Diskussion af forsøgsdesign - Aarhus Universitet

September 2013

Diskussion af forsøgsdesign

›  Baggrund ›  Hypotese ›  Formål ›  Materialer & metoder ›  Resultater ›  Diskussion ›  Konklusion ›  Perspektivering ›  Litteratur

September 2013

Talent med bredde

UFT dag 1

› Næringsstofoptagelse

UFT dag 2

› Tarmkræft

September 2013

UFT dag 1: ”Næringsstofoptagelse” 17. september 2013

Praktisk øvelse med humane tarmceller i absorptionsmodel Tidsplan)for)dagen:)

9.10%9.30' Velkommen'og'introduktion'til'dagens'program;'introduktion'om'forskningsteam,'baggrund'for'dagens'øvelse,'celledyrkningsmetoder,'analysemetoder'og'forsøgsdesign.'(SPU,&TSK,&DSGN,&AKN,&KBP)'

9.30%11.30' Cellelaboratoriet:)

' %'Gennemgang'af'øvelsen'om'næringsstofoptagelse.(TSK,&SPU)'

' %'Billedoptagelse'af'Caco%2'tyktarmsceller'i'kulturflaske'og'2%kompartmentmodel.'(KBP)'

' %'Måling'af'differentiering'af'tarmepithel'(transepithel'modstand;'TEER)'i'absorptionsmodel'(2%kompartment'model)'(Nb:'Cellerne'er'opsat'inden'øvelsen).'(DSGN)'

' %'Fremstilling'og'tilsætning'af'næringsstofopløsninger'til'cellekulturer'i'absorptionsmodel'(Nb:'Der'laves'ikke'GCMS'analyse'på'materiale'fra'de'aktuelle'plader).&(AKN)'

11.30%12.00' Frokost'

12.00%13.30' Mødelokalet:)

' %'Orientering'om'analyse'af'næringsstofkoncentrationer'ved'GC%MS.(BHL)'

%'Resultater,'data'bearbejdelse,'diskussion'og'formidling'af'resultater''' '(Nb:'Resultaterne'stammer'fra'allerede'gennemført'forsøg).'(TSK,&SPU)'

13.30%13.45' Pause)

13.45%14.30' Cellelaboratoriet:)

%'Gentagelse'af'måling'af'celledifferentiering'(TEER)'efter'en'behandlingsperiode.'(AKN,&DSGN)'

14.30%15.00' Mødelokalet:)

%'Opsamling'og'diskussion'af'dagens'øvelse.'(SPU,&TSK,&DSGN,&AKN,&KBP)

September 2013

Introduktion til celledyrkningsmetoder Mælkekirtelvæv •  MCF-7 Human bryst cancer •  MVLN Human bryst cancer •  MDA-MB-231 Human bryst cancer •  MCF-10a Human bryst •  MAC-T Bovine mælkekirtelepithel •  PCC Primære bovine udiff. epithel •  PCC-2 Primære bovine diff. epithel Knogle •  U2-OS Human osteosarcoma •  SAOS-2 Human osteosarcoma Nervevæv •  SH-SY5Y Human nerveceller

Andre væv •  RAW 264.7 Mouse makrofager •  BFIC Bovine primære fibroblaster •  LW1 Porcine embryo fibroblaster •  SGBS Humane adipocytter

Mavetarm-kanalen •  MKN-45 Human mave cancer •  IEC-6 Rotte tyndtarm •  FHs 74 Human tyndtarm •  IPEC-J2 Porcin tyndtarm •  PPEC Porcin primær epithel •  Caco-2 Human colon cancer •  HT29 Human colon cancer •  HT29-MTX Human colon cancer •  LoVo Human colon cancer •  HCT-116 Human colon cancer •  Sw-480 Human colon cancer •  Colo-320 Human colon cancer •  CCK-81 Human colon cancer •  FHC Human colon Prostata •  LnCaP Human prostata cancer •  PC-3 Human prostata cancer •  DU-145 Human prostata cancer Hud •  PCS 200 Human epidermale keratinocytter •  PFIC Porcine primære fibroblaster

September 2013

Kortkædede fedtsyrer short-chained fatty acids (SCFA)

› Kortkædede fedstyrer (SCFA: Short-chain Fatty Acids) er en undergruppe af fedtsyrer med "haler" af 2-6 carbon-atomer Disse fedtsyrer fremkommer ved fermentering af kostfibre i colon (tyktarmen). Optagelsen af de kortkædede fedtsyrer foregår igennem de differentierede tarmcellers epithel. 5

September 2013

Konc. af SCFA i tyktarm (estimeret) ›  Jf. Maud et al., British Journal of Nutrition (2009) 102, 1590-1600. (grise)

[mM] K5 (fys) K4 K3 K2 K1 Acetat 70 35 17,5 8,75 4,375 Propionat 18 9 4,5 2,25 1,125 Butyrat 8 4 2 1 0,5

September 2013

UFT Dag1 - Morfologi af celler i kulturflaske

September 2013

UFT Dag1 – Tarmceller i 2-kompartment model, parametre og analysemetoder

›  Tarmceller i 2-kompartment model: ›  SCFA koncentration ved GC-MS ›  TEER ved Millicell ERS måling

Blodside

Tarmside

September 2013

Fremgangsmåde

› Billedoptagelse

9

September 2013

Fremgangsmåde

› Måling af differentiering af tarmepithel

10

September 2013

Fremgangsmåde

› Fremstilling og tilsætning af næringsstofopløsninger til cellekulturer i absorptionsmodel

11

September 2013

TEER measured

September 2013

TEER-målinger

13

September 2013

UFT Dag1 - Diskussion af resultater, data og formidling

Assay 2 Acetat Propionat Butyrat

Behandling Tid (t) Lumenside Blodside Lumenside Blodside Lumenside Blodside 1 K1 0 4,615 0,035 1,035 -‐0,009 0,548 -‐0,001 [mmol/l] 2 K1 4 4,305 0,445 0,963 0,113 0,398 0,040 3 K1 24 3,714 1,213 0,717 0,274 0,053 0,037 4 K2 0 8,714 0,035 2,146 -‐0,009 1,059 -‐0,001 5 K2 4 8,276 0,529 1,970 0,175 0,868 0,073 6 K2 24 7,172 1,956 1,548 0,602 0,320 0,160 7 K3 0 17,248 0,035 4,297 -‐0,009 2,097 -‐0,001 8 K3 4 16,872 0,825 4,043 0,309 1,814 0,151 9 K3 24 13,953 3,599 3,210 1,156 1,042 0,456 10 K4 0 34,184 0,035 8,385 -‐0,009 4,059 -‐0,001 11 K4 4 31,580 1,285 7,662 0,467 3,437 0,282 12 K4 24 27,233 6,232 5,950 2,008 2,429 0,922 13 K5 0 64,782 0,035 15,016 -‐0,009 7,681 -‐0,001 14 K5 4 60,064 2,018 14,450 0,665 6,971 0,361 15 K5 24 10,176 32,706 3,089 11,497 1,410 6,048

0.000 10.000 20.000 30.000 40.000 50.000 60.000 70.000

0 2 4 6 8 10 12 14 16

AI

Acetat K1 Lumen

K1 Blod

K2 Lumen

K2 Blod

K3 Lumen

K3 Blod

September 2013

UFT projekt ”Talent med bredde” oktober 2013 SPU/AKN

UFT dag 2: ”Tarmkræft” 1. oktober 2013 Praktisk øvelse med tarmceller i kultur Tidsplan for dagen:

9.10-‐9.30 Velkommen og introduktion til dagens program; baggrund for dagens øvelse, celledyrkningsmetoder, analysemetoder og forsøgsdesign.(SPU, TSK, DSGN, AKN, KBP)

9.30-‐11.30 Cellelaboratoriet:

-‐ Gennemgang af øvelsen om tarmkræft. (SPU, TSK)

-‐ Billedoptagelse af normale celler og kræftceller i kultur (IEC-‐6, Caco-‐2, HT29-‐MTX, MCF-‐7, MAC-‐T). (DSGN)

-‐ Trypsinering af celler og opsætning af assay. (AKN, KBP)

-‐ Fremstilling af opløsninger til behandling (FCS og etoposide) og tilsætning til plade med celler, som har inkuberet 24 timer (Nb: vi måler effekter efterfølgende fredag). (AKN, KBP)

11.30-‐12.00 Frokost

12.00-‐13.15 Cellelaboratoriet:

-‐ Iagttag celler, der har været behandlet med FCS og etoposide i 72 timer, i mikroskop. Noter synlige effekter. (Nb: Pladerne er sat op 72 timer før øvelsen). (DSGN)

-‐ Mål effekter af FCS og etoposide-‐behandlinger fluorometrisk i plader hvor der er tilsat Alamar Blue opløsning (Nb. Alamar Blue opløsning er tilsat 2 timer inden øvelsen). (SPU)

Fremstilling af materiale til klasseforsøg:

-‐ Tarmceller (kontrol) eller behandlet med etoposide i 6-‐brønds plade skrabes og overføres til rør (Nb: det materiale, der skal benyttes på uddannelsesstedet er fremstillet tidligere og udleveres) (KBP)

13.15-‐13.30 Pause

13.30-‐15.00 Mødelokalet: (SPU, TSK, DSGN, AKN, KBP)

-‐ Resultater, data bearbejdelse, diskussion og formidling af resultater

-‐ Opsamling og diskussion af dagens øvelse, evt.

September 2013

UFT Dag 2 – Baggrund for øvelsen

›  Fakta: ›  Hver 3. dansker bliver ramt af kræft inden 75 år ›  Der findes over 200 forskellige kræftformer ›  Årsagen til kræft er ofte et samspil mellem arv og miljø (kost, livsstil, motion mm.)

September 2013

Tyktarmskræft er en kræftform, der udvikler sig som følge af forandringer i slimhindecellerne i tyktarmen. Forekomst af tyktarmskræft Tyktarmskræft kan opstå hele livet, men især efter 50-års alderen. Der er cirka 2.700 nye tilfælde om året i Danmark. Sygdommen er lige så hyppig hos mænd som hos kvinder. Årsager Overvægt, alkohol og type 2 sukkersyge medfører en øget risiko for at udvikle tyktarmskræft. Men i nogle tilfælde er tyktarmskræft arvelig.

Screening for tarmkræft Alle personer i alderen 50-74 år bliver fra 2014 tilbudt screening for tarmkræft hvert andet år. Undersøgelser viser, at screening for tarmkræft kan nedsætte dødeligheden af sygdommen. I dag bliver sygdommen opdaget sent hos 60 procent af patienterne, fordi symptomerne først giver sig til kende sent i sygdomsforløbet.

Tyktarmen er cirka 150-170 centimeter lang. Gennem tyndtarmen (5-6 m lang) optager kroppen næringsstoffer fra maden. Tyktarmen er fortsættelsen af tyndtarmen og fortsætter ned til endetarmen, som udgør de nederste 15 centimeter af tarmen.


September 2013

›  Hvad er kræftceller ›  Celler der vokser ude af kontrol med resten af kroppens celler ›  Forårsaget af gentagne mutationer i normale celler

Nyrekræftceller. Farvet scanningsbillede af kræftceller (pink) fra en nyretumor. Kræftceller deler sig hurtigt og danner ofte klumper (tumorer) som kan invadere og ødelægge omliggende væv. Cellerne har dannet trådl ignende cytoplasmatiske projektioner fra overfladen. Behandlingomfatter kirurgisk fjernelse af det syge væv eventuelt kombineret med kemoterapi. Forstørrelse: x1300 ved 6x7cm størrelse.


September 2013

›  Behandling af kræft

›  Operation: Hovedparten af alle kræftpatienter (60 pct.) bliver opereret. Ved operationen (kirurgisk behandling) skæres det kræftsyge væv eller organ væk, eventuelt sammen med lymfeknuder i nærheden.

›  Strålebehandling: Strålerne (som regel røntgenstråler) virker ved at påvirke kræftcellernes arvemateriale, så de enten dør eller holder op med at dele sig. Målet er at give en stråledosis stor nok til at ramme kræftcellerne uden at skade sundt væv. Men strålehandling påvirker udover kræftcellerne også kroppens normale celler, og det er denne påvirkning, der kan give bivirkninger. Ved at give behandlingen over mange gange, får de normale celler tid til at reparere sig selv. Normale celler er mere robuste og bedre til at reparere skader end kræftcellerne, og derfor kommer de fleste normale celler sig efter bestrålingen.

›  Kemoterapi: Behandling med stoffer, der standser cellers deling på forskellig måde. Kemoterapi påvirker ikke kun kræftcellerne, men også kroppens normale celler. Det er denne påvirkning, der kan give bivirkninger som hårtab, kvalme og problemer med slimhinderne. Der findes mange forskellige typer kemoterapistoffer, og de kaldes cytostatika eller cellegifte. Cytostatika angriber især de celler, der deler sig hurtigt, sådan som kræftceller gør.

›  Anti-hormonbehandling: Brystkræft og livmoderkræft stimuleres af det kvindelige kønshormon østrogen. Prostatakræft er afhængig af det mandlige kønshormon testosteron. Ved hormonfølsomme kræfttyper kan man fjerne eller dæmpe kroppens produktion af hormon så kræftcellernes vækst ikke stimuleres og sygdommen vil udvikle sig langsommere.

›  Andre behandlingsformer er immunterapi, genterapi og stamcelletransplantation.


www.cancer.dk

September 2013

›  Kemoterapi dræber hurtigt-delende celler ved apoptose


Kemoterapi

•  Kerne-kondencering

•  DNA fragmentering

Denne proces medieres ved aktivering af caspase-3

September 2013

Etoposide er et kræfthæmmende stof som binder og inaktiverer enzymet topoisomerase II så spaltning og samling af hhv. dobbelt- og enkeltstrenget DNA ikke kan forekomme. Etoposide blokerer cellecyklus I S-fasen og G2-fasen og inducerer apoptose.


›  Etoposide

September 2013

›  Cellebaserede modeller ›  Suspension, adhæsion, 2-kompartment , co-kultur

Blodside

Tarmside

UFT Dag 2 – Celledyrkningsmetoder

September 2013

Mælkekirtelvæv •  MCF-7 Human bryst cancer •  MVLN Human bryst cancer •  MDA-MB-231 Human bryst cancer •  MCF-10a Human bryst •  MAC-T Bovine mælkekirtelepithel •  PCC Primære bovine udiff. epithel •  PCC-2 Primære bovine diff. epithel

Knogle •  U2-OS Human osteosarcoma •  SAOS-2 Human osteosarcoma

Nervevæv •  SH-SY5Y Human nerveceller

Andre væv •  RAW 264.7 Mouse makrofager •  BFIC Bovine primære fibroblaster •  LW1 Porcine embryo fibroblaster •  SGBS Humane adipocytter

Mavetarm-kanalen •  MKN-45 Human mave cancer •  IEC-6 Rotte tyndtarm •  FHs 74 Human tyndtarm •  IPEC-J2 Porcin tyndtarm •  PPEC Porcin primær epithel •  Caco-2 Human colon cancer •  HT29 Human colon cancer •  HT29-MTX Human colon cancer •  LoVo Human colon cancer •  HCT-116 Human colon cancer •  Sw-480 Human colon cancer •  Colo-320 Human colon cancer •  CCK-81 Human colon cancer •  FHC Human colon Prostata •  LnCaP Human prostata cancer •  PC-3 Human prostata cancer •  DU-145 Human prostata cancer Hud •  PCS 200 Human epidermale keratinocytter •  PFIC Porcine primære fibroblaster

UFT Dag 2 – Cellebaserede modeller

September 2013

UFT Dag 2 - Øvelsen

›  Morfologi og billedoptagelse af normale celler og kræftceller

›  Normale celler: ›  IEC-6 tyndtarmsepithelceller fra rotte ›  MAC-T yver-epithelceller fra ko

›  Kræftceller:

›  Caco-2 humane tyktarmsepithelceller ›  HT-29-MTX humane tyktarmsepithelceller (goblet) ›  MCF-7 humane brystepithelceller

Normale

Cancer

September 2013

UFT Dag 2 - Cellebaserede modeller, parametre og analysemetoder

›  Celler på bund af 96-brønds plader: ›  Celler behandlet med vækst-stimulerende opløsning (FCS) og kemoterapeutikum (etoposide) ›  Cellevækst måles ved Alamar Blue fluorometri (mitochondrie-aktivitet) ›  Cellevækst kan også måles ved PicoGreen fluorometri (DNA mængde)

September 2013

FHs74Int IPEC

HT-29 HCT-116

FHC

Caco-2

”Flat”

”Rounded”

UFT Dag 2 - Diskussion af resultater, data og formidling

September 2013


› Mikroskopisk vurdering af effekt af behandlinger ›  Celler behandlet med FCS og etoposide i 72 timer

Kontrol - Næsten konfluent lag

Voksende - Konfluent lag

Apoptotisk -  Kondenseret kromatin -  Fragmenteret kerne

0.6% FCS 10% FCS Etoposide

September 2013


Morfologi af normale celler og kræftceller

September 2013


Description Packaging Bottomless glass bottle. Contents are inside inserted fused cone. Biochem/physiol Actions Etoposide is an antitumor agent that complexes with topoisomerase II and DNA to enhance double-strand and single-strand cleavage of DNA and reversibly inhibit religation. Blocks the cell cycle in in S-phase and G2-phase of the cell cycle; induces apoptosis in normal and tumor cell lines; inhibits synthesis of the oncoprotein Mdm2 and induces apoptosis in tumor lines that overexpress Mdm2.

Vækst af normale celler og kræftceller i kultur

September 2013

Fremgangsmåde

› Billedoptagelse

30

September 2013

Fremgangsmåde

› Trypsinering af celler og opsætning af assay

31

September 2013

Fremgangsmåde

› Fremstilling af opløsninger til behandling og tilsætning til plade med celler

32

September 2013


› Cancerceller adskiller sig ved: ›  Morfologi (klumper) ›  Vækst (> normale celler)

›  Vokser uden vækstfaktorer/serum

›  Bliver ved med at vokse i tilstedeværelse af vækstfaktorer/serum (ingen kontakt-inhibering)

›  Aldres ikke (bliver ved med at dele sig) ›  Mangler apoptose regulering ved DNA beskadigelse ›  Aneuploidy (kromosomændringer) ›  Anaerob metabolisme (glykolyse) medfører laktat dannelse der stimulerer tumorvækst

September 2013


Description Packaging Bottomless glass bottle. Contents are inside inserted fused cone. Biochem/physiol Actions Etoposide is an antitumor agent that complexes with topoisomerase II and DNA to enhance double-strand and single-strand cleavage of DNA and reversibly inhibit religation. Blocks the cell cycle in in S-phase and G2-phase of the cell cycle; induces apoptosis in normal and tumor cell lines; inhibits synthesis of the oncoprotein Mdm2 and induces apoptosis in tumor lines that overexpress Mdm2.

Assay 103 Caco-‐2 AlamarBlue

Plade 1FCS

0 0,625 1,25 2,5 5 10504509 916003 755010 801269 1011800 882979597058 886963 806645 873291 1246420 1137409649151 902690 900918 1004323 1000202 1121755634905 810753 860476 919877 1094274 1162850

middel 596406 879102 830762 899690 1088174 1076248sem 32544 23543 31787 42563 56753 64977

Plade 2Etoposide

0 0,1 1 10 20 40537075 666860 598268 540856 408265 374416579915 695245 642042 467350 423988 448416656413 681898 682490 500411 377722 412550621933 674658 620955 487351 356483 430705695161645068

middel 622594 679665 635939 498992 391615 416522sem 23130 6033 17907 15522 15145 15830

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

0 0,625 1,25 2,5 5 10

Fluo

rocens

%FCS

Assay 103 Caco-‐2 FCS kurve AlamarBlue

0100000200000300000400000500000600000700000800000

0 0,1 1 10 20 40

Fluo

rocens

µM Etoposide

Assay 103 Caco-‐2 Etoposide kurve AlamarBlue

September 2013


PicoGreen

Plade 3FCS

0 1,25 2,5 5 104751914 8264162 7384818 11935373 149680637419598 3981580 5062540 12572091 149872856056061 6382526 8371826 11792681 156524895918129 4221161 6845220 9797176 14636394

middel 6036426 5712357 6916101 11524330 15061058sem 546009 1007476 693995 600127 212959

Plade 4Etoposide

0 0,1 1 10 20 409744668 8075656 8356979 5748568 3660005 33277509477263 7930251 8206004 6138137 4451270 32650108002091 8168662 7785228 5367985 4502539 26565719452058 7913785 7647069 6292178 4548959 313073499583889359190

middel 9332276 8022089 7998820 5886717 4290693 3095016sem 280925 60908 168462 207320 211174 151815

02000000400000060000008000000

1000000012000000140000001600000018000000

0 1,25 2,5 5 10

Fluo

rocens

% FCS

Assay 103 Caco-‐2 FCS kurve PicoGreen

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

0 0,1 1 10 20 40

Fluo

rocens

µM Etoposide

Assay 103 Caco-‐2 Etoposide kurve PicoGreen

Documents

Diskussion af forsøgsdesign - Aarhus Universitet