Diagnóstico citogenético genético de LLC y MM - rticc.org · Normal Alterado Cariotipos. un Universidad de Navarra RP11-199F11 y RP11-241D13 ... cariotipo y/o FISH) El diagnóstico

Universidad de Navarraun

Diagnóstico citogenético genético de LLC y MM

II REUNION ANUAL


Diagnóstico genético de LLC


LLC: bajo índice mitótico escasez metafases

análisis cariotípico

convencional

35 - 45 %

Alteraciones cromosómicas

nuevas técnicas

FISH

GCH

75 - 80%


Parámetro Bajo riesgo Alto riesgo

Biológicos

Citogenética Normal,13q-(única) 17p-,11q-

IgVH Mutado No mutado

CD38 ≤30% >30%

ZAP70 ≤20% >20%

β2-MG,LDH, sTK, sCD23 Normal Aumentado

Factores Pronósticos


Factores Pronósticos

ANÁLISIS CITOGENÉTICO:FISH JERÁRQUICO

Categorías: 17p- > 11q- > trisomía12 > Normal > 13q-

Mal pronóstico Buen pronóstico

Döhner y col., NEJM, 2000Supervivencia en Meses

100

13q- single

36 72 108 144 1800

20

40

60

80

11q-+12

17p-

0

n=325


ANÁLISIS MUTACIONAL DE LOS GENES IgVH

Pro-B

Pre-B

CENTRO GERMINAL

Célula pluripotencial linfoide

Célula B de memoria

Célula plasmática

•Hipermutación somática

•Cambio de clase

•Recombinación variable

Centroblasto Centrocito

Presentación del antígeno

progenitor

Célula B inmadura

Célula B madura

ApoptosisCs. en anergia


ANÁLISIS MUTACIONAL DE LOS GENES IgVH

24 48 72 96 120 144 168 1920

25

50

75

100 mutadosn=132

no mutadosn=168

Supervivencia en Meses

Factor pronóstico independiente


1. Establecer un protocolo de trabajo para el estudio genético de muestras de LLC al diagnóstico

• determinar el tipo de muestra óptimo para el cultivo

• desarrollar un ensayo multi-FISH

• optimizar la técnica de detección de mutaciones en los

genes IgVH


3,0%

SP

50,0%

SP + TPA

23,5%

MO

32,5%

MO + TPA

NuloNormalAlterado

Cariotipos


RP11-199F11 y RP11-241D13(TP53) (ATM)

CEP 12 DNA Probe Kit LSI D13S25

B.Ensayo Multi-FISH


A C

D E F

B

Trisomía 12 del(11)(q22.3) del(13)(q14.3)


2. Amplificación genes IgVH

1. Obtención de cDNA

3. Purificación PCR

+

4.Secuenciación 5. Identificación del segmento reordenado y análisis

VH3

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast

98% de homología

C.Hipermutación somática


ANALISIS GENETICO EN PACIENTES CON LLC

En la práctica……...


NUEVA MUESTRA AL DIAGNÓSTICO

Muestra de SP recogida

sobre heparina

Muestra de SP recogida

sobre EDTA

EXTRACCIÓN DE PBLs

DETECCIÓN DE HIPERMUTACIÓN

SOMÁTICA GENES IgVH

CULTIVO DE SP

ESTIMULADO CON TPA

MULTI-FISH EN CÉLULAS FIJADAS

DEL CULTIVO ESTIMULADO

CARIOTIPO


SONDAS UTILIZADAS:

p53 (17p13.1) (Sonda no comercial)

ATM (11q22.3) (Sonda no comercial)

CEP 12 (centrómero12) (Vysis)

LSI D13S25 (13q14.3) (Vysis)

RESULTADOS:

200 núcleos en interfase de muestra del paciente, para cada sonda,

del(17)(p13) negativo

del(11)(q22.3) 57% con deleción

trisomía 12 negativo

del(13)(q14) x2 44% deleción homocigótica

del(13)(q14) 46,5% deleción heterocigótica

INFORME FISH


INFORME HIPERMUTACIÓN

TÉCNICA:

(Hamblin, et al Blood.1999; 94:1848-1854)

RESULTADO:

MONOCLONAL

Familia: 3

Segmento: 09

Porcentaje: 100% de homología

NO MUTADO


INFORME HIPERMUTACIÓN

TÉCNICA:

(Hamblin, et al Blood.1999; 94:1848-1854)

RESULTADO:

MONOCLONAL

Familia: 4

Segmento: 04

Porcentaje: 90,63% de homología

MUTADO


Diagnóstico genético del MM


Diagnóstico genético del MM

(por el momento utilizamos cariotipo y/o FISH)

El diagnóstico con arraystodavía no es utilizado en la

rutina

El curso clínico está determinado por eventos genéticos de las células tumorales……….


MOHeparina

Cariotipo

Diagnóstico citogenético del MM


Conventional Chromosome Analysis in Multiple Myeloma


Conventional Chromosome Analysis in Multiple Myeloma

Normal karyotype70%

Department ofGenetics

University ofNavarra

Universitätsklinikum Kiel

Institut für Humangenetik



Recommendations for FISH in multiple myelomaLondon on March 11th 2005

• It is recommended that all labs should test for deletion 13, t(11;14) and t(4;14) and include p53 deletion wherever possible.

• The use of the Abbott/Vysis 5, 9, 15 probe set is encouraged to detect hyperdiploidy.


MOHeparina

CariotipoSegún % CP

CP >15-20%

FISH MM

13q

TP53

IGH


5, 9, 15 probe


MOHeparina


CP >15-20%

FISH MM

13q

TP53

IGH

negativo

t(11;14)(q13;q32) CCND1t(4;14)(p36;q32) FGFR3/MMSETt(14;16)(q32;q23) MAFt(14;20)(q11;q32) MAFBt(6;14)(p21;q32) CCND3t(6;14)(p25;q32) IRF4 negativo

positivo

t(8;14)(q24;q32) MYC


5, 9, 15 probe



MOHeparina


CP <15-20% CP >15-20%

FISH MM

13q

TP53

IGH

Hiperdiploidia

t(11;14)(q13;q32) CCND1t(4;14)(p36;q32) FGFR3/MMSETt(14;16)(q32;q23) MAFt(14;20)(q11;q32) MAFBt(6;14)(p21;q32) CCND3t(6;14)(p25;q32) IRF4 negativo

positivo

t(8;14)(q24;q32) MYC


FICTIONMACS

5, 9, 15 probe

MOEDTAMACS CP


MACS - magnetic cell sorting

CD138 (Syndecan-1) MicroBeadsfor Plasma CellIsolation


multicolor FICTION“Fluorescence Immunophenotyping and Interphase

Cytogenetics as a Tool for the Investigation Of Neoplasms”

Staining for VS38c surface antigen Plasma Cell specificPrimary Ab: VS38 mouse anti human CD38, Secondary Ab 1st Rabbit (*Alexa 350) anti mouse, Secondary Ab 2nd goat (*Alexa 350) anti rabbit and Secondary Ab 3rd monkey (*Alexa 350) anti goat

Plasma cell VS38 + VS38 -

Department ofGenetics

University ofNavarra

Universitätsklinikum Kiel

Institut für Humangenetik


2008 cambio, realismo ?? FUTURO INMEDIATO (definir pacientes de

alto riesgo estimado en un 25% de pacientes) Clínica Mayo

•FISH t(4;14),t(14;16) y del(17p)•Cariotipo para monosomia/del 13q e hipodiploidia

Definir pacientes alto riesgo: cariotipo, FISH, GEF, aCGH, B2m, PCLI,)


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