Examensarbete 15 hp, Vt 08 Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi Biomedicinska analytikerprogrammet

Development and optimization of methods for detection of Chlamydophila

pneumoniae.

Josefine Kanberg

Eva Hjelm, Marie Edvinsson, Ylva Molin Institutionen för medicinska vetenskaper, Klinisk bakteriologi Akademiska sjukhuset, Uppsala

1

ABSTRACT The purpose of the study was to set up a method for cultivation of C. pneumoniae

from infected mouse tissue in Hep2 cells. We also evaluated a new reagent,

Chlamatis, which is considered to increase the detection sensitivity of the bacterium

with both PCR and cultivation. All 10 serum samples treated with Chlamatis were

negative for C. pneumoniae in PCR. The cultivation of tissue was found to work

without problems. The yield of the bacteria was highest at the speed of 30 Hz using

homogenization with TissueLyser. Mice infected with C. pneumoniae were killed at

days 4, 8, 20 and 40. The highest yields of C. pneumoniae were found at days 4 and 8

using PCR with all infected mice. The results obtained with PCR and cultivation

confirmed each other to a large extent. For heart tissue, PCR positive mice were found

only at days 4 and 8. The number of PCR positive lung samples confirmed to a large

extent the number found by cultivation, except for mice killed after 4 days and 40

days where the results differed slightly. This indicated that the optimization of the

cultivation method was successful.

Keywords: C. pneumoniae, TWAR, PCR, Cultivation, Chlamatis

2

INTRODUKTION

Chlamydiaceae är obligata intracellulära små kockoida gramnegativa bakterier som

bildar s.k. inklusionskroppar i sina värdceller, där den förökar sig. Att bakterien är

obligat intracellulär innebär att den endast kan föröka sig i en värdcell. Bakterierna

har fått sitt namn från det grekiska ordet chlamydo, som betyder täcke eller mantel;

detta för att inklusionerna ligger gömda inuti en värdcell [Danielsson, 2002].

Ursprungligen betraktades Chlamydiacae som stora virus eftersom de kan bilda

cellinklusioner liknande dem som uppstår vid poxvirusinfektioner. Bakterierna har en

unik bifasisk cellcykel bestående av en extracellulär infektiös elementärkropp (EB,

elementary body) som är 0,3 μm i diameter och en intracellulär metaboliskt aktiv

retikulärkropp (RB, reticulate body) som är 0,5 – 1,5 μm i diameter. EB fäster till en

epitelcell när den kommer i kontakt med slemhinnan och tas in i cellen via endocytos.

Inne i cellen differentierar den till RB som sedan delar sig inuti en intracellulär vakuol

vilket leder till att en inklusion bildas. Efter ett par dagar övergår RB till EB. Cellen

lyserar när inklusionen är stor och EB frisätts och kan i sin tur infektera nya celler.

Processen pågår tills den bromsas av immunförsvaret eller antibiotikabehandling, se

figur 1.

3

Figur 1. A visar Klamydias cykel inuti en värdcell, 1. Extracellulär infektiös

elementärkropp EB tas upp via endocytos, 2. EB differentierar till intracellulär

metaboliskt aktiv retikulärkropp RB, 3. RB replikerar och bildar inklusioner, 4. RB

som har attackerats av immunförsvaret, slutar replikera och omvandlas till en icke

infektiös, persisterande form. 5. RB differentierar till EB och värdcellen lyseras och

EB kan infektera andra celler. B visar en elektronmikroskopisk bild på EB och RB

[Kuo, 2004].

Familjen Chlamydiaceae har flera genera, men humanpatogena bakterier finns bara i

genusen Chlamydia och Chlamydophila. De humanpatogena arterna inkluderar

Chlamydia trachomatis, Chlamydophila psittaci och Chlamydophila pneumoniae.

4

Chlamydia trachomatis ger upphov till genital klamydiasjukdom och trakom, medan

Chlamydophila psittaci som är en zoonos och sprids via fåglar, kan orsaka psittacos

(papegojsjuka) som är en allvarlig form av pneumoni.

Chlamydophila pneumoniae upptäcktes först 1983 och beskrevs då som en

variant av Chlamydophila psittaci [Kuo, 1986]. Den fick först ”smeknamnet” TWAR

efter de två första laboratorieisolaten; TW-183 isolerades från ögat från ett barn som

deltog i en trakomvaccinstudie i Taiwan [Kuo, 1995] och AR-39 från svalgprov från

en patient med akut luftvägsinfektion vid University of Washington i Seattle

[Grayston, 1986]. Först 1989 fastställdes klassificeringen av TWAR som den tredje

arten av Chlamydia [Grayston, 1989] och fick 1999 beteckningen Chlamydophila

pneumoniae.

C. pneumoniae är den vanligaste förekommande bakterien av de tre kända

arterna i Sverige. Den kan orsaka såväl akuta som kroniska luftvägsinfektioner. Det

uppskattas, siffror baserade på sammanställda studier, att den orsakar i genomsnitt 10

% av alla fall av samhällsförvärvad pneumoni och 5 % av alla bronkit- sinuitfall

[Kuo, 1995]. Det har visat sig att incidensen av infektioner är högst vid 5-14 års ålder

och hos över hälften av alla vuxna finns antikroppar, som visar att de haft infektionen

någon gång under sitt liv [Kuo, 1995]. Seroprevalensstudier har visat att den är lika

vanlig i hela världen [Grayston, 1990, 1992]. C. pneumoniae är en temperaturkänslig

bakterie som snabbt inaktiveras utanför människokroppen [SMI, 2008]. Bakterierna

sprids från person till person via luftburen smitta och inkubationstiden beräknas vara

ca 1-3 veckor.

Den kliniska bilden varierar från lätta övre luftvägsinfektioner som t.ex.

svalgkatarr med halsont eller luftrörskatarr till svåra pneumonier. Sjukdomen börjar

5

ofta smygande med stigande feber, huvudvärk och sjukdomskänsla 2-4 dygn innan

mer lokaliserade symtom uppträder som långvarig hosta.

Eftersom C. pneumoniae är en bakterie så kan luftvägsinfektionen behandlas

med antibiotika. Diagnostik av infektionen sker oftast med serologiska metoder men

PCR är en bättre metod eftersom den är mer känslig. C. pneumoniae från patientprov

växer dåligt i cellodling och inklusionernas form är mycket mindre än andra sorters

chlamydia. Cellodling har låg känslighet i en klinisk situation och är dessutom

långsam och arbetskrävande. De mest mottagliga cellinjerna för isolering är HL [Kuo,

1990, Cles, 1990] och HEp-2 [Wong, 1992].

Det påvisades ett serologiskt samband mellan C. Pneumoniae-infektioner och

ateroskleros först 1988 [Saikku, 1988]. Saikku et al. visade att patienter med

kranskärlssjukdom hade höga nivåer av antikroppar mot C. pneumoniae. Det

serologiska sambandet har ifrågasatts [Danesh, 2000] och har lett till ett stort intresse

att studera C. pneumoniaes roll vid uppkomsten av hjärt/kärlsjukdom och se hur både

akuta och långvariga infektioner påverkar metabolismen i olika organ. En teori är att

bakterien tas upp av de alveolära makrofagerna i lungorna, och via dessa celler

passerar ut i blodbanan. De kan sedan på något sätt ta sig in i blodkärlsväggen och så

småningom åstadkomma en inflammation. DNA från C. pneumoniae har kunnat

påvisas i aterosklerosiska plack men inte i normal kärlvävnad [Kuo, 1993]. Man vet

att C. pneumoniae finns i monocyter i blodbanan men man vet inte om det är

bakterien som fastnar i kärlväggen och orsakar hjärt/kärlsjukdom eller om det från

början finns ett sjukligt tillstånd, som gör att bakterien lättare fastnar i det. En hypotes

är att bakterien övergår i en persisterande fas, d.v.s. överlever utan att tillväxa men

ändå åstadkommer en inflammatorisk reaktion i blodkärlen, som i förlängningen kan

6

leda till ateroskleros. Denna hypotes kräver fler djurförsök för att man ska kunna

fastlägga om den är sann eller inte.

Vi har i detta projekt provat ett nyinköpt reagens, Chlamatis, som påstås öka

sensitiviteten av detektion med både odling och PCR av C. pneumoniae. Chlamatis

består av antikroppar som binder till EB-fasen av bakterien och det finns ännu inga

publicerade studier om detta reagens. Vi har också odlat C. pneumoniae från

musvävnad. Publicerade studier har visat att C. pneumoniae kan odlas från infekterad

musvävnad, men det har tidigare inte gjorts på detta laboratorium. Här har förekomst

av bakterien i infekterad vävnad tidigare endast undersökts med PCR. Syftet med

detta arbete var att sätta upp en metod för odling av C. pneumoniae från vävnad,

optimera denna och sedan jämföra med PCR på prover från färsk musvävnad

infekterad med det kliniska isolatet G954 av C. Pneumonia, eftersom även döda

bakterier kan detekteras med PCR. En standardkurva för kvantitativ PCR

konstruerades för att kvantitativt kunna jämföra de båda metoderna.

7

Material och metoder

Patientprover: Tio serumprover från patienter som tidigare opererats för aortastenos

användes. Etiskt tillstånd för detta har givits av forskningsetiska kommittén vid

medicinska fakulteten, Uppsala universitet. Proverna förvarades frusna i -70ºC. Hos

fyra av patienterna har C. pneumoniae tidigare påvisats i de vita blodkropparna.

Musvävnad: Lungvävnad från mus (C57BL/6J) som infekterats med C. pneumoniae

stam G-954 vid ett tidigare tillfälle och som förvarats i -70°C sedan dess användes.

Dessutom användes färsk vävnad från lunga och hjärta från samma musstam som

infekterats på samma sätt. Dessa prover togs om hand samma dag som de togs från

mössen.

Chlamatisbehandling av serumprov: Till 600 µl serum sattes 90 µl Chlamatis

(Cambridge Theranostics Ltd, Cambridge, UK). Blandningen inkuberades på lätt skak

i 37ºC under 30 min och centrifugerades sedan i 2 min vid 16000 g. Supernatanten

togs till vara och DNA extraherades.

Optimering av förbehandling för DNA-extraktion: Bitar av fryst musvävnad

fördelades till 6 eppendorfrör, 10 mg/rör. Till tre av rören tillsattes 180 µl ATL

buffert och 20 µl Proteinas K och till de andra tre sattes 180 µl ATL buffert och en

stålkula (Qiagen) varefter vävnaden homogeniserades med TissueLyser (Qiagen) i

hastigheten 30 Hz i 20 s. Sedan inkuberades alla 6 rören i 56ºC på lätt skak över natt.

Extraktionen fullföljdes nästa dag.

DNA-extraktion: DNA extraherades från musvävnad med QiaAmp DNA Mini Kit

(Qiagen) enligt tillverkarens instruktioner och eluerades med 100 µl AE buffert.

Sanntids-PCR: DNA amplifierades med sanntids-PCR, riktat mot Major Outer

Membrane Protein (MOMP) genen som beskrivits tidigare [Kuoppa Y]. Volymen av

8

mastermix var 15 µl i varje brunn och bestod av 12,5 µl TaqMan Universal PCR

master mix (Applied Biosystems, USA), 0,9 µl 25 µM forward primer (Thermo

Hybaid, Germany), 0,3 µl 25 µM reverse primer (Thermo Hybaid, Germany), 1,5 µl 5

µM probe märkt med FAM i 5´-änden (Scandinavian Gene Synthesis, Sweden). Till

detta sattes 10 µl prov. Alla prover kördes i duplikat. I varje körning ingick en positiv

kontroll samt en negativ kontroll. Positiv kontroll bestod av plasmider innehållande

ett fragment av genen och negativ kontroll av PCR-vatten. Proverna kördes i både full

koncentration samt spädda 1:10 i PCR-vatten för att minska effekten av eventuella

inhibitorer. DNA amplifierades i ett program som bestod av 50ºC i 3 min, 90ºC i 10

min följt av 60 cykler med 95ºC i 15 s och 60ºC i 60 s.

Preparering av plasmid för positiv kontroll samt standardkurva: Plasmiderna

preparerades enligt protokoll som medföljer i Plasmid Mini Kit (Qiagen). Plasmiderna

användes som positiv kontroll i PCR men även för kvantifiering av proverna med

standardkurvan från plasmiderna.

Odling av Hep2-celler: D1-medium blandades och inkuberades i 35ºC i minst 30 min

för användning. Kryorör med Hep2-celler plockades upp från kvävetanken och

tinades snabbt i ljummet vatten. Innehållet i röret överfördes till en 25cm3

cellodlingsflaska och 8-10 ml varmt D1-medium tillsattes. Flaskan inkuberades i 2-4

timmar. Mediet hälldes sedan försiktigt av och 8-10 ml D1-medium tillsattes på nytt.

Flaskan märktes med samma passagenummer som stod på kryoröret och inkuberades i

35ºC. Cellerna växer normalt upp efter 3-6 dagar och kunde då passeras.

Passering av celler: D1-medium (90 ml RPMI 1640, 10ml kalvserum, 1,6 ml Hepes

1mol/l, 0,5 ml NaHCO3 9,8%, 0,2 ml Gentamicin 10mg/ml, 2 ml glutamin 0,2mol/l)

och trypsinlösning (4,5ml EDTA 0,68 % och 0,25ml trypsin 0,012 %) blandades och

värmdes i 35ºC i minst 30 min. Cellmediet hälldes av från odlingsflaskan och trypsin

9

tillsattes (10 ml till 75 cm2 och 2 ml till 25 cm2). För att undvika att cellerna

påverkades tillsattes trypsinet inte direkt på cellytan. Flaskan vickades fram och

tillbaka så att trypsinet rann över cellerna 5-10 gånger. Trypsinet hälldes av och

cellerna inkuberades 5-10 min i 35ºC tills cellerna lossnade från ytan. Varmt D1-

medium tillsattes (10 ml till 75 cm2 och 2 ml till 25 cm2) och cellerna lösgjordes

mekaniskt från varandra genom pipettering några gånger. Till nya flaskor tillsattes

(0,25 ml till 25 cm2 och 1,5 ml till 75 cm2) cellösning samt D1-medium (40 ml till

75cm2 och 10 ml till 25 cm2). Resten av cellösningen späddes med D1-medium till

koncentrationen 1-2x105/ml celler och odlades ut i 24-hålsplattor, 1 ml/brunn.

Plattorna inkuberades i 35ºC över natt. D2-medium gjordes i ordning (D1 med 1ml

cykloheximid 100µg/ml) till infektering nästa dag och ställdes i kyl.

Optimering av förbehandling av odling av musvävnad: Hep2-celler odlades i 24-håls-

plattor dagen före försöket. Frysta bitar av två olika musvävnad (30 mg) fördes över

till rör med sukrosfosfat-glutaminlösning, SPG, (10 x vävnadvikt) och en stålkula

(Qiagen) sattes till varje rör. Rören homogeniserades med TissueLyser (Qiagen) i tre

olika hastigheter 15 Hz, 20 Hz och 30 Hz i 15 s 2x och centrifugerades sedan 10 min i

4ºC, 550 g. Supernatanten togs till vara och späddes i steg om 1:10 i varmt D1-

medium till en slutkoncentration 1:105. Spädningarna tillsattes i duplikat, 1 ml/brunn

samt duplikat av negativ kontroll som bestod av rent D1-medium och positiv kontroll

som bestod av C. pneumoniae stam G954, (240 IFU/ml), inclusion forming units, som

är ett kliniskt isolat från en sinuit-patient. Plattorna centrifugerades i 1 tim 30ºC, 2270

g och inkuberades därefter 2 tim i 35ºC CO2-inkubator. Därefter tillsattes varmt 1

ml/brunn D2-medium och inkuberades tre dygn i 35ºC CO2-inkubator.

Odling av C. pneumoniae i färsk musvävnad: Hep2-celler odlades i 24-håls-plattor

dagen före försöket i D1-medium. Färsk lungvävnad 30-60mg homogeniserades i

10

SPG med TissueLyser (Qiagen) 30 Hz i 15 s och centrifugerades 10 min i 4ºC, 600 g.

Supernatanten späddes i steg om 1:10 i varmt D1-medium till en slutkoncentration

1:105. Spädningarna tillsattes i duplikat, 1 ml/brunn samt duplikat av negativ kontroll

som bestod av rent D1-medium. Plattorna centrifugerades i 1 tim 30ºC, 2270 g och

inkuberades därefter 2 tim i 35ºC CO2-inkubator. Därefter tillsattes varmt D2-medium

1 ml/brunn och plattorna inkuberades tre dygn i 35ºC CO2-inkubator.

Färgning av Klamydia: Cellerna fixerades med 95 % etanol i 10 min, ca 1 ml/brunn.

Fixeringsvätskan sögs sedan av och brunnarna sköljdes en gång med PBS, ca 1

ml/brunn. Därefter tillsattes en droppe monoklonala antikroppar riktade mot

Chlamydia LPS (Pathfinder® Chlamydia Culture confirmation, Biorad, USA)

tillsammans med två droppar propidiumjodid (0,002 mg/ml) till varje brunn. Plattorna

inkuberades i mörker, minst 30 min och brunnarna sköljdes sedan en gång med PBS,

1 ml/brunn. Som sista steg tillsattes monteringsvätska (glycerol 87 % + PBS), ca fyra

droppar/brunn. Antalet IFU/brunn räknades i den brunn där det fanns ca 50 IFU, med

inverterat UV-mikroskop.

RESULTAT

Utvärdering av Chlamatis: Alla 10 serumprover som behandlades med Chlamatis

var negativa för C. pneumoniae i PCR. Samma prover analyserades ännu en gång men

utan förbehandling med Chlamatis, även då var de negativa för C. pneumoniae.

11

Odling från fryst musvävnad: Odling från fryst musvävnad visade sig fungera utan

problem, se figur 2. Det var viktigt att inte förstöra bakterierna med för hög

homogeniseringshastighet så att de fortfarande var levande och odlingsbara. Tre olika

hastigheter provades för homogenisering med TissueLyser, 15 Hz, 20 Hz och 30 Hz

och resultatet visade att bakterierna homogeniserades bäst vid 30 Hz utan att bli

förstörda.

Figur 2. Odling från fryst musvävnad. Det röda är Hep-2 celler och de gröna prickarna

är inklusioner av C. pneumoniae. Bilden tagen med UV-mikroskop. Förstoring 100x.

Optimering av förbehandling för DNA-extraktion: Optimering av förbehandling

för DNA-extraktion visade att vävnaden som homogeniserades med TissueLyser i

hastigheten 30 Hz i 20 s innan inkubation gav bättre resultat än endast inkubering i

56ºC på över natt. Detta resultat tillämpades sedan i följande DNA-extraktioner.

12

Påvisande av C. pneumoniae från färsk musvävnad: Möss infekterade med C.

pneumoniae avlivades vid 4 olika tillfällen: dag 4, 8, 20 och 40. Dag 4 och 8

avlivades 6 möss och dag 20 och 40 avlivades 5 möss. Den färska vävnaden från

mössen togs om hand samma dag för odling på Hep2-celler, se figur 3. Vävnaden

frystes ned för att vid annat tillfälle göra en DNA-extrahering. Medelvärdet av C.

pneumoniae dag 4, 8, 20 och 20 redovisas i tabell 1. C. pneumoniae i odling var som

högst dag 4 och lägst dag 20. I tabell 2 redovisas resultat från PCR-körningarna.

Högsta värdet av bakterien var i PCR-körningarna dag 4 och lägsta värdet dag 20.

Tabell 1. Medelvärdet på IFU/mg vävnad för varje dag.

Avlivningsdag Odling

(medelvärde/dag) 4 23247 8 4,93 20 0,26 40 4,46

Tabell 2. Medelvärdet på antal kopior/mg vävnad för varje dag.

Avlivningsdag PCR körning (medelvärde/dag) 4 172 636 8 17325 20 22 794 40 40 138

Figur 3 visar att bakterien kunde återfinnas i lungvävnad med PCR hos 6/6 möss 4

och 8 dagar efter infektionstillfället, hos 3/5 möss efter 20 dagar och hos 4/5 möss

efter 40 dagar. Odling gav obetydligt mindre utbyte med undantag för dag 40, då bara

3/5 möss var odlingspositiva.

13

0

1

2

3

4

5

6

7

4 8 20 40

Avlivingsdag

Ant

al C

.pne

umon

iae

infe

kter

ade

mös

s

Figur 3. Antal C. Pneumoniae-positiva möss vid PCR och odling från lunga tagna dag

4, 8, 20 och 40 efter infektionstillfället. Blå staplarna står för PCR och lila staplar står

för odling.

Skillnaden i utbyte från lung- respektive hjärtvävnad visas i figur 4. DNA från

C. pneumoniae kunde påvisas i hjärta hos 3 möss tagna dag 4 och endast hos en mus

tagen dag 8.

0

1

2

3

4

5

6

7

4 8 20 40

Avlivningsdag

Ant

al C

.pne

umon

iae

infe

kter

ade

mös

s

14

Figur 4. Antal positiva C. pneumoniae med PCR-analys på material från lunga och

hjärta. Blå staplar för lunga och lila staplar för hjärta.

15

DISKUSSION

C. pneumoniaes är känd för sin unika cellcykel och kan överleva intracellulärt i flera

år [Nyström-Rosander, 2006]. Dess förmåga att föröka sig kräver en värdcell och är

en viktig egenskap hos den gramnegativa bakterien [Campbell, 2002]. Mest intressant

har varit fokuseringen på förmågan av C. pneumoniae att infektera humana

makrofager, endotelceller och glatta muskelceller, vilket är känt för att vara involverat

i den aterosklerosiska processen [Ross, 1990]. Bakterien tros ha en spridning från de

respiratoriska områdena ut till kroppen genom de alveolära makrofagerna [Moazed,

1989]. Den mest dominerande detektionsmetoden som används för C. pneumoniae är

en serologisk metod som mäter antikroppar riktade mot bakterien [Kuo, 1995]. PCR

är den näst mest förekommande detektionsmetoden och mäter antal DNA kopior/mg

vävnad. Odling är en okänslig metod för att påvisa C. pneumoniae i kliniskt material

jämfört med PCR. Odling är dessutom en tidskrävande metod då bakterierna måste få

växa till sig 3 dygn i inkubator. Detta i sin tur leder till att metoden blir dyr i

arbetskostnader. Isolering av bakterien sker bäst från cellodling men den kan även

odlas i äggulesäck av ett embryo kycklingägg precis som C. trachomatis [Kuo, 1995].

Syftet med detta arbete var dels att utvärdera ett nytt reagens, Chlamatis, och

dels att optimera en metod för att kunna odla C. pneumoniae-infekterad musvävnad

på Hep2-celler.

Reagenset Chlamatis presenterades på en kongress i Ferrara, Italien 2006

(Petayev I.M 2007). Det sades kunna öka sensitiviteten för detektion av C.

penumoniae med både odling och PCR högst betydligt. Detta skulle gälla framför allt

vid undersökning av serum. Vi valde därför ut serumprover från 10 patienter där alla

hade höga antikroppstitrar för C. pneumoniae, 6 hade DNA från bakterien i vävnad

16

varav 4 hade DNA från bakterien även i lymfocyterna. Vi kunde inte påvisa C.

pneumoniae med PCR vare sig med eller utan Chlamatisbehandling i något av

proverna och kan därför inte konfirmera de resultat som presenterades på kongressen.

Eftersom det ännu inte finns några publicerade studier om detta reagens, så är vi

mycket tveksamma till dess eventuella effekt.

Odling av C. pneumoniae från vävnad från infekterade djur har inte använts

tidigare på detta laboratorium. Den metod vi har satt upp överensstämmer till stor del

med tidigare publicerade metoder [Yang, 1993] och [Erkkilä, 2002]. I dessa tidigare

studier homogeniserades vävnaden med en mortel och SPG buffert tillsattes. Därefter

centrifugerades proverna 10 min i 4ºC, för att sedan frysas i -70°C innan de odlades.

Anledningen till att bakterien centrifugeras i 4ºC är att den snabbt blir inaktiverad i

rumstemperatur [Kuo, 1995]. Vi har sedan lång tid tillbaka erfarenhet av att odla C.

pneumoniae i Hep2-celler, både för patientprov och för att propagera upp stora

mängder bakterier för djurförsök, så därför valdes denna cellinje också till dessa

försök.

Vid optimeringen av odlingsförfarandet användes först fryst lungvävnad från

ett tidigare djurförsök. Denna vävnad var tidigare undersökt med PCR och var positiv

för C. pneumoniae-DNA och hade sedan dess förvarats i -70°C. Att homogenisera

vävnad i TissueLyser var mycket enklare och det var också mindre risk för

kontamination av oönskade bakterier än när man homogeniserar med mortel. Det

fanns dock en viss risk för att DNA sönderdelas om hastighet och tid överskreds.

Sedan optimal hastighet och tid, 30 Hz i 20 s, bestämts, användes dessa i de följande

försöken med färsk musvävnad. Bakterien växte bra och fina inklusioner erhölls med

detta förfarande.

17

För att kunna kvantifiera bakterierna i den färska vävnaden med PCR gjordes

en standardkurva. Eftersom PCR oftast är känsligare än odling var det viktigt att

kunna jämföra de mängder som uppmättes med odling med dem som uppmättes med

PCR. Antalet PCR-positiva lungor överensstämde till stor del med antalet

odlingspositiva lungor förutom dag 4 där 5/6 PCR-positiva lungor var odlingspositiva

och dag 40 där 3/5 PCR-positiva lungor också var positiva med odling. De uppmätta

mängderna av bakterien i vävnaden minskade också väsentligt från dag 4 till dag 40,

vilket visade att djuren tillfrisknat.

Det är tidigare visat [Yang, 1993] att möss tagna dag 4 efter infektionstillfället

ger det största utbytet av bakterien i lunga med odling, vilket överstämmer med

resultaten vi fått. I lunga var antalet C. pneumoniae-positiva möss i vår studie som

högst dag 8, med alla möss positiva. Enligt den tidigare studien [Yang, 1993] ska

bakterierna kunna återfinnas hos alla möss fram till dag 21, vilket inte stämde helt

med vårt resultat då vi bara kunde påvisa bakterier hos 3/5 möss dag 20. Vad detta

berodde på är svårt att säga, men eftersom odling och PCR gav samma resultat så kan

de jämföras med studien [Erkkilä, 2002] där de endast lyckats återfinna bakterien hos

4/5 möss dag 10. Många olika förhållanden kan påverka odlingen som t.ex.

förbehandling vid homogeniseringen eller spädningarna, då det är lätt att det går fel

någonstans i stegen före odlingen.

Det visade sig att utbytet från hjärtvävnad var mycket sämre än från lunga,

med PCR, vilket inte stämde riktigt med tidigare studier [Edvinsson, 2007] där

bakterien erhölls från 4/6 möss dag 2 och 3/6 dag 5 och 8.

Den slutsats vi kan dra från vår studie är att den metod vi har satt upp för

odling av C. pneumoniae från färsk musvävnad fungerade bra och hade prestanda som

överstämmer med tidigare publicerade studier. Denna metod kommer att användas i

18

framtida försök med antibiotikabehandling av C. pneumoniae-infekterade möss.

Eftersom även döda bakterier kan detekteras med PCR, är det helt nödvändigt att

kunna odla bakterien för att kunna skilja levande från döda bakterier.

19

REFERENSER

Campbell L.A., Kuo C.-C. 2004. Chlamydia pneumoniae – an infectious risk factor

for atherosclerosis? Nat. Rev. Microbiol. 2:23-32.

Cles L. D. and Stamm W. E. 1990. Use of HL cells for improved isolation and

passage of Chlamydia pneumoniae. J. Clin. Microbiol. 28:938-40.

Danesh J., Whincup P., Walker M. et al. 2000. Chlamydia pneumoniae IgG titres

coronary heart disease: prospective study and meta-analysis. BMJ 312:208-13.

Edvinsson M., Frisk P., Molin Y. et al. 2008. Trace element balance is changed in

infected organs during acute Chlamydophila pneumoniae infection in mice. Biometals

21:229-37.

Erkkilä L., Laitinen K., Laurila A. et al. 2002. Experimental Chlamydia

pneumoniae infection in NIH/S mice: effect or reinoculation with chlamydial or cell

preparation on celture, PCR and histological findings of lung tissue. Vaccine 20:

2318-24.

Grayston J. T. 1992. Infection caused by Chlamydia pneumoniae, strain TWAR.

Clin.Infect Dis. 15:757-63.

Grayston J. T., Campell L. A., Kuo C.-C. et al. 1990. A new respiratory tract

pathogen: Chlamydia pneumoniae strain TWAR. J. Infect. Dis. 161:618-25.

Grayston J. T., Kuo C.-C., Campell L. A. et al. 1989. Chlamydia pneumoniae sp.

nov. for Chlamydia sp. strain TWAR. Int. J. Syst. Bacteriol. 39:88-90.

Grayston, J. T., Kuo C.-C., Wang S.-P. et al. 1986. A new Chlamydia psittaci

strain, TWAR, isolated in acute respiratory tract infection. N. Engl. J. Med. 315:161-

8.

Kuo C.-C. and Campbell L. A. 2004. Chlamydia pneumoniae — an infectious risk

factor for atherosclerosis. Nat. Rev. Microbiol. 2, 23-32.

Kuo C.-C., Chen H. H., Wang S. P. et al. 1986. Identification of a new group of

Chlamydia psittaci strains called TWAR. J. Clin. Microbiol. 24:1034-7.

Kuo C.-C. and Grayston J. T. 1990. A sensitive cell line, HL cells, for isolation and

propagation of Chlamydia pneumoniae strain TWAR. J. Infect. Dis. 162:755-8.

20

Kuo C.-C., Jackson L. A., Campbell L. A. et al. 1995. Chlamydia pneumoniae

(TWAR). Clin Microbiol. Rev. 8: 451-61.

Kuo C.-C., Shor A, Campbell L. A. et al. 1993. Demonstration of Chlamydia

pneumoniae in atherosclerotic lesions of coronary arterics. J Infect Dis 167:841-9.

Kuoppa Y., Boman J., Scott L., Eriksson I. et al. 2002. Quantitative

detection of respiratory Chlamydia pneumoniae infection by real-time PCR. J

Clin Microbiol 40: 2273-4.

Moazed T.C., Kuo C.-C., Grayston J. T. et al. 1998. Evidence of systemic

dissemination of Chlamydia pneumoniae via macrophages in the mouse. J. Infect.

Dis. 5:1322-5.

Nyström-Rosander C., Edvinsson M., Hjelm E. et al. 2002. Chlamydophila

pneumoniae: Specific mRNA in aorta ascendens in patients undergoing coronary

artery by-pass grafting. Scand. J. Infect. Dis. 38:758-63.

Petyev I. M., Zigangirova N. A. Chlamydia pneumoniae bacteriemia in coronary

heart disease and peripheral occlusive disease. International Conference on

Chlamydia and Mycoplasma Human Infections. Ferrara, Italy, April 19th-20th, 2007.

Ross R. 1990. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s.

Nature 362:801-9.

Saikku P., Leinonen M., Mattila K. et al. 1988. Serological evidence of an

association of a novel Chlamydia, TWAR, with chronic coronary heart disease and

acute myocardial infarction. Lancet 2:983-6.

Wong K. H., Skelton S. K. and Chan Y. K. 1992. Efficient culture of Chlamydia

pneumoniae with cell lines derived from the human respiratory tract. J. Clin.

Microbiol. 30:1625-30.

Yang Z. P., Kuo C.-C., Grayston T., 1993. A mouse model of Chlamydia

pneumoniae strain TWAR pneumonitis. Infect. Immun. 61:2037-40.

21