Curso Optativo-2016

Dra. María Gabriela Lacoste

El diseño de los primers para una PCR es FUNDAMENTAL.

Longitud

Especificidad

Temperatura de

Hibridación

Contendido

GC

Complementariedad

de secuencias

Reconocer una SECUENCIA UNICA dentro del ADN templado

Especificidad de un primer depende de la LONGITUD del mismo.

SECUENCIA CORRECTA!!

5´

5´

5´

5´

3´

3´

3´

3´

3´

3´

3´

3´

5´

5´

5´

5´

5´ 3´ 3´ 5´

3´ 5´3´ 5´

5´ 3´

5´ 3´

3´ 5´

(A)

(B)

(C)

(D)

5´ 3´

La longitud de la secuencia es fundamental para la asociación ESPECIFICIDAD

Por ejemplo:

Hay una probabilidad de ¼ (4-1) de encontrar una A, G, C o T en una secuenciadada.

Hay una probabilidad de 1/16 (4-2) de encontrar una secuencia de dinucleótidos.

Hay una probabilidad de 1/256 (4-4) de encontrar una secuencia detetranucleótidos.

Si tenemos una secuencia de 17 pb, estadísticamente, esta estará presente unavez cada 4-17 bases o aproximadamente 17 billones de bases.

LONGITUD IDEAL: 18-24 nt

Muy largos: fallas en el annealing bajo rendimiento

Depende de la LONGITUD y la COMPOSICION del primer.

T° annealing depende de la Temperatura de melting o fusión (Tm) delos primers.

Tm= temperatura a la cual la mitad de las moléculas de primer están apareadascon el ADN molde.

Tm=2 (A+T) + 4(G+C)

Tm longitud contenido GC

T°annealing: 5° C por debajo del Tm más

bajo del par de primers (T°a=al

menos 50°C)

INESPECIFICIDAD

OPTIMA

BAJO RENDIMIENTO ONO AMPLIFICACION

Los primers no deben tener T°a muydiferentes entre si (no mas de 5°C).

T°annealing

Asegura la unión estable entre el primer y el ADN templado

40-60% CONTENIDO GC

PoliT, PoliA o PoliA/T unión más débil: se puede separar el complejoprimer-templado en esa zona.

Evitar tramos de polipurinas o polipirimidinas

PoliC, PoliG o PoliG/C unión más fuerte: hibridación no específica.

Asegura la unión correcta del primer al molde en el extremo 3´ (unión másfuerte que A/T) aumenta la eficiencia de la reacción

G o C en el extremo 3´

Elongación empieza en el extremo 3´del primer.

PROBLEMA: Si el extremo 3´tiene 3 o mas G/C se puede unirestablemente a casi cualquier secuencia con tres G/C.

IDEAL:

Extremo 5´ estable con 1 o 2 bases G/C y extremo 3´con no masde UNA base G/C

Complementariedad intra-primer

Más de 3 pb: el primer se pliega sobre si mismo en una estructura doblecadena interfiere con el annealing al ADN templado.

Complementariedad inter-primer

Formación de dímeros disminuye la formación de producto porcompetencia

BUSQUEDA DE LA SECUENCIA DE INTERÉSY DISEÑO DE PRIMERS CON PRIMER-BLAST

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

National Center for Biotechnology Information

Si queremos buscar un gen completo, por ejemplo, el CFTR humano

1°

2°3°

OMIM: información acerca de la asociación delgen con enfermedades humanas

En este caso el gen es demasiado grande para el programa PrimerBLAST, por lo que tenemos que buscar un fragmento menor deinterés dentro del gen.

Si queremos buscar un fragmento del gen, por ejemplo, el exón 10 delCFTR humano

1°

2°3°

Seleccionar el tamaño de amplicón deseado

Elegimos pares de primers para controlar estructura secundariay alineación.

OTROS PROGRAMAS DE DISEÑO DE PRIMERS

PrimerQuest: http://www.idtdna.com/primerquest/Home/Index

ORIGIN901 gcagagtacc tgaaacagga agtattttaa atattttgaa tcaaatgagt taatagaatc961 tttacaaata agaatataca cttctgctta ggatgataat tggaggcaag tgaatcctga1021 gcgtgatttg ataatgacct aataatgatg ggttttattt ccagacttca cttctaatga1081 tgattatggg agaactggag ccttcagagg gtaaaattaa gcacagtgga agaatttcat1141 tctgttctca gttttcctgg attatgcctg gcaccattaa agaaaatatc atctttggtg1201 tttcctatga tgaatataga tacagaagcg tcatcaaagc atgccaacta gaagaggtaa1261 gaaactatgt gaaaactttt tgattatgca tatgaaccct tcacactacc caaattatat1321 atttggctcc atattcaatc ggttagtcta catatattta tgtttcctct atgggtaagc1381 tactgtgaat ggatcaatta ataaaacaca tgacctatgc tttaagaagc ttgcaaacac1441 atgaaataaa tgcaatttat tttttaaata atgggttcat ttgatcacaa taaatgcatt1501 ttatgaaatg gtgagaattt tgttcactca ttagtgagac aaacgtcctc aatggttatt1561 tatatggcat gcatataagt gatatgtggt atctttttaa aagataccac aaaatatgca

ACCGATTGAATATGGAGCCAA 5´ 3´AACCGAGGTATAAGTTAGCCA 3´ 5´

TTGGCTCCATATTCAATCGGT complementaria

ATGGGAGAACTGGAGCCTTC 5´ 3´

Forward Reverse OJO!!!!

COMO UBICAR MI PRIMER EN LA SECUENCIA

ANALISIS DE PRIMERS

OLIGO ANALYZER 3.1

Analizamos el Primer FORWARD

Parámetros generales

Hairpin

El Tm debe ser menor que la temperatura de annealingpropuesta para la reacción. Se sugiere que el Tm del hairpindebe estar al menos 50°C por debajo de la T de annealing.

Self-Dimer

El valor de ΔG debe estar entre 0 y -9 kcal/mol.

Hetero-Dimer

Copiamos la secuenciadel primer reverse

Hetero-Dimer

El valor de ΔG debe estar entre 0 y -9 kcal/mol.

NCBI Blast

Alineamos nuestro primer con la base de datos, para compararsu similitud con otras secuencias.

Repetimos el procedimiento con el primer REVERSE…

… y también podemos analizar otros pares de primers propuestos porel programa de diseño hasta seleccionar el par que cumpla con lasmejores características…