Diagnós(co+Molecular+de+ …...Problema(( Neutropenia Febril Bajo Riesgo IBI (1/3) Alto Riesgo IBI (2/3) Sin Sepsis (3/4) Sepsis (1/4) Fallece No Fallece PINDA, 2010 20-25% Diagnóstico

Diagnós(co Molecular de infecciones: al lado de la cama del

inmunocomprome(do Dr. Juan Pablo Torres Torre;

Pediatra Infectólogo – Doctor en Ciencias Médicas

Depto. de Pediatría y Cirugía Infan<l Oriente

Unidad de Infectología – Hospital Calvo Mackenna

Facultad de Medicina, Universidad de Chile

Sub Director de Inves<gación

Clínica Las Condes

XXVIII CONGRESO CHILE NO DE INFECTOLOGÍA, LA SERENA 2011

•  La infección es la primera causa de mortalidad en niños con cáncer y neutropenia febril (NF). Similar en pacientes trasplantados

•  Diagnós<co e<ológico NF: Hasta 20 -‐ 30% •  Es relevante conocer agente de la infección para iniciar tratamiento an<microbiano adecuado.

•  Predicción del riesgo de infección severa

Problema

Problema Neutropenia

Febril

Bajo Riesgo IBI (1/3) Alto Riesgo IBI (2/3)

Sin Sepsis (3/4) Sepsis (1/4)

Fallece No Fallece

PINDA, 2010

20-25% Diagnóstico Etiológico

60% Diagnóstico Etiológico

80% Diagnóstico Etiológico

British Medical Bulletin 2002; 61: 97-114

Diagnós<co molecular vs convencional

Cul(vo IFI/IFD ELISA Sondas PCR

Rapidez + +++ +++ ++ ++/+++

Sensibilidad ++ / +++ ++ ++ ++ ++++

Especificidad +++ ++ ++ +++ ++++

Facilidad + + +++ + ++

Ventajas Diagnós<co Molecular

Resultados más rápidos

Técnicas estandarizadas, automa<zadas

Microorganismos de dibcil crecimiento

Mayor sensibilidad y especificidad

Inves<gación

Limitaciones Diagnós<co Molecular

Falsos (+): Contaminación

Falsos (-‐): Extracción ADN, inhibidores, par<dores

Mayor costo (rela<vo)

Debe sospechar agente infeccioso

No informa sensibilidad an<microbianos

Diagnós<co Molecular de Infecciones Paciente Inmunocomprome<do

•  Infecciones virales •  Infecciones bacterianas •  Infecciones fúngicas

•  Predicción de la infección (e(ología, severidad)

VIRUS

Infección por CMV An<genemia versus PCR cuan<ta<va

Farfán M, Torres JP, Vergara A y cols. Rev Chil Infectol 2011;28:113-17

Infección por CMV An<genemia versus PCR cuan<ta<va

Farfán M, Torres JP, Vergara A y cols. Rev Chil Infectol 2011;28:113-17

Infecciones virales

POSITIVOS (n)

NEGATIVOS (n)

TOTAL (n)

Rendimiento (+)

Citomegalovirus 345 1601 1946 18%

Epstein Barr 360 899 1259 40%

Adenovirus 6 603 609 1%

•  Período 2009-‐2011: Total PCR cuan<<vas = 2308 •  Pacientes TMO, Tx hepá<co, Tx renal, otro •  Muestras: sangre, tejido, LBA, LCR, fluídos •  PCR <empo real cuan<ta<va CMV, VEB, ADV

Centro Estudios Moleculares U de Chile – HLCM, 2011

Infecciones virales Onco + TMO (n=1506)

POSITIVOS (n)

NEGATIVOS (n)

TOTAL (n)

Rendimiento (+)


Epstein Barr 105 611 716 15%

Adenovirus 5 576 581 1%

Trasplante hepá(co (n=241)

POSITIVOS (n)

NEGATIVOS (n)

TOTAL (n)

Rendimiento (+)


Epstein Barr 115 80 195 59%

Trasplante renal (n=262)

POSITIVOS (n)

NEGATIVOS (n)

TOTAL (n)

Rendimiento (+)


Epstein Barr 37 166 203 18%

Centro Estudios Moleculares U de Chile – HLCM, 2011

Infecciones virales

•  CMV: Detección de infección, no enfermedad

Infecciones virales

•  CMV: Detección de infección, no enfermedad •  ADV: Bajo número de detecciones

5 (+)/581 (1%) determinaciones

3 (+) / 30 (10%) pacientes

3 (+) / 13 (23%) vigilancia post TMO

Lucero Y. Centro Estudios Moleculares U de Chile – HLCM, 2011

Infecciones virales

•  CMV: Detección de infección, no enfermedad •  ADV: Bajo número de detecciones

•  VEB: Detección precoz, Sd linfoprolifera<vo

•  Muestra nasofaríngea: -‐ Detección 17 virus respiratorios

-‐ Plataforma PCR-‐microarrays de baja densidad (Genomica®)

Detección molecular virus respiratorios

Caracterís(cas clínicas y de laboratorio al ingreso 331 episodios de NF en niños con cáncer

Torres JP y cols. Fondecyt 11080113

Distribución de microorganismos detectados en NF alto/bajo riesgo IBI en 331 episodios de NF



Estacionalidad de las infecciones respiratorias virales en 331 episodios de neutropenia febril


Presencia de sintomatología respiratoria en pacientes con y sin detección de virus respiratorio.

Síntomas Virus Respiratorio(+)

Virus Respiratorio (-‐)

p

Coriza 29% 17% 0.04

Signología Pulmonar

23% 10% 0.02

Tos 34% 24% NS

Odinofagia 11% 7% NS



Edad (años)

Riesgo IBI

Virus Respiratorio detectado

Hipotensión PCR al ingreso (mg/L)

Presentación Clínica Resultado

12 Bajo Influenza A No 53 Leucemia refractaria Muerte

2 Bajo Influenza A No 135 Neumonia Favorable

3 Alto Parainfluenza No 13 Neumonia Favorable

17 Bajo Parainfluenza Sí 141 Neumonia + Shock Favorable

1 Bajo Parainfluenza Sí 104 Proc<<s + Shock Favorable

7 Alto VRS Sí 208 Neumonia + Shock Favorable

11 Bajo VRS No 6 Neumonia Favorable

Caracterís<cas episodios NF con ingreso UTI


Infecciones Respiratorias Virales

•  Las infecciones respiratorias virales fueron el principal agente de infección detectado, tanto en NF de alto y bajo riesgo IBI.

•  Pacientes con detección virus respiratorio, sin detección convencional o molecular de infección bacteriana, tuvieron evolución favorable.

•  Coinfecciones virales y viral-‐bacteriana no fueron más

graves. •  Conocer precozmente la e<ología de las NF ayudaría a

op<mizar el manejo de estos pacientes.

BACTERIAS

Detección molecular de bacterias

•  Obj: Aumentar la detección del patógeno en episodios de neutropenia febril

•  Muestra: Sangre directa •  Hora 0 y 24 •  Validación de PCR en <empo real para las infecciones bacterianas que más se asocian a mortalidad en NF en niños:

-‐ Staphylococcus aureus -‐ Escherichia coli

-‐ Pseudomonas aeruginosa

Santolaya ME y cols. Ped Infect Dis J 2011;11:957-61



Gram negativos Gram positivos Hongos

Escherichia coli Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) Serratia marcescens Enterobacter (cloacae/aerogenes) Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter baumannii Stenotrophomonas maltophilia

Staphylococcus aureus CoNS 1 Streptococcus pneumoniae Streptococcus spp. Enterococcus faecium Enterococcus faecalis

Candida albicans Candida tropicalis Candida parapsilosis Candida glabrata Candida krusei Aspergillus fumigatus

F G(+) G(-) Probe A

Probe B

Probe C

for Microorganism X

for Microorganism Y

for Microorganism Z

Detección múl<ple patógenos bacterianos


•  Sep<fast en 141 episodios de NF vs Hemocul<vos

•  HC: n=44 35/141 (25%)

•  HC + SF: n=78 61/141 (43%)

p=0.002

J Clin Microbiol 2010;48:3510-16

Sep<fast hora 0 y 24 en 17 episodios de NF

No. Blood Culture SeptiFast 0 hour SeptiFast 24 hour

1 Negative Not done Negative




5 Negative Negative Negative

6 Negative Negative Negative

7 Negative Enterobacter Negative

8 Negative Negative E. coli

9 E. coli E. coli + Stenotrophomonas Negative

10 E. coli S. aureus Negative

11 E. coli + CoNS Streptococcus pneumoniae Negative

12 E. coli + CoNS Negative S. aureus

13 Enterobacter Negative Klebsiella + Enterobacter

14 P. aeruginosa + Enterobacter Negative Negative

15 Gram-negative Bacillus Enterobacter S. aureus

16 S. aureus Not done S. aureus

17 S. aureus Negative Negative

Sakurai H, Vergara I, Torres JP y cols. Comunicación personal

Blood Cultures (time 0 hour)

SeptiFast

time 0 hour (n=12) time 24 hour (n=17) total (n=17)

Positive Negative Positive Negative Positive Negative

Positive 1 1 2 1 3 2

Negative 7 3 7 7 6 6

SeptiFast (0 hour) SeptiFast (24 hour) SeptiFast (total)

Sensitivity 13% 22% 33%

Specificity 75% 88% 75%

Positive predictive value 50% 67% 60%

Negative predictive value 30% 50% 50%

Positive Likelihood ratio 0.50 1.78 1.33

Negative Likelihood ratio 1.17 0.89 0.89

Sakurai H, Vergara I, Torres JP y cols. Comunicación personal

Sep<fast hora 0 y 24 en 17 episodios de NF


•  MALDI-‐TOF en 212 hemocul<vos posi<vos

-‐  Sin iden<ficar: 42/212 (19%) -‐  Iden<ficación: 162/170 (95%)

J Clin Microbiol 2010;48:444-47

Neutropenia Febril <18a

Bajo Riesgo Alto Riesgo 2. Estudio variables bioquímicas: - NU, glicemia, PCR, IL-8. 3. Estudio variables moleculares: - RPC E coli, S aureus, P aeruginosa al ingreso en muestra sangre directa

Sin Sepsis Sepsis

Fallece No Fallece

1. Estudio variables clínicas: - Clasificación episodio NF (alto o bajo riesgo de IBI) - T°, conciencia, hemodinamia, diuresis

Sangre Sangre

ANF

1. Estudio viral molecular: - RPC múltiple 17 virus respiratorios (VRS, ADV, Influenza, hMPV, Parainfluenza, Coronavirus, Rinovirus)

Consentimiento Asentimiento

VIRUS BACTERIAS

Microorganismos detectados en 199 episodios de neutropenia febril

n= 120/199

Torres JP, Santolaya ME y cols. IDSA 2010, Vancouver.

HONGOS

109Sangre

109Suero

105Sangre

105Suero

PCR <empo real Aspergillus fumigatus •  Límite de detección 280 fg ADN A. fumigatus/reacción

Ducasse K y cols. Congreso SOCHINF 2010

PCR <empo real Aspergillus fumigatus

Ducasse K y cols. Congreso SOCHINF 2010

Negativo Positivo0

1

2

3Galactomanano

Dogma Central Biología Molecular

DNA RNA Proteína

Transcriptasa Reversa cDNA

PCR RT-PCR

Microarrays

Microarrays

•  Pequeño vidrio o chip de 1-‐2 cm2 •  Muestras de DNA ordenadas en el vidrio

•  Detectan miles de secuencias de DNA o RNA

Lancet Infect Dis 2004;4:100-11

Genómica y Proteómica HUMANA

INFECTOMA

Genómica y Proteómica PATÓGENO

FARMACOMA

Efecto DROGAS Genómica y Proteómica HUMANA

Efecto DROGAS Genómica y Proteómica PATÓGENO

HOSPEDERO MICROORGANISMO

Microorganismo

Virochip

J Pediatr 2008;153:76-83

Hospedero

Ramilo O, Mejías A. Cell Host & Microbe 2009

Blood 2007;109:2066-77

Virus vs Bacterias

91%

95%

87%

Blood 2007;109:2066-77

Training Test

S. aureus (Gram +) vs E. coli (Gram -‐)

95% 85%

Perfiles transcripcionales iden<fican patrones específicos de infección

E. COLI

S. PNEUMONIAE

S. AUREUS

INFLUENZA

RSV

Ramilo O, Mejías A. Comunicación personal. 2008

Nature 2010; 466:973-99

Neutropenia Febril <18a

Bajo Riesgo Alto Riesgo 2. Estudio variables bioquímicas: - NU, glicemia, PCR, IL-8. 3. Estudio variables moleculares: - RPC E coli, S aureus, P aeruginosa - Estudio microarreglos (interacción hospedero/microorganismo)

Sin Sepsis Sepsis

Fallece No Fallece

1. Estudio variables clínicas: - Clasificación episodio NF (alto o bajo riesgo de IBI) - T°, conciencia, hemodinamia, diuresis

4. Caracterizar perfil de expresión génica. 5. Modelo de Predicción Sepsis/No Sepsis

Sangre Sangre

ANF

1. Estudio viral molecular: - RPC múltiple 17 virus respiratorios (VRS, ADV, Influenza, hMPV, Parainfluenza, Coronavirus, Rinovirus)

Consentimiento Asentimiento

2. Estudio perfiles expresión génica: - Microarrarreglos - Predicción: a) Infección viral b) Coinfección virus-bacteria c) Infección bacteriana

Perspec<vas Diagnós<co Molecular

•  Conocer gené<ca y epidemiología molecular de enfermedades infecciosas

•  Aumento diagnós<co infectológico molecular •  Diagnós<co rápido de patógenos (3 – 12 horas) •  Iden<ficar nuevos agentes infecciosos o fas<diosos •  Nuevas terapias ATB e inmunológicas •  Predicción

•  Infecciones virales -‐ Seguimiento y detección precoz CMV, ADV, EBV (estrategia an<cipatoria)

-‐ Caracterización infección respiratoria viral / coinfección •  Infecciones bacterianas -‐ Op<mización del diagnós<co e<ológico

-‐ Detección precoz múl<ple de patógenos •  Infecciones fúngicas -‐ Preliminar. PCR Aspergillus fumigatus


•  Predicción (microarrays)

-‐ Infección viral versus Infección bacteriana

-‐ Sepsis versus no sepsis


Centro Estudios Moleculares

Facultad Medicina U. de Chile

Hospital Luis Calvo Mackenna

Proyectos -‐ RLT-‐PCR Aspergillus

-‐ Farmacogenómica

-‐ Otras PCRs

Fondecyt -‐ Inf. Resp. virales IC

-‐ Inf. Bact. y Sepsis en IC

-‐ Inf. Bact. (E. coli)

PINDA

Perspec(vas

Diagnóstico

Tratamiento Predicción

Agradecimientos

Hospital Calvo Mackenna -‐ María Elena Santolaya

-‐ Milena Villarroel

-‐ José Cofré

-‐ Paulina Coria

-‐ Jacob Cohen

-‐ Antonio Banfi -‐ Jorge Morales -‐ EU Verónica de la Maza -‐ Sra. Rosario Berríos

Hospital Exequiel González Cortés:

-‐ Carmen Salgado

-‐ Marcela Zubieta

Hospital San Juan de Dios: -‐ Mónica Varas

-‐Ana M Alvarez

Hospital San Borja

Arriarán

-‐ Carmen L Avilés

-‐ Pamela Silva

Hospital Roberto del Río: -‐ Juan Todecilla

-‐ San<ago Topelberg

Hospital Sótero del Río

-‐ Ana Becker

-‐ Tamara Viviani

•  Centro Estudios Moleculares U. de Chile – Hosp Calvo Mackenna Dr. Mauricio Farfán TM Alejandra Vergara

•  Programa Microbiología, ICBM, FM UCh Dr Miguel O’Ryan.

•  Na(onwide Childrens Hospital, Columbus, OH, USA -‐ Dr. Octavio Ramilo -‐ Dra. Asunción Mejías -‐ Dra. Mónica Ardura

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Diagnós(co+Molecular+de+ …...Problema(( Neutropenia Febril Bajo Riesgo IBI (1/3) Alto Riesgo IBI (2/3) Sin Sepsis (3/4) Sepsis (1/4) Fallece No Fallece PINDA, 2010 20-25% Diagnóstico