (

10

3)


non traiteacute

d = 10 cm V = 10 mmin

d = 14 cm V = 203 mmin

d = 16 cm V = 42 mmin

d = 15 cm V = 200 mmin

d = 16 cm V = 240 mmin


137



1 16 24

2 16 34

3 18 29

4 18 19

5 16 14

6 14 19

7 14 29











10 15 20 25 30 35

14

15

16

17

18

1823 1024

802404

654

885 1053

Vit

esse

(m

min

)

Distance (cm)


138









graphiteCNWs120s


1 16 240 1930 plusmn 1019

2 14 203 3805 plusmn 324

3 15 200 4258 plusmn 575

4 16 420 2274 plusmn 1052

5 1 10 4334plusmn 219
















139
































140






















100

200

300

400

500

-J (

microA

cm

2)

laccase

laccase oxydeacutee


141


















0

200

400

600

800

1000

d = 15 cm V = 20 mmin

avec EDC-NHS

d = 15 cm V = 20 mmin

sans EDC-NHS


avec EDC-NHS

-J(micro

Ac

m2)

laccase

laccase oxydeacutee


sans EDC-NHS


142
















denzyme = 5 nm 09 09 08 06 07 10 10

denzyme = 7 nm 11 11 10 08 09 12 12



denzyme = 5 nm 05 04 08













143

































144























145



plane

146


147































148

















149























150
























151

∆R

R=

Rp-Rs

Rp+Rs (Eq V1)




















70deg



152



















le Tableau V1


153



Amide I

1700-1600

Amide II

1580-1510














154

























155





















A B

A B


156




IRRAS ex situ

Type de

fonctionnalisation

de la plaque

Activation avec

EDC-NHS

pH du tampon

phosphate lors des


immobilisation














IRRAS in situ

Type de

fonctionnalisation

de la plaque

Activation avec

EDC-NHS

pH de la solution


immobilisation




157










cysteacuteamine









3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200 1000

00

1 u

a


28

56

29

66

2926

1741 16

38

153

9

1400

-145

0


158













thioglycolique


thioglycolique




cysteacuteamine

3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200 1000

00

1 u

a


296

6

2856

1716

2926

1735

1539

1420


159























3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200 1000

00

1 u

a




3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200 1000

00

1 u

a

nombre donde (cm-1

)



1658

15

48

18

30

A B

1656

15

44


160













3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200 1000

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)



3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200 1000

00

1 u

a

nombre donde (cm-1

)



2000 1800 1600 1400 120040

60

80

100

120

T

ransm

issi

on


B A 1656

1654

15

42

1542

1640


161























2000 1800 1600 1400 1200

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)

spectre IR

bande amide II

bande amide I

vibration COOH



162

























A B


163








opposeacutee

V212Analyse XPS








296 294 292 290 288 286 284 282 280 278

6000

7000

8000

9000

10000

11000

12000

Inte

nsi

teacute


C1s spectre

C sp2

C-O C-N

COOH O=C-N

ligne de base

enveloppe

940 938 936 934 932 930 92812000

12100

12200

12300

12400

12500

12600

inte

nsiteacute


296 294 292 290 288 286 284 282 280 2786000

7000

8000

9000

10000

11000

Inte

nsi

teacute


C1s spectre

C sp2

C-O C-N

COOH O=C-N

ligne de base

enveloppe

938 936 934 932 930 92813400

13600

13800

14000

14200

14400

14600

inte

nsi

teacute


A

B


164





Au1 Au3


denzyme= 5 nm 13 14

denzyme= 7 nm 11 12


denzyme= 5 nm 13 14

denzyme= 7 nm 11 12














V221Etude PM-IRRAS






165
























166











4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)


0 min

5 min

15 min

2100 2000 1900 1800 1700 1600 1500 1400 1300

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)


0 min

5 min

15 min

4000 3800 3600 3400 3200 3000 2800

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)


0 min

5 min

15 min

18

15

17

36

1715

1700

14

67

15

84

2957

2924

2851

13

77

17

77

A B

C


167

















4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000

00

1 u

a



15 min

45 min

1h15



2000 1900 1800 1700 1600 1500 1400

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)


15 min

45 min

1h15



4000 3800 3600 3400 3200 3000 2800

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)


15 min

45 min

1h15



3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200

00

1 u

a


2959 2

92

4

2856

29

64

29

25

28

46 1642

1736

15

59

1733

14

67

1630

A B

C D

15

55


168
















4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)


5 min

15 min

30 min

1h

1h30

2100 2000 1900 1800 1700 1600 1500 1400 1300

00

1 u

a



5 min

15 min

30 min

1h

1h30

4000 3800 3600 3400 3200 3000 2800

00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)


5 min

15 min

30 min

1h

1h30

3000 2800 2000 1800 1600 1400 1200 1000

00

1 u

a


1649

1735 1556

2924

2959

2851

2852 2

925

2962

1736

1467 1632

A B

C D

1553


169





















Au1rsquo 738 118 62

Au2rsquo 757 154 49

2000 1800 1600 1400 1200

spectre IR

bande amide II

bande amide I

vibration COOH


00

1 u

a

nombre dondes (cm-1

)

Peak Analysis

BaselineLine



Chi^2=330040E-007


Fitting Results

Max Height

000388

001334

000411

Area IntgP

1435122

7386503

1178376

FWHM

4569932

6844208

3545522

Center Grvty

157243484

164796144

173599132

Area Intg

018878

097164

015501

Peak Type

Gaussian

Gaussian

Gaussian

Peak Index

1

2

3


170











V222Analyses XPS





300 295 290 285 280 275

10

11

12

13

14

15

16

17

inte

nsiteacute

(1

03)


C1s spectre

C sp2

C sp3

C-O C-N

COOH O=C-N

ligne de base

enveloppe

940 938 936 934 932 930 928200

205

210

215

220

225

230

235

240

inte

nsiteacute

(1

03)


300 295 290 285 280 275

10

12

14

16

18

20

inte

nsiteacute

(1

03)


C1s spectre

C sp2

C sp3

C-O C-N

COOH O=C-N

ligne de base

enveloppe

928 930 932 934 936 938 940192

194

196

198

200

202

204

inte

nsi

teacute (

10

3)


A

B


171





Au1rsquo Au2rsquo



denzyme= 5 nm 12 14

denzyme= 7 nm 1 12


denzyme= 5 nm 12 14

denzyme= 7 nm 1 12




















172




tertiaire


















173

























174

175


176


177

































178

































179
























culture




drsquoaccroche

180

181

Annexes

182

Annexes

183



















Concentration (gL)



Glucose 10

Agar 15

Eau 1 L






Annexes

184








Tableau A2


Concentration gL


Glucose 10

Bactopeptone 10







Annexes

185








Concentration gL

Glucose 20


NH4Cl 132


MgSO4 7 H2O 024

CuSO4 0025

Thiamine 1 microM






3 4 5 6 7 8000

005

010

015

020

025

030

035

Act

ivit

eacute (U

mL

)

Jours

YL4

OPT3-2

OPT7-7

OPT6-3

OPT5-4

1 2 3 4 5 6

000

002

004

006

008

010

Act

ivit

eacute (U

mL

)

Jours

OPT3-2

OPT7-7

Annexes

186



Annexes

187














-14 -12 -10 -08 -06 -04 -02 00 02 04 06

-04

-03

-02

-01

00

01

i (m

A)

E (VECS)

-15 -10 -05 00 05 10

-300

-250

-200

-150

-100

-50

0

50

100

i (m

A)

E (VECS)

-20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180-0025

-0020

-0015

-0010

-0005

0000

0005

i (m

A)

Temps (s)

0 min

20 min

30 min

40 min

A B

Annexes

188




189




375-383



Power Sources 325 (2016) 252-263













745-756








Publications 2006



1533-1543













190



Research 40 (2007) 445-452



Soc 137 (2015) 8783-8794


Life Sci 72 (2015) 869-883
















(1997) 163-202



261-267







(1990) 99-102



3576




Reviews 37 (2008) 1188-1196




191



(2014) 104-114













(2008) 531-537























Reviews 38 (2009) 2214-2230







192









(2012) 228-235












Society 123 (2001) 3838-3839



160







Chemistry 21 (2015) 16868-16873






17212-17220








193



(2007) 989-996








(2016) 60-67




















(2016) 390-395



8895



5040-5043



(2012)




482

194



(2011) 1129-1132










094306



815-819










Chim Acta 797 (2013) 30-39





209-222














(2006) 20478-20485

195



36-40



144-152



State Ionics 180 (2009) 381-385








Langmuir 19 (2003) 8807-8812












141-149










Chemistry C 112 (2008) 7158-7167








196







Abstract

















Reacutesumeacute
















technique PM-IRRAS



Documents

Développement de biocathodes pour biopiles enzymatiques