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• Dr. J. Galon
• Matthieu CAMUS
INSERM U255Dirigée par : Pr. H. FridmanCentre des CordeliersParis VI
Outils Bioinformatiquespour l‘Analyse du
Microenvironnement Tumoral
Lymphocytes T Régulateurs,Lymphocytes B, NK, Macrophages …Lymphocytes T Régulateurs,Lymphocytes B, NK, Macrophages …
Cellules présentatrices d’AntigènesCellules présentatrices d’Antigènes
Lymphocytes TEffecteurs
Lymphocytes TEffecteurs
Cytokines
Facteurs de croissance
Chemokines
Immunologie des TumeursImmunologie des Tumeurs
Cellule Dendritique
Micro-Environnement Tumoral
-> analyses à Large-échelle pour l’étude des cellules infiltrantes
Stroma
Background
Tumeur
FACS Phenotype Data (n=820)
FACS Functional Data (n=980)
DNA MicroArrays (n=12000)
CIPHERGEN CollaborationSELDI-TOF (proteomic)
Colon cancer : Approaches
parameters patients
10
950
12000
10ALPHELIS CollaborationTissue MicroArrays (TMA)(1 marqueur cellulaire, deux régions)
APPLIED CollaborationTaqman PCR LDA (n=48)
• Base de données (autorisation/authentification/CNIL)
• Gestion des données cliniques
• Gestion des données biologiques et expérimentales
• Modules de connections aux appareils de laboratoire
• Requêtes multicritères (listing, analyse)
• Connections aux autres bases (MARS, publiques)
• Connections aux logiciels d’analyse (Genesis, PathwayExporer)
• Modules d’analyses et statistiques
14.12.2005By B. Mlecnik & R. Molidor
V1.5.2
(+ 20 versions)
-> 1221 patients inclus
-> plus de 500 000 paramètres
Clinical info
Materialinfo
(autorisation/authentification/CNIL)
Connection
PhAnS
FAnS
Pathways OntologyPubmedMARS
Databases
ClueGO
Knowledge Explorer
ARACNe mapper
QueryPathway Explorer
Software
Genesis
Stats
DATA
TME
v.1.5.2 14/12/2005
Phénotypage 50 marqueurs (Ac fluorescents)
Acquisition (cytomètre)
Tri (PhAnS 2.0) et stockage des données (TME.db)
Analyses Statistiques (StatView, Excel)
Clustering Marqueurs/Patients (Genesis)
Phénotypage 50 marqueurs (Ac fluorescents)
Acquisition (cytomètre)
Tri (PhAnS 2.0) et stockage des données (TME.db)
Analyses Statistiques (StatView, Excel)
Clustering Marqueurs/Patients (Genesis)
Exemple: Analyses FACSExemple: Analyses FACS
CD3
CD8
SSC
CD3
Analyses FACSAnalyses FACS
(%)(MFI)
(forme)
PhAnS2
Flow cytometry
TME
PHENOTYPIC ANALYSIS
Tri et stockage des données FACSTri et stockage des données FACS
416 paramètres
Global representation of clustered marker expression values (% and MFI)
616 parameters
39 patients
100
104
0
1
%
MFI
Genesis software
-2 +2
Patients (C) Non-tumoral
Principal Componant Analysis(PCA)
Patients (A) colon cancer
Patients (B) colon cancer
Healthy donnors
Healthy donnors (in vitro stimulation)
Représentation et analyse des données FACSReprésentation et analyse des données FACS
Vers de nouvelles approches d’analyse globale
1) Nouvelles méthodes de visualisation de groupes fonctionnels
• Intégration aux voies de signalisation (PathwayExplorer)• Intégration aux données d’ontologie (ClueGO)
2) Analyse des réseaux d’interactions
• Analyse de reconstruction de réseau cellulaire (ARACNe)• Analyse des interactions positive et négatives indirectes
3) Intégration automatique de la connaissance aux données
• Cartographie de la bibliographie (KnowledgeExplorer)
(15 millions d’articles scientifiques) • Analyse en réseau de prédiction
Analyses BioinformatiquesAnalyses Bioinformatiques
ARACNe (algorithm for the reconstruction of accurate cellular networks) Nat Genet. 2005 (4):382-90. Reverse engineering of regulatory networks in human B cells.
Basso K, Margolin AA, Stolovitzky G, Klein U, Dalla-Favera R, Califano A.
Cancer Colorectal
4ème cause de décès dans le monde(environ 500.000 décès par an)
Un des cancers les plus fréquents
Incidence Accrue (+40% ces 20 dernières années)
Background
Le rôle de l’infiltrat immunitaire dans le contrôle
des étapes précoces de l’invasion métastatique (VELIPI)
est peu connu chez l’homme
et pourrait avoir un impact important
sur le devenir clinique des patients.
VELIPI :venous emboli (VE)lymphatic invasion (LI)perineural invasion (PI)
Observations PréliminairesAnalyses univariées de survie sur la population de patients
(n = 959):
VELIPI est un puissant facteur pronostic (p<10-9)
0 25 75 125 175 225
Survival (months)
0
20
40
60
80
100O
vera
ll S
urv
ival (%
)
[VELIPI ]=yes
[VELIPI ]=no
Première QuestionPremière Question
Quelles sont les différences quantitatives et qualitatives
de l’infiltrat immunitaire entre les patients présentant
des signes précoces d’invasion métastatique (VELIPI+)
par rapport aux patients VELIPI-?
Analyses de coupes de tissus
Analyses FACS
Analyses PCR (Applied-Biosystems).
TUMEUR
Les patients VELIPI- presentent une fréquence accrue
d’infiltrat immunitaire fort par rapport aux patients VELIPI+.
Coupes de Tissus
n=377
FACS : Cellules TotalesFACS : Cellules Totales
0
5
10
15
20
25
CD3+ CD14+ CD19+ CD56+CD3-
CD3+CD56+
CD45+CD1a+
P<0.05
VELIPI +
VELIPI -
*
% p
ositi
ve c
ells
Diminution significative de l’infiltrat lymphocytaire T chez les patients VELIPI+.
n=39
Taqman LDA
Reponse Immunitaire Adaptadive
Les patients VELIPI-/récidive- présentent
des réponses immunitaires adaptative plus fortes
Sp
ec
ific
ge
ne
/18
S
RN
A (
%)
IFN-g
0
200
400
600
+ + - -
+ - + -
VELIPI
Relapse
CD8a
0
100
200
300
+ + - -
+ - + - + - + -
+ + - -
GZM-B
0
200
400
600
GNLY
0
200
400
600
800
+ + - -
+ - + -
p<0.05
n = 75
Conclusions 1Conclusions 1
Corrélation entre les réponses immunitaires adaptatives
conduites par les lymphocytes T CD8 effecteurs
et
les patients VELIPI- qui ne subiront pas de rechute.
Diminution significative de l’infiltrat (lymphocytes T)
chez les patients VELIPI+ par rapport aux patients
VELIPI-.
Seconde questionSeconde question
Les lymphocytes T effecteurs et effecteurs-mémoires
sont-ils directement impliqués dans le contrôle des
évènement métastatiques précoces?
Analyses FACS
Analyses des Tissue MicroArrays (TMA)
VELIPI - VELIPI +
p<0.05
Marqueurs d’expression significativement differencielle (p<0.05)Entre les patients VELIPI- et VELIPI+
FACSFACS
CD45RO
Mémoire
2 zones représentative du centre de la tumeur sont forées à partir de blocs de tissus inclus en paraffine
Les carottes sont déposées dons un bloc récepteur, ensuite découpépour effectuer des analyses immunohistochimiques (IHC).
Tissue MicroArrays (TMA)
CD45RO
=> 6640 IHC
CD45RO
Analyse de spots de tissus tumoraux par Immunohistochimie
(Spot Browser®, ALPHELYS)
Tissue MicroArrays (TMA)
Tissue
CD45RO
TMA (n=415)
0 40 80 120 160
Survival (months)
CD45RO-hi
CD45RO-lo
p<0.0001
% S
urv
iva
l
0
20
40
60
80
100
Différences significatives de survie des patientsen fonction de la densité (hi/lo)
des lymphocytes T CD45RO+ mémoires infliltrés.
Conclusions 2Conclusions 2
Cette étude à large-échelle
indique un role positif des
lymphocytes T effecteurs-mémoires
dans le contrôle local de l’invasion métastatique
et le devenir clinique des patients.
Conclusions Finales
• Réseau Multidisciplinaire, approches, techniques,
et bioinformatique : fonctionnel et efficace
• Validation du concept et de sa faisabilité
La nature et la densité de l’infiltrat immunitaire influencent les processus
métastatiques précoces et le devenir cliniquedes patients atteint de cancers colorectaux.
fonctionnalité des lymphocytes infiltrant les tumeurs
(activation, proliferation et migration)
PerspectivesPerspectives
Quelle est l’importance de la
coordination de la réponse immunitaire
sur le pronostic clinique?
1)
2)
Equipe (INSERM U255, Cordeliers)
• Jérôme GALON, (CR)• Franck PAGES, (MCU-PH)
• Anne COSTES, (Assistante-Ingénieur)• Aurélia RODI, (Technicienne)• Matthieu CAMUS, (4ième année thèse)• Amos KIRILOVSKY, (1ière année thèse)• Marie TOSOLINI, (1ière année thèse)• Pauline BERGER, (Stage Technicienne)• Nicolas GOUGELET, (Stage Technicien)
• Wolf-Hervé FRIDMAN (PU-PH)
Bioinformatic Laboratory (Graz)
• Robert MOLIDOR, (PostDoc)• Bernhard MLECNIK, (Thèse)• Thomas RAMSAUER, (Master)• Fatima SANCHEZ-CABO (PostDoc)
• Zlatko TRAJANOSKI (PU)
Departement de Chirurgie Digestive(HEGP)
• Anne BERGER (PU-PH)• Paul-Henri CUGNENC (PU-PH)
Collaborations Industries
• Applied-Biosystems (TaqMan-LDA)• Ciphergen (SELDI-TOF protéomic)• Alphelys (TMA)• SISPIA (Informatics)
Merci!Merci!