DNA-Analytik���SS 2013

Dr. Holger Klapproth

3. Vorlesungsstunde:���Die Geheimnisse der PCR

5´

2´

O

OH

N

HN

O

OPO

OH

O

POPHO

OH

O

OH

O

N

N

H2N

Guanin

The Polymerase Chain Reaction (PCR)is exponential

Primer annealingat 60-50°C

Melting of DNA at~95°C Polymerisation at

72°C

1. Cycle 2. Cycle

PCR and TaqMan are registered trademarks of Hoffmann La Roche and Perkin Elmer

PCR

Was brauche ich zur PCR

•  Eine DNA-Vorlage := Template •  Zwei kurze DNA Abschnitte, die an das Template

binden := Primer •  Die thermostabile DNA-Polymerase •  Desoxyribonukleotidtriphosphate:= dNTPs (dATP,

dCTP, dGTP, dTTP) •  Das Gerät zur Durchführung := Thermocycler

Was ist das Template ?

•  Das Template ist eine DNA. •  Die Template-DNA kann doppelsträngig (Normalfall)

oder einzelsträngig sein. •  Die DNA sollte eine Länge von 60-5000 Nukleotiden

haben. •  Besondere Enzymgemische (Long-PCR) können auch

bis zu 50000 Nukleotide lange Templates amplifizieren.

Und wie geht die PCR ?

3 Phasen: 1. Denaturierung 2. Annealing 3. Extension

40x

Faustregel: pro Minute werden���in der Extension Phase ca. ���1.000 Nukleotide aufgebaut

Was sind Primer

•  Primer sind kurze DNA-Stränge •  Die an die Template-DNA binden •  Die ca. 20 Nukleotide (nt) Länge aufweisen •  Deren Schmelzpunkt bei ca 60° C liegt •  Die Primer binden bei geeigneten Temperaturen (z.B. 60°) an je

einen Template-Strang •  Bei der Extension baut die Polymerase von den Primern an den

neuen DNA-Strang auf

Was sind PCR-Primerpaare

•  Kurze DNA-Sonden, die an jeweils einen Strang eines DNA-Doppelstranges bei gleicher Temperatur binden, so daß der jeweilige Strang von einer Polymerase 5´-3´ verlängert werden kann���und���die beiden Primer maximal 5000 Basenpaare auseinander liegen

•  Primerpaare haben annähernd den gleichen Tm

Wieviel DNA brauche ich pro Reaktion ?

•  Theoretisch genügt ein Molekül •  Aber ein Molekül kann man man nicht gut dispensieren •  Um sicher zu sein sollte ich pro Experiment mit

mindestens 10 Kopien meiner Template-DNA arbeiten •  Liegt zuviel Template-DNA vor, so kann die PCR nicht

mehr effizient arbeiten ! •  Z.T. muss die ideale Template-Menge experimentell

ermittelt werden

Prinzip der Basenpaarung

Das Geheimnis des Schmelzpunktes

•  Der Schmelzpunkt einer doppelsträngigen DNA ist die Temperatur bei der 50% der DNA als Einzelsträge vorliegen!

•  Berechnung der Schmelztemperaturen von DNA-Oligonukleotiden:!

•  %GC-Methode:!

•  tm = 81.5 - 21.59 - (675 / length) + (0.41 * %GC)!

•  wobei -21.59 = 16.6 x log10 [K+]!

Nearest Neighbour Methode •  tm = (deltaH / (deltaS - 43.9317 - 2.8)) - 273.15 - 21.59!

•  wobei: -43.9317 = R x ln(c) mit R = 1.987 cal / K x mol!•  und c = 250 pM!

•  deltaH = - (1000 * summe(dH))!•  deltaS = - summe(dS) - 10.8!

•  wobei -10.8 = Entropie der Helix-Initiation!

•  -21.59 = 16.6 x log ([K+]) mit [K+] = 50 mM!•  !•  2.8 = Korrekturfaktor für nicht-komplementäre Oligos!

•  Diesen Berechnungen liegt eine Oligokonzentration von 250 pM und eine K+-Konzentration von 50 mM zugrunde.!

Schmelzpunkt per Hand

•  Pro A oder T: 2°C •  Pro G oder C: 4°C

•  Einfach aufaddieren

•  Gilt für kurze DNA-Stränge

Wie weise ich die DNA nach der PCR nach ?

Was ist Gelelektrophorese ?

•  Das Auftrennen geladener Moleküle im elektrischen Feld

•  Die Auftrennung wird durch ein Gel unterstützt, d.h. eine permeable Matrix, die die Moleküle abhängig ihrer Größe zurückhält

•  Die Auflösung wird vor allem durch die „Dichte“ des Gels bestimmt

Interkalierende Farbstoffe

•  färben Nukleinsäuren unspezifisch an •  ändern das Fluoreszenzverhalten bei Bindung an

Nukleinsäuren •  Nachweisgrenzen bei ca. 10 ng - 100 fg DNA je nach

Farbstoff •  kann in das Gel mit hinzugegeben werden oder aber das

Gel wird nach der Elektrophorese in dem Farbstoff gebadet

Wo bekomme ich die Information über ein Gen her?

Es gibt Datenbanken mit allen bekannten Genen.