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Universidad de La Salle Universidad de La Salle
Ciencia Unisalle Ciencia Unisalle
Ingenieriacutea de Alimentos Facultad de Ingenieriacutea
1-1-2009
Determinacioacuten de las caracteriacutesticas aromaacuteticas de Determinacioacuten de las caracteriacutesticas aromaacuteticas de
Brettanomycesdekkera aislado en vino tinto Babic de la regioacuten Brettanomycesdekkera aislado en vino tinto Babic de la regioacuten
de Dalmacia Croacia de Dalmacia Croacia
Diana Rociacuteo Urrea Blanco Universidad de La Salle Bogotaacute
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Citacioacuten recomendada Citacioacuten recomendada Urrea Blanco D R (2009) Determinacioacuten de las caracteriacutesticas aromaacuteticas de Brettanomycesdekkera aislado en vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia Retrieved from httpsciencialasalleeducoing_alimentos145
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DETERMINACION DE LAS CARACTERISTICAS
AROMATICAS DE BrettanomycesDekkera AISLADO
EN VINO TINTO BABIC DE LA REGION DE
DALMACIA CROACIA
DIANA ROCIO URREA BLANCO
UNIVERSIDAD DE LA SALLE- UNIVERSITY OF ZAGREB
FACULTAD DE INGENIERIA DE ALIMENTOS- FACULTY OF FOOD
TECHNOLOGY AND BIOTECHNOLOGY
DEPARTAMENTO DE INGENIERIA DE ALIMENTOS - DEPARTMENT OF
TECHNOLOGY AND ANALYSIS OF BEVERAGES
BOGOTA COLOMBIA ndash ZAGREB CROATIA
2009
DETERMINACION DE LAS CARACTERISTICAS AROMATICAS DE
BrettanomycesDekkera AISLADO EN VINO TINTO BABIC DE LA REGION DE
DALMACIA CROACIA
DIANA ROCIO URREA BLANCO
Trabajo de grado para optar al tiacutetulo de Ingeniera de Alimentos
Asesores de investigacioacuten
LEO GRACIN
PhD Senior Scientific Assistant
PATRICIA CHAPARRO GONZALES
Ingeniera de Alimentos
UNIVERSIDAD DE LA SALLE- UNIVERSITY OF ZAGREB
FACULTAD DE INGENIERIA DE ALIMENTOS- FACULTY OF FOOD
TECHNOLOGY AND BIOTECHNOLOGY
DEPARTAMENTO DE INGENIERIA DE ALIMENTOS - DEPARTMENT OF
TECHNOLOGY AND ANALYSIS OF BEVERAGES
BOGOTA COLOMBIA ndash ZAGREB CROATIA
2009
CONTENIDO
paacuteg
RESUMEN ----------------------------------------------------------------------------------------------------- 6
ABSTRACT ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 7
INTRODUCCION -------------------------------------------------------------------------------------------- 8
1 MARCO TEORICO -------------------------------------------------------------------------------------- 10
11 REPRODUCCION -------------------------------------------------------------------------------------- 10
111 GEMACIOacuteN MULTILATERAL --------------------------------------------------------------------------------- 12
112 GEMACIOacuteN POLAR ------------------------------------------------------------------------------------------- 12
113 FISIOacuteN ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 12
114 PSEUDOMYCELIUM ------------------------------------------------------------------------------------------ 13
12 TAXONOMIA ------------------------------------------------------------------------------------- 13
121 DEKKERABRETTANOMYCES ------------------------------------------------------------------------- 14
13 CARACTERISTICAS FISIOLOGICAS ----------------------------------------------------- 16
132 IDENTIFICACIOacuteN DE BRETTANOMYCESDEKKERA ----------------------------------------------- 21
14 MEDIOS SOacuteLIDOS SELECTIVOS ----------------------------------------------------------------- 21
15 DIOacuteXIDO DE AZUFRE (SO2) EN VINOS ---------------------------------------------------------- 23
151 FORMAS DEL DIOacuteXIDO DE AZUFRE (SO2) ---------------------------------------------------------------- 24
152 INHIBIDOR MICROBIANO ------------------------------------------------------------------------------------ 25
16 ANTIBRETTreg COMO ALTERNATIVA DE PREVENCIOacuteN Y ELIMINACIOacuteN DE
BRETTANOMYCESDEKKERA ------------------------------------------------------------------------------- 27
2 PROBLEMA -------------------------------------------------------------------------------------- 29
3 JUSTIFICACION -------------------------------------------------------------------------------- 31
4
4 OBJETIVOS ------------------------------------------------------------------------------------------------ 32
41 GENERAL ------------------------------------------------------------------------------------------------- 32
42 ESPECIacuteFICOS ---------------------------------------------------------------------------------------------- 32
5 ALCANCES --------------------------------------------------------------------------------------- 33
6 ESTADO DEL ARTE --------------------------------------------------------------------------- 34
7 MATERIALES Y METODOS ----------------------------------------------------------------- 39
71 MEDIO SOLIDO SELECTIVO PARA BRETTANOMYCESDEKKERA ------------------------- 39
711 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------------- 39
712 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------------ 39
72 MEDIO LIacuteQUIDO SELECTIVO PARA BRETTANOMYCESDEKKERA ------------------ 42
721 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------- 42
722 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------- 42
73 INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO DE
LA REGION DE DALMACIA CROACIA ------------------------------------------------------------- 44
731 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------- 44
732 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------- 44
74 DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO
BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE --- 46
741 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------------- 46
742 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------------ 46
8 DISCUSIOacuteN Y RESULTADOS --------------------------------------------------------------- 48
81 RESULTADOS PARA EL DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO ------------------- 48
82 RESULTADOS PRUEBAS MEDIO LIQUIDO -------------------------------------------- 53
83 RESULTADOS DE LA INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg
EN VINO TINTO DE LA REGION DE DALMACIA CROACIA ----------------------------------- 55
5
84 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN EL
VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID
PHASE --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 65
841 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGUacuteN TEMPERATURAS DE
ALMACENAMIENTO --------------------------------------------------------------------------------------------- 70
9 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES --------------------------------------------- 82
91 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA DESARROLLO DEL MEDIO
SOLIDO 82
92 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA DESARROLLO DEL MEDIO
LIacuteQUIDO ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 83
93 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA INFLUENCIA DE DIOXIDO
DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE
DALMACIA CROACIA ----------------------------------------------------------------------------------- 84
94 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA DETERMINACION DE
AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL
METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE ---------------------------------------------- 85
ANEXOS ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 87
6
RESUMEN Este estudio presenta el desarrollo y evaluacioacuten de simples meacutetodos para la deteccioacuten de
la levadura BrettanomycesDekkera en vino y su medio de produccioacuten con el uso de
medio solido y liquido selectivo ademaacutes se evaluacutea el efecto del Dioacutexido de Azufre SO2 y
AntiBrettreg en vino tinto de la regioacuten de Dalmacia Croacia El meacutetodo de deteccioacuten de
esta levadura emplea medios selectivos enriquecidos los cuales contienen Glucosa (20
grl) en comparacioacuten con Etanol (6ml l) como fuentes de carboacuten y energiacutea cicloheximida
(30 grl) para prevenir la presencia de Sachharomyces ampicilina (10 mgL) como
antibioacutetico para prevenir el crecimiento de bacterias y acido p-cumaacuterico (100 mgL) como
precursor de la produccioacuten de 4-etilfenol para el medio solido el uso de agar se realiza
en una concentracioacuten de 16 grL Despueacutes de la siembra realizada en los medios (solido y
liquido) de vino contaminado con la levadura BrettanomycesDekkera es monitoreado
diariamente micro y macroscoacutepicamente
Una muestra de vino tinto Babic de Croacia fue contaminado con colonias de la levadura
BrettanomycesDekkera y fue dividido en 8 muestras de las cuales 2 de estas fueron
monitoreadas como control sin adicioacuten de ninguacuten compuesto 2 con adicioacuten de dioacutexido de
azufre SO2 en una concentracioacuten de 40mgL y 4 de estos con AntiBrettreg en una
concentracioacuten de 40grHl El meacutetodo de este estudio se basa en la determinacioacuten del
comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en estas condiciones Este se
evaluoacute en teacuterminos de crecimiento de la citada levadura (UFCml) presentes en las
muestras y anaacutelisis fisicoquiacutemicos antes y despueacutes de 15 diacuteas de adicioacuten y monitoreo
7
ABSTRACT
This experiment presents the development and testing of a simple way to detect
BrettanomycesDekkera from wine and wine environments using selective media in solid
phase and liquid phase and the influence of Sulfur Dioxide (SO2) and Antibrett reg in red
wines from Dalmatian region The method of detection of this yeast employs selective
enrichment mediums These mediums contains glucose (20gl) and Ethanol (6) as
carbon and energy source cycloheximide (30 mgl) to prevent growth of Sachharomyces
ampicilin (10 mgl) to prevent growth of bacteria and p-coumaric acid (100 mgl) as a
precursor of the production of 4-etilphenol depending on the phase of the medium agar
compound is used in a concentration of 16 grl After putted on the medium wine
contaminated with BrettanomycesDekkera is monitored by micro and macro inspection
also with the liquid medium
A red wine from Dalmatian region was contaminated with BrettanomycesDekkera colonies
and divided in 8 different containers from these 8 containers we had two for control no
addition two with addition of Sulfur Dioxide (SO2) in a concentration of 40 mgl and four of
them with Antibrett reg in a concentration of 40gHl The method for this study is based in
following the behavior of the yeast BrettanomycesDekkera with these compounds in this
wine this behavior was monitored based in CFUml showing in the samples and physic
and chemical analysis before addition and 15 days after
8
INTRODUCCION
Las levaduras del geacutenero Brettanomyces o su forma telemoacuterfica (nombre que
reciben las especies que presentan reproduccioacuten sexual y en consecuencia
formacioacuten de esporas por meiosis) Dekkera fueron descritas por primera vez por
Claussen en 1903 en la produccioacuten de cerveza1
Este geacutenero se conoce desde hace tiempo como agente contaminante en la
industria cervecera de la sidra y de bebidas carbonatadas2 En la industria
enoloacutegica su descripcioacuten como alterante es maacutes reciente
Durante los antildeos 1950s muchos autores reportaron el aislamiento del genero
Brettanomyces en uvas francesas e italianas (Van der Walt y Van der Kerken
1958) Sin embargo en muchas regiones del mundo viniacutecola esta levadura no ha
sido identificada lo cual dificulta su deteccioacuten en materiales o productos
contaminadosEntre todos los microorganismos la levadura
BrettanomycesDekkera es una de las maacutes temidas por los vinicultores El
crecimiento y desarrollo de esta levadura causa alteraciones denominadas
ldquocaraacutecter Brettrdquo lo cual ocurre especialmente en vinos tintos3
1 Gilliland R Brettanomyces I Occurrence characteristics and effects on beer flavor J Inst Brew
1961
2 Deak T y Beuchat LR Handbook of spoilage yeast CRC Press Nova York 1996
3 Heresztyn T Archives of Microbiology 1986 Metabolism of phenolic compounds from
hydroxycinnamic acids by Brettanomyces yeast
9
El ldquocaraacutecter Brettrdquo produce un amplio espectro de sabores y aromas alterantes
entre los cuales estaacuten corral minerales tinta tabaco cuero faacutermacos y
ahumado estas alteraciones se le atribuyen a los compuestos 4-etilfenol y 4-
etiguayacol las cuales causan una supresioacuten de aromas atractivos en el vino
como de frutas y flores y perdida de sabores agradables para el consumidor como
acido salado amargo o picante 4
Esta levadura tiene distinto comportamiento seguacuten el tipo de vino al que esteacute
asociada pues cada tipo de vino tiene diferente composicioacuten de carbonos
nitroacutegenos vitaminas y minerales
Con este estudio se evaluacutea el comportamiento y caracterizacioacuten de la levadura
BrettanomycesDekkera en vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia con
el desarrollo de medios solido y liquido para la selectividad de la levadura
alteraciones aromaacuteticas del vino tinto Babic producidas por 4 etilfenol y 4
etilguayacol y el comportamiento de BrettanomycesDekkera en el vino al ser
tratado con Dioacutexido de azufre (SO2) comparativamente con tratamiento Antibrettreg
4 Boulton Singleton Bisson amp Kunkee 1996 Descripcioacuten de aromas fenoacutelicos
10
1 MARCO TEORICO
Las levaduras representan el grupo de microorganismos maacutes importante en la
industria viniacutecola porque sin Saccharomyces producir vinos de alta calidad seriacutea
imposible Ademas de Saccharomyces hay muchos otros geacuteneros y especies de
levaduras presentes durante la vinificacioacuten que afectan la calidad del vino positiva
o negativamente5
Las levaduras comprenden 39 geacuteneros y 350 especies Se identifican y clasifican
basaacutendose en caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas Entre los aspectos
morfoloacutegicos considerados se encuentran el tamantildeo y la forma de las ceacutelulas en
medios soacutelidos y liacutequidos especificados el modo de reproduccioacuten y si forma velo
en la superficie o sedimenta en un medio liacutequido Entre las caracteriacutesticas
fisioloacutegicas consideradas se encuentra si puede crecer (y fermentar) en un
determinado carbohidrato y si puede o no utilizar determinadas fuentes de
nitroacutegeno como los nitratos6
11 REPRODUCCION
Las levaduras son agrupadas en tres familias conocidas como
Saccharomycetaceae Sporobolomycetaceae y Cryptococcaceae Estas
5 H Erten June 2002 Relations between elevated temperatures and fermentation behavior of
Kloeckera apiculata and Saccharomyces cerevisiae associated with winemaking in mixed culture
World Journal of Microbiology and Biotechnology Volume 18 N 4 pag 1 Adana Turkey 6 Cerveceros de Argentina 2006 Levadura wwwcervezadeargentinacomararticuloslevadurahtm
11
representan el grupo de microorganismos entre bacterias y hongos respecto a su
tamantildeo de ceacutelula Este grupo es caracterizado por su forma de reproduccioacuten
vegetativa conocida como ldquogemacioacutenrdquo Bajo condiciones optimas una ceacutelula
madre puede gemar varias veces durante el periodo reproductivo Sin embargo
bajo estrictas condiciones de fermentacioacuten una levadura va a gemar solamente
entre tres o cuatro veces Aquiacute la disponibilidad de oxigeno la cual es necesaria
para la formacioacuten de precursores de la membrana de la ceacutelula limita la
replicacioacuten7
Estos microorganismos muestran varios tipos de gemacioacuten lo cual puede dar un
valor diagnostico Entre aquellas aisladas de fermentacioacuten y antildeejamiento del vino
se observan maacutes frecuentemente multilateral y gemacioacuten polar 8
La modalidad maacutes comuacuten es la gemacioacuten proceso asexual en el cual la ceacutelula
progenitora emite un conducto tubular desde la vacuola nuclear hacia un punto
perifeacuterico proacuteximo a la misma Entonces se forma en la direccioacuten del conducto
una pequentildea protuberancia en la superficie externa de la ceacutelula y el conducto
pasa atravesando la pared celular a dicha protuberancia la cual se ensancha
llenaacutendose con el material citoplaacutesmico y nuclear de la ceacutelula progenitora Cuando
el brote o yema formada llega a ser casi tan grande como la ceacutelula progenitora los
aparatos nucleares de ambas ceacutelulas se orientan de forma que sus centrosomas
respectivos equidisten del punto de unioacuten Al llegar este momento la ceacutelula madre
y la ceacutelula hija se separan y se inicia la formacioacuten de nuevas ymas En la
gemacioacuten normal no se forman tabiques de separacioacuten entre ceacutelula madre y
ceacutelulas hijas pero en algunos casos el proceso se inicia en la gemacioacuten y se
completa por divisioacuten con la separacioacuten definitiva de ambos individuos La ceacutelula
madura de puede producir por gemacioacuten durante el curso de vida un promedio de
7 Brinton M Miller and Warren Litsky PhD 1976 Industrial Microbiology Edi Mac Graw Hill United States
of America
8 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures
edi Springer second edition Fresno California United States of America
12
24 generaciones de ceacutelulas hijas Las yemas sucesivas se forman siempre en
sitios diferentes de la superficie de la ceacutelula9
111 Gemacioacuten multilateral
La gemacioacuten multilateral ocurre en el ldquohombrordquo o aacuterea de la levadura donde ocurre
la reproduccioacuten La gemacioacuten y ciclo de separacioacuten crea un problema para las
levaduras durante su fase fermentativa pues en este tiempo la ceacutelula madre se
reduce aproximadamente un medio Porque la siacutentesis de la membrana celular
ocurre bajo condiciones anaeroacutebicas lo que limita los ciclos asexuales
replicativos Como resultado la mayoriacutea de las fermentaciones se completan en la
fase estacionaria (no gemacioacuten) Un ejemplo de esta reproduccioacuten es
BrettanomycesDekkera10
112 Gemacioacuten Polar
A diferencia de la gemacioacuten multilateral la gemacioacuten polar puede ocurrir en uno o
dos polos En el caso de Kloeckera y Saccharomyces la gemacioacuten ocurre en
ambos polos aumentando la poblacioacuten de levaduras con forma de ldquolimoacutenrdquo 11
113 Fisioacuten
Esta reproduccioacuten es caracteriacutesticas del genero Schizosaccharomyces donde la
formacioacuten de la ceacutelula hija ocurre sin la reduccioacuten de la madre ceacutelula como en los
casos anteriores En este caso la formacioacuten de la microscoacutepica pared celular
ocurre entre la madre ceacutelula y la hija seguida por la separacioacuten12
9 Araya Pablo 2002 Reproduccioacuten de hongos unicelulares mediante gemacioacuten esporulacioacuten y
fisioacuten httphtmlrincondelvagocomreproduccion-asexualhtml
10 11 12 Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic
Publishers GmbH United States of America and Canada
13
114 Pseudomycelium
Cualquier fabricante de vinos ha tenido la oportunidad de notar la formacioacuten de
una peliacutecula en la superficie del vino Esto surge debido a la gemacioacuten repetida de
las levaduras oxidativas y fallas en el momento de la separacioacuten de la ceacutelula hija
de la madre Con el tiempo el lazo previo entre la madre ceacutelula e hija se ampliacutea
dando la impresioacuten de filamentos como si se tratase de mohos siendo que son
levaduras 13
12 TAXONOMIA
Para distinguir las levaduras que pueden producir ascoporas de aquellas que no
los micologistas usan doble taxonomiacutea para su clasificacioacuten Desafortunadamente
la nomenclatura para la combinacioacuten anamorfotelemorfo es frecuentemente
diferente Unos ejemplos de levaduras sexualasexual o telemorfoanamorfo son
DekeraBrettanomyces Metschnikowia pulcherrimaCandida pulcherrima
Hanseniaspora uvarumKloeckera apiculata Torulaspora delbruecki Candida
colliculosa 14
Sin embargo las levaduras son diferenciadas por los taxonomistas por asignacioacuten
de varios nombres de geacutenerosespecies varios vinicultores usan un sistema
informal para agrupar levaduras basadas en su morfologiacutea u otras caracteriacutesticas
Por ejemplo a Kloeckera apiculata se le refiere como ldquolevadura apiculadardquo
tiene forma de limoacuten Esta levaduras asi com muchas otras presentes en el mosto
de la uva como lo son Candida Cryptococcus Debaryomyces Hansenula
Issatchenkia Kluyveromyces Metschnikowia Pichia y Rhodotorula tambieacuten son
llamadas levaduras ldquonativasrdquo ldquonaturalesrdquo o ldquosalvajesrdquo por su origen el vintildeedo o en
13
Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers
GmbH United States of America and Canada
14 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
14
la vinera Algunos enoacutelogos han discutido contra el uso de estos teacuterminos porque
esta implicancia no sucede en todas las levaduras ya que estas son de alguna
forma ldquono-nativasrdquo o ldquono naturalesrdquo (Ej Saccharomyces o Brettanomyces) El
teacutermino ldquono Saccharomycesrdquo es maacutes comuacuten para nombrar aquellas levaduras
presentes en el mosto de la uva que no son del genero Saccharomyces15
Las levaduras encontradas despueacutes de la fermentacioacuten alcohoacutelica tambieacuten son
asignadas a un grupo informal Algunas veces las levaduras que conducen la
principal fermentacioacuten (Saccharomyces) son muchas veces llamadas ldquolevaduras
fermentativasrdquo basados en su metabolismo Durante su antildeejamiento algunas
levaduras (Candida Hansenula y Pichia) pueden crecer en la superficie en
presencia de oxigeno Esta peliacutecula superficial es comuacutenmente asociada a
deterioro del vino esta levadura se le conoce como ldquolevadura formadora de
peliacuteculardquo16
121 DekkeraBrettanomyces
La taxonomiacutea cientiacutefica sobre BrettanomycesDekkera ha cambiado en los uacuteltimos
antildeos Brettanomyces estaacute clasificado dentro de la misma familia que
Saccharomyces (familia Saccharomycetaceae) Actualmente dentro del geacutenero
Brettanomyces se aceptan cinco especies diferentes (B bruxellensis B
anomalus B custersianus B nanas y B naardenensis)17
Las teacutecnicas de biologiacutea molecular han demostrado que B intermedious B
lambicus B custerseii o D intermedia son sinoacutenimos de B bruxellensis por lo
que estas denominaciones han quedado en desuso Los microorganismos de este
geacutenero presentan dos formas una capaz de reproducirse sexualmente (Dekkera)
15
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
16 Kurtzman CP 1998 The industrial and agricultural significance of yeasts 4
th Edition Amsterdam
Holanda
17 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
15
y otra que lo hace asexualmente (Brettanomyces) Tambieacuten se llaman
respectivamente forma perfecta y forma imperfecta En algunos casos la forma
perfecta y la imperfecta reciben nombres diferentes como ocurre con B anomalus
y D anomala En otros casos el nombre es similar como las pertenecientes a la
especie bruxellensis que pueden parecer como D bruxellensis como B
bruxellensis o como BrettanomycesDekkera A efectos praacutecticos en la bodega
estos dos estados son similares Cuando vemos referencias a Brettanomyces
como contaminante en la mayor parte de los casos se refieren a
DekkeraBrettanomyces ya que este es el responsable de las alteraciones en el
vino18 y 19
La morfologiacutea celular de BrettanomycesDekkera es ojival o ciliacutendrica con
gemacioacuten multipolar en reproduccioacuten vegetativa Una de las caracteriacutesticas de
este geacutenero es su tamantildeo celular variable y la formacioacuten de filamentos19
18 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 23
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
19
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
16
Figura 1 Microfotografiacutea de cultivo de BrettanomycesDekkera a) Variabilidad morfoloacutegica y de
tamantildeo celular b) forma filamentosa
Fuente Lopez-Cordon Eva BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia wwwacenologiacom
Los defectos sensoriales asociados directamente a Brett aparecen
mayoritariamente en vinos tintos de calidad y las causas radican en la propia
fisiologiacutea del microorganismo Ademaacutes al ser una levadura de crecimiento muy
lento la alteracioacuten se presenta principalmente durante el almacenamiento y sobre
todo la crianza del vino habitual en los vinos tintos de gama alta En las barricas
de madera el microorganismo tiene a su disposicioacuten todo el sustrato y tiempo
suficiente para realizar su actividad La naturaleza porosa de la madera y su difiacutecil
limpieza contribuye a que las poblaciones existentes se mantengan incluso
despueacutes del lavado de la barrica Ademaacutes BrettanomycesDekkera tiene la
capacidad de degradar uno de sus componentes la celobiosa 20
13 CARACTERISTICAS FISIOLOGICAS
S cerevisiae y BrettanomycesDekkera tienen metabolismos similares muy
adaptados a las condiciones de vinificacioacuten Tras la fermentacioacuten alcohoacutelica S
cerevisiae es la levadura mayoritaria debido a que las condiciones nutricionales
20
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
17
del vino son muy estrictas (altas concentraciones de etanol y bajas
concentraciones de nutrientes) En este momento BrettanomycesDekkera
continuacutea creciendo gracias a que utiliza nutrientes que S cerevisiae no ha podido
consumir sobre todo algunos azuacutecares y fuentes de nitroacutegeno21
Una de las caracteriacutesticas que diferencia a BrettanomycesDekkera es la gran
diversidad de azuacutecares que puede fermentar (ver tabla de Relacioacuten de los
principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) La mayoriacutea de
las cepas pueden crecer utilizando trealosa y celobiosa azucares presentes en el
vino y no consumibles por S cerevisiae Otra de las ventajas que presenta frente
a S cerevisiae (y frente a la mayoriacutea de las levaduras) es que puede utilizar los
nitratos como fuente de nitroacutegeno Debido a que S cerevisiae soacutelo utiliza el
nitroacutegeno amoniacal y los aminoaacutecidos libres estos se consumen con relativa
rapidez Al final de la fermentacioacuten el nitroacutegeno moniacal es escaso y se favorece
el crecimiento de las levaduras que pueden utilizar otras fuentes de nitroacutegeno
Ademaacutes Brettanomyces puede crecer con concentraciones de fosfato diamoacutenico
tan bajas como 05gl o a partir de diversos aminoaacutecidos En resumen
BrettanomycesDekkera crece maacutes despacio que S cerevisiae es resistente a
concentraciones altas de alcohol puede utilizar otros azucares como fuentes de
energiacutea y nitrato como fuente de nitroacutegeno Esto explica que pueda reproducirse
cuando la fermentacioacuten alcohoacutelica ha terminado a partir de nutrientes no
consumibles por S cerevisiae y cuando no tiene competidores22
21
Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
22 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
18
Tabla 1 Relacioacuten de los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto
Fuente Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista
VINOTEQ N 38 pag 21 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
131 BrettanomycesDekkera y siacutentesis de fenoles volaacutetiles
El origen de los fenoles volaacutetiles estaacute relacionado con la actividad secuencial de
dos enzimas que descarboxilan los aacutecidos en hidroxiestirenos (vinilfenoles) que
19
son posteriormente reducidos a etilderivados (etilfenoles)23 como puede
observarse en la figura 2
Figura 2 Siacutentesis de etilfenoles de BrettanomycesDekkera
Fuente ACE revista de Enologia wwwacenologiacom
El primer paso de descaboxilacion de los aacutecidos hidroxicinamicos es comuacuten
tambieacuten en otros microorganismos como bacterias hongos y otras levaduras Sin
embargo el segundo paso reduccioacuten de vinilfenoles es caracteriacutestico de algunos
tipos de levaduras como Dekkera bruxelliensis D anomala Pichia guillermondi
Candida versarilis C halophila y C mannitofaciens24
Los fenoles volaacutetiles que se asocian al problema Brett en vinos son el 4-etilfenol y
el 4- etilguaiacol asiacute como sus precursores intermedios 4-vinilfenol y 4-
vinilguaiacol aunque estos uacuteltimos son menos importantes por ser muy reactivos y
raacutepidamente convertidos en etilfenoles por BrettanomycesDekkera o en su caso
23
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
24 Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
20
condensan con otras moleacuteculas como antocianos25 Los etilfenoles y
especialmente elevadas concentraciones de 4-vinilfenol en vinos se asocian con
aromas desagradables asociados a descriptores como ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de
caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo26
El umbral sensorial del 4-etilfenol es de 230 μg l-1 y el del 4-etilguaiacol es de 47
μgl Pese a su menor umbral sensorial el 4-etilguaiacol responde a descriptores
como ldquobaconrdquo o ldquoahumadordquo que a bajas concentraciones aportan complejidad por
lo que se puede considerar sensorialmente menos conflitivo que el 4-etilfenol 27
Figura 3 Defectos sensoriales producidos en el vino por BrettanomycesDekkera
Fuente Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
25 Morata A Goacutemez-Cordoveacutes M Calderoacuten F Suaacuterez J 2006 Effects of pH temperature and SO2 on the
formation of pyranoanthocyanins during red wine fermentation with two species of Saccharomyces Journal Food Microbiology No106 pag 4 Madrid Espana
26 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea 27 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
21
132 Identificacioacuten de BrettanomycesDekkera
Los Bioacutelogos usan sistemas de identificacioacuten basados en similitudes taxonoacutemicas
entre organismos dichas similitudes pueden ser morfoloacutegicas tipos capacidad de
produccioacuten de sustratos como azuacutecar yo nitratos caracteriacutesticas fisioloacutegicas y
bioquiacutemicas secuencia del material geneacutetico y respuestas inmunoloacutegicas28
En la industria viniacutecola es importante recurrir a diferentes tipos de pruebas para la
identificacioacuten de microorganismos una de estas y la maacutes realizada es la revisioacuten
del microorganismo bajo el microscopio Esta prueba brinda informacioacuten sobre la
morfologiacutea del microorganismo (cocos bacilos formas puntudas ojival entre
otros) tamantildeo (dimensiones) agrupaciones celulares (solas parejas triacuteos
grupos o cadenas) Sin embargo el uso del microscopio es una prueba raacutepida
para examinar mostos o vino pero no determina cantidades que muchas veces es
requerido para tratamientos de accioacuten otro de los inconvenientes es que los
microorganismos pueden variar su morfologiacutea en forma o tamantildeo dependiendo de
la edad y las condiciones de crecimiento por lo que puede no ser clara la
identificacioacuten de este29
14 Medios soacutelidos selectivos
Si se requiere de la confirmacioacuten del microorganismo este debe ser aislado del
vino para una caracterizacioacuten para esto se requiere de medios soacutelidos Cuando se
examina un microorganismo en un medio solido es importante revisar las
caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias (ver figura 4 Morfologiacuteas de colonias
en medios soacutelidos) Entre estas caracteriacutesticas estaacuten forma (circular irregular o
2829 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
22
rizada) tamantildeo (dimensiones estas normalmente se expresan en miliacutemetros)
topografiacutea (plano elevado convexo coacutencavo o embonado) presencia de
pigmentos opacidad (transparente traslucido u opaco) superficie (suave rugosa
lisa o aacutespero) bordes (entero ondulado crespo dentado rizado) o cualquier
cambio en el agar (color opacidad cambios en los indicadores de pH o CaCO3
respectivamente)30
Figura 4 Varias morfologiacuteas de crecimiento de colonias en medio solido
Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007
Gran nuacutemero de medios selectivos se han creado para la aislacioacuten deteccioacuten yo
conteo de levaduras provenientes de jugos de uva mostos o vinos El medio maacutes
utilizado en estos fines es YPD (Yeast Peptone Dextrose) pero dicho medio no
es selectivo entre levaduras y se usa comuacutenmente para el conteo de
Saccharomyces31 Las colonias empiezan a parecer con un periodo de incubacioacuten
30
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
31 Essia Ngang J Wolniewicz E Villa P2005 Stimulation of lactobacilli during alcoholic fermentation action
of sucrose hydrolysis by yeast Biotechnology letters No 8 pag 743 Amiens France
23
de 2 a 4 diacuteas a 22C a 25C Igualmente el agar de jugo de uva es no selectivo y
presenta faacutecil crecimiento de levaduras bacterias y mohos
Para la levadura Brettanomyces Dekkera se han elaborado diferentes medios
selectivos entre ellos el maacutes conocido es WL por sus siglas en ingles del
laboratorio que lo creo ldquoWallerstein Laboratoriesrdquo este medio contiene
cicloheximida compuesto selectivo para Brettanomyces e inhibe Saccharomyces
El punto criacutetico es encontrar la cantidad exacta de este compuesto para la
inhibicioacuten de las levaduras sin que afecte a BrettanomycesDekkera32
Ademaacutes del medio WL BrettanomycesDekkera puede ser cultivado en otros
medios selectivos como Brettanomyces medio A creado por Vilas en 1993
Brettanomyces medio B el cual contiene cicloeximida como agente selectivo
mientras que Brettanomyces medio C tiene cicloheximida y ampicilina este medio
fue creado por B Watson en 1998 Brettanomyces medio D fue creado
recientemente por Rodrigues en 2001 este medio es conocido como DBDM
(DekkeraBrettanomyces differential medium ) es un medio selectivo para
Brettanomyces en contra de Saccharomyces y otras levaduras este medio es el
maacutes utilizado en la vineras para caracterizacioacuten de BrettanomycesDekkera
actualmente33
15 Dioacutexido de azufre (SO2) en vinos
32
33
Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers
GmbH United States of America and Canada
24
El dioacutexido de azufre tambieacuten llamado oxido de azufre es un eficaz agente
conservante antioxidante y antimicrobiano en la industria viniacutecola34
Durante la vinificacioacuten SO2 ha representado histoacutericamente una herramienta muy
importante usada por los vinicultores para el control de crecimiento microbioloacutegico
Debido a preocupaciones por la salud del consumidor el uso de este producto ha
disminuido dramaacuteticamente con el posible riesgo de aumentar el riesgo
microbioloacutegico35
El actual liacutemite legal de SO2 en vinos en los Estados Unidos es de 350mgL una
concentracioacuten mucho mayor a la usada en la industria viniacutecola No obstante vinos
que contienen maacutes de 10mgL deben declarar este compuesto en la etiqueta
porque SO2 es un metabolito que las levaduras usan durante la fermentacioacuten Los
vinos siempre contienen algo de sulfitos aunque la adicioacuten no se realice durante el
proceso36
151 Formas del Dioacutexido de Azufre (SO2)
Una vez disuelto en agua el dioacutexido de azufre existe en equilibrio entre SO2
molecular (SO2H2O) bisulfito (HSO3) y sulfito (SO32-) Este equilibrio depende del
pH Ademaacutes de estar en equilibrio con el molecular y especies sulfito el bisulfito
tambieacuten existe en forma ldquolibrerdquo y en forma ldquoatadardquo Aquiacute la moleacutecula reaccionara
34
Orwine Eureka 2008Investigadores europeos buscan alternativas al dioxido de azufre en vinos
httpawprowordpresscom20081107investigadores-europeos-buscan-alternativas-al-dioxido-de-
azufre-en-el-vino
3536 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
25
con compuestos carbonilos (ej Acetaldehiacutedo) formando productos adicionales
como Acido Hydroxysulfonico 37
Ademaacutes de Acetaldehiacutedo algunas moleacuteculas presentes en el jugo de uva que
reaccionan con bisulfito son acido piruvico α-keto-glutaric dihidroxyacetona
diacetyl Pigmentos de antocianinas entre otros38
152 Inhibidor Microbiano
El sulfuro molecular es la forma antimicrobiana del dioacutexido de azufre La cantidad
de SO2 molecular presente en cualquier vino no se mide directamente La
concentracioacuten es calculada conociendo la concentracioacuten de SO2 libre y el pH del
vino basaacutendose en la siguiente foacutermula
Alternativamente la figura 5 Se puede utilizar como guiacutea para aproximar la
cantidad de SO2 libre necesitada a determinado valor de pH de valores entre 05 o
08 mgl de SO2 molecular 39
El SO2 inhibe microorganismos de varias formas incluyendo rupturas de puentes
bisulfitos en proteiacutenas y reaccionando con coofactores como NAD+ y FAD tambieacuten
reacciona con ATP
3739
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
38 Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi
Springer New York United States
26
Figura 5 Cantidades de SO2 libre a un pH determinado para obtener 05 o 08 mgl de SO2
molecular
Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007
La concentracioacuten de SO2 molecular necesario para prevenir el crecimiento de
microorganismos variacutea seguacuten vinojugo pH temperatura poblacioacuten densidad y
diversidad estado de crecimiento grado de alcohol entre otros factores Beech
1979 sugirioacute una adicioacuten de 08 mgl de SO2 molecular como la cantidad
necesaria del compuesto en vinos blancos de mesa para dar una reduccioacuten de
cerca de 104 UFCml de la poblacioacuten de diferente tipo de microorganismos en 24
horas Las diferencias que existen entre las levaduras y bacterias en base a la
27
sensibilidad a este compuesto son dadas a conocer por diferentes autores (Warth
1977 1985 Du Toit 2005 Davis 1988 Hood 1983)40
16 Antibrettreg como alternativa de prevencioacuten y eliminacioacuten de
BrettanomycesDekkera
Antibrettreg es un producto nuevo creado por Spindal SARL-Gretz - Armainvilliers
Francia Es una preparacioacuten enzimaacutetica para inactivar Brettanomyces y para
reducir olores producidos por fenoles volaacutetiles41
Antibrettreg es preparado a base de paredes celulares de levadura activados
enzimaacuteticamente que presentan elevadas propiedades adsorbentes frente al 4-
etilfeno y 4- etilguayacol compuestos asociados con olores desagradables en el
vino tales como sudor de caballo farmacia o barniz42
Antibrettreg inhibe la produccioacuten de la vinilreductasa que participa en la
transformacioacuten de los aacutecidos cinaacutemicos naturalmente presentes en los vinos en
los correspondientes derivados etilados responsables de los olores atribuidos a
BrettanomycesDekkera 43
40
Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi
Springer New York United States
41 Manual de instrucciones de producto Antibrett reg producido por Spindal SARL-Gretz -
Armainvilliers France
424344 AEB Group 2008 ANTIBRETT Preparado a base de paredes celulares de levadura para la inactivacioacuten
de Brettanomyces y la eliminacioacuten de los olores de estos productos httpwwwaeb-
groupcomimgsSPAGNOLODepliantANTIBRETT-lett-ESPpdf
28
El uso de Antibrettreg es efectivo incluso contra otros olores anoacutemalos como los
que se generan en las barricas sucias principalmente huacutemedas dantildeando la
calidad olfativa del vino44
29
2 PROBLEMA
La levadura BrettanomycesDekkera es una levadura de contaminacioacuten presente
en la mayoriacutea de industrias viniacutecolas en el mundo Afecta directamente la
produccioacuten y calidad sensorial de los vinos con el desarrollo de los compuestos 4
etilfenol y 4 etilguayacol los cuales dantildean el perfil olfativo del vino dando aromas
caracteriacutesticas a ldquoestablordquo ldquocuerordquo ldquosudor de caballordquo o ldquobarnizrdquo conocido como
ldquocaraacutecter Brettrdquo
Esta contaminacioacuten se da especialmente en los vinos tintos debido a sus
caracteriacutesticas de produccioacuten (fermentacioacuten crianza antildeejamiento) y sus
propiedades fisicoquiacutemicas (Grado alcohoacutelico pH Acidez total Acidez volaacutetil
entre otros)
En Croacia existe una gran produccioacuten de vinos tintos entre los cuales se
encuentra el vino tinto Babic proveniente de la isla de Hvar el cual es famoso por
ser un vino duro carnoso estructurado y casi sobre-maduro con un grado
alcohoacutelico que ronda los 15 vv siendo la primera denominacioacuten de origen que
se aproboacute en Croacia en el antildeo 1961 este vino es de gran importancia en la
regioacuten la mayoriacutea de sitios de elaboracioacuten son pequentildeas industrias que han sido
afectadas por el bdquocaraacutecter Brett‟ Muchas investigaciones se han realizado al
respecto de la levadura BrettanomycesDekkera pero se conoce muy poco sobre
sus efectos en el vino Babic debido a sus caracteriacutesticas particulares (alcohol
30
15 pH 35 Acidez total 520 gr Acido TartaricoL Acidez volaacutetil 08 gr Acido
AceticoL Azucar residual 47 grLt)45
La dificultad de la pequentildea industria para acceder a productos que lleven a la
identificacioacuten de la levadura mencionada y de esta manera conllevar a planes de
accioacuten contra el ldquocaraacutecter Brettrdquo es una de las grandes dificultades de la industria
vinera en este paiacutes en donde los productos para la industria enoacuteloga son
complicados y de alto precio para acceder a ellos y en consecuencia no se
realizan muchas de estas pruebas de deteccioacuten de BrettanomycesDekkera
llevando al mercado productos contaminados de baja calidad que inicialmente
podriacutea haber sido un vino de alta calidad debido a sus caracteriacutesticas uacutenicas y de
gran popularidad
45
Datos obtenidos en el laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
31
3 JUSTIFICACION
Actualmente Croacia cuenta con maacutes de 300 zonas vineras en las que se producen 67
de vino blanco 32 vino tinto y el restante 1 vino rosado De acuerdo a recientes datos
estadiacutesticos hay 650 km2 de vintildeedos en Croacia de los cuales 375 km2 son uvas con
indicacioacuten geograacutefica de origen que producen maacutes de 300 vinos y maacutes de la mitad de este
nuacutemero son vinos elaborados en microempresas con un total de 50000000 de botellas
de vino el 8 es vino superior 70 de calidad y el 22 es vino de mesa de produccioacuten
nacional46
Croacia es un fuerte productor de vino a nivel regional con sus diferentes variedades
propias (Merlot Plavac Dingač Postup Malvazija Pošip Kujundžuša Babic) pero dicha
produccioacuten ha sido fuertemente afectada por la presencia de la levadura
BrettanomycesDekkera trayendo consecuencias como perdidas de produccioacuten peacuterdida
de calidad sensorial del vino grandes peacuterdidas econoacutemicas y desprestigio a sus vinos de
denominacioacuten de origen
Es por esto que en este proyecto de investigacioacuten se busca una faacutecil y raacutepida
identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera causante del ldquocaraacutecter Brettrdquo con el
desarrollo de medios selectivos liquido y solido ademaacutes de opciones para el tratamiento
yo prevencioacuten de esta levadura en la cadena productiva comparativamente entre dioacutexido
de azufre (SO2 ) y Antibrettreg y la identificacioacuten de los aromas caracteriacutesticos del ldquocaraacutecter
Brettrdquo en el vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia
46
Hrvatski zavod za vinogradarstvo i vinasrtvo 2003 Pravilnik o vinu httpwwwhrzvvhrpropisihtm
32
4 OBJETIVOS
41 General
Caracterizar y evaluar el comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera
en teacuterminos de crecimiento y produccioacuten de aromas no deseados en vino tinto
Babic
42 Especiacuteficos
Desarrollar el medio solido y medio liacutequido selectivo para
BrettanomycesDekkera
Evaluar el comportamiento de la levadura en estos medios selectivos
Determinar la influencia del Dioacutexido de azufre (SO2) y el compuesto
Antibrettreg en la levadura BrettanomycesDekkera presente en vino tinto
Babic 2007
Identificar los compuestos aromaacuteticos producidos por Brettanomyces
bruxellensis en vino tinto Babic usando el meacutetodo ldquomultiple headspace
solid-phase microextraction (SPME)rdquo
33
5 ALCANCES
En este proyecto se pretende desarrollar un medio selectivo faacutecil de producir en
donde sea raacutepida la identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera en la
produccioacuten de vinos tintos se realizaran pruebas para corroborar el crecimiento de
esta levadura en el medio determinando el tiempo que esta levadura toma en
adaptarse en el medio y su comportamiento en este una vez comprobada su
adaptacioacuten al medio liquido se trabajara con el meacutetodo de cromatografiacutea de gas
(GC) y el uso de micro extraccioacuten en fase solida (SPME) para el anaacutelisis
cuantitativo de los compuestos volaacutetiles (4-etil-fenol 4-etil-guayacol4-vinilfenol y
4-vinil-guayacol) y posteriormente con el vino tinto Babic Ademaacutes se desea
comprobar la efectividad de los productos con que las vineras de Croacia inhiben
o eliminan la presencia de la levadura en los vinos tintos como lo son el producto
AntiBrettreg y el Dioacutexido de azufre (SO2)
34
6 ESTADO DEL ARTE
Sobre el campo problemico causado por la levadura BrettanomycesDekkera en la
industria viniacutecola se han realizado bastante investigaciones a nivel de
caracterizacioacuten de la levadura los factores fisicoquiacutemicos que favorecen el
crecimiento de la levadura meacutetodos de prevencioacuten y control evaluacioacuten de
dantildeos sensoriales en diferentes tipos de vinos formacioacuten de compuestos fenoacutelicos
en los diferentes tipos de vino otros compuestos no fenoacutelicos asociados al
ldquocaraacutecter Brettrdquo teacutecnicas de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera
evaluacioacuten de la teacutecnicas de control e inhibicioacuten de dicha levadura desarrollo de
nuevos medios de deteccioacuten y aislamiento de la levadura relacioacuten entre la
levadura BrettanomycesDekkera con las otras levaduras presentes en el vino
entre otros
Seguacuten estas investigaciones se analizan aquellas que pueden aportar datos
importantes para el desarrollo del trabajo que se quiere realizar y se tiene en
cuenta sus metodologiacuteas conclusiones recomendaciones y comentarios
Entre las importantes para el planteamiento de este trabajo se menciona el trabajo
realizado por la Universidad Politeacutecnica de Madrid Espantildea el cual analiza
algunas de las caracteriacutesticas maacutes relevantes de este geacutenero de levaduras su
crecimiento en bodega factores fisicoquiacutemicos que favorecen su crecimiento y
desarrollo en el vino los defectos sensoriales que presenta en los vinos y estudia
algunas de los meacutetodos fiacutesicos para el control de BrettanomycesDekkera en vino
35
(clarificacioacuten filtracioacuten amicrobica proteiacutenas clarificantes anhiacutedrido sulfuros
dimetil dicarbonato Aditivos)47
Para conocer maacutes sobre la levadura en condiciones de barrica y almacenamiento
se revisa el articulo elaborado en el Departamento Teacutecnico Guserbiot La rioja
Espantildea en este artiacuteculo se describe brevemente su metabolismo y su ecologiacutea en
las bodegas Igualmente se comparan las teacutecnicas utilizadas en los laboratorios
para su deteccioacuten y cuaacuteles son las limitaciones de los diferentes meacutetodos
Finalmente se analizan las estrategias desarrolladas para su eliminacioacuten de las
bodegas y se dan una serie de recomendaciones para su control48
El instituto de fermentaciones Industriales Consejo superior de investigaciones
cientiacuteficas Juan de Cierva Madrid Espantildea en el cual se revisa la formacioacuten de
etilfenoles (4 etil-fenol 4 etil guayacol) en vinos tintos anejos Los factores
fisicoquiacutemicos que favorecen el crecimiento de la levadura no deseada
BrettanomycesDekkera las teacutecnicas usadas para la detectar la presencia de esta
levadura en vinos ( Revisioacuten microscoacutepica fluorescente remocioacuten de aacutecidos
grasos de su membrana teacutecnicas moleculares como PCR y electroforesis) y de
control (Proteiacutenas fining Fining con gelatina liquida filtracioacuten variables
fisicoquiacutemicas adicioacuten de aditivos procedimientos de altas presiones
manipulacioacuten geneacutetica) con esta investigacioacuten se concluye que la combinacioacuten y el
uso de las numerosas teacutecnicas pueden ayudar a la prevencioacuten y reduccioacuten de la
levadura BrettanomycesDekkera 49 Este trabajo muestra las muacuteltiples opciones
47
A Morata S Benito F Palomero F Calderoacuten y J A Suaacuterez-Lepe Ecologiacutea y prevencioacuten de
BrettanomycesDekkera durante la elaboracioacuten y crianza de vinos tintos Revista enoacutelogos (Editada por la
Federacioacuten Espantildeola de Asociaciones de Enoacutelogos y Periodistas Asociados) No 50 paacuteg 1-12 Madrid Espantildea
48 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 20-
24 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
49 R Suarez JA Suarez-Lepe A Morata F Calderon 2006 The production of ethyl phenols in wine by yeasts
of the genera Brettanomyces and Dekkera A review Journal Food Chemistry No 102 pag 10-21 Madrid
Espantildea
36
existentes en el control y prevencioacuten de la levadura mencionada sin embargo deja
claro que la mayoriacutea de estas opciones son costosas y no de faacutecil adquisicioacuten para
una pequentildea industria
El anaacutelisis sensorial ha sido de los aspectos maacutes estudiados al respecto de
BrettanomycesDekkera una de estas investigaciones fue realizada en Centre
Europeacuteen des Sciences du Goucirct en Talence Francia en el cual se evaluaron 50
vinos bordeaux sensorialmente para demostrar la complejidad del ldquoCaraacutecter Brett‟‟
al cual se unen otros compuestos aromaacuteticos ademaacutes de los fenoacutelicos como acido
isobutirico e isovalerico en este tipo de vino debido a sus caracteriacutesticas
fisicoquiacutemicas50
De los meacutetodos de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera los medios
selectivos son muy populares es por esto que el Laboratorio de Microbiologiacutea
Departamento de Botanica e Engenharia Biologica Instituto Superior de
Agronomia Lisboa Portugal realizo un trabajo en el cual se pretendia desarrollar
un medio selectivo o diferencial capaz de aislar la levadura
BrettanomycesDekkera del vino y de la cadena productiva del vino con el fin de
detreminar la relacioacuten entre esta levadura y los compuestos 4-etilfenol y 4 etil-
guayacol51 otro estudio realizado para la deteccioacuten de dicha levadura fue
realizado en la Escola Superior de Biotecnologiacutea Universidade Catoacutelica
Portuguesa el desarrollo de un simple procedimiento compatible con las rutinas
50 Andrea Romano a Marie Claire Perello a Aline Lonvaud-Funel Gilles Sicard Gilles de Revel2008 Sensory
and analytical re-evaluation of lsquolsquoBrett characterrdquo Journal Food Chemestry No 114 pag 15-19 Talence
France
51 N Rodrigues G Gonccedilalves S Pereira-da-Silva M Malfeito-Ferreira and V Loureiro2001 Development
and use of a new medium to detect yeasts of the genera DekkeraBrettanomyces Journal of applied microbiology No 90 pag 588-599Lisboa Portugal
37
usadas en las vineras para la deteccioacuten de BrettanomycesDekkera en vino y en
maquinarias52
En el laboratorio de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas Alcohoacutelicas de la
Universidad de Zagreb se ha trabajado anteriormente en el desarrollo de medio
solido selectivo con pruebas de diferentes concentraciones de los compuestos
como resultados se encuentra una buen relacioacuten entre las concentraciones de los
compuestos sin embargo como recomendaciones se encuentran la falta de
antibioacutetico para evitar contaminacioacuten por bacterias probar con diferentes fuentes
de carbono para comparacioacuten de tiempo de crecimiento positivo y un monitoreo
diario en el medio53
Los compuestos aromaacuteticos que libera la presencia de BrettanomycesDekkera
estaacute asociada a los compuestos 4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinilfenol y 4
viniguayacol a partir de esto los centros de investigacioacuten han hondado en la
identificacioacuten de dichos compuestos relacionados en la enologiacutea y especialmente
con BrettanomycesDekkera a partir de eso el Departamento de Quiacutemica
Universidad de La Rioja Espantildea este estudio presenta un meacutetodo basado en el
uso de Cromatografiacutea de Gas y micro extraccioacuten en fase solida para el anaacutelisis
cuantitativo de 4-etilfenol 4-etil guayacol 4-vinilfenol 4-vinilguayacol
Demostrando la existencia de un efecto matriz en el anaacutelisis de compuestos
responsables del ldquocaraacutecter Brettrdquo en vino Este nuevo meacutetodo fue
satisfactoriamente aplicado a cierto nuacutemero de vinos tintos comerciales vinos
52
JA Couto A Barbosa and T Hogg 2005 A simple cultural method for the presumptive detection of the yeasts BrettanomycesDekkera in wines Letters in Applied Microbiology No 41 pag 505-510 Porto
Portugal
53 Serkovic Dubravka Gracin Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac
Brettanomyces bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet pag 1-117 ZagrebCroatia
38
blancos y roseacute Este meacutetodo puede ser una alternativa para evitar el efecto matriz
en muestras de vino54
De acuerdo con este tema en la jornada cientiacutefica del 99 el grupo de investigacioacuten
enoloacutegica se estudio la formacioacuten de sustancias volaacutetiles por 13 cepas de S
cerevisiae con buenas aptitudes enoloacutegicas inoculadas individualmente en un
mosto homogeacuteneo de la variedad airen fermentado en las mismas condiciones
de aireacioacuten y a temperatura controlada55
54
C Pizarro N Perez-del-Notario JM Gonzalez-Saiz 2007 Determination of Brett character responsible
compounds in wines by using multiple headspace solid-phase micro extraction Journal of Chromatography
No 1143 pag 176-181 La Rioja Espantildea
55 E Pueyo P Hidalgo K Fernaacutendez y P Martiacuten-Aacutelvarez 1999 Anaacutelisis de compuestos volaacutetiles en vinos
obtenidos con distintas cepas de Saccharomyces cerevisiae Aplicacioacuten de la teacutecnica de microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientificas 99 Grupos de Investigacion Enologica Zaragoza Espana
39
7 MATERIALES Y METODOS
A continuacioacuten se presentan materiales y meacutetodos para la investigacioacuten
Este proyecto fue realizado en su gran mayoriacutea en las instalaciones de la
Universidad de Zagreb en la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos
(PBF) Laboratorios del Departamento de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas
Alcohoacutelicas ubicado en la ciudad de Zagreb Croacia
Los anaacutelisis fisicoquiacutemicos del vino tinto Babic fueron realizados en los
laboratorios de VINOLAB ubicado en Zagreb Croacia
71 MEDIO SOLIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera
711 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Autoclave de laboratorio
Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa Etanol peptona extracto de levadura
agar cicloheximida acido cumaacuterico ampicilina)
Balanza electroacutenica de precisioacuten
Microscopio oacuteptico
712 Metodologiacutea
Basados en estudios anteriores realizados en el laboratorio para el desarrollo de
medio solido selectivo para BrettanomycesDekkera (Serkovic Dubravka Gracin
40
Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac Brettanomyces
bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet Universidad de Zagreb pag 1-
117 Zagreb Croacia) se evaluaron las recomendaciones mencionadas en dicha
investigacioacuten para la mejoriacutea y desarrollo de otros medios soacutelidos selectivos
Se usoacute como base el medio YPD (Yeast Peptone Dextrose) el cual estaacute
compuesto de la siguiente forma 20gL peptona 10 gl extracto de levadura 20 gl
de agar56 este medio es selectivo para levaduras pero no es selectivo entre ellas
Es necesario el uso de una fuente de carbono para la levadura
BrettanomycesDekkera de acuerdo a la teoriacutea y revisando la tabla 1 (Relacioacuten de
los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) y seguacuten
facilidades de disponibilidad en el laboratorio se utiliza glucosa la cual es
utilizable por entre 75-100 de las cepas de BrettanomycesDekkera seguacuten la
tabla mencionada anteriormente
Esta fuente de carbono (Glucosa) fue probada en una concentracioacuten de 20 gL
Cicloheximida fue probada a 30 mgL para inhibir Saccharomyces en el medio y
darle mayor selectividad para Brettanomyces Dekkera Se antildeade acido p-
cumarico en una concentracioacuten de 100 mgL como precursor para la formacioacuten
del compuesto 4 etilfenol caracteriacutestico de la levadura BrettanomycesDekkera
Para inhibir bacterias en el medio se usa ampicilina a 10 mgL esta se agrega
despueacutes de realizada la esterilizacioacuten y cuando la temperatura del medio este
igual o menor a 40C El pH del medio se ajusto a 5
Paralelamente se crea el medio con Etanol como fuente de carbono en una
concentracioacuten de 6 o 60 mlL con la misma concentracioacuten de los otros
compuesto como cicloheximida 30mgL acido cumarico 100mgL 20 gL peptona
10 gL de extracto de levadura 16gL de agar Este medio se crea como
56
Concentraciones preestablecidas en el laboratorio de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas alcoholicas
41
comparativo para determinar cual fuente de carbono es la maacutes utilizada por la
levadura Brettanomyces bruxellensis para su reproduccioacuten Seguacuten la teoriacutea (ver
tabla 1) el etanol es utilizado por entre 25-75 de las cepas de
BrettanomycesDekkera pero es el azuacutecar que se encuentra en mayor
concentracioacuten presente en los vinos tintos aproximadamente 130 gl57
Estos medios fueron debidamente esterilizados para eliminar cualquier
microorganismo o espora presente en este Este procedimiento se realizo por el
meacutetodo de combinacioacuten de altas temperatura y presioacuten (Autoclave 121 C a 1034
kPa)
Se usaron colonias de BrettanomycesDekkera aisladas anteriormente de vinos
contaminados y guardas para investigaciones en el Departamento de Tecnologiacutea y
Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos
Universidad de Zagreb Croacia
Los medios fueron monitoreados visualmente todos los diacuteas y se toman
observaciones de macroscoacutepicas y microscoacutepicas Se comparan estos dos medios
en teacuterminos de rapidez de crecimiento de la levadura y selectividad Estas
muestras fueron incubadas a 28C por 10 diacuteas
La prueba fue realizada por duplicado en diferentes tiempos
57
Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
42
72 MEDIO LIacuteQUIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera
721 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Frascos de vidrio esteacuteriles
Autoclave de laboratorio
Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa peptona extracto de levadura
cicloheximida acido cumarico ampicilina etanol)
Microscopio oacuteptico
Balanza electroacutenica de precisioacuten
722 Metodologiacutea
En el mercado para enologiacutea existen medio liacutequidos selectivos para la deteccioacuten
de BrettanomycesDekkera en vinos sin embargo estos son de difiacutecil accesibilidad
por sus elevados precios es por esto que se desarrolla un medio liquido selectivo
para dicha levadura en el laboratorio del Departmaneto de Tecnologiacutea y Anaacutelisis
de Bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia
Para este medio se toma como base el medio selectivo con Glucosa como fuente
carbono desarrollado anteriormente sin usar agar para mantener el medio en su
estado liquido
43
La composicioacuten de este medio liacutequido es la siguiente
20 gL Glucosa
20 gL peptona
10gL extracto de levadura
30mgL de cicloheximida
100mgL acido p-cumarico
10 mgL ampicilina
Estos compuestos fueron medidos en una balanza electroacutenica de precisioacuten se
antildeade 250 ml de agua destilada y se mezcla constantemente se pasa a proceso
de esterilizacioacuten en autoclave a 120C y 1034 KPa por 45 minutos
De esta forma se asegura la usencia de microorganismos yo esporas en el
medio Despueacutes de bajar la Temperatura a 40C se agrega a la mezcla ampicilina
en una concentracioacuten de 10mgL
En frascos de vidrio esteacuteril se agrega 40 ml de medio liacutequido y diferentes
cantidades iniciales de levaduras BrettanomycesDekkera fueron inoculadas al
respectivo medio el primer frasco tiene una cantidad de 106 ceacutelulasml el segundo
tiene 104 ceacutelulasml el tercero tiene 102 celulasml y el cuarto con una cantidad
aproximada de 25 ceacutelulasml Estas cantidades estaacuten basadas en estudios
anteriores para medios liacutequidos selectivos en levaduras58
58 J Ungar A M James P W Muggleton H F Pegler y E G Tomich1950 The Cultivation of
Haemophilus pertussis in Partially Defined Liquid Media Journal of General Microbiology No 4
pag 345-359 Greenford
44
Este medio liacutequido inoculado fue inspeccionado diariamente visualmente revisioacuten
de turbidez microscoacutepicamente y olfativamente para deteccioacuten de olores del
ldquocaraacutecter Brettrdquo
Los diacuteas fueron contabilizados para determinar resultados positivos en estos
ensayos
73 INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN
VINO TINTO DE LA REGION DE DALMACIA CROACIA
731 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Medio selectivo solido para BretanomycesDekkera
Medio selectivo Liquido para BrettanomycesDekkera
Quiacutemicos de laboratorio (Dioxido de Azufre (SO2) Antibrettreg Glucosa)
Vino Babic 2007
Anallizador infrarojo Bacchius II microdom
732 Metodologiacutea
Con los medios desarrollados (solido y liquido) se quiere conocer el efecto del
dioacutexido de azufre (SO2) y el producto Antibrettreg en la levadura
BrettanomycesDekkera presente en el vino tinto de la regioacuten de Dalmacia
Con las herramientas que se tienen en el laboratorio del departamento de
tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia se quiere
determinar la influencia de estos productos en la levadura BrettanomycesDekkera
presente en vino tinto croata de la regioacuten de Dalmacia Babic
45
El primer paso es adaptar la levadura al vino tinto croata (Babic) para esto se
inoculan 20 colonias de BrettanomycesDekkera en 500 ml de vino se antildeadioacute
glucosa en una concentracioacuten de 2gL y se oxigena la mezcla Para este paso de
adaptacioacuten se dejan las muestras de 1 a 2 diacuteas a temperatura ambiente (20C)
Despueacutes de este periodo se revisa microscoacutepicamente la presencia positiva de
BrettanomycesDekkera en los 500 ml de vino en los que se estaba haciendo el
paso de adaptacioacuten en Babic al comprobar su presencia positiva se procede a
mezclar los 500 ml de vino contaminado con BrettanomycesDekkera con los 3
Litros de vino Babic que se disponen para esta prueba
Estos 3 litros de vino tinto Babic contaminado con la levadura
BrettanomycesDekkera se reparten en 8 frascos de vidrios esteacuteriles al siguiente
diacutea se toman dos frascos para agregar cada uno de los compuestos a evaluar
(SO2 y Antibrettreg)
Para SO2 se toman dos frascos uno de 600ml y uno de 100ml se agrega una
concentracioacuten de 40 mgl
Para el producto AntiBrettreg se toman cuatro frascos dos de 600 ml y dos de 100
ml seguacuten especificaciones del producto y la alta poblacioacuten de
BrettanomycesDekkera en las muestras se adiciono la maacutexima concentracioacuten de
AntiBrettreg a las muestras la cual fue de 40 gHl
Estas muestras se dejaron a temperatura ambiente simulando condiciones de
almacenamiento del vino en barricas temperatura aproximada de 20C evitando el
contacto con la luz solar y evitando movimientos fuertes Esto se mantuvo por 15
diacuteas que fue el tiempo de duracioacuten del experimento
Con el vino restante se mantuvo en las mismas condiciones de almacenamiento
de los demaacutes para hacer un paralelo de comparacioacuten
Previamente se analizaron las caracteriacutesticas del vino sin contaminar por medio
del analizador infrarrojo Bacchus II microdom antes de agregar los compuestos
46
SO2 y AntiBrettreg y despueacutes se volvioacute a realizar el anaacutelisis para determinar los
efectos de estos compuestos en el vino y asiacute mismo al de control
74 DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN
EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO
MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE
741 Materiales
Cromatografo de Gas HP5890 Serie II
Microextractor de fase solida (SPME)
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Quiacutemicos de laboratorio (p-cresolAcetaldehido Propanol diacetil etil-
acetato i-butanol acido aceacutetico i-amil-alcohol n-amil lactato de etilo
acetato amil metiacutelico 1-hexanol etil-hexanol linalol nerol citronelol
geraniol 2-feniletanol octanoato de etilo 4-etilfenol 2-feniletil acetato 4-
etilguaiacol)
Vino Tinto Babic
Agua destilada
742 Metodologiacutea
El meacutetodo fue desarrollado anteriormente en el Departamento de Tecnologiacutea y
Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos de
la Universidad de Zagreb Croacia Y despueacutes de modificaciones fue utilizado en el
desarrollo del trabajo El meacutetodo utilizado es descrito a continuacioacuten
47
Cromatografo de gas HP 5890 SERIES II
Programa HP-chem
a) Condiciones para analisis SPME-GC
Muestra diluida 5050 con adicion de estandar interno (p-cresol1mgl)
25ml de la muestra diluida con mezcla continua a temperatura ambiente
Tiempo de adsorcion 30 minutos
SPME es colocado en la muestra para la adsorcion durante el tiempo
previsto
b) Condiciones para el Cromatografo de gas (GC)
La columna usada en este experimento es RTXreg-5 (Restec USA sn 210627)
30m id=025mm 025μm
Gas portador Nitrogeno
Flujo del Nitrogeno 5 mlmin
Temperatura del inyector 240 C
Temperatura del detector 250 C
Temperaturas programadas 35 C5 min 150 C 34 Cmin 180 C
10Cmin 190 C 5 Cmin
Se conocen los resultados del cromatografiacutea de gases (ver tabla 10) y se hacen
necesarias varias correcciones del meacutetodo y algunas pruebas con unos
compuestos para determinar realmente su tiempo de retencioacuten en este tipo de
vino Se deben comprobar tiempos de retencioacuten
48
8 DISCUSIOacuteN Y RESULTADOS
81 RESULTADOS PARA EL DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO
Tabla 2 Medio Selectivo con Glucosa como fuente de carbono para
BrettanomycesDekkera en incubacioacuten por 5 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten
microscoacutepica
1 Negativo Negativo - No se realiza
2 Negativo Negativo - Presencia de levaduras
3 Negativo Negativo - Presencia de
Levaduras
4 Aparicioacuten de
algunas colonias
Negativo Transparente Presencia de levaduras
5 Colonias definidas Positivo-
Fenoles
Amarillo Presencia positiva de
BrettanomycesDekkera
49
Este medio tiene alto grado de selectividad para levaduras con un tiempo de
crecimiento de aproximadamente 5 diacuteas en 28C lo que lo hace raacutepido gracias al
antibioacutetico (ampicilina) que hace parte de la composicioacuten del medio no hay
presencia de bacterias Se hace confiable para resultados positivos de levaduras
BrettanomycesDekkera debido a que las levaduras Saccharomyces fueron
inhibidas con el compuesto cicloheximida su selectividad fue comprobada por
revisioacuten microscoacutepica macroscoacutepica y sensorial
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con glucosa como fuente de carboacuten son las
siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
50
Tabla 3 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono para Brettanomyces Dekkera en
incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica
1 Ninguno Negativo - -
2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras y
bacterias
9 Diminutas
colonias
transparentes
Negativo Transparentes Presencia de levaduras y
algunas bacterias
10 Positivo Positivo-
Fenoacutelicos
Amarillo Presencia de levaduras
BrettanomycesDekkera y
bacterias
El medio selectivo para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de
carbono tambieacuten es selectiva entre levaduras ya que solo se identifico la levadura
BrettanomycesDekkera en este sin embargo se evidencia una presencia de otro
microorganismo presuntamente bacteria ya que este medio no contiene agente
antibacteriano (ampicilina) Es necesaria la adicioacuten de ampicilina en una
concentracioacuten de 10mgl para inhibir la presencia de bacterias
Este medio presenta un tiempo maacutes prolongado para mostrar crecimiento de la
levadura BrettanomycesDekkera aproximadamente 10 diacuteas
51
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las
presentadas en el medio selectivo con glucosa como fuente de carbono y son las
siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
52
Tabla 4 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono y adicioacuten de ampicilina para
Brettanomyces Dekkera en incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica
1 Ninguno Negativo - -
2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
9 Diminutas
colonias
transparentes
Negativo Transparentes Presencia de levaduras
10 Positivo Positivo-
Fenoacutelicos
Amarillo Presencia de levaduras
BrettanomycesDekkera
El efecto de la ampicilina sobre el medio selectivo con etanol como fuente de
carbono fue el esperado inhibioacute completamente el crecimiento de colonias
bacterianas en el medio el tiempo de crecimiento de la levadura y presencia de
aromas fenoacutelicos fue el mismo de 10 diacuteas en incubacioacuten de 28C
53
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las
presentadas anteriormente y son las siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
82 RESULTADOS PRUEBAS MEDIO LIQUIDO
Tabla 5 Influencia de la concentracioacuten de levaduras BrettanomycesDekkera en el
tiempo necesario para detectar la produccioacuten de 4-etil-fenol en medio liquido
Nuacutemero de ceacutelulas ml
(concentracioacuten final)
Tiempo necesario para obtener resultados
positivos (diacuteas)
1 Experimento
32x106 le 3
3 X 104 3
33x102 7
40 No detectado
2 Experimento
43x106 le3
39x104 le3
37x102 8
62 No detectado
54
El nuacutemero de ceacutelulas de levadura de BrettanomycesDekkera fue contabilizado
usando contador de ceacutelulas Chamber
Los aromas fenoacutelicos son difiacuteciles de detectar debido al fuerte olor que tiene el
medio liquido caracteriacutestico de sus componentes esto dificulta la identificacioacuten del
ldquocaraacutecter Brettrdquo en especial cuando las concentraciones de
BrettanomycesDekkera no son elevadas Ademaacutes de los olores fenoacutelicos otros
compuestos volaacutetiles se detectan tales como acido aceacutetico y olores oxidativos
tambieacuten producido por la levadura BrettanomycesDekkera
En la inspeccioacuten visual se detecta alta turbidez en el medio Se compara con un
medio sin presencia de BrettanomycesDekkera
En las muestras con mayor concentracioacuten de la levadura es maacutes notoria la
turbidez Despueacutes de 3 diacuteas se presenta un precipitado blanco en todas las
muestras de altas concentraciones
La revisioacuten microbioloacutegica se realiza diariamente para determinar el nuacutemero de
ceacutelulas y la presencia positiva de la levadura a evaluar
Entre los dos experimentos realizados con el medio liquido el tiempo que se
demoro en detectar compuestos fenoacutelicos fue muy similar entre ellos
dependiendo del nuacutemero de ceacutelulas en el medio en mayores concentraciones el
tiempo de deteccioacuten fue menor
Hay que sentildealar que BrettanomycesDekkera debe alcanzar una concentracioacuten
miacutenima (denominada poblacioacuten criacutetica) de 103 UFCml para comenzar a liberar etil
fenoles Por debajo de esta concentracioacuten la levadura seriacutea metaboacutelicamente
activa pero no produciraacute compuestos alterantes a niveles detectables esto se ve
reflejado en los resultados en los que las concentraciones de ceacutelulas son muy
bajas
55
Estos resultados se comparan con los resultados dados en el medio solido Los
dos medios muestran altos grados de selectividad hacia la levadura
BrettanomycesDekkera y similar comportamiento para el crecimiento de dicha
levadura
En el medio liacutequido cuando hay altas concentraciones de BrettanomycesDekkera
el tiempo de deteccioacuten del microorganismo es menor que con el medio solido pues
en el liacutequido es aproximadamente 3 diacuteas y en el soacutelido son 5 diacuteas
83 RESULTADOS DE LA INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE
(SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO DE LA REGION DE
DALMACIA CROACIA
El vino fue analizado antes de la adicioacuten de los compuestos quiacutemicos a evaluar y
15 diacuteas despueacutes de adicioacuten para ver la reaccioacuten de este frente a SO2 y Antibrettreg
estas caracteriacutesticas se determinaron con el equipo de laboratorio Bacchus II
Microdom localizado en el laboratorio Vinolab doo Zagreb Croacia Los
resultados se muestran en la tabla
Tabla 6 Resultados de las muestras de vino inoculados con la levadura BrettanomycesDekkera
durante 15 diacuteas Comparativos con los diferentes compuestos
CFUml
Vino Day 1 Day 4 Day 10 Day 15
Control 130E+04 800E+03 700E+03 500E+03
Control 800E+03 640E+03 700E+03 280E+03
SO2 110E+04 400E+02 400E+02 67
SO2 900E+03 380E+03 270E+03 183
Antibrett 140E+05 920E+04 140E+04 400E+03
Antibrett 210E+05 181E+05 160E+04 900E+03
Antibrett 120E+05 990E+04 120E+04 100E+03
Antibrett 230E+05 204E+05 300E+03 200E+03
56
Tabla 7 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 antes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o
Antibrettreg Diacutea 0
Alcohol
()
Acidez Total
(gr Aci
Tartaacuterico L)
Acidez volaacutetil
(Aci
AceacuteticoL)
Densidad
(grml)
Azuacutecar residual
(grl)
Extracto
seco
(grl)
Acido
Laacutectico
(grl)
Glicerol
(grl)
Taninos
(grl)
Acetato
(grl)
1473
525
083
09928
473
332
164
799
305
117
1471
522
084
09927
479
329
162
786
299
116
Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
Tabla 8 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 despueacutes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o
Antibrettreg Diacutea 15
Alcohol
()
Acidez Total
(gr Aci
Tartaacuterico L)
Acidez volaacutetil
(Aci
AceacuteticoL)
Densidad
(grml)
Azuacutecar residual
(grl)
Extrac
to seco
(grl)
Acido
Laacutectico
(grl)
Glicerol
(grl)
Taninos
(grl)
Acetatos
(grl)
Control
1414
565
107
09935
436
364
177
827
259
136
Control
1415
556
108
09936
420
365
170
824
256
137
SO2
1456 543 108 09932 476 369 167 803 281 125
SO2
1457
542 108 09933 472 370 170 804 271 124
Antibrett 1454 533 106 09933 448 371 175 813 277 125
Antibrett 1455 534 105 09933 460 372 171 809 282 124
Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
57
Figura 4 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en el vino de control para
evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas
El comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en la prueba por
duplicado en el vino de control fue muy similar pues con el tiempo esta levadura
deja de reproducirse y va muriendo cuando las condiciones ya no son aptas para
su desarrollo debido a que la mayoriacutea de su fuente de carbono (Glucosa) esta
consumida sin embargo esta levadura no llega a su desaparicioacuten total lo que
representa uno de los mayores problemas en la elaboracioacuten del vino
Esta levadura tiene un metabolismo lento y el factor tiempo es un requisito
fundamental para su desarrollo este experimento se empezoacute con una alta
poblacioacuten de BrettanomycesDekkera (130 x 104 UFCml y 8 x 103 UFCml
respectivamente) y durante el transcurso del tiempo la poblacioacuten fue disminuyendo
debido a la perdida de las condiciones necesarias para la reproduccioacuten
58
Figura 5 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de SO2 en
concentracioacuten de 40 mgl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas
El SO2 tuvo un comportamiento efectivo y raacutepido contra las colonias de
BrettanomycesDekkera La poblacioacuten de esta levadura se redujo de forma
significativa entre el diacutea primero y el cuarto se encontroacute una diferencia porcentual
de 96 en la primera prueba y del 60 en la de duplicado al diacutea 15 ya la
poblacioacuten era casi nula pasando raacutepidamente de un numero por encima de la
poblacioacuten critica de la levadura BrettanomycesDekkera a un numero lt103 UFCml
siendo muy eficaz y raacutepido en el manejo de produccioacuten
Este compuesto ademaacutes de favorecer la extraccioacuten de los compuestos fenoacutelicos y
de su actividad antioxidante al inhibir la accioacuten de las polifenoloxidasas a dosis
adecuadas de un maacuteximo de 50gl inhibe la multiplicacioacuten bacteriana y de
levaduras
59
Figura 6 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de
Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo
de 15 diacuteas
Figura 7 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de
Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo
de 15 diacuteas
El compuesto Antibrettreg en la primera prueba tanto como en el duplicado tuvo su
mayor tiempo de reduccioacuten de UFCml entre los diacuteas 4-10 con una diferencia
porcentual de 91 en comparacioacuten con el diacutea cuarto al decimo a diferencia de
60
SO2 el cual presenta la gran disminucioacuten de colonias entre los primeros diacuteas de
agregarse el producto
El tiempo para que la poblacioacuten de la levadura llegara a la cantidad menor a la de
la poblacioacuten critica es mucho mayor que la del compuesto SO2 sabiendo que esta
poblacioacuten debe ser lt103 UFCml
El compuesto Antibrettreg puede tardarse 4-10 diacuteas en representar una reduccioacuten
de UFCml significativa en dicho tiempo puede representar grandes peacuterdidas
nutricionales y altos costos de produccioacuten para la fabricacioacuten
Figura 8 Comportamiento del contenido de alcohol en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin adicioacuten)
hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
BrettanomycesDekkera estaacute presente en vinos de alto contenido alcohoacutelico
aproximadamente entre 125 a 14 pues esta levadura toma a etanol como
fuente de carbono y este vino (Babic) procede de uvas muy maduras las cuales
presentan mayor cantidad de azuacutecares residuales (como glucosa y fructosa y
otras pentosas residuales)
138
14
142
144
146
148
Alcohol
Day 0 Day 15
61
Analizando el comportamiento del vino durante el experimento de 15 diacuteas sin
compuestos quiacutemicos y con SO2 y Antibrettreg a partir de las caracteriacutesticas
iniacuteciales que se determinaron seguacuten el equipo BACCHUS analizador infrarrojo se
presenta en general una reduccioacuten del contenido alcohoacutelico de este vino pero se
ve una mayor reduccioacuten en el vino de control el cual redujo en un 394 su
contenido alcohoacutelico desde el dia 0 hasta el diacutea 15 este vino no tiene ninguacuten
compuesto contra la levadura BrettanomycesDekkera y por su elevada presencia
en los 15 diacuteas de experimento consumioacute esta cantidad de etanol
Mientras en el vino que conteniacutea SO2 tras 15 diacuteas de tratamiento se vio una
reduccioacuten de alcohol de 1 ya que este compuesto redujo la cantidad de
BrettanomycesDekkera en los primeros diacuteas de tratamiento previniendo su
reproduccioacuten y protegiendo el contenido alcohoacutelico del vino Babic 2007
En los vinos de prueba con Antibrett reg la reduccioacuten alcohoacutelica se dio en un
porcentaje de 122 un poco maacutes alta que con SO2 y mucho maacutes baja en
comparacioacuten del vino de control este compuesto tambieacuten previno la gemacioacuten de
la levadura evitando la perdida de etanol en el vino sin embargo como este
compuesto duro mas en este proceso de eliminar BrettanomycesDekkera se
produjo una mayor peacuterdida alcohoacutelica
62
Figura 9 Comportamiento del contenido de acidez volatil en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin
adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
Debido a la presencia de oxigeno en los frascos la acidez volaacutetil aumento pero no
significativamente en las muestras No hubo grandes diferencias entre las
muestras con compuestos y las de control por lo que se deduce que estos
compuestos no ayudan a evitar esta acidez Esta acidez tan alta puede dantildear la
calidad del vino de forma casi irreparable Pero el factor oxigeno es de los maacutes
controlados en la produccioacuten de vinos
la alteracioacuten del aumento de la acidez volaacutetil no estaacute relacionada con la levadura
BrettanomycesDekkera sino a la presencia de oxigeno en el almacenamiento el
oxigeno fue usado en esta prueba para promover condiciones apropiadas para el
desarrollo de la levadura
002040608
112
Acidez Volatil
Day 0 Day 15
63
Figura 10 Comportamiento del contenido de Acido Acetico en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin
adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
Brettanomyces Dekkera son productores de aacutecido aceacutetico y elevan el contenido
de los vinos anormalmente en condiciones de anaerobiosis En condiciones de
aerobiosis producen concentraciones bajas o nulas de aacutecido aceacutetico
Este acido aceacutetico al igual que los fenoles afecta el sabor y el perfil olfativo del
vino tinto este efecto es tambieacuten producido por la levadura
BrettanomycesDekkera vemos en los resultados el gran crecimiento de este
compuesto en el vino control el cual no tenia compouestos en contra de
BrettanomycesDekkera lo que produjo este aumento significativo del acido aceacutetico
en comparacioacuten con estos que teniacutean SO2 y Antibrettreg entre ellos la diferencia en
este compuesto es muy reducida y no significativa pues estos compuestos no
permitieron la gemacioacuten de esta levadura y esta no produjo este acido en esa gran
cantidad
A este compuesto se le atribuye el olor y sabor a vinagre del vino tinto un defecto
muy comuacuten y poco agradable para el consumidor
105110115120125130135140
Acido Acetico
Day 0 Day 15
64
Figura 11 Comportamiento del contenido de Azucares reductores en vino Babic 2007
desde el diacutea 0 (sin adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en
comparacioacuten con el vino de control
BrettanomyesDekkera utiliza los azucares residuales como fuente de carbono
para su crecimiento en el vino este es el factor maacutes importante para su desarrollo
y este es el que determina en cierto caso la cantidad de levaduras de
BretanomycesDekkera presente en las graficas se determina claramente que en
el vino de control donde la cantidad de esta levadura es muy alta 15 diacuteas despueacutes
de empezar las pruebas la cantidad de azucares reductores es muy baja y ha
bajado en un porcentaje de 10 mientras que el vino que tiene SO2 bajo la
cantidad de azucares reductores en un 042 y el vino que tiene el compuesto
Antibrettreg redujo su nivel de azucares reductores en 462
38
4
42
44
46
48
5
Azucares Reductores
Day 0 Day 15
65
84 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE
CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON
EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID
PHASE
Tabla 10 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en
vino Babic 2007 con el meacutetodo propuesto
Compuesto Tiempos de
retencioacuten (min)
Acetaldehiacutedo 1437
Propanol 3759
Diacetil 4202
Etil-acetato 4523
i-butanol 6232
Acido Aceacutetico 7840
i-amil alcohol 11740
n-amil 13489
lactato de etiacutelico 15741
acetato amil metiacutelico 17796
1-hexanol 19101
etil-hexanol 24456
Linalol 30370
2-feniletanol 32768
p-cresol 33522
octanoato de etilo 34226
4-etilfenol 37100
2-feniletil acetato 32769
4-etilguayacol 39704
4 vinilfenol 40529
decanoato de etilo 42117
Refirieacutendose a estos resultados es necesaria la creacioacuten de soluciones estaacutendar
para determinar tiempos de retencioacuten con el meacutetodo y si es necesario ajustes a
este
66
Tabla 11 Soluciones estaacutendar para compuestos en vinos tintos Croatas
MODEL 0
(en volumen de 100 ml en 40 Etanol)
Compuesto Pureza Cantidad
(g)
Concentracioacuten (gl)
Acetaldehiacutedo 099 1623 160677
Propanol 0995 13849 137718
Diacetil 098 01071 104958
Etil-acetato 0995 30172 3002114
i-butanol 099 15016 1486584
Acido Acetico 0995 0 0
i-amil alcohol 099 20116 1991484
n-amil 098 15442 1513316
lactato de etilio 098 00507 049686
acetato amil metilico 098 01028 100744
1-hexanol 098 00367 035966
etil-hexanol 098 00308 029876
Linalol 097 00288 027936
Nerol 097 00311 030478
Citronelol 098 0031 03038
Geraniol 098 15803 1548694
2-feniletanol 098 00402 039396
4-etilfenol 098 00812 078764
octanoato de etilo 097 00597 059103
2-feniletil acetato 099 00315 031185
4-etilguayacol 098 00803 079674
Fuente Laboratorio de anaacutelisis e investigacioacuten de bebidas Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea
de Alimentos Universidad de Zagreb Zagreb Croacia 2009
Las soluciones estaacutendar se realizan teniendo como referencia las cantidades de
estos compuestos en los vinos tintos croatas datos suministrados por el Doctor
Leo Gracin en concentraciones de gl a partir de este dato y teniendo en cuenta
67
la pureza de los compuestos que se teniacutean en el laboratorio de anaacutelisis e
investigacioacuten de bebidas se crean las soluciones estaacutendar Ejemplo
Solucioacuten estaacutendar para 4 etil-fenol en un volumen de 100 ml
Con estas soluciones estaacutendar se realizo el tiempo de retencioacuten para corroborar el
meacutetodo Los resultados de esto fueron tiempos de retencioacuten diferentes a los del
meacutetodo primero con el que se realizaron los ensayos y a partir de esos resultados
se ajusto el meacutetodo con el que se trabajo
68
Tabla 12 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en
vino Babic 2007 con el meacutetodo modificado
Compuesto Tiempos de
retencioacuten (min)
Acetaldehiacutedo 1542
Propanol 4046
Diacetil 4733
Etil-acetato 4807
i-butanol 6659
Acido Acetico 8343
i-amil alcohol 12123
n-amil 13866
lactato de etilio 16072
acetato amil metilico 18336
1-hexanol 19447
etil-hexanol 24835
Linalol 31831
2-feniletanol 33305
p-cresol 33703
octanoato de etilo 34571
4-etilfenol 37724
Citronelol 38326
Nerol 38576
2-feniletil acetato 39012
Geraniol 39944
4-etilguayacol 40271
4 vilifenol 41168
decanoato de etilo 42657
69
DIA 0
Se coloca ISTD a todas las muestras respectivas para poder determinar
cantidades de los compuestos aromaacuteticos
Se realiza la cromatografiacutea de gas al vino Babic 2007 antes de ser inoculado con
BrettanomycesDekkera
Tabla 13 Resultados de la cromatografiacutea de gas del vino Babic 2007
Compuesto Tiempo de retencioacuten
min
Cantidad
mgl
Acetaldehiacutedo 1542 0
Propanol 4046 0
Diacetil 4733 37215204
Etil-acetato 4807 0
i-butanol 6659 0
Acido Aceacutetico 8343 2817465
i-amil alcohol 12123 16799019
n-amil 13866 26
lactato de etiacutelico 16072 10983961
acetato amil metiacutelico 18336 0185196
1-hexanol 19447 264655
etil-hexanol 24835 0158751
Linalol 31831 0
2-feniletanol 33305 4235560
p-cresol 33703 1
octanoato de etilo 34571 0152412
4-etilfenol 37724 00581345
Citronelol 38326 00439729
Nerol 38576 00344799
2-feniletil acetato 39012 00407983
Geraniol 39944 0
4-etilguayacol 40271 0
4 vilifenol 41168 0
Decanoato de etilo 42657 00190144
70
Basados en los compuestos aromaacuteticos que brinda el ldquoCaraacutecter Brettrdquo se van a
analizar detalladamente los siguientes aromas 4-Etilfenol 4-Etilguayacol 4-
Vinylfenol
Figura 12 Compuestos aromaticos en vino tinto Babic sin estar contaminado con la levadura
BrettanomycesDekkera
El vino a analizar esta por debajo de las concentraciones consideradas como
perjudiciales para el aroma del vino tinto (El umbral sensorial del 4-etilfenol es de
230 μgl y el del 4-etilguaiacol es de 47 μgl) pues posee una concentracion de
58microgL de 4etilfenol 0 microgL de 4 etilguayacol y 0 microgL de vinylfenol
841 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGUacuteN TEMPERATURAS
DE ALMACENAMIENTO
0
02
4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinylfenol
Vino 00581345 0 0
C (
mg
L)
Vino Babic 2007 Dia 0
71
Tabla 14 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el
ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 20C por 4 diacuteas Prueba por duplicado
MUESTRAS INCUBADA A 20C
Compuesto Day 1
Amount
(mgL)
Day 2
Amount
(mgL)
Day 3
Amount
(mgL)
Day 4
Amount
(mgL)
4-etilfenol 0260244 017294 0177547 020156
4-etilfenol 0260244 0245915 0204542 0262499
4-etilguayacol 0 0 0 0
4-etilguayacol 0 0 0 0
4 vinilifenol 1107096 781349 685317 460323
4 vinilifenol 1107096 1297465 621324 693225
72
Figura 13 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
BrettanomycesDekkera es la levadura responsable de la produccion de 4-etil-
fenol compuesto asociado con olores caracteristicos a ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 00581345 0260244 0172935 0177547 020156
C (
mg
L)
4 etilfenol
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 00581345 0260244 0245915 0204542 0262499
C (
mg
L)
4 etilfenol
73
caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo dantildeando la calidad sensorial del vino tinto Babic la
produccioacuten de este compuesto en esta muestra realizada por duplicado fue
ascendente y tuvo incremento muy grande en el primer dia de almacenamiento y
en el transcurso de los siguientes cuatro diacuteas se mantuvo relativamente estable lo
cual no concuerda con el comportamiento tiacutepico de esta levadura quien tiene un
crecimiento lento e incrementa la produccioacuten de fenoles con su gemacioacuten esto
genera muchas dudas sobre el buen funcionamiento del equipo GC o de la
estabilidad de las levaduras BrettanomycesDekkera en este almacenamiento
Figura 14 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar prueba por duplicado
002040608
1
Vino Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0 0 0
4 etilguayacol
002040608
1
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0 0 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
74
Presencia negativa de 4 etil guayacol durante todo el almacenamiento
probablemente las condiciones de almacenamiento y el medio no dieron lugar al
desarrollo de este compuesto el cual se considera menos conflictivo que el 4-etil-
fenol
Figura 15 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
Estos resultados tambieacuten dejan dudas del normal comportamiento de dicha
levadura pues indican que la levadura no convirtioacute este compuesto en etilfenol
0
2
4
6
8
10
12
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 110709781349685317460323
4 vinylfenol
0
2
4
6
8
10
12
14
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
Series1 0 11071 12974 62132 69322
C (
mg
l)
4 Vinylfenol
75
durante el almacenamiento caracteriacutestica que solo la levadura
BrettanomycesDekkera puede realizar se ve que las concentraciones de
vinylfenoles son mucho mas altas que las de fenoles lo que nos deja determinar
que la poblacioacuten de BrettanomycesDekkera es muy baja y existen otras levaduras
productoras de vinylfenoles en este tipo de vino en las condiciones de
almacenamiento dadas para estas pruebas
Tabla 16 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el
ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 28C por 4 diacuteas
MUESTRA 2 INCUBADA A 28C
Compuesto Day 1
Amount
(mgL)
Day 2
Amount
(mgL)
Day 3
Amount
(mgL)
Day 4
Amount
(mgL)
4-etilfenol 0260244 019612 0186614 019932
4-etilfenol 0260244 020576 0214917 0193554
4-etilguayacol 0 014304 0223836 0
4-etilguayacol 0 002287 00529832 0
4 vinilifenol 1107096 787068 665182 397847
4 vinilifenol 1107096 284389 00204392 0
76
Figura 16 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar
El desarrollo de este compuesto en el diacutea 1 fue significativo y luego relativamente
estable el comportamiento fue similar en las pruebas de diferentes temperaturas
de almacenamiento para este compuesto el cual es el maacutes problemaacutetico en la
industria viniacutecola
0
005
01
015
02
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 005813019932018661019611019932
4 etilfenol
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 005813 019355 021491 020576 026024
4 etilfenol
77
Figura 17 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar
Los resultados de la prueba son poco confiables y no entendibles por lo que
podemos verificar que el GC no estaacute trabajando de forma adecuada para la
deteccioacuten del compuesto
0001002003004005006
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 Etilguayacol 0 0 0022 0053 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
0005
01015
02025
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0223 0143 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
78
Figura 18 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
El comportamiento de este compuesto en la prueba es muy irregular y poco
confiable
0
2
4
6
8
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 397847665182787068397847
4 vinylfenol
0
2
4
6
8
10
12
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 11071 28438 00204 0
4 vinylfenol
79
Figura 19 Comportamiento del compuesto 4 etilfenol durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
La concentracioacuten de 4 etil fenol fue mayor al cuarto diacutea almacenado a
temperatura ambiente de 20C pero este compuesto no tuvo una actividad notoria
de ascenso durante su almacenamiento como se esperaba lo que deja muchas
dudas sobre los resultados de este ensayo
0
05
1
15
2
25
3
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etil fenol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 20C
80
Figura 20 Comportamiento del compuesto 4 etil guayacol durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
Comportamiento anormal del compuesto no se ve tendencias de aumento o
disminucioacuten de este en ninguna de las pruebas no tiene un comportamiento
regular pues se esperaba que la levadura BrettanomycesDekkera
descarboxinizara el compuesto 4-vinilguaiacol y aumentar las concentraciones de
4-etilguaiacol esta reaccioacuten no se hizo notoria en los compuestos aromaacuteticos
seguacuten lo determino el Cromatografo de Gas (GC)
0
005
01
015
02
025
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3
C (
mg
L)
4 etil guayacol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 20C
81
Figura 21 Comportamiento del compuesto 4 Vinyl fenoll durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
La no presencia de este compuesto en el vino original demuestra las baja o casi
nula presencia de la levadura BrettanomycesDekkera al diacutea primero este
compuesto incrementa de forma notoria en las muestras debido a la presencia de
acido cumaacuterico en el medio ya que sufre su carboxilacion convirtieacutendose en 4 vinyl
fenol sin embargo su comportamiento no fue regular y presento problemas de
lecturas
0
2
4
6
8
10
12
14
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
C (
mg
L)4 Vinyl fenol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 28C
82
9 CONCLUSIONES Y
RECOMENDACIONES
91 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO
Se desarrolloacute un medio selectivo soacutelido para BrettanomycesDekkera
accesible y faacutecil de elaborar
Se detectan colonias de la levadura BrettanomycesDekera en el agar
selectivo con glucosa como fuente de carbono en un lapso de 5 diacuteas en
incubacioacuten a 28C
El medio selectivo soacutelido con Glucosa como fuente de carbono fue maacutes
raacutepido y efectivo ya que toma 5 diacuteas para dar resultados positivos frente al
de Etanol como fuente de carbono el cual toma 10 diacuteas para mostrar
resultados positivos aunque ambos dieron resultados satisfactorios en la
selectividad de la levadura BrettanomycesDekkera
La levadura se adapto de forma satisfactoria a estos medios en
condiciones de almacenamiento propias para su desarrollo (28C)
Las colonias de la levadura BrettanomycesDekkera tiene un crecimiento
en estos medios soacutelidos de forma circular con topografiacutea convexa y borde
entero dimensiones 5-6 mm color Amarillo opacicidad oscuro
83
superficie lisa y suave siendo faacutecil de identificar y realizar los conteos
necesarios
El medio solido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten
de la levadura BrettanomycesDekkera en vino tinto es raacutepido econoacutemico
y uacutetil
El uso de azucares para fermentacioacuten de la levadura
BrettanomycesDekkera que Saccharomyces no puede fermentar para
mayor selectividad
Realizacioacuten de pruebas Bioquiacutemicas como meacutetodo raacutepido de selectividad
92 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DESARROLLO DEL MEDIO LIacuteQUIDO
Se desarrollo un medio selectivo liquido para BrettanomycesDekkera
accesible y faacutecil de elaborar
Este medio mostroacute resultados positivos de la presencia de
BrettanomycesDekkera en un lapso de tiempo menor (3 diacuteas) que con el
medio solido (5 diacuteas) en caso de que el nuacutemero de ceacutelulas de la levadura
BrettanomycesDekkera sea mayor a la poblacioacuten critica (103)
Cuando la poblacioacuten de ceacutelulas de la levadura BrettanomycesDekkera es
menor a la poblacioacuten critica el tiempo de identificacioacuten de esta levadura por
medio liquido es muy prolongado puede tomar maacutes de 10 diacuteas o incluso no
detectarlo
84
Los compuestos quiacutemicos usados para el desarrollo del medio liacutequido no
son los adecuados para este tipo de medios donde los resultados positivos
son olfativos pues estos compuestos emiten fuertes olores que confunden
los olores caracteriacutesticos del caraacutecter Brett
El medio liquido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten
de altas concentraciones de la levadura BrettanomycesDekkera en vino
tinto es raacutepido econoacutemico y uacutetil
93 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg
EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE DALMACIA
CROACIA
Este trabajo mostroacute que el dioacutexido de azufre (SO2) tiene buenos resultados
en contra de la levadura BrettanomycesDekkera en concentraciones
normales de 40mgl concentracioacuten en la que se trabaja este compuesto en
los vinos tintos
En Europa el dioacutexido de azufre es usado de forma tradicional en gran
nuacutemero de alimentos y especialmente en vinos sin embargo y a pesar de
su uso regulado se busca la sustitucioacuten de este o su maacutexima reduccioacuten
para hacer de este producto maacutes sano para las personas no tolerantes a
este tipo de compuestos sin embargo seguacuten el trabajo realizado en
comparacioacuten con el producto Antibrettreg el SO2 es maacutes eficaz en el control
85
de la levadura ayudando a evitarla y eliminarla de la cadena productiva del
vino tinto
Gracias a sus caracteriacutesticas el vino tinto Babic es muy vulnerable a la
levadura BrettanomycesDekkera pero a su vez se puede tratar faacutecilmente
con productos como SO2 y Antibrettreg aunque es maacutes efectivo contra
BrettanomycesDekkera el dioacutexido de azufre (SO2)
Antibrettreg es una buena opcioacuten para el control de BrettanomycesDekkera
para evitar el uso de productos alergenicos como SO2
94 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN
EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO
MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE
Al terminar la primera prueba con anaacutelisis en cromatografiacutea a gas y el SPME
queda como resultados
Es necesario repetir la prueba
No se determina el efecto de los estaacutendares internos sometidos a tiempos
de almacenamiento en temperaturas de 20C y 28C lo que puede dar falsos
resultados de cantidades de compuestos
86
Se debe crear un medio maacutes apto para el desarrollo de la levadura y un
control diario de crecimiento ( agregar maacutes Glucosa en caso de que se
haya consumido toda controlar presencia de Bacterias y otros
microorganismos que no se deseen en el medio)
Es necesario control de aromas con panel sensorial para determinar el
umbral de deteccioacuten en este vino
Control de crecimiento por medio solido Selectivo para
BrettanomycesDekekra conteo de colonias presentes en el vino inoculado
y su desarrollo durante almacenamiento a diferentes temperaturas
La segunda prueba no fue posible realizarla por dantildeos en el equipo de
cromatografiacutea de gas (GC)
87
ANEXOS
11
89
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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Orwine Eureka 2008Investigadores europeos buscan alternativas al
dioxido de azufre en vinos
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alternativas-al-dioxido-de-azufre-en-el-vino
Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999
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AEB Group 2008 ANTIBRETT Preparado a base de paredes celulares de
levadura para la inactivacioacuten de Brettanomyces y la eliminacioacuten de los
91
olores de estos productos httpwwwaeb-
groupcomimgsSPAGNOLODepliantANTIBRETT-lett-ESPpdf
Hrvatski zavod za vinogradarstvo i vinasrtvo 2003 Pravilnik o vinu
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A Morata S Benito F Palomero F Calderoacuten y J A Suaacuterez-Lepe
Ecologiacutea y prevencioacuten de BrettanomycesDekkera durante la elaboracioacuten y
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Espantildeola de Asociaciones de Enoacutelogos y Periodistas Asociados) No 50
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92
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E Pueyo P Hidalgo K Fernaacutendez y P Martiacuten-Aacutelvarez 1999 Anaacutelisis de
compuestos volaacutetiles en vinos obtenidos con distintas cepas de
Saccharomyces cerevisiae Aplicacioacuten de la teacutecnica de micro extraccioacuten en
fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientiacuteficas 99 Grupos de
Investigacioacuten Enoloacutegica Zaragoza Espantildea
93
11
GRACIAS es una palabra corta para todo lo que quiero expresar a todos aquellos que
hicieron parte de este suentildeo hecho realidadhellip
A Dios y a la virgen Auxiliadora por llevarme de su mano cada diacutea de mi carrera en cada
momento alegre y en cada momento difiacutecil fueron mi fortaleza
A mis papitos por hacer de mi estudio una realidad por su sacrificio y apoyo desinteresado y
sincero
A mi Hermanito por ser mi fortaleza mi ejemplo y mi amigo incondicional
A mi familia Blanco y Urrea por su compantildeiacutea durante esta etapa
A mi facultad (Decano Dr Camilo Rozo Dra Patricia Jimeacutenez y mis profesores) por
ensenarme mi profesioacuten y aportar lo mejor de ustedes para mi formacioacuten personal
A mis asesores de Tesis (Ing Patricia Chaparro y Dr Sc Leo Gracin) por su guiacutea y
colaboracioacuten oportuna
A mis queridos amigos quienes siempre han estado a mi lado en las dificultades y en las
alegriacuteas (Ingrid Mafe Cami G Cami R Harold Pipe Karla Andreacutes T Diego G)
A IAESTE en alianza con el ORI por hacer posible mi intercambio y poder hacer mi tesis en el
maravilloso paiacutes de Croacia
A Croacia por ser mi segundo hogar por abrirme sus puertas y su corazoacuten por brindarme
tan maravillosas personas en mi camino
Croatia Thank you for being my second home for opening your doors and your heart to me
and give me the opportunity to meet so many wonderful people
To my boss my teacher my mentor and specially my friend Leo
To the faculty of food technology and Biotechnology and the department of technology
and analysis of beverages for give me the opportunity to give all my knowledge to the
project and learn a lot more
To all the amazing people I met during this experience (Igor Karin Natka Josip Ana Matija
Daniel Pz Szilvia Dini Daniela Lidija Sanja and everybody else who I had the pleasure to
meet in this great trip) for give me the best of your hearts
I only have one thing to say hellipTHANK YOU
Solo me queda una palabra por decirhellipGRACIAS
DETERMINACION DE LAS CARACTERISTICAS
AROMATICAS DE BrettanomycesDekkera AISLADO
EN VINO TINTO BABIC DE LA REGION DE
DALMACIA CROACIA
DIANA ROCIO URREA BLANCO
UNIVERSIDAD DE LA SALLE- UNIVERSITY OF ZAGREB
FACULTAD DE INGENIERIA DE ALIMENTOS- FACULTY OF FOOD
TECHNOLOGY AND BIOTECHNOLOGY
DEPARTAMENTO DE INGENIERIA DE ALIMENTOS - DEPARTMENT OF
TECHNOLOGY AND ANALYSIS OF BEVERAGES
BOGOTA COLOMBIA ndash ZAGREB CROATIA
2009
DETERMINACION DE LAS CARACTERISTICAS AROMATICAS DE
BrettanomycesDekkera AISLADO EN VINO TINTO BABIC DE LA REGION DE
DALMACIA CROACIA
DIANA ROCIO URREA BLANCO
Trabajo de grado para optar al tiacutetulo de Ingeniera de Alimentos
Asesores de investigacioacuten
LEO GRACIN
PhD Senior Scientific Assistant
PATRICIA CHAPARRO GONZALES
Ingeniera de Alimentos
UNIVERSIDAD DE LA SALLE- UNIVERSITY OF ZAGREB
FACULTAD DE INGENIERIA DE ALIMENTOS- FACULTY OF FOOD
TECHNOLOGY AND BIOTECHNOLOGY
DEPARTAMENTO DE INGENIERIA DE ALIMENTOS - DEPARTMENT OF
TECHNOLOGY AND ANALYSIS OF BEVERAGES
BOGOTA COLOMBIA ndash ZAGREB CROATIA
2009
CONTENIDO
paacuteg
RESUMEN ----------------------------------------------------------------------------------------------------- 6
ABSTRACT ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 7
INTRODUCCION -------------------------------------------------------------------------------------------- 8
1 MARCO TEORICO -------------------------------------------------------------------------------------- 10
11 REPRODUCCION -------------------------------------------------------------------------------------- 10
111 GEMACIOacuteN MULTILATERAL --------------------------------------------------------------------------------- 12
112 GEMACIOacuteN POLAR ------------------------------------------------------------------------------------------- 12
113 FISIOacuteN ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 12
114 PSEUDOMYCELIUM ------------------------------------------------------------------------------------------ 13
12 TAXONOMIA ------------------------------------------------------------------------------------- 13
121 DEKKERABRETTANOMYCES ------------------------------------------------------------------------- 14
13 CARACTERISTICAS FISIOLOGICAS ----------------------------------------------------- 16
132 IDENTIFICACIOacuteN DE BRETTANOMYCESDEKKERA ----------------------------------------------- 21
14 MEDIOS SOacuteLIDOS SELECTIVOS ----------------------------------------------------------------- 21
15 DIOacuteXIDO DE AZUFRE (SO2) EN VINOS ---------------------------------------------------------- 23
151 FORMAS DEL DIOacuteXIDO DE AZUFRE (SO2) ---------------------------------------------------------------- 24
152 INHIBIDOR MICROBIANO ------------------------------------------------------------------------------------ 25
16 ANTIBRETTreg COMO ALTERNATIVA DE PREVENCIOacuteN Y ELIMINACIOacuteN DE
BRETTANOMYCESDEKKERA ------------------------------------------------------------------------------- 27
2 PROBLEMA -------------------------------------------------------------------------------------- 29
3 JUSTIFICACION -------------------------------------------------------------------------------- 31
4
4 OBJETIVOS ------------------------------------------------------------------------------------------------ 32
41 GENERAL ------------------------------------------------------------------------------------------------- 32
42 ESPECIacuteFICOS ---------------------------------------------------------------------------------------------- 32
5 ALCANCES --------------------------------------------------------------------------------------- 33
6 ESTADO DEL ARTE --------------------------------------------------------------------------- 34
7 MATERIALES Y METODOS ----------------------------------------------------------------- 39
71 MEDIO SOLIDO SELECTIVO PARA BRETTANOMYCESDEKKERA ------------------------- 39
711 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------------- 39
712 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------------ 39
72 MEDIO LIacuteQUIDO SELECTIVO PARA BRETTANOMYCESDEKKERA ------------------ 42
721 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------- 42
722 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------- 42
73 INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO DE
LA REGION DE DALMACIA CROACIA ------------------------------------------------------------- 44
731 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------- 44
732 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------- 44
74 DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO
BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE --- 46
741 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------------- 46
742 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------------ 46
8 DISCUSIOacuteN Y RESULTADOS --------------------------------------------------------------- 48
81 RESULTADOS PARA EL DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO ------------------- 48
82 RESULTADOS PRUEBAS MEDIO LIQUIDO -------------------------------------------- 53
83 RESULTADOS DE LA INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg
EN VINO TINTO DE LA REGION DE DALMACIA CROACIA ----------------------------------- 55
5
84 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN EL
VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID
PHASE --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 65
841 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGUacuteN TEMPERATURAS DE
ALMACENAMIENTO --------------------------------------------------------------------------------------------- 70
9 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES --------------------------------------------- 82
91 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA DESARROLLO DEL MEDIO
SOLIDO 82
92 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA DESARROLLO DEL MEDIO
LIacuteQUIDO ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 83
93 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA INFLUENCIA DE DIOXIDO
DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE
DALMACIA CROACIA ----------------------------------------------------------------------------------- 84
94 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA DETERMINACION DE
AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL
METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE ---------------------------------------------- 85
ANEXOS ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 87
6
RESUMEN Este estudio presenta el desarrollo y evaluacioacuten de simples meacutetodos para la deteccioacuten de
la levadura BrettanomycesDekkera en vino y su medio de produccioacuten con el uso de
medio solido y liquido selectivo ademaacutes se evaluacutea el efecto del Dioacutexido de Azufre SO2 y
AntiBrettreg en vino tinto de la regioacuten de Dalmacia Croacia El meacutetodo de deteccioacuten de
esta levadura emplea medios selectivos enriquecidos los cuales contienen Glucosa (20
grl) en comparacioacuten con Etanol (6ml l) como fuentes de carboacuten y energiacutea cicloheximida
(30 grl) para prevenir la presencia de Sachharomyces ampicilina (10 mgL) como
antibioacutetico para prevenir el crecimiento de bacterias y acido p-cumaacuterico (100 mgL) como
precursor de la produccioacuten de 4-etilfenol para el medio solido el uso de agar se realiza
en una concentracioacuten de 16 grL Despueacutes de la siembra realizada en los medios (solido y
liquido) de vino contaminado con la levadura BrettanomycesDekkera es monitoreado
diariamente micro y macroscoacutepicamente
Una muestra de vino tinto Babic de Croacia fue contaminado con colonias de la levadura
BrettanomycesDekkera y fue dividido en 8 muestras de las cuales 2 de estas fueron
monitoreadas como control sin adicioacuten de ninguacuten compuesto 2 con adicioacuten de dioacutexido de
azufre SO2 en una concentracioacuten de 40mgL y 4 de estos con AntiBrettreg en una
concentracioacuten de 40grHl El meacutetodo de este estudio se basa en la determinacioacuten del
comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en estas condiciones Este se
evaluoacute en teacuterminos de crecimiento de la citada levadura (UFCml) presentes en las
muestras y anaacutelisis fisicoquiacutemicos antes y despueacutes de 15 diacuteas de adicioacuten y monitoreo
7
ABSTRACT
This experiment presents the development and testing of a simple way to detect
BrettanomycesDekkera from wine and wine environments using selective media in solid
phase and liquid phase and the influence of Sulfur Dioxide (SO2) and Antibrett reg in red
wines from Dalmatian region The method of detection of this yeast employs selective
enrichment mediums These mediums contains glucose (20gl) and Ethanol (6) as
carbon and energy source cycloheximide (30 mgl) to prevent growth of Sachharomyces
ampicilin (10 mgl) to prevent growth of bacteria and p-coumaric acid (100 mgl) as a
precursor of the production of 4-etilphenol depending on the phase of the medium agar
compound is used in a concentration of 16 grl After putted on the medium wine
contaminated with BrettanomycesDekkera is monitored by micro and macro inspection
also with the liquid medium
A red wine from Dalmatian region was contaminated with BrettanomycesDekkera colonies
and divided in 8 different containers from these 8 containers we had two for control no
addition two with addition of Sulfur Dioxide (SO2) in a concentration of 40 mgl and four of
them with Antibrett reg in a concentration of 40gHl The method for this study is based in
following the behavior of the yeast BrettanomycesDekkera with these compounds in this
wine this behavior was monitored based in CFUml showing in the samples and physic
and chemical analysis before addition and 15 days after
8
INTRODUCCION
Las levaduras del geacutenero Brettanomyces o su forma telemoacuterfica (nombre que
reciben las especies que presentan reproduccioacuten sexual y en consecuencia
formacioacuten de esporas por meiosis) Dekkera fueron descritas por primera vez por
Claussen en 1903 en la produccioacuten de cerveza1
Este geacutenero se conoce desde hace tiempo como agente contaminante en la
industria cervecera de la sidra y de bebidas carbonatadas2 En la industria
enoloacutegica su descripcioacuten como alterante es maacutes reciente
Durante los antildeos 1950s muchos autores reportaron el aislamiento del genero
Brettanomyces en uvas francesas e italianas (Van der Walt y Van der Kerken
1958) Sin embargo en muchas regiones del mundo viniacutecola esta levadura no ha
sido identificada lo cual dificulta su deteccioacuten en materiales o productos
contaminadosEntre todos los microorganismos la levadura
BrettanomycesDekkera es una de las maacutes temidas por los vinicultores El
crecimiento y desarrollo de esta levadura causa alteraciones denominadas
ldquocaraacutecter Brettrdquo lo cual ocurre especialmente en vinos tintos3
1 Gilliland R Brettanomyces I Occurrence characteristics and effects on beer flavor J Inst Brew
1961
2 Deak T y Beuchat LR Handbook of spoilage yeast CRC Press Nova York 1996
3 Heresztyn T Archives of Microbiology 1986 Metabolism of phenolic compounds from
hydroxycinnamic acids by Brettanomyces yeast
9
El ldquocaraacutecter Brettrdquo produce un amplio espectro de sabores y aromas alterantes
entre los cuales estaacuten corral minerales tinta tabaco cuero faacutermacos y
ahumado estas alteraciones se le atribuyen a los compuestos 4-etilfenol y 4-
etiguayacol las cuales causan una supresioacuten de aromas atractivos en el vino
como de frutas y flores y perdida de sabores agradables para el consumidor como
acido salado amargo o picante 4
Esta levadura tiene distinto comportamiento seguacuten el tipo de vino al que esteacute
asociada pues cada tipo de vino tiene diferente composicioacuten de carbonos
nitroacutegenos vitaminas y minerales
Con este estudio se evaluacutea el comportamiento y caracterizacioacuten de la levadura
BrettanomycesDekkera en vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia con
el desarrollo de medios solido y liquido para la selectividad de la levadura
alteraciones aromaacuteticas del vino tinto Babic producidas por 4 etilfenol y 4
etilguayacol y el comportamiento de BrettanomycesDekkera en el vino al ser
tratado con Dioacutexido de azufre (SO2) comparativamente con tratamiento Antibrettreg
4 Boulton Singleton Bisson amp Kunkee 1996 Descripcioacuten de aromas fenoacutelicos
10
1 MARCO TEORICO
Las levaduras representan el grupo de microorganismos maacutes importante en la
industria viniacutecola porque sin Saccharomyces producir vinos de alta calidad seriacutea
imposible Ademas de Saccharomyces hay muchos otros geacuteneros y especies de
levaduras presentes durante la vinificacioacuten que afectan la calidad del vino positiva
o negativamente5
Las levaduras comprenden 39 geacuteneros y 350 especies Se identifican y clasifican
basaacutendose en caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas Entre los aspectos
morfoloacutegicos considerados se encuentran el tamantildeo y la forma de las ceacutelulas en
medios soacutelidos y liacutequidos especificados el modo de reproduccioacuten y si forma velo
en la superficie o sedimenta en un medio liacutequido Entre las caracteriacutesticas
fisioloacutegicas consideradas se encuentra si puede crecer (y fermentar) en un
determinado carbohidrato y si puede o no utilizar determinadas fuentes de
nitroacutegeno como los nitratos6
11 REPRODUCCION
Las levaduras son agrupadas en tres familias conocidas como
Saccharomycetaceae Sporobolomycetaceae y Cryptococcaceae Estas
5 H Erten June 2002 Relations between elevated temperatures and fermentation behavior of
Kloeckera apiculata and Saccharomyces cerevisiae associated with winemaking in mixed culture
World Journal of Microbiology and Biotechnology Volume 18 N 4 pag 1 Adana Turkey 6 Cerveceros de Argentina 2006 Levadura wwwcervezadeargentinacomararticuloslevadurahtm
11
representan el grupo de microorganismos entre bacterias y hongos respecto a su
tamantildeo de ceacutelula Este grupo es caracterizado por su forma de reproduccioacuten
vegetativa conocida como ldquogemacioacutenrdquo Bajo condiciones optimas una ceacutelula
madre puede gemar varias veces durante el periodo reproductivo Sin embargo
bajo estrictas condiciones de fermentacioacuten una levadura va a gemar solamente
entre tres o cuatro veces Aquiacute la disponibilidad de oxigeno la cual es necesaria
para la formacioacuten de precursores de la membrana de la ceacutelula limita la
replicacioacuten7
Estos microorganismos muestran varios tipos de gemacioacuten lo cual puede dar un
valor diagnostico Entre aquellas aisladas de fermentacioacuten y antildeejamiento del vino
se observan maacutes frecuentemente multilateral y gemacioacuten polar 8
La modalidad maacutes comuacuten es la gemacioacuten proceso asexual en el cual la ceacutelula
progenitora emite un conducto tubular desde la vacuola nuclear hacia un punto
perifeacuterico proacuteximo a la misma Entonces se forma en la direccioacuten del conducto
una pequentildea protuberancia en la superficie externa de la ceacutelula y el conducto
pasa atravesando la pared celular a dicha protuberancia la cual se ensancha
llenaacutendose con el material citoplaacutesmico y nuclear de la ceacutelula progenitora Cuando
el brote o yema formada llega a ser casi tan grande como la ceacutelula progenitora los
aparatos nucleares de ambas ceacutelulas se orientan de forma que sus centrosomas
respectivos equidisten del punto de unioacuten Al llegar este momento la ceacutelula madre
y la ceacutelula hija se separan y se inicia la formacioacuten de nuevas ymas En la
gemacioacuten normal no se forman tabiques de separacioacuten entre ceacutelula madre y
ceacutelulas hijas pero en algunos casos el proceso se inicia en la gemacioacuten y se
completa por divisioacuten con la separacioacuten definitiva de ambos individuos La ceacutelula
madura de puede producir por gemacioacuten durante el curso de vida un promedio de
7 Brinton M Miller and Warren Litsky PhD 1976 Industrial Microbiology Edi Mac Graw Hill United States
of America
8 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures
edi Springer second edition Fresno California United States of America
12
24 generaciones de ceacutelulas hijas Las yemas sucesivas se forman siempre en
sitios diferentes de la superficie de la ceacutelula9
111 Gemacioacuten multilateral
La gemacioacuten multilateral ocurre en el ldquohombrordquo o aacuterea de la levadura donde ocurre
la reproduccioacuten La gemacioacuten y ciclo de separacioacuten crea un problema para las
levaduras durante su fase fermentativa pues en este tiempo la ceacutelula madre se
reduce aproximadamente un medio Porque la siacutentesis de la membrana celular
ocurre bajo condiciones anaeroacutebicas lo que limita los ciclos asexuales
replicativos Como resultado la mayoriacutea de las fermentaciones se completan en la
fase estacionaria (no gemacioacuten) Un ejemplo de esta reproduccioacuten es
BrettanomycesDekkera10
112 Gemacioacuten Polar
A diferencia de la gemacioacuten multilateral la gemacioacuten polar puede ocurrir en uno o
dos polos En el caso de Kloeckera y Saccharomyces la gemacioacuten ocurre en
ambos polos aumentando la poblacioacuten de levaduras con forma de ldquolimoacutenrdquo 11
113 Fisioacuten
Esta reproduccioacuten es caracteriacutesticas del genero Schizosaccharomyces donde la
formacioacuten de la ceacutelula hija ocurre sin la reduccioacuten de la madre ceacutelula como en los
casos anteriores En este caso la formacioacuten de la microscoacutepica pared celular
ocurre entre la madre ceacutelula y la hija seguida por la separacioacuten12
9 Araya Pablo 2002 Reproduccioacuten de hongos unicelulares mediante gemacioacuten esporulacioacuten y
fisioacuten httphtmlrincondelvagocomreproduccion-asexualhtml
10 11 12 Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic
Publishers GmbH United States of America and Canada
13
114 Pseudomycelium
Cualquier fabricante de vinos ha tenido la oportunidad de notar la formacioacuten de
una peliacutecula en la superficie del vino Esto surge debido a la gemacioacuten repetida de
las levaduras oxidativas y fallas en el momento de la separacioacuten de la ceacutelula hija
de la madre Con el tiempo el lazo previo entre la madre ceacutelula e hija se ampliacutea
dando la impresioacuten de filamentos como si se tratase de mohos siendo que son
levaduras 13
12 TAXONOMIA
Para distinguir las levaduras que pueden producir ascoporas de aquellas que no
los micologistas usan doble taxonomiacutea para su clasificacioacuten Desafortunadamente
la nomenclatura para la combinacioacuten anamorfotelemorfo es frecuentemente
diferente Unos ejemplos de levaduras sexualasexual o telemorfoanamorfo son
DekeraBrettanomyces Metschnikowia pulcherrimaCandida pulcherrima
Hanseniaspora uvarumKloeckera apiculata Torulaspora delbruecki Candida
colliculosa 14
Sin embargo las levaduras son diferenciadas por los taxonomistas por asignacioacuten
de varios nombres de geacutenerosespecies varios vinicultores usan un sistema
informal para agrupar levaduras basadas en su morfologiacutea u otras caracteriacutesticas
Por ejemplo a Kloeckera apiculata se le refiere como ldquolevadura apiculadardquo
tiene forma de limoacuten Esta levaduras asi com muchas otras presentes en el mosto
de la uva como lo son Candida Cryptococcus Debaryomyces Hansenula
Issatchenkia Kluyveromyces Metschnikowia Pichia y Rhodotorula tambieacuten son
llamadas levaduras ldquonativasrdquo ldquonaturalesrdquo o ldquosalvajesrdquo por su origen el vintildeedo o en
13
Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers
GmbH United States of America and Canada
14 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
14
la vinera Algunos enoacutelogos han discutido contra el uso de estos teacuterminos porque
esta implicancia no sucede en todas las levaduras ya que estas son de alguna
forma ldquono-nativasrdquo o ldquono naturalesrdquo (Ej Saccharomyces o Brettanomyces) El
teacutermino ldquono Saccharomycesrdquo es maacutes comuacuten para nombrar aquellas levaduras
presentes en el mosto de la uva que no son del genero Saccharomyces15
Las levaduras encontradas despueacutes de la fermentacioacuten alcohoacutelica tambieacuten son
asignadas a un grupo informal Algunas veces las levaduras que conducen la
principal fermentacioacuten (Saccharomyces) son muchas veces llamadas ldquolevaduras
fermentativasrdquo basados en su metabolismo Durante su antildeejamiento algunas
levaduras (Candida Hansenula y Pichia) pueden crecer en la superficie en
presencia de oxigeno Esta peliacutecula superficial es comuacutenmente asociada a
deterioro del vino esta levadura se le conoce como ldquolevadura formadora de
peliacuteculardquo16
121 DekkeraBrettanomyces
La taxonomiacutea cientiacutefica sobre BrettanomycesDekkera ha cambiado en los uacuteltimos
antildeos Brettanomyces estaacute clasificado dentro de la misma familia que
Saccharomyces (familia Saccharomycetaceae) Actualmente dentro del geacutenero
Brettanomyces se aceptan cinco especies diferentes (B bruxellensis B
anomalus B custersianus B nanas y B naardenensis)17
Las teacutecnicas de biologiacutea molecular han demostrado que B intermedious B
lambicus B custerseii o D intermedia son sinoacutenimos de B bruxellensis por lo
que estas denominaciones han quedado en desuso Los microorganismos de este
geacutenero presentan dos formas una capaz de reproducirse sexualmente (Dekkera)
15
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
16 Kurtzman CP 1998 The industrial and agricultural significance of yeasts 4
th Edition Amsterdam
Holanda
17 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
15
y otra que lo hace asexualmente (Brettanomyces) Tambieacuten se llaman
respectivamente forma perfecta y forma imperfecta En algunos casos la forma
perfecta y la imperfecta reciben nombres diferentes como ocurre con B anomalus
y D anomala En otros casos el nombre es similar como las pertenecientes a la
especie bruxellensis que pueden parecer como D bruxellensis como B
bruxellensis o como BrettanomycesDekkera A efectos praacutecticos en la bodega
estos dos estados son similares Cuando vemos referencias a Brettanomyces
como contaminante en la mayor parte de los casos se refieren a
DekkeraBrettanomyces ya que este es el responsable de las alteraciones en el
vino18 y 19
La morfologiacutea celular de BrettanomycesDekkera es ojival o ciliacutendrica con
gemacioacuten multipolar en reproduccioacuten vegetativa Una de las caracteriacutesticas de
este geacutenero es su tamantildeo celular variable y la formacioacuten de filamentos19
18 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 23
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
19
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
16
Figura 1 Microfotografiacutea de cultivo de BrettanomycesDekkera a) Variabilidad morfoloacutegica y de
tamantildeo celular b) forma filamentosa
Fuente Lopez-Cordon Eva BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia wwwacenologiacom
Los defectos sensoriales asociados directamente a Brett aparecen
mayoritariamente en vinos tintos de calidad y las causas radican en la propia
fisiologiacutea del microorganismo Ademaacutes al ser una levadura de crecimiento muy
lento la alteracioacuten se presenta principalmente durante el almacenamiento y sobre
todo la crianza del vino habitual en los vinos tintos de gama alta En las barricas
de madera el microorganismo tiene a su disposicioacuten todo el sustrato y tiempo
suficiente para realizar su actividad La naturaleza porosa de la madera y su difiacutecil
limpieza contribuye a que las poblaciones existentes se mantengan incluso
despueacutes del lavado de la barrica Ademaacutes BrettanomycesDekkera tiene la
capacidad de degradar uno de sus componentes la celobiosa 20
13 CARACTERISTICAS FISIOLOGICAS
S cerevisiae y BrettanomycesDekkera tienen metabolismos similares muy
adaptados a las condiciones de vinificacioacuten Tras la fermentacioacuten alcohoacutelica S
cerevisiae es la levadura mayoritaria debido a que las condiciones nutricionales
20
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
17
del vino son muy estrictas (altas concentraciones de etanol y bajas
concentraciones de nutrientes) En este momento BrettanomycesDekkera
continuacutea creciendo gracias a que utiliza nutrientes que S cerevisiae no ha podido
consumir sobre todo algunos azuacutecares y fuentes de nitroacutegeno21
Una de las caracteriacutesticas que diferencia a BrettanomycesDekkera es la gran
diversidad de azuacutecares que puede fermentar (ver tabla de Relacioacuten de los
principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) La mayoriacutea de
las cepas pueden crecer utilizando trealosa y celobiosa azucares presentes en el
vino y no consumibles por S cerevisiae Otra de las ventajas que presenta frente
a S cerevisiae (y frente a la mayoriacutea de las levaduras) es que puede utilizar los
nitratos como fuente de nitroacutegeno Debido a que S cerevisiae soacutelo utiliza el
nitroacutegeno amoniacal y los aminoaacutecidos libres estos se consumen con relativa
rapidez Al final de la fermentacioacuten el nitroacutegeno moniacal es escaso y se favorece
el crecimiento de las levaduras que pueden utilizar otras fuentes de nitroacutegeno
Ademaacutes Brettanomyces puede crecer con concentraciones de fosfato diamoacutenico
tan bajas como 05gl o a partir de diversos aminoaacutecidos En resumen
BrettanomycesDekkera crece maacutes despacio que S cerevisiae es resistente a
concentraciones altas de alcohol puede utilizar otros azucares como fuentes de
energiacutea y nitrato como fuente de nitroacutegeno Esto explica que pueda reproducirse
cuando la fermentacioacuten alcohoacutelica ha terminado a partir de nutrientes no
consumibles por S cerevisiae y cuando no tiene competidores22
21
Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
22 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
18
Tabla 1 Relacioacuten de los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto
Fuente Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista
VINOTEQ N 38 pag 21 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
131 BrettanomycesDekkera y siacutentesis de fenoles volaacutetiles
El origen de los fenoles volaacutetiles estaacute relacionado con la actividad secuencial de
dos enzimas que descarboxilan los aacutecidos en hidroxiestirenos (vinilfenoles) que
19
son posteriormente reducidos a etilderivados (etilfenoles)23 como puede
observarse en la figura 2
Figura 2 Siacutentesis de etilfenoles de BrettanomycesDekkera
Fuente ACE revista de Enologia wwwacenologiacom
El primer paso de descaboxilacion de los aacutecidos hidroxicinamicos es comuacuten
tambieacuten en otros microorganismos como bacterias hongos y otras levaduras Sin
embargo el segundo paso reduccioacuten de vinilfenoles es caracteriacutestico de algunos
tipos de levaduras como Dekkera bruxelliensis D anomala Pichia guillermondi
Candida versarilis C halophila y C mannitofaciens24
Los fenoles volaacutetiles que se asocian al problema Brett en vinos son el 4-etilfenol y
el 4- etilguaiacol asiacute como sus precursores intermedios 4-vinilfenol y 4-
vinilguaiacol aunque estos uacuteltimos son menos importantes por ser muy reactivos y
raacutepidamente convertidos en etilfenoles por BrettanomycesDekkera o en su caso
23
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
24 Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
20
condensan con otras moleacuteculas como antocianos25 Los etilfenoles y
especialmente elevadas concentraciones de 4-vinilfenol en vinos se asocian con
aromas desagradables asociados a descriptores como ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de
caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo26
El umbral sensorial del 4-etilfenol es de 230 μg l-1 y el del 4-etilguaiacol es de 47
μgl Pese a su menor umbral sensorial el 4-etilguaiacol responde a descriptores
como ldquobaconrdquo o ldquoahumadordquo que a bajas concentraciones aportan complejidad por
lo que se puede considerar sensorialmente menos conflitivo que el 4-etilfenol 27
Figura 3 Defectos sensoriales producidos en el vino por BrettanomycesDekkera
Fuente Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
25 Morata A Goacutemez-Cordoveacutes M Calderoacuten F Suaacuterez J 2006 Effects of pH temperature and SO2 on the
formation of pyranoanthocyanins during red wine fermentation with two species of Saccharomyces Journal Food Microbiology No106 pag 4 Madrid Espana
26 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea 27 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
21
132 Identificacioacuten de BrettanomycesDekkera
Los Bioacutelogos usan sistemas de identificacioacuten basados en similitudes taxonoacutemicas
entre organismos dichas similitudes pueden ser morfoloacutegicas tipos capacidad de
produccioacuten de sustratos como azuacutecar yo nitratos caracteriacutesticas fisioloacutegicas y
bioquiacutemicas secuencia del material geneacutetico y respuestas inmunoloacutegicas28
En la industria viniacutecola es importante recurrir a diferentes tipos de pruebas para la
identificacioacuten de microorganismos una de estas y la maacutes realizada es la revisioacuten
del microorganismo bajo el microscopio Esta prueba brinda informacioacuten sobre la
morfologiacutea del microorganismo (cocos bacilos formas puntudas ojival entre
otros) tamantildeo (dimensiones) agrupaciones celulares (solas parejas triacuteos
grupos o cadenas) Sin embargo el uso del microscopio es una prueba raacutepida
para examinar mostos o vino pero no determina cantidades que muchas veces es
requerido para tratamientos de accioacuten otro de los inconvenientes es que los
microorganismos pueden variar su morfologiacutea en forma o tamantildeo dependiendo de
la edad y las condiciones de crecimiento por lo que puede no ser clara la
identificacioacuten de este29
14 Medios soacutelidos selectivos
Si se requiere de la confirmacioacuten del microorganismo este debe ser aislado del
vino para una caracterizacioacuten para esto se requiere de medios soacutelidos Cuando se
examina un microorganismo en un medio solido es importante revisar las
caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias (ver figura 4 Morfologiacuteas de colonias
en medios soacutelidos) Entre estas caracteriacutesticas estaacuten forma (circular irregular o
2829 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
22
rizada) tamantildeo (dimensiones estas normalmente se expresan en miliacutemetros)
topografiacutea (plano elevado convexo coacutencavo o embonado) presencia de
pigmentos opacidad (transparente traslucido u opaco) superficie (suave rugosa
lisa o aacutespero) bordes (entero ondulado crespo dentado rizado) o cualquier
cambio en el agar (color opacidad cambios en los indicadores de pH o CaCO3
respectivamente)30
Figura 4 Varias morfologiacuteas de crecimiento de colonias en medio solido
Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007
Gran nuacutemero de medios selectivos se han creado para la aislacioacuten deteccioacuten yo
conteo de levaduras provenientes de jugos de uva mostos o vinos El medio maacutes
utilizado en estos fines es YPD (Yeast Peptone Dextrose) pero dicho medio no
es selectivo entre levaduras y se usa comuacutenmente para el conteo de
Saccharomyces31 Las colonias empiezan a parecer con un periodo de incubacioacuten
30
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
31 Essia Ngang J Wolniewicz E Villa P2005 Stimulation of lactobacilli during alcoholic fermentation action
of sucrose hydrolysis by yeast Biotechnology letters No 8 pag 743 Amiens France
23
de 2 a 4 diacuteas a 22C a 25C Igualmente el agar de jugo de uva es no selectivo y
presenta faacutecil crecimiento de levaduras bacterias y mohos
Para la levadura Brettanomyces Dekkera se han elaborado diferentes medios
selectivos entre ellos el maacutes conocido es WL por sus siglas en ingles del
laboratorio que lo creo ldquoWallerstein Laboratoriesrdquo este medio contiene
cicloheximida compuesto selectivo para Brettanomyces e inhibe Saccharomyces
El punto criacutetico es encontrar la cantidad exacta de este compuesto para la
inhibicioacuten de las levaduras sin que afecte a BrettanomycesDekkera32
Ademaacutes del medio WL BrettanomycesDekkera puede ser cultivado en otros
medios selectivos como Brettanomyces medio A creado por Vilas en 1993
Brettanomyces medio B el cual contiene cicloeximida como agente selectivo
mientras que Brettanomyces medio C tiene cicloheximida y ampicilina este medio
fue creado por B Watson en 1998 Brettanomyces medio D fue creado
recientemente por Rodrigues en 2001 este medio es conocido como DBDM
(DekkeraBrettanomyces differential medium ) es un medio selectivo para
Brettanomyces en contra de Saccharomyces y otras levaduras este medio es el
maacutes utilizado en la vineras para caracterizacioacuten de BrettanomycesDekkera
actualmente33
15 Dioacutexido de azufre (SO2) en vinos
32
33
Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers
GmbH United States of America and Canada
24
El dioacutexido de azufre tambieacuten llamado oxido de azufre es un eficaz agente
conservante antioxidante y antimicrobiano en la industria viniacutecola34
Durante la vinificacioacuten SO2 ha representado histoacutericamente una herramienta muy
importante usada por los vinicultores para el control de crecimiento microbioloacutegico
Debido a preocupaciones por la salud del consumidor el uso de este producto ha
disminuido dramaacuteticamente con el posible riesgo de aumentar el riesgo
microbioloacutegico35
El actual liacutemite legal de SO2 en vinos en los Estados Unidos es de 350mgL una
concentracioacuten mucho mayor a la usada en la industria viniacutecola No obstante vinos
que contienen maacutes de 10mgL deben declarar este compuesto en la etiqueta
porque SO2 es un metabolito que las levaduras usan durante la fermentacioacuten Los
vinos siempre contienen algo de sulfitos aunque la adicioacuten no se realice durante el
proceso36
151 Formas del Dioacutexido de Azufre (SO2)
Una vez disuelto en agua el dioacutexido de azufre existe en equilibrio entre SO2
molecular (SO2H2O) bisulfito (HSO3) y sulfito (SO32-) Este equilibrio depende del
pH Ademaacutes de estar en equilibrio con el molecular y especies sulfito el bisulfito
tambieacuten existe en forma ldquolibrerdquo y en forma ldquoatadardquo Aquiacute la moleacutecula reaccionara
34
Orwine Eureka 2008Investigadores europeos buscan alternativas al dioxido de azufre en vinos
httpawprowordpresscom20081107investigadores-europeos-buscan-alternativas-al-dioxido-de-
azufre-en-el-vino
3536 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
25
con compuestos carbonilos (ej Acetaldehiacutedo) formando productos adicionales
como Acido Hydroxysulfonico 37
Ademaacutes de Acetaldehiacutedo algunas moleacuteculas presentes en el jugo de uva que
reaccionan con bisulfito son acido piruvico α-keto-glutaric dihidroxyacetona
diacetyl Pigmentos de antocianinas entre otros38
152 Inhibidor Microbiano
El sulfuro molecular es la forma antimicrobiana del dioacutexido de azufre La cantidad
de SO2 molecular presente en cualquier vino no se mide directamente La
concentracioacuten es calculada conociendo la concentracioacuten de SO2 libre y el pH del
vino basaacutendose en la siguiente foacutermula
Alternativamente la figura 5 Se puede utilizar como guiacutea para aproximar la
cantidad de SO2 libre necesitada a determinado valor de pH de valores entre 05 o
08 mgl de SO2 molecular 39
El SO2 inhibe microorganismos de varias formas incluyendo rupturas de puentes
bisulfitos en proteiacutenas y reaccionando con coofactores como NAD+ y FAD tambieacuten
reacciona con ATP
3739
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
38 Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi
Springer New York United States
26
Figura 5 Cantidades de SO2 libre a un pH determinado para obtener 05 o 08 mgl de SO2
molecular
Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007
La concentracioacuten de SO2 molecular necesario para prevenir el crecimiento de
microorganismos variacutea seguacuten vinojugo pH temperatura poblacioacuten densidad y
diversidad estado de crecimiento grado de alcohol entre otros factores Beech
1979 sugirioacute una adicioacuten de 08 mgl de SO2 molecular como la cantidad
necesaria del compuesto en vinos blancos de mesa para dar una reduccioacuten de
cerca de 104 UFCml de la poblacioacuten de diferente tipo de microorganismos en 24
horas Las diferencias que existen entre las levaduras y bacterias en base a la
27
sensibilidad a este compuesto son dadas a conocer por diferentes autores (Warth
1977 1985 Du Toit 2005 Davis 1988 Hood 1983)40
16 Antibrettreg como alternativa de prevencioacuten y eliminacioacuten de
BrettanomycesDekkera
Antibrettreg es un producto nuevo creado por Spindal SARL-Gretz - Armainvilliers
Francia Es una preparacioacuten enzimaacutetica para inactivar Brettanomyces y para
reducir olores producidos por fenoles volaacutetiles41
Antibrettreg es preparado a base de paredes celulares de levadura activados
enzimaacuteticamente que presentan elevadas propiedades adsorbentes frente al 4-
etilfeno y 4- etilguayacol compuestos asociados con olores desagradables en el
vino tales como sudor de caballo farmacia o barniz42
Antibrettreg inhibe la produccioacuten de la vinilreductasa que participa en la
transformacioacuten de los aacutecidos cinaacutemicos naturalmente presentes en los vinos en
los correspondientes derivados etilados responsables de los olores atribuidos a
BrettanomycesDekkera 43
40
Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi
Springer New York United States
41 Manual de instrucciones de producto Antibrett reg producido por Spindal SARL-Gretz -
Armainvilliers France
424344 AEB Group 2008 ANTIBRETT Preparado a base de paredes celulares de levadura para la inactivacioacuten
de Brettanomyces y la eliminacioacuten de los olores de estos productos httpwwwaeb-
groupcomimgsSPAGNOLODepliantANTIBRETT-lett-ESPpdf
28
El uso de Antibrettreg es efectivo incluso contra otros olores anoacutemalos como los
que se generan en las barricas sucias principalmente huacutemedas dantildeando la
calidad olfativa del vino44
29
2 PROBLEMA
La levadura BrettanomycesDekkera es una levadura de contaminacioacuten presente
en la mayoriacutea de industrias viniacutecolas en el mundo Afecta directamente la
produccioacuten y calidad sensorial de los vinos con el desarrollo de los compuestos 4
etilfenol y 4 etilguayacol los cuales dantildean el perfil olfativo del vino dando aromas
caracteriacutesticas a ldquoestablordquo ldquocuerordquo ldquosudor de caballordquo o ldquobarnizrdquo conocido como
ldquocaraacutecter Brettrdquo
Esta contaminacioacuten se da especialmente en los vinos tintos debido a sus
caracteriacutesticas de produccioacuten (fermentacioacuten crianza antildeejamiento) y sus
propiedades fisicoquiacutemicas (Grado alcohoacutelico pH Acidez total Acidez volaacutetil
entre otros)
En Croacia existe una gran produccioacuten de vinos tintos entre los cuales se
encuentra el vino tinto Babic proveniente de la isla de Hvar el cual es famoso por
ser un vino duro carnoso estructurado y casi sobre-maduro con un grado
alcohoacutelico que ronda los 15 vv siendo la primera denominacioacuten de origen que
se aproboacute en Croacia en el antildeo 1961 este vino es de gran importancia en la
regioacuten la mayoriacutea de sitios de elaboracioacuten son pequentildeas industrias que han sido
afectadas por el bdquocaraacutecter Brett‟ Muchas investigaciones se han realizado al
respecto de la levadura BrettanomycesDekkera pero se conoce muy poco sobre
sus efectos en el vino Babic debido a sus caracteriacutesticas particulares (alcohol
30
15 pH 35 Acidez total 520 gr Acido TartaricoL Acidez volaacutetil 08 gr Acido
AceticoL Azucar residual 47 grLt)45
La dificultad de la pequentildea industria para acceder a productos que lleven a la
identificacioacuten de la levadura mencionada y de esta manera conllevar a planes de
accioacuten contra el ldquocaraacutecter Brettrdquo es una de las grandes dificultades de la industria
vinera en este paiacutes en donde los productos para la industria enoacuteloga son
complicados y de alto precio para acceder a ellos y en consecuencia no se
realizan muchas de estas pruebas de deteccioacuten de BrettanomycesDekkera
llevando al mercado productos contaminados de baja calidad que inicialmente
podriacutea haber sido un vino de alta calidad debido a sus caracteriacutesticas uacutenicas y de
gran popularidad
45
Datos obtenidos en el laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
31
3 JUSTIFICACION
Actualmente Croacia cuenta con maacutes de 300 zonas vineras en las que se producen 67
de vino blanco 32 vino tinto y el restante 1 vino rosado De acuerdo a recientes datos
estadiacutesticos hay 650 km2 de vintildeedos en Croacia de los cuales 375 km2 son uvas con
indicacioacuten geograacutefica de origen que producen maacutes de 300 vinos y maacutes de la mitad de este
nuacutemero son vinos elaborados en microempresas con un total de 50000000 de botellas
de vino el 8 es vino superior 70 de calidad y el 22 es vino de mesa de produccioacuten
nacional46
Croacia es un fuerte productor de vino a nivel regional con sus diferentes variedades
propias (Merlot Plavac Dingač Postup Malvazija Pošip Kujundžuša Babic) pero dicha
produccioacuten ha sido fuertemente afectada por la presencia de la levadura
BrettanomycesDekkera trayendo consecuencias como perdidas de produccioacuten peacuterdida
de calidad sensorial del vino grandes peacuterdidas econoacutemicas y desprestigio a sus vinos de
denominacioacuten de origen
Es por esto que en este proyecto de investigacioacuten se busca una faacutecil y raacutepida
identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera causante del ldquocaraacutecter Brettrdquo con el
desarrollo de medios selectivos liquido y solido ademaacutes de opciones para el tratamiento
yo prevencioacuten de esta levadura en la cadena productiva comparativamente entre dioacutexido
de azufre (SO2 ) y Antibrettreg y la identificacioacuten de los aromas caracteriacutesticos del ldquocaraacutecter
Brettrdquo en el vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia
46
Hrvatski zavod za vinogradarstvo i vinasrtvo 2003 Pravilnik o vinu httpwwwhrzvvhrpropisihtm
32
4 OBJETIVOS
41 General
Caracterizar y evaluar el comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera
en teacuterminos de crecimiento y produccioacuten de aromas no deseados en vino tinto
Babic
42 Especiacuteficos
Desarrollar el medio solido y medio liacutequido selectivo para
BrettanomycesDekkera
Evaluar el comportamiento de la levadura en estos medios selectivos
Determinar la influencia del Dioacutexido de azufre (SO2) y el compuesto
Antibrettreg en la levadura BrettanomycesDekkera presente en vino tinto
Babic 2007
Identificar los compuestos aromaacuteticos producidos por Brettanomyces
bruxellensis en vino tinto Babic usando el meacutetodo ldquomultiple headspace
solid-phase microextraction (SPME)rdquo
33
5 ALCANCES
En este proyecto se pretende desarrollar un medio selectivo faacutecil de producir en
donde sea raacutepida la identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera en la
produccioacuten de vinos tintos se realizaran pruebas para corroborar el crecimiento de
esta levadura en el medio determinando el tiempo que esta levadura toma en
adaptarse en el medio y su comportamiento en este una vez comprobada su
adaptacioacuten al medio liquido se trabajara con el meacutetodo de cromatografiacutea de gas
(GC) y el uso de micro extraccioacuten en fase solida (SPME) para el anaacutelisis
cuantitativo de los compuestos volaacutetiles (4-etil-fenol 4-etil-guayacol4-vinilfenol y
4-vinil-guayacol) y posteriormente con el vino tinto Babic Ademaacutes se desea
comprobar la efectividad de los productos con que las vineras de Croacia inhiben
o eliminan la presencia de la levadura en los vinos tintos como lo son el producto
AntiBrettreg y el Dioacutexido de azufre (SO2)
34
6 ESTADO DEL ARTE
Sobre el campo problemico causado por la levadura BrettanomycesDekkera en la
industria viniacutecola se han realizado bastante investigaciones a nivel de
caracterizacioacuten de la levadura los factores fisicoquiacutemicos que favorecen el
crecimiento de la levadura meacutetodos de prevencioacuten y control evaluacioacuten de
dantildeos sensoriales en diferentes tipos de vinos formacioacuten de compuestos fenoacutelicos
en los diferentes tipos de vino otros compuestos no fenoacutelicos asociados al
ldquocaraacutecter Brettrdquo teacutecnicas de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera
evaluacioacuten de la teacutecnicas de control e inhibicioacuten de dicha levadura desarrollo de
nuevos medios de deteccioacuten y aislamiento de la levadura relacioacuten entre la
levadura BrettanomycesDekkera con las otras levaduras presentes en el vino
entre otros
Seguacuten estas investigaciones se analizan aquellas que pueden aportar datos
importantes para el desarrollo del trabajo que se quiere realizar y se tiene en
cuenta sus metodologiacuteas conclusiones recomendaciones y comentarios
Entre las importantes para el planteamiento de este trabajo se menciona el trabajo
realizado por la Universidad Politeacutecnica de Madrid Espantildea el cual analiza
algunas de las caracteriacutesticas maacutes relevantes de este geacutenero de levaduras su
crecimiento en bodega factores fisicoquiacutemicos que favorecen su crecimiento y
desarrollo en el vino los defectos sensoriales que presenta en los vinos y estudia
algunas de los meacutetodos fiacutesicos para el control de BrettanomycesDekkera en vino
35
(clarificacioacuten filtracioacuten amicrobica proteiacutenas clarificantes anhiacutedrido sulfuros
dimetil dicarbonato Aditivos)47
Para conocer maacutes sobre la levadura en condiciones de barrica y almacenamiento
se revisa el articulo elaborado en el Departamento Teacutecnico Guserbiot La rioja
Espantildea en este artiacuteculo se describe brevemente su metabolismo y su ecologiacutea en
las bodegas Igualmente se comparan las teacutecnicas utilizadas en los laboratorios
para su deteccioacuten y cuaacuteles son las limitaciones de los diferentes meacutetodos
Finalmente se analizan las estrategias desarrolladas para su eliminacioacuten de las
bodegas y se dan una serie de recomendaciones para su control48
El instituto de fermentaciones Industriales Consejo superior de investigaciones
cientiacuteficas Juan de Cierva Madrid Espantildea en el cual se revisa la formacioacuten de
etilfenoles (4 etil-fenol 4 etil guayacol) en vinos tintos anejos Los factores
fisicoquiacutemicos que favorecen el crecimiento de la levadura no deseada
BrettanomycesDekkera las teacutecnicas usadas para la detectar la presencia de esta
levadura en vinos ( Revisioacuten microscoacutepica fluorescente remocioacuten de aacutecidos
grasos de su membrana teacutecnicas moleculares como PCR y electroforesis) y de
control (Proteiacutenas fining Fining con gelatina liquida filtracioacuten variables
fisicoquiacutemicas adicioacuten de aditivos procedimientos de altas presiones
manipulacioacuten geneacutetica) con esta investigacioacuten se concluye que la combinacioacuten y el
uso de las numerosas teacutecnicas pueden ayudar a la prevencioacuten y reduccioacuten de la
levadura BrettanomycesDekkera 49 Este trabajo muestra las muacuteltiples opciones
47
A Morata S Benito F Palomero F Calderoacuten y J A Suaacuterez-Lepe Ecologiacutea y prevencioacuten de
BrettanomycesDekkera durante la elaboracioacuten y crianza de vinos tintos Revista enoacutelogos (Editada por la
Federacioacuten Espantildeola de Asociaciones de Enoacutelogos y Periodistas Asociados) No 50 paacuteg 1-12 Madrid Espantildea
48 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 20-
24 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
49 R Suarez JA Suarez-Lepe A Morata F Calderon 2006 The production of ethyl phenols in wine by yeasts
of the genera Brettanomyces and Dekkera A review Journal Food Chemistry No 102 pag 10-21 Madrid
Espantildea
36
existentes en el control y prevencioacuten de la levadura mencionada sin embargo deja
claro que la mayoriacutea de estas opciones son costosas y no de faacutecil adquisicioacuten para
una pequentildea industria
El anaacutelisis sensorial ha sido de los aspectos maacutes estudiados al respecto de
BrettanomycesDekkera una de estas investigaciones fue realizada en Centre
Europeacuteen des Sciences du Goucirct en Talence Francia en el cual se evaluaron 50
vinos bordeaux sensorialmente para demostrar la complejidad del ldquoCaraacutecter Brett‟‟
al cual se unen otros compuestos aromaacuteticos ademaacutes de los fenoacutelicos como acido
isobutirico e isovalerico en este tipo de vino debido a sus caracteriacutesticas
fisicoquiacutemicas50
De los meacutetodos de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera los medios
selectivos son muy populares es por esto que el Laboratorio de Microbiologiacutea
Departamento de Botanica e Engenharia Biologica Instituto Superior de
Agronomia Lisboa Portugal realizo un trabajo en el cual se pretendia desarrollar
un medio selectivo o diferencial capaz de aislar la levadura
BrettanomycesDekkera del vino y de la cadena productiva del vino con el fin de
detreminar la relacioacuten entre esta levadura y los compuestos 4-etilfenol y 4 etil-
guayacol51 otro estudio realizado para la deteccioacuten de dicha levadura fue
realizado en la Escola Superior de Biotecnologiacutea Universidade Catoacutelica
Portuguesa el desarrollo de un simple procedimiento compatible con las rutinas
50 Andrea Romano a Marie Claire Perello a Aline Lonvaud-Funel Gilles Sicard Gilles de Revel2008 Sensory
and analytical re-evaluation of lsquolsquoBrett characterrdquo Journal Food Chemestry No 114 pag 15-19 Talence
France
51 N Rodrigues G Gonccedilalves S Pereira-da-Silva M Malfeito-Ferreira and V Loureiro2001 Development
and use of a new medium to detect yeasts of the genera DekkeraBrettanomyces Journal of applied microbiology No 90 pag 588-599Lisboa Portugal
37
usadas en las vineras para la deteccioacuten de BrettanomycesDekkera en vino y en
maquinarias52
En el laboratorio de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas Alcohoacutelicas de la
Universidad de Zagreb se ha trabajado anteriormente en el desarrollo de medio
solido selectivo con pruebas de diferentes concentraciones de los compuestos
como resultados se encuentra una buen relacioacuten entre las concentraciones de los
compuestos sin embargo como recomendaciones se encuentran la falta de
antibioacutetico para evitar contaminacioacuten por bacterias probar con diferentes fuentes
de carbono para comparacioacuten de tiempo de crecimiento positivo y un monitoreo
diario en el medio53
Los compuestos aromaacuteticos que libera la presencia de BrettanomycesDekkera
estaacute asociada a los compuestos 4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinilfenol y 4
viniguayacol a partir de esto los centros de investigacioacuten han hondado en la
identificacioacuten de dichos compuestos relacionados en la enologiacutea y especialmente
con BrettanomycesDekkera a partir de eso el Departamento de Quiacutemica
Universidad de La Rioja Espantildea este estudio presenta un meacutetodo basado en el
uso de Cromatografiacutea de Gas y micro extraccioacuten en fase solida para el anaacutelisis
cuantitativo de 4-etilfenol 4-etil guayacol 4-vinilfenol 4-vinilguayacol
Demostrando la existencia de un efecto matriz en el anaacutelisis de compuestos
responsables del ldquocaraacutecter Brettrdquo en vino Este nuevo meacutetodo fue
satisfactoriamente aplicado a cierto nuacutemero de vinos tintos comerciales vinos
52
JA Couto A Barbosa and T Hogg 2005 A simple cultural method for the presumptive detection of the yeasts BrettanomycesDekkera in wines Letters in Applied Microbiology No 41 pag 505-510 Porto
Portugal
53 Serkovic Dubravka Gracin Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac
Brettanomyces bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet pag 1-117 ZagrebCroatia
38
blancos y roseacute Este meacutetodo puede ser una alternativa para evitar el efecto matriz
en muestras de vino54
De acuerdo con este tema en la jornada cientiacutefica del 99 el grupo de investigacioacuten
enoloacutegica se estudio la formacioacuten de sustancias volaacutetiles por 13 cepas de S
cerevisiae con buenas aptitudes enoloacutegicas inoculadas individualmente en un
mosto homogeacuteneo de la variedad airen fermentado en las mismas condiciones
de aireacioacuten y a temperatura controlada55
54
C Pizarro N Perez-del-Notario JM Gonzalez-Saiz 2007 Determination of Brett character responsible
compounds in wines by using multiple headspace solid-phase micro extraction Journal of Chromatography
No 1143 pag 176-181 La Rioja Espantildea
55 E Pueyo P Hidalgo K Fernaacutendez y P Martiacuten-Aacutelvarez 1999 Anaacutelisis de compuestos volaacutetiles en vinos
obtenidos con distintas cepas de Saccharomyces cerevisiae Aplicacioacuten de la teacutecnica de microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientificas 99 Grupos de Investigacion Enologica Zaragoza Espana
39
7 MATERIALES Y METODOS
A continuacioacuten se presentan materiales y meacutetodos para la investigacioacuten
Este proyecto fue realizado en su gran mayoriacutea en las instalaciones de la
Universidad de Zagreb en la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos
(PBF) Laboratorios del Departamento de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas
Alcohoacutelicas ubicado en la ciudad de Zagreb Croacia
Los anaacutelisis fisicoquiacutemicos del vino tinto Babic fueron realizados en los
laboratorios de VINOLAB ubicado en Zagreb Croacia
71 MEDIO SOLIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera
711 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Autoclave de laboratorio
Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa Etanol peptona extracto de levadura
agar cicloheximida acido cumaacuterico ampicilina)
Balanza electroacutenica de precisioacuten
Microscopio oacuteptico
712 Metodologiacutea
Basados en estudios anteriores realizados en el laboratorio para el desarrollo de
medio solido selectivo para BrettanomycesDekkera (Serkovic Dubravka Gracin
40
Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac Brettanomyces
bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet Universidad de Zagreb pag 1-
117 Zagreb Croacia) se evaluaron las recomendaciones mencionadas en dicha
investigacioacuten para la mejoriacutea y desarrollo de otros medios soacutelidos selectivos
Se usoacute como base el medio YPD (Yeast Peptone Dextrose) el cual estaacute
compuesto de la siguiente forma 20gL peptona 10 gl extracto de levadura 20 gl
de agar56 este medio es selectivo para levaduras pero no es selectivo entre ellas
Es necesario el uso de una fuente de carbono para la levadura
BrettanomycesDekkera de acuerdo a la teoriacutea y revisando la tabla 1 (Relacioacuten de
los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) y seguacuten
facilidades de disponibilidad en el laboratorio se utiliza glucosa la cual es
utilizable por entre 75-100 de las cepas de BrettanomycesDekkera seguacuten la
tabla mencionada anteriormente
Esta fuente de carbono (Glucosa) fue probada en una concentracioacuten de 20 gL
Cicloheximida fue probada a 30 mgL para inhibir Saccharomyces en el medio y
darle mayor selectividad para Brettanomyces Dekkera Se antildeade acido p-
cumarico en una concentracioacuten de 100 mgL como precursor para la formacioacuten
del compuesto 4 etilfenol caracteriacutestico de la levadura BrettanomycesDekkera
Para inhibir bacterias en el medio se usa ampicilina a 10 mgL esta se agrega
despueacutes de realizada la esterilizacioacuten y cuando la temperatura del medio este
igual o menor a 40C El pH del medio se ajusto a 5
Paralelamente se crea el medio con Etanol como fuente de carbono en una
concentracioacuten de 6 o 60 mlL con la misma concentracioacuten de los otros
compuesto como cicloheximida 30mgL acido cumarico 100mgL 20 gL peptona
10 gL de extracto de levadura 16gL de agar Este medio se crea como
56
Concentraciones preestablecidas en el laboratorio de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas alcoholicas
41
comparativo para determinar cual fuente de carbono es la maacutes utilizada por la
levadura Brettanomyces bruxellensis para su reproduccioacuten Seguacuten la teoriacutea (ver
tabla 1) el etanol es utilizado por entre 25-75 de las cepas de
BrettanomycesDekkera pero es el azuacutecar que se encuentra en mayor
concentracioacuten presente en los vinos tintos aproximadamente 130 gl57
Estos medios fueron debidamente esterilizados para eliminar cualquier
microorganismo o espora presente en este Este procedimiento se realizo por el
meacutetodo de combinacioacuten de altas temperatura y presioacuten (Autoclave 121 C a 1034
kPa)
Se usaron colonias de BrettanomycesDekkera aisladas anteriormente de vinos
contaminados y guardas para investigaciones en el Departamento de Tecnologiacutea y
Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos
Universidad de Zagreb Croacia
Los medios fueron monitoreados visualmente todos los diacuteas y se toman
observaciones de macroscoacutepicas y microscoacutepicas Se comparan estos dos medios
en teacuterminos de rapidez de crecimiento de la levadura y selectividad Estas
muestras fueron incubadas a 28C por 10 diacuteas
La prueba fue realizada por duplicado en diferentes tiempos
57
Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
42
72 MEDIO LIacuteQUIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera
721 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Frascos de vidrio esteacuteriles
Autoclave de laboratorio
Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa peptona extracto de levadura
cicloheximida acido cumarico ampicilina etanol)
Microscopio oacuteptico
Balanza electroacutenica de precisioacuten
722 Metodologiacutea
En el mercado para enologiacutea existen medio liacutequidos selectivos para la deteccioacuten
de BrettanomycesDekkera en vinos sin embargo estos son de difiacutecil accesibilidad
por sus elevados precios es por esto que se desarrolla un medio liquido selectivo
para dicha levadura en el laboratorio del Departmaneto de Tecnologiacutea y Anaacutelisis
de Bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia
Para este medio se toma como base el medio selectivo con Glucosa como fuente
carbono desarrollado anteriormente sin usar agar para mantener el medio en su
estado liquido
43
La composicioacuten de este medio liacutequido es la siguiente
20 gL Glucosa
20 gL peptona
10gL extracto de levadura
30mgL de cicloheximida
100mgL acido p-cumarico
10 mgL ampicilina
Estos compuestos fueron medidos en una balanza electroacutenica de precisioacuten se
antildeade 250 ml de agua destilada y se mezcla constantemente se pasa a proceso
de esterilizacioacuten en autoclave a 120C y 1034 KPa por 45 minutos
De esta forma se asegura la usencia de microorganismos yo esporas en el
medio Despueacutes de bajar la Temperatura a 40C se agrega a la mezcla ampicilina
en una concentracioacuten de 10mgL
En frascos de vidrio esteacuteril se agrega 40 ml de medio liacutequido y diferentes
cantidades iniciales de levaduras BrettanomycesDekkera fueron inoculadas al
respectivo medio el primer frasco tiene una cantidad de 106 ceacutelulasml el segundo
tiene 104 ceacutelulasml el tercero tiene 102 celulasml y el cuarto con una cantidad
aproximada de 25 ceacutelulasml Estas cantidades estaacuten basadas en estudios
anteriores para medios liacutequidos selectivos en levaduras58
58 J Ungar A M James P W Muggleton H F Pegler y E G Tomich1950 The Cultivation of
Haemophilus pertussis in Partially Defined Liquid Media Journal of General Microbiology No 4
pag 345-359 Greenford
44
Este medio liacutequido inoculado fue inspeccionado diariamente visualmente revisioacuten
de turbidez microscoacutepicamente y olfativamente para deteccioacuten de olores del
ldquocaraacutecter Brettrdquo
Los diacuteas fueron contabilizados para determinar resultados positivos en estos
ensayos
73 INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN
VINO TINTO DE LA REGION DE DALMACIA CROACIA
731 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Medio selectivo solido para BretanomycesDekkera
Medio selectivo Liquido para BrettanomycesDekkera
Quiacutemicos de laboratorio (Dioxido de Azufre (SO2) Antibrettreg Glucosa)
Vino Babic 2007
Anallizador infrarojo Bacchius II microdom
732 Metodologiacutea
Con los medios desarrollados (solido y liquido) se quiere conocer el efecto del
dioacutexido de azufre (SO2) y el producto Antibrettreg en la levadura
BrettanomycesDekkera presente en el vino tinto de la regioacuten de Dalmacia
Con las herramientas que se tienen en el laboratorio del departamento de
tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia se quiere
determinar la influencia de estos productos en la levadura BrettanomycesDekkera
presente en vino tinto croata de la regioacuten de Dalmacia Babic
45
El primer paso es adaptar la levadura al vino tinto croata (Babic) para esto se
inoculan 20 colonias de BrettanomycesDekkera en 500 ml de vino se antildeadioacute
glucosa en una concentracioacuten de 2gL y se oxigena la mezcla Para este paso de
adaptacioacuten se dejan las muestras de 1 a 2 diacuteas a temperatura ambiente (20C)
Despueacutes de este periodo se revisa microscoacutepicamente la presencia positiva de
BrettanomycesDekkera en los 500 ml de vino en los que se estaba haciendo el
paso de adaptacioacuten en Babic al comprobar su presencia positiva se procede a
mezclar los 500 ml de vino contaminado con BrettanomycesDekkera con los 3
Litros de vino Babic que se disponen para esta prueba
Estos 3 litros de vino tinto Babic contaminado con la levadura
BrettanomycesDekkera se reparten en 8 frascos de vidrios esteacuteriles al siguiente
diacutea se toman dos frascos para agregar cada uno de los compuestos a evaluar
(SO2 y Antibrettreg)
Para SO2 se toman dos frascos uno de 600ml y uno de 100ml se agrega una
concentracioacuten de 40 mgl
Para el producto AntiBrettreg se toman cuatro frascos dos de 600 ml y dos de 100
ml seguacuten especificaciones del producto y la alta poblacioacuten de
BrettanomycesDekkera en las muestras se adiciono la maacutexima concentracioacuten de
AntiBrettreg a las muestras la cual fue de 40 gHl
Estas muestras se dejaron a temperatura ambiente simulando condiciones de
almacenamiento del vino en barricas temperatura aproximada de 20C evitando el
contacto con la luz solar y evitando movimientos fuertes Esto se mantuvo por 15
diacuteas que fue el tiempo de duracioacuten del experimento
Con el vino restante se mantuvo en las mismas condiciones de almacenamiento
de los demaacutes para hacer un paralelo de comparacioacuten
Previamente se analizaron las caracteriacutesticas del vino sin contaminar por medio
del analizador infrarrojo Bacchus II microdom antes de agregar los compuestos
46
SO2 y AntiBrettreg y despueacutes se volvioacute a realizar el anaacutelisis para determinar los
efectos de estos compuestos en el vino y asiacute mismo al de control
74 DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN
EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO
MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE
741 Materiales
Cromatografo de Gas HP5890 Serie II
Microextractor de fase solida (SPME)
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Quiacutemicos de laboratorio (p-cresolAcetaldehido Propanol diacetil etil-
acetato i-butanol acido aceacutetico i-amil-alcohol n-amil lactato de etilo
acetato amil metiacutelico 1-hexanol etil-hexanol linalol nerol citronelol
geraniol 2-feniletanol octanoato de etilo 4-etilfenol 2-feniletil acetato 4-
etilguaiacol)
Vino Tinto Babic
Agua destilada
742 Metodologiacutea
El meacutetodo fue desarrollado anteriormente en el Departamento de Tecnologiacutea y
Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos de
la Universidad de Zagreb Croacia Y despueacutes de modificaciones fue utilizado en el
desarrollo del trabajo El meacutetodo utilizado es descrito a continuacioacuten
47
Cromatografo de gas HP 5890 SERIES II
Programa HP-chem
a) Condiciones para analisis SPME-GC
Muestra diluida 5050 con adicion de estandar interno (p-cresol1mgl)
25ml de la muestra diluida con mezcla continua a temperatura ambiente
Tiempo de adsorcion 30 minutos
SPME es colocado en la muestra para la adsorcion durante el tiempo
previsto
b) Condiciones para el Cromatografo de gas (GC)
La columna usada en este experimento es RTXreg-5 (Restec USA sn 210627)
30m id=025mm 025μm
Gas portador Nitrogeno
Flujo del Nitrogeno 5 mlmin
Temperatura del inyector 240 C
Temperatura del detector 250 C
Temperaturas programadas 35 C5 min 150 C 34 Cmin 180 C
10Cmin 190 C 5 Cmin
Se conocen los resultados del cromatografiacutea de gases (ver tabla 10) y se hacen
necesarias varias correcciones del meacutetodo y algunas pruebas con unos
compuestos para determinar realmente su tiempo de retencioacuten en este tipo de
vino Se deben comprobar tiempos de retencioacuten
48
8 DISCUSIOacuteN Y RESULTADOS
81 RESULTADOS PARA EL DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO
Tabla 2 Medio Selectivo con Glucosa como fuente de carbono para
BrettanomycesDekkera en incubacioacuten por 5 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten
microscoacutepica
1 Negativo Negativo - No se realiza
2 Negativo Negativo - Presencia de levaduras
3 Negativo Negativo - Presencia de
Levaduras
4 Aparicioacuten de
algunas colonias
Negativo Transparente Presencia de levaduras
5 Colonias definidas Positivo-
Fenoles
Amarillo Presencia positiva de
BrettanomycesDekkera
49
Este medio tiene alto grado de selectividad para levaduras con un tiempo de
crecimiento de aproximadamente 5 diacuteas en 28C lo que lo hace raacutepido gracias al
antibioacutetico (ampicilina) que hace parte de la composicioacuten del medio no hay
presencia de bacterias Se hace confiable para resultados positivos de levaduras
BrettanomycesDekkera debido a que las levaduras Saccharomyces fueron
inhibidas con el compuesto cicloheximida su selectividad fue comprobada por
revisioacuten microscoacutepica macroscoacutepica y sensorial
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con glucosa como fuente de carboacuten son las
siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
50
Tabla 3 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono para Brettanomyces Dekkera en
incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica
1 Ninguno Negativo - -
2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras y
bacterias
9 Diminutas
colonias
transparentes
Negativo Transparentes Presencia de levaduras y
algunas bacterias
10 Positivo Positivo-
Fenoacutelicos
Amarillo Presencia de levaduras
BrettanomycesDekkera y
bacterias
El medio selectivo para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de
carbono tambieacuten es selectiva entre levaduras ya que solo se identifico la levadura
BrettanomycesDekkera en este sin embargo se evidencia una presencia de otro
microorganismo presuntamente bacteria ya que este medio no contiene agente
antibacteriano (ampicilina) Es necesaria la adicioacuten de ampicilina en una
concentracioacuten de 10mgl para inhibir la presencia de bacterias
Este medio presenta un tiempo maacutes prolongado para mostrar crecimiento de la
levadura BrettanomycesDekkera aproximadamente 10 diacuteas
51
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las
presentadas en el medio selectivo con glucosa como fuente de carbono y son las
siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
52
Tabla 4 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono y adicioacuten de ampicilina para
Brettanomyces Dekkera en incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica
1 Ninguno Negativo - -
2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
9 Diminutas
colonias
transparentes
Negativo Transparentes Presencia de levaduras
10 Positivo Positivo-
Fenoacutelicos
Amarillo Presencia de levaduras
BrettanomycesDekkera
El efecto de la ampicilina sobre el medio selectivo con etanol como fuente de
carbono fue el esperado inhibioacute completamente el crecimiento de colonias
bacterianas en el medio el tiempo de crecimiento de la levadura y presencia de
aromas fenoacutelicos fue el mismo de 10 diacuteas en incubacioacuten de 28C
53
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las
presentadas anteriormente y son las siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
82 RESULTADOS PRUEBAS MEDIO LIQUIDO
Tabla 5 Influencia de la concentracioacuten de levaduras BrettanomycesDekkera en el
tiempo necesario para detectar la produccioacuten de 4-etil-fenol en medio liquido
Nuacutemero de ceacutelulas ml
(concentracioacuten final)
Tiempo necesario para obtener resultados
positivos (diacuteas)
1 Experimento
32x106 le 3
3 X 104 3
33x102 7
40 No detectado
2 Experimento
43x106 le3
39x104 le3
37x102 8
62 No detectado
54
El nuacutemero de ceacutelulas de levadura de BrettanomycesDekkera fue contabilizado
usando contador de ceacutelulas Chamber
Los aromas fenoacutelicos son difiacuteciles de detectar debido al fuerte olor que tiene el
medio liquido caracteriacutestico de sus componentes esto dificulta la identificacioacuten del
ldquocaraacutecter Brettrdquo en especial cuando las concentraciones de
BrettanomycesDekkera no son elevadas Ademaacutes de los olores fenoacutelicos otros
compuestos volaacutetiles se detectan tales como acido aceacutetico y olores oxidativos
tambieacuten producido por la levadura BrettanomycesDekkera
En la inspeccioacuten visual se detecta alta turbidez en el medio Se compara con un
medio sin presencia de BrettanomycesDekkera
En las muestras con mayor concentracioacuten de la levadura es maacutes notoria la
turbidez Despueacutes de 3 diacuteas se presenta un precipitado blanco en todas las
muestras de altas concentraciones
La revisioacuten microbioloacutegica se realiza diariamente para determinar el nuacutemero de
ceacutelulas y la presencia positiva de la levadura a evaluar
Entre los dos experimentos realizados con el medio liquido el tiempo que se
demoro en detectar compuestos fenoacutelicos fue muy similar entre ellos
dependiendo del nuacutemero de ceacutelulas en el medio en mayores concentraciones el
tiempo de deteccioacuten fue menor
Hay que sentildealar que BrettanomycesDekkera debe alcanzar una concentracioacuten
miacutenima (denominada poblacioacuten criacutetica) de 103 UFCml para comenzar a liberar etil
fenoles Por debajo de esta concentracioacuten la levadura seriacutea metaboacutelicamente
activa pero no produciraacute compuestos alterantes a niveles detectables esto se ve
reflejado en los resultados en los que las concentraciones de ceacutelulas son muy
bajas
55
Estos resultados se comparan con los resultados dados en el medio solido Los
dos medios muestran altos grados de selectividad hacia la levadura
BrettanomycesDekkera y similar comportamiento para el crecimiento de dicha
levadura
En el medio liacutequido cuando hay altas concentraciones de BrettanomycesDekkera
el tiempo de deteccioacuten del microorganismo es menor que con el medio solido pues
en el liacutequido es aproximadamente 3 diacuteas y en el soacutelido son 5 diacuteas
83 RESULTADOS DE LA INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE
(SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO DE LA REGION DE
DALMACIA CROACIA
El vino fue analizado antes de la adicioacuten de los compuestos quiacutemicos a evaluar y
15 diacuteas despueacutes de adicioacuten para ver la reaccioacuten de este frente a SO2 y Antibrettreg
estas caracteriacutesticas se determinaron con el equipo de laboratorio Bacchus II
Microdom localizado en el laboratorio Vinolab doo Zagreb Croacia Los
resultados se muestran en la tabla
Tabla 6 Resultados de las muestras de vino inoculados con la levadura BrettanomycesDekkera
durante 15 diacuteas Comparativos con los diferentes compuestos
CFUml
Vino Day 1 Day 4 Day 10 Day 15
Control 130E+04 800E+03 700E+03 500E+03
Control 800E+03 640E+03 700E+03 280E+03
SO2 110E+04 400E+02 400E+02 67
SO2 900E+03 380E+03 270E+03 183
Antibrett 140E+05 920E+04 140E+04 400E+03
Antibrett 210E+05 181E+05 160E+04 900E+03
Antibrett 120E+05 990E+04 120E+04 100E+03
Antibrett 230E+05 204E+05 300E+03 200E+03
56
Tabla 7 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 antes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o
Antibrettreg Diacutea 0
Alcohol
()
Acidez Total
(gr Aci
Tartaacuterico L)
Acidez volaacutetil
(Aci
AceacuteticoL)
Densidad
(grml)
Azuacutecar residual
(grl)
Extracto
seco
(grl)
Acido
Laacutectico
(grl)
Glicerol
(grl)
Taninos
(grl)
Acetato
(grl)
1473
525
083
09928
473
332
164
799
305
117
1471
522
084
09927
479
329
162
786
299
116
Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
Tabla 8 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 despueacutes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o
Antibrettreg Diacutea 15
Alcohol
()
Acidez Total
(gr Aci
Tartaacuterico L)
Acidez volaacutetil
(Aci
AceacuteticoL)
Densidad
(grml)
Azuacutecar residual
(grl)
Extrac
to seco
(grl)
Acido
Laacutectico
(grl)
Glicerol
(grl)
Taninos
(grl)
Acetatos
(grl)
Control
1414
565
107
09935
436
364
177
827
259
136
Control
1415
556
108
09936
420
365
170
824
256
137
SO2
1456 543 108 09932 476 369 167 803 281 125
SO2
1457
542 108 09933 472 370 170 804 271 124
Antibrett 1454 533 106 09933 448 371 175 813 277 125
Antibrett 1455 534 105 09933 460 372 171 809 282 124
Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
57
Figura 4 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en el vino de control para
evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas
El comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en la prueba por
duplicado en el vino de control fue muy similar pues con el tiempo esta levadura
deja de reproducirse y va muriendo cuando las condiciones ya no son aptas para
su desarrollo debido a que la mayoriacutea de su fuente de carbono (Glucosa) esta
consumida sin embargo esta levadura no llega a su desaparicioacuten total lo que
representa uno de los mayores problemas en la elaboracioacuten del vino
Esta levadura tiene un metabolismo lento y el factor tiempo es un requisito
fundamental para su desarrollo este experimento se empezoacute con una alta
poblacioacuten de BrettanomycesDekkera (130 x 104 UFCml y 8 x 103 UFCml
respectivamente) y durante el transcurso del tiempo la poblacioacuten fue disminuyendo
debido a la perdida de las condiciones necesarias para la reproduccioacuten
58
Figura 5 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de SO2 en
concentracioacuten de 40 mgl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas
El SO2 tuvo un comportamiento efectivo y raacutepido contra las colonias de
BrettanomycesDekkera La poblacioacuten de esta levadura se redujo de forma
significativa entre el diacutea primero y el cuarto se encontroacute una diferencia porcentual
de 96 en la primera prueba y del 60 en la de duplicado al diacutea 15 ya la
poblacioacuten era casi nula pasando raacutepidamente de un numero por encima de la
poblacioacuten critica de la levadura BrettanomycesDekkera a un numero lt103 UFCml
siendo muy eficaz y raacutepido en el manejo de produccioacuten
Este compuesto ademaacutes de favorecer la extraccioacuten de los compuestos fenoacutelicos y
de su actividad antioxidante al inhibir la accioacuten de las polifenoloxidasas a dosis
adecuadas de un maacuteximo de 50gl inhibe la multiplicacioacuten bacteriana y de
levaduras
59
Figura 6 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de
Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo
de 15 diacuteas
Figura 7 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de
Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo
de 15 diacuteas
El compuesto Antibrettreg en la primera prueba tanto como en el duplicado tuvo su
mayor tiempo de reduccioacuten de UFCml entre los diacuteas 4-10 con una diferencia
porcentual de 91 en comparacioacuten con el diacutea cuarto al decimo a diferencia de
60
SO2 el cual presenta la gran disminucioacuten de colonias entre los primeros diacuteas de
agregarse el producto
El tiempo para que la poblacioacuten de la levadura llegara a la cantidad menor a la de
la poblacioacuten critica es mucho mayor que la del compuesto SO2 sabiendo que esta
poblacioacuten debe ser lt103 UFCml
El compuesto Antibrettreg puede tardarse 4-10 diacuteas en representar una reduccioacuten
de UFCml significativa en dicho tiempo puede representar grandes peacuterdidas
nutricionales y altos costos de produccioacuten para la fabricacioacuten
Figura 8 Comportamiento del contenido de alcohol en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin adicioacuten)
hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
BrettanomycesDekkera estaacute presente en vinos de alto contenido alcohoacutelico
aproximadamente entre 125 a 14 pues esta levadura toma a etanol como
fuente de carbono y este vino (Babic) procede de uvas muy maduras las cuales
presentan mayor cantidad de azuacutecares residuales (como glucosa y fructosa y
otras pentosas residuales)
138
14
142
144
146
148
Alcohol
Day 0 Day 15
61
Analizando el comportamiento del vino durante el experimento de 15 diacuteas sin
compuestos quiacutemicos y con SO2 y Antibrettreg a partir de las caracteriacutesticas
iniacuteciales que se determinaron seguacuten el equipo BACCHUS analizador infrarrojo se
presenta en general una reduccioacuten del contenido alcohoacutelico de este vino pero se
ve una mayor reduccioacuten en el vino de control el cual redujo en un 394 su
contenido alcohoacutelico desde el dia 0 hasta el diacutea 15 este vino no tiene ninguacuten
compuesto contra la levadura BrettanomycesDekkera y por su elevada presencia
en los 15 diacuteas de experimento consumioacute esta cantidad de etanol
Mientras en el vino que conteniacutea SO2 tras 15 diacuteas de tratamiento se vio una
reduccioacuten de alcohol de 1 ya que este compuesto redujo la cantidad de
BrettanomycesDekkera en los primeros diacuteas de tratamiento previniendo su
reproduccioacuten y protegiendo el contenido alcohoacutelico del vino Babic 2007
En los vinos de prueba con Antibrett reg la reduccioacuten alcohoacutelica se dio en un
porcentaje de 122 un poco maacutes alta que con SO2 y mucho maacutes baja en
comparacioacuten del vino de control este compuesto tambieacuten previno la gemacioacuten de
la levadura evitando la perdida de etanol en el vino sin embargo como este
compuesto duro mas en este proceso de eliminar BrettanomycesDekkera se
produjo una mayor peacuterdida alcohoacutelica
62
Figura 9 Comportamiento del contenido de acidez volatil en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin
adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
Debido a la presencia de oxigeno en los frascos la acidez volaacutetil aumento pero no
significativamente en las muestras No hubo grandes diferencias entre las
muestras con compuestos y las de control por lo que se deduce que estos
compuestos no ayudan a evitar esta acidez Esta acidez tan alta puede dantildear la
calidad del vino de forma casi irreparable Pero el factor oxigeno es de los maacutes
controlados en la produccioacuten de vinos
la alteracioacuten del aumento de la acidez volaacutetil no estaacute relacionada con la levadura
BrettanomycesDekkera sino a la presencia de oxigeno en el almacenamiento el
oxigeno fue usado en esta prueba para promover condiciones apropiadas para el
desarrollo de la levadura
002040608
112
Acidez Volatil
Day 0 Day 15
63
Figura 10 Comportamiento del contenido de Acido Acetico en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin
adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
Brettanomyces Dekkera son productores de aacutecido aceacutetico y elevan el contenido
de los vinos anormalmente en condiciones de anaerobiosis En condiciones de
aerobiosis producen concentraciones bajas o nulas de aacutecido aceacutetico
Este acido aceacutetico al igual que los fenoles afecta el sabor y el perfil olfativo del
vino tinto este efecto es tambieacuten producido por la levadura
BrettanomycesDekkera vemos en los resultados el gran crecimiento de este
compuesto en el vino control el cual no tenia compouestos en contra de
BrettanomycesDekkera lo que produjo este aumento significativo del acido aceacutetico
en comparacioacuten con estos que teniacutean SO2 y Antibrettreg entre ellos la diferencia en
este compuesto es muy reducida y no significativa pues estos compuestos no
permitieron la gemacioacuten de esta levadura y esta no produjo este acido en esa gran
cantidad
A este compuesto se le atribuye el olor y sabor a vinagre del vino tinto un defecto
muy comuacuten y poco agradable para el consumidor
105110115120125130135140
Acido Acetico
Day 0 Day 15
64
Figura 11 Comportamiento del contenido de Azucares reductores en vino Babic 2007
desde el diacutea 0 (sin adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en
comparacioacuten con el vino de control
BrettanomyesDekkera utiliza los azucares residuales como fuente de carbono
para su crecimiento en el vino este es el factor maacutes importante para su desarrollo
y este es el que determina en cierto caso la cantidad de levaduras de
BretanomycesDekkera presente en las graficas se determina claramente que en
el vino de control donde la cantidad de esta levadura es muy alta 15 diacuteas despueacutes
de empezar las pruebas la cantidad de azucares reductores es muy baja y ha
bajado en un porcentaje de 10 mientras que el vino que tiene SO2 bajo la
cantidad de azucares reductores en un 042 y el vino que tiene el compuesto
Antibrettreg redujo su nivel de azucares reductores en 462
38
4
42
44
46
48
5
Azucares Reductores
Day 0 Day 15
65
84 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE
CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON
EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID
PHASE
Tabla 10 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en
vino Babic 2007 con el meacutetodo propuesto
Compuesto Tiempos de
retencioacuten (min)
Acetaldehiacutedo 1437
Propanol 3759
Diacetil 4202
Etil-acetato 4523
i-butanol 6232
Acido Aceacutetico 7840
i-amil alcohol 11740
n-amil 13489
lactato de etiacutelico 15741
acetato amil metiacutelico 17796
1-hexanol 19101
etil-hexanol 24456
Linalol 30370
2-feniletanol 32768
p-cresol 33522
octanoato de etilo 34226
4-etilfenol 37100
2-feniletil acetato 32769
4-etilguayacol 39704
4 vinilfenol 40529
decanoato de etilo 42117
Refirieacutendose a estos resultados es necesaria la creacioacuten de soluciones estaacutendar
para determinar tiempos de retencioacuten con el meacutetodo y si es necesario ajustes a
este
66
Tabla 11 Soluciones estaacutendar para compuestos en vinos tintos Croatas
MODEL 0
(en volumen de 100 ml en 40 Etanol)
Compuesto Pureza Cantidad
(g)
Concentracioacuten (gl)
Acetaldehiacutedo 099 1623 160677
Propanol 0995 13849 137718
Diacetil 098 01071 104958
Etil-acetato 0995 30172 3002114
i-butanol 099 15016 1486584
Acido Acetico 0995 0 0
i-amil alcohol 099 20116 1991484
n-amil 098 15442 1513316
lactato de etilio 098 00507 049686
acetato amil metilico 098 01028 100744
1-hexanol 098 00367 035966
etil-hexanol 098 00308 029876
Linalol 097 00288 027936
Nerol 097 00311 030478
Citronelol 098 0031 03038
Geraniol 098 15803 1548694
2-feniletanol 098 00402 039396
4-etilfenol 098 00812 078764
octanoato de etilo 097 00597 059103
2-feniletil acetato 099 00315 031185
4-etilguayacol 098 00803 079674
Fuente Laboratorio de anaacutelisis e investigacioacuten de bebidas Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea
de Alimentos Universidad de Zagreb Zagreb Croacia 2009
Las soluciones estaacutendar se realizan teniendo como referencia las cantidades de
estos compuestos en los vinos tintos croatas datos suministrados por el Doctor
Leo Gracin en concentraciones de gl a partir de este dato y teniendo en cuenta
67
la pureza de los compuestos que se teniacutean en el laboratorio de anaacutelisis e
investigacioacuten de bebidas se crean las soluciones estaacutendar Ejemplo
Solucioacuten estaacutendar para 4 etil-fenol en un volumen de 100 ml
Con estas soluciones estaacutendar se realizo el tiempo de retencioacuten para corroborar el
meacutetodo Los resultados de esto fueron tiempos de retencioacuten diferentes a los del
meacutetodo primero con el que se realizaron los ensayos y a partir de esos resultados
se ajusto el meacutetodo con el que se trabajo
68
Tabla 12 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en
vino Babic 2007 con el meacutetodo modificado
Compuesto Tiempos de
retencioacuten (min)
Acetaldehiacutedo 1542
Propanol 4046
Diacetil 4733
Etil-acetato 4807
i-butanol 6659
Acido Acetico 8343
i-amil alcohol 12123
n-amil 13866
lactato de etilio 16072
acetato amil metilico 18336
1-hexanol 19447
etil-hexanol 24835
Linalol 31831
2-feniletanol 33305
p-cresol 33703
octanoato de etilo 34571
4-etilfenol 37724
Citronelol 38326
Nerol 38576
2-feniletil acetato 39012
Geraniol 39944
4-etilguayacol 40271
4 vilifenol 41168
decanoato de etilo 42657
69
DIA 0
Se coloca ISTD a todas las muestras respectivas para poder determinar
cantidades de los compuestos aromaacuteticos
Se realiza la cromatografiacutea de gas al vino Babic 2007 antes de ser inoculado con
BrettanomycesDekkera
Tabla 13 Resultados de la cromatografiacutea de gas del vino Babic 2007
Compuesto Tiempo de retencioacuten
min
Cantidad
mgl
Acetaldehiacutedo 1542 0
Propanol 4046 0
Diacetil 4733 37215204
Etil-acetato 4807 0
i-butanol 6659 0
Acido Aceacutetico 8343 2817465
i-amil alcohol 12123 16799019
n-amil 13866 26
lactato de etiacutelico 16072 10983961
acetato amil metiacutelico 18336 0185196
1-hexanol 19447 264655
etil-hexanol 24835 0158751
Linalol 31831 0
2-feniletanol 33305 4235560
p-cresol 33703 1
octanoato de etilo 34571 0152412
4-etilfenol 37724 00581345
Citronelol 38326 00439729
Nerol 38576 00344799
2-feniletil acetato 39012 00407983
Geraniol 39944 0
4-etilguayacol 40271 0
4 vilifenol 41168 0
Decanoato de etilo 42657 00190144
70
Basados en los compuestos aromaacuteticos que brinda el ldquoCaraacutecter Brettrdquo se van a
analizar detalladamente los siguientes aromas 4-Etilfenol 4-Etilguayacol 4-
Vinylfenol
Figura 12 Compuestos aromaticos en vino tinto Babic sin estar contaminado con la levadura
BrettanomycesDekkera
El vino a analizar esta por debajo de las concentraciones consideradas como
perjudiciales para el aroma del vino tinto (El umbral sensorial del 4-etilfenol es de
230 μgl y el del 4-etilguaiacol es de 47 μgl) pues posee una concentracion de
58microgL de 4etilfenol 0 microgL de 4 etilguayacol y 0 microgL de vinylfenol
841 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGUacuteN TEMPERATURAS
DE ALMACENAMIENTO
0
02
4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinylfenol
Vino 00581345 0 0
C (
mg
L)
Vino Babic 2007 Dia 0
71
Tabla 14 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el
ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 20C por 4 diacuteas Prueba por duplicado
MUESTRAS INCUBADA A 20C
Compuesto Day 1
Amount
(mgL)
Day 2
Amount
(mgL)
Day 3
Amount
(mgL)
Day 4
Amount
(mgL)
4-etilfenol 0260244 017294 0177547 020156
4-etilfenol 0260244 0245915 0204542 0262499
4-etilguayacol 0 0 0 0
4-etilguayacol 0 0 0 0
4 vinilifenol 1107096 781349 685317 460323
4 vinilifenol 1107096 1297465 621324 693225
72
Figura 13 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
BrettanomycesDekkera es la levadura responsable de la produccion de 4-etil-
fenol compuesto asociado con olores caracteristicos a ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 00581345 0260244 0172935 0177547 020156
C (
mg
L)
4 etilfenol
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 00581345 0260244 0245915 0204542 0262499
C (
mg
L)
4 etilfenol
73
caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo dantildeando la calidad sensorial del vino tinto Babic la
produccioacuten de este compuesto en esta muestra realizada por duplicado fue
ascendente y tuvo incremento muy grande en el primer dia de almacenamiento y
en el transcurso de los siguientes cuatro diacuteas se mantuvo relativamente estable lo
cual no concuerda con el comportamiento tiacutepico de esta levadura quien tiene un
crecimiento lento e incrementa la produccioacuten de fenoles con su gemacioacuten esto
genera muchas dudas sobre el buen funcionamiento del equipo GC o de la
estabilidad de las levaduras BrettanomycesDekkera en este almacenamiento
Figura 14 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar prueba por duplicado
002040608
1
Vino Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0 0 0
4 etilguayacol
002040608
1
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0 0 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
74
Presencia negativa de 4 etil guayacol durante todo el almacenamiento
probablemente las condiciones de almacenamiento y el medio no dieron lugar al
desarrollo de este compuesto el cual se considera menos conflictivo que el 4-etil-
fenol
Figura 15 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
Estos resultados tambieacuten dejan dudas del normal comportamiento de dicha
levadura pues indican que la levadura no convirtioacute este compuesto en etilfenol
0
2
4
6
8
10
12
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 110709781349685317460323
4 vinylfenol
0
2
4
6
8
10
12
14
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
Series1 0 11071 12974 62132 69322
C (
mg
l)
4 Vinylfenol
75
durante el almacenamiento caracteriacutestica que solo la levadura
BrettanomycesDekkera puede realizar se ve que las concentraciones de
vinylfenoles son mucho mas altas que las de fenoles lo que nos deja determinar
que la poblacioacuten de BrettanomycesDekkera es muy baja y existen otras levaduras
productoras de vinylfenoles en este tipo de vino en las condiciones de
almacenamiento dadas para estas pruebas
Tabla 16 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el
ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 28C por 4 diacuteas
MUESTRA 2 INCUBADA A 28C
Compuesto Day 1
Amount
(mgL)
Day 2
Amount
(mgL)
Day 3
Amount
(mgL)
Day 4
Amount
(mgL)
4-etilfenol 0260244 019612 0186614 019932
4-etilfenol 0260244 020576 0214917 0193554
4-etilguayacol 0 014304 0223836 0
4-etilguayacol 0 002287 00529832 0
4 vinilifenol 1107096 787068 665182 397847
4 vinilifenol 1107096 284389 00204392 0
76
Figura 16 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar
El desarrollo de este compuesto en el diacutea 1 fue significativo y luego relativamente
estable el comportamiento fue similar en las pruebas de diferentes temperaturas
de almacenamiento para este compuesto el cual es el maacutes problemaacutetico en la
industria viniacutecola
0
005
01
015
02
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 005813019932018661019611019932
4 etilfenol
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 005813 019355 021491 020576 026024
4 etilfenol
77
Figura 17 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar
Los resultados de la prueba son poco confiables y no entendibles por lo que
podemos verificar que el GC no estaacute trabajando de forma adecuada para la
deteccioacuten del compuesto
0001002003004005006
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 Etilguayacol 0 0 0022 0053 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
0005
01015
02025
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0223 0143 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
78
Figura 18 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
El comportamiento de este compuesto en la prueba es muy irregular y poco
confiable
0
2
4
6
8
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 397847665182787068397847
4 vinylfenol
0
2
4
6
8
10
12
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 11071 28438 00204 0
4 vinylfenol
79
Figura 19 Comportamiento del compuesto 4 etilfenol durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
La concentracioacuten de 4 etil fenol fue mayor al cuarto diacutea almacenado a
temperatura ambiente de 20C pero este compuesto no tuvo una actividad notoria
de ascenso durante su almacenamiento como se esperaba lo que deja muchas
dudas sobre los resultados de este ensayo
0
05
1
15
2
25
3
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etil fenol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 20C
80
Figura 20 Comportamiento del compuesto 4 etil guayacol durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
Comportamiento anormal del compuesto no se ve tendencias de aumento o
disminucioacuten de este en ninguna de las pruebas no tiene un comportamiento
regular pues se esperaba que la levadura BrettanomycesDekkera
descarboxinizara el compuesto 4-vinilguaiacol y aumentar las concentraciones de
4-etilguaiacol esta reaccioacuten no se hizo notoria en los compuestos aromaacuteticos
seguacuten lo determino el Cromatografo de Gas (GC)
0
005
01
015
02
025
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3
C (
mg
L)
4 etil guayacol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 20C
81
Figura 21 Comportamiento del compuesto 4 Vinyl fenoll durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
La no presencia de este compuesto en el vino original demuestra las baja o casi
nula presencia de la levadura BrettanomycesDekkera al diacutea primero este
compuesto incrementa de forma notoria en las muestras debido a la presencia de
acido cumaacuterico en el medio ya que sufre su carboxilacion convirtieacutendose en 4 vinyl
fenol sin embargo su comportamiento no fue regular y presento problemas de
lecturas
0
2
4
6
8
10
12
14
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
C (
mg
L)4 Vinyl fenol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 28C
82
9 CONCLUSIONES Y
RECOMENDACIONES
91 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO
Se desarrolloacute un medio selectivo soacutelido para BrettanomycesDekkera
accesible y faacutecil de elaborar
Se detectan colonias de la levadura BrettanomycesDekera en el agar
selectivo con glucosa como fuente de carbono en un lapso de 5 diacuteas en
incubacioacuten a 28C
El medio selectivo soacutelido con Glucosa como fuente de carbono fue maacutes
raacutepido y efectivo ya que toma 5 diacuteas para dar resultados positivos frente al
de Etanol como fuente de carbono el cual toma 10 diacuteas para mostrar
resultados positivos aunque ambos dieron resultados satisfactorios en la
selectividad de la levadura BrettanomycesDekkera
La levadura se adapto de forma satisfactoria a estos medios en
condiciones de almacenamiento propias para su desarrollo (28C)
Las colonias de la levadura BrettanomycesDekkera tiene un crecimiento
en estos medios soacutelidos de forma circular con topografiacutea convexa y borde
entero dimensiones 5-6 mm color Amarillo opacicidad oscuro
83
superficie lisa y suave siendo faacutecil de identificar y realizar los conteos
necesarios
El medio solido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten
de la levadura BrettanomycesDekkera en vino tinto es raacutepido econoacutemico
y uacutetil
El uso de azucares para fermentacioacuten de la levadura
BrettanomycesDekkera que Saccharomyces no puede fermentar para
mayor selectividad
Realizacioacuten de pruebas Bioquiacutemicas como meacutetodo raacutepido de selectividad
92 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DESARROLLO DEL MEDIO LIacuteQUIDO
Se desarrollo un medio selectivo liquido para BrettanomycesDekkera
accesible y faacutecil de elaborar
Este medio mostroacute resultados positivos de la presencia de
BrettanomycesDekkera en un lapso de tiempo menor (3 diacuteas) que con el
medio solido (5 diacuteas) en caso de que el nuacutemero de ceacutelulas de la levadura
BrettanomycesDekkera sea mayor a la poblacioacuten critica (103)
Cuando la poblacioacuten de ceacutelulas de la levadura BrettanomycesDekkera es
menor a la poblacioacuten critica el tiempo de identificacioacuten de esta levadura por
medio liquido es muy prolongado puede tomar maacutes de 10 diacuteas o incluso no
detectarlo
84
Los compuestos quiacutemicos usados para el desarrollo del medio liacutequido no
son los adecuados para este tipo de medios donde los resultados positivos
son olfativos pues estos compuestos emiten fuertes olores que confunden
los olores caracteriacutesticos del caraacutecter Brett
El medio liquido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten
de altas concentraciones de la levadura BrettanomycesDekkera en vino
tinto es raacutepido econoacutemico y uacutetil
93 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg
EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE DALMACIA
CROACIA
Este trabajo mostroacute que el dioacutexido de azufre (SO2) tiene buenos resultados
en contra de la levadura BrettanomycesDekkera en concentraciones
normales de 40mgl concentracioacuten en la que se trabaja este compuesto en
los vinos tintos
En Europa el dioacutexido de azufre es usado de forma tradicional en gran
nuacutemero de alimentos y especialmente en vinos sin embargo y a pesar de
su uso regulado se busca la sustitucioacuten de este o su maacutexima reduccioacuten
para hacer de este producto maacutes sano para las personas no tolerantes a
este tipo de compuestos sin embargo seguacuten el trabajo realizado en
comparacioacuten con el producto Antibrettreg el SO2 es maacutes eficaz en el control
85
de la levadura ayudando a evitarla y eliminarla de la cadena productiva del
vino tinto
Gracias a sus caracteriacutesticas el vino tinto Babic es muy vulnerable a la
levadura BrettanomycesDekkera pero a su vez se puede tratar faacutecilmente
con productos como SO2 y Antibrettreg aunque es maacutes efectivo contra
BrettanomycesDekkera el dioacutexido de azufre (SO2)
Antibrettreg es una buena opcioacuten para el control de BrettanomycesDekkera
para evitar el uso de productos alergenicos como SO2
94 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN
EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO
MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE
Al terminar la primera prueba con anaacutelisis en cromatografiacutea a gas y el SPME
queda como resultados
Es necesario repetir la prueba
No se determina el efecto de los estaacutendares internos sometidos a tiempos
de almacenamiento en temperaturas de 20C y 28C lo que puede dar falsos
resultados de cantidades de compuestos
86
Se debe crear un medio maacutes apto para el desarrollo de la levadura y un
control diario de crecimiento ( agregar maacutes Glucosa en caso de que se
haya consumido toda controlar presencia de Bacterias y otros
microorganismos que no se deseen en el medio)
Es necesario control de aromas con panel sensorial para determinar el
umbral de deteccioacuten en este vino
Control de crecimiento por medio solido Selectivo para
BrettanomycesDekekra conteo de colonias presentes en el vino inoculado
y su desarrollo durante almacenamiento a diferentes temperaturas
La segunda prueba no fue posible realizarla por dantildeos en el equipo de
cromatografiacutea de gas (GC)
87
ANEXOS
11
89
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
Gilliland R Brettanomyces I Occurrence characteristics and effects on
beer flavor J Inst Brew 1961
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Saccharomyces cerevisiae Aplicacioacuten de la teacutecnica de micro extraccioacuten en
fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientiacuteficas 99 Grupos de
Investigacioacuten Enoloacutegica Zaragoza Espantildea
93
11
GRACIAS es una palabra corta para todo lo que quiero expresar a todos aquellos que
hicieron parte de este suentildeo hecho realidadhellip
A Dios y a la virgen Auxiliadora por llevarme de su mano cada diacutea de mi carrera en cada
momento alegre y en cada momento difiacutecil fueron mi fortaleza
A mis papitos por hacer de mi estudio una realidad por su sacrificio y apoyo desinteresado y
sincero
A mi Hermanito por ser mi fortaleza mi ejemplo y mi amigo incondicional
A mi familia Blanco y Urrea por su compantildeiacutea durante esta etapa
A mi facultad (Decano Dr Camilo Rozo Dra Patricia Jimeacutenez y mis profesores) por
ensenarme mi profesioacuten y aportar lo mejor de ustedes para mi formacioacuten personal
A mis asesores de Tesis (Ing Patricia Chaparro y Dr Sc Leo Gracin) por su guiacutea y
colaboracioacuten oportuna
A mis queridos amigos quienes siempre han estado a mi lado en las dificultades y en las
alegriacuteas (Ingrid Mafe Cami G Cami R Harold Pipe Karla Andreacutes T Diego G)
A IAESTE en alianza con el ORI por hacer posible mi intercambio y poder hacer mi tesis en el
maravilloso paiacutes de Croacia
A Croacia por ser mi segundo hogar por abrirme sus puertas y su corazoacuten por brindarme
tan maravillosas personas en mi camino
Croatia Thank you for being my second home for opening your doors and your heart to me
and give me the opportunity to meet so many wonderful people
To my boss my teacher my mentor and specially my friend Leo
To the faculty of food technology and Biotechnology and the department of technology
and analysis of beverages for give me the opportunity to give all my knowledge to the
project and learn a lot more
To all the amazing people I met during this experience (Igor Karin Natka Josip Ana Matija
Daniel Pz Szilvia Dini Daniela Lidija Sanja and everybody else who I had the pleasure to
meet in this great trip) for give me the best of your hearts
I only have one thing to say hellipTHANK YOU
Solo me queda una palabra por decirhellipGRACIAS
DETERMINACION DE LAS CARACTERISTICAS AROMATICAS DE
BrettanomycesDekkera AISLADO EN VINO TINTO BABIC DE LA REGION DE
DALMACIA CROACIA
DIANA ROCIO URREA BLANCO
Trabajo de grado para optar al tiacutetulo de Ingeniera de Alimentos
Asesores de investigacioacuten
LEO GRACIN
PhD Senior Scientific Assistant
PATRICIA CHAPARRO GONZALES
Ingeniera de Alimentos
UNIVERSIDAD DE LA SALLE- UNIVERSITY OF ZAGREB
FACULTAD DE INGENIERIA DE ALIMENTOS- FACULTY OF FOOD
TECHNOLOGY AND BIOTECHNOLOGY
DEPARTAMENTO DE INGENIERIA DE ALIMENTOS - DEPARTMENT OF
TECHNOLOGY AND ANALYSIS OF BEVERAGES
BOGOTA COLOMBIA ndash ZAGREB CROATIA
2009
CONTENIDO
paacuteg
RESUMEN ----------------------------------------------------------------------------------------------------- 6
ABSTRACT ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 7
INTRODUCCION -------------------------------------------------------------------------------------------- 8
1 MARCO TEORICO -------------------------------------------------------------------------------------- 10
11 REPRODUCCION -------------------------------------------------------------------------------------- 10
111 GEMACIOacuteN MULTILATERAL --------------------------------------------------------------------------------- 12
112 GEMACIOacuteN POLAR ------------------------------------------------------------------------------------------- 12
113 FISIOacuteN ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 12
114 PSEUDOMYCELIUM ------------------------------------------------------------------------------------------ 13
12 TAXONOMIA ------------------------------------------------------------------------------------- 13
121 DEKKERABRETTANOMYCES ------------------------------------------------------------------------- 14
13 CARACTERISTICAS FISIOLOGICAS ----------------------------------------------------- 16
132 IDENTIFICACIOacuteN DE BRETTANOMYCESDEKKERA ----------------------------------------------- 21
14 MEDIOS SOacuteLIDOS SELECTIVOS ----------------------------------------------------------------- 21
15 DIOacuteXIDO DE AZUFRE (SO2) EN VINOS ---------------------------------------------------------- 23
151 FORMAS DEL DIOacuteXIDO DE AZUFRE (SO2) ---------------------------------------------------------------- 24
152 INHIBIDOR MICROBIANO ------------------------------------------------------------------------------------ 25
16 ANTIBRETTreg COMO ALTERNATIVA DE PREVENCIOacuteN Y ELIMINACIOacuteN DE
BRETTANOMYCESDEKKERA ------------------------------------------------------------------------------- 27
2 PROBLEMA -------------------------------------------------------------------------------------- 29
3 JUSTIFICACION -------------------------------------------------------------------------------- 31
4
4 OBJETIVOS ------------------------------------------------------------------------------------------------ 32
41 GENERAL ------------------------------------------------------------------------------------------------- 32
42 ESPECIacuteFICOS ---------------------------------------------------------------------------------------------- 32
5 ALCANCES --------------------------------------------------------------------------------------- 33
6 ESTADO DEL ARTE --------------------------------------------------------------------------- 34
7 MATERIALES Y METODOS ----------------------------------------------------------------- 39
71 MEDIO SOLIDO SELECTIVO PARA BRETTANOMYCESDEKKERA ------------------------- 39
711 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------------- 39
712 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------------ 39
72 MEDIO LIacuteQUIDO SELECTIVO PARA BRETTANOMYCESDEKKERA ------------------ 42
721 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------- 42
722 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------- 42
73 INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO DE
LA REGION DE DALMACIA CROACIA ------------------------------------------------------------- 44
731 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------- 44
732 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------- 44
74 DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO
BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE --- 46
741 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------------- 46
742 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------------ 46
8 DISCUSIOacuteN Y RESULTADOS --------------------------------------------------------------- 48
81 RESULTADOS PARA EL DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO ------------------- 48
82 RESULTADOS PRUEBAS MEDIO LIQUIDO -------------------------------------------- 53
83 RESULTADOS DE LA INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg
EN VINO TINTO DE LA REGION DE DALMACIA CROACIA ----------------------------------- 55
5
84 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN EL
VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID
PHASE --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 65
841 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGUacuteN TEMPERATURAS DE
ALMACENAMIENTO --------------------------------------------------------------------------------------------- 70
9 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES --------------------------------------------- 82
91 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA DESARROLLO DEL MEDIO
SOLIDO 82
92 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA DESARROLLO DEL MEDIO
LIacuteQUIDO ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 83
93 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA INFLUENCIA DE DIOXIDO
DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE
DALMACIA CROACIA ----------------------------------------------------------------------------------- 84
94 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA DETERMINACION DE
AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL
METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE ---------------------------------------------- 85
ANEXOS ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 87
6
RESUMEN Este estudio presenta el desarrollo y evaluacioacuten de simples meacutetodos para la deteccioacuten de
la levadura BrettanomycesDekkera en vino y su medio de produccioacuten con el uso de
medio solido y liquido selectivo ademaacutes se evaluacutea el efecto del Dioacutexido de Azufre SO2 y
AntiBrettreg en vino tinto de la regioacuten de Dalmacia Croacia El meacutetodo de deteccioacuten de
esta levadura emplea medios selectivos enriquecidos los cuales contienen Glucosa (20
grl) en comparacioacuten con Etanol (6ml l) como fuentes de carboacuten y energiacutea cicloheximida
(30 grl) para prevenir la presencia de Sachharomyces ampicilina (10 mgL) como
antibioacutetico para prevenir el crecimiento de bacterias y acido p-cumaacuterico (100 mgL) como
precursor de la produccioacuten de 4-etilfenol para el medio solido el uso de agar se realiza
en una concentracioacuten de 16 grL Despueacutes de la siembra realizada en los medios (solido y
liquido) de vino contaminado con la levadura BrettanomycesDekkera es monitoreado
diariamente micro y macroscoacutepicamente
Una muestra de vino tinto Babic de Croacia fue contaminado con colonias de la levadura
BrettanomycesDekkera y fue dividido en 8 muestras de las cuales 2 de estas fueron
monitoreadas como control sin adicioacuten de ninguacuten compuesto 2 con adicioacuten de dioacutexido de
azufre SO2 en una concentracioacuten de 40mgL y 4 de estos con AntiBrettreg en una
concentracioacuten de 40grHl El meacutetodo de este estudio se basa en la determinacioacuten del
comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en estas condiciones Este se
evaluoacute en teacuterminos de crecimiento de la citada levadura (UFCml) presentes en las
muestras y anaacutelisis fisicoquiacutemicos antes y despueacutes de 15 diacuteas de adicioacuten y monitoreo
7
ABSTRACT
This experiment presents the development and testing of a simple way to detect
BrettanomycesDekkera from wine and wine environments using selective media in solid
phase and liquid phase and the influence of Sulfur Dioxide (SO2) and Antibrett reg in red
wines from Dalmatian region The method of detection of this yeast employs selective
enrichment mediums These mediums contains glucose (20gl) and Ethanol (6) as
carbon and energy source cycloheximide (30 mgl) to prevent growth of Sachharomyces
ampicilin (10 mgl) to prevent growth of bacteria and p-coumaric acid (100 mgl) as a
precursor of the production of 4-etilphenol depending on the phase of the medium agar
compound is used in a concentration of 16 grl After putted on the medium wine
contaminated with BrettanomycesDekkera is monitored by micro and macro inspection
also with the liquid medium
A red wine from Dalmatian region was contaminated with BrettanomycesDekkera colonies
and divided in 8 different containers from these 8 containers we had two for control no
addition two with addition of Sulfur Dioxide (SO2) in a concentration of 40 mgl and four of
them with Antibrett reg in a concentration of 40gHl The method for this study is based in
following the behavior of the yeast BrettanomycesDekkera with these compounds in this
wine this behavior was monitored based in CFUml showing in the samples and physic
and chemical analysis before addition and 15 days after
8
INTRODUCCION
Las levaduras del geacutenero Brettanomyces o su forma telemoacuterfica (nombre que
reciben las especies que presentan reproduccioacuten sexual y en consecuencia
formacioacuten de esporas por meiosis) Dekkera fueron descritas por primera vez por
Claussen en 1903 en la produccioacuten de cerveza1
Este geacutenero se conoce desde hace tiempo como agente contaminante en la
industria cervecera de la sidra y de bebidas carbonatadas2 En la industria
enoloacutegica su descripcioacuten como alterante es maacutes reciente
Durante los antildeos 1950s muchos autores reportaron el aislamiento del genero
Brettanomyces en uvas francesas e italianas (Van der Walt y Van der Kerken
1958) Sin embargo en muchas regiones del mundo viniacutecola esta levadura no ha
sido identificada lo cual dificulta su deteccioacuten en materiales o productos
contaminadosEntre todos los microorganismos la levadura
BrettanomycesDekkera es una de las maacutes temidas por los vinicultores El
crecimiento y desarrollo de esta levadura causa alteraciones denominadas
ldquocaraacutecter Brettrdquo lo cual ocurre especialmente en vinos tintos3
1 Gilliland R Brettanomyces I Occurrence characteristics and effects on beer flavor J Inst Brew
1961
2 Deak T y Beuchat LR Handbook of spoilage yeast CRC Press Nova York 1996
3 Heresztyn T Archives of Microbiology 1986 Metabolism of phenolic compounds from
hydroxycinnamic acids by Brettanomyces yeast
9
El ldquocaraacutecter Brettrdquo produce un amplio espectro de sabores y aromas alterantes
entre los cuales estaacuten corral minerales tinta tabaco cuero faacutermacos y
ahumado estas alteraciones se le atribuyen a los compuestos 4-etilfenol y 4-
etiguayacol las cuales causan una supresioacuten de aromas atractivos en el vino
como de frutas y flores y perdida de sabores agradables para el consumidor como
acido salado amargo o picante 4
Esta levadura tiene distinto comportamiento seguacuten el tipo de vino al que esteacute
asociada pues cada tipo de vino tiene diferente composicioacuten de carbonos
nitroacutegenos vitaminas y minerales
Con este estudio se evaluacutea el comportamiento y caracterizacioacuten de la levadura
BrettanomycesDekkera en vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia con
el desarrollo de medios solido y liquido para la selectividad de la levadura
alteraciones aromaacuteticas del vino tinto Babic producidas por 4 etilfenol y 4
etilguayacol y el comportamiento de BrettanomycesDekkera en el vino al ser
tratado con Dioacutexido de azufre (SO2) comparativamente con tratamiento Antibrettreg
4 Boulton Singleton Bisson amp Kunkee 1996 Descripcioacuten de aromas fenoacutelicos
10
1 MARCO TEORICO
Las levaduras representan el grupo de microorganismos maacutes importante en la
industria viniacutecola porque sin Saccharomyces producir vinos de alta calidad seriacutea
imposible Ademas de Saccharomyces hay muchos otros geacuteneros y especies de
levaduras presentes durante la vinificacioacuten que afectan la calidad del vino positiva
o negativamente5
Las levaduras comprenden 39 geacuteneros y 350 especies Se identifican y clasifican
basaacutendose en caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas Entre los aspectos
morfoloacutegicos considerados se encuentran el tamantildeo y la forma de las ceacutelulas en
medios soacutelidos y liacutequidos especificados el modo de reproduccioacuten y si forma velo
en la superficie o sedimenta en un medio liacutequido Entre las caracteriacutesticas
fisioloacutegicas consideradas se encuentra si puede crecer (y fermentar) en un
determinado carbohidrato y si puede o no utilizar determinadas fuentes de
nitroacutegeno como los nitratos6
11 REPRODUCCION
Las levaduras son agrupadas en tres familias conocidas como
Saccharomycetaceae Sporobolomycetaceae y Cryptococcaceae Estas
5 H Erten June 2002 Relations between elevated temperatures and fermentation behavior of
Kloeckera apiculata and Saccharomyces cerevisiae associated with winemaking in mixed culture
World Journal of Microbiology and Biotechnology Volume 18 N 4 pag 1 Adana Turkey 6 Cerveceros de Argentina 2006 Levadura wwwcervezadeargentinacomararticuloslevadurahtm
11
representan el grupo de microorganismos entre bacterias y hongos respecto a su
tamantildeo de ceacutelula Este grupo es caracterizado por su forma de reproduccioacuten
vegetativa conocida como ldquogemacioacutenrdquo Bajo condiciones optimas una ceacutelula
madre puede gemar varias veces durante el periodo reproductivo Sin embargo
bajo estrictas condiciones de fermentacioacuten una levadura va a gemar solamente
entre tres o cuatro veces Aquiacute la disponibilidad de oxigeno la cual es necesaria
para la formacioacuten de precursores de la membrana de la ceacutelula limita la
replicacioacuten7
Estos microorganismos muestran varios tipos de gemacioacuten lo cual puede dar un
valor diagnostico Entre aquellas aisladas de fermentacioacuten y antildeejamiento del vino
se observan maacutes frecuentemente multilateral y gemacioacuten polar 8
La modalidad maacutes comuacuten es la gemacioacuten proceso asexual en el cual la ceacutelula
progenitora emite un conducto tubular desde la vacuola nuclear hacia un punto
perifeacuterico proacuteximo a la misma Entonces se forma en la direccioacuten del conducto
una pequentildea protuberancia en la superficie externa de la ceacutelula y el conducto
pasa atravesando la pared celular a dicha protuberancia la cual se ensancha
llenaacutendose con el material citoplaacutesmico y nuclear de la ceacutelula progenitora Cuando
el brote o yema formada llega a ser casi tan grande como la ceacutelula progenitora los
aparatos nucleares de ambas ceacutelulas se orientan de forma que sus centrosomas
respectivos equidisten del punto de unioacuten Al llegar este momento la ceacutelula madre
y la ceacutelula hija se separan y se inicia la formacioacuten de nuevas ymas En la
gemacioacuten normal no se forman tabiques de separacioacuten entre ceacutelula madre y
ceacutelulas hijas pero en algunos casos el proceso se inicia en la gemacioacuten y se
completa por divisioacuten con la separacioacuten definitiva de ambos individuos La ceacutelula
madura de puede producir por gemacioacuten durante el curso de vida un promedio de
7 Brinton M Miller and Warren Litsky PhD 1976 Industrial Microbiology Edi Mac Graw Hill United States
of America
8 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures
edi Springer second edition Fresno California United States of America
12
24 generaciones de ceacutelulas hijas Las yemas sucesivas se forman siempre en
sitios diferentes de la superficie de la ceacutelula9
111 Gemacioacuten multilateral
La gemacioacuten multilateral ocurre en el ldquohombrordquo o aacuterea de la levadura donde ocurre
la reproduccioacuten La gemacioacuten y ciclo de separacioacuten crea un problema para las
levaduras durante su fase fermentativa pues en este tiempo la ceacutelula madre se
reduce aproximadamente un medio Porque la siacutentesis de la membrana celular
ocurre bajo condiciones anaeroacutebicas lo que limita los ciclos asexuales
replicativos Como resultado la mayoriacutea de las fermentaciones se completan en la
fase estacionaria (no gemacioacuten) Un ejemplo de esta reproduccioacuten es
BrettanomycesDekkera10
112 Gemacioacuten Polar
A diferencia de la gemacioacuten multilateral la gemacioacuten polar puede ocurrir en uno o
dos polos En el caso de Kloeckera y Saccharomyces la gemacioacuten ocurre en
ambos polos aumentando la poblacioacuten de levaduras con forma de ldquolimoacutenrdquo 11
113 Fisioacuten
Esta reproduccioacuten es caracteriacutesticas del genero Schizosaccharomyces donde la
formacioacuten de la ceacutelula hija ocurre sin la reduccioacuten de la madre ceacutelula como en los
casos anteriores En este caso la formacioacuten de la microscoacutepica pared celular
ocurre entre la madre ceacutelula y la hija seguida por la separacioacuten12
9 Araya Pablo 2002 Reproduccioacuten de hongos unicelulares mediante gemacioacuten esporulacioacuten y
fisioacuten httphtmlrincondelvagocomreproduccion-asexualhtml
10 11 12 Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic
Publishers GmbH United States of America and Canada
13
114 Pseudomycelium
Cualquier fabricante de vinos ha tenido la oportunidad de notar la formacioacuten de
una peliacutecula en la superficie del vino Esto surge debido a la gemacioacuten repetida de
las levaduras oxidativas y fallas en el momento de la separacioacuten de la ceacutelula hija
de la madre Con el tiempo el lazo previo entre la madre ceacutelula e hija se ampliacutea
dando la impresioacuten de filamentos como si se tratase de mohos siendo que son
levaduras 13
12 TAXONOMIA
Para distinguir las levaduras que pueden producir ascoporas de aquellas que no
los micologistas usan doble taxonomiacutea para su clasificacioacuten Desafortunadamente
la nomenclatura para la combinacioacuten anamorfotelemorfo es frecuentemente
diferente Unos ejemplos de levaduras sexualasexual o telemorfoanamorfo son
DekeraBrettanomyces Metschnikowia pulcherrimaCandida pulcherrima
Hanseniaspora uvarumKloeckera apiculata Torulaspora delbruecki Candida
colliculosa 14
Sin embargo las levaduras son diferenciadas por los taxonomistas por asignacioacuten
de varios nombres de geacutenerosespecies varios vinicultores usan un sistema
informal para agrupar levaduras basadas en su morfologiacutea u otras caracteriacutesticas
Por ejemplo a Kloeckera apiculata se le refiere como ldquolevadura apiculadardquo
tiene forma de limoacuten Esta levaduras asi com muchas otras presentes en el mosto
de la uva como lo son Candida Cryptococcus Debaryomyces Hansenula
Issatchenkia Kluyveromyces Metschnikowia Pichia y Rhodotorula tambieacuten son
llamadas levaduras ldquonativasrdquo ldquonaturalesrdquo o ldquosalvajesrdquo por su origen el vintildeedo o en
13
Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers
GmbH United States of America and Canada
14 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
14
la vinera Algunos enoacutelogos han discutido contra el uso de estos teacuterminos porque
esta implicancia no sucede en todas las levaduras ya que estas son de alguna
forma ldquono-nativasrdquo o ldquono naturalesrdquo (Ej Saccharomyces o Brettanomyces) El
teacutermino ldquono Saccharomycesrdquo es maacutes comuacuten para nombrar aquellas levaduras
presentes en el mosto de la uva que no son del genero Saccharomyces15
Las levaduras encontradas despueacutes de la fermentacioacuten alcohoacutelica tambieacuten son
asignadas a un grupo informal Algunas veces las levaduras que conducen la
principal fermentacioacuten (Saccharomyces) son muchas veces llamadas ldquolevaduras
fermentativasrdquo basados en su metabolismo Durante su antildeejamiento algunas
levaduras (Candida Hansenula y Pichia) pueden crecer en la superficie en
presencia de oxigeno Esta peliacutecula superficial es comuacutenmente asociada a
deterioro del vino esta levadura se le conoce como ldquolevadura formadora de
peliacuteculardquo16
121 DekkeraBrettanomyces
La taxonomiacutea cientiacutefica sobre BrettanomycesDekkera ha cambiado en los uacuteltimos
antildeos Brettanomyces estaacute clasificado dentro de la misma familia que
Saccharomyces (familia Saccharomycetaceae) Actualmente dentro del geacutenero
Brettanomyces se aceptan cinco especies diferentes (B bruxellensis B
anomalus B custersianus B nanas y B naardenensis)17
Las teacutecnicas de biologiacutea molecular han demostrado que B intermedious B
lambicus B custerseii o D intermedia son sinoacutenimos de B bruxellensis por lo
que estas denominaciones han quedado en desuso Los microorganismos de este
geacutenero presentan dos formas una capaz de reproducirse sexualmente (Dekkera)
15
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
16 Kurtzman CP 1998 The industrial and agricultural significance of yeasts 4
th Edition Amsterdam
Holanda
17 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
15
y otra que lo hace asexualmente (Brettanomyces) Tambieacuten se llaman
respectivamente forma perfecta y forma imperfecta En algunos casos la forma
perfecta y la imperfecta reciben nombres diferentes como ocurre con B anomalus
y D anomala En otros casos el nombre es similar como las pertenecientes a la
especie bruxellensis que pueden parecer como D bruxellensis como B
bruxellensis o como BrettanomycesDekkera A efectos praacutecticos en la bodega
estos dos estados son similares Cuando vemos referencias a Brettanomyces
como contaminante en la mayor parte de los casos se refieren a
DekkeraBrettanomyces ya que este es el responsable de las alteraciones en el
vino18 y 19
La morfologiacutea celular de BrettanomycesDekkera es ojival o ciliacutendrica con
gemacioacuten multipolar en reproduccioacuten vegetativa Una de las caracteriacutesticas de
este geacutenero es su tamantildeo celular variable y la formacioacuten de filamentos19
18 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 23
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
19
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
16
Figura 1 Microfotografiacutea de cultivo de BrettanomycesDekkera a) Variabilidad morfoloacutegica y de
tamantildeo celular b) forma filamentosa
Fuente Lopez-Cordon Eva BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia wwwacenologiacom
Los defectos sensoriales asociados directamente a Brett aparecen
mayoritariamente en vinos tintos de calidad y las causas radican en la propia
fisiologiacutea del microorganismo Ademaacutes al ser una levadura de crecimiento muy
lento la alteracioacuten se presenta principalmente durante el almacenamiento y sobre
todo la crianza del vino habitual en los vinos tintos de gama alta En las barricas
de madera el microorganismo tiene a su disposicioacuten todo el sustrato y tiempo
suficiente para realizar su actividad La naturaleza porosa de la madera y su difiacutecil
limpieza contribuye a que las poblaciones existentes se mantengan incluso
despueacutes del lavado de la barrica Ademaacutes BrettanomycesDekkera tiene la
capacidad de degradar uno de sus componentes la celobiosa 20
13 CARACTERISTICAS FISIOLOGICAS
S cerevisiae y BrettanomycesDekkera tienen metabolismos similares muy
adaptados a las condiciones de vinificacioacuten Tras la fermentacioacuten alcohoacutelica S
cerevisiae es la levadura mayoritaria debido a que las condiciones nutricionales
20
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
17
del vino son muy estrictas (altas concentraciones de etanol y bajas
concentraciones de nutrientes) En este momento BrettanomycesDekkera
continuacutea creciendo gracias a que utiliza nutrientes que S cerevisiae no ha podido
consumir sobre todo algunos azuacutecares y fuentes de nitroacutegeno21
Una de las caracteriacutesticas que diferencia a BrettanomycesDekkera es la gran
diversidad de azuacutecares que puede fermentar (ver tabla de Relacioacuten de los
principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) La mayoriacutea de
las cepas pueden crecer utilizando trealosa y celobiosa azucares presentes en el
vino y no consumibles por S cerevisiae Otra de las ventajas que presenta frente
a S cerevisiae (y frente a la mayoriacutea de las levaduras) es que puede utilizar los
nitratos como fuente de nitroacutegeno Debido a que S cerevisiae soacutelo utiliza el
nitroacutegeno amoniacal y los aminoaacutecidos libres estos se consumen con relativa
rapidez Al final de la fermentacioacuten el nitroacutegeno moniacal es escaso y se favorece
el crecimiento de las levaduras que pueden utilizar otras fuentes de nitroacutegeno
Ademaacutes Brettanomyces puede crecer con concentraciones de fosfato diamoacutenico
tan bajas como 05gl o a partir de diversos aminoaacutecidos En resumen
BrettanomycesDekkera crece maacutes despacio que S cerevisiae es resistente a
concentraciones altas de alcohol puede utilizar otros azucares como fuentes de
energiacutea y nitrato como fuente de nitroacutegeno Esto explica que pueda reproducirse
cuando la fermentacioacuten alcohoacutelica ha terminado a partir de nutrientes no
consumibles por S cerevisiae y cuando no tiene competidores22
21
Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
22 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
18
Tabla 1 Relacioacuten de los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto
Fuente Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista
VINOTEQ N 38 pag 21 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
131 BrettanomycesDekkera y siacutentesis de fenoles volaacutetiles
El origen de los fenoles volaacutetiles estaacute relacionado con la actividad secuencial de
dos enzimas que descarboxilan los aacutecidos en hidroxiestirenos (vinilfenoles) que
19
son posteriormente reducidos a etilderivados (etilfenoles)23 como puede
observarse en la figura 2
Figura 2 Siacutentesis de etilfenoles de BrettanomycesDekkera
Fuente ACE revista de Enologia wwwacenologiacom
El primer paso de descaboxilacion de los aacutecidos hidroxicinamicos es comuacuten
tambieacuten en otros microorganismos como bacterias hongos y otras levaduras Sin
embargo el segundo paso reduccioacuten de vinilfenoles es caracteriacutestico de algunos
tipos de levaduras como Dekkera bruxelliensis D anomala Pichia guillermondi
Candida versarilis C halophila y C mannitofaciens24
Los fenoles volaacutetiles que se asocian al problema Brett en vinos son el 4-etilfenol y
el 4- etilguaiacol asiacute como sus precursores intermedios 4-vinilfenol y 4-
vinilguaiacol aunque estos uacuteltimos son menos importantes por ser muy reactivos y
raacutepidamente convertidos en etilfenoles por BrettanomycesDekkera o en su caso
23
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
24 Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
20
condensan con otras moleacuteculas como antocianos25 Los etilfenoles y
especialmente elevadas concentraciones de 4-vinilfenol en vinos se asocian con
aromas desagradables asociados a descriptores como ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de
caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo26
El umbral sensorial del 4-etilfenol es de 230 μg l-1 y el del 4-etilguaiacol es de 47
μgl Pese a su menor umbral sensorial el 4-etilguaiacol responde a descriptores
como ldquobaconrdquo o ldquoahumadordquo que a bajas concentraciones aportan complejidad por
lo que se puede considerar sensorialmente menos conflitivo que el 4-etilfenol 27
Figura 3 Defectos sensoriales producidos en el vino por BrettanomycesDekkera
Fuente Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
25 Morata A Goacutemez-Cordoveacutes M Calderoacuten F Suaacuterez J 2006 Effects of pH temperature and SO2 on the
formation of pyranoanthocyanins during red wine fermentation with two species of Saccharomyces Journal Food Microbiology No106 pag 4 Madrid Espana
26 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea 27 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
21
132 Identificacioacuten de BrettanomycesDekkera
Los Bioacutelogos usan sistemas de identificacioacuten basados en similitudes taxonoacutemicas
entre organismos dichas similitudes pueden ser morfoloacutegicas tipos capacidad de
produccioacuten de sustratos como azuacutecar yo nitratos caracteriacutesticas fisioloacutegicas y
bioquiacutemicas secuencia del material geneacutetico y respuestas inmunoloacutegicas28
En la industria viniacutecola es importante recurrir a diferentes tipos de pruebas para la
identificacioacuten de microorganismos una de estas y la maacutes realizada es la revisioacuten
del microorganismo bajo el microscopio Esta prueba brinda informacioacuten sobre la
morfologiacutea del microorganismo (cocos bacilos formas puntudas ojival entre
otros) tamantildeo (dimensiones) agrupaciones celulares (solas parejas triacuteos
grupos o cadenas) Sin embargo el uso del microscopio es una prueba raacutepida
para examinar mostos o vino pero no determina cantidades que muchas veces es
requerido para tratamientos de accioacuten otro de los inconvenientes es que los
microorganismos pueden variar su morfologiacutea en forma o tamantildeo dependiendo de
la edad y las condiciones de crecimiento por lo que puede no ser clara la
identificacioacuten de este29
14 Medios soacutelidos selectivos
Si se requiere de la confirmacioacuten del microorganismo este debe ser aislado del
vino para una caracterizacioacuten para esto se requiere de medios soacutelidos Cuando se
examina un microorganismo en un medio solido es importante revisar las
caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias (ver figura 4 Morfologiacuteas de colonias
en medios soacutelidos) Entre estas caracteriacutesticas estaacuten forma (circular irregular o
2829 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
22
rizada) tamantildeo (dimensiones estas normalmente se expresan en miliacutemetros)
topografiacutea (plano elevado convexo coacutencavo o embonado) presencia de
pigmentos opacidad (transparente traslucido u opaco) superficie (suave rugosa
lisa o aacutespero) bordes (entero ondulado crespo dentado rizado) o cualquier
cambio en el agar (color opacidad cambios en los indicadores de pH o CaCO3
respectivamente)30
Figura 4 Varias morfologiacuteas de crecimiento de colonias en medio solido
Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007
Gran nuacutemero de medios selectivos se han creado para la aislacioacuten deteccioacuten yo
conteo de levaduras provenientes de jugos de uva mostos o vinos El medio maacutes
utilizado en estos fines es YPD (Yeast Peptone Dextrose) pero dicho medio no
es selectivo entre levaduras y se usa comuacutenmente para el conteo de
Saccharomyces31 Las colonias empiezan a parecer con un periodo de incubacioacuten
30
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
31 Essia Ngang J Wolniewicz E Villa P2005 Stimulation of lactobacilli during alcoholic fermentation action
of sucrose hydrolysis by yeast Biotechnology letters No 8 pag 743 Amiens France
23
de 2 a 4 diacuteas a 22C a 25C Igualmente el agar de jugo de uva es no selectivo y
presenta faacutecil crecimiento de levaduras bacterias y mohos
Para la levadura Brettanomyces Dekkera se han elaborado diferentes medios
selectivos entre ellos el maacutes conocido es WL por sus siglas en ingles del
laboratorio que lo creo ldquoWallerstein Laboratoriesrdquo este medio contiene
cicloheximida compuesto selectivo para Brettanomyces e inhibe Saccharomyces
El punto criacutetico es encontrar la cantidad exacta de este compuesto para la
inhibicioacuten de las levaduras sin que afecte a BrettanomycesDekkera32
Ademaacutes del medio WL BrettanomycesDekkera puede ser cultivado en otros
medios selectivos como Brettanomyces medio A creado por Vilas en 1993
Brettanomyces medio B el cual contiene cicloeximida como agente selectivo
mientras que Brettanomyces medio C tiene cicloheximida y ampicilina este medio
fue creado por B Watson en 1998 Brettanomyces medio D fue creado
recientemente por Rodrigues en 2001 este medio es conocido como DBDM
(DekkeraBrettanomyces differential medium ) es un medio selectivo para
Brettanomyces en contra de Saccharomyces y otras levaduras este medio es el
maacutes utilizado en la vineras para caracterizacioacuten de BrettanomycesDekkera
actualmente33
15 Dioacutexido de azufre (SO2) en vinos
32
33
Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers
GmbH United States of America and Canada
24
El dioacutexido de azufre tambieacuten llamado oxido de azufre es un eficaz agente
conservante antioxidante y antimicrobiano en la industria viniacutecola34
Durante la vinificacioacuten SO2 ha representado histoacutericamente una herramienta muy
importante usada por los vinicultores para el control de crecimiento microbioloacutegico
Debido a preocupaciones por la salud del consumidor el uso de este producto ha
disminuido dramaacuteticamente con el posible riesgo de aumentar el riesgo
microbioloacutegico35
El actual liacutemite legal de SO2 en vinos en los Estados Unidos es de 350mgL una
concentracioacuten mucho mayor a la usada en la industria viniacutecola No obstante vinos
que contienen maacutes de 10mgL deben declarar este compuesto en la etiqueta
porque SO2 es un metabolito que las levaduras usan durante la fermentacioacuten Los
vinos siempre contienen algo de sulfitos aunque la adicioacuten no se realice durante el
proceso36
151 Formas del Dioacutexido de Azufre (SO2)
Una vez disuelto en agua el dioacutexido de azufre existe en equilibrio entre SO2
molecular (SO2H2O) bisulfito (HSO3) y sulfito (SO32-) Este equilibrio depende del
pH Ademaacutes de estar en equilibrio con el molecular y especies sulfito el bisulfito
tambieacuten existe en forma ldquolibrerdquo y en forma ldquoatadardquo Aquiacute la moleacutecula reaccionara
34
Orwine Eureka 2008Investigadores europeos buscan alternativas al dioxido de azufre en vinos
httpawprowordpresscom20081107investigadores-europeos-buscan-alternativas-al-dioxido-de-
azufre-en-el-vino
3536 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
25
con compuestos carbonilos (ej Acetaldehiacutedo) formando productos adicionales
como Acido Hydroxysulfonico 37
Ademaacutes de Acetaldehiacutedo algunas moleacuteculas presentes en el jugo de uva que
reaccionan con bisulfito son acido piruvico α-keto-glutaric dihidroxyacetona
diacetyl Pigmentos de antocianinas entre otros38
152 Inhibidor Microbiano
El sulfuro molecular es la forma antimicrobiana del dioacutexido de azufre La cantidad
de SO2 molecular presente en cualquier vino no se mide directamente La
concentracioacuten es calculada conociendo la concentracioacuten de SO2 libre y el pH del
vino basaacutendose en la siguiente foacutermula
Alternativamente la figura 5 Se puede utilizar como guiacutea para aproximar la
cantidad de SO2 libre necesitada a determinado valor de pH de valores entre 05 o
08 mgl de SO2 molecular 39
El SO2 inhibe microorganismos de varias formas incluyendo rupturas de puentes
bisulfitos en proteiacutenas y reaccionando con coofactores como NAD+ y FAD tambieacuten
reacciona con ATP
3739
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
38 Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi
Springer New York United States
26
Figura 5 Cantidades de SO2 libre a un pH determinado para obtener 05 o 08 mgl de SO2
molecular
Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007
La concentracioacuten de SO2 molecular necesario para prevenir el crecimiento de
microorganismos variacutea seguacuten vinojugo pH temperatura poblacioacuten densidad y
diversidad estado de crecimiento grado de alcohol entre otros factores Beech
1979 sugirioacute una adicioacuten de 08 mgl de SO2 molecular como la cantidad
necesaria del compuesto en vinos blancos de mesa para dar una reduccioacuten de
cerca de 104 UFCml de la poblacioacuten de diferente tipo de microorganismos en 24
horas Las diferencias que existen entre las levaduras y bacterias en base a la
27
sensibilidad a este compuesto son dadas a conocer por diferentes autores (Warth
1977 1985 Du Toit 2005 Davis 1988 Hood 1983)40
16 Antibrettreg como alternativa de prevencioacuten y eliminacioacuten de
BrettanomycesDekkera
Antibrettreg es un producto nuevo creado por Spindal SARL-Gretz - Armainvilliers
Francia Es una preparacioacuten enzimaacutetica para inactivar Brettanomyces y para
reducir olores producidos por fenoles volaacutetiles41
Antibrettreg es preparado a base de paredes celulares de levadura activados
enzimaacuteticamente que presentan elevadas propiedades adsorbentes frente al 4-
etilfeno y 4- etilguayacol compuestos asociados con olores desagradables en el
vino tales como sudor de caballo farmacia o barniz42
Antibrettreg inhibe la produccioacuten de la vinilreductasa que participa en la
transformacioacuten de los aacutecidos cinaacutemicos naturalmente presentes en los vinos en
los correspondientes derivados etilados responsables de los olores atribuidos a
BrettanomycesDekkera 43
40
Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi
Springer New York United States
41 Manual de instrucciones de producto Antibrett reg producido por Spindal SARL-Gretz -
Armainvilliers France
424344 AEB Group 2008 ANTIBRETT Preparado a base de paredes celulares de levadura para la inactivacioacuten
de Brettanomyces y la eliminacioacuten de los olores de estos productos httpwwwaeb-
groupcomimgsSPAGNOLODepliantANTIBRETT-lett-ESPpdf
28
El uso de Antibrettreg es efectivo incluso contra otros olores anoacutemalos como los
que se generan en las barricas sucias principalmente huacutemedas dantildeando la
calidad olfativa del vino44
29
2 PROBLEMA
La levadura BrettanomycesDekkera es una levadura de contaminacioacuten presente
en la mayoriacutea de industrias viniacutecolas en el mundo Afecta directamente la
produccioacuten y calidad sensorial de los vinos con el desarrollo de los compuestos 4
etilfenol y 4 etilguayacol los cuales dantildean el perfil olfativo del vino dando aromas
caracteriacutesticas a ldquoestablordquo ldquocuerordquo ldquosudor de caballordquo o ldquobarnizrdquo conocido como
ldquocaraacutecter Brettrdquo
Esta contaminacioacuten se da especialmente en los vinos tintos debido a sus
caracteriacutesticas de produccioacuten (fermentacioacuten crianza antildeejamiento) y sus
propiedades fisicoquiacutemicas (Grado alcohoacutelico pH Acidez total Acidez volaacutetil
entre otros)
En Croacia existe una gran produccioacuten de vinos tintos entre los cuales se
encuentra el vino tinto Babic proveniente de la isla de Hvar el cual es famoso por
ser un vino duro carnoso estructurado y casi sobre-maduro con un grado
alcohoacutelico que ronda los 15 vv siendo la primera denominacioacuten de origen que
se aproboacute en Croacia en el antildeo 1961 este vino es de gran importancia en la
regioacuten la mayoriacutea de sitios de elaboracioacuten son pequentildeas industrias que han sido
afectadas por el bdquocaraacutecter Brett‟ Muchas investigaciones se han realizado al
respecto de la levadura BrettanomycesDekkera pero se conoce muy poco sobre
sus efectos en el vino Babic debido a sus caracteriacutesticas particulares (alcohol
30
15 pH 35 Acidez total 520 gr Acido TartaricoL Acidez volaacutetil 08 gr Acido
AceticoL Azucar residual 47 grLt)45
La dificultad de la pequentildea industria para acceder a productos que lleven a la
identificacioacuten de la levadura mencionada y de esta manera conllevar a planes de
accioacuten contra el ldquocaraacutecter Brettrdquo es una de las grandes dificultades de la industria
vinera en este paiacutes en donde los productos para la industria enoacuteloga son
complicados y de alto precio para acceder a ellos y en consecuencia no se
realizan muchas de estas pruebas de deteccioacuten de BrettanomycesDekkera
llevando al mercado productos contaminados de baja calidad que inicialmente
podriacutea haber sido un vino de alta calidad debido a sus caracteriacutesticas uacutenicas y de
gran popularidad
45
Datos obtenidos en el laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
31
3 JUSTIFICACION
Actualmente Croacia cuenta con maacutes de 300 zonas vineras en las que se producen 67
de vino blanco 32 vino tinto y el restante 1 vino rosado De acuerdo a recientes datos
estadiacutesticos hay 650 km2 de vintildeedos en Croacia de los cuales 375 km2 son uvas con
indicacioacuten geograacutefica de origen que producen maacutes de 300 vinos y maacutes de la mitad de este
nuacutemero son vinos elaborados en microempresas con un total de 50000000 de botellas
de vino el 8 es vino superior 70 de calidad y el 22 es vino de mesa de produccioacuten
nacional46
Croacia es un fuerte productor de vino a nivel regional con sus diferentes variedades
propias (Merlot Plavac Dingač Postup Malvazija Pošip Kujundžuša Babic) pero dicha
produccioacuten ha sido fuertemente afectada por la presencia de la levadura
BrettanomycesDekkera trayendo consecuencias como perdidas de produccioacuten peacuterdida
de calidad sensorial del vino grandes peacuterdidas econoacutemicas y desprestigio a sus vinos de
denominacioacuten de origen
Es por esto que en este proyecto de investigacioacuten se busca una faacutecil y raacutepida
identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera causante del ldquocaraacutecter Brettrdquo con el
desarrollo de medios selectivos liquido y solido ademaacutes de opciones para el tratamiento
yo prevencioacuten de esta levadura en la cadena productiva comparativamente entre dioacutexido
de azufre (SO2 ) y Antibrettreg y la identificacioacuten de los aromas caracteriacutesticos del ldquocaraacutecter
Brettrdquo en el vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia
46
Hrvatski zavod za vinogradarstvo i vinasrtvo 2003 Pravilnik o vinu httpwwwhrzvvhrpropisihtm
32
4 OBJETIVOS
41 General
Caracterizar y evaluar el comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera
en teacuterminos de crecimiento y produccioacuten de aromas no deseados en vino tinto
Babic
42 Especiacuteficos
Desarrollar el medio solido y medio liacutequido selectivo para
BrettanomycesDekkera
Evaluar el comportamiento de la levadura en estos medios selectivos
Determinar la influencia del Dioacutexido de azufre (SO2) y el compuesto
Antibrettreg en la levadura BrettanomycesDekkera presente en vino tinto
Babic 2007
Identificar los compuestos aromaacuteticos producidos por Brettanomyces
bruxellensis en vino tinto Babic usando el meacutetodo ldquomultiple headspace
solid-phase microextraction (SPME)rdquo
33
5 ALCANCES
En este proyecto se pretende desarrollar un medio selectivo faacutecil de producir en
donde sea raacutepida la identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera en la
produccioacuten de vinos tintos se realizaran pruebas para corroborar el crecimiento de
esta levadura en el medio determinando el tiempo que esta levadura toma en
adaptarse en el medio y su comportamiento en este una vez comprobada su
adaptacioacuten al medio liquido se trabajara con el meacutetodo de cromatografiacutea de gas
(GC) y el uso de micro extraccioacuten en fase solida (SPME) para el anaacutelisis
cuantitativo de los compuestos volaacutetiles (4-etil-fenol 4-etil-guayacol4-vinilfenol y
4-vinil-guayacol) y posteriormente con el vino tinto Babic Ademaacutes se desea
comprobar la efectividad de los productos con que las vineras de Croacia inhiben
o eliminan la presencia de la levadura en los vinos tintos como lo son el producto
AntiBrettreg y el Dioacutexido de azufre (SO2)
34
6 ESTADO DEL ARTE
Sobre el campo problemico causado por la levadura BrettanomycesDekkera en la
industria viniacutecola se han realizado bastante investigaciones a nivel de
caracterizacioacuten de la levadura los factores fisicoquiacutemicos que favorecen el
crecimiento de la levadura meacutetodos de prevencioacuten y control evaluacioacuten de
dantildeos sensoriales en diferentes tipos de vinos formacioacuten de compuestos fenoacutelicos
en los diferentes tipos de vino otros compuestos no fenoacutelicos asociados al
ldquocaraacutecter Brettrdquo teacutecnicas de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera
evaluacioacuten de la teacutecnicas de control e inhibicioacuten de dicha levadura desarrollo de
nuevos medios de deteccioacuten y aislamiento de la levadura relacioacuten entre la
levadura BrettanomycesDekkera con las otras levaduras presentes en el vino
entre otros
Seguacuten estas investigaciones se analizan aquellas que pueden aportar datos
importantes para el desarrollo del trabajo que se quiere realizar y se tiene en
cuenta sus metodologiacuteas conclusiones recomendaciones y comentarios
Entre las importantes para el planteamiento de este trabajo se menciona el trabajo
realizado por la Universidad Politeacutecnica de Madrid Espantildea el cual analiza
algunas de las caracteriacutesticas maacutes relevantes de este geacutenero de levaduras su
crecimiento en bodega factores fisicoquiacutemicos que favorecen su crecimiento y
desarrollo en el vino los defectos sensoriales que presenta en los vinos y estudia
algunas de los meacutetodos fiacutesicos para el control de BrettanomycesDekkera en vino
35
(clarificacioacuten filtracioacuten amicrobica proteiacutenas clarificantes anhiacutedrido sulfuros
dimetil dicarbonato Aditivos)47
Para conocer maacutes sobre la levadura en condiciones de barrica y almacenamiento
se revisa el articulo elaborado en el Departamento Teacutecnico Guserbiot La rioja
Espantildea en este artiacuteculo se describe brevemente su metabolismo y su ecologiacutea en
las bodegas Igualmente se comparan las teacutecnicas utilizadas en los laboratorios
para su deteccioacuten y cuaacuteles son las limitaciones de los diferentes meacutetodos
Finalmente se analizan las estrategias desarrolladas para su eliminacioacuten de las
bodegas y se dan una serie de recomendaciones para su control48
El instituto de fermentaciones Industriales Consejo superior de investigaciones
cientiacuteficas Juan de Cierva Madrid Espantildea en el cual se revisa la formacioacuten de
etilfenoles (4 etil-fenol 4 etil guayacol) en vinos tintos anejos Los factores
fisicoquiacutemicos que favorecen el crecimiento de la levadura no deseada
BrettanomycesDekkera las teacutecnicas usadas para la detectar la presencia de esta
levadura en vinos ( Revisioacuten microscoacutepica fluorescente remocioacuten de aacutecidos
grasos de su membrana teacutecnicas moleculares como PCR y electroforesis) y de
control (Proteiacutenas fining Fining con gelatina liquida filtracioacuten variables
fisicoquiacutemicas adicioacuten de aditivos procedimientos de altas presiones
manipulacioacuten geneacutetica) con esta investigacioacuten se concluye que la combinacioacuten y el
uso de las numerosas teacutecnicas pueden ayudar a la prevencioacuten y reduccioacuten de la
levadura BrettanomycesDekkera 49 Este trabajo muestra las muacuteltiples opciones
47
A Morata S Benito F Palomero F Calderoacuten y J A Suaacuterez-Lepe Ecologiacutea y prevencioacuten de
BrettanomycesDekkera durante la elaboracioacuten y crianza de vinos tintos Revista enoacutelogos (Editada por la
Federacioacuten Espantildeola de Asociaciones de Enoacutelogos y Periodistas Asociados) No 50 paacuteg 1-12 Madrid Espantildea
48 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 20-
24 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
49 R Suarez JA Suarez-Lepe A Morata F Calderon 2006 The production of ethyl phenols in wine by yeasts
of the genera Brettanomyces and Dekkera A review Journal Food Chemistry No 102 pag 10-21 Madrid
Espantildea
36
existentes en el control y prevencioacuten de la levadura mencionada sin embargo deja
claro que la mayoriacutea de estas opciones son costosas y no de faacutecil adquisicioacuten para
una pequentildea industria
El anaacutelisis sensorial ha sido de los aspectos maacutes estudiados al respecto de
BrettanomycesDekkera una de estas investigaciones fue realizada en Centre
Europeacuteen des Sciences du Goucirct en Talence Francia en el cual se evaluaron 50
vinos bordeaux sensorialmente para demostrar la complejidad del ldquoCaraacutecter Brett‟‟
al cual se unen otros compuestos aromaacuteticos ademaacutes de los fenoacutelicos como acido
isobutirico e isovalerico en este tipo de vino debido a sus caracteriacutesticas
fisicoquiacutemicas50
De los meacutetodos de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera los medios
selectivos son muy populares es por esto que el Laboratorio de Microbiologiacutea
Departamento de Botanica e Engenharia Biologica Instituto Superior de
Agronomia Lisboa Portugal realizo un trabajo en el cual se pretendia desarrollar
un medio selectivo o diferencial capaz de aislar la levadura
BrettanomycesDekkera del vino y de la cadena productiva del vino con el fin de
detreminar la relacioacuten entre esta levadura y los compuestos 4-etilfenol y 4 etil-
guayacol51 otro estudio realizado para la deteccioacuten de dicha levadura fue
realizado en la Escola Superior de Biotecnologiacutea Universidade Catoacutelica
Portuguesa el desarrollo de un simple procedimiento compatible con las rutinas
50 Andrea Romano a Marie Claire Perello a Aline Lonvaud-Funel Gilles Sicard Gilles de Revel2008 Sensory
and analytical re-evaluation of lsquolsquoBrett characterrdquo Journal Food Chemestry No 114 pag 15-19 Talence
France
51 N Rodrigues G Gonccedilalves S Pereira-da-Silva M Malfeito-Ferreira and V Loureiro2001 Development
and use of a new medium to detect yeasts of the genera DekkeraBrettanomyces Journal of applied microbiology No 90 pag 588-599Lisboa Portugal
37
usadas en las vineras para la deteccioacuten de BrettanomycesDekkera en vino y en
maquinarias52
En el laboratorio de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas Alcohoacutelicas de la
Universidad de Zagreb se ha trabajado anteriormente en el desarrollo de medio
solido selectivo con pruebas de diferentes concentraciones de los compuestos
como resultados se encuentra una buen relacioacuten entre las concentraciones de los
compuestos sin embargo como recomendaciones se encuentran la falta de
antibioacutetico para evitar contaminacioacuten por bacterias probar con diferentes fuentes
de carbono para comparacioacuten de tiempo de crecimiento positivo y un monitoreo
diario en el medio53
Los compuestos aromaacuteticos que libera la presencia de BrettanomycesDekkera
estaacute asociada a los compuestos 4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinilfenol y 4
viniguayacol a partir de esto los centros de investigacioacuten han hondado en la
identificacioacuten de dichos compuestos relacionados en la enologiacutea y especialmente
con BrettanomycesDekkera a partir de eso el Departamento de Quiacutemica
Universidad de La Rioja Espantildea este estudio presenta un meacutetodo basado en el
uso de Cromatografiacutea de Gas y micro extraccioacuten en fase solida para el anaacutelisis
cuantitativo de 4-etilfenol 4-etil guayacol 4-vinilfenol 4-vinilguayacol
Demostrando la existencia de un efecto matriz en el anaacutelisis de compuestos
responsables del ldquocaraacutecter Brettrdquo en vino Este nuevo meacutetodo fue
satisfactoriamente aplicado a cierto nuacutemero de vinos tintos comerciales vinos
52
JA Couto A Barbosa and T Hogg 2005 A simple cultural method for the presumptive detection of the yeasts BrettanomycesDekkera in wines Letters in Applied Microbiology No 41 pag 505-510 Porto
Portugal
53 Serkovic Dubravka Gracin Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac
Brettanomyces bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet pag 1-117 ZagrebCroatia
38
blancos y roseacute Este meacutetodo puede ser una alternativa para evitar el efecto matriz
en muestras de vino54
De acuerdo con este tema en la jornada cientiacutefica del 99 el grupo de investigacioacuten
enoloacutegica se estudio la formacioacuten de sustancias volaacutetiles por 13 cepas de S
cerevisiae con buenas aptitudes enoloacutegicas inoculadas individualmente en un
mosto homogeacuteneo de la variedad airen fermentado en las mismas condiciones
de aireacioacuten y a temperatura controlada55
54
C Pizarro N Perez-del-Notario JM Gonzalez-Saiz 2007 Determination of Brett character responsible
compounds in wines by using multiple headspace solid-phase micro extraction Journal of Chromatography
No 1143 pag 176-181 La Rioja Espantildea
55 E Pueyo P Hidalgo K Fernaacutendez y P Martiacuten-Aacutelvarez 1999 Anaacutelisis de compuestos volaacutetiles en vinos
obtenidos con distintas cepas de Saccharomyces cerevisiae Aplicacioacuten de la teacutecnica de microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientificas 99 Grupos de Investigacion Enologica Zaragoza Espana
39
7 MATERIALES Y METODOS
A continuacioacuten se presentan materiales y meacutetodos para la investigacioacuten
Este proyecto fue realizado en su gran mayoriacutea en las instalaciones de la
Universidad de Zagreb en la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos
(PBF) Laboratorios del Departamento de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas
Alcohoacutelicas ubicado en la ciudad de Zagreb Croacia
Los anaacutelisis fisicoquiacutemicos del vino tinto Babic fueron realizados en los
laboratorios de VINOLAB ubicado en Zagreb Croacia
71 MEDIO SOLIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera
711 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Autoclave de laboratorio
Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa Etanol peptona extracto de levadura
agar cicloheximida acido cumaacuterico ampicilina)
Balanza electroacutenica de precisioacuten
Microscopio oacuteptico
712 Metodologiacutea
Basados en estudios anteriores realizados en el laboratorio para el desarrollo de
medio solido selectivo para BrettanomycesDekkera (Serkovic Dubravka Gracin
40
Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac Brettanomyces
bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet Universidad de Zagreb pag 1-
117 Zagreb Croacia) se evaluaron las recomendaciones mencionadas en dicha
investigacioacuten para la mejoriacutea y desarrollo de otros medios soacutelidos selectivos
Se usoacute como base el medio YPD (Yeast Peptone Dextrose) el cual estaacute
compuesto de la siguiente forma 20gL peptona 10 gl extracto de levadura 20 gl
de agar56 este medio es selectivo para levaduras pero no es selectivo entre ellas
Es necesario el uso de una fuente de carbono para la levadura
BrettanomycesDekkera de acuerdo a la teoriacutea y revisando la tabla 1 (Relacioacuten de
los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) y seguacuten
facilidades de disponibilidad en el laboratorio se utiliza glucosa la cual es
utilizable por entre 75-100 de las cepas de BrettanomycesDekkera seguacuten la
tabla mencionada anteriormente
Esta fuente de carbono (Glucosa) fue probada en una concentracioacuten de 20 gL
Cicloheximida fue probada a 30 mgL para inhibir Saccharomyces en el medio y
darle mayor selectividad para Brettanomyces Dekkera Se antildeade acido p-
cumarico en una concentracioacuten de 100 mgL como precursor para la formacioacuten
del compuesto 4 etilfenol caracteriacutestico de la levadura BrettanomycesDekkera
Para inhibir bacterias en el medio se usa ampicilina a 10 mgL esta se agrega
despueacutes de realizada la esterilizacioacuten y cuando la temperatura del medio este
igual o menor a 40C El pH del medio se ajusto a 5
Paralelamente se crea el medio con Etanol como fuente de carbono en una
concentracioacuten de 6 o 60 mlL con la misma concentracioacuten de los otros
compuesto como cicloheximida 30mgL acido cumarico 100mgL 20 gL peptona
10 gL de extracto de levadura 16gL de agar Este medio se crea como
56
Concentraciones preestablecidas en el laboratorio de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas alcoholicas
41
comparativo para determinar cual fuente de carbono es la maacutes utilizada por la
levadura Brettanomyces bruxellensis para su reproduccioacuten Seguacuten la teoriacutea (ver
tabla 1) el etanol es utilizado por entre 25-75 de las cepas de
BrettanomycesDekkera pero es el azuacutecar que se encuentra en mayor
concentracioacuten presente en los vinos tintos aproximadamente 130 gl57
Estos medios fueron debidamente esterilizados para eliminar cualquier
microorganismo o espora presente en este Este procedimiento se realizo por el
meacutetodo de combinacioacuten de altas temperatura y presioacuten (Autoclave 121 C a 1034
kPa)
Se usaron colonias de BrettanomycesDekkera aisladas anteriormente de vinos
contaminados y guardas para investigaciones en el Departamento de Tecnologiacutea y
Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos
Universidad de Zagreb Croacia
Los medios fueron monitoreados visualmente todos los diacuteas y se toman
observaciones de macroscoacutepicas y microscoacutepicas Se comparan estos dos medios
en teacuterminos de rapidez de crecimiento de la levadura y selectividad Estas
muestras fueron incubadas a 28C por 10 diacuteas
La prueba fue realizada por duplicado en diferentes tiempos
57
Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
42
72 MEDIO LIacuteQUIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera
721 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Frascos de vidrio esteacuteriles
Autoclave de laboratorio
Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa peptona extracto de levadura
cicloheximida acido cumarico ampicilina etanol)
Microscopio oacuteptico
Balanza electroacutenica de precisioacuten
722 Metodologiacutea
En el mercado para enologiacutea existen medio liacutequidos selectivos para la deteccioacuten
de BrettanomycesDekkera en vinos sin embargo estos son de difiacutecil accesibilidad
por sus elevados precios es por esto que se desarrolla un medio liquido selectivo
para dicha levadura en el laboratorio del Departmaneto de Tecnologiacutea y Anaacutelisis
de Bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia
Para este medio se toma como base el medio selectivo con Glucosa como fuente
carbono desarrollado anteriormente sin usar agar para mantener el medio en su
estado liquido
43
La composicioacuten de este medio liacutequido es la siguiente
20 gL Glucosa
20 gL peptona
10gL extracto de levadura
30mgL de cicloheximida
100mgL acido p-cumarico
10 mgL ampicilina
Estos compuestos fueron medidos en una balanza electroacutenica de precisioacuten se
antildeade 250 ml de agua destilada y se mezcla constantemente se pasa a proceso
de esterilizacioacuten en autoclave a 120C y 1034 KPa por 45 minutos
De esta forma se asegura la usencia de microorganismos yo esporas en el
medio Despueacutes de bajar la Temperatura a 40C se agrega a la mezcla ampicilina
en una concentracioacuten de 10mgL
En frascos de vidrio esteacuteril se agrega 40 ml de medio liacutequido y diferentes
cantidades iniciales de levaduras BrettanomycesDekkera fueron inoculadas al
respectivo medio el primer frasco tiene una cantidad de 106 ceacutelulasml el segundo
tiene 104 ceacutelulasml el tercero tiene 102 celulasml y el cuarto con una cantidad
aproximada de 25 ceacutelulasml Estas cantidades estaacuten basadas en estudios
anteriores para medios liacutequidos selectivos en levaduras58
58 J Ungar A M James P W Muggleton H F Pegler y E G Tomich1950 The Cultivation of
Haemophilus pertussis in Partially Defined Liquid Media Journal of General Microbiology No 4
pag 345-359 Greenford
44
Este medio liacutequido inoculado fue inspeccionado diariamente visualmente revisioacuten
de turbidez microscoacutepicamente y olfativamente para deteccioacuten de olores del
ldquocaraacutecter Brettrdquo
Los diacuteas fueron contabilizados para determinar resultados positivos en estos
ensayos
73 INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN
VINO TINTO DE LA REGION DE DALMACIA CROACIA
731 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Medio selectivo solido para BretanomycesDekkera
Medio selectivo Liquido para BrettanomycesDekkera
Quiacutemicos de laboratorio (Dioxido de Azufre (SO2) Antibrettreg Glucosa)
Vino Babic 2007
Anallizador infrarojo Bacchius II microdom
732 Metodologiacutea
Con los medios desarrollados (solido y liquido) se quiere conocer el efecto del
dioacutexido de azufre (SO2) y el producto Antibrettreg en la levadura
BrettanomycesDekkera presente en el vino tinto de la regioacuten de Dalmacia
Con las herramientas que se tienen en el laboratorio del departamento de
tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia se quiere
determinar la influencia de estos productos en la levadura BrettanomycesDekkera
presente en vino tinto croata de la regioacuten de Dalmacia Babic
45
El primer paso es adaptar la levadura al vino tinto croata (Babic) para esto se
inoculan 20 colonias de BrettanomycesDekkera en 500 ml de vino se antildeadioacute
glucosa en una concentracioacuten de 2gL y se oxigena la mezcla Para este paso de
adaptacioacuten se dejan las muestras de 1 a 2 diacuteas a temperatura ambiente (20C)
Despueacutes de este periodo se revisa microscoacutepicamente la presencia positiva de
BrettanomycesDekkera en los 500 ml de vino en los que se estaba haciendo el
paso de adaptacioacuten en Babic al comprobar su presencia positiva se procede a
mezclar los 500 ml de vino contaminado con BrettanomycesDekkera con los 3
Litros de vino Babic que se disponen para esta prueba
Estos 3 litros de vino tinto Babic contaminado con la levadura
BrettanomycesDekkera se reparten en 8 frascos de vidrios esteacuteriles al siguiente
diacutea se toman dos frascos para agregar cada uno de los compuestos a evaluar
(SO2 y Antibrettreg)
Para SO2 se toman dos frascos uno de 600ml y uno de 100ml se agrega una
concentracioacuten de 40 mgl
Para el producto AntiBrettreg se toman cuatro frascos dos de 600 ml y dos de 100
ml seguacuten especificaciones del producto y la alta poblacioacuten de
BrettanomycesDekkera en las muestras se adiciono la maacutexima concentracioacuten de
AntiBrettreg a las muestras la cual fue de 40 gHl
Estas muestras se dejaron a temperatura ambiente simulando condiciones de
almacenamiento del vino en barricas temperatura aproximada de 20C evitando el
contacto con la luz solar y evitando movimientos fuertes Esto se mantuvo por 15
diacuteas que fue el tiempo de duracioacuten del experimento
Con el vino restante se mantuvo en las mismas condiciones de almacenamiento
de los demaacutes para hacer un paralelo de comparacioacuten
Previamente se analizaron las caracteriacutesticas del vino sin contaminar por medio
del analizador infrarrojo Bacchus II microdom antes de agregar los compuestos
46
SO2 y AntiBrettreg y despueacutes se volvioacute a realizar el anaacutelisis para determinar los
efectos de estos compuestos en el vino y asiacute mismo al de control
74 DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN
EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO
MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE
741 Materiales
Cromatografo de Gas HP5890 Serie II
Microextractor de fase solida (SPME)
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Quiacutemicos de laboratorio (p-cresolAcetaldehido Propanol diacetil etil-
acetato i-butanol acido aceacutetico i-amil-alcohol n-amil lactato de etilo
acetato amil metiacutelico 1-hexanol etil-hexanol linalol nerol citronelol
geraniol 2-feniletanol octanoato de etilo 4-etilfenol 2-feniletil acetato 4-
etilguaiacol)
Vino Tinto Babic
Agua destilada
742 Metodologiacutea
El meacutetodo fue desarrollado anteriormente en el Departamento de Tecnologiacutea y
Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos de
la Universidad de Zagreb Croacia Y despueacutes de modificaciones fue utilizado en el
desarrollo del trabajo El meacutetodo utilizado es descrito a continuacioacuten
47
Cromatografo de gas HP 5890 SERIES II
Programa HP-chem
a) Condiciones para analisis SPME-GC
Muestra diluida 5050 con adicion de estandar interno (p-cresol1mgl)
25ml de la muestra diluida con mezcla continua a temperatura ambiente
Tiempo de adsorcion 30 minutos
SPME es colocado en la muestra para la adsorcion durante el tiempo
previsto
b) Condiciones para el Cromatografo de gas (GC)
La columna usada en este experimento es RTXreg-5 (Restec USA sn 210627)
30m id=025mm 025μm
Gas portador Nitrogeno
Flujo del Nitrogeno 5 mlmin
Temperatura del inyector 240 C
Temperatura del detector 250 C
Temperaturas programadas 35 C5 min 150 C 34 Cmin 180 C
10Cmin 190 C 5 Cmin
Se conocen los resultados del cromatografiacutea de gases (ver tabla 10) y se hacen
necesarias varias correcciones del meacutetodo y algunas pruebas con unos
compuestos para determinar realmente su tiempo de retencioacuten en este tipo de
vino Se deben comprobar tiempos de retencioacuten
48
8 DISCUSIOacuteN Y RESULTADOS
81 RESULTADOS PARA EL DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO
Tabla 2 Medio Selectivo con Glucosa como fuente de carbono para
BrettanomycesDekkera en incubacioacuten por 5 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten
microscoacutepica
1 Negativo Negativo - No se realiza
2 Negativo Negativo - Presencia de levaduras
3 Negativo Negativo - Presencia de
Levaduras
4 Aparicioacuten de
algunas colonias
Negativo Transparente Presencia de levaduras
5 Colonias definidas Positivo-
Fenoles
Amarillo Presencia positiva de
BrettanomycesDekkera
49
Este medio tiene alto grado de selectividad para levaduras con un tiempo de
crecimiento de aproximadamente 5 diacuteas en 28C lo que lo hace raacutepido gracias al
antibioacutetico (ampicilina) que hace parte de la composicioacuten del medio no hay
presencia de bacterias Se hace confiable para resultados positivos de levaduras
BrettanomycesDekkera debido a que las levaduras Saccharomyces fueron
inhibidas con el compuesto cicloheximida su selectividad fue comprobada por
revisioacuten microscoacutepica macroscoacutepica y sensorial
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con glucosa como fuente de carboacuten son las
siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
50
Tabla 3 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono para Brettanomyces Dekkera en
incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica
1 Ninguno Negativo - -
2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras y
bacterias
9 Diminutas
colonias
transparentes
Negativo Transparentes Presencia de levaduras y
algunas bacterias
10 Positivo Positivo-
Fenoacutelicos
Amarillo Presencia de levaduras
BrettanomycesDekkera y
bacterias
El medio selectivo para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de
carbono tambieacuten es selectiva entre levaduras ya que solo se identifico la levadura
BrettanomycesDekkera en este sin embargo se evidencia una presencia de otro
microorganismo presuntamente bacteria ya que este medio no contiene agente
antibacteriano (ampicilina) Es necesaria la adicioacuten de ampicilina en una
concentracioacuten de 10mgl para inhibir la presencia de bacterias
Este medio presenta un tiempo maacutes prolongado para mostrar crecimiento de la
levadura BrettanomycesDekkera aproximadamente 10 diacuteas
51
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las
presentadas en el medio selectivo con glucosa como fuente de carbono y son las
siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
52
Tabla 4 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono y adicioacuten de ampicilina para
Brettanomyces Dekkera en incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica
1 Ninguno Negativo - -
2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
9 Diminutas
colonias
transparentes
Negativo Transparentes Presencia de levaduras
10 Positivo Positivo-
Fenoacutelicos
Amarillo Presencia de levaduras
BrettanomycesDekkera
El efecto de la ampicilina sobre el medio selectivo con etanol como fuente de
carbono fue el esperado inhibioacute completamente el crecimiento de colonias
bacterianas en el medio el tiempo de crecimiento de la levadura y presencia de
aromas fenoacutelicos fue el mismo de 10 diacuteas en incubacioacuten de 28C
53
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las
presentadas anteriormente y son las siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
82 RESULTADOS PRUEBAS MEDIO LIQUIDO
Tabla 5 Influencia de la concentracioacuten de levaduras BrettanomycesDekkera en el
tiempo necesario para detectar la produccioacuten de 4-etil-fenol en medio liquido
Nuacutemero de ceacutelulas ml
(concentracioacuten final)
Tiempo necesario para obtener resultados
positivos (diacuteas)
1 Experimento
32x106 le 3
3 X 104 3
33x102 7
40 No detectado
2 Experimento
43x106 le3
39x104 le3
37x102 8
62 No detectado
54
El nuacutemero de ceacutelulas de levadura de BrettanomycesDekkera fue contabilizado
usando contador de ceacutelulas Chamber
Los aromas fenoacutelicos son difiacuteciles de detectar debido al fuerte olor que tiene el
medio liquido caracteriacutestico de sus componentes esto dificulta la identificacioacuten del
ldquocaraacutecter Brettrdquo en especial cuando las concentraciones de
BrettanomycesDekkera no son elevadas Ademaacutes de los olores fenoacutelicos otros
compuestos volaacutetiles se detectan tales como acido aceacutetico y olores oxidativos
tambieacuten producido por la levadura BrettanomycesDekkera
En la inspeccioacuten visual se detecta alta turbidez en el medio Se compara con un
medio sin presencia de BrettanomycesDekkera
En las muestras con mayor concentracioacuten de la levadura es maacutes notoria la
turbidez Despueacutes de 3 diacuteas se presenta un precipitado blanco en todas las
muestras de altas concentraciones
La revisioacuten microbioloacutegica se realiza diariamente para determinar el nuacutemero de
ceacutelulas y la presencia positiva de la levadura a evaluar
Entre los dos experimentos realizados con el medio liquido el tiempo que se
demoro en detectar compuestos fenoacutelicos fue muy similar entre ellos
dependiendo del nuacutemero de ceacutelulas en el medio en mayores concentraciones el
tiempo de deteccioacuten fue menor
Hay que sentildealar que BrettanomycesDekkera debe alcanzar una concentracioacuten
miacutenima (denominada poblacioacuten criacutetica) de 103 UFCml para comenzar a liberar etil
fenoles Por debajo de esta concentracioacuten la levadura seriacutea metaboacutelicamente
activa pero no produciraacute compuestos alterantes a niveles detectables esto se ve
reflejado en los resultados en los que las concentraciones de ceacutelulas son muy
bajas
55
Estos resultados se comparan con los resultados dados en el medio solido Los
dos medios muestran altos grados de selectividad hacia la levadura
BrettanomycesDekkera y similar comportamiento para el crecimiento de dicha
levadura
En el medio liacutequido cuando hay altas concentraciones de BrettanomycesDekkera
el tiempo de deteccioacuten del microorganismo es menor que con el medio solido pues
en el liacutequido es aproximadamente 3 diacuteas y en el soacutelido son 5 diacuteas
83 RESULTADOS DE LA INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE
(SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO DE LA REGION DE
DALMACIA CROACIA
El vino fue analizado antes de la adicioacuten de los compuestos quiacutemicos a evaluar y
15 diacuteas despueacutes de adicioacuten para ver la reaccioacuten de este frente a SO2 y Antibrettreg
estas caracteriacutesticas se determinaron con el equipo de laboratorio Bacchus II
Microdom localizado en el laboratorio Vinolab doo Zagreb Croacia Los
resultados se muestran en la tabla
Tabla 6 Resultados de las muestras de vino inoculados con la levadura BrettanomycesDekkera
durante 15 diacuteas Comparativos con los diferentes compuestos
CFUml
Vino Day 1 Day 4 Day 10 Day 15
Control 130E+04 800E+03 700E+03 500E+03
Control 800E+03 640E+03 700E+03 280E+03
SO2 110E+04 400E+02 400E+02 67
SO2 900E+03 380E+03 270E+03 183
Antibrett 140E+05 920E+04 140E+04 400E+03
Antibrett 210E+05 181E+05 160E+04 900E+03
Antibrett 120E+05 990E+04 120E+04 100E+03
Antibrett 230E+05 204E+05 300E+03 200E+03
56
Tabla 7 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 antes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o
Antibrettreg Diacutea 0
Alcohol
()
Acidez Total
(gr Aci
Tartaacuterico L)
Acidez volaacutetil
(Aci
AceacuteticoL)
Densidad
(grml)
Azuacutecar residual
(grl)
Extracto
seco
(grl)
Acido
Laacutectico
(grl)
Glicerol
(grl)
Taninos
(grl)
Acetato
(grl)
1473
525
083
09928
473
332
164
799
305
117
1471
522
084
09927
479
329
162
786
299
116
Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
Tabla 8 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 despueacutes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o
Antibrettreg Diacutea 15
Alcohol
()
Acidez Total
(gr Aci
Tartaacuterico L)
Acidez volaacutetil
(Aci
AceacuteticoL)
Densidad
(grml)
Azuacutecar residual
(grl)
Extrac
to seco
(grl)
Acido
Laacutectico
(grl)
Glicerol
(grl)
Taninos
(grl)
Acetatos
(grl)
Control
1414
565
107
09935
436
364
177
827
259
136
Control
1415
556
108
09936
420
365
170
824
256
137
SO2
1456 543 108 09932 476 369 167 803 281 125
SO2
1457
542 108 09933 472 370 170 804 271 124
Antibrett 1454 533 106 09933 448 371 175 813 277 125
Antibrett 1455 534 105 09933 460 372 171 809 282 124
Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
57
Figura 4 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en el vino de control para
evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas
El comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en la prueba por
duplicado en el vino de control fue muy similar pues con el tiempo esta levadura
deja de reproducirse y va muriendo cuando las condiciones ya no son aptas para
su desarrollo debido a que la mayoriacutea de su fuente de carbono (Glucosa) esta
consumida sin embargo esta levadura no llega a su desaparicioacuten total lo que
representa uno de los mayores problemas en la elaboracioacuten del vino
Esta levadura tiene un metabolismo lento y el factor tiempo es un requisito
fundamental para su desarrollo este experimento se empezoacute con una alta
poblacioacuten de BrettanomycesDekkera (130 x 104 UFCml y 8 x 103 UFCml
respectivamente) y durante el transcurso del tiempo la poblacioacuten fue disminuyendo
debido a la perdida de las condiciones necesarias para la reproduccioacuten
58
Figura 5 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de SO2 en
concentracioacuten de 40 mgl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas
El SO2 tuvo un comportamiento efectivo y raacutepido contra las colonias de
BrettanomycesDekkera La poblacioacuten de esta levadura se redujo de forma
significativa entre el diacutea primero y el cuarto se encontroacute una diferencia porcentual
de 96 en la primera prueba y del 60 en la de duplicado al diacutea 15 ya la
poblacioacuten era casi nula pasando raacutepidamente de un numero por encima de la
poblacioacuten critica de la levadura BrettanomycesDekkera a un numero lt103 UFCml
siendo muy eficaz y raacutepido en el manejo de produccioacuten
Este compuesto ademaacutes de favorecer la extraccioacuten de los compuestos fenoacutelicos y
de su actividad antioxidante al inhibir la accioacuten de las polifenoloxidasas a dosis
adecuadas de un maacuteximo de 50gl inhibe la multiplicacioacuten bacteriana y de
levaduras
59
Figura 6 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de
Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo
de 15 diacuteas
Figura 7 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de
Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo
de 15 diacuteas
El compuesto Antibrettreg en la primera prueba tanto como en el duplicado tuvo su
mayor tiempo de reduccioacuten de UFCml entre los diacuteas 4-10 con una diferencia
porcentual de 91 en comparacioacuten con el diacutea cuarto al decimo a diferencia de
60
SO2 el cual presenta la gran disminucioacuten de colonias entre los primeros diacuteas de
agregarse el producto
El tiempo para que la poblacioacuten de la levadura llegara a la cantidad menor a la de
la poblacioacuten critica es mucho mayor que la del compuesto SO2 sabiendo que esta
poblacioacuten debe ser lt103 UFCml
El compuesto Antibrettreg puede tardarse 4-10 diacuteas en representar una reduccioacuten
de UFCml significativa en dicho tiempo puede representar grandes peacuterdidas
nutricionales y altos costos de produccioacuten para la fabricacioacuten
Figura 8 Comportamiento del contenido de alcohol en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin adicioacuten)
hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
BrettanomycesDekkera estaacute presente en vinos de alto contenido alcohoacutelico
aproximadamente entre 125 a 14 pues esta levadura toma a etanol como
fuente de carbono y este vino (Babic) procede de uvas muy maduras las cuales
presentan mayor cantidad de azuacutecares residuales (como glucosa y fructosa y
otras pentosas residuales)
138
14
142
144
146
148
Alcohol
Day 0 Day 15
61
Analizando el comportamiento del vino durante el experimento de 15 diacuteas sin
compuestos quiacutemicos y con SO2 y Antibrettreg a partir de las caracteriacutesticas
iniacuteciales que se determinaron seguacuten el equipo BACCHUS analizador infrarrojo se
presenta en general una reduccioacuten del contenido alcohoacutelico de este vino pero se
ve una mayor reduccioacuten en el vino de control el cual redujo en un 394 su
contenido alcohoacutelico desde el dia 0 hasta el diacutea 15 este vino no tiene ninguacuten
compuesto contra la levadura BrettanomycesDekkera y por su elevada presencia
en los 15 diacuteas de experimento consumioacute esta cantidad de etanol
Mientras en el vino que conteniacutea SO2 tras 15 diacuteas de tratamiento se vio una
reduccioacuten de alcohol de 1 ya que este compuesto redujo la cantidad de
BrettanomycesDekkera en los primeros diacuteas de tratamiento previniendo su
reproduccioacuten y protegiendo el contenido alcohoacutelico del vino Babic 2007
En los vinos de prueba con Antibrett reg la reduccioacuten alcohoacutelica se dio en un
porcentaje de 122 un poco maacutes alta que con SO2 y mucho maacutes baja en
comparacioacuten del vino de control este compuesto tambieacuten previno la gemacioacuten de
la levadura evitando la perdida de etanol en el vino sin embargo como este
compuesto duro mas en este proceso de eliminar BrettanomycesDekkera se
produjo una mayor peacuterdida alcohoacutelica
62
Figura 9 Comportamiento del contenido de acidez volatil en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin
adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
Debido a la presencia de oxigeno en los frascos la acidez volaacutetil aumento pero no
significativamente en las muestras No hubo grandes diferencias entre las
muestras con compuestos y las de control por lo que se deduce que estos
compuestos no ayudan a evitar esta acidez Esta acidez tan alta puede dantildear la
calidad del vino de forma casi irreparable Pero el factor oxigeno es de los maacutes
controlados en la produccioacuten de vinos
la alteracioacuten del aumento de la acidez volaacutetil no estaacute relacionada con la levadura
BrettanomycesDekkera sino a la presencia de oxigeno en el almacenamiento el
oxigeno fue usado en esta prueba para promover condiciones apropiadas para el
desarrollo de la levadura
002040608
112
Acidez Volatil
Day 0 Day 15
63
Figura 10 Comportamiento del contenido de Acido Acetico en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin
adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
Brettanomyces Dekkera son productores de aacutecido aceacutetico y elevan el contenido
de los vinos anormalmente en condiciones de anaerobiosis En condiciones de
aerobiosis producen concentraciones bajas o nulas de aacutecido aceacutetico
Este acido aceacutetico al igual que los fenoles afecta el sabor y el perfil olfativo del
vino tinto este efecto es tambieacuten producido por la levadura
BrettanomycesDekkera vemos en los resultados el gran crecimiento de este
compuesto en el vino control el cual no tenia compouestos en contra de
BrettanomycesDekkera lo que produjo este aumento significativo del acido aceacutetico
en comparacioacuten con estos que teniacutean SO2 y Antibrettreg entre ellos la diferencia en
este compuesto es muy reducida y no significativa pues estos compuestos no
permitieron la gemacioacuten de esta levadura y esta no produjo este acido en esa gran
cantidad
A este compuesto se le atribuye el olor y sabor a vinagre del vino tinto un defecto
muy comuacuten y poco agradable para el consumidor
105110115120125130135140
Acido Acetico
Day 0 Day 15
64
Figura 11 Comportamiento del contenido de Azucares reductores en vino Babic 2007
desde el diacutea 0 (sin adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en
comparacioacuten con el vino de control
BrettanomyesDekkera utiliza los azucares residuales como fuente de carbono
para su crecimiento en el vino este es el factor maacutes importante para su desarrollo
y este es el que determina en cierto caso la cantidad de levaduras de
BretanomycesDekkera presente en las graficas se determina claramente que en
el vino de control donde la cantidad de esta levadura es muy alta 15 diacuteas despueacutes
de empezar las pruebas la cantidad de azucares reductores es muy baja y ha
bajado en un porcentaje de 10 mientras que el vino que tiene SO2 bajo la
cantidad de azucares reductores en un 042 y el vino que tiene el compuesto
Antibrettreg redujo su nivel de azucares reductores en 462
38
4
42
44
46
48
5
Azucares Reductores
Day 0 Day 15
65
84 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE
CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON
EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID
PHASE
Tabla 10 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en
vino Babic 2007 con el meacutetodo propuesto
Compuesto Tiempos de
retencioacuten (min)
Acetaldehiacutedo 1437
Propanol 3759
Diacetil 4202
Etil-acetato 4523
i-butanol 6232
Acido Aceacutetico 7840
i-amil alcohol 11740
n-amil 13489
lactato de etiacutelico 15741
acetato amil metiacutelico 17796
1-hexanol 19101
etil-hexanol 24456
Linalol 30370
2-feniletanol 32768
p-cresol 33522
octanoato de etilo 34226
4-etilfenol 37100
2-feniletil acetato 32769
4-etilguayacol 39704
4 vinilfenol 40529
decanoato de etilo 42117
Refirieacutendose a estos resultados es necesaria la creacioacuten de soluciones estaacutendar
para determinar tiempos de retencioacuten con el meacutetodo y si es necesario ajustes a
este
66
Tabla 11 Soluciones estaacutendar para compuestos en vinos tintos Croatas
MODEL 0
(en volumen de 100 ml en 40 Etanol)
Compuesto Pureza Cantidad
(g)
Concentracioacuten (gl)
Acetaldehiacutedo 099 1623 160677
Propanol 0995 13849 137718
Diacetil 098 01071 104958
Etil-acetato 0995 30172 3002114
i-butanol 099 15016 1486584
Acido Acetico 0995 0 0
i-amil alcohol 099 20116 1991484
n-amil 098 15442 1513316
lactato de etilio 098 00507 049686
acetato amil metilico 098 01028 100744
1-hexanol 098 00367 035966
etil-hexanol 098 00308 029876
Linalol 097 00288 027936
Nerol 097 00311 030478
Citronelol 098 0031 03038
Geraniol 098 15803 1548694
2-feniletanol 098 00402 039396
4-etilfenol 098 00812 078764
octanoato de etilo 097 00597 059103
2-feniletil acetato 099 00315 031185
4-etilguayacol 098 00803 079674
Fuente Laboratorio de anaacutelisis e investigacioacuten de bebidas Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea
de Alimentos Universidad de Zagreb Zagreb Croacia 2009
Las soluciones estaacutendar se realizan teniendo como referencia las cantidades de
estos compuestos en los vinos tintos croatas datos suministrados por el Doctor
Leo Gracin en concentraciones de gl a partir de este dato y teniendo en cuenta
67
la pureza de los compuestos que se teniacutean en el laboratorio de anaacutelisis e
investigacioacuten de bebidas se crean las soluciones estaacutendar Ejemplo
Solucioacuten estaacutendar para 4 etil-fenol en un volumen de 100 ml
Con estas soluciones estaacutendar se realizo el tiempo de retencioacuten para corroborar el
meacutetodo Los resultados de esto fueron tiempos de retencioacuten diferentes a los del
meacutetodo primero con el que se realizaron los ensayos y a partir de esos resultados
se ajusto el meacutetodo con el que se trabajo
68
Tabla 12 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en
vino Babic 2007 con el meacutetodo modificado
Compuesto Tiempos de
retencioacuten (min)
Acetaldehiacutedo 1542
Propanol 4046
Diacetil 4733
Etil-acetato 4807
i-butanol 6659
Acido Acetico 8343
i-amil alcohol 12123
n-amil 13866
lactato de etilio 16072
acetato amil metilico 18336
1-hexanol 19447
etil-hexanol 24835
Linalol 31831
2-feniletanol 33305
p-cresol 33703
octanoato de etilo 34571
4-etilfenol 37724
Citronelol 38326
Nerol 38576
2-feniletil acetato 39012
Geraniol 39944
4-etilguayacol 40271
4 vilifenol 41168
decanoato de etilo 42657
69
DIA 0
Se coloca ISTD a todas las muestras respectivas para poder determinar
cantidades de los compuestos aromaacuteticos
Se realiza la cromatografiacutea de gas al vino Babic 2007 antes de ser inoculado con
BrettanomycesDekkera
Tabla 13 Resultados de la cromatografiacutea de gas del vino Babic 2007
Compuesto Tiempo de retencioacuten
min
Cantidad
mgl
Acetaldehiacutedo 1542 0
Propanol 4046 0
Diacetil 4733 37215204
Etil-acetato 4807 0
i-butanol 6659 0
Acido Aceacutetico 8343 2817465
i-amil alcohol 12123 16799019
n-amil 13866 26
lactato de etiacutelico 16072 10983961
acetato amil metiacutelico 18336 0185196
1-hexanol 19447 264655
etil-hexanol 24835 0158751
Linalol 31831 0
2-feniletanol 33305 4235560
p-cresol 33703 1
octanoato de etilo 34571 0152412
4-etilfenol 37724 00581345
Citronelol 38326 00439729
Nerol 38576 00344799
2-feniletil acetato 39012 00407983
Geraniol 39944 0
4-etilguayacol 40271 0
4 vilifenol 41168 0
Decanoato de etilo 42657 00190144
70
Basados en los compuestos aromaacuteticos que brinda el ldquoCaraacutecter Brettrdquo se van a
analizar detalladamente los siguientes aromas 4-Etilfenol 4-Etilguayacol 4-
Vinylfenol
Figura 12 Compuestos aromaticos en vino tinto Babic sin estar contaminado con la levadura
BrettanomycesDekkera
El vino a analizar esta por debajo de las concentraciones consideradas como
perjudiciales para el aroma del vino tinto (El umbral sensorial del 4-etilfenol es de
230 μgl y el del 4-etilguaiacol es de 47 μgl) pues posee una concentracion de
58microgL de 4etilfenol 0 microgL de 4 etilguayacol y 0 microgL de vinylfenol
841 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGUacuteN TEMPERATURAS
DE ALMACENAMIENTO
0
02
4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinylfenol
Vino 00581345 0 0
C (
mg
L)
Vino Babic 2007 Dia 0
71
Tabla 14 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el
ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 20C por 4 diacuteas Prueba por duplicado
MUESTRAS INCUBADA A 20C
Compuesto Day 1
Amount
(mgL)
Day 2
Amount
(mgL)
Day 3
Amount
(mgL)
Day 4
Amount
(mgL)
4-etilfenol 0260244 017294 0177547 020156
4-etilfenol 0260244 0245915 0204542 0262499
4-etilguayacol 0 0 0 0
4-etilguayacol 0 0 0 0
4 vinilifenol 1107096 781349 685317 460323
4 vinilifenol 1107096 1297465 621324 693225
72
Figura 13 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
BrettanomycesDekkera es la levadura responsable de la produccion de 4-etil-
fenol compuesto asociado con olores caracteristicos a ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 00581345 0260244 0172935 0177547 020156
C (
mg
L)
4 etilfenol
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 00581345 0260244 0245915 0204542 0262499
C (
mg
L)
4 etilfenol
73
caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo dantildeando la calidad sensorial del vino tinto Babic la
produccioacuten de este compuesto en esta muestra realizada por duplicado fue
ascendente y tuvo incremento muy grande en el primer dia de almacenamiento y
en el transcurso de los siguientes cuatro diacuteas se mantuvo relativamente estable lo
cual no concuerda con el comportamiento tiacutepico de esta levadura quien tiene un
crecimiento lento e incrementa la produccioacuten de fenoles con su gemacioacuten esto
genera muchas dudas sobre el buen funcionamiento del equipo GC o de la
estabilidad de las levaduras BrettanomycesDekkera en este almacenamiento
Figura 14 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar prueba por duplicado
002040608
1
Vino Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0 0 0
4 etilguayacol
002040608
1
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0 0 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
74
Presencia negativa de 4 etil guayacol durante todo el almacenamiento
probablemente las condiciones de almacenamiento y el medio no dieron lugar al
desarrollo de este compuesto el cual se considera menos conflictivo que el 4-etil-
fenol
Figura 15 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
Estos resultados tambieacuten dejan dudas del normal comportamiento de dicha
levadura pues indican que la levadura no convirtioacute este compuesto en etilfenol
0
2
4
6
8
10
12
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 110709781349685317460323
4 vinylfenol
0
2
4
6
8
10
12
14
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
Series1 0 11071 12974 62132 69322
C (
mg
l)
4 Vinylfenol
75
durante el almacenamiento caracteriacutestica que solo la levadura
BrettanomycesDekkera puede realizar se ve que las concentraciones de
vinylfenoles son mucho mas altas que las de fenoles lo que nos deja determinar
que la poblacioacuten de BrettanomycesDekkera es muy baja y existen otras levaduras
productoras de vinylfenoles en este tipo de vino en las condiciones de
almacenamiento dadas para estas pruebas
Tabla 16 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el
ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 28C por 4 diacuteas
MUESTRA 2 INCUBADA A 28C
Compuesto Day 1
Amount
(mgL)
Day 2
Amount
(mgL)
Day 3
Amount
(mgL)
Day 4
Amount
(mgL)
4-etilfenol 0260244 019612 0186614 019932
4-etilfenol 0260244 020576 0214917 0193554
4-etilguayacol 0 014304 0223836 0
4-etilguayacol 0 002287 00529832 0
4 vinilifenol 1107096 787068 665182 397847
4 vinilifenol 1107096 284389 00204392 0
76
Figura 16 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar
El desarrollo de este compuesto en el diacutea 1 fue significativo y luego relativamente
estable el comportamiento fue similar en las pruebas de diferentes temperaturas
de almacenamiento para este compuesto el cual es el maacutes problemaacutetico en la
industria viniacutecola
0
005
01
015
02
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 005813019932018661019611019932
4 etilfenol
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 005813 019355 021491 020576 026024
4 etilfenol
77
Figura 17 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar
Los resultados de la prueba son poco confiables y no entendibles por lo que
podemos verificar que el GC no estaacute trabajando de forma adecuada para la
deteccioacuten del compuesto
0001002003004005006
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 Etilguayacol 0 0 0022 0053 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
0005
01015
02025
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0223 0143 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
78
Figura 18 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
El comportamiento de este compuesto en la prueba es muy irregular y poco
confiable
0
2
4
6
8
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 397847665182787068397847
4 vinylfenol
0
2
4
6
8
10
12
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 11071 28438 00204 0
4 vinylfenol
79
Figura 19 Comportamiento del compuesto 4 etilfenol durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
La concentracioacuten de 4 etil fenol fue mayor al cuarto diacutea almacenado a
temperatura ambiente de 20C pero este compuesto no tuvo una actividad notoria
de ascenso durante su almacenamiento como se esperaba lo que deja muchas
dudas sobre los resultados de este ensayo
0
05
1
15
2
25
3
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etil fenol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 20C
80
Figura 20 Comportamiento del compuesto 4 etil guayacol durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
Comportamiento anormal del compuesto no se ve tendencias de aumento o
disminucioacuten de este en ninguna de las pruebas no tiene un comportamiento
regular pues se esperaba que la levadura BrettanomycesDekkera
descarboxinizara el compuesto 4-vinilguaiacol y aumentar las concentraciones de
4-etilguaiacol esta reaccioacuten no se hizo notoria en los compuestos aromaacuteticos
seguacuten lo determino el Cromatografo de Gas (GC)
0
005
01
015
02
025
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3
C (
mg
L)
4 etil guayacol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 20C
81
Figura 21 Comportamiento del compuesto 4 Vinyl fenoll durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
La no presencia de este compuesto en el vino original demuestra las baja o casi
nula presencia de la levadura BrettanomycesDekkera al diacutea primero este
compuesto incrementa de forma notoria en las muestras debido a la presencia de
acido cumaacuterico en el medio ya que sufre su carboxilacion convirtieacutendose en 4 vinyl
fenol sin embargo su comportamiento no fue regular y presento problemas de
lecturas
0
2
4
6
8
10
12
14
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
C (
mg
L)4 Vinyl fenol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 28C
82
9 CONCLUSIONES Y
RECOMENDACIONES
91 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO
Se desarrolloacute un medio selectivo soacutelido para BrettanomycesDekkera
accesible y faacutecil de elaborar
Se detectan colonias de la levadura BrettanomycesDekera en el agar
selectivo con glucosa como fuente de carbono en un lapso de 5 diacuteas en
incubacioacuten a 28C
El medio selectivo soacutelido con Glucosa como fuente de carbono fue maacutes
raacutepido y efectivo ya que toma 5 diacuteas para dar resultados positivos frente al
de Etanol como fuente de carbono el cual toma 10 diacuteas para mostrar
resultados positivos aunque ambos dieron resultados satisfactorios en la
selectividad de la levadura BrettanomycesDekkera
La levadura se adapto de forma satisfactoria a estos medios en
condiciones de almacenamiento propias para su desarrollo (28C)
Las colonias de la levadura BrettanomycesDekkera tiene un crecimiento
en estos medios soacutelidos de forma circular con topografiacutea convexa y borde
entero dimensiones 5-6 mm color Amarillo opacicidad oscuro
83
superficie lisa y suave siendo faacutecil de identificar y realizar los conteos
necesarios
El medio solido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten
de la levadura BrettanomycesDekkera en vino tinto es raacutepido econoacutemico
y uacutetil
El uso de azucares para fermentacioacuten de la levadura
BrettanomycesDekkera que Saccharomyces no puede fermentar para
mayor selectividad
Realizacioacuten de pruebas Bioquiacutemicas como meacutetodo raacutepido de selectividad
92 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DESARROLLO DEL MEDIO LIacuteQUIDO
Se desarrollo un medio selectivo liquido para BrettanomycesDekkera
accesible y faacutecil de elaborar
Este medio mostroacute resultados positivos de la presencia de
BrettanomycesDekkera en un lapso de tiempo menor (3 diacuteas) que con el
medio solido (5 diacuteas) en caso de que el nuacutemero de ceacutelulas de la levadura
BrettanomycesDekkera sea mayor a la poblacioacuten critica (103)
Cuando la poblacioacuten de ceacutelulas de la levadura BrettanomycesDekkera es
menor a la poblacioacuten critica el tiempo de identificacioacuten de esta levadura por
medio liquido es muy prolongado puede tomar maacutes de 10 diacuteas o incluso no
detectarlo
84
Los compuestos quiacutemicos usados para el desarrollo del medio liacutequido no
son los adecuados para este tipo de medios donde los resultados positivos
son olfativos pues estos compuestos emiten fuertes olores que confunden
los olores caracteriacutesticos del caraacutecter Brett
El medio liquido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten
de altas concentraciones de la levadura BrettanomycesDekkera en vino
tinto es raacutepido econoacutemico y uacutetil
93 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg
EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE DALMACIA
CROACIA
Este trabajo mostroacute que el dioacutexido de azufre (SO2) tiene buenos resultados
en contra de la levadura BrettanomycesDekkera en concentraciones
normales de 40mgl concentracioacuten en la que se trabaja este compuesto en
los vinos tintos
En Europa el dioacutexido de azufre es usado de forma tradicional en gran
nuacutemero de alimentos y especialmente en vinos sin embargo y a pesar de
su uso regulado se busca la sustitucioacuten de este o su maacutexima reduccioacuten
para hacer de este producto maacutes sano para las personas no tolerantes a
este tipo de compuestos sin embargo seguacuten el trabajo realizado en
comparacioacuten con el producto Antibrettreg el SO2 es maacutes eficaz en el control
85
de la levadura ayudando a evitarla y eliminarla de la cadena productiva del
vino tinto
Gracias a sus caracteriacutesticas el vino tinto Babic es muy vulnerable a la
levadura BrettanomycesDekkera pero a su vez se puede tratar faacutecilmente
con productos como SO2 y Antibrettreg aunque es maacutes efectivo contra
BrettanomycesDekkera el dioacutexido de azufre (SO2)
Antibrettreg es una buena opcioacuten para el control de BrettanomycesDekkera
para evitar el uso de productos alergenicos como SO2
94 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN
EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO
MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE
Al terminar la primera prueba con anaacutelisis en cromatografiacutea a gas y el SPME
queda como resultados
Es necesario repetir la prueba
No se determina el efecto de los estaacutendares internos sometidos a tiempos
de almacenamiento en temperaturas de 20C y 28C lo que puede dar falsos
resultados de cantidades de compuestos
86
Se debe crear un medio maacutes apto para el desarrollo de la levadura y un
control diario de crecimiento ( agregar maacutes Glucosa en caso de que se
haya consumido toda controlar presencia de Bacterias y otros
microorganismos que no se deseen en el medio)
Es necesario control de aromas con panel sensorial para determinar el
umbral de deteccioacuten en este vino
Control de crecimiento por medio solido Selectivo para
BrettanomycesDekekra conteo de colonias presentes en el vino inoculado
y su desarrollo durante almacenamiento a diferentes temperaturas
La segunda prueba no fue posible realizarla por dantildeos en el equipo de
cromatografiacutea de gas (GC)
87
ANEXOS
11
89
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientiacuteficas 99 Grupos de
Investigacioacuten Enoloacutegica Zaragoza Espantildea
93
11
GRACIAS es una palabra corta para todo lo que quiero expresar a todos aquellos que
hicieron parte de este suentildeo hecho realidadhellip
A Dios y a la virgen Auxiliadora por llevarme de su mano cada diacutea de mi carrera en cada
momento alegre y en cada momento difiacutecil fueron mi fortaleza
A mis papitos por hacer de mi estudio una realidad por su sacrificio y apoyo desinteresado y
sincero
A mi Hermanito por ser mi fortaleza mi ejemplo y mi amigo incondicional
A mi familia Blanco y Urrea por su compantildeiacutea durante esta etapa
A mi facultad (Decano Dr Camilo Rozo Dra Patricia Jimeacutenez y mis profesores) por
ensenarme mi profesioacuten y aportar lo mejor de ustedes para mi formacioacuten personal
A mis asesores de Tesis (Ing Patricia Chaparro y Dr Sc Leo Gracin) por su guiacutea y
colaboracioacuten oportuna
A mis queridos amigos quienes siempre han estado a mi lado en las dificultades y en las
alegriacuteas (Ingrid Mafe Cami G Cami R Harold Pipe Karla Andreacutes T Diego G)
A IAESTE en alianza con el ORI por hacer posible mi intercambio y poder hacer mi tesis en el
maravilloso paiacutes de Croacia
A Croacia por ser mi segundo hogar por abrirme sus puertas y su corazoacuten por brindarme
tan maravillosas personas en mi camino
Croatia Thank you for being my second home for opening your doors and your heart to me
and give me the opportunity to meet so many wonderful people
To my boss my teacher my mentor and specially my friend Leo
To the faculty of food technology and Biotechnology and the department of technology
and analysis of beverages for give me the opportunity to give all my knowledge to the
project and learn a lot more
To all the amazing people I met during this experience (Igor Karin Natka Josip Ana Matija
Daniel Pz Szilvia Dini Daniela Lidija Sanja and everybody else who I had the pleasure to
meet in this great trip) for give me the best of your hearts
I only have one thing to say hellipTHANK YOU
Solo me queda una palabra por decirhellipGRACIAS
CONTENIDO
paacuteg
RESUMEN ----------------------------------------------------------------------------------------------------- 6
ABSTRACT ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 7
INTRODUCCION -------------------------------------------------------------------------------------------- 8
1 MARCO TEORICO -------------------------------------------------------------------------------------- 10
11 REPRODUCCION -------------------------------------------------------------------------------------- 10
111 GEMACIOacuteN MULTILATERAL --------------------------------------------------------------------------------- 12
112 GEMACIOacuteN POLAR ------------------------------------------------------------------------------------------- 12
113 FISIOacuteN ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 12
114 PSEUDOMYCELIUM ------------------------------------------------------------------------------------------ 13
12 TAXONOMIA ------------------------------------------------------------------------------------- 13
121 DEKKERABRETTANOMYCES ------------------------------------------------------------------------- 14
13 CARACTERISTICAS FISIOLOGICAS ----------------------------------------------------- 16
132 IDENTIFICACIOacuteN DE BRETTANOMYCESDEKKERA ----------------------------------------------- 21
14 MEDIOS SOacuteLIDOS SELECTIVOS ----------------------------------------------------------------- 21
15 DIOacuteXIDO DE AZUFRE (SO2) EN VINOS ---------------------------------------------------------- 23
151 FORMAS DEL DIOacuteXIDO DE AZUFRE (SO2) ---------------------------------------------------------------- 24
152 INHIBIDOR MICROBIANO ------------------------------------------------------------------------------------ 25
16 ANTIBRETTreg COMO ALTERNATIVA DE PREVENCIOacuteN Y ELIMINACIOacuteN DE
BRETTANOMYCESDEKKERA ------------------------------------------------------------------------------- 27
2 PROBLEMA -------------------------------------------------------------------------------------- 29
3 JUSTIFICACION -------------------------------------------------------------------------------- 31
4
4 OBJETIVOS ------------------------------------------------------------------------------------------------ 32
41 GENERAL ------------------------------------------------------------------------------------------------- 32
42 ESPECIacuteFICOS ---------------------------------------------------------------------------------------------- 32
5 ALCANCES --------------------------------------------------------------------------------------- 33
6 ESTADO DEL ARTE --------------------------------------------------------------------------- 34
7 MATERIALES Y METODOS ----------------------------------------------------------------- 39
71 MEDIO SOLIDO SELECTIVO PARA BRETTANOMYCESDEKKERA ------------------------- 39
711 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------------- 39
712 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------------ 39
72 MEDIO LIacuteQUIDO SELECTIVO PARA BRETTANOMYCESDEKKERA ------------------ 42
721 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------- 42
722 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------- 42
73 INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO DE
LA REGION DE DALMACIA CROACIA ------------------------------------------------------------- 44
731 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------- 44
732 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------- 44
74 DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO
BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE --- 46
741 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------------- 46
742 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------------ 46
8 DISCUSIOacuteN Y RESULTADOS --------------------------------------------------------------- 48
81 RESULTADOS PARA EL DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO ------------------- 48
82 RESULTADOS PRUEBAS MEDIO LIQUIDO -------------------------------------------- 53
83 RESULTADOS DE LA INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg
EN VINO TINTO DE LA REGION DE DALMACIA CROACIA ----------------------------------- 55
5
84 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN EL
VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID
PHASE --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 65
841 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGUacuteN TEMPERATURAS DE
ALMACENAMIENTO --------------------------------------------------------------------------------------------- 70
9 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES --------------------------------------------- 82
91 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA DESARROLLO DEL MEDIO
SOLIDO 82
92 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA DESARROLLO DEL MEDIO
LIacuteQUIDO ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 83
93 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA INFLUENCIA DE DIOXIDO
DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE
DALMACIA CROACIA ----------------------------------------------------------------------------------- 84
94 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA DETERMINACION DE
AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL
METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE ---------------------------------------------- 85
ANEXOS ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 87
6
RESUMEN Este estudio presenta el desarrollo y evaluacioacuten de simples meacutetodos para la deteccioacuten de
la levadura BrettanomycesDekkera en vino y su medio de produccioacuten con el uso de
medio solido y liquido selectivo ademaacutes se evaluacutea el efecto del Dioacutexido de Azufre SO2 y
AntiBrettreg en vino tinto de la regioacuten de Dalmacia Croacia El meacutetodo de deteccioacuten de
esta levadura emplea medios selectivos enriquecidos los cuales contienen Glucosa (20
grl) en comparacioacuten con Etanol (6ml l) como fuentes de carboacuten y energiacutea cicloheximida
(30 grl) para prevenir la presencia de Sachharomyces ampicilina (10 mgL) como
antibioacutetico para prevenir el crecimiento de bacterias y acido p-cumaacuterico (100 mgL) como
precursor de la produccioacuten de 4-etilfenol para el medio solido el uso de agar se realiza
en una concentracioacuten de 16 grL Despueacutes de la siembra realizada en los medios (solido y
liquido) de vino contaminado con la levadura BrettanomycesDekkera es monitoreado
diariamente micro y macroscoacutepicamente
Una muestra de vino tinto Babic de Croacia fue contaminado con colonias de la levadura
BrettanomycesDekkera y fue dividido en 8 muestras de las cuales 2 de estas fueron
monitoreadas como control sin adicioacuten de ninguacuten compuesto 2 con adicioacuten de dioacutexido de
azufre SO2 en una concentracioacuten de 40mgL y 4 de estos con AntiBrettreg en una
concentracioacuten de 40grHl El meacutetodo de este estudio se basa en la determinacioacuten del
comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en estas condiciones Este se
evaluoacute en teacuterminos de crecimiento de la citada levadura (UFCml) presentes en las
muestras y anaacutelisis fisicoquiacutemicos antes y despueacutes de 15 diacuteas de adicioacuten y monitoreo
7
ABSTRACT
This experiment presents the development and testing of a simple way to detect
BrettanomycesDekkera from wine and wine environments using selective media in solid
phase and liquid phase and the influence of Sulfur Dioxide (SO2) and Antibrett reg in red
wines from Dalmatian region The method of detection of this yeast employs selective
enrichment mediums These mediums contains glucose (20gl) and Ethanol (6) as
carbon and energy source cycloheximide (30 mgl) to prevent growth of Sachharomyces
ampicilin (10 mgl) to prevent growth of bacteria and p-coumaric acid (100 mgl) as a
precursor of the production of 4-etilphenol depending on the phase of the medium agar
compound is used in a concentration of 16 grl After putted on the medium wine
contaminated with BrettanomycesDekkera is monitored by micro and macro inspection
also with the liquid medium
A red wine from Dalmatian region was contaminated with BrettanomycesDekkera colonies
and divided in 8 different containers from these 8 containers we had two for control no
addition two with addition of Sulfur Dioxide (SO2) in a concentration of 40 mgl and four of
them with Antibrett reg in a concentration of 40gHl The method for this study is based in
following the behavior of the yeast BrettanomycesDekkera with these compounds in this
wine this behavior was monitored based in CFUml showing in the samples and physic
and chemical analysis before addition and 15 days after
8
INTRODUCCION
Las levaduras del geacutenero Brettanomyces o su forma telemoacuterfica (nombre que
reciben las especies que presentan reproduccioacuten sexual y en consecuencia
formacioacuten de esporas por meiosis) Dekkera fueron descritas por primera vez por
Claussen en 1903 en la produccioacuten de cerveza1
Este geacutenero se conoce desde hace tiempo como agente contaminante en la
industria cervecera de la sidra y de bebidas carbonatadas2 En la industria
enoloacutegica su descripcioacuten como alterante es maacutes reciente
Durante los antildeos 1950s muchos autores reportaron el aislamiento del genero
Brettanomyces en uvas francesas e italianas (Van der Walt y Van der Kerken
1958) Sin embargo en muchas regiones del mundo viniacutecola esta levadura no ha
sido identificada lo cual dificulta su deteccioacuten en materiales o productos
contaminadosEntre todos los microorganismos la levadura
BrettanomycesDekkera es una de las maacutes temidas por los vinicultores El
crecimiento y desarrollo de esta levadura causa alteraciones denominadas
ldquocaraacutecter Brettrdquo lo cual ocurre especialmente en vinos tintos3
1 Gilliland R Brettanomyces I Occurrence characteristics and effects on beer flavor J Inst Brew
1961
2 Deak T y Beuchat LR Handbook of spoilage yeast CRC Press Nova York 1996
3 Heresztyn T Archives of Microbiology 1986 Metabolism of phenolic compounds from
hydroxycinnamic acids by Brettanomyces yeast
9
El ldquocaraacutecter Brettrdquo produce un amplio espectro de sabores y aromas alterantes
entre los cuales estaacuten corral minerales tinta tabaco cuero faacutermacos y
ahumado estas alteraciones se le atribuyen a los compuestos 4-etilfenol y 4-
etiguayacol las cuales causan una supresioacuten de aromas atractivos en el vino
como de frutas y flores y perdida de sabores agradables para el consumidor como
acido salado amargo o picante 4
Esta levadura tiene distinto comportamiento seguacuten el tipo de vino al que esteacute
asociada pues cada tipo de vino tiene diferente composicioacuten de carbonos
nitroacutegenos vitaminas y minerales
Con este estudio se evaluacutea el comportamiento y caracterizacioacuten de la levadura
BrettanomycesDekkera en vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia con
el desarrollo de medios solido y liquido para la selectividad de la levadura
alteraciones aromaacuteticas del vino tinto Babic producidas por 4 etilfenol y 4
etilguayacol y el comportamiento de BrettanomycesDekkera en el vino al ser
tratado con Dioacutexido de azufre (SO2) comparativamente con tratamiento Antibrettreg
4 Boulton Singleton Bisson amp Kunkee 1996 Descripcioacuten de aromas fenoacutelicos
10
1 MARCO TEORICO
Las levaduras representan el grupo de microorganismos maacutes importante en la
industria viniacutecola porque sin Saccharomyces producir vinos de alta calidad seriacutea
imposible Ademas de Saccharomyces hay muchos otros geacuteneros y especies de
levaduras presentes durante la vinificacioacuten que afectan la calidad del vino positiva
o negativamente5
Las levaduras comprenden 39 geacuteneros y 350 especies Se identifican y clasifican
basaacutendose en caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas Entre los aspectos
morfoloacutegicos considerados se encuentran el tamantildeo y la forma de las ceacutelulas en
medios soacutelidos y liacutequidos especificados el modo de reproduccioacuten y si forma velo
en la superficie o sedimenta en un medio liacutequido Entre las caracteriacutesticas
fisioloacutegicas consideradas se encuentra si puede crecer (y fermentar) en un
determinado carbohidrato y si puede o no utilizar determinadas fuentes de
nitroacutegeno como los nitratos6
11 REPRODUCCION
Las levaduras son agrupadas en tres familias conocidas como
Saccharomycetaceae Sporobolomycetaceae y Cryptococcaceae Estas
5 H Erten June 2002 Relations between elevated temperatures and fermentation behavior of
Kloeckera apiculata and Saccharomyces cerevisiae associated with winemaking in mixed culture
World Journal of Microbiology and Biotechnology Volume 18 N 4 pag 1 Adana Turkey 6 Cerveceros de Argentina 2006 Levadura wwwcervezadeargentinacomararticuloslevadurahtm
11
representan el grupo de microorganismos entre bacterias y hongos respecto a su
tamantildeo de ceacutelula Este grupo es caracterizado por su forma de reproduccioacuten
vegetativa conocida como ldquogemacioacutenrdquo Bajo condiciones optimas una ceacutelula
madre puede gemar varias veces durante el periodo reproductivo Sin embargo
bajo estrictas condiciones de fermentacioacuten una levadura va a gemar solamente
entre tres o cuatro veces Aquiacute la disponibilidad de oxigeno la cual es necesaria
para la formacioacuten de precursores de la membrana de la ceacutelula limita la
replicacioacuten7
Estos microorganismos muestran varios tipos de gemacioacuten lo cual puede dar un
valor diagnostico Entre aquellas aisladas de fermentacioacuten y antildeejamiento del vino
se observan maacutes frecuentemente multilateral y gemacioacuten polar 8
La modalidad maacutes comuacuten es la gemacioacuten proceso asexual en el cual la ceacutelula
progenitora emite un conducto tubular desde la vacuola nuclear hacia un punto
perifeacuterico proacuteximo a la misma Entonces se forma en la direccioacuten del conducto
una pequentildea protuberancia en la superficie externa de la ceacutelula y el conducto
pasa atravesando la pared celular a dicha protuberancia la cual se ensancha
llenaacutendose con el material citoplaacutesmico y nuclear de la ceacutelula progenitora Cuando
el brote o yema formada llega a ser casi tan grande como la ceacutelula progenitora los
aparatos nucleares de ambas ceacutelulas se orientan de forma que sus centrosomas
respectivos equidisten del punto de unioacuten Al llegar este momento la ceacutelula madre
y la ceacutelula hija se separan y se inicia la formacioacuten de nuevas ymas En la
gemacioacuten normal no se forman tabiques de separacioacuten entre ceacutelula madre y
ceacutelulas hijas pero en algunos casos el proceso se inicia en la gemacioacuten y se
completa por divisioacuten con la separacioacuten definitiva de ambos individuos La ceacutelula
madura de puede producir por gemacioacuten durante el curso de vida un promedio de
7 Brinton M Miller and Warren Litsky PhD 1976 Industrial Microbiology Edi Mac Graw Hill United States
of America
8 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures
edi Springer second edition Fresno California United States of America
12
24 generaciones de ceacutelulas hijas Las yemas sucesivas se forman siempre en
sitios diferentes de la superficie de la ceacutelula9
111 Gemacioacuten multilateral
La gemacioacuten multilateral ocurre en el ldquohombrordquo o aacuterea de la levadura donde ocurre
la reproduccioacuten La gemacioacuten y ciclo de separacioacuten crea un problema para las
levaduras durante su fase fermentativa pues en este tiempo la ceacutelula madre se
reduce aproximadamente un medio Porque la siacutentesis de la membrana celular
ocurre bajo condiciones anaeroacutebicas lo que limita los ciclos asexuales
replicativos Como resultado la mayoriacutea de las fermentaciones se completan en la
fase estacionaria (no gemacioacuten) Un ejemplo de esta reproduccioacuten es
BrettanomycesDekkera10
112 Gemacioacuten Polar
A diferencia de la gemacioacuten multilateral la gemacioacuten polar puede ocurrir en uno o
dos polos En el caso de Kloeckera y Saccharomyces la gemacioacuten ocurre en
ambos polos aumentando la poblacioacuten de levaduras con forma de ldquolimoacutenrdquo 11
113 Fisioacuten
Esta reproduccioacuten es caracteriacutesticas del genero Schizosaccharomyces donde la
formacioacuten de la ceacutelula hija ocurre sin la reduccioacuten de la madre ceacutelula como en los
casos anteriores En este caso la formacioacuten de la microscoacutepica pared celular
ocurre entre la madre ceacutelula y la hija seguida por la separacioacuten12
9 Araya Pablo 2002 Reproduccioacuten de hongos unicelulares mediante gemacioacuten esporulacioacuten y
fisioacuten httphtmlrincondelvagocomreproduccion-asexualhtml
10 11 12 Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic
Publishers GmbH United States of America and Canada
13
114 Pseudomycelium
Cualquier fabricante de vinos ha tenido la oportunidad de notar la formacioacuten de
una peliacutecula en la superficie del vino Esto surge debido a la gemacioacuten repetida de
las levaduras oxidativas y fallas en el momento de la separacioacuten de la ceacutelula hija
de la madre Con el tiempo el lazo previo entre la madre ceacutelula e hija se ampliacutea
dando la impresioacuten de filamentos como si se tratase de mohos siendo que son
levaduras 13
12 TAXONOMIA
Para distinguir las levaduras que pueden producir ascoporas de aquellas que no
los micologistas usan doble taxonomiacutea para su clasificacioacuten Desafortunadamente
la nomenclatura para la combinacioacuten anamorfotelemorfo es frecuentemente
diferente Unos ejemplos de levaduras sexualasexual o telemorfoanamorfo son
DekeraBrettanomyces Metschnikowia pulcherrimaCandida pulcherrima
Hanseniaspora uvarumKloeckera apiculata Torulaspora delbruecki Candida
colliculosa 14
Sin embargo las levaduras son diferenciadas por los taxonomistas por asignacioacuten
de varios nombres de geacutenerosespecies varios vinicultores usan un sistema
informal para agrupar levaduras basadas en su morfologiacutea u otras caracteriacutesticas
Por ejemplo a Kloeckera apiculata se le refiere como ldquolevadura apiculadardquo
tiene forma de limoacuten Esta levaduras asi com muchas otras presentes en el mosto
de la uva como lo son Candida Cryptococcus Debaryomyces Hansenula
Issatchenkia Kluyveromyces Metschnikowia Pichia y Rhodotorula tambieacuten son
llamadas levaduras ldquonativasrdquo ldquonaturalesrdquo o ldquosalvajesrdquo por su origen el vintildeedo o en
13
Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers
GmbH United States of America and Canada
14 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
14
la vinera Algunos enoacutelogos han discutido contra el uso de estos teacuterminos porque
esta implicancia no sucede en todas las levaduras ya que estas son de alguna
forma ldquono-nativasrdquo o ldquono naturalesrdquo (Ej Saccharomyces o Brettanomyces) El
teacutermino ldquono Saccharomycesrdquo es maacutes comuacuten para nombrar aquellas levaduras
presentes en el mosto de la uva que no son del genero Saccharomyces15
Las levaduras encontradas despueacutes de la fermentacioacuten alcohoacutelica tambieacuten son
asignadas a un grupo informal Algunas veces las levaduras que conducen la
principal fermentacioacuten (Saccharomyces) son muchas veces llamadas ldquolevaduras
fermentativasrdquo basados en su metabolismo Durante su antildeejamiento algunas
levaduras (Candida Hansenula y Pichia) pueden crecer en la superficie en
presencia de oxigeno Esta peliacutecula superficial es comuacutenmente asociada a
deterioro del vino esta levadura se le conoce como ldquolevadura formadora de
peliacuteculardquo16
121 DekkeraBrettanomyces
La taxonomiacutea cientiacutefica sobre BrettanomycesDekkera ha cambiado en los uacuteltimos
antildeos Brettanomyces estaacute clasificado dentro de la misma familia que
Saccharomyces (familia Saccharomycetaceae) Actualmente dentro del geacutenero
Brettanomyces se aceptan cinco especies diferentes (B bruxellensis B
anomalus B custersianus B nanas y B naardenensis)17
Las teacutecnicas de biologiacutea molecular han demostrado que B intermedious B
lambicus B custerseii o D intermedia son sinoacutenimos de B bruxellensis por lo
que estas denominaciones han quedado en desuso Los microorganismos de este
geacutenero presentan dos formas una capaz de reproducirse sexualmente (Dekkera)
15
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
16 Kurtzman CP 1998 The industrial and agricultural significance of yeasts 4
th Edition Amsterdam
Holanda
17 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
15
y otra que lo hace asexualmente (Brettanomyces) Tambieacuten se llaman
respectivamente forma perfecta y forma imperfecta En algunos casos la forma
perfecta y la imperfecta reciben nombres diferentes como ocurre con B anomalus
y D anomala En otros casos el nombre es similar como las pertenecientes a la
especie bruxellensis que pueden parecer como D bruxellensis como B
bruxellensis o como BrettanomycesDekkera A efectos praacutecticos en la bodega
estos dos estados son similares Cuando vemos referencias a Brettanomyces
como contaminante en la mayor parte de los casos se refieren a
DekkeraBrettanomyces ya que este es el responsable de las alteraciones en el
vino18 y 19
La morfologiacutea celular de BrettanomycesDekkera es ojival o ciliacutendrica con
gemacioacuten multipolar en reproduccioacuten vegetativa Una de las caracteriacutesticas de
este geacutenero es su tamantildeo celular variable y la formacioacuten de filamentos19
18 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 23
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
19
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
16
Figura 1 Microfotografiacutea de cultivo de BrettanomycesDekkera a) Variabilidad morfoloacutegica y de
tamantildeo celular b) forma filamentosa
Fuente Lopez-Cordon Eva BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia wwwacenologiacom
Los defectos sensoriales asociados directamente a Brett aparecen
mayoritariamente en vinos tintos de calidad y las causas radican en la propia
fisiologiacutea del microorganismo Ademaacutes al ser una levadura de crecimiento muy
lento la alteracioacuten se presenta principalmente durante el almacenamiento y sobre
todo la crianza del vino habitual en los vinos tintos de gama alta En las barricas
de madera el microorganismo tiene a su disposicioacuten todo el sustrato y tiempo
suficiente para realizar su actividad La naturaleza porosa de la madera y su difiacutecil
limpieza contribuye a que las poblaciones existentes se mantengan incluso
despueacutes del lavado de la barrica Ademaacutes BrettanomycesDekkera tiene la
capacidad de degradar uno de sus componentes la celobiosa 20
13 CARACTERISTICAS FISIOLOGICAS
S cerevisiae y BrettanomycesDekkera tienen metabolismos similares muy
adaptados a las condiciones de vinificacioacuten Tras la fermentacioacuten alcohoacutelica S
cerevisiae es la levadura mayoritaria debido a que las condiciones nutricionales
20
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
17
del vino son muy estrictas (altas concentraciones de etanol y bajas
concentraciones de nutrientes) En este momento BrettanomycesDekkera
continuacutea creciendo gracias a que utiliza nutrientes que S cerevisiae no ha podido
consumir sobre todo algunos azuacutecares y fuentes de nitroacutegeno21
Una de las caracteriacutesticas que diferencia a BrettanomycesDekkera es la gran
diversidad de azuacutecares que puede fermentar (ver tabla de Relacioacuten de los
principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) La mayoriacutea de
las cepas pueden crecer utilizando trealosa y celobiosa azucares presentes en el
vino y no consumibles por S cerevisiae Otra de las ventajas que presenta frente
a S cerevisiae (y frente a la mayoriacutea de las levaduras) es que puede utilizar los
nitratos como fuente de nitroacutegeno Debido a que S cerevisiae soacutelo utiliza el
nitroacutegeno amoniacal y los aminoaacutecidos libres estos se consumen con relativa
rapidez Al final de la fermentacioacuten el nitroacutegeno moniacal es escaso y se favorece
el crecimiento de las levaduras que pueden utilizar otras fuentes de nitroacutegeno
Ademaacutes Brettanomyces puede crecer con concentraciones de fosfato diamoacutenico
tan bajas como 05gl o a partir de diversos aminoaacutecidos En resumen
BrettanomycesDekkera crece maacutes despacio que S cerevisiae es resistente a
concentraciones altas de alcohol puede utilizar otros azucares como fuentes de
energiacutea y nitrato como fuente de nitroacutegeno Esto explica que pueda reproducirse
cuando la fermentacioacuten alcohoacutelica ha terminado a partir de nutrientes no
consumibles por S cerevisiae y cuando no tiene competidores22
21
Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
22 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
18
Tabla 1 Relacioacuten de los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto
Fuente Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista
VINOTEQ N 38 pag 21 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
131 BrettanomycesDekkera y siacutentesis de fenoles volaacutetiles
El origen de los fenoles volaacutetiles estaacute relacionado con la actividad secuencial de
dos enzimas que descarboxilan los aacutecidos en hidroxiestirenos (vinilfenoles) que
19
son posteriormente reducidos a etilderivados (etilfenoles)23 como puede
observarse en la figura 2
Figura 2 Siacutentesis de etilfenoles de BrettanomycesDekkera
Fuente ACE revista de Enologia wwwacenologiacom
El primer paso de descaboxilacion de los aacutecidos hidroxicinamicos es comuacuten
tambieacuten en otros microorganismos como bacterias hongos y otras levaduras Sin
embargo el segundo paso reduccioacuten de vinilfenoles es caracteriacutestico de algunos
tipos de levaduras como Dekkera bruxelliensis D anomala Pichia guillermondi
Candida versarilis C halophila y C mannitofaciens24
Los fenoles volaacutetiles que se asocian al problema Brett en vinos son el 4-etilfenol y
el 4- etilguaiacol asiacute como sus precursores intermedios 4-vinilfenol y 4-
vinilguaiacol aunque estos uacuteltimos son menos importantes por ser muy reactivos y
raacutepidamente convertidos en etilfenoles por BrettanomycesDekkera o en su caso
23
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
24 Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
20
condensan con otras moleacuteculas como antocianos25 Los etilfenoles y
especialmente elevadas concentraciones de 4-vinilfenol en vinos se asocian con
aromas desagradables asociados a descriptores como ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de
caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo26
El umbral sensorial del 4-etilfenol es de 230 μg l-1 y el del 4-etilguaiacol es de 47
μgl Pese a su menor umbral sensorial el 4-etilguaiacol responde a descriptores
como ldquobaconrdquo o ldquoahumadordquo que a bajas concentraciones aportan complejidad por
lo que se puede considerar sensorialmente menos conflitivo que el 4-etilfenol 27
Figura 3 Defectos sensoriales producidos en el vino por BrettanomycesDekkera
Fuente Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
25 Morata A Goacutemez-Cordoveacutes M Calderoacuten F Suaacuterez J 2006 Effects of pH temperature and SO2 on the
formation of pyranoanthocyanins during red wine fermentation with two species of Saccharomyces Journal Food Microbiology No106 pag 4 Madrid Espana
26 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea 27 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
21
132 Identificacioacuten de BrettanomycesDekkera
Los Bioacutelogos usan sistemas de identificacioacuten basados en similitudes taxonoacutemicas
entre organismos dichas similitudes pueden ser morfoloacutegicas tipos capacidad de
produccioacuten de sustratos como azuacutecar yo nitratos caracteriacutesticas fisioloacutegicas y
bioquiacutemicas secuencia del material geneacutetico y respuestas inmunoloacutegicas28
En la industria viniacutecola es importante recurrir a diferentes tipos de pruebas para la
identificacioacuten de microorganismos una de estas y la maacutes realizada es la revisioacuten
del microorganismo bajo el microscopio Esta prueba brinda informacioacuten sobre la
morfologiacutea del microorganismo (cocos bacilos formas puntudas ojival entre
otros) tamantildeo (dimensiones) agrupaciones celulares (solas parejas triacuteos
grupos o cadenas) Sin embargo el uso del microscopio es una prueba raacutepida
para examinar mostos o vino pero no determina cantidades que muchas veces es
requerido para tratamientos de accioacuten otro de los inconvenientes es que los
microorganismos pueden variar su morfologiacutea en forma o tamantildeo dependiendo de
la edad y las condiciones de crecimiento por lo que puede no ser clara la
identificacioacuten de este29
14 Medios soacutelidos selectivos
Si se requiere de la confirmacioacuten del microorganismo este debe ser aislado del
vino para una caracterizacioacuten para esto se requiere de medios soacutelidos Cuando se
examina un microorganismo en un medio solido es importante revisar las
caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias (ver figura 4 Morfologiacuteas de colonias
en medios soacutelidos) Entre estas caracteriacutesticas estaacuten forma (circular irregular o
2829 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
22
rizada) tamantildeo (dimensiones estas normalmente se expresan en miliacutemetros)
topografiacutea (plano elevado convexo coacutencavo o embonado) presencia de
pigmentos opacidad (transparente traslucido u opaco) superficie (suave rugosa
lisa o aacutespero) bordes (entero ondulado crespo dentado rizado) o cualquier
cambio en el agar (color opacidad cambios en los indicadores de pH o CaCO3
respectivamente)30
Figura 4 Varias morfologiacuteas de crecimiento de colonias en medio solido
Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007
Gran nuacutemero de medios selectivos se han creado para la aislacioacuten deteccioacuten yo
conteo de levaduras provenientes de jugos de uva mostos o vinos El medio maacutes
utilizado en estos fines es YPD (Yeast Peptone Dextrose) pero dicho medio no
es selectivo entre levaduras y se usa comuacutenmente para el conteo de
Saccharomyces31 Las colonias empiezan a parecer con un periodo de incubacioacuten
30
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
31 Essia Ngang J Wolniewicz E Villa P2005 Stimulation of lactobacilli during alcoholic fermentation action
of sucrose hydrolysis by yeast Biotechnology letters No 8 pag 743 Amiens France
23
de 2 a 4 diacuteas a 22C a 25C Igualmente el agar de jugo de uva es no selectivo y
presenta faacutecil crecimiento de levaduras bacterias y mohos
Para la levadura Brettanomyces Dekkera se han elaborado diferentes medios
selectivos entre ellos el maacutes conocido es WL por sus siglas en ingles del
laboratorio que lo creo ldquoWallerstein Laboratoriesrdquo este medio contiene
cicloheximida compuesto selectivo para Brettanomyces e inhibe Saccharomyces
El punto criacutetico es encontrar la cantidad exacta de este compuesto para la
inhibicioacuten de las levaduras sin que afecte a BrettanomycesDekkera32
Ademaacutes del medio WL BrettanomycesDekkera puede ser cultivado en otros
medios selectivos como Brettanomyces medio A creado por Vilas en 1993
Brettanomyces medio B el cual contiene cicloeximida como agente selectivo
mientras que Brettanomyces medio C tiene cicloheximida y ampicilina este medio
fue creado por B Watson en 1998 Brettanomyces medio D fue creado
recientemente por Rodrigues en 2001 este medio es conocido como DBDM
(DekkeraBrettanomyces differential medium ) es un medio selectivo para
Brettanomyces en contra de Saccharomyces y otras levaduras este medio es el
maacutes utilizado en la vineras para caracterizacioacuten de BrettanomycesDekkera
actualmente33
15 Dioacutexido de azufre (SO2) en vinos
32
33
Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers
GmbH United States of America and Canada
24
El dioacutexido de azufre tambieacuten llamado oxido de azufre es un eficaz agente
conservante antioxidante y antimicrobiano en la industria viniacutecola34
Durante la vinificacioacuten SO2 ha representado histoacutericamente una herramienta muy
importante usada por los vinicultores para el control de crecimiento microbioloacutegico
Debido a preocupaciones por la salud del consumidor el uso de este producto ha
disminuido dramaacuteticamente con el posible riesgo de aumentar el riesgo
microbioloacutegico35
El actual liacutemite legal de SO2 en vinos en los Estados Unidos es de 350mgL una
concentracioacuten mucho mayor a la usada en la industria viniacutecola No obstante vinos
que contienen maacutes de 10mgL deben declarar este compuesto en la etiqueta
porque SO2 es un metabolito que las levaduras usan durante la fermentacioacuten Los
vinos siempre contienen algo de sulfitos aunque la adicioacuten no se realice durante el
proceso36
151 Formas del Dioacutexido de Azufre (SO2)
Una vez disuelto en agua el dioacutexido de azufre existe en equilibrio entre SO2
molecular (SO2H2O) bisulfito (HSO3) y sulfito (SO32-) Este equilibrio depende del
pH Ademaacutes de estar en equilibrio con el molecular y especies sulfito el bisulfito
tambieacuten existe en forma ldquolibrerdquo y en forma ldquoatadardquo Aquiacute la moleacutecula reaccionara
34
Orwine Eureka 2008Investigadores europeos buscan alternativas al dioxido de azufre en vinos
httpawprowordpresscom20081107investigadores-europeos-buscan-alternativas-al-dioxido-de-
azufre-en-el-vino
3536 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
25
con compuestos carbonilos (ej Acetaldehiacutedo) formando productos adicionales
como Acido Hydroxysulfonico 37
Ademaacutes de Acetaldehiacutedo algunas moleacuteculas presentes en el jugo de uva que
reaccionan con bisulfito son acido piruvico α-keto-glutaric dihidroxyacetona
diacetyl Pigmentos de antocianinas entre otros38
152 Inhibidor Microbiano
El sulfuro molecular es la forma antimicrobiana del dioacutexido de azufre La cantidad
de SO2 molecular presente en cualquier vino no se mide directamente La
concentracioacuten es calculada conociendo la concentracioacuten de SO2 libre y el pH del
vino basaacutendose en la siguiente foacutermula
Alternativamente la figura 5 Se puede utilizar como guiacutea para aproximar la
cantidad de SO2 libre necesitada a determinado valor de pH de valores entre 05 o
08 mgl de SO2 molecular 39
El SO2 inhibe microorganismos de varias formas incluyendo rupturas de puentes
bisulfitos en proteiacutenas y reaccionando con coofactores como NAD+ y FAD tambieacuten
reacciona con ATP
3739
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
38 Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi
Springer New York United States
26
Figura 5 Cantidades de SO2 libre a un pH determinado para obtener 05 o 08 mgl de SO2
molecular
Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007
La concentracioacuten de SO2 molecular necesario para prevenir el crecimiento de
microorganismos variacutea seguacuten vinojugo pH temperatura poblacioacuten densidad y
diversidad estado de crecimiento grado de alcohol entre otros factores Beech
1979 sugirioacute una adicioacuten de 08 mgl de SO2 molecular como la cantidad
necesaria del compuesto en vinos blancos de mesa para dar una reduccioacuten de
cerca de 104 UFCml de la poblacioacuten de diferente tipo de microorganismos en 24
horas Las diferencias que existen entre las levaduras y bacterias en base a la
27
sensibilidad a este compuesto son dadas a conocer por diferentes autores (Warth
1977 1985 Du Toit 2005 Davis 1988 Hood 1983)40
16 Antibrettreg como alternativa de prevencioacuten y eliminacioacuten de
BrettanomycesDekkera
Antibrettreg es un producto nuevo creado por Spindal SARL-Gretz - Armainvilliers
Francia Es una preparacioacuten enzimaacutetica para inactivar Brettanomyces y para
reducir olores producidos por fenoles volaacutetiles41
Antibrettreg es preparado a base de paredes celulares de levadura activados
enzimaacuteticamente que presentan elevadas propiedades adsorbentes frente al 4-
etilfeno y 4- etilguayacol compuestos asociados con olores desagradables en el
vino tales como sudor de caballo farmacia o barniz42
Antibrettreg inhibe la produccioacuten de la vinilreductasa que participa en la
transformacioacuten de los aacutecidos cinaacutemicos naturalmente presentes en los vinos en
los correspondientes derivados etilados responsables de los olores atribuidos a
BrettanomycesDekkera 43
40
Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi
Springer New York United States
41 Manual de instrucciones de producto Antibrett reg producido por Spindal SARL-Gretz -
Armainvilliers France
424344 AEB Group 2008 ANTIBRETT Preparado a base de paredes celulares de levadura para la inactivacioacuten
de Brettanomyces y la eliminacioacuten de los olores de estos productos httpwwwaeb-
groupcomimgsSPAGNOLODepliantANTIBRETT-lett-ESPpdf
28
El uso de Antibrettreg es efectivo incluso contra otros olores anoacutemalos como los
que se generan en las barricas sucias principalmente huacutemedas dantildeando la
calidad olfativa del vino44
29
2 PROBLEMA
La levadura BrettanomycesDekkera es una levadura de contaminacioacuten presente
en la mayoriacutea de industrias viniacutecolas en el mundo Afecta directamente la
produccioacuten y calidad sensorial de los vinos con el desarrollo de los compuestos 4
etilfenol y 4 etilguayacol los cuales dantildean el perfil olfativo del vino dando aromas
caracteriacutesticas a ldquoestablordquo ldquocuerordquo ldquosudor de caballordquo o ldquobarnizrdquo conocido como
ldquocaraacutecter Brettrdquo
Esta contaminacioacuten se da especialmente en los vinos tintos debido a sus
caracteriacutesticas de produccioacuten (fermentacioacuten crianza antildeejamiento) y sus
propiedades fisicoquiacutemicas (Grado alcohoacutelico pH Acidez total Acidez volaacutetil
entre otros)
En Croacia existe una gran produccioacuten de vinos tintos entre los cuales se
encuentra el vino tinto Babic proveniente de la isla de Hvar el cual es famoso por
ser un vino duro carnoso estructurado y casi sobre-maduro con un grado
alcohoacutelico que ronda los 15 vv siendo la primera denominacioacuten de origen que
se aproboacute en Croacia en el antildeo 1961 este vino es de gran importancia en la
regioacuten la mayoriacutea de sitios de elaboracioacuten son pequentildeas industrias que han sido
afectadas por el bdquocaraacutecter Brett‟ Muchas investigaciones se han realizado al
respecto de la levadura BrettanomycesDekkera pero se conoce muy poco sobre
sus efectos en el vino Babic debido a sus caracteriacutesticas particulares (alcohol
30
15 pH 35 Acidez total 520 gr Acido TartaricoL Acidez volaacutetil 08 gr Acido
AceticoL Azucar residual 47 grLt)45
La dificultad de la pequentildea industria para acceder a productos que lleven a la
identificacioacuten de la levadura mencionada y de esta manera conllevar a planes de
accioacuten contra el ldquocaraacutecter Brettrdquo es una de las grandes dificultades de la industria
vinera en este paiacutes en donde los productos para la industria enoacuteloga son
complicados y de alto precio para acceder a ellos y en consecuencia no se
realizan muchas de estas pruebas de deteccioacuten de BrettanomycesDekkera
llevando al mercado productos contaminados de baja calidad que inicialmente
podriacutea haber sido un vino de alta calidad debido a sus caracteriacutesticas uacutenicas y de
gran popularidad
45
Datos obtenidos en el laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
31
3 JUSTIFICACION
Actualmente Croacia cuenta con maacutes de 300 zonas vineras en las que se producen 67
de vino blanco 32 vino tinto y el restante 1 vino rosado De acuerdo a recientes datos
estadiacutesticos hay 650 km2 de vintildeedos en Croacia de los cuales 375 km2 son uvas con
indicacioacuten geograacutefica de origen que producen maacutes de 300 vinos y maacutes de la mitad de este
nuacutemero son vinos elaborados en microempresas con un total de 50000000 de botellas
de vino el 8 es vino superior 70 de calidad y el 22 es vino de mesa de produccioacuten
nacional46
Croacia es un fuerte productor de vino a nivel regional con sus diferentes variedades
propias (Merlot Plavac Dingač Postup Malvazija Pošip Kujundžuša Babic) pero dicha
produccioacuten ha sido fuertemente afectada por la presencia de la levadura
BrettanomycesDekkera trayendo consecuencias como perdidas de produccioacuten peacuterdida
de calidad sensorial del vino grandes peacuterdidas econoacutemicas y desprestigio a sus vinos de
denominacioacuten de origen
Es por esto que en este proyecto de investigacioacuten se busca una faacutecil y raacutepida
identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera causante del ldquocaraacutecter Brettrdquo con el
desarrollo de medios selectivos liquido y solido ademaacutes de opciones para el tratamiento
yo prevencioacuten de esta levadura en la cadena productiva comparativamente entre dioacutexido
de azufre (SO2 ) y Antibrettreg y la identificacioacuten de los aromas caracteriacutesticos del ldquocaraacutecter
Brettrdquo en el vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia
46
Hrvatski zavod za vinogradarstvo i vinasrtvo 2003 Pravilnik o vinu httpwwwhrzvvhrpropisihtm
32
4 OBJETIVOS
41 General
Caracterizar y evaluar el comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera
en teacuterminos de crecimiento y produccioacuten de aromas no deseados en vino tinto
Babic
42 Especiacuteficos
Desarrollar el medio solido y medio liacutequido selectivo para
BrettanomycesDekkera
Evaluar el comportamiento de la levadura en estos medios selectivos
Determinar la influencia del Dioacutexido de azufre (SO2) y el compuesto
Antibrettreg en la levadura BrettanomycesDekkera presente en vino tinto
Babic 2007
Identificar los compuestos aromaacuteticos producidos por Brettanomyces
bruxellensis en vino tinto Babic usando el meacutetodo ldquomultiple headspace
solid-phase microextraction (SPME)rdquo
33
5 ALCANCES
En este proyecto se pretende desarrollar un medio selectivo faacutecil de producir en
donde sea raacutepida la identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera en la
produccioacuten de vinos tintos se realizaran pruebas para corroborar el crecimiento de
esta levadura en el medio determinando el tiempo que esta levadura toma en
adaptarse en el medio y su comportamiento en este una vez comprobada su
adaptacioacuten al medio liquido se trabajara con el meacutetodo de cromatografiacutea de gas
(GC) y el uso de micro extraccioacuten en fase solida (SPME) para el anaacutelisis
cuantitativo de los compuestos volaacutetiles (4-etil-fenol 4-etil-guayacol4-vinilfenol y
4-vinil-guayacol) y posteriormente con el vino tinto Babic Ademaacutes se desea
comprobar la efectividad de los productos con que las vineras de Croacia inhiben
o eliminan la presencia de la levadura en los vinos tintos como lo son el producto
AntiBrettreg y el Dioacutexido de azufre (SO2)
34
6 ESTADO DEL ARTE
Sobre el campo problemico causado por la levadura BrettanomycesDekkera en la
industria viniacutecola se han realizado bastante investigaciones a nivel de
caracterizacioacuten de la levadura los factores fisicoquiacutemicos que favorecen el
crecimiento de la levadura meacutetodos de prevencioacuten y control evaluacioacuten de
dantildeos sensoriales en diferentes tipos de vinos formacioacuten de compuestos fenoacutelicos
en los diferentes tipos de vino otros compuestos no fenoacutelicos asociados al
ldquocaraacutecter Brettrdquo teacutecnicas de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera
evaluacioacuten de la teacutecnicas de control e inhibicioacuten de dicha levadura desarrollo de
nuevos medios de deteccioacuten y aislamiento de la levadura relacioacuten entre la
levadura BrettanomycesDekkera con las otras levaduras presentes en el vino
entre otros
Seguacuten estas investigaciones se analizan aquellas que pueden aportar datos
importantes para el desarrollo del trabajo que se quiere realizar y se tiene en
cuenta sus metodologiacuteas conclusiones recomendaciones y comentarios
Entre las importantes para el planteamiento de este trabajo se menciona el trabajo
realizado por la Universidad Politeacutecnica de Madrid Espantildea el cual analiza
algunas de las caracteriacutesticas maacutes relevantes de este geacutenero de levaduras su
crecimiento en bodega factores fisicoquiacutemicos que favorecen su crecimiento y
desarrollo en el vino los defectos sensoriales que presenta en los vinos y estudia
algunas de los meacutetodos fiacutesicos para el control de BrettanomycesDekkera en vino
35
(clarificacioacuten filtracioacuten amicrobica proteiacutenas clarificantes anhiacutedrido sulfuros
dimetil dicarbonato Aditivos)47
Para conocer maacutes sobre la levadura en condiciones de barrica y almacenamiento
se revisa el articulo elaborado en el Departamento Teacutecnico Guserbiot La rioja
Espantildea en este artiacuteculo se describe brevemente su metabolismo y su ecologiacutea en
las bodegas Igualmente se comparan las teacutecnicas utilizadas en los laboratorios
para su deteccioacuten y cuaacuteles son las limitaciones de los diferentes meacutetodos
Finalmente se analizan las estrategias desarrolladas para su eliminacioacuten de las
bodegas y se dan una serie de recomendaciones para su control48
El instituto de fermentaciones Industriales Consejo superior de investigaciones
cientiacuteficas Juan de Cierva Madrid Espantildea en el cual se revisa la formacioacuten de
etilfenoles (4 etil-fenol 4 etil guayacol) en vinos tintos anejos Los factores
fisicoquiacutemicos que favorecen el crecimiento de la levadura no deseada
BrettanomycesDekkera las teacutecnicas usadas para la detectar la presencia de esta
levadura en vinos ( Revisioacuten microscoacutepica fluorescente remocioacuten de aacutecidos
grasos de su membrana teacutecnicas moleculares como PCR y electroforesis) y de
control (Proteiacutenas fining Fining con gelatina liquida filtracioacuten variables
fisicoquiacutemicas adicioacuten de aditivos procedimientos de altas presiones
manipulacioacuten geneacutetica) con esta investigacioacuten se concluye que la combinacioacuten y el
uso de las numerosas teacutecnicas pueden ayudar a la prevencioacuten y reduccioacuten de la
levadura BrettanomycesDekkera 49 Este trabajo muestra las muacuteltiples opciones
47
A Morata S Benito F Palomero F Calderoacuten y J A Suaacuterez-Lepe Ecologiacutea y prevencioacuten de
BrettanomycesDekkera durante la elaboracioacuten y crianza de vinos tintos Revista enoacutelogos (Editada por la
Federacioacuten Espantildeola de Asociaciones de Enoacutelogos y Periodistas Asociados) No 50 paacuteg 1-12 Madrid Espantildea
48 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 20-
24 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
49 R Suarez JA Suarez-Lepe A Morata F Calderon 2006 The production of ethyl phenols in wine by yeasts
of the genera Brettanomyces and Dekkera A review Journal Food Chemistry No 102 pag 10-21 Madrid
Espantildea
36
existentes en el control y prevencioacuten de la levadura mencionada sin embargo deja
claro que la mayoriacutea de estas opciones son costosas y no de faacutecil adquisicioacuten para
una pequentildea industria
El anaacutelisis sensorial ha sido de los aspectos maacutes estudiados al respecto de
BrettanomycesDekkera una de estas investigaciones fue realizada en Centre
Europeacuteen des Sciences du Goucirct en Talence Francia en el cual se evaluaron 50
vinos bordeaux sensorialmente para demostrar la complejidad del ldquoCaraacutecter Brett‟‟
al cual se unen otros compuestos aromaacuteticos ademaacutes de los fenoacutelicos como acido
isobutirico e isovalerico en este tipo de vino debido a sus caracteriacutesticas
fisicoquiacutemicas50
De los meacutetodos de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera los medios
selectivos son muy populares es por esto que el Laboratorio de Microbiologiacutea
Departamento de Botanica e Engenharia Biologica Instituto Superior de
Agronomia Lisboa Portugal realizo un trabajo en el cual se pretendia desarrollar
un medio selectivo o diferencial capaz de aislar la levadura
BrettanomycesDekkera del vino y de la cadena productiva del vino con el fin de
detreminar la relacioacuten entre esta levadura y los compuestos 4-etilfenol y 4 etil-
guayacol51 otro estudio realizado para la deteccioacuten de dicha levadura fue
realizado en la Escola Superior de Biotecnologiacutea Universidade Catoacutelica
Portuguesa el desarrollo de un simple procedimiento compatible con las rutinas
50 Andrea Romano a Marie Claire Perello a Aline Lonvaud-Funel Gilles Sicard Gilles de Revel2008 Sensory
and analytical re-evaluation of lsquolsquoBrett characterrdquo Journal Food Chemestry No 114 pag 15-19 Talence
France
51 N Rodrigues G Gonccedilalves S Pereira-da-Silva M Malfeito-Ferreira and V Loureiro2001 Development
and use of a new medium to detect yeasts of the genera DekkeraBrettanomyces Journal of applied microbiology No 90 pag 588-599Lisboa Portugal
37
usadas en las vineras para la deteccioacuten de BrettanomycesDekkera en vino y en
maquinarias52
En el laboratorio de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas Alcohoacutelicas de la
Universidad de Zagreb se ha trabajado anteriormente en el desarrollo de medio
solido selectivo con pruebas de diferentes concentraciones de los compuestos
como resultados se encuentra una buen relacioacuten entre las concentraciones de los
compuestos sin embargo como recomendaciones se encuentran la falta de
antibioacutetico para evitar contaminacioacuten por bacterias probar con diferentes fuentes
de carbono para comparacioacuten de tiempo de crecimiento positivo y un monitoreo
diario en el medio53
Los compuestos aromaacuteticos que libera la presencia de BrettanomycesDekkera
estaacute asociada a los compuestos 4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinilfenol y 4
viniguayacol a partir de esto los centros de investigacioacuten han hondado en la
identificacioacuten de dichos compuestos relacionados en la enologiacutea y especialmente
con BrettanomycesDekkera a partir de eso el Departamento de Quiacutemica
Universidad de La Rioja Espantildea este estudio presenta un meacutetodo basado en el
uso de Cromatografiacutea de Gas y micro extraccioacuten en fase solida para el anaacutelisis
cuantitativo de 4-etilfenol 4-etil guayacol 4-vinilfenol 4-vinilguayacol
Demostrando la existencia de un efecto matriz en el anaacutelisis de compuestos
responsables del ldquocaraacutecter Brettrdquo en vino Este nuevo meacutetodo fue
satisfactoriamente aplicado a cierto nuacutemero de vinos tintos comerciales vinos
52
JA Couto A Barbosa and T Hogg 2005 A simple cultural method for the presumptive detection of the yeasts BrettanomycesDekkera in wines Letters in Applied Microbiology No 41 pag 505-510 Porto
Portugal
53 Serkovic Dubravka Gracin Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac
Brettanomyces bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet pag 1-117 ZagrebCroatia
38
blancos y roseacute Este meacutetodo puede ser una alternativa para evitar el efecto matriz
en muestras de vino54
De acuerdo con este tema en la jornada cientiacutefica del 99 el grupo de investigacioacuten
enoloacutegica se estudio la formacioacuten de sustancias volaacutetiles por 13 cepas de S
cerevisiae con buenas aptitudes enoloacutegicas inoculadas individualmente en un
mosto homogeacuteneo de la variedad airen fermentado en las mismas condiciones
de aireacioacuten y a temperatura controlada55
54
C Pizarro N Perez-del-Notario JM Gonzalez-Saiz 2007 Determination of Brett character responsible
compounds in wines by using multiple headspace solid-phase micro extraction Journal of Chromatography
No 1143 pag 176-181 La Rioja Espantildea
55 E Pueyo P Hidalgo K Fernaacutendez y P Martiacuten-Aacutelvarez 1999 Anaacutelisis de compuestos volaacutetiles en vinos
obtenidos con distintas cepas de Saccharomyces cerevisiae Aplicacioacuten de la teacutecnica de microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientificas 99 Grupos de Investigacion Enologica Zaragoza Espana
39
7 MATERIALES Y METODOS
A continuacioacuten se presentan materiales y meacutetodos para la investigacioacuten
Este proyecto fue realizado en su gran mayoriacutea en las instalaciones de la
Universidad de Zagreb en la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos
(PBF) Laboratorios del Departamento de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas
Alcohoacutelicas ubicado en la ciudad de Zagreb Croacia
Los anaacutelisis fisicoquiacutemicos del vino tinto Babic fueron realizados en los
laboratorios de VINOLAB ubicado en Zagreb Croacia
71 MEDIO SOLIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera
711 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Autoclave de laboratorio
Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa Etanol peptona extracto de levadura
agar cicloheximida acido cumaacuterico ampicilina)
Balanza electroacutenica de precisioacuten
Microscopio oacuteptico
712 Metodologiacutea
Basados en estudios anteriores realizados en el laboratorio para el desarrollo de
medio solido selectivo para BrettanomycesDekkera (Serkovic Dubravka Gracin
40
Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac Brettanomyces
bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet Universidad de Zagreb pag 1-
117 Zagreb Croacia) se evaluaron las recomendaciones mencionadas en dicha
investigacioacuten para la mejoriacutea y desarrollo de otros medios soacutelidos selectivos
Se usoacute como base el medio YPD (Yeast Peptone Dextrose) el cual estaacute
compuesto de la siguiente forma 20gL peptona 10 gl extracto de levadura 20 gl
de agar56 este medio es selectivo para levaduras pero no es selectivo entre ellas
Es necesario el uso de una fuente de carbono para la levadura
BrettanomycesDekkera de acuerdo a la teoriacutea y revisando la tabla 1 (Relacioacuten de
los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) y seguacuten
facilidades de disponibilidad en el laboratorio se utiliza glucosa la cual es
utilizable por entre 75-100 de las cepas de BrettanomycesDekkera seguacuten la
tabla mencionada anteriormente
Esta fuente de carbono (Glucosa) fue probada en una concentracioacuten de 20 gL
Cicloheximida fue probada a 30 mgL para inhibir Saccharomyces en el medio y
darle mayor selectividad para Brettanomyces Dekkera Se antildeade acido p-
cumarico en una concentracioacuten de 100 mgL como precursor para la formacioacuten
del compuesto 4 etilfenol caracteriacutestico de la levadura BrettanomycesDekkera
Para inhibir bacterias en el medio se usa ampicilina a 10 mgL esta se agrega
despueacutes de realizada la esterilizacioacuten y cuando la temperatura del medio este
igual o menor a 40C El pH del medio se ajusto a 5
Paralelamente se crea el medio con Etanol como fuente de carbono en una
concentracioacuten de 6 o 60 mlL con la misma concentracioacuten de los otros
compuesto como cicloheximida 30mgL acido cumarico 100mgL 20 gL peptona
10 gL de extracto de levadura 16gL de agar Este medio se crea como
56
Concentraciones preestablecidas en el laboratorio de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas alcoholicas
41
comparativo para determinar cual fuente de carbono es la maacutes utilizada por la
levadura Brettanomyces bruxellensis para su reproduccioacuten Seguacuten la teoriacutea (ver
tabla 1) el etanol es utilizado por entre 25-75 de las cepas de
BrettanomycesDekkera pero es el azuacutecar que se encuentra en mayor
concentracioacuten presente en los vinos tintos aproximadamente 130 gl57
Estos medios fueron debidamente esterilizados para eliminar cualquier
microorganismo o espora presente en este Este procedimiento se realizo por el
meacutetodo de combinacioacuten de altas temperatura y presioacuten (Autoclave 121 C a 1034
kPa)
Se usaron colonias de BrettanomycesDekkera aisladas anteriormente de vinos
contaminados y guardas para investigaciones en el Departamento de Tecnologiacutea y
Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos
Universidad de Zagreb Croacia
Los medios fueron monitoreados visualmente todos los diacuteas y se toman
observaciones de macroscoacutepicas y microscoacutepicas Se comparan estos dos medios
en teacuterminos de rapidez de crecimiento de la levadura y selectividad Estas
muestras fueron incubadas a 28C por 10 diacuteas
La prueba fue realizada por duplicado en diferentes tiempos
57
Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
42
72 MEDIO LIacuteQUIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera
721 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Frascos de vidrio esteacuteriles
Autoclave de laboratorio
Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa peptona extracto de levadura
cicloheximida acido cumarico ampicilina etanol)
Microscopio oacuteptico
Balanza electroacutenica de precisioacuten
722 Metodologiacutea
En el mercado para enologiacutea existen medio liacutequidos selectivos para la deteccioacuten
de BrettanomycesDekkera en vinos sin embargo estos son de difiacutecil accesibilidad
por sus elevados precios es por esto que se desarrolla un medio liquido selectivo
para dicha levadura en el laboratorio del Departmaneto de Tecnologiacutea y Anaacutelisis
de Bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia
Para este medio se toma como base el medio selectivo con Glucosa como fuente
carbono desarrollado anteriormente sin usar agar para mantener el medio en su
estado liquido
43
La composicioacuten de este medio liacutequido es la siguiente
20 gL Glucosa
20 gL peptona
10gL extracto de levadura
30mgL de cicloheximida
100mgL acido p-cumarico
10 mgL ampicilina
Estos compuestos fueron medidos en una balanza electroacutenica de precisioacuten se
antildeade 250 ml de agua destilada y se mezcla constantemente se pasa a proceso
de esterilizacioacuten en autoclave a 120C y 1034 KPa por 45 minutos
De esta forma se asegura la usencia de microorganismos yo esporas en el
medio Despueacutes de bajar la Temperatura a 40C se agrega a la mezcla ampicilina
en una concentracioacuten de 10mgL
En frascos de vidrio esteacuteril se agrega 40 ml de medio liacutequido y diferentes
cantidades iniciales de levaduras BrettanomycesDekkera fueron inoculadas al
respectivo medio el primer frasco tiene una cantidad de 106 ceacutelulasml el segundo
tiene 104 ceacutelulasml el tercero tiene 102 celulasml y el cuarto con una cantidad
aproximada de 25 ceacutelulasml Estas cantidades estaacuten basadas en estudios
anteriores para medios liacutequidos selectivos en levaduras58
58 J Ungar A M James P W Muggleton H F Pegler y E G Tomich1950 The Cultivation of
Haemophilus pertussis in Partially Defined Liquid Media Journal of General Microbiology No 4
pag 345-359 Greenford
44
Este medio liacutequido inoculado fue inspeccionado diariamente visualmente revisioacuten
de turbidez microscoacutepicamente y olfativamente para deteccioacuten de olores del
ldquocaraacutecter Brettrdquo
Los diacuteas fueron contabilizados para determinar resultados positivos en estos
ensayos
73 INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN
VINO TINTO DE LA REGION DE DALMACIA CROACIA
731 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Medio selectivo solido para BretanomycesDekkera
Medio selectivo Liquido para BrettanomycesDekkera
Quiacutemicos de laboratorio (Dioxido de Azufre (SO2) Antibrettreg Glucosa)
Vino Babic 2007
Anallizador infrarojo Bacchius II microdom
732 Metodologiacutea
Con los medios desarrollados (solido y liquido) se quiere conocer el efecto del
dioacutexido de azufre (SO2) y el producto Antibrettreg en la levadura
BrettanomycesDekkera presente en el vino tinto de la regioacuten de Dalmacia
Con las herramientas que se tienen en el laboratorio del departamento de
tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia se quiere
determinar la influencia de estos productos en la levadura BrettanomycesDekkera
presente en vino tinto croata de la regioacuten de Dalmacia Babic
45
El primer paso es adaptar la levadura al vino tinto croata (Babic) para esto se
inoculan 20 colonias de BrettanomycesDekkera en 500 ml de vino se antildeadioacute
glucosa en una concentracioacuten de 2gL y se oxigena la mezcla Para este paso de
adaptacioacuten se dejan las muestras de 1 a 2 diacuteas a temperatura ambiente (20C)
Despueacutes de este periodo se revisa microscoacutepicamente la presencia positiva de
BrettanomycesDekkera en los 500 ml de vino en los que se estaba haciendo el
paso de adaptacioacuten en Babic al comprobar su presencia positiva se procede a
mezclar los 500 ml de vino contaminado con BrettanomycesDekkera con los 3
Litros de vino Babic que se disponen para esta prueba
Estos 3 litros de vino tinto Babic contaminado con la levadura
BrettanomycesDekkera se reparten en 8 frascos de vidrios esteacuteriles al siguiente
diacutea se toman dos frascos para agregar cada uno de los compuestos a evaluar
(SO2 y Antibrettreg)
Para SO2 se toman dos frascos uno de 600ml y uno de 100ml se agrega una
concentracioacuten de 40 mgl
Para el producto AntiBrettreg se toman cuatro frascos dos de 600 ml y dos de 100
ml seguacuten especificaciones del producto y la alta poblacioacuten de
BrettanomycesDekkera en las muestras se adiciono la maacutexima concentracioacuten de
AntiBrettreg a las muestras la cual fue de 40 gHl
Estas muestras se dejaron a temperatura ambiente simulando condiciones de
almacenamiento del vino en barricas temperatura aproximada de 20C evitando el
contacto con la luz solar y evitando movimientos fuertes Esto se mantuvo por 15
diacuteas que fue el tiempo de duracioacuten del experimento
Con el vino restante se mantuvo en las mismas condiciones de almacenamiento
de los demaacutes para hacer un paralelo de comparacioacuten
Previamente se analizaron las caracteriacutesticas del vino sin contaminar por medio
del analizador infrarrojo Bacchus II microdom antes de agregar los compuestos
46
SO2 y AntiBrettreg y despueacutes se volvioacute a realizar el anaacutelisis para determinar los
efectos de estos compuestos en el vino y asiacute mismo al de control
74 DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN
EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO
MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE
741 Materiales
Cromatografo de Gas HP5890 Serie II
Microextractor de fase solida (SPME)
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Quiacutemicos de laboratorio (p-cresolAcetaldehido Propanol diacetil etil-
acetato i-butanol acido aceacutetico i-amil-alcohol n-amil lactato de etilo
acetato amil metiacutelico 1-hexanol etil-hexanol linalol nerol citronelol
geraniol 2-feniletanol octanoato de etilo 4-etilfenol 2-feniletil acetato 4-
etilguaiacol)
Vino Tinto Babic
Agua destilada
742 Metodologiacutea
El meacutetodo fue desarrollado anteriormente en el Departamento de Tecnologiacutea y
Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos de
la Universidad de Zagreb Croacia Y despueacutes de modificaciones fue utilizado en el
desarrollo del trabajo El meacutetodo utilizado es descrito a continuacioacuten
47
Cromatografo de gas HP 5890 SERIES II
Programa HP-chem
a) Condiciones para analisis SPME-GC
Muestra diluida 5050 con adicion de estandar interno (p-cresol1mgl)
25ml de la muestra diluida con mezcla continua a temperatura ambiente
Tiempo de adsorcion 30 minutos
SPME es colocado en la muestra para la adsorcion durante el tiempo
previsto
b) Condiciones para el Cromatografo de gas (GC)
La columna usada en este experimento es RTXreg-5 (Restec USA sn 210627)
30m id=025mm 025μm
Gas portador Nitrogeno
Flujo del Nitrogeno 5 mlmin
Temperatura del inyector 240 C
Temperatura del detector 250 C
Temperaturas programadas 35 C5 min 150 C 34 Cmin 180 C
10Cmin 190 C 5 Cmin
Se conocen los resultados del cromatografiacutea de gases (ver tabla 10) y se hacen
necesarias varias correcciones del meacutetodo y algunas pruebas con unos
compuestos para determinar realmente su tiempo de retencioacuten en este tipo de
vino Se deben comprobar tiempos de retencioacuten
48
8 DISCUSIOacuteN Y RESULTADOS
81 RESULTADOS PARA EL DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO
Tabla 2 Medio Selectivo con Glucosa como fuente de carbono para
BrettanomycesDekkera en incubacioacuten por 5 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten
microscoacutepica
1 Negativo Negativo - No se realiza
2 Negativo Negativo - Presencia de levaduras
3 Negativo Negativo - Presencia de
Levaduras
4 Aparicioacuten de
algunas colonias
Negativo Transparente Presencia de levaduras
5 Colonias definidas Positivo-
Fenoles
Amarillo Presencia positiva de
BrettanomycesDekkera
49
Este medio tiene alto grado de selectividad para levaduras con un tiempo de
crecimiento de aproximadamente 5 diacuteas en 28C lo que lo hace raacutepido gracias al
antibioacutetico (ampicilina) que hace parte de la composicioacuten del medio no hay
presencia de bacterias Se hace confiable para resultados positivos de levaduras
BrettanomycesDekkera debido a que las levaduras Saccharomyces fueron
inhibidas con el compuesto cicloheximida su selectividad fue comprobada por
revisioacuten microscoacutepica macroscoacutepica y sensorial
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con glucosa como fuente de carboacuten son las
siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
50
Tabla 3 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono para Brettanomyces Dekkera en
incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica
1 Ninguno Negativo - -
2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras y
bacterias
9 Diminutas
colonias
transparentes
Negativo Transparentes Presencia de levaduras y
algunas bacterias
10 Positivo Positivo-
Fenoacutelicos
Amarillo Presencia de levaduras
BrettanomycesDekkera y
bacterias
El medio selectivo para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de
carbono tambieacuten es selectiva entre levaduras ya que solo se identifico la levadura
BrettanomycesDekkera en este sin embargo se evidencia una presencia de otro
microorganismo presuntamente bacteria ya que este medio no contiene agente
antibacteriano (ampicilina) Es necesaria la adicioacuten de ampicilina en una
concentracioacuten de 10mgl para inhibir la presencia de bacterias
Este medio presenta un tiempo maacutes prolongado para mostrar crecimiento de la
levadura BrettanomycesDekkera aproximadamente 10 diacuteas
51
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las
presentadas en el medio selectivo con glucosa como fuente de carbono y son las
siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
52
Tabla 4 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono y adicioacuten de ampicilina para
Brettanomyces Dekkera en incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica
1 Ninguno Negativo - -
2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
9 Diminutas
colonias
transparentes
Negativo Transparentes Presencia de levaduras
10 Positivo Positivo-
Fenoacutelicos
Amarillo Presencia de levaduras
BrettanomycesDekkera
El efecto de la ampicilina sobre el medio selectivo con etanol como fuente de
carbono fue el esperado inhibioacute completamente el crecimiento de colonias
bacterianas en el medio el tiempo de crecimiento de la levadura y presencia de
aromas fenoacutelicos fue el mismo de 10 diacuteas en incubacioacuten de 28C
53
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las
presentadas anteriormente y son las siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
82 RESULTADOS PRUEBAS MEDIO LIQUIDO
Tabla 5 Influencia de la concentracioacuten de levaduras BrettanomycesDekkera en el
tiempo necesario para detectar la produccioacuten de 4-etil-fenol en medio liquido
Nuacutemero de ceacutelulas ml
(concentracioacuten final)
Tiempo necesario para obtener resultados
positivos (diacuteas)
1 Experimento
32x106 le 3
3 X 104 3
33x102 7
40 No detectado
2 Experimento
43x106 le3
39x104 le3
37x102 8
62 No detectado
54
El nuacutemero de ceacutelulas de levadura de BrettanomycesDekkera fue contabilizado
usando contador de ceacutelulas Chamber
Los aromas fenoacutelicos son difiacuteciles de detectar debido al fuerte olor que tiene el
medio liquido caracteriacutestico de sus componentes esto dificulta la identificacioacuten del
ldquocaraacutecter Brettrdquo en especial cuando las concentraciones de
BrettanomycesDekkera no son elevadas Ademaacutes de los olores fenoacutelicos otros
compuestos volaacutetiles se detectan tales como acido aceacutetico y olores oxidativos
tambieacuten producido por la levadura BrettanomycesDekkera
En la inspeccioacuten visual se detecta alta turbidez en el medio Se compara con un
medio sin presencia de BrettanomycesDekkera
En las muestras con mayor concentracioacuten de la levadura es maacutes notoria la
turbidez Despueacutes de 3 diacuteas se presenta un precipitado blanco en todas las
muestras de altas concentraciones
La revisioacuten microbioloacutegica se realiza diariamente para determinar el nuacutemero de
ceacutelulas y la presencia positiva de la levadura a evaluar
Entre los dos experimentos realizados con el medio liquido el tiempo que se
demoro en detectar compuestos fenoacutelicos fue muy similar entre ellos
dependiendo del nuacutemero de ceacutelulas en el medio en mayores concentraciones el
tiempo de deteccioacuten fue menor
Hay que sentildealar que BrettanomycesDekkera debe alcanzar una concentracioacuten
miacutenima (denominada poblacioacuten criacutetica) de 103 UFCml para comenzar a liberar etil
fenoles Por debajo de esta concentracioacuten la levadura seriacutea metaboacutelicamente
activa pero no produciraacute compuestos alterantes a niveles detectables esto se ve
reflejado en los resultados en los que las concentraciones de ceacutelulas son muy
bajas
55
Estos resultados se comparan con los resultados dados en el medio solido Los
dos medios muestran altos grados de selectividad hacia la levadura
BrettanomycesDekkera y similar comportamiento para el crecimiento de dicha
levadura
En el medio liacutequido cuando hay altas concentraciones de BrettanomycesDekkera
el tiempo de deteccioacuten del microorganismo es menor que con el medio solido pues
en el liacutequido es aproximadamente 3 diacuteas y en el soacutelido son 5 diacuteas
83 RESULTADOS DE LA INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE
(SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO DE LA REGION DE
DALMACIA CROACIA
El vino fue analizado antes de la adicioacuten de los compuestos quiacutemicos a evaluar y
15 diacuteas despueacutes de adicioacuten para ver la reaccioacuten de este frente a SO2 y Antibrettreg
estas caracteriacutesticas se determinaron con el equipo de laboratorio Bacchus II
Microdom localizado en el laboratorio Vinolab doo Zagreb Croacia Los
resultados se muestran en la tabla
Tabla 6 Resultados de las muestras de vino inoculados con la levadura BrettanomycesDekkera
durante 15 diacuteas Comparativos con los diferentes compuestos
CFUml
Vino Day 1 Day 4 Day 10 Day 15
Control 130E+04 800E+03 700E+03 500E+03
Control 800E+03 640E+03 700E+03 280E+03
SO2 110E+04 400E+02 400E+02 67
SO2 900E+03 380E+03 270E+03 183
Antibrett 140E+05 920E+04 140E+04 400E+03
Antibrett 210E+05 181E+05 160E+04 900E+03
Antibrett 120E+05 990E+04 120E+04 100E+03
Antibrett 230E+05 204E+05 300E+03 200E+03
56
Tabla 7 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 antes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o
Antibrettreg Diacutea 0
Alcohol
()
Acidez Total
(gr Aci
Tartaacuterico L)
Acidez volaacutetil
(Aci
AceacuteticoL)
Densidad
(grml)
Azuacutecar residual
(grl)
Extracto
seco
(grl)
Acido
Laacutectico
(grl)
Glicerol
(grl)
Taninos
(grl)
Acetato
(grl)
1473
525
083
09928
473
332
164
799
305
117
1471
522
084
09927
479
329
162
786
299
116
Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
Tabla 8 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 despueacutes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o
Antibrettreg Diacutea 15
Alcohol
()
Acidez Total
(gr Aci
Tartaacuterico L)
Acidez volaacutetil
(Aci
AceacuteticoL)
Densidad
(grml)
Azuacutecar residual
(grl)
Extrac
to seco
(grl)
Acido
Laacutectico
(grl)
Glicerol
(grl)
Taninos
(grl)
Acetatos
(grl)
Control
1414
565
107
09935
436
364
177
827
259
136
Control
1415
556
108
09936
420
365
170
824
256
137
SO2
1456 543 108 09932 476 369 167 803 281 125
SO2
1457
542 108 09933 472 370 170 804 271 124
Antibrett 1454 533 106 09933 448 371 175 813 277 125
Antibrett 1455 534 105 09933 460 372 171 809 282 124
Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
57
Figura 4 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en el vino de control para
evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas
El comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en la prueba por
duplicado en el vino de control fue muy similar pues con el tiempo esta levadura
deja de reproducirse y va muriendo cuando las condiciones ya no son aptas para
su desarrollo debido a que la mayoriacutea de su fuente de carbono (Glucosa) esta
consumida sin embargo esta levadura no llega a su desaparicioacuten total lo que
representa uno de los mayores problemas en la elaboracioacuten del vino
Esta levadura tiene un metabolismo lento y el factor tiempo es un requisito
fundamental para su desarrollo este experimento se empezoacute con una alta
poblacioacuten de BrettanomycesDekkera (130 x 104 UFCml y 8 x 103 UFCml
respectivamente) y durante el transcurso del tiempo la poblacioacuten fue disminuyendo
debido a la perdida de las condiciones necesarias para la reproduccioacuten
58
Figura 5 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de SO2 en
concentracioacuten de 40 mgl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas
El SO2 tuvo un comportamiento efectivo y raacutepido contra las colonias de
BrettanomycesDekkera La poblacioacuten de esta levadura se redujo de forma
significativa entre el diacutea primero y el cuarto se encontroacute una diferencia porcentual
de 96 en la primera prueba y del 60 en la de duplicado al diacutea 15 ya la
poblacioacuten era casi nula pasando raacutepidamente de un numero por encima de la
poblacioacuten critica de la levadura BrettanomycesDekkera a un numero lt103 UFCml
siendo muy eficaz y raacutepido en el manejo de produccioacuten
Este compuesto ademaacutes de favorecer la extraccioacuten de los compuestos fenoacutelicos y
de su actividad antioxidante al inhibir la accioacuten de las polifenoloxidasas a dosis
adecuadas de un maacuteximo de 50gl inhibe la multiplicacioacuten bacteriana y de
levaduras
59
Figura 6 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de
Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo
de 15 diacuteas
Figura 7 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de
Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo
de 15 diacuteas
El compuesto Antibrettreg en la primera prueba tanto como en el duplicado tuvo su
mayor tiempo de reduccioacuten de UFCml entre los diacuteas 4-10 con una diferencia
porcentual de 91 en comparacioacuten con el diacutea cuarto al decimo a diferencia de
60
SO2 el cual presenta la gran disminucioacuten de colonias entre los primeros diacuteas de
agregarse el producto
El tiempo para que la poblacioacuten de la levadura llegara a la cantidad menor a la de
la poblacioacuten critica es mucho mayor que la del compuesto SO2 sabiendo que esta
poblacioacuten debe ser lt103 UFCml
El compuesto Antibrettreg puede tardarse 4-10 diacuteas en representar una reduccioacuten
de UFCml significativa en dicho tiempo puede representar grandes peacuterdidas
nutricionales y altos costos de produccioacuten para la fabricacioacuten
Figura 8 Comportamiento del contenido de alcohol en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin adicioacuten)
hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
BrettanomycesDekkera estaacute presente en vinos de alto contenido alcohoacutelico
aproximadamente entre 125 a 14 pues esta levadura toma a etanol como
fuente de carbono y este vino (Babic) procede de uvas muy maduras las cuales
presentan mayor cantidad de azuacutecares residuales (como glucosa y fructosa y
otras pentosas residuales)
138
14
142
144
146
148
Alcohol
Day 0 Day 15
61
Analizando el comportamiento del vino durante el experimento de 15 diacuteas sin
compuestos quiacutemicos y con SO2 y Antibrettreg a partir de las caracteriacutesticas
iniacuteciales que se determinaron seguacuten el equipo BACCHUS analizador infrarrojo se
presenta en general una reduccioacuten del contenido alcohoacutelico de este vino pero se
ve una mayor reduccioacuten en el vino de control el cual redujo en un 394 su
contenido alcohoacutelico desde el dia 0 hasta el diacutea 15 este vino no tiene ninguacuten
compuesto contra la levadura BrettanomycesDekkera y por su elevada presencia
en los 15 diacuteas de experimento consumioacute esta cantidad de etanol
Mientras en el vino que conteniacutea SO2 tras 15 diacuteas de tratamiento se vio una
reduccioacuten de alcohol de 1 ya que este compuesto redujo la cantidad de
BrettanomycesDekkera en los primeros diacuteas de tratamiento previniendo su
reproduccioacuten y protegiendo el contenido alcohoacutelico del vino Babic 2007
En los vinos de prueba con Antibrett reg la reduccioacuten alcohoacutelica se dio en un
porcentaje de 122 un poco maacutes alta que con SO2 y mucho maacutes baja en
comparacioacuten del vino de control este compuesto tambieacuten previno la gemacioacuten de
la levadura evitando la perdida de etanol en el vino sin embargo como este
compuesto duro mas en este proceso de eliminar BrettanomycesDekkera se
produjo una mayor peacuterdida alcohoacutelica
62
Figura 9 Comportamiento del contenido de acidez volatil en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin
adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
Debido a la presencia de oxigeno en los frascos la acidez volaacutetil aumento pero no
significativamente en las muestras No hubo grandes diferencias entre las
muestras con compuestos y las de control por lo que se deduce que estos
compuestos no ayudan a evitar esta acidez Esta acidez tan alta puede dantildear la
calidad del vino de forma casi irreparable Pero el factor oxigeno es de los maacutes
controlados en la produccioacuten de vinos
la alteracioacuten del aumento de la acidez volaacutetil no estaacute relacionada con la levadura
BrettanomycesDekkera sino a la presencia de oxigeno en el almacenamiento el
oxigeno fue usado en esta prueba para promover condiciones apropiadas para el
desarrollo de la levadura
002040608
112
Acidez Volatil
Day 0 Day 15
63
Figura 10 Comportamiento del contenido de Acido Acetico en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin
adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
Brettanomyces Dekkera son productores de aacutecido aceacutetico y elevan el contenido
de los vinos anormalmente en condiciones de anaerobiosis En condiciones de
aerobiosis producen concentraciones bajas o nulas de aacutecido aceacutetico
Este acido aceacutetico al igual que los fenoles afecta el sabor y el perfil olfativo del
vino tinto este efecto es tambieacuten producido por la levadura
BrettanomycesDekkera vemos en los resultados el gran crecimiento de este
compuesto en el vino control el cual no tenia compouestos en contra de
BrettanomycesDekkera lo que produjo este aumento significativo del acido aceacutetico
en comparacioacuten con estos que teniacutean SO2 y Antibrettreg entre ellos la diferencia en
este compuesto es muy reducida y no significativa pues estos compuestos no
permitieron la gemacioacuten de esta levadura y esta no produjo este acido en esa gran
cantidad
A este compuesto se le atribuye el olor y sabor a vinagre del vino tinto un defecto
muy comuacuten y poco agradable para el consumidor
105110115120125130135140
Acido Acetico
Day 0 Day 15
64
Figura 11 Comportamiento del contenido de Azucares reductores en vino Babic 2007
desde el diacutea 0 (sin adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en
comparacioacuten con el vino de control
BrettanomyesDekkera utiliza los azucares residuales como fuente de carbono
para su crecimiento en el vino este es el factor maacutes importante para su desarrollo
y este es el que determina en cierto caso la cantidad de levaduras de
BretanomycesDekkera presente en las graficas se determina claramente que en
el vino de control donde la cantidad de esta levadura es muy alta 15 diacuteas despueacutes
de empezar las pruebas la cantidad de azucares reductores es muy baja y ha
bajado en un porcentaje de 10 mientras que el vino que tiene SO2 bajo la
cantidad de azucares reductores en un 042 y el vino que tiene el compuesto
Antibrettreg redujo su nivel de azucares reductores en 462
38
4
42
44
46
48
5
Azucares Reductores
Day 0 Day 15
65
84 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE
CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON
EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID
PHASE
Tabla 10 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en
vino Babic 2007 con el meacutetodo propuesto
Compuesto Tiempos de
retencioacuten (min)
Acetaldehiacutedo 1437
Propanol 3759
Diacetil 4202
Etil-acetato 4523
i-butanol 6232
Acido Aceacutetico 7840
i-amil alcohol 11740
n-amil 13489
lactato de etiacutelico 15741
acetato amil metiacutelico 17796
1-hexanol 19101
etil-hexanol 24456
Linalol 30370
2-feniletanol 32768
p-cresol 33522
octanoato de etilo 34226
4-etilfenol 37100
2-feniletil acetato 32769
4-etilguayacol 39704
4 vinilfenol 40529
decanoato de etilo 42117
Refirieacutendose a estos resultados es necesaria la creacioacuten de soluciones estaacutendar
para determinar tiempos de retencioacuten con el meacutetodo y si es necesario ajustes a
este
66
Tabla 11 Soluciones estaacutendar para compuestos en vinos tintos Croatas
MODEL 0
(en volumen de 100 ml en 40 Etanol)
Compuesto Pureza Cantidad
(g)
Concentracioacuten (gl)
Acetaldehiacutedo 099 1623 160677
Propanol 0995 13849 137718
Diacetil 098 01071 104958
Etil-acetato 0995 30172 3002114
i-butanol 099 15016 1486584
Acido Acetico 0995 0 0
i-amil alcohol 099 20116 1991484
n-amil 098 15442 1513316
lactato de etilio 098 00507 049686
acetato amil metilico 098 01028 100744
1-hexanol 098 00367 035966
etil-hexanol 098 00308 029876
Linalol 097 00288 027936
Nerol 097 00311 030478
Citronelol 098 0031 03038
Geraniol 098 15803 1548694
2-feniletanol 098 00402 039396
4-etilfenol 098 00812 078764
octanoato de etilo 097 00597 059103
2-feniletil acetato 099 00315 031185
4-etilguayacol 098 00803 079674
Fuente Laboratorio de anaacutelisis e investigacioacuten de bebidas Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea
de Alimentos Universidad de Zagreb Zagreb Croacia 2009
Las soluciones estaacutendar se realizan teniendo como referencia las cantidades de
estos compuestos en los vinos tintos croatas datos suministrados por el Doctor
Leo Gracin en concentraciones de gl a partir de este dato y teniendo en cuenta
67
la pureza de los compuestos que se teniacutean en el laboratorio de anaacutelisis e
investigacioacuten de bebidas se crean las soluciones estaacutendar Ejemplo
Solucioacuten estaacutendar para 4 etil-fenol en un volumen de 100 ml
Con estas soluciones estaacutendar se realizo el tiempo de retencioacuten para corroborar el
meacutetodo Los resultados de esto fueron tiempos de retencioacuten diferentes a los del
meacutetodo primero con el que se realizaron los ensayos y a partir de esos resultados
se ajusto el meacutetodo con el que se trabajo
68
Tabla 12 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en
vino Babic 2007 con el meacutetodo modificado
Compuesto Tiempos de
retencioacuten (min)
Acetaldehiacutedo 1542
Propanol 4046
Diacetil 4733
Etil-acetato 4807
i-butanol 6659
Acido Acetico 8343
i-amil alcohol 12123
n-amil 13866
lactato de etilio 16072
acetato amil metilico 18336
1-hexanol 19447
etil-hexanol 24835
Linalol 31831
2-feniletanol 33305
p-cresol 33703
octanoato de etilo 34571
4-etilfenol 37724
Citronelol 38326
Nerol 38576
2-feniletil acetato 39012
Geraniol 39944
4-etilguayacol 40271
4 vilifenol 41168
decanoato de etilo 42657
69
DIA 0
Se coloca ISTD a todas las muestras respectivas para poder determinar
cantidades de los compuestos aromaacuteticos
Se realiza la cromatografiacutea de gas al vino Babic 2007 antes de ser inoculado con
BrettanomycesDekkera
Tabla 13 Resultados de la cromatografiacutea de gas del vino Babic 2007
Compuesto Tiempo de retencioacuten
min
Cantidad
mgl
Acetaldehiacutedo 1542 0
Propanol 4046 0
Diacetil 4733 37215204
Etil-acetato 4807 0
i-butanol 6659 0
Acido Aceacutetico 8343 2817465
i-amil alcohol 12123 16799019
n-amil 13866 26
lactato de etiacutelico 16072 10983961
acetato amil metiacutelico 18336 0185196
1-hexanol 19447 264655
etil-hexanol 24835 0158751
Linalol 31831 0
2-feniletanol 33305 4235560
p-cresol 33703 1
octanoato de etilo 34571 0152412
4-etilfenol 37724 00581345
Citronelol 38326 00439729
Nerol 38576 00344799
2-feniletil acetato 39012 00407983
Geraniol 39944 0
4-etilguayacol 40271 0
4 vilifenol 41168 0
Decanoato de etilo 42657 00190144
70
Basados en los compuestos aromaacuteticos que brinda el ldquoCaraacutecter Brettrdquo se van a
analizar detalladamente los siguientes aromas 4-Etilfenol 4-Etilguayacol 4-
Vinylfenol
Figura 12 Compuestos aromaticos en vino tinto Babic sin estar contaminado con la levadura
BrettanomycesDekkera
El vino a analizar esta por debajo de las concentraciones consideradas como
perjudiciales para el aroma del vino tinto (El umbral sensorial del 4-etilfenol es de
230 μgl y el del 4-etilguaiacol es de 47 μgl) pues posee una concentracion de
58microgL de 4etilfenol 0 microgL de 4 etilguayacol y 0 microgL de vinylfenol
841 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGUacuteN TEMPERATURAS
DE ALMACENAMIENTO
0
02
4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinylfenol
Vino 00581345 0 0
C (
mg
L)
Vino Babic 2007 Dia 0
71
Tabla 14 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el
ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 20C por 4 diacuteas Prueba por duplicado
MUESTRAS INCUBADA A 20C
Compuesto Day 1
Amount
(mgL)
Day 2
Amount
(mgL)
Day 3
Amount
(mgL)
Day 4
Amount
(mgL)
4-etilfenol 0260244 017294 0177547 020156
4-etilfenol 0260244 0245915 0204542 0262499
4-etilguayacol 0 0 0 0
4-etilguayacol 0 0 0 0
4 vinilifenol 1107096 781349 685317 460323
4 vinilifenol 1107096 1297465 621324 693225
72
Figura 13 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
BrettanomycesDekkera es la levadura responsable de la produccion de 4-etil-
fenol compuesto asociado con olores caracteristicos a ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 00581345 0260244 0172935 0177547 020156
C (
mg
L)
4 etilfenol
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 00581345 0260244 0245915 0204542 0262499
C (
mg
L)
4 etilfenol
73
caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo dantildeando la calidad sensorial del vino tinto Babic la
produccioacuten de este compuesto en esta muestra realizada por duplicado fue
ascendente y tuvo incremento muy grande en el primer dia de almacenamiento y
en el transcurso de los siguientes cuatro diacuteas se mantuvo relativamente estable lo
cual no concuerda con el comportamiento tiacutepico de esta levadura quien tiene un
crecimiento lento e incrementa la produccioacuten de fenoles con su gemacioacuten esto
genera muchas dudas sobre el buen funcionamiento del equipo GC o de la
estabilidad de las levaduras BrettanomycesDekkera en este almacenamiento
Figura 14 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar prueba por duplicado
002040608
1
Vino Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0 0 0
4 etilguayacol
002040608
1
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0 0 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
74
Presencia negativa de 4 etil guayacol durante todo el almacenamiento
probablemente las condiciones de almacenamiento y el medio no dieron lugar al
desarrollo de este compuesto el cual se considera menos conflictivo que el 4-etil-
fenol
Figura 15 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
Estos resultados tambieacuten dejan dudas del normal comportamiento de dicha
levadura pues indican que la levadura no convirtioacute este compuesto en etilfenol
0
2
4
6
8
10
12
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 110709781349685317460323
4 vinylfenol
0
2
4
6
8
10
12
14
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
Series1 0 11071 12974 62132 69322
C (
mg
l)
4 Vinylfenol
75
durante el almacenamiento caracteriacutestica que solo la levadura
BrettanomycesDekkera puede realizar se ve que las concentraciones de
vinylfenoles son mucho mas altas que las de fenoles lo que nos deja determinar
que la poblacioacuten de BrettanomycesDekkera es muy baja y existen otras levaduras
productoras de vinylfenoles en este tipo de vino en las condiciones de
almacenamiento dadas para estas pruebas
Tabla 16 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el
ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 28C por 4 diacuteas
MUESTRA 2 INCUBADA A 28C
Compuesto Day 1
Amount
(mgL)
Day 2
Amount
(mgL)
Day 3
Amount
(mgL)
Day 4
Amount
(mgL)
4-etilfenol 0260244 019612 0186614 019932
4-etilfenol 0260244 020576 0214917 0193554
4-etilguayacol 0 014304 0223836 0
4-etilguayacol 0 002287 00529832 0
4 vinilifenol 1107096 787068 665182 397847
4 vinilifenol 1107096 284389 00204392 0
76
Figura 16 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar
El desarrollo de este compuesto en el diacutea 1 fue significativo y luego relativamente
estable el comportamiento fue similar en las pruebas de diferentes temperaturas
de almacenamiento para este compuesto el cual es el maacutes problemaacutetico en la
industria viniacutecola
0
005
01
015
02
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 005813019932018661019611019932
4 etilfenol
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 005813 019355 021491 020576 026024
4 etilfenol
77
Figura 17 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar
Los resultados de la prueba son poco confiables y no entendibles por lo que
podemos verificar que el GC no estaacute trabajando de forma adecuada para la
deteccioacuten del compuesto
0001002003004005006
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 Etilguayacol 0 0 0022 0053 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
0005
01015
02025
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0223 0143 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
78
Figura 18 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
El comportamiento de este compuesto en la prueba es muy irregular y poco
confiable
0
2
4
6
8
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 397847665182787068397847
4 vinylfenol
0
2
4
6
8
10
12
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 11071 28438 00204 0
4 vinylfenol
79
Figura 19 Comportamiento del compuesto 4 etilfenol durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
La concentracioacuten de 4 etil fenol fue mayor al cuarto diacutea almacenado a
temperatura ambiente de 20C pero este compuesto no tuvo una actividad notoria
de ascenso durante su almacenamiento como se esperaba lo que deja muchas
dudas sobre los resultados de este ensayo
0
05
1
15
2
25
3
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etil fenol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 20C
80
Figura 20 Comportamiento del compuesto 4 etil guayacol durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
Comportamiento anormal del compuesto no se ve tendencias de aumento o
disminucioacuten de este en ninguna de las pruebas no tiene un comportamiento
regular pues se esperaba que la levadura BrettanomycesDekkera
descarboxinizara el compuesto 4-vinilguaiacol y aumentar las concentraciones de
4-etilguaiacol esta reaccioacuten no se hizo notoria en los compuestos aromaacuteticos
seguacuten lo determino el Cromatografo de Gas (GC)
0
005
01
015
02
025
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3
C (
mg
L)
4 etil guayacol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 20C
81
Figura 21 Comportamiento del compuesto 4 Vinyl fenoll durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
La no presencia de este compuesto en el vino original demuestra las baja o casi
nula presencia de la levadura BrettanomycesDekkera al diacutea primero este
compuesto incrementa de forma notoria en las muestras debido a la presencia de
acido cumaacuterico en el medio ya que sufre su carboxilacion convirtieacutendose en 4 vinyl
fenol sin embargo su comportamiento no fue regular y presento problemas de
lecturas
0
2
4
6
8
10
12
14
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
C (
mg
L)4 Vinyl fenol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 28C
82
9 CONCLUSIONES Y
RECOMENDACIONES
91 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO
Se desarrolloacute un medio selectivo soacutelido para BrettanomycesDekkera
accesible y faacutecil de elaborar
Se detectan colonias de la levadura BrettanomycesDekera en el agar
selectivo con glucosa como fuente de carbono en un lapso de 5 diacuteas en
incubacioacuten a 28C
El medio selectivo soacutelido con Glucosa como fuente de carbono fue maacutes
raacutepido y efectivo ya que toma 5 diacuteas para dar resultados positivos frente al
de Etanol como fuente de carbono el cual toma 10 diacuteas para mostrar
resultados positivos aunque ambos dieron resultados satisfactorios en la
selectividad de la levadura BrettanomycesDekkera
La levadura se adapto de forma satisfactoria a estos medios en
condiciones de almacenamiento propias para su desarrollo (28C)
Las colonias de la levadura BrettanomycesDekkera tiene un crecimiento
en estos medios soacutelidos de forma circular con topografiacutea convexa y borde
entero dimensiones 5-6 mm color Amarillo opacicidad oscuro
83
superficie lisa y suave siendo faacutecil de identificar y realizar los conteos
necesarios
El medio solido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten
de la levadura BrettanomycesDekkera en vino tinto es raacutepido econoacutemico
y uacutetil
El uso de azucares para fermentacioacuten de la levadura
BrettanomycesDekkera que Saccharomyces no puede fermentar para
mayor selectividad
Realizacioacuten de pruebas Bioquiacutemicas como meacutetodo raacutepido de selectividad
92 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DESARROLLO DEL MEDIO LIacuteQUIDO
Se desarrollo un medio selectivo liquido para BrettanomycesDekkera
accesible y faacutecil de elaborar
Este medio mostroacute resultados positivos de la presencia de
BrettanomycesDekkera en un lapso de tiempo menor (3 diacuteas) que con el
medio solido (5 diacuteas) en caso de que el nuacutemero de ceacutelulas de la levadura
BrettanomycesDekkera sea mayor a la poblacioacuten critica (103)
Cuando la poblacioacuten de ceacutelulas de la levadura BrettanomycesDekkera es
menor a la poblacioacuten critica el tiempo de identificacioacuten de esta levadura por
medio liquido es muy prolongado puede tomar maacutes de 10 diacuteas o incluso no
detectarlo
84
Los compuestos quiacutemicos usados para el desarrollo del medio liacutequido no
son los adecuados para este tipo de medios donde los resultados positivos
son olfativos pues estos compuestos emiten fuertes olores que confunden
los olores caracteriacutesticos del caraacutecter Brett
El medio liquido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten
de altas concentraciones de la levadura BrettanomycesDekkera en vino
tinto es raacutepido econoacutemico y uacutetil
93 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg
EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE DALMACIA
CROACIA
Este trabajo mostroacute que el dioacutexido de azufre (SO2) tiene buenos resultados
en contra de la levadura BrettanomycesDekkera en concentraciones
normales de 40mgl concentracioacuten en la que se trabaja este compuesto en
los vinos tintos
En Europa el dioacutexido de azufre es usado de forma tradicional en gran
nuacutemero de alimentos y especialmente en vinos sin embargo y a pesar de
su uso regulado se busca la sustitucioacuten de este o su maacutexima reduccioacuten
para hacer de este producto maacutes sano para las personas no tolerantes a
este tipo de compuestos sin embargo seguacuten el trabajo realizado en
comparacioacuten con el producto Antibrettreg el SO2 es maacutes eficaz en el control
85
de la levadura ayudando a evitarla y eliminarla de la cadena productiva del
vino tinto
Gracias a sus caracteriacutesticas el vino tinto Babic es muy vulnerable a la
levadura BrettanomycesDekkera pero a su vez se puede tratar faacutecilmente
con productos como SO2 y Antibrettreg aunque es maacutes efectivo contra
BrettanomycesDekkera el dioacutexido de azufre (SO2)
Antibrettreg es una buena opcioacuten para el control de BrettanomycesDekkera
para evitar el uso de productos alergenicos como SO2
94 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN
EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO
MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE
Al terminar la primera prueba con anaacutelisis en cromatografiacutea a gas y el SPME
queda como resultados
Es necesario repetir la prueba
No se determina el efecto de los estaacutendares internos sometidos a tiempos
de almacenamiento en temperaturas de 20C y 28C lo que puede dar falsos
resultados de cantidades de compuestos
86
Se debe crear un medio maacutes apto para el desarrollo de la levadura y un
control diario de crecimiento ( agregar maacutes Glucosa en caso de que se
haya consumido toda controlar presencia de Bacterias y otros
microorganismos que no se deseen en el medio)
Es necesario control de aromas con panel sensorial para determinar el
umbral de deteccioacuten en este vino
Control de crecimiento por medio solido Selectivo para
BrettanomycesDekekra conteo de colonias presentes en el vino inoculado
y su desarrollo durante almacenamiento a diferentes temperaturas
La segunda prueba no fue posible realizarla por dantildeos en el equipo de
cromatografiacutea de gas (GC)
87
ANEXOS
11
89
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientiacuteficas 99 Grupos de
Investigacioacuten Enoloacutegica Zaragoza Espantildea
93
11
GRACIAS es una palabra corta para todo lo que quiero expresar a todos aquellos que
hicieron parte de este suentildeo hecho realidadhellip
A Dios y a la virgen Auxiliadora por llevarme de su mano cada diacutea de mi carrera en cada
momento alegre y en cada momento difiacutecil fueron mi fortaleza
A mis papitos por hacer de mi estudio una realidad por su sacrificio y apoyo desinteresado y
sincero
A mi Hermanito por ser mi fortaleza mi ejemplo y mi amigo incondicional
A mi familia Blanco y Urrea por su compantildeiacutea durante esta etapa
A mi facultad (Decano Dr Camilo Rozo Dra Patricia Jimeacutenez y mis profesores) por
ensenarme mi profesioacuten y aportar lo mejor de ustedes para mi formacioacuten personal
A mis asesores de Tesis (Ing Patricia Chaparro y Dr Sc Leo Gracin) por su guiacutea y
colaboracioacuten oportuna
A mis queridos amigos quienes siempre han estado a mi lado en las dificultades y en las
alegriacuteas (Ingrid Mafe Cami G Cami R Harold Pipe Karla Andreacutes T Diego G)
A IAESTE en alianza con el ORI por hacer posible mi intercambio y poder hacer mi tesis en el
maravilloso paiacutes de Croacia
A Croacia por ser mi segundo hogar por abrirme sus puertas y su corazoacuten por brindarme
tan maravillosas personas en mi camino
Croatia Thank you for being my second home for opening your doors and your heart to me
and give me the opportunity to meet so many wonderful people
To my boss my teacher my mentor and specially my friend Leo
To the faculty of food technology and Biotechnology and the department of technology
and analysis of beverages for give me the opportunity to give all my knowledge to the
project and learn a lot more
To all the amazing people I met during this experience (Igor Karin Natka Josip Ana Matija
Daniel Pz Szilvia Dini Daniela Lidija Sanja and everybody else who I had the pleasure to
meet in this great trip) for give me the best of your hearts
I only have one thing to say hellipTHANK YOU
Solo me queda una palabra por decirhellipGRACIAS
4
4 OBJETIVOS ------------------------------------------------------------------------------------------------ 32
41 GENERAL ------------------------------------------------------------------------------------------------- 32
42 ESPECIacuteFICOS ---------------------------------------------------------------------------------------------- 32
5 ALCANCES --------------------------------------------------------------------------------------- 33
6 ESTADO DEL ARTE --------------------------------------------------------------------------- 34
7 MATERIALES Y METODOS ----------------------------------------------------------------- 39
71 MEDIO SOLIDO SELECTIVO PARA BRETTANOMYCESDEKKERA ------------------------- 39
711 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------------- 39
712 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------------ 39
72 MEDIO LIacuteQUIDO SELECTIVO PARA BRETTANOMYCESDEKKERA ------------------ 42
721 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------- 42
722 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------- 42
73 INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO DE
LA REGION DE DALMACIA CROACIA ------------------------------------------------------------- 44
731 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------- 44
732 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------- 44
74 DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO
BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE --- 46
741 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------------- 46
742 METODOLOGIacuteA ------------------------------------------------------------------------------------------------ 46
8 DISCUSIOacuteN Y RESULTADOS --------------------------------------------------------------- 48
81 RESULTADOS PARA EL DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO ------------------- 48
82 RESULTADOS PRUEBAS MEDIO LIQUIDO -------------------------------------------- 53
83 RESULTADOS DE LA INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg
EN VINO TINTO DE LA REGION DE DALMACIA CROACIA ----------------------------------- 55
5
84 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN EL
VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID
PHASE --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 65
841 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGUacuteN TEMPERATURAS DE
ALMACENAMIENTO --------------------------------------------------------------------------------------------- 70
9 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES --------------------------------------------- 82
91 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA DESARROLLO DEL MEDIO
SOLIDO 82
92 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA DESARROLLO DEL MEDIO
LIacuteQUIDO ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 83
93 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA INFLUENCIA DE DIOXIDO
DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE
DALMACIA CROACIA ----------------------------------------------------------------------------------- 84
94 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA DETERMINACION DE
AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL
METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE ---------------------------------------------- 85
ANEXOS ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 87
6
RESUMEN Este estudio presenta el desarrollo y evaluacioacuten de simples meacutetodos para la deteccioacuten de
la levadura BrettanomycesDekkera en vino y su medio de produccioacuten con el uso de
medio solido y liquido selectivo ademaacutes se evaluacutea el efecto del Dioacutexido de Azufre SO2 y
AntiBrettreg en vino tinto de la regioacuten de Dalmacia Croacia El meacutetodo de deteccioacuten de
esta levadura emplea medios selectivos enriquecidos los cuales contienen Glucosa (20
grl) en comparacioacuten con Etanol (6ml l) como fuentes de carboacuten y energiacutea cicloheximida
(30 grl) para prevenir la presencia de Sachharomyces ampicilina (10 mgL) como
antibioacutetico para prevenir el crecimiento de bacterias y acido p-cumaacuterico (100 mgL) como
precursor de la produccioacuten de 4-etilfenol para el medio solido el uso de agar se realiza
en una concentracioacuten de 16 grL Despueacutes de la siembra realizada en los medios (solido y
liquido) de vino contaminado con la levadura BrettanomycesDekkera es monitoreado
diariamente micro y macroscoacutepicamente
Una muestra de vino tinto Babic de Croacia fue contaminado con colonias de la levadura
BrettanomycesDekkera y fue dividido en 8 muestras de las cuales 2 de estas fueron
monitoreadas como control sin adicioacuten de ninguacuten compuesto 2 con adicioacuten de dioacutexido de
azufre SO2 en una concentracioacuten de 40mgL y 4 de estos con AntiBrettreg en una
concentracioacuten de 40grHl El meacutetodo de este estudio se basa en la determinacioacuten del
comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en estas condiciones Este se
evaluoacute en teacuterminos de crecimiento de la citada levadura (UFCml) presentes en las
muestras y anaacutelisis fisicoquiacutemicos antes y despueacutes de 15 diacuteas de adicioacuten y monitoreo
7
ABSTRACT
This experiment presents the development and testing of a simple way to detect
BrettanomycesDekkera from wine and wine environments using selective media in solid
phase and liquid phase and the influence of Sulfur Dioxide (SO2) and Antibrett reg in red
wines from Dalmatian region The method of detection of this yeast employs selective
enrichment mediums These mediums contains glucose (20gl) and Ethanol (6) as
carbon and energy source cycloheximide (30 mgl) to prevent growth of Sachharomyces
ampicilin (10 mgl) to prevent growth of bacteria and p-coumaric acid (100 mgl) as a
precursor of the production of 4-etilphenol depending on the phase of the medium agar
compound is used in a concentration of 16 grl After putted on the medium wine
contaminated with BrettanomycesDekkera is monitored by micro and macro inspection
also with the liquid medium
A red wine from Dalmatian region was contaminated with BrettanomycesDekkera colonies
and divided in 8 different containers from these 8 containers we had two for control no
addition two with addition of Sulfur Dioxide (SO2) in a concentration of 40 mgl and four of
them with Antibrett reg in a concentration of 40gHl The method for this study is based in
following the behavior of the yeast BrettanomycesDekkera with these compounds in this
wine this behavior was monitored based in CFUml showing in the samples and physic
and chemical analysis before addition and 15 days after
8
INTRODUCCION
Las levaduras del geacutenero Brettanomyces o su forma telemoacuterfica (nombre que
reciben las especies que presentan reproduccioacuten sexual y en consecuencia
formacioacuten de esporas por meiosis) Dekkera fueron descritas por primera vez por
Claussen en 1903 en la produccioacuten de cerveza1
Este geacutenero se conoce desde hace tiempo como agente contaminante en la
industria cervecera de la sidra y de bebidas carbonatadas2 En la industria
enoloacutegica su descripcioacuten como alterante es maacutes reciente
Durante los antildeos 1950s muchos autores reportaron el aislamiento del genero
Brettanomyces en uvas francesas e italianas (Van der Walt y Van der Kerken
1958) Sin embargo en muchas regiones del mundo viniacutecola esta levadura no ha
sido identificada lo cual dificulta su deteccioacuten en materiales o productos
contaminadosEntre todos los microorganismos la levadura
BrettanomycesDekkera es una de las maacutes temidas por los vinicultores El
crecimiento y desarrollo de esta levadura causa alteraciones denominadas
ldquocaraacutecter Brettrdquo lo cual ocurre especialmente en vinos tintos3
1 Gilliland R Brettanomyces I Occurrence characteristics and effects on beer flavor J Inst Brew
1961
2 Deak T y Beuchat LR Handbook of spoilage yeast CRC Press Nova York 1996
3 Heresztyn T Archives of Microbiology 1986 Metabolism of phenolic compounds from
hydroxycinnamic acids by Brettanomyces yeast
9
El ldquocaraacutecter Brettrdquo produce un amplio espectro de sabores y aromas alterantes
entre los cuales estaacuten corral minerales tinta tabaco cuero faacutermacos y
ahumado estas alteraciones se le atribuyen a los compuestos 4-etilfenol y 4-
etiguayacol las cuales causan una supresioacuten de aromas atractivos en el vino
como de frutas y flores y perdida de sabores agradables para el consumidor como
acido salado amargo o picante 4
Esta levadura tiene distinto comportamiento seguacuten el tipo de vino al que esteacute
asociada pues cada tipo de vino tiene diferente composicioacuten de carbonos
nitroacutegenos vitaminas y minerales
Con este estudio se evaluacutea el comportamiento y caracterizacioacuten de la levadura
BrettanomycesDekkera en vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia con
el desarrollo de medios solido y liquido para la selectividad de la levadura
alteraciones aromaacuteticas del vino tinto Babic producidas por 4 etilfenol y 4
etilguayacol y el comportamiento de BrettanomycesDekkera en el vino al ser
tratado con Dioacutexido de azufre (SO2) comparativamente con tratamiento Antibrettreg
4 Boulton Singleton Bisson amp Kunkee 1996 Descripcioacuten de aromas fenoacutelicos
10
1 MARCO TEORICO
Las levaduras representan el grupo de microorganismos maacutes importante en la
industria viniacutecola porque sin Saccharomyces producir vinos de alta calidad seriacutea
imposible Ademas de Saccharomyces hay muchos otros geacuteneros y especies de
levaduras presentes durante la vinificacioacuten que afectan la calidad del vino positiva
o negativamente5
Las levaduras comprenden 39 geacuteneros y 350 especies Se identifican y clasifican
basaacutendose en caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas Entre los aspectos
morfoloacutegicos considerados se encuentran el tamantildeo y la forma de las ceacutelulas en
medios soacutelidos y liacutequidos especificados el modo de reproduccioacuten y si forma velo
en la superficie o sedimenta en un medio liacutequido Entre las caracteriacutesticas
fisioloacutegicas consideradas se encuentra si puede crecer (y fermentar) en un
determinado carbohidrato y si puede o no utilizar determinadas fuentes de
nitroacutegeno como los nitratos6
11 REPRODUCCION
Las levaduras son agrupadas en tres familias conocidas como
Saccharomycetaceae Sporobolomycetaceae y Cryptococcaceae Estas
5 H Erten June 2002 Relations between elevated temperatures and fermentation behavior of
Kloeckera apiculata and Saccharomyces cerevisiae associated with winemaking in mixed culture
World Journal of Microbiology and Biotechnology Volume 18 N 4 pag 1 Adana Turkey 6 Cerveceros de Argentina 2006 Levadura wwwcervezadeargentinacomararticuloslevadurahtm
11
representan el grupo de microorganismos entre bacterias y hongos respecto a su
tamantildeo de ceacutelula Este grupo es caracterizado por su forma de reproduccioacuten
vegetativa conocida como ldquogemacioacutenrdquo Bajo condiciones optimas una ceacutelula
madre puede gemar varias veces durante el periodo reproductivo Sin embargo
bajo estrictas condiciones de fermentacioacuten una levadura va a gemar solamente
entre tres o cuatro veces Aquiacute la disponibilidad de oxigeno la cual es necesaria
para la formacioacuten de precursores de la membrana de la ceacutelula limita la
replicacioacuten7
Estos microorganismos muestran varios tipos de gemacioacuten lo cual puede dar un
valor diagnostico Entre aquellas aisladas de fermentacioacuten y antildeejamiento del vino
se observan maacutes frecuentemente multilateral y gemacioacuten polar 8
La modalidad maacutes comuacuten es la gemacioacuten proceso asexual en el cual la ceacutelula
progenitora emite un conducto tubular desde la vacuola nuclear hacia un punto
perifeacuterico proacuteximo a la misma Entonces se forma en la direccioacuten del conducto
una pequentildea protuberancia en la superficie externa de la ceacutelula y el conducto
pasa atravesando la pared celular a dicha protuberancia la cual se ensancha
llenaacutendose con el material citoplaacutesmico y nuclear de la ceacutelula progenitora Cuando
el brote o yema formada llega a ser casi tan grande como la ceacutelula progenitora los
aparatos nucleares de ambas ceacutelulas se orientan de forma que sus centrosomas
respectivos equidisten del punto de unioacuten Al llegar este momento la ceacutelula madre
y la ceacutelula hija se separan y se inicia la formacioacuten de nuevas ymas En la
gemacioacuten normal no se forman tabiques de separacioacuten entre ceacutelula madre y
ceacutelulas hijas pero en algunos casos el proceso se inicia en la gemacioacuten y se
completa por divisioacuten con la separacioacuten definitiva de ambos individuos La ceacutelula
madura de puede producir por gemacioacuten durante el curso de vida un promedio de
7 Brinton M Miller and Warren Litsky PhD 1976 Industrial Microbiology Edi Mac Graw Hill United States
of America
8 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures
edi Springer second edition Fresno California United States of America
12
24 generaciones de ceacutelulas hijas Las yemas sucesivas se forman siempre en
sitios diferentes de la superficie de la ceacutelula9
111 Gemacioacuten multilateral
La gemacioacuten multilateral ocurre en el ldquohombrordquo o aacuterea de la levadura donde ocurre
la reproduccioacuten La gemacioacuten y ciclo de separacioacuten crea un problema para las
levaduras durante su fase fermentativa pues en este tiempo la ceacutelula madre se
reduce aproximadamente un medio Porque la siacutentesis de la membrana celular
ocurre bajo condiciones anaeroacutebicas lo que limita los ciclos asexuales
replicativos Como resultado la mayoriacutea de las fermentaciones se completan en la
fase estacionaria (no gemacioacuten) Un ejemplo de esta reproduccioacuten es
BrettanomycesDekkera10
112 Gemacioacuten Polar
A diferencia de la gemacioacuten multilateral la gemacioacuten polar puede ocurrir en uno o
dos polos En el caso de Kloeckera y Saccharomyces la gemacioacuten ocurre en
ambos polos aumentando la poblacioacuten de levaduras con forma de ldquolimoacutenrdquo 11
113 Fisioacuten
Esta reproduccioacuten es caracteriacutesticas del genero Schizosaccharomyces donde la
formacioacuten de la ceacutelula hija ocurre sin la reduccioacuten de la madre ceacutelula como en los
casos anteriores En este caso la formacioacuten de la microscoacutepica pared celular
ocurre entre la madre ceacutelula y la hija seguida por la separacioacuten12
9 Araya Pablo 2002 Reproduccioacuten de hongos unicelulares mediante gemacioacuten esporulacioacuten y
fisioacuten httphtmlrincondelvagocomreproduccion-asexualhtml
10 11 12 Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic
Publishers GmbH United States of America and Canada
13
114 Pseudomycelium
Cualquier fabricante de vinos ha tenido la oportunidad de notar la formacioacuten de
una peliacutecula en la superficie del vino Esto surge debido a la gemacioacuten repetida de
las levaduras oxidativas y fallas en el momento de la separacioacuten de la ceacutelula hija
de la madre Con el tiempo el lazo previo entre la madre ceacutelula e hija se ampliacutea
dando la impresioacuten de filamentos como si se tratase de mohos siendo que son
levaduras 13
12 TAXONOMIA
Para distinguir las levaduras que pueden producir ascoporas de aquellas que no
los micologistas usan doble taxonomiacutea para su clasificacioacuten Desafortunadamente
la nomenclatura para la combinacioacuten anamorfotelemorfo es frecuentemente
diferente Unos ejemplos de levaduras sexualasexual o telemorfoanamorfo son
DekeraBrettanomyces Metschnikowia pulcherrimaCandida pulcherrima
Hanseniaspora uvarumKloeckera apiculata Torulaspora delbruecki Candida
colliculosa 14
Sin embargo las levaduras son diferenciadas por los taxonomistas por asignacioacuten
de varios nombres de geacutenerosespecies varios vinicultores usan un sistema
informal para agrupar levaduras basadas en su morfologiacutea u otras caracteriacutesticas
Por ejemplo a Kloeckera apiculata se le refiere como ldquolevadura apiculadardquo
tiene forma de limoacuten Esta levaduras asi com muchas otras presentes en el mosto
de la uva como lo son Candida Cryptococcus Debaryomyces Hansenula
Issatchenkia Kluyveromyces Metschnikowia Pichia y Rhodotorula tambieacuten son
llamadas levaduras ldquonativasrdquo ldquonaturalesrdquo o ldquosalvajesrdquo por su origen el vintildeedo o en
13
Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers
GmbH United States of America and Canada
14 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
14
la vinera Algunos enoacutelogos han discutido contra el uso de estos teacuterminos porque
esta implicancia no sucede en todas las levaduras ya que estas son de alguna
forma ldquono-nativasrdquo o ldquono naturalesrdquo (Ej Saccharomyces o Brettanomyces) El
teacutermino ldquono Saccharomycesrdquo es maacutes comuacuten para nombrar aquellas levaduras
presentes en el mosto de la uva que no son del genero Saccharomyces15
Las levaduras encontradas despueacutes de la fermentacioacuten alcohoacutelica tambieacuten son
asignadas a un grupo informal Algunas veces las levaduras que conducen la
principal fermentacioacuten (Saccharomyces) son muchas veces llamadas ldquolevaduras
fermentativasrdquo basados en su metabolismo Durante su antildeejamiento algunas
levaduras (Candida Hansenula y Pichia) pueden crecer en la superficie en
presencia de oxigeno Esta peliacutecula superficial es comuacutenmente asociada a
deterioro del vino esta levadura se le conoce como ldquolevadura formadora de
peliacuteculardquo16
121 DekkeraBrettanomyces
La taxonomiacutea cientiacutefica sobre BrettanomycesDekkera ha cambiado en los uacuteltimos
antildeos Brettanomyces estaacute clasificado dentro de la misma familia que
Saccharomyces (familia Saccharomycetaceae) Actualmente dentro del geacutenero
Brettanomyces se aceptan cinco especies diferentes (B bruxellensis B
anomalus B custersianus B nanas y B naardenensis)17
Las teacutecnicas de biologiacutea molecular han demostrado que B intermedious B
lambicus B custerseii o D intermedia son sinoacutenimos de B bruxellensis por lo
que estas denominaciones han quedado en desuso Los microorganismos de este
geacutenero presentan dos formas una capaz de reproducirse sexualmente (Dekkera)
15
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
16 Kurtzman CP 1998 The industrial and agricultural significance of yeasts 4
th Edition Amsterdam
Holanda
17 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
15
y otra que lo hace asexualmente (Brettanomyces) Tambieacuten se llaman
respectivamente forma perfecta y forma imperfecta En algunos casos la forma
perfecta y la imperfecta reciben nombres diferentes como ocurre con B anomalus
y D anomala En otros casos el nombre es similar como las pertenecientes a la
especie bruxellensis que pueden parecer como D bruxellensis como B
bruxellensis o como BrettanomycesDekkera A efectos praacutecticos en la bodega
estos dos estados son similares Cuando vemos referencias a Brettanomyces
como contaminante en la mayor parte de los casos se refieren a
DekkeraBrettanomyces ya que este es el responsable de las alteraciones en el
vino18 y 19
La morfologiacutea celular de BrettanomycesDekkera es ojival o ciliacutendrica con
gemacioacuten multipolar en reproduccioacuten vegetativa Una de las caracteriacutesticas de
este geacutenero es su tamantildeo celular variable y la formacioacuten de filamentos19
18 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 23
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
19
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
16
Figura 1 Microfotografiacutea de cultivo de BrettanomycesDekkera a) Variabilidad morfoloacutegica y de
tamantildeo celular b) forma filamentosa
Fuente Lopez-Cordon Eva BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia wwwacenologiacom
Los defectos sensoriales asociados directamente a Brett aparecen
mayoritariamente en vinos tintos de calidad y las causas radican en la propia
fisiologiacutea del microorganismo Ademaacutes al ser una levadura de crecimiento muy
lento la alteracioacuten se presenta principalmente durante el almacenamiento y sobre
todo la crianza del vino habitual en los vinos tintos de gama alta En las barricas
de madera el microorganismo tiene a su disposicioacuten todo el sustrato y tiempo
suficiente para realizar su actividad La naturaleza porosa de la madera y su difiacutecil
limpieza contribuye a que las poblaciones existentes se mantengan incluso
despueacutes del lavado de la barrica Ademaacutes BrettanomycesDekkera tiene la
capacidad de degradar uno de sus componentes la celobiosa 20
13 CARACTERISTICAS FISIOLOGICAS
S cerevisiae y BrettanomycesDekkera tienen metabolismos similares muy
adaptados a las condiciones de vinificacioacuten Tras la fermentacioacuten alcohoacutelica S
cerevisiae es la levadura mayoritaria debido a que las condiciones nutricionales
20
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
17
del vino son muy estrictas (altas concentraciones de etanol y bajas
concentraciones de nutrientes) En este momento BrettanomycesDekkera
continuacutea creciendo gracias a que utiliza nutrientes que S cerevisiae no ha podido
consumir sobre todo algunos azuacutecares y fuentes de nitroacutegeno21
Una de las caracteriacutesticas que diferencia a BrettanomycesDekkera es la gran
diversidad de azuacutecares que puede fermentar (ver tabla de Relacioacuten de los
principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) La mayoriacutea de
las cepas pueden crecer utilizando trealosa y celobiosa azucares presentes en el
vino y no consumibles por S cerevisiae Otra de las ventajas que presenta frente
a S cerevisiae (y frente a la mayoriacutea de las levaduras) es que puede utilizar los
nitratos como fuente de nitroacutegeno Debido a que S cerevisiae soacutelo utiliza el
nitroacutegeno amoniacal y los aminoaacutecidos libres estos se consumen con relativa
rapidez Al final de la fermentacioacuten el nitroacutegeno moniacal es escaso y se favorece
el crecimiento de las levaduras que pueden utilizar otras fuentes de nitroacutegeno
Ademaacutes Brettanomyces puede crecer con concentraciones de fosfato diamoacutenico
tan bajas como 05gl o a partir de diversos aminoaacutecidos En resumen
BrettanomycesDekkera crece maacutes despacio que S cerevisiae es resistente a
concentraciones altas de alcohol puede utilizar otros azucares como fuentes de
energiacutea y nitrato como fuente de nitroacutegeno Esto explica que pueda reproducirse
cuando la fermentacioacuten alcohoacutelica ha terminado a partir de nutrientes no
consumibles por S cerevisiae y cuando no tiene competidores22
21
Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
22 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
18
Tabla 1 Relacioacuten de los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto
Fuente Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista
VINOTEQ N 38 pag 21 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
131 BrettanomycesDekkera y siacutentesis de fenoles volaacutetiles
El origen de los fenoles volaacutetiles estaacute relacionado con la actividad secuencial de
dos enzimas que descarboxilan los aacutecidos en hidroxiestirenos (vinilfenoles) que
19
son posteriormente reducidos a etilderivados (etilfenoles)23 como puede
observarse en la figura 2
Figura 2 Siacutentesis de etilfenoles de BrettanomycesDekkera
Fuente ACE revista de Enologia wwwacenologiacom
El primer paso de descaboxilacion de los aacutecidos hidroxicinamicos es comuacuten
tambieacuten en otros microorganismos como bacterias hongos y otras levaduras Sin
embargo el segundo paso reduccioacuten de vinilfenoles es caracteriacutestico de algunos
tipos de levaduras como Dekkera bruxelliensis D anomala Pichia guillermondi
Candida versarilis C halophila y C mannitofaciens24
Los fenoles volaacutetiles que se asocian al problema Brett en vinos son el 4-etilfenol y
el 4- etilguaiacol asiacute como sus precursores intermedios 4-vinilfenol y 4-
vinilguaiacol aunque estos uacuteltimos son menos importantes por ser muy reactivos y
raacutepidamente convertidos en etilfenoles por BrettanomycesDekkera o en su caso
23
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
24 Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
20
condensan con otras moleacuteculas como antocianos25 Los etilfenoles y
especialmente elevadas concentraciones de 4-vinilfenol en vinos se asocian con
aromas desagradables asociados a descriptores como ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de
caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo26
El umbral sensorial del 4-etilfenol es de 230 μg l-1 y el del 4-etilguaiacol es de 47
μgl Pese a su menor umbral sensorial el 4-etilguaiacol responde a descriptores
como ldquobaconrdquo o ldquoahumadordquo que a bajas concentraciones aportan complejidad por
lo que se puede considerar sensorialmente menos conflitivo que el 4-etilfenol 27
Figura 3 Defectos sensoriales producidos en el vino por BrettanomycesDekkera
Fuente Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
25 Morata A Goacutemez-Cordoveacutes M Calderoacuten F Suaacuterez J 2006 Effects of pH temperature and SO2 on the
formation of pyranoanthocyanins during red wine fermentation with two species of Saccharomyces Journal Food Microbiology No106 pag 4 Madrid Espana
26 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea 27 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
21
132 Identificacioacuten de BrettanomycesDekkera
Los Bioacutelogos usan sistemas de identificacioacuten basados en similitudes taxonoacutemicas
entre organismos dichas similitudes pueden ser morfoloacutegicas tipos capacidad de
produccioacuten de sustratos como azuacutecar yo nitratos caracteriacutesticas fisioloacutegicas y
bioquiacutemicas secuencia del material geneacutetico y respuestas inmunoloacutegicas28
En la industria viniacutecola es importante recurrir a diferentes tipos de pruebas para la
identificacioacuten de microorganismos una de estas y la maacutes realizada es la revisioacuten
del microorganismo bajo el microscopio Esta prueba brinda informacioacuten sobre la
morfologiacutea del microorganismo (cocos bacilos formas puntudas ojival entre
otros) tamantildeo (dimensiones) agrupaciones celulares (solas parejas triacuteos
grupos o cadenas) Sin embargo el uso del microscopio es una prueba raacutepida
para examinar mostos o vino pero no determina cantidades que muchas veces es
requerido para tratamientos de accioacuten otro de los inconvenientes es que los
microorganismos pueden variar su morfologiacutea en forma o tamantildeo dependiendo de
la edad y las condiciones de crecimiento por lo que puede no ser clara la
identificacioacuten de este29
14 Medios soacutelidos selectivos
Si se requiere de la confirmacioacuten del microorganismo este debe ser aislado del
vino para una caracterizacioacuten para esto se requiere de medios soacutelidos Cuando se
examina un microorganismo en un medio solido es importante revisar las
caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias (ver figura 4 Morfologiacuteas de colonias
en medios soacutelidos) Entre estas caracteriacutesticas estaacuten forma (circular irregular o
2829 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
22
rizada) tamantildeo (dimensiones estas normalmente se expresan en miliacutemetros)
topografiacutea (plano elevado convexo coacutencavo o embonado) presencia de
pigmentos opacidad (transparente traslucido u opaco) superficie (suave rugosa
lisa o aacutespero) bordes (entero ondulado crespo dentado rizado) o cualquier
cambio en el agar (color opacidad cambios en los indicadores de pH o CaCO3
respectivamente)30
Figura 4 Varias morfologiacuteas de crecimiento de colonias en medio solido
Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007
Gran nuacutemero de medios selectivos se han creado para la aislacioacuten deteccioacuten yo
conteo de levaduras provenientes de jugos de uva mostos o vinos El medio maacutes
utilizado en estos fines es YPD (Yeast Peptone Dextrose) pero dicho medio no
es selectivo entre levaduras y se usa comuacutenmente para el conteo de
Saccharomyces31 Las colonias empiezan a parecer con un periodo de incubacioacuten
30
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
31 Essia Ngang J Wolniewicz E Villa P2005 Stimulation of lactobacilli during alcoholic fermentation action
of sucrose hydrolysis by yeast Biotechnology letters No 8 pag 743 Amiens France
23
de 2 a 4 diacuteas a 22C a 25C Igualmente el agar de jugo de uva es no selectivo y
presenta faacutecil crecimiento de levaduras bacterias y mohos
Para la levadura Brettanomyces Dekkera se han elaborado diferentes medios
selectivos entre ellos el maacutes conocido es WL por sus siglas en ingles del
laboratorio que lo creo ldquoWallerstein Laboratoriesrdquo este medio contiene
cicloheximida compuesto selectivo para Brettanomyces e inhibe Saccharomyces
El punto criacutetico es encontrar la cantidad exacta de este compuesto para la
inhibicioacuten de las levaduras sin que afecte a BrettanomycesDekkera32
Ademaacutes del medio WL BrettanomycesDekkera puede ser cultivado en otros
medios selectivos como Brettanomyces medio A creado por Vilas en 1993
Brettanomyces medio B el cual contiene cicloeximida como agente selectivo
mientras que Brettanomyces medio C tiene cicloheximida y ampicilina este medio
fue creado por B Watson en 1998 Brettanomyces medio D fue creado
recientemente por Rodrigues en 2001 este medio es conocido como DBDM
(DekkeraBrettanomyces differential medium ) es un medio selectivo para
Brettanomyces en contra de Saccharomyces y otras levaduras este medio es el
maacutes utilizado en la vineras para caracterizacioacuten de BrettanomycesDekkera
actualmente33
15 Dioacutexido de azufre (SO2) en vinos
32
33
Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers
GmbH United States of America and Canada
24
El dioacutexido de azufre tambieacuten llamado oxido de azufre es un eficaz agente
conservante antioxidante y antimicrobiano en la industria viniacutecola34
Durante la vinificacioacuten SO2 ha representado histoacutericamente una herramienta muy
importante usada por los vinicultores para el control de crecimiento microbioloacutegico
Debido a preocupaciones por la salud del consumidor el uso de este producto ha
disminuido dramaacuteticamente con el posible riesgo de aumentar el riesgo
microbioloacutegico35
El actual liacutemite legal de SO2 en vinos en los Estados Unidos es de 350mgL una
concentracioacuten mucho mayor a la usada en la industria viniacutecola No obstante vinos
que contienen maacutes de 10mgL deben declarar este compuesto en la etiqueta
porque SO2 es un metabolito que las levaduras usan durante la fermentacioacuten Los
vinos siempre contienen algo de sulfitos aunque la adicioacuten no se realice durante el
proceso36
151 Formas del Dioacutexido de Azufre (SO2)
Una vez disuelto en agua el dioacutexido de azufre existe en equilibrio entre SO2
molecular (SO2H2O) bisulfito (HSO3) y sulfito (SO32-) Este equilibrio depende del
pH Ademaacutes de estar en equilibrio con el molecular y especies sulfito el bisulfito
tambieacuten existe en forma ldquolibrerdquo y en forma ldquoatadardquo Aquiacute la moleacutecula reaccionara
34
Orwine Eureka 2008Investigadores europeos buscan alternativas al dioxido de azufre en vinos
httpawprowordpresscom20081107investigadores-europeos-buscan-alternativas-al-dioxido-de-
azufre-en-el-vino
3536 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
25
con compuestos carbonilos (ej Acetaldehiacutedo) formando productos adicionales
como Acido Hydroxysulfonico 37
Ademaacutes de Acetaldehiacutedo algunas moleacuteculas presentes en el jugo de uva que
reaccionan con bisulfito son acido piruvico α-keto-glutaric dihidroxyacetona
diacetyl Pigmentos de antocianinas entre otros38
152 Inhibidor Microbiano
El sulfuro molecular es la forma antimicrobiana del dioacutexido de azufre La cantidad
de SO2 molecular presente en cualquier vino no se mide directamente La
concentracioacuten es calculada conociendo la concentracioacuten de SO2 libre y el pH del
vino basaacutendose en la siguiente foacutermula
Alternativamente la figura 5 Se puede utilizar como guiacutea para aproximar la
cantidad de SO2 libre necesitada a determinado valor de pH de valores entre 05 o
08 mgl de SO2 molecular 39
El SO2 inhibe microorganismos de varias formas incluyendo rupturas de puentes
bisulfitos en proteiacutenas y reaccionando con coofactores como NAD+ y FAD tambieacuten
reacciona con ATP
3739
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
38 Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi
Springer New York United States
26
Figura 5 Cantidades de SO2 libre a un pH determinado para obtener 05 o 08 mgl de SO2
molecular
Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007
La concentracioacuten de SO2 molecular necesario para prevenir el crecimiento de
microorganismos variacutea seguacuten vinojugo pH temperatura poblacioacuten densidad y
diversidad estado de crecimiento grado de alcohol entre otros factores Beech
1979 sugirioacute una adicioacuten de 08 mgl de SO2 molecular como la cantidad
necesaria del compuesto en vinos blancos de mesa para dar una reduccioacuten de
cerca de 104 UFCml de la poblacioacuten de diferente tipo de microorganismos en 24
horas Las diferencias que existen entre las levaduras y bacterias en base a la
27
sensibilidad a este compuesto son dadas a conocer por diferentes autores (Warth
1977 1985 Du Toit 2005 Davis 1988 Hood 1983)40
16 Antibrettreg como alternativa de prevencioacuten y eliminacioacuten de
BrettanomycesDekkera
Antibrettreg es un producto nuevo creado por Spindal SARL-Gretz - Armainvilliers
Francia Es una preparacioacuten enzimaacutetica para inactivar Brettanomyces y para
reducir olores producidos por fenoles volaacutetiles41
Antibrettreg es preparado a base de paredes celulares de levadura activados
enzimaacuteticamente que presentan elevadas propiedades adsorbentes frente al 4-
etilfeno y 4- etilguayacol compuestos asociados con olores desagradables en el
vino tales como sudor de caballo farmacia o barniz42
Antibrettreg inhibe la produccioacuten de la vinilreductasa que participa en la
transformacioacuten de los aacutecidos cinaacutemicos naturalmente presentes en los vinos en
los correspondientes derivados etilados responsables de los olores atribuidos a
BrettanomycesDekkera 43
40
Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi
Springer New York United States
41 Manual de instrucciones de producto Antibrett reg producido por Spindal SARL-Gretz -
Armainvilliers France
424344 AEB Group 2008 ANTIBRETT Preparado a base de paredes celulares de levadura para la inactivacioacuten
de Brettanomyces y la eliminacioacuten de los olores de estos productos httpwwwaeb-
groupcomimgsSPAGNOLODepliantANTIBRETT-lett-ESPpdf
28
El uso de Antibrettreg es efectivo incluso contra otros olores anoacutemalos como los
que se generan en las barricas sucias principalmente huacutemedas dantildeando la
calidad olfativa del vino44
29
2 PROBLEMA
La levadura BrettanomycesDekkera es una levadura de contaminacioacuten presente
en la mayoriacutea de industrias viniacutecolas en el mundo Afecta directamente la
produccioacuten y calidad sensorial de los vinos con el desarrollo de los compuestos 4
etilfenol y 4 etilguayacol los cuales dantildean el perfil olfativo del vino dando aromas
caracteriacutesticas a ldquoestablordquo ldquocuerordquo ldquosudor de caballordquo o ldquobarnizrdquo conocido como
ldquocaraacutecter Brettrdquo
Esta contaminacioacuten se da especialmente en los vinos tintos debido a sus
caracteriacutesticas de produccioacuten (fermentacioacuten crianza antildeejamiento) y sus
propiedades fisicoquiacutemicas (Grado alcohoacutelico pH Acidez total Acidez volaacutetil
entre otros)
En Croacia existe una gran produccioacuten de vinos tintos entre los cuales se
encuentra el vino tinto Babic proveniente de la isla de Hvar el cual es famoso por
ser un vino duro carnoso estructurado y casi sobre-maduro con un grado
alcohoacutelico que ronda los 15 vv siendo la primera denominacioacuten de origen que
se aproboacute en Croacia en el antildeo 1961 este vino es de gran importancia en la
regioacuten la mayoriacutea de sitios de elaboracioacuten son pequentildeas industrias que han sido
afectadas por el bdquocaraacutecter Brett‟ Muchas investigaciones se han realizado al
respecto de la levadura BrettanomycesDekkera pero se conoce muy poco sobre
sus efectos en el vino Babic debido a sus caracteriacutesticas particulares (alcohol
30
15 pH 35 Acidez total 520 gr Acido TartaricoL Acidez volaacutetil 08 gr Acido
AceticoL Azucar residual 47 grLt)45
La dificultad de la pequentildea industria para acceder a productos que lleven a la
identificacioacuten de la levadura mencionada y de esta manera conllevar a planes de
accioacuten contra el ldquocaraacutecter Brettrdquo es una de las grandes dificultades de la industria
vinera en este paiacutes en donde los productos para la industria enoacuteloga son
complicados y de alto precio para acceder a ellos y en consecuencia no se
realizan muchas de estas pruebas de deteccioacuten de BrettanomycesDekkera
llevando al mercado productos contaminados de baja calidad que inicialmente
podriacutea haber sido un vino de alta calidad debido a sus caracteriacutesticas uacutenicas y de
gran popularidad
45
Datos obtenidos en el laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
31
3 JUSTIFICACION
Actualmente Croacia cuenta con maacutes de 300 zonas vineras en las que se producen 67
de vino blanco 32 vino tinto y el restante 1 vino rosado De acuerdo a recientes datos
estadiacutesticos hay 650 km2 de vintildeedos en Croacia de los cuales 375 km2 son uvas con
indicacioacuten geograacutefica de origen que producen maacutes de 300 vinos y maacutes de la mitad de este
nuacutemero son vinos elaborados en microempresas con un total de 50000000 de botellas
de vino el 8 es vino superior 70 de calidad y el 22 es vino de mesa de produccioacuten
nacional46
Croacia es un fuerte productor de vino a nivel regional con sus diferentes variedades
propias (Merlot Plavac Dingač Postup Malvazija Pošip Kujundžuša Babic) pero dicha
produccioacuten ha sido fuertemente afectada por la presencia de la levadura
BrettanomycesDekkera trayendo consecuencias como perdidas de produccioacuten peacuterdida
de calidad sensorial del vino grandes peacuterdidas econoacutemicas y desprestigio a sus vinos de
denominacioacuten de origen
Es por esto que en este proyecto de investigacioacuten se busca una faacutecil y raacutepida
identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera causante del ldquocaraacutecter Brettrdquo con el
desarrollo de medios selectivos liquido y solido ademaacutes de opciones para el tratamiento
yo prevencioacuten de esta levadura en la cadena productiva comparativamente entre dioacutexido
de azufre (SO2 ) y Antibrettreg y la identificacioacuten de los aromas caracteriacutesticos del ldquocaraacutecter
Brettrdquo en el vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia
46
Hrvatski zavod za vinogradarstvo i vinasrtvo 2003 Pravilnik o vinu httpwwwhrzvvhrpropisihtm
32
4 OBJETIVOS
41 General
Caracterizar y evaluar el comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera
en teacuterminos de crecimiento y produccioacuten de aromas no deseados en vino tinto
Babic
42 Especiacuteficos
Desarrollar el medio solido y medio liacutequido selectivo para
BrettanomycesDekkera
Evaluar el comportamiento de la levadura en estos medios selectivos
Determinar la influencia del Dioacutexido de azufre (SO2) y el compuesto
Antibrettreg en la levadura BrettanomycesDekkera presente en vino tinto
Babic 2007
Identificar los compuestos aromaacuteticos producidos por Brettanomyces
bruxellensis en vino tinto Babic usando el meacutetodo ldquomultiple headspace
solid-phase microextraction (SPME)rdquo
33
5 ALCANCES
En este proyecto se pretende desarrollar un medio selectivo faacutecil de producir en
donde sea raacutepida la identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera en la
produccioacuten de vinos tintos se realizaran pruebas para corroborar el crecimiento de
esta levadura en el medio determinando el tiempo que esta levadura toma en
adaptarse en el medio y su comportamiento en este una vez comprobada su
adaptacioacuten al medio liquido se trabajara con el meacutetodo de cromatografiacutea de gas
(GC) y el uso de micro extraccioacuten en fase solida (SPME) para el anaacutelisis
cuantitativo de los compuestos volaacutetiles (4-etil-fenol 4-etil-guayacol4-vinilfenol y
4-vinil-guayacol) y posteriormente con el vino tinto Babic Ademaacutes se desea
comprobar la efectividad de los productos con que las vineras de Croacia inhiben
o eliminan la presencia de la levadura en los vinos tintos como lo son el producto
AntiBrettreg y el Dioacutexido de azufre (SO2)
34
6 ESTADO DEL ARTE
Sobre el campo problemico causado por la levadura BrettanomycesDekkera en la
industria viniacutecola se han realizado bastante investigaciones a nivel de
caracterizacioacuten de la levadura los factores fisicoquiacutemicos que favorecen el
crecimiento de la levadura meacutetodos de prevencioacuten y control evaluacioacuten de
dantildeos sensoriales en diferentes tipos de vinos formacioacuten de compuestos fenoacutelicos
en los diferentes tipos de vino otros compuestos no fenoacutelicos asociados al
ldquocaraacutecter Brettrdquo teacutecnicas de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera
evaluacioacuten de la teacutecnicas de control e inhibicioacuten de dicha levadura desarrollo de
nuevos medios de deteccioacuten y aislamiento de la levadura relacioacuten entre la
levadura BrettanomycesDekkera con las otras levaduras presentes en el vino
entre otros
Seguacuten estas investigaciones se analizan aquellas que pueden aportar datos
importantes para el desarrollo del trabajo que se quiere realizar y se tiene en
cuenta sus metodologiacuteas conclusiones recomendaciones y comentarios
Entre las importantes para el planteamiento de este trabajo se menciona el trabajo
realizado por la Universidad Politeacutecnica de Madrid Espantildea el cual analiza
algunas de las caracteriacutesticas maacutes relevantes de este geacutenero de levaduras su
crecimiento en bodega factores fisicoquiacutemicos que favorecen su crecimiento y
desarrollo en el vino los defectos sensoriales que presenta en los vinos y estudia
algunas de los meacutetodos fiacutesicos para el control de BrettanomycesDekkera en vino
35
(clarificacioacuten filtracioacuten amicrobica proteiacutenas clarificantes anhiacutedrido sulfuros
dimetil dicarbonato Aditivos)47
Para conocer maacutes sobre la levadura en condiciones de barrica y almacenamiento
se revisa el articulo elaborado en el Departamento Teacutecnico Guserbiot La rioja
Espantildea en este artiacuteculo se describe brevemente su metabolismo y su ecologiacutea en
las bodegas Igualmente se comparan las teacutecnicas utilizadas en los laboratorios
para su deteccioacuten y cuaacuteles son las limitaciones de los diferentes meacutetodos
Finalmente se analizan las estrategias desarrolladas para su eliminacioacuten de las
bodegas y se dan una serie de recomendaciones para su control48
El instituto de fermentaciones Industriales Consejo superior de investigaciones
cientiacuteficas Juan de Cierva Madrid Espantildea en el cual se revisa la formacioacuten de
etilfenoles (4 etil-fenol 4 etil guayacol) en vinos tintos anejos Los factores
fisicoquiacutemicos que favorecen el crecimiento de la levadura no deseada
BrettanomycesDekkera las teacutecnicas usadas para la detectar la presencia de esta
levadura en vinos ( Revisioacuten microscoacutepica fluorescente remocioacuten de aacutecidos
grasos de su membrana teacutecnicas moleculares como PCR y electroforesis) y de
control (Proteiacutenas fining Fining con gelatina liquida filtracioacuten variables
fisicoquiacutemicas adicioacuten de aditivos procedimientos de altas presiones
manipulacioacuten geneacutetica) con esta investigacioacuten se concluye que la combinacioacuten y el
uso de las numerosas teacutecnicas pueden ayudar a la prevencioacuten y reduccioacuten de la
levadura BrettanomycesDekkera 49 Este trabajo muestra las muacuteltiples opciones
47
A Morata S Benito F Palomero F Calderoacuten y J A Suaacuterez-Lepe Ecologiacutea y prevencioacuten de
BrettanomycesDekkera durante la elaboracioacuten y crianza de vinos tintos Revista enoacutelogos (Editada por la
Federacioacuten Espantildeola de Asociaciones de Enoacutelogos y Periodistas Asociados) No 50 paacuteg 1-12 Madrid Espantildea
48 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 20-
24 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
49 R Suarez JA Suarez-Lepe A Morata F Calderon 2006 The production of ethyl phenols in wine by yeasts
of the genera Brettanomyces and Dekkera A review Journal Food Chemistry No 102 pag 10-21 Madrid
Espantildea
36
existentes en el control y prevencioacuten de la levadura mencionada sin embargo deja
claro que la mayoriacutea de estas opciones son costosas y no de faacutecil adquisicioacuten para
una pequentildea industria
El anaacutelisis sensorial ha sido de los aspectos maacutes estudiados al respecto de
BrettanomycesDekkera una de estas investigaciones fue realizada en Centre
Europeacuteen des Sciences du Goucirct en Talence Francia en el cual se evaluaron 50
vinos bordeaux sensorialmente para demostrar la complejidad del ldquoCaraacutecter Brett‟‟
al cual se unen otros compuestos aromaacuteticos ademaacutes de los fenoacutelicos como acido
isobutirico e isovalerico en este tipo de vino debido a sus caracteriacutesticas
fisicoquiacutemicas50
De los meacutetodos de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera los medios
selectivos son muy populares es por esto que el Laboratorio de Microbiologiacutea
Departamento de Botanica e Engenharia Biologica Instituto Superior de
Agronomia Lisboa Portugal realizo un trabajo en el cual se pretendia desarrollar
un medio selectivo o diferencial capaz de aislar la levadura
BrettanomycesDekkera del vino y de la cadena productiva del vino con el fin de
detreminar la relacioacuten entre esta levadura y los compuestos 4-etilfenol y 4 etil-
guayacol51 otro estudio realizado para la deteccioacuten de dicha levadura fue
realizado en la Escola Superior de Biotecnologiacutea Universidade Catoacutelica
Portuguesa el desarrollo de un simple procedimiento compatible con las rutinas
50 Andrea Romano a Marie Claire Perello a Aline Lonvaud-Funel Gilles Sicard Gilles de Revel2008 Sensory
and analytical re-evaluation of lsquolsquoBrett characterrdquo Journal Food Chemestry No 114 pag 15-19 Talence
France
51 N Rodrigues G Gonccedilalves S Pereira-da-Silva M Malfeito-Ferreira and V Loureiro2001 Development
and use of a new medium to detect yeasts of the genera DekkeraBrettanomyces Journal of applied microbiology No 90 pag 588-599Lisboa Portugal
37
usadas en las vineras para la deteccioacuten de BrettanomycesDekkera en vino y en
maquinarias52
En el laboratorio de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas Alcohoacutelicas de la
Universidad de Zagreb se ha trabajado anteriormente en el desarrollo de medio
solido selectivo con pruebas de diferentes concentraciones de los compuestos
como resultados se encuentra una buen relacioacuten entre las concentraciones de los
compuestos sin embargo como recomendaciones se encuentran la falta de
antibioacutetico para evitar contaminacioacuten por bacterias probar con diferentes fuentes
de carbono para comparacioacuten de tiempo de crecimiento positivo y un monitoreo
diario en el medio53
Los compuestos aromaacuteticos que libera la presencia de BrettanomycesDekkera
estaacute asociada a los compuestos 4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinilfenol y 4
viniguayacol a partir de esto los centros de investigacioacuten han hondado en la
identificacioacuten de dichos compuestos relacionados en la enologiacutea y especialmente
con BrettanomycesDekkera a partir de eso el Departamento de Quiacutemica
Universidad de La Rioja Espantildea este estudio presenta un meacutetodo basado en el
uso de Cromatografiacutea de Gas y micro extraccioacuten en fase solida para el anaacutelisis
cuantitativo de 4-etilfenol 4-etil guayacol 4-vinilfenol 4-vinilguayacol
Demostrando la existencia de un efecto matriz en el anaacutelisis de compuestos
responsables del ldquocaraacutecter Brettrdquo en vino Este nuevo meacutetodo fue
satisfactoriamente aplicado a cierto nuacutemero de vinos tintos comerciales vinos
52
JA Couto A Barbosa and T Hogg 2005 A simple cultural method for the presumptive detection of the yeasts BrettanomycesDekkera in wines Letters in Applied Microbiology No 41 pag 505-510 Porto
Portugal
53 Serkovic Dubravka Gracin Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac
Brettanomyces bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet pag 1-117 ZagrebCroatia
38
blancos y roseacute Este meacutetodo puede ser una alternativa para evitar el efecto matriz
en muestras de vino54
De acuerdo con este tema en la jornada cientiacutefica del 99 el grupo de investigacioacuten
enoloacutegica se estudio la formacioacuten de sustancias volaacutetiles por 13 cepas de S
cerevisiae con buenas aptitudes enoloacutegicas inoculadas individualmente en un
mosto homogeacuteneo de la variedad airen fermentado en las mismas condiciones
de aireacioacuten y a temperatura controlada55
54
C Pizarro N Perez-del-Notario JM Gonzalez-Saiz 2007 Determination of Brett character responsible
compounds in wines by using multiple headspace solid-phase micro extraction Journal of Chromatography
No 1143 pag 176-181 La Rioja Espantildea
55 E Pueyo P Hidalgo K Fernaacutendez y P Martiacuten-Aacutelvarez 1999 Anaacutelisis de compuestos volaacutetiles en vinos
obtenidos con distintas cepas de Saccharomyces cerevisiae Aplicacioacuten de la teacutecnica de microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientificas 99 Grupos de Investigacion Enologica Zaragoza Espana
39
7 MATERIALES Y METODOS
A continuacioacuten se presentan materiales y meacutetodos para la investigacioacuten
Este proyecto fue realizado en su gran mayoriacutea en las instalaciones de la
Universidad de Zagreb en la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos
(PBF) Laboratorios del Departamento de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas
Alcohoacutelicas ubicado en la ciudad de Zagreb Croacia
Los anaacutelisis fisicoquiacutemicos del vino tinto Babic fueron realizados en los
laboratorios de VINOLAB ubicado en Zagreb Croacia
71 MEDIO SOLIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera
711 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Autoclave de laboratorio
Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa Etanol peptona extracto de levadura
agar cicloheximida acido cumaacuterico ampicilina)
Balanza electroacutenica de precisioacuten
Microscopio oacuteptico
712 Metodologiacutea
Basados en estudios anteriores realizados en el laboratorio para el desarrollo de
medio solido selectivo para BrettanomycesDekkera (Serkovic Dubravka Gracin
40
Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac Brettanomyces
bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet Universidad de Zagreb pag 1-
117 Zagreb Croacia) se evaluaron las recomendaciones mencionadas en dicha
investigacioacuten para la mejoriacutea y desarrollo de otros medios soacutelidos selectivos
Se usoacute como base el medio YPD (Yeast Peptone Dextrose) el cual estaacute
compuesto de la siguiente forma 20gL peptona 10 gl extracto de levadura 20 gl
de agar56 este medio es selectivo para levaduras pero no es selectivo entre ellas
Es necesario el uso de una fuente de carbono para la levadura
BrettanomycesDekkera de acuerdo a la teoriacutea y revisando la tabla 1 (Relacioacuten de
los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) y seguacuten
facilidades de disponibilidad en el laboratorio se utiliza glucosa la cual es
utilizable por entre 75-100 de las cepas de BrettanomycesDekkera seguacuten la
tabla mencionada anteriormente
Esta fuente de carbono (Glucosa) fue probada en una concentracioacuten de 20 gL
Cicloheximida fue probada a 30 mgL para inhibir Saccharomyces en el medio y
darle mayor selectividad para Brettanomyces Dekkera Se antildeade acido p-
cumarico en una concentracioacuten de 100 mgL como precursor para la formacioacuten
del compuesto 4 etilfenol caracteriacutestico de la levadura BrettanomycesDekkera
Para inhibir bacterias en el medio se usa ampicilina a 10 mgL esta se agrega
despueacutes de realizada la esterilizacioacuten y cuando la temperatura del medio este
igual o menor a 40C El pH del medio se ajusto a 5
Paralelamente se crea el medio con Etanol como fuente de carbono en una
concentracioacuten de 6 o 60 mlL con la misma concentracioacuten de los otros
compuesto como cicloheximida 30mgL acido cumarico 100mgL 20 gL peptona
10 gL de extracto de levadura 16gL de agar Este medio se crea como
56
Concentraciones preestablecidas en el laboratorio de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas alcoholicas
41
comparativo para determinar cual fuente de carbono es la maacutes utilizada por la
levadura Brettanomyces bruxellensis para su reproduccioacuten Seguacuten la teoriacutea (ver
tabla 1) el etanol es utilizado por entre 25-75 de las cepas de
BrettanomycesDekkera pero es el azuacutecar que se encuentra en mayor
concentracioacuten presente en los vinos tintos aproximadamente 130 gl57
Estos medios fueron debidamente esterilizados para eliminar cualquier
microorganismo o espora presente en este Este procedimiento se realizo por el
meacutetodo de combinacioacuten de altas temperatura y presioacuten (Autoclave 121 C a 1034
kPa)
Se usaron colonias de BrettanomycesDekkera aisladas anteriormente de vinos
contaminados y guardas para investigaciones en el Departamento de Tecnologiacutea y
Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos
Universidad de Zagreb Croacia
Los medios fueron monitoreados visualmente todos los diacuteas y se toman
observaciones de macroscoacutepicas y microscoacutepicas Se comparan estos dos medios
en teacuterminos de rapidez de crecimiento de la levadura y selectividad Estas
muestras fueron incubadas a 28C por 10 diacuteas
La prueba fue realizada por duplicado en diferentes tiempos
57
Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
42
72 MEDIO LIacuteQUIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera
721 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Frascos de vidrio esteacuteriles
Autoclave de laboratorio
Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa peptona extracto de levadura
cicloheximida acido cumarico ampicilina etanol)
Microscopio oacuteptico
Balanza electroacutenica de precisioacuten
722 Metodologiacutea
En el mercado para enologiacutea existen medio liacutequidos selectivos para la deteccioacuten
de BrettanomycesDekkera en vinos sin embargo estos son de difiacutecil accesibilidad
por sus elevados precios es por esto que se desarrolla un medio liquido selectivo
para dicha levadura en el laboratorio del Departmaneto de Tecnologiacutea y Anaacutelisis
de Bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia
Para este medio se toma como base el medio selectivo con Glucosa como fuente
carbono desarrollado anteriormente sin usar agar para mantener el medio en su
estado liquido
43
La composicioacuten de este medio liacutequido es la siguiente
20 gL Glucosa
20 gL peptona
10gL extracto de levadura
30mgL de cicloheximida
100mgL acido p-cumarico
10 mgL ampicilina
Estos compuestos fueron medidos en una balanza electroacutenica de precisioacuten se
antildeade 250 ml de agua destilada y se mezcla constantemente se pasa a proceso
de esterilizacioacuten en autoclave a 120C y 1034 KPa por 45 minutos
De esta forma se asegura la usencia de microorganismos yo esporas en el
medio Despueacutes de bajar la Temperatura a 40C se agrega a la mezcla ampicilina
en una concentracioacuten de 10mgL
En frascos de vidrio esteacuteril se agrega 40 ml de medio liacutequido y diferentes
cantidades iniciales de levaduras BrettanomycesDekkera fueron inoculadas al
respectivo medio el primer frasco tiene una cantidad de 106 ceacutelulasml el segundo
tiene 104 ceacutelulasml el tercero tiene 102 celulasml y el cuarto con una cantidad
aproximada de 25 ceacutelulasml Estas cantidades estaacuten basadas en estudios
anteriores para medios liacutequidos selectivos en levaduras58
58 J Ungar A M James P W Muggleton H F Pegler y E G Tomich1950 The Cultivation of
Haemophilus pertussis in Partially Defined Liquid Media Journal of General Microbiology No 4
pag 345-359 Greenford
44
Este medio liacutequido inoculado fue inspeccionado diariamente visualmente revisioacuten
de turbidez microscoacutepicamente y olfativamente para deteccioacuten de olores del
ldquocaraacutecter Brettrdquo
Los diacuteas fueron contabilizados para determinar resultados positivos en estos
ensayos
73 INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN
VINO TINTO DE LA REGION DE DALMACIA CROACIA
731 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Medio selectivo solido para BretanomycesDekkera
Medio selectivo Liquido para BrettanomycesDekkera
Quiacutemicos de laboratorio (Dioxido de Azufre (SO2) Antibrettreg Glucosa)
Vino Babic 2007
Anallizador infrarojo Bacchius II microdom
732 Metodologiacutea
Con los medios desarrollados (solido y liquido) se quiere conocer el efecto del
dioacutexido de azufre (SO2) y el producto Antibrettreg en la levadura
BrettanomycesDekkera presente en el vino tinto de la regioacuten de Dalmacia
Con las herramientas que se tienen en el laboratorio del departamento de
tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia se quiere
determinar la influencia de estos productos en la levadura BrettanomycesDekkera
presente en vino tinto croata de la regioacuten de Dalmacia Babic
45
El primer paso es adaptar la levadura al vino tinto croata (Babic) para esto se
inoculan 20 colonias de BrettanomycesDekkera en 500 ml de vino se antildeadioacute
glucosa en una concentracioacuten de 2gL y se oxigena la mezcla Para este paso de
adaptacioacuten se dejan las muestras de 1 a 2 diacuteas a temperatura ambiente (20C)
Despueacutes de este periodo se revisa microscoacutepicamente la presencia positiva de
BrettanomycesDekkera en los 500 ml de vino en los que se estaba haciendo el
paso de adaptacioacuten en Babic al comprobar su presencia positiva se procede a
mezclar los 500 ml de vino contaminado con BrettanomycesDekkera con los 3
Litros de vino Babic que se disponen para esta prueba
Estos 3 litros de vino tinto Babic contaminado con la levadura
BrettanomycesDekkera se reparten en 8 frascos de vidrios esteacuteriles al siguiente
diacutea se toman dos frascos para agregar cada uno de los compuestos a evaluar
(SO2 y Antibrettreg)
Para SO2 se toman dos frascos uno de 600ml y uno de 100ml se agrega una
concentracioacuten de 40 mgl
Para el producto AntiBrettreg se toman cuatro frascos dos de 600 ml y dos de 100
ml seguacuten especificaciones del producto y la alta poblacioacuten de
BrettanomycesDekkera en las muestras se adiciono la maacutexima concentracioacuten de
AntiBrettreg a las muestras la cual fue de 40 gHl
Estas muestras se dejaron a temperatura ambiente simulando condiciones de
almacenamiento del vino en barricas temperatura aproximada de 20C evitando el
contacto con la luz solar y evitando movimientos fuertes Esto se mantuvo por 15
diacuteas que fue el tiempo de duracioacuten del experimento
Con el vino restante se mantuvo en las mismas condiciones de almacenamiento
de los demaacutes para hacer un paralelo de comparacioacuten
Previamente se analizaron las caracteriacutesticas del vino sin contaminar por medio
del analizador infrarrojo Bacchus II microdom antes de agregar los compuestos
46
SO2 y AntiBrettreg y despueacutes se volvioacute a realizar el anaacutelisis para determinar los
efectos de estos compuestos en el vino y asiacute mismo al de control
74 DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN
EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO
MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE
741 Materiales
Cromatografo de Gas HP5890 Serie II
Microextractor de fase solida (SPME)
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Quiacutemicos de laboratorio (p-cresolAcetaldehido Propanol diacetil etil-
acetato i-butanol acido aceacutetico i-amil-alcohol n-amil lactato de etilo
acetato amil metiacutelico 1-hexanol etil-hexanol linalol nerol citronelol
geraniol 2-feniletanol octanoato de etilo 4-etilfenol 2-feniletil acetato 4-
etilguaiacol)
Vino Tinto Babic
Agua destilada
742 Metodologiacutea
El meacutetodo fue desarrollado anteriormente en el Departamento de Tecnologiacutea y
Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos de
la Universidad de Zagreb Croacia Y despueacutes de modificaciones fue utilizado en el
desarrollo del trabajo El meacutetodo utilizado es descrito a continuacioacuten
47
Cromatografo de gas HP 5890 SERIES II
Programa HP-chem
a) Condiciones para analisis SPME-GC
Muestra diluida 5050 con adicion de estandar interno (p-cresol1mgl)
25ml de la muestra diluida con mezcla continua a temperatura ambiente
Tiempo de adsorcion 30 minutos
SPME es colocado en la muestra para la adsorcion durante el tiempo
previsto
b) Condiciones para el Cromatografo de gas (GC)
La columna usada en este experimento es RTXreg-5 (Restec USA sn 210627)
30m id=025mm 025μm
Gas portador Nitrogeno
Flujo del Nitrogeno 5 mlmin
Temperatura del inyector 240 C
Temperatura del detector 250 C
Temperaturas programadas 35 C5 min 150 C 34 Cmin 180 C
10Cmin 190 C 5 Cmin
Se conocen los resultados del cromatografiacutea de gases (ver tabla 10) y se hacen
necesarias varias correcciones del meacutetodo y algunas pruebas con unos
compuestos para determinar realmente su tiempo de retencioacuten en este tipo de
vino Se deben comprobar tiempos de retencioacuten
48
8 DISCUSIOacuteN Y RESULTADOS
81 RESULTADOS PARA EL DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO
Tabla 2 Medio Selectivo con Glucosa como fuente de carbono para
BrettanomycesDekkera en incubacioacuten por 5 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten
microscoacutepica
1 Negativo Negativo - No se realiza
2 Negativo Negativo - Presencia de levaduras
3 Negativo Negativo - Presencia de
Levaduras
4 Aparicioacuten de
algunas colonias
Negativo Transparente Presencia de levaduras
5 Colonias definidas Positivo-
Fenoles
Amarillo Presencia positiva de
BrettanomycesDekkera
49
Este medio tiene alto grado de selectividad para levaduras con un tiempo de
crecimiento de aproximadamente 5 diacuteas en 28C lo que lo hace raacutepido gracias al
antibioacutetico (ampicilina) que hace parte de la composicioacuten del medio no hay
presencia de bacterias Se hace confiable para resultados positivos de levaduras
BrettanomycesDekkera debido a que las levaduras Saccharomyces fueron
inhibidas con el compuesto cicloheximida su selectividad fue comprobada por
revisioacuten microscoacutepica macroscoacutepica y sensorial
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con glucosa como fuente de carboacuten son las
siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
50
Tabla 3 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono para Brettanomyces Dekkera en
incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica
1 Ninguno Negativo - -
2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras y
bacterias
9 Diminutas
colonias
transparentes
Negativo Transparentes Presencia de levaduras y
algunas bacterias
10 Positivo Positivo-
Fenoacutelicos
Amarillo Presencia de levaduras
BrettanomycesDekkera y
bacterias
El medio selectivo para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de
carbono tambieacuten es selectiva entre levaduras ya que solo se identifico la levadura
BrettanomycesDekkera en este sin embargo se evidencia una presencia de otro
microorganismo presuntamente bacteria ya que este medio no contiene agente
antibacteriano (ampicilina) Es necesaria la adicioacuten de ampicilina en una
concentracioacuten de 10mgl para inhibir la presencia de bacterias
Este medio presenta un tiempo maacutes prolongado para mostrar crecimiento de la
levadura BrettanomycesDekkera aproximadamente 10 diacuteas
51
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las
presentadas en el medio selectivo con glucosa como fuente de carbono y son las
siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
52
Tabla 4 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono y adicioacuten de ampicilina para
Brettanomyces Dekkera en incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica
1 Ninguno Negativo - -
2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
9 Diminutas
colonias
transparentes
Negativo Transparentes Presencia de levaduras
10 Positivo Positivo-
Fenoacutelicos
Amarillo Presencia de levaduras
BrettanomycesDekkera
El efecto de la ampicilina sobre el medio selectivo con etanol como fuente de
carbono fue el esperado inhibioacute completamente el crecimiento de colonias
bacterianas en el medio el tiempo de crecimiento de la levadura y presencia de
aromas fenoacutelicos fue el mismo de 10 diacuteas en incubacioacuten de 28C
53
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las
presentadas anteriormente y son las siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
82 RESULTADOS PRUEBAS MEDIO LIQUIDO
Tabla 5 Influencia de la concentracioacuten de levaduras BrettanomycesDekkera en el
tiempo necesario para detectar la produccioacuten de 4-etil-fenol en medio liquido
Nuacutemero de ceacutelulas ml
(concentracioacuten final)
Tiempo necesario para obtener resultados
positivos (diacuteas)
1 Experimento
32x106 le 3
3 X 104 3
33x102 7
40 No detectado
2 Experimento
43x106 le3
39x104 le3
37x102 8
62 No detectado
54
El nuacutemero de ceacutelulas de levadura de BrettanomycesDekkera fue contabilizado
usando contador de ceacutelulas Chamber
Los aromas fenoacutelicos son difiacuteciles de detectar debido al fuerte olor que tiene el
medio liquido caracteriacutestico de sus componentes esto dificulta la identificacioacuten del
ldquocaraacutecter Brettrdquo en especial cuando las concentraciones de
BrettanomycesDekkera no son elevadas Ademaacutes de los olores fenoacutelicos otros
compuestos volaacutetiles se detectan tales como acido aceacutetico y olores oxidativos
tambieacuten producido por la levadura BrettanomycesDekkera
En la inspeccioacuten visual se detecta alta turbidez en el medio Se compara con un
medio sin presencia de BrettanomycesDekkera
En las muestras con mayor concentracioacuten de la levadura es maacutes notoria la
turbidez Despueacutes de 3 diacuteas se presenta un precipitado blanco en todas las
muestras de altas concentraciones
La revisioacuten microbioloacutegica se realiza diariamente para determinar el nuacutemero de
ceacutelulas y la presencia positiva de la levadura a evaluar
Entre los dos experimentos realizados con el medio liquido el tiempo que se
demoro en detectar compuestos fenoacutelicos fue muy similar entre ellos
dependiendo del nuacutemero de ceacutelulas en el medio en mayores concentraciones el
tiempo de deteccioacuten fue menor
Hay que sentildealar que BrettanomycesDekkera debe alcanzar una concentracioacuten
miacutenima (denominada poblacioacuten criacutetica) de 103 UFCml para comenzar a liberar etil
fenoles Por debajo de esta concentracioacuten la levadura seriacutea metaboacutelicamente
activa pero no produciraacute compuestos alterantes a niveles detectables esto se ve
reflejado en los resultados en los que las concentraciones de ceacutelulas son muy
bajas
55
Estos resultados se comparan con los resultados dados en el medio solido Los
dos medios muestran altos grados de selectividad hacia la levadura
BrettanomycesDekkera y similar comportamiento para el crecimiento de dicha
levadura
En el medio liacutequido cuando hay altas concentraciones de BrettanomycesDekkera
el tiempo de deteccioacuten del microorganismo es menor que con el medio solido pues
en el liacutequido es aproximadamente 3 diacuteas y en el soacutelido son 5 diacuteas
83 RESULTADOS DE LA INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE
(SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO DE LA REGION DE
DALMACIA CROACIA
El vino fue analizado antes de la adicioacuten de los compuestos quiacutemicos a evaluar y
15 diacuteas despueacutes de adicioacuten para ver la reaccioacuten de este frente a SO2 y Antibrettreg
estas caracteriacutesticas se determinaron con el equipo de laboratorio Bacchus II
Microdom localizado en el laboratorio Vinolab doo Zagreb Croacia Los
resultados se muestran en la tabla
Tabla 6 Resultados de las muestras de vino inoculados con la levadura BrettanomycesDekkera
durante 15 diacuteas Comparativos con los diferentes compuestos
CFUml
Vino Day 1 Day 4 Day 10 Day 15
Control 130E+04 800E+03 700E+03 500E+03
Control 800E+03 640E+03 700E+03 280E+03
SO2 110E+04 400E+02 400E+02 67
SO2 900E+03 380E+03 270E+03 183
Antibrett 140E+05 920E+04 140E+04 400E+03
Antibrett 210E+05 181E+05 160E+04 900E+03
Antibrett 120E+05 990E+04 120E+04 100E+03
Antibrett 230E+05 204E+05 300E+03 200E+03
56
Tabla 7 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 antes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o
Antibrettreg Diacutea 0
Alcohol
()
Acidez Total
(gr Aci
Tartaacuterico L)
Acidez volaacutetil
(Aci
AceacuteticoL)
Densidad
(grml)
Azuacutecar residual
(grl)
Extracto
seco
(grl)
Acido
Laacutectico
(grl)
Glicerol
(grl)
Taninos
(grl)
Acetato
(grl)
1473
525
083
09928
473
332
164
799
305
117
1471
522
084
09927
479
329
162
786
299
116
Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
Tabla 8 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 despueacutes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o
Antibrettreg Diacutea 15
Alcohol
()
Acidez Total
(gr Aci
Tartaacuterico L)
Acidez volaacutetil
(Aci
AceacuteticoL)
Densidad
(grml)
Azuacutecar residual
(grl)
Extrac
to seco
(grl)
Acido
Laacutectico
(grl)
Glicerol
(grl)
Taninos
(grl)
Acetatos
(grl)
Control
1414
565
107
09935
436
364
177
827
259
136
Control
1415
556
108
09936
420
365
170
824
256
137
SO2
1456 543 108 09932 476 369 167 803 281 125
SO2
1457
542 108 09933 472 370 170 804 271 124
Antibrett 1454 533 106 09933 448 371 175 813 277 125
Antibrett 1455 534 105 09933 460 372 171 809 282 124
Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
57
Figura 4 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en el vino de control para
evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas
El comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en la prueba por
duplicado en el vino de control fue muy similar pues con el tiempo esta levadura
deja de reproducirse y va muriendo cuando las condiciones ya no son aptas para
su desarrollo debido a que la mayoriacutea de su fuente de carbono (Glucosa) esta
consumida sin embargo esta levadura no llega a su desaparicioacuten total lo que
representa uno de los mayores problemas en la elaboracioacuten del vino
Esta levadura tiene un metabolismo lento y el factor tiempo es un requisito
fundamental para su desarrollo este experimento se empezoacute con una alta
poblacioacuten de BrettanomycesDekkera (130 x 104 UFCml y 8 x 103 UFCml
respectivamente) y durante el transcurso del tiempo la poblacioacuten fue disminuyendo
debido a la perdida de las condiciones necesarias para la reproduccioacuten
58
Figura 5 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de SO2 en
concentracioacuten de 40 mgl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas
El SO2 tuvo un comportamiento efectivo y raacutepido contra las colonias de
BrettanomycesDekkera La poblacioacuten de esta levadura se redujo de forma
significativa entre el diacutea primero y el cuarto se encontroacute una diferencia porcentual
de 96 en la primera prueba y del 60 en la de duplicado al diacutea 15 ya la
poblacioacuten era casi nula pasando raacutepidamente de un numero por encima de la
poblacioacuten critica de la levadura BrettanomycesDekkera a un numero lt103 UFCml
siendo muy eficaz y raacutepido en el manejo de produccioacuten
Este compuesto ademaacutes de favorecer la extraccioacuten de los compuestos fenoacutelicos y
de su actividad antioxidante al inhibir la accioacuten de las polifenoloxidasas a dosis
adecuadas de un maacuteximo de 50gl inhibe la multiplicacioacuten bacteriana y de
levaduras
59
Figura 6 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de
Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo
de 15 diacuteas
Figura 7 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de
Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo
de 15 diacuteas
El compuesto Antibrettreg en la primera prueba tanto como en el duplicado tuvo su
mayor tiempo de reduccioacuten de UFCml entre los diacuteas 4-10 con una diferencia
porcentual de 91 en comparacioacuten con el diacutea cuarto al decimo a diferencia de
60
SO2 el cual presenta la gran disminucioacuten de colonias entre los primeros diacuteas de
agregarse el producto
El tiempo para que la poblacioacuten de la levadura llegara a la cantidad menor a la de
la poblacioacuten critica es mucho mayor que la del compuesto SO2 sabiendo que esta
poblacioacuten debe ser lt103 UFCml
El compuesto Antibrettreg puede tardarse 4-10 diacuteas en representar una reduccioacuten
de UFCml significativa en dicho tiempo puede representar grandes peacuterdidas
nutricionales y altos costos de produccioacuten para la fabricacioacuten
Figura 8 Comportamiento del contenido de alcohol en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin adicioacuten)
hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
BrettanomycesDekkera estaacute presente en vinos de alto contenido alcohoacutelico
aproximadamente entre 125 a 14 pues esta levadura toma a etanol como
fuente de carbono y este vino (Babic) procede de uvas muy maduras las cuales
presentan mayor cantidad de azuacutecares residuales (como glucosa y fructosa y
otras pentosas residuales)
138
14
142
144
146
148
Alcohol
Day 0 Day 15
61
Analizando el comportamiento del vino durante el experimento de 15 diacuteas sin
compuestos quiacutemicos y con SO2 y Antibrettreg a partir de las caracteriacutesticas
iniacuteciales que se determinaron seguacuten el equipo BACCHUS analizador infrarrojo se
presenta en general una reduccioacuten del contenido alcohoacutelico de este vino pero se
ve una mayor reduccioacuten en el vino de control el cual redujo en un 394 su
contenido alcohoacutelico desde el dia 0 hasta el diacutea 15 este vino no tiene ninguacuten
compuesto contra la levadura BrettanomycesDekkera y por su elevada presencia
en los 15 diacuteas de experimento consumioacute esta cantidad de etanol
Mientras en el vino que conteniacutea SO2 tras 15 diacuteas de tratamiento se vio una
reduccioacuten de alcohol de 1 ya que este compuesto redujo la cantidad de
BrettanomycesDekkera en los primeros diacuteas de tratamiento previniendo su
reproduccioacuten y protegiendo el contenido alcohoacutelico del vino Babic 2007
En los vinos de prueba con Antibrett reg la reduccioacuten alcohoacutelica se dio en un
porcentaje de 122 un poco maacutes alta que con SO2 y mucho maacutes baja en
comparacioacuten del vino de control este compuesto tambieacuten previno la gemacioacuten de
la levadura evitando la perdida de etanol en el vino sin embargo como este
compuesto duro mas en este proceso de eliminar BrettanomycesDekkera se
produjo una mayor peacuterdida alcohoacutelica
62
Figura 9 Comportamiento del contenido de acidez volatil en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin
adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
Debido a la presencia de oxigeno en los frascos la acidez volaacutetil aumento pero no
significativamente en las muestras No hubo grandes diferencias entre las
muestras con compuestos y las de control por lo que se deduce que estos
compuestos no ayudan a evitar esta acidez Esta acidez tan alta puede dantildear la
calidad del vino de forma casi irreparable Pero el factor oxigeno es de los maacutes
controlados en la produccioacuten de vinos
la alteracioacuten del aumento de la acidez volaacutetil no estaacute relacionada con la levadura
BrettanomycesDekkera sino a la presencia de oxigeno en el almacenamiento el
oxigeno fue usado en esta prueba para promover condiciones apropiadas para el
desarrollo de la levadura
002040608
112
Acidez Volatil
Day 0 Day 15
63
Figura 10 Comportamiento del contenido de Acido Acetico en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin
adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
Brettanomyces Dekkera son productores de aacutecido aceacutetico y elevan el contenido
de los vinos anormalmente en condiciones de anaerobiosis En condiciones de
aerobiosis producen concentraciones bajas o nulas de aacutecido aceacutetico
Este acido aceacutetico al igual que los fenoles afecta el sabor y el perfil olfativo del
vino tinto este efecto es tambieacuten producido por la levadura
BrettanomycesDekkera vemos en los resultados el gran crecimiento de este
compuesto en el vino control el cual no tenia compouestos en contra de
BrettanomycesDekkera lo que produjo este aumento significativo del acido aceacutetico
en comparacioacuten con estos que teniacutean SO2 y Antibrettreg entre ellos la diferencia en
este compuesto es muy reducida y no significativa pues estos compuestos no
permitieron la gemacioacuten de esta levadura y esta no produjo este acido en esa gran
cantidad
A este compuesto se le atribuye el olor y sabor a vinagre del vino tinto un defecto
muy comuacuten y poco agradable para el consumidor
105110115120125130135140
Acido Acetico
Day 0 Day 15
64
Figura 11 Comportamiento del contenido de Azucares reductores en vino Babic 2007
desde el diacutea 0 (sin adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en
comparacioacuten con el vino de control
BrettanomyesDekkera utiliza los azucares residuales como fuente de carbono
para su crecimiento en el vino este es el factor maacutes importante para su desarrollo
y este es el que determina en cierto caso la cantidad de levaduras de
BretanomycesDekkera presente en las graficas se determina claramente que en
el vino de control donde la cantidad de esta levadura es muy alta 15 diacuteas despueacutes
de empezar las pruebas la cantidad de azucares reductores es muy baja y ha
bajado en un porcentaje de 10 mientras que el vino que tiene SO2 bajo la
cantidad de azucares reductores en un 042 y el vino que tiene el compuesto
Antibrettreg redujo su nivel de azucares reductores en 462
38
4
42
44
46
48
5
Azucares Reductores
Day 0 Day 15
65
84 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE
CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON
EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID
PHASE
Tabla 10 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en
vino Babic 2007 con el meacutetodo propuesto
Compuesto Tiempos de
retencioacuten (min)
Acetaldehiacutedo 1437
Propanol 3759
Diacetil 4202
Etil-acetato 4523
i-butanol 6232
Acido Aceacutetico 7840
i-amil alcohol 11740
n-amil 13489
lactato de etiacutelico 15741
acetato amil metiacutelico 17796
1-hexanol 19101
etil-hexanol 24456
Linalol 30370
2-feniletanol 32768
p-cresol 33522
octanoato de etilo 34226
4-etilfenol 37100
2-feniletil acetato 32769
4-etilguayacol 39704
4 vinilfenol 40529
decanoato de etilo 42117
Refirieacutendose a estos resultados es necesaria la creacioacuten de soluciones estaacutendar
para determinar tiempos de retencioacuten con el meacutetodo y si es necesario ajustes a
este
66
Tabla 11 Soluciones estaacutendar para compuestos en vinos tintos Croatas
MODEL 0
(en volumen de 100 ml en 40 Etanol)
Compuesto Pureza Cantidad
(g)
Concentracioacuten (gl)
Acetaldehiacutedo 099 1623 160677
Propanol 0995 13849 137718
Diacetil 098 01071 104958
Etil-acetato 0995 30172 3002114
i-butanol 099 15016 1486584
Acido Acetico 0995 0 0
i-amil alcohol 099 20116 1991484
n-amil 098 15442 1513316
lactato de etilio 098 00507 049686
acetato amil metilico 098 01028 100744
1-hexanol 098 00367 035966
etil-hexanol 098 00308 029876
Linalol 097 00288 027936
Nerol 097 00311 030478
Citronelol 098 0031 03038
Geraniol 098 15803 1548694
2-feniletanol 098 00402 039396
4-etilfenol 098 00812 078764
octanoato de etilo 097 00597 059103
2-feniletil acetato 099 00315 031185
4-etilguayacol 098 00803 079674
Fuente Laboratorio de anaacutelisis e investigacioacuten de bebidas Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea
de Alimentos Universidad de Zagreb Zagreb Croacia 2009
Las soluciones estaacutendar se realizan teniendo como referencia las cantidades de
estos compuestos en los vinos tintos croatas datos suministrados por el Doctor
Leo Gracin en concentraciones de gl a partir de este dato y teniendo en cuenta
67
la pureza de los compuestos que se teniacutean en el laboratorio de anaacutelisis e
investigacioacuten de bebidas se crean las soluciones estaacutendar Ejemplo
Solucioacuten estaacutendar para 4 etil-fenol en un volumen de 100 ml
Con estas soluciones estaacutendar se realizo el tiempo de retencioacuten para corroborar el
meacutetodo Los resultados de esto fueron tiempos de retencioacuten diferentes a los del
meacutetodo primero con el que se realizaron los ensayos y a partir de esos resultados
se ajusto el meacutetodo con el que se trabajo
68
Tabla 12 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en
vino Babic 2007 con el meacutetodo modificado
Compuesto Tiempos de
retencioacuten (min)
Acetaldehiacutedo 1542
Propanol 4046
Diacetil 4733
Etil-acetato 4807
i-butanol 6659
Acido Acetico 8343
i-amil alcohol 12123
n-amil 13866
lactato de etilio 16072
acetato amil metilico 18336
1-hexanol 19447
etil-hexanol 24835
Linalol 31831
2-feniletanol 33305
p-cresol 33703
octanoato de etilo 34571
4-etilfenol 37724
Citronelol 38326
Nerol 38576
2-feniletil acetato 39012
Geraniol 39944
4-etilguayacol 40271
4 vilifenol 41168
decanoato de etilo 42657
69
DIA 0
Se coloca ISTD a todas las muestras respectivas para poder determinar
cantidades de los compuestos aromaacuteticos
Se realiza la cromatografiacutea de gas al vino Babic 2007 antes de ser inoculado con
BrettanomycesDekkera
Tabla 13 Resultados de la cromatografiacutea de gas del vino Babic 2007
Compuesto Tiempo de retencioacuten
min
Cantidad
mgl
Acetaldehiacutedo 1542 0
Propanol 4046 0
Diacetil 4733 37215204
Etil-acetato 4807 0
i-butanol 6659 0
Acido Aceacutetico 8343 2817465
i-amil alcohol 12123 16799019
n-amil 13866 26
lactato de etiacutelico 16072 10983961
acetato amil metiacutelico 18336 0185196
1-hexanol 19447 264655
etil-hexanol 24835 0158751
Linalol 31831 0
2-feniletanol 33305 4235560
p-cresol 33703 1
octanoato de etilo 34571 0152412
4-etilfenol 37724 00581345
Citronelol 38326 00439729
Nerol 38576 00344799
2-feniletil acetato 39012 00407983
Geraniol 39944 0
4-etilguayacol 40271 0
4 vilifenol 41168 0
Decanoato de etilo 42657 00190144
70
Basados en los compuestos aromaacuteticos que brinda el ldquoCaraacutecter Brettrdquo se van a
analizar detalladamente los siguientes aromas 4-Etilfenol 4-Etilguayacol 4-
Vinylfenol
Figura 12 Compuestos aromaticos en vino tinto Babic sin estar contaminado con la levadura
BrettanomycesDekkera
El vino a analizar esta por debajo de las concentraciones consideradas como
perjudiciales para el aroma del vino tinto (El umbral sensorial del 4-etilfenol es de
230 μgl y el del 4-etilguaiacol es de 47 μgl) pues posee una concentracion de
58microgL de 4etilfenol 0 microgL de 4 etilguayacol y 0 microgL de vinylfenol
841 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGUacuteN TEMPERATURAS
DE ALMACENAMIENTO
0
02
4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinylfenol
Vino 00581345 0 0
C (
mg
L)
Vino Babic 2007 Dia 0
71
Tabla 14 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el
ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 20C por 4 diacuteas Prueba por duplicado
MUESTRAS INCUBADA A 20C
Compuesto Day 1
Amount
(mgL)
Day 2
Amount
(mgL)
Day 3
Amount
(mgL)
Day 4
Amount
(mgL)
4-etilfenol 0260244 017294 0177547 020156
4-etilfenol 0260244 0245915 0204542 0262499
4-etilguayacol 0 0 0 0
4-etilguayacol 0 0 0 0
4 vinilifenol 1107096 781349 685317 460323
4 vinilifenol 1107096 1297465 621324 693225
72
Figura 13 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
BrettanomycesDekkera es la levadura responsable de la produccion de 4-etil-
fenol compuesto asociado con olores caracteristicos a ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 00581345 0260244 0172935 0177547 020156
C (
mg
L)
4 etilfenol
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 00581345 0260244 0245915 0204542 0262499
C (
mg
L)
4 etilfenol
73
caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo dantildeando la calidad sensorial del vino tinto Babic la
produccioacuten de este compuesto en esta muestra realizada por duplicado fue
ascendente y tuvo incremento muy grande en el primer dia de almacenamiento y
en el transcurso de los siguientes cuatro diacuteas se mantuvo relativamente estable lo
cual no concuerda con el comportamiento tiacutepico de esta levadura quien tiene un
crecimiento lento e incrementa la produccioacuten de fenoles con su gemacioacuten esto
genera muchas dudas sobre el buen funcionamiento del equipo GC o de la
estabilidad de las levaduras BrettanomycesDekkera en este almacenamiento
Figura 14 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar prueba por duplicado
002040608
1
Vino Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0 0 0
4 etilguayacol
002040608
1
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0 0 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
74
Presencia negativa de 4 etil guayacol durante todo el almacenamiento
probablemente las condiciones de almacenamiento y el medio no dieron lugar al
desarrollo de este compuesto el cual se considera menos conflictivo que el 4-etil-
fenol
Figura 15 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
Estos resultados tambieacuten dejan dudas del normal comportamiento de dicha
levadura pues indican que la levadura no convirtioacute este compuesto en etilfenol
0
2
4
6
8
10
12
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 110709781349685317460323
4 vinylfenol
0
2
4
6
8
10
12
14
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
Series1 0 11071 12974 62132 69322
C (
mg
l)
4 Vinylfenol
75
durante el almacenamiento caracteriacutestica que solo la levadura
BrettanomycesDekkera puede realizar se ve que las concentraciones de
vinylfenoles son mucho mas altas que las de fenoles lo que nos deja determinar
que la poblacioacuten de BrettanomycesDekkera es muy baja y existen otras levaduras
productoras de vinylfenoles en este tipo de vino en las condiciones de
almacenamiento dadas para estas pruebas
Tabla 16 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el
ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 28C por 4 diacuteas
MUESTRA 2 INCUBADA A 28C
Compuesto Day 1
Amount
(mgL)
Day 2
Amount
(mgL)
Day 3
Amount
(mgL)
Day 4
Amount
(mgL)
4-etilfenol 0260244 019612 0186614 019932
4-etilfenol 0260244 020576 0214917 0193554
4-etilguayacol 0 014304 0223836 0
4-etilguayacol 0 002287 00529832 0
4 vinilifenol 1107096 787068 665182 397847
4 vinilifenol 1107096 284389 00204392 0
76
Figura 16 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar
El desarrollo de este compuesto en el diacutea 1 fue significativo y luego relativamente
estable el comportamiento fue similar en las pruebas de diferentes temperaturas
de almacenamiento para este compuesto el cual es el maacutes problemaacutetico en la
industria viniacutecola
0
005
01
015
02
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 005813019932018661019611019932
4 etilfenol
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 005813 019355 021491 020576 026024
4 etilfenol
77
Figura 17 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar
Los resultados de la prueba son poco confiables y no entendibles por lo que
podemos verificar que el GC no estaacute trabajando de forma adecuada para la
deteccioacuten del compuesto
0001002003004005006
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 Etilguayacol 0 0 0022 0053 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
0005
01015
02025
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0223 0143 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
78
Figura 18 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
El comportamiento de este compuesto en la prueba es muy irregular y poco
confiable
0
2
4
6
8
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 397847665182787068397847
4 vinylfenol
0
2
4
6
8
10
12
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 11071 28438 00204 0
4 vinylfenol
79
Figura 19 Comportamiento del compuesto 4 etilfenol durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
La concentracioacuten de 4 etil fenol fue mayor al cuarto diacutea almacenado a
temperatura ambiente de 20C pero este compuesto no tuvo una actividad notoria
de ascenso durante su almacenamiento como se esperaba lo que deja muchas
dudas sobre los resultados de este ensayo
0
05
1
15
2
25
3
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etil fenol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 20C
80
Figura 20 Comportamiento del compuesto 4 etil guayacol durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
Comportamiento anormal del compuesto no se ve tendencias de aumento o
disminucioacuten de este en ninguna de las pruebas no tiene un comportamiento
regular pues se esperaba que la levadura BrettanomycesDekkera
descarboxinizara el compuesto 4-vinilguaiacol y aumentar las concentraciones de
4-etilguaiacol esta reaccioacuten no se hizo notoria en los compuestos aromaacuteticos
seguacuten lo determino el Cromatografo de Gas (GC)
0
005
01
015
02
025
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3
C (
mg
L)
4 etil guayacol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 20C
81
Figura 21 Comportamiento del compuesto 4 Vinyl fenoll durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
La no presencia de este compuesto en el vino original demuestra las baja o casi
nula presencia de la levadura BrettanomycesDekkera al diacutea primero este
compuesto incrementa de forma notoria en las muestras debido a la presencia de
acido cumaacuterico en el medio ya que sufre su carboxilacion convirtieacutendose en 4 vinyl
fenol sin embargo su comportamiento no fue regular y presento problemas de
lecturas
0
2
4
6
8
10
12
14
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
C (
mg
L)4 Vinyl fenol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 28C
82
9 CONCLUSIONES Y
RECOMENDACIONES
91 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO
Se desarrolloacute un medio selectivo soacutelido para BrettanomycesDekkera
accesible y faacutecil de elaborar
Se detectan colonias de la levadura BrettanomycesDekera en el agar
selectivo con glucosa como fuente de carbono en un lapso de 5 diacuteas en
incubacioacuten a 28C
El medio selectivo soacutelido con Glucosa como fuente de carbono fue maacutes
raacutepido y efectivo ya que toma 5 diacuteas para dar resultados positivos frente al
de Etanol como fuente de carbono el cual toma 10 diacuteas para mostrar
resultados positivos aunque ambos dieron resultados satisfactorios en la
selectividad de la levadura BrettanomycesDekkera
La levadura se adapto de forma satisfactoria a estos medios en
condiciones de almacenamiento propias para su desarrollo (28C)
Las colonias de la levadura BrettanomycesDekkera tiene un crecimiento
en estos medios soacutelidos de forma circular con topografiacutea convexa y borde
entero dimensiones 5-6 mm color Amarillo opacicidad oscuro
83
superficie lisa y suave siendo faacutecil de identificar y realizar los conteos
necesarios
El medio solido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten
de la levadura BrettanomycesDekkera en vino tinto es raacutepido econoacutemico
y uacutetil
El uso de azucares para fermentacioacuten de la levadura
BrettanomycesDekkera que Saccharomyces no puede fermentar para
mayor selectividad
Realizacioacuten de pruebas Bioquiacutemicas como meacutetodo raacutepido de selectividad
92 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DESARROLLO DEL MEDIO LIacuteQUIDO
Se desarrollo un medio selectivo liquido para BrettanomycesDekkera
accesible y faacutecil de elaborar
Este medio mostroacute resultados positivos de la presencia de
BrettanomycesDekkera en un lapso de tiempo menor (3 diacuteas) que con el
medio solido (5 diacuteas) en caso de que el nuacutemero de ceacutelulas de la levadura
BrettanomycesDekkera sea mayor a la poblacioacuten critica (103)
Cuando la poblacioacuten de ceacutelulas de la levadura BrettanomycesDekkera es
menor a la poblacioacuten critica el tiempo de identificacioacuten de esta levadura por
medio liquido es muy prolongado puede tomar maacutes de 10 diacuteas o incluso no
detectarlo
84
Los compuestos quiacutemicos usados para el desarrollo del medio liacutequido no
son los adecuados para este tipo de medios donde los resultados positivos
son olfativos pues estos compuestos emiten fuertes olores que confunden
los olores caracteriacutesticos del caraacutecter Brett
El medio liquido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten
de altas concentraciones de la levadura BrettanomycesDekkera en vino
tinto es raacutepido econoacutemico y uacutetil
93 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg
EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE DALMACIA
CROACIA
Este trabajo mostroacute que el dioacutexido de azufre (SO2) tiene buenos resultados
en contra de la levadura BrettanomycesDekkera en concentraciones
normales de 40mgl concentracioacuten en la que se trabaja este compuesto en
los vinos tintos
En Europa el dioacutexido de azufre es usado de forma tradicional en gran
nuacutemero de alimentos y especialmente en vinos sin embargo y a pesar de
su uso regulado se busca la sustitucioacuten de este o su maacutexima reduccioacuten
para hacer de este producto maacutes sano para las personas no tolerantes a
este tipo de compuestos sin embargo seguacuten el trabajo realizado en
comparacioacuten con el producto Antibrettreg el SO2 es maacutes eficaz en el control
85
de la levadura ayudando a evitarla y eliminarla de la cadena productiva del
vino tinto
Gracias a sus caracteriacutesticas el vino tinto Babic es muy vulnerable a la
levadura BrettanomycesDekkera pero a su vez se puede tratar faacutecilmente
con productos como SO2 y Antibrettreg aunque es maacutes efectivo contra
BrettanomycesDekkera el dioacutexido de azufre (SO2)
Antibrettreg es una buena opcioacuten para el control de BrettanomycesDekkera
para evitar el uso de productos alergenicos como SO2
94 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN
EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO
MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE
Al terminar la primera prueba con anaacutelisis en cromatografiacutea a gas y el SPME
queda como resultados
Es necesario repetir la prueba
No se determina el efecto de los estaacutendares internos sometidos a tiempos
de almacenamiento en temperaturas de 20C y 28C lo que puede dar falsos
resultados de cantidades de compuestos
86
Se debe crear un medio maacutes apto para el desarrollo de la levadura y un
control diario de crecimiento ( agregar maacutes Glucosa en caso de que se
haya consumido toda controlar presencia de Bacterias y otros
microorganismos que no se deseen en el medio)
Es necesario control de aromas con panel sensorial para determinar el
umbral de deteccioacuten en este vino
Control de crecimiento por medio solido Selectivo para
BrettanomycesDekekra conteo de colonias presentes en el vino inoculado
y su desarrollo durante almacenamiento a diferentes temperaturas
La segunda prueba no fue posible realizarla por dantildeos en el equipo de
cromatografiacutea de gas (GC)
87
ANEXOS
11
89
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientiacuteficas 99 Grupos de
Investigacioacuten Enoloacutegica Zaragoza Espantildea
93
11
GRACIAS es una palabra corta para todo lo que quiero expresar a todos aquellos que
hicieron parte de este suentildeo hecho realidadhellip
A Dios y a la virgen Auxiliadora por llevarme de su mano cada diacutea de mi carrera en cada
momento alegre y en cada momento difiacutecil fueron mi fortaleza
A mis papitos por hacer de mi estudio una realidad por su sacrificio y apoyo desinteresado y
sincero
A mi Hermanito por ser mi fortaleza mi ejemplo y mi amigo incondicional
A mi familia Blanco y Urrea por su compantildeiacutea durante esta etapa
A mi facultad (Decano Dr Camilo Rozo Dra Patricia Jimeacutenez y mis profesores) por
ensenarme mi profesioacuten y aportar lo mejor de ustedes para mi formacioacuten personal
A mis asesores de Tesis (Ing Patricia Chaparro y Dr Sc Leo Gracin) por su guiacutea y
colaboracioacuten oportuna
A mis queridos amigos quienes siempre han estado a mi lado en las dificultades y en las
alegriacuteas (Ingrid Mafe Cami G Cami R Harold Pipe Karla Andreacutes T Diego G)
A IAESTE en alianza con el ORI por hacer posible mi intercambio y poder hacer mi tesis en el
maravilloso paiacutes de Croacia
A Croacia por ser mi segundo hogar por abrirme sus puertas y su corazoacuten por brindarme
tan maravillosas personas en mi camino
Croatia Thank you for being my second home for opening your doors and your heart to me
and give me the opportunity to meet so many wonderful people
To my boss my teacher my mentor and specially my friend Leo
To the faculty of food technology and Biotechnology and the department of technology
and analysis of beverages for give me the opportunity to give all my knowledge to the
project and learn a lot more
To all the amazing people I met during this experience (Igor Karin Natka Josip Ana Matija
Daniel Pz Szilvia Dini Daniela Lidija Sanja and everybody else who I had the pleasure to
meet in this great trip) for give me the best of your hearts
I only have one thing to say hellipTHANK YOU
Solo me queda una palabra por decirhellipGRACIAS
5
84 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN EL
VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID
PHASE --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 65
841 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGUacuteN TEMPERATURAS DE
ALMACENAMIENTO --------------------------------------------------------------------------------------------- 70
9 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES --------------------------------------------- 82
91 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA DESARROLLO DEL MEDIO
SOLIDO 82
92 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA DESARROLLO DEL MEDIO
LIacuteQUIDO ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 83
93 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA INFLUENCIA DE DIOXIDO
DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE
DALMACIA CROACIA ----------------------------------------------------------------------------------- 84
94 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA DETERMINACION DE
AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL
METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE ---------------------------------------------- 85
ANEXOS ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 87
6
RESUMEN Este estudio presenta el desarrollo y evaluacioacuten de simples meacutetodos para la deteccioacuten de
la levadura BrettanomycesDekkera en vino y su medio de produccioacuten con el uso de
medio solido y liquido selectivo ademaacutes se evaluacutea el efecto del Dioacutexido de Azufre SO2 y
AntiBrettreg en vino tinto de la regioacuten de Dalmacia Croacia El meacutetodo de deteccioacuten de
esta levadura emplea medios selectivos enriquecidos los cuales contienen Glucosa (20
grl) en comparacioacuten con Etanol (6ml l) como fuentes de carboacuten y energiacutea cicloheximida
(30 grl) para prevenir la presencia de Sachharomyces ampicilina (10 mgL) como
antibioacutetico para prevenir el crecimiento de bacterias y acido p-cumaacuterico (100 mgL) como
precursor de la produccioacuten de 4-etilfenol para el medio solido el uso de agar se realiza
en una concentracioacuten de 16 grL Despueacutes de la siembra realizada en los medios (solido y
liquido) de vino contaminado con la levadura BrettanomycesDekkera es monitoreado
diariamente micro y macroscoacutepicamente
Una muestra de vino tinto Babic de Croacia fue contaminado con colonias de la levadura
BrettanomycesDekkera y fue dividido en 8 muestras de las cuales 2 de estas fueron
monitoreadas como control sin adicioacuten de ninguacuten compuesto 2 con adicioacuten de dioacutexido de
azufre SO2 en una concentracioacuten de 40mgL y 4 de estos con AntiBrettreg en una
concentracioacuten de 40grHl El meacutetodo de este estudio se basa en la determinacioacuten del
comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en estas condiciones Este se
evaluoacute en teacuterminos de crecimiento de la citada levadura (UFCml) presentes en las
muestras y anaacutelisis fisicoquiacutemicos antes y despueacutes de 15 diacuteas de adicioacuten y monitoreo
7
ABSTRACT
This experiment presents the development and testing of a simple way to detect
BrettanomycesDekkera from wine and wine environments using selective media in solid
phase and liquid phase and the influence of Sulfur Dioxide (SO2) and Antibrett reg in red
wines from Dalmatian region The method of detection of this yeast employs selective
enrichment mediums These mediums contains glucose (20gl) and Ethanol (6) as
carbon and energy source cycloheximide (30 mgl) to prevent growth of Sachharomyces
ampicilin (10 mgl) to prevent growth of bacteria and p-coumaric acid (100 mgl) as a
precursor of the production of 4-etilphenol depending on the phase of the medium agar
compound is used in a concentration of 16 grl After putted on the medium wine
contaminated with BrettanomycesDekkera is monitored by micro and macro inspection
also with the liquid medium
A red wine from Dalmatian region was contaminated with BrettanomycesDekkera colonies
and divided in 8 different containers from these 8 containers we had two for control no
addition two with addition of Sulfur Dioxide (SO2) in a concentration of 40 mgl and four of
them with Antibrett reg in a concentration of 40gHl The method for this study is based in
following the behavior of the yeast BrettanomycesDekkera with these compounds in this
wine this behavior was monitored based in CFUml showing in the samples and physic
and chemical analysis before addition and 15 days after
8
INTRODUCCION
Las levaduras del geacutenero Brettanomyces o su forma telemoacuterfica (nombre que
reciben las especies que presentan reproduccioacuten sexual y en consecuencia
formacioacuten de esporas por meiosis) Dekkera fueron descritas por primera vez por
Claussen en 1903 en la produccioacuten de cerveza1
Este geacutenero se conoce desde hace tiempo como agente contaminante en la
industria cervecera de la sidra y de bebidas carbonatadas2 En la industria
enoloacutegica su descripcioacuten como alterante es maacutes reciente
Durante los antildeos 1950s muchos autores reportaron el aislamiento del genero
Brettanomyces en uvas francesas e italianas (Van der Walt y Van der Kerken
1958) Sin embargo en muchas regiones del mundo viniacutecola esta levadura no ha
sido identificada lo cual dificulta su deteccioacuten en materiales o productos
contaminadosEntre todos los microorganismos la levadura
BrettanomycesDekkera es una de las maacutes temidas por los vinicultores El
crecimiento y desarrollo de esta levadura causa alteraciones denominadas
ldquocaraacutecter Brettrdquo lo cual ocurre especialmente en vinos tintos3
1 Gilliland R Brettanomyces I Occurrence characteristics and effects on beer flavor J Inst Brew
1961
2 Deak T y Beuchat LR Handbook of spoilage yeast CRC Press Nova York 1996
3 Heresztyn T Archives of Microbiology 1986 Metabolism of phenolic compounds from
hydroxycinnamic acids by Brettanomyces yeast
9
El ldquocaraacutecter Brettrdquo produce un amplio espectro de sabores y aromas alterantes
entre los cuales estaacuten corral minerales tinta tabaco cuero faacutermacos y
ahumado estas alteraciones se le atribuyen a los compuestos 4-etilfenol y 4-
etiguayacol las cuales causan una supresioacuten de aromas atractivos en el vino
como de frutas y flores y perdida de sabores agradables para el consumidor como
acido salado amargo o picante 4
Esta levadura tiene distinto comportamiento seguacuten el tipo de vino al que esteacute
asociada pues cada tipo de vino tiene diferente composicioacuten de carbonos
nitroacutegenos vitaminas y minerales
Con este estudio se evaluacutea el comportamiento y caracterizacioacuten de la levadura
BrettanomycesDekkera en vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia con
el desarrollo de medios solido y liquido para la selectividad de la levadura
alteraciones aromaacuteticas del vino tinto Babic producidas por 4 etilfenol y 4
etilguayacol y el comportamiento de BrettanomycesDekkera en el vino al ser
tratado con Dioacutexido de azufre (SO2) comparativamente con tratamiento Antibrettreg
4 Boulton Singleton Bisson amp Kunkee 1996 Descripcioacuten de aromas fenoacutelicos
10
1 MARCO TEORICO
Las levaduras representan el grupo de microorganismos maacutes importante en la
industria viniacutecola porque sin Saccharomyces producir vinos de alta calidad seriacutea
imposible Ademas de Saccharomyces hay muchos otros geacuteneros y especies de
levaduras presentes durante la vinificacioacuten que afectan la calidad del vino positiva
o negativamente5
Las levaduras comprenden 39 geacuteneros y 350 especies Se identifican y clasifican
basaacutendose en caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas Entre los aspectos
morfoloacutegicos considerados se encuentran el tamantildeo y la forma de las ceacutelulas en
medios soacutelidos y liacutequidos especificados el modo de reproduccioacuten y si forma velo
en la superficie o sedimenta en un medio liacutequido Entre las caracteriacutesticas
fisioloacutegicas consideradas se encuentra si puede crecer (y fermentar) en un
determinado carbohidrato y si puede o no utilizar determinadas fuentes de
nitroacutegeno como los nitratos6
11 REPRODUCCION
Las levaduras son agrupadas en tres familias conocidas como
Saccharomycetaceae Sporobolomycetaceae y Cryptococcaceae Estas
5 H Erten June 2002 Relations between elevated temperatures and fermentation behavior of
Kloeckera apiculata and Saccharomyces cerevisiae associated with winemaking in mixed culture
World Journal of Microbiology and Biotechnology Volume 18 N 4 pag 1 Adana Turkey 6 Cerveceros de Argentina 2006 Levadura wwwcervezadeargentinacomararticuloslevadurahtm
11
representan el grupo de microorganismos entre bacterias y hongos respecto a su
tamantildeo de ceacutelula Este grupo es caracterizado por su forma de reproduccioacuten
vegetativa conocida como ldquogemacioacutenrdquo Bajo condiciones optimas una ceacutelula
madre puede gemar varias veces durante el periodo reproductivo Sin embargo
bajo estrictas condiciones de fermentacioacuten una levadura va a gemar solamente
entre tres o cuatro veces Aquiacute la disponibilidad de oxigeno la cual es necesaria
para la formacioacuten de precursores de la membrana de la ceacutelula limita la
replicacioacuten7
Estos microorganismos muestran varios tipos de gemacioacuten lo cual puede dar un
valor diagnostico Entre aquellas aisladas de fermentacioacuten y antildeejamiento del vino
se observan maacutes frecuentemente multilateral y gemacioacuten polar 8
La modalidad maacutes comuacuten es la gemacioacuten proceso asexual en el cual la ceacutelula
progenitora emite un conducto tubular desde la vacuola nuclear hacia un punto
perifeacuterico proacuteximo a la misma Entonces se forma en la direccioacuten del conducto
una pequentildea protuberancia en la superficie externa de la ceacutelula y el conducto
pasa atravesando la pared celular a dicha protuberancia la cual se ensancha
llenaacutendose con el material citoplaacutesmico y nuclear de la ceacutelula progenitora Cuando
el brote o yema formada llega a ser casi tan grande como la ceacutelula progenitora los
aparatos nucleares de ambas ceacutelulas se orientan de forma que sus centrosomas
respectivos equidisten del punto de unioacuten Al llegar este momento la ceacutelula madre
y la ceacutelula hija se separan y se inicia la formacioacuten de nuevas ymas En la
gemacioacuten normal no se forman tabiques de separacioacuten entre ceacutelula madre y
ceacutelulas hijas pero en algunos casos el proceso se inicia en la gemacioacuten y se
completa por divisioacuten con la separacioacuten definitiva de ambos individuos La ceacutelula
madura de puede producir por gemacioacuten durante el curso de vida un promedio de
7 Brinton M Miller and Warren Litsky PhD 1976 Industrial Microbiology Edi Mac Graw Hill United States
of America
8 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures
edi Springer second edition Fresno California United States of America
12
24 generaciones de ceacutelulas hijas Las yemas sucesivas se forman siempre en
sitios diferentes de la superficie de la ceacutelula9
111 Gemacioacuten multilateral
La gemacioacuten multilateral ocurre en el ldquohombrordquo o aacuterea de la levadura donde ocurre
la reproduccioacuten La gemacioacuten y ciclo de separacioacuten crea un problema para las
levaduras durante su fase fermentativa pues en este tiempo la ceacutelula madre se
reduce aproximadamente un medio Porque la siacutentesis de la membrana celular
ocurre bajo condiciones anaeroacutebicas lo que limita los ciclos asexuales
replicativos Como resultado la mayoriacutea de las fermentaciones se completan en la
fase estacionaria (no gemacioacuten) Un ejemplo de esta reproduccioacuten es
BrettanomycesDekkera10
112 Gemacioacuten Polar
A diferencia de la gemacioacuten multilateral la gemacioacuten polar puede ocurrir en uno o
dos polos En el caso de Kloeckera y Saccharomyces la gemacioacuten ocurre en
ambos polos aumentando la poblacioacuten de levaduras con forma de ldquolimoacutenrdquo 11
113 Fisioacuten
Esta reproduccioacuten es caracteriacutesticas del genero Schizosaccharomyces donde la
formacioacuten de la ceacutelula hija ocurre sin la reduccioacuten de la madre ceacutelula como en los
casos anteriores En este caso la formacioacuten de la microscoacutepica pared celular
ocurre entre la madre ceacutelula y la hija seguida por la separacioacuten12
9 Araya Pablo 2002 Reproduccioacuten de hongos unicelulares mediante gemacioacuten esporulacioacuten y
fisioacuten httphtmlrincondelvagocomreproduccion-asexualhtml
10 11 12 Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic
Publishers GmbH United States of America and Canada
13
114 Pseudomycelium
Cualquier fabricante de vinos ha tenido la oportunidad de notar la formacioacuten de
una peliacutecula en la superficie del vino Esto surge debido a la gemacioacuten repetida de
las levaduras oxidativas y fallas en el momento de la separacioacuten de la ceacutelula hija
de la madre Con el tiempo el lazo previo entre la madre ceacutelula e hija se ampliacutea
dando la impresioacuten de filamentos como si se tratase de mohos siendo que son
levaduras 13
12 TAXONOMIA
Para distinguir las levaduras que pueden producir ascoporas de aquellas que no
los micologistas usan doble taxonomiacutea para su clasificacioacuten Desafortunadamente
la nomenclatura para la combinacioacuten anamorfotelemorfo es frecuentemente
diferente Unos ejemplos de levaduras sexualasexual o telemorfoanamorfo son
DekeraBrettanomyces Metschnikowia pulcherrimaCandida pulcherrima
Hanseniaspora uvarumKloeckera apiculata Torulaspora delbruecki Candida
colliculosa 14
Sin embargo las levaduras son diferenciadas por los taxonomistas por asignacioacuten
de varios nombres de geacutenerosespecies varios vinicultores usan un sistema
informal para agrupar levaduras basadas en su morfologiacutea u otras caracteriacutesticas
Por ejemplo a Kloeckera apiculata se le refiere como ldquolevadura apiculadardquo
tiene forma de limoacuten Esta levaduras asi com muchas otras presentes en el mosto
de la uva como lo son Candida Cryptococcus Debaryomyces Hansenula
Issatchenkia Kluyveromyces Metschnikowia Pichia y Rhodotorula tambieacuten son
llamadas levaduras ldquonativasrdquo ldquonaturalesrdquo o ldquosalvajesrdquo por su origen el vintildeedo o en
13
Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers
GmbH United States of America and Canada
14 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
14
la vinera Algunos enoacutelogos han discutido contra el uso de estos teacuterminos porque
esta implicancia no sucede en todas las levaduras ya que estas son de alguna
forma ldquono-nativasrdquo o ldquono naturalesrdquo (Ej Saccharomyces o Brettanomyces) El
teacutermino ldquono Saccharomycesrdquo es maacutes comuacuten para nombrar aquellas levaduras
presentes en el mosto de la uva que no son del genero Saccharomyces15
Las levaduras encontradas despueacutes de la fermentacioacuten alcohoacutelica tambieacuten son
asignadas a un grupo informal Algunas veces las levaduras que conducen la
principal fermentacioacuten (Saccharomyces) son muchas veces llamadas ldquolevaduras
fermentativasrdquo basados en su metabolismo Durante su antildeejamiento algunas
levaduras (Candida Hansenula y Pichia) pueden crecer en la superficie en
presencia de oxigeno Esta peliacutecula superficial es comuacutenmente asociada a
deterioro del vino esta levadura se le conoce como ldquolevadura formadora de
peliacuteculardquo16
121 DekkeraBrettanomyces
La taxonomiacutea cientiacutefica sobre BrettanomycesDekkera ha cambiado en los uacuteltimos
antildeos Brettanomyces estaacute clasificado dentro de la misma familia que
Saccharomyces (familia Saccharomycetaceae) Actualmente dentro del geacutenero
Brettanomyces se aceptan cinco especies diferentes (B bruxellensis B
anomalus B custersianus B nanas y B naardenensis)17
Las teacutecnicas de biologiacutea molecular han demostrado que B intermedious B
lambicus B custerseii o D intermedia son sinoacutenimos de B bruxellensis por lo
que estas denominaciones han quedado en desuso Los microorganismos de este
geacutenero presentan dos formas una capaz de reproducirse sexualmente (Dekkera)
15
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
16 Kurtzman CP 1998 The industrial and agricultural significance of yeasts 4
th Edition Amsterdam
Holanda
17 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
15
y otra que lo hace asexualmente (Brettanomyces) Tambieacuten se llaman
respectivamente forma perfecta y forma imperfecta En algunos casos la forma
perfecta y la imperfecta reciben nombres diferentes como ocurre con B anomalus
y D anomala En otros casos el nombre es similar como las pertenecientes a la
especie bruxellensis que pueden parecer como D bruxellensis como B
bruxellensis o como BrettanomycesDekkera A efectos praacutecticos en la bodega
estos dos estados son similares Cuando vemos referencias a Brettanomyces
como contaminante en la mayor parte de los casos se refieren a
DekkeraBrettanomyces ya que este es el responsable de las alteraciones en el
vino18 y 19
La morfologiacutea celular de BrettanomycesDekkera es ojival o ciliacutendrica con
gemacioacuten multipolar en reproduccioacuten vegetativa Una de las caracteriacutesticas de
este geacutenero es su tamantildeo celular variable y la formacioacuten de filamentos19
18 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 23
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
19
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
16
Figura 1 Microfotografiacutea de cultivo de BrettanomycesDekkera a) Variabilidad morfoloacutegica y de
tamantildeo celular b) forma filamentosa
Fuente Lopez-Cordon Eva BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia wwwacenologiacom
Los defectos sensoriales asociados directamente a Brett aparecen
mayoritariamente en vinos tintos de calidad y las causas radican en la propia
fisiologiacutea del microorganismo Ademaacutes al ser una levadura de crecimiento muy
lento la alteracioacuten se presenta principalmente durante el almacenamiento y sobre
todo la crianza del vino habitual en los vinos tintos de gama alta En las barricas
de madera el microorganismo tiene a su disposicioacuten todo el sustrato y tiempo
suficiente para realizar su actividad La naturaleza porosa de la madera y su difiacutecil
limpieza contribuye a que las poblaciones existentes se mantengan incluso
despueacutes del lavado de la barrica Ademaacutes BrettanomycesDekkera tiene la
capacidad de degradar uno de sus componentes la celobiosa 20
13 CARACTERISTICAS FISIOLOGICAS
S cerevisiae y BrettanomycesDekkera tienen metabolismos similares muy
adaptados a las condiciones de vinificacioacuten Tras la fermentacioacuten alcohoacutelica S
cerevisiae es la levadura mayoritaria debido a que las condiciones nutricionales
20
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
17
del vino son muy estrictas (altas concentraciones de etanol y bajas
concentraciones de nutrientes) En este momento BrettanomycesDekkera
continuacutea creciendo gracias a que utiliza nutrientes que S cerevisiae no ha podido
consumir sobre todo algunos azuacutecares y fuentes de nitroacutegeno21
Una de las caracteriacutesticas que diferencia a BrettanomycesDekkera es la gran
diversidad de azuacutecares que puede fermentar (ver tabla de Relacioacuten de los
principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) La mayoriacutea de
las cepas pueden crecer utilizando trealosa y celobiosa azucares presentes en el
vino y no consumibles por S cerevisiae Otra de las ventajas que presenta frente
a S cerevisiae (y frente a la mayoriacutea de las levaduras) es que puede utilizar los
nitratos como fuente de nitroacutegeno Debido a que S cerevisiae soacutelo utiliza el
nitroacutegeno amoniacal y los aminoaacutecidos libres estos se consumen con relativa
rapidez Al final de la fermentacioacuten el nitroacutegeno moniacal es escaso y se favorece
el crecimiento de las levaduras que pueden utilizar otras fuentes de nitroacutegeno
Ademaacutes Brettanomyces puede crecer con concentraciones de fosfato diamoacutenico
tan bajas como 05gl o a partir de diversos aminoaacutecidos En resumen
BrettanomycesDekkera crece maacutes despacio que S cerevisiae es resistente a
concentraciones altas de alcohol puede utilizar otros azucares como fuentes de
energiacutea y nitrato como fuente de nitroacutegeno Esto explica que pueda reproducirse
cuando la fermentacioacuten alcohoacutelica ha terminado a partir de nutrientes no
consumibles por S cerevisiae y cuando no tiene competidores22
21
Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
22 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
18
Tabla 1 Relacioacuten de los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto
Fuente Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista
VINOTEQ N 38 pag 21 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
131 BrettanomycesDekkera y siacutentesis de fenoles volaacutetiles
El origen de los fenoles volaacutetiles estaacute relacionado con la actividad secuencial de
dos enzimas que descarboxilan los aacutecidos en hidroxiestirenos (vinilfenoles) que
19
son posteriormente reducidos a etilderivados (etilfenoles)23 como puede
observarse en la figura 2
Figura 2 Siacutentesis de etilfenoles de BrettanomycesDekkera
Fuente ACE revista de Enologia wwwacenologiacom
El primer paso de descaboxilacion de los aacutecidos hidroxicinamicos es comuacuten
tambieacuten en otros microorganismos como bacterias hongos y otras levaduras Sin
embargo el segundo paso reduccioacuten de vinilfenoles es caracteriacutestico de algunos
tipos de levaduras como Dekkera bruxelliensis D anomala Pichia guillermondi
Candida versarilis C halophila y C mannitofaciens24
Los fenoles volaacutetiles que se asocian al problema Brett en vinos son el 4-etilfenol y
el 4- etilguaiacol asiacute como sus precursores intermedios 4-vinilfenol y 4-
vinilguaiacol aunque estos uacuteltimos son menos importantes por ser muy reactivos y
raacutepidamente convertidos en etilfenoles por BrettanomycesDekkera o en su caso
23
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
24 Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
20
condensan con otras moleacuteculas como antocianos25 Los etilfenoles y
especialmente elevadas concentraciones de 4-vinilfenol en vinos se asocian con
aromas desagradables asociados a descriptores como ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de
caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo26
El umbral sensorial del 4-etilfenol es de 230 μg l-1 y el del 4-etilguaiacol es de 47
μgl Pese a su menor umbral sensorial el 4-etilguaiacol responde a descriptores
como ldquobaconrdquo o ldquoahumadordquo que a bajas concentraciones aportan complejidad por
lo que se puede considerar sensorialmente menos conflitivo que el 4-etilfenol 27
Figura 3 Defectos sensoriales producidos en el vino por BrettanomycesDekkera
Fuente Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
25 Morata A Goacutemez-Cordoveacutes M Calderoacuten F Suaacuterez J 2006 Effects of pH temperature and SO2 on the
formation of pyranoanthocyanins during red wine fermentation with two species of Saccharomyces Journal Food Microbiology No106 pag 4 Madrid Espana
26 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea 27 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
21
132 Identificacioacuten de BrettanomycesDekkera
Los Bioacutelogos usan sistemas de identificacioacuten basados en similitudes taxonoacutemicas
entre organismos dichas similitudes pueden ser morfoloacutegicas tipos capacidad de
produccioacuten de sustratos como azuacutecar yo nitratos caracteriacutesticas fisioloacutegicas y
bioquiacutemicas secuencia del material geneacutetico y respuestas inmunoloacutegicas28
En la industria viniacutecola es importante recurrir a diferentes tipos de pruebas para la
identificacioacuten de microorganismos una de estas y la maacutes realizada es la revisioacuten
del microorganismo bajo el microscopio Esta prueba brinda informacioacuten sobre la
morfologiacutea del microorganismo (cocos bacilos formas puntudas ojival entre
otros) tamantildeo (dimensiones) agrupaciones celulares (solas parejas triacuteos
grupos o cadenas) Sin embargo el uso del microscopio es una prueba raacutepida
para examinar mostos o vino pero no determina cantidades que muchas veces es
requerido para tratamientos de accioacuten otro de los inconvenientes es que los
microorganismos pueden variar su morfologiacutea en forma o tamantildeo dependiendo de
la edad y las condiciones de crecimiento por lo que puede no ser clara la
identificacioacuten de este29
14 Medios soacutelidos selectivos
Si se requiere de la confirmacioacuten del microorganismo este debe ser aislado del
vino para una caracterizacioacuten para esto se requiere de medios soacutelidos Cuando se
examina un microorganismo en un medio solido es importante revisar las
caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias (ver figura 4 Morfologiacuteas de colonias
en medios soacutelidos) Entre estas caracteriacutesticas estaacuten forma (circular irregular o
2829 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
22
rizada) tamantildeo (dimensiones estas normalmente se expresan en miliacutemetros)
topografiacutea (plano elevado convexo coacutencavo o embonado) presencia de
pigmentos opacidad (transparente traslucido u opaco) superficie (suave rugosa
lisa o aacutespero) bordes (entero ondulado crespo dentado rizado) o cualquier
cambio en el agar (color opacidad cambios en los indicadores de pH o CaCO3
respectivamente)30
Figura 4 Varias morfologiacuteas de crecimiento de colonias en medio solido
Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007
Gran nuacutemero de medios selectivos se han creado para la aislacioacuten deteccioacuten yo
conteo de levaduras provenientes de jugos de uva mostos o vinos El medio maacutes
utilizado en estos fines es YPD (Yeast Peptone Dextrose) pero dicho medio no
es selectivo entre levaduras y se usa comuacutenmente para el conteo de
Saccharomyces31 Las colonias empiezan a parecer con un periodo de incubacioacuten
30
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
31 Essia Ngang J Wolniewicz E Villa P2005 Stimulation of lactobacilli during alcoholic fermentation action
of sucrose hydrolysis by yeast Biotechnology letters No 8 pag 743 Amiens France
23
de 2 a 4 diacuteas a 22C a 25C Igualmente el agar de jugo de uva es no selectivo y
presenta faacutecil crecimiento de levaduras bacterias y mohos
Para la levadura Brettanomyces Dekkera se han elaborado diferentes medios
selectivos entre ellos el maacutes conocido es WL por sus siglas en ingles del
laboratorio que lo creo ldquoWallerstein Laboratoriesrdquo este medio contiene
cicloheximida compuesto selectivo para Brettanomyces e inhibe Saccharomyces
El punto criacutetico es encontrar la cantidad exacta de este compuesto para la
inhibicioacuten de las levaduras sin que afecte a BrettanomycesDekkera32
Ademaacutes del medio WL BrettanomycesDekkera puede ser cultivado en otros
medios selectivos como Brettanomyces medio A creado por Vilas en 1993
Brettanomyces medio B el cual contiene cicloeximida como agente selectivo
mientras que Brettanomyces medio C tiene cicloheximida y ampicilina este medio
fue creado por B Watson en 1998 Brettanomyces medio D fue creado
recientemente por Rodrigues en 2001 este medio es conocido como DBDM
(DekkeraBrettanomyces differential medium ) es un medio selectivo para
Brettanomyces en contra de Saccharomyces y otras levaduras este medio es el
maacutes utilizado en la vineras para caracterizacioacuten de BrettanomycesDekkera
actualmente33
15 Dioacutexido de azufre (SO2) en vinos
32
33
Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers
GmbH United States of America and Canada
24
El dioacutexido de azufre tambieacuten llamado oxido de azufre es un eficaz agente
conservante antioxidante y antimicrobiano en la industria viniacutecola34
Durante la vinificacioacuten SO2 ha representado histoacutericamente una herramienta muy
importante usada por los vinicultores para el control de crecimiento microbioloacutegico
Debido a preocupaciones por la salud del consumidor el uso de este producto ha
disminuido dramaacuteticamente con el posible riesgo de aumentar el riesgo
microbioloacutegico35
El actual liacutemite legal de SO2 en vinos en los Estados Unidos es de 350mgL una
concentracioacuten mucho mayor a la usada en la industria viniacutecola No obstante vinos
que contienen maacutes de 10mgL deben declarar este compuesto en la etiqueta
porque SO2 es un metabolito que las levaduras usan durante la fermentacioacuten Los
vinos siempre contienen algo de sulfitos aunque la adicioacuten no se realice durante el
proceso36
151 Formas del Dioacutexido de Azufre (SO2)
Una vez disuelto en agua el dioacutexido de azufre existe en equilibrio entre SO2
molecular (SO2H2O) bisulfito (HSO3) y sulfito (SO32-) Este equilibrio depende del
pH Ademaacutes de estar en equilibrio con el molecular y especies sulfito el bisulfito
tambieacuten existe en forma ldquolibrerdquo y en forma ldquoatadardquo Aquiacute la moleacutecula reaccionara
34
Orwine Eureka 2008Investigadores europeos buscan alternativas al dioxido de azufre en vinos
httpawprowordpresscom20081107investigadores-europeos-buscan-alternativas-al-dioxido-de-
azufre-en-el-vino
3536 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
25
con compuestos carbonilos (ej Acetaldehiacutedo) formando productos adicionales
como Acido Hydroxysulfonico 37
Ademaacutes de Acetaldehiacutedo algunas moleacuteculas presentes en el jugo de uva que
reaccionan con bisulfito son acido piruvico α-keto-glutaric dihidroxyacetona
diacetyl Pigmentos de antocianinas entre otros38
152 Inhibidor Microbiano
El sulfuro molecular es la forma antimicrobiana del dioacutexido de azufre La cantidad
de SO2 molecular presente en cualquier vino no se mide directamente La
concentracioacuten es calculada conociendo la concentracioacuten de SO2 libre y el pH del
vino basaacutendose en la siguiente foacutermula
Alternativamente la figura 5 Se puede utilizar como guiacutea para aproximar la
cantidad de SO2 libre necesitada a determinado valor de pH de valores entre 05 o
08 mgl de SO2 molecular 39
El SO2 inhibe microorganismos de varias formas incluyendo rupturas de puentes
bisulfitos en proteiacutenas y reaccionando con coofactores como NAD+ y FAD tambieacuten
reacciona con ATP
3739
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
38 Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi
Springer New York United States
26
Figura 5 Cantidades de SO2 libre a un pH determinado para obtener 05 o 08 mgl de SO2
molecular
Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007
La concentracioacuten de SO2 molecular necesario para prevenir el crecimiento de
microorganismos variacutea seguacuten vinojugo pH temperatura poblacioacuten densidad y
diversidad estado de crecimiento grado de alcohol entre otros factores Beech
1979 sugirioacute una adicioacuten de 08 mgl de SO2 molecular como la cantidad
necesaria del compuesto en vinos blancos de mesa para dar una reduccioacuten de
cerca de 104 UFCml de la poblacioacuten de diferente tipo de microorganismos en 24
horas Las diferencias que existen entre las levaduras y bacterias en base a la
27
sensibilidad a este compuesto son dadas a conocer por diferentes autores (Warth
1977 1985 Du Toit 2005 Davis 1988 Hood 1983)40
16 Antibrettreg como alternativa de prevencioacuten y eliminacioacuten de
BrettanomycesDekkera
Antibrettreg es un producto nuevo creado por Spindal SARL-Gretz - Armainvilliers
Francia Es una preparacioacuten enzimaacutetica para inactivar Brettanomyces y para
reducir olores producidos por fenoles volaacutetiles41
Antibrettreg es preparado a base de paredes celulares de levadura activados
enzimaacuteticamente que presentan elevadas propiedades adsorbentes frente al 4-
etilfeno y 4- etilguayacol compuestos asociados con olores desagradables en el
vino tales como sudor de caballo farmacia o barniz42
Antibrettreg inhibe la produccioacuten de la vinilreductasa que participa en la
transformacioacuten de los aacutecidos cinaacutemicos naturalmente presentes en los vinos en
los correspondientes derivados etilados responsables de los olores atribuidos a
BrettanomycesDekkera 43
40
Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi
Springer New York United States
41 Manual de instrucciones de producto Antibrett reg producido por Spindal SARL-Gretz -
Armainvilliers France
424344 AEB Group 2008 ANTIBRETT Preparado a base de paredes celulares de levadura para la inactivacioacuten
de Brettanomyces y la eliminacioacuten de los olores de estos productos httpwwwaeb-
groupcomimgsSPAGNOLODepliantANTIBRETT-lett-ESPpdf
28
El uso de Antibrettreg es efectivo incluso contra otros olores anoacutemalos como los
que se generan en las barricas sucias principalmente huacutemedas dantildeando la
calidad olfativa del vino44
29
2 PROBLEMA
La levadura BrettanomycesDekkera es una levadura de contaminacioacuten presente
en la mayoriacutea de industrias viniacutecolas en el mundo Afecta directamente la
produccioacuten y calidad sensorial de los vinos con el desarrollo de los compuestos 4
etilfenol y 4 etilguayacol los cuales dantildean el perfil olfativo del vino dando aromas
caracteriacutesticas a ldquoestablordquo ldquocuerordquo ldquosudor de caballordquo o ldquobarnizrdquo conocido como
ldquocaraacutecter Brettrdquo
Esta contaminacioacuten se da especialmente en los vinos tintos debido a sus
caracteriacutesticas de produccioacuten (fermentacioacuten crianza antildeejamiento) y sus
propiedades fisicoquiacutemicas (Grado alcohoacutelico pH Acidez total Acidez volaacutetil
entre otros)
En Croacia existe una gran produccioacuten de vinos tintos entre los cuales se
encuentra el vino tinto Babic proveniente de la isla de Hvar el cual es famoso por
ser un vino duro carnoso estructurado y casi sobre-maduro con un grado
alcohoacutelico que ronda los 15 vv siendo la primera denominacioacuten de origen que
se aproboacute en Croacia en el antildeo 1961 este vino es de gran importancia en la
regioacuten la mayoriacutea de sitios de elaboracioacuten son pequentildeas industrias que han sido
afectadas por el bdquocaraacutecter Brett‟ Muchas investigaciones se han realizado al
respecto de la levadura BrettanomycesDekkera pero se conoce muy poco sobre
sus efectos en el vino Babic debido a sus caracteriacutesticas particulares (alcohol
30
15 pH 35 Acidez total 520 gr Acido TartaricoL Acidez volaacutetil 08 gr Acido
AceticoL Azucar residual 47 grLt)45
La dificultad de la pequentildea industria para acceder a productos que lleven a la
identificacioacuten de la levadura mencionada y de esta manera conllevar a planes de
accioacuten contra el ldquocaraacutecter Brettrdquo es una de las grandes dificultades de la industria
vinera en este paiacutes en donde los productos para la industria enoacuteloga son
complicados y de alto precio para acceder a ellos y en consecuencia no se
realizan muchas de estas pruebas de deteccioacuten de BrettanomycesDekkera
llevando al mercado productos contaminados de baja calidad que inicialmente
podriacutea haber sido un vino de alta calidad debido a sus caracteriacutesticas uacutenicas y de
gran popularidad
45
Datos obtenidos en el laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
31
3 JUSTIFICACION
Actualmente Croacia cuenta con maacutes de 300 zonas vineras en las que se producen 67
de vino blanco 32 vino tinto y el restante 1 vino rosado De acuerdo a recientes datos
estadiacutesticos hay 650 km2 de vintildeedos en Croacia de los cuales 375 km2 son uvas con
indicacioacuten geograacutefica de origen que producen maacutes de 300 vinos y maacutes de la mitad de este
nuacutemero son vinos elaborados en microempresas con un total de 50000000 de botellas
de vino el 8 es vino superior 70 de calidad y el 22 es vino de mesa de produccioacuten
nacional46
Croacia es un fuerte productor de vino a nivel regional con sus diferentes variedades
propias (Merlot Plavac Dingač Postup Malvazija Pošip Kujundžuša Babic) pero dicha
produccioacuten ha sido fuertemente afectada por la presencia de la levadura
BrettanomycesDekkera trayendo consecuencias como perdidas de produccioacuten peacuterdida
de calidad sensorial del vino grandes peacuterdidas econoacutemicas y desprestigio a sus vinos de
denominacioacuten de origen
Es por esto que en este proyecto de investigacioacuten se busca una faacutecil y raacutepida
identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera causante del ldquocaraacutecter Brettrdquo con el
desarrollo de medios selectivos liquido y solido ademaacutes de opciones para el tratamiento
yo prevencioacuten de esta levadura en la cadena productiva comparativamente entre dioacutexido
de azufre (SO2 ) y Antibrettreg y la identificacioacuten de los aromas caracteriacutesticos del ldquocaraacutecter
Brettrdquo en el vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia
46
Hrvatski zavod za vinogradarstvo i vinasrtvo 2003 Pravilnik o vinu httpwwwhrzvvhrpropisihtm
32
4 OBJETIVOS
41 General
Caracterizar y evaluar el comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera
en teacuterminos de crecimiento y produccioacuten de aromas no deseados en vino tinto
Babic
42 Especiacuteficos
Desarrollar el medio solido y medio liacutequido selectivo para
BrettanomycesDekkera
Evaluar el comportamiento de la levadura en estos medios selectivos
Determinar la influencia del Dioacutexido de azufre (SO2) y el compuesto
Antibrettreg en la levadura BrettanomycesDekkera presente en vino tinto
Babic 2007
Identificar los compuestos aromaacuteticos producidos por Brettanomyces
bruxellensis en vino tinto Babic usando el meacutetodo ldquomultiple headspace
solid-phase microextraction (SPME)rdquo
33
5 ALCANCES
En este proyecto se pretende desarrollar un medio selectivo faacutecil de producir en
donde sea raacutepida la identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera en la
produccioacuten de vinos tintos se realizaran pruebas para corroborar el crecimiento de
esta levadura en el medio determinando el tiempo que esta levadura toma en
adaptarse en el medio y su comportamiento en este una vez comprobada su
adaptacioacuten al medio liquido se trabajara con el meacutetodo de cromatografiacutea de gas
(GC) y el uso de micro extraccioacuten en fase solida (SPME) para el anaacutelisis
cuantitativo de los compuestos volaacutetiles (4-etil-fenol 4-etil-guayacol4-vinilfenol y
4-vinil-guayacol) y posteriormente con el vino tinto Babic Ademaacutes se desea
comprobar la efectividad de los productos con que las vineras de Croacia inhiben
o eliminan la presencia de la levadura en los vinos tintos como lo son el producto
AntiBrettreg y el Dioacutexido de azufre (SO2)
34
6 ESTADO DEL ARTE
Sobre el campo problemico causado por la levadura BrettanomycesDekkera en la
industria viniacutecola se han realizado bastante investigaciones a nivel de
caracterizacioacuten de la levadura los factores fisicoquiacutemicos que favorecen el
crecimiento de la levadura meacutetodos de prevencioacuten y control evaluacioacuten de
dantildeos sensoriales en diferentes tipos de vinos formacioacuten de compuestos fenoacutelicos
en los diferentes tipos de vino otros compuestos no fenoacutelicos asociados al
ldquocaraacutecter Brettrdquo teacutecnicas de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera
evaluacioacuten de la teacutecnicas de control e inhibicioacuten de dicha levadura desarrollo de
nuevos medios de deteccioacuten y aislamiento de la levadura relacioacuten entre la
levadura BrettanomycesDekkera con las otras levaduras presentes en el vino
entre otros
Seguacuten estas investigaciones se analizan aquellas que pueden aportar datos
importantes para el desarrollo del trabajo que se quiere realizar y se tiene en
cuenta sus metodologiacuteas conclusiones recomendaciones y comentarios
Entre las importantes para el planteamiento de este trabajo se menciona el trabajo
realizado por la Universidad Politeacutecnica de Madrid Espantildea el cual analiza
algunas de las caracteriacutesticas maacutes relevantes de este geacutenero de levaduras su
crecimiento en bodega factores fisicoquiacutemicos que favorecen su crecimiento y
desarrollo en el vino los defectos sensoriales que presenta en los vinos y estudia
algunas de los meacutetodos fiacutesicos para el control de BrettanomycesDekkera en vino
35
(clarificacioacuten filtracioacuten amicrobica proteiacutenas clarificantes anhiacutedrido sulfuros
dimetil dicarbonato Aditivos)47
Para conocer maacutes sobre la levadura en condiciones de barrica y almacenamiento
se revisa el articulo elaborado en el Departamento Teacutecnico Guserbiot La rioja
Espantildea en este artiacuteculo se describe brevemente su metabolismo y su ecologiacutea en
las bodegas Igualmente se comparan las teacutecnicas utilizadas en los laboratorios
para su deteccioacuten y cuaacuteles son las limitaciones de los diferentes meacutetodos
Finalmente se analizan las estrategias desarrolladas para su eliminacioacuten de las
bodegas y se dan una serie de recomendaciones para su control48
El instituto de fermentaciones Industriales Consejo superior de investigaciones
cientiacuteficas Juan de Cierva Madrid Espantildea en el cual se revisa la formacioacuten de
etilfenoles (4 etil-fenol 4 etil guayacol) en vinos tintos anejos Los factores
fisicoquiacutemicos que favorecen el crecimiento de la levadura no deseada
BrettanomycesDekkera las teacutecnicas usadas para la detectar la presencia de esta
levadura en vinos ( Revisioacuten microscoacutepica fluorescente remocioacuten de aacutecidos
grasos de su membrana teacutecnicas moleculares como PCR y electroforesis) y de
control (Proteiacutenas fining Fining con gelatina liquida filtracioacuten variables
fisicoquiacutemicas adicioacuten de aditivos procedimientos de altas presiones
manipulacioacuten geneacutetica) con esta investigacioacuten se concluye que la combinacioacuten y el
uso de las numerosas teacutecnicas pueden ayudar a la prevencioacuten y reduccioacuten de la
levadura BrettanomycesDekkera 49 Este trabajo muestra las muacuteltiples opciones
47
A Morata S Benito F Palomero F Calderoacuten y J A Suaacuterez-Lepe Ecologiacutea y prevencioacuten de
BrettanomycesDekkera durante la elaboracioacuten y crianza de vinos tintos Revista enoacutelogos (Editada por la
Federacioacuten Espantildeola de Asociaciones de Enoacutelogos y Periodistas Asociados) No 50 paacuteg 1-12 Madrid Espantildea
48 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 20-
24 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
49 R Suarez JA Suarez-Lepe A Morata F Calderon 2006 The production of ethyl phenols in wine by yeasts
of the genera Brettanomyces and Dekkera A review Journal Food Chemistry No 102 pag 10-21 Madrid
Espantildea
36
existentes en el control y prevencioacuten de la levadura mencionada sin embargo deja
claro que la mayoriacutea de estas opciones son costosas y no de faacutecil adquisicioacuten para
una pequentildea industria
El anaacutelisis sensorial ha sido de los aspectos maacutes estudiados al respecto de
BrettanomycesDekkera una de estas investigaciones fue realizada en Centre
Europeacuteen des Sciences du Goucirct en Talence Francia en el cual se evaluaron 50
vinos bordeaux sensorialmente para demostrar la complejidad del ldquoCaraacutecter Brett‟‟
al cual se unen otros compuestos aromaacuteticos ademaacutes de los fenoacutelicos como acido
isobutirico e isovalerico en este tipo de vino debido a sus caracteriacutesticas
fisicoquiacutemicas50
De los meacutetodos de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera los medios
selectivos son muy populares es por esto que el Laboratorio de Microbiologiacutea
Departamento de Botanica e Engenharia Biologica Instituto Superior de
Agronomia Lisboa Portugal realizo un trabajo en el cual se pretendia desarrollar
un medio selectivo o diferencial capaz de aislar la levadura
BrettanomycesDekkera del vino y de la cadena productiva del vino con el fin de
detreminar la relacioacuten entre esta levadura y los compuestos 4-etilfenol y 4 etil-
guayacol51 otro estudio realizado para la deteccioacuten de dicha levadura fue
realizado en la Escola Superior de Biotecnologiacutea Universidade Catoacutelica
Portuguesa el desarrollo de un simple procedimiento compatible con las rutinas
50 Andrea Romano a Marie Claire Perello a Aline Lonvaud-Funel Gilles Sicard Gilles de Revel2008 Sensory
and analytical re-evaluation of lsquolsquoBrett characterrdquo Journal Food Chemestry No 114 pag 15-19 Talence
France
51 N Rodrigues G Gonccedilalves S Pereira-da-Silva M Malfeito-Ferreira and V Loureiro2001 Development
and use of a new medium to detect yeasts of the genera DekkeraBrettanomyces Journal of applied microbiology No 90 pag 588-599Lisboa Portugal
37
usadas en las vineras para la deteccioacuten de BrettanomycesDekkera en vino y en
maquinarias52
En el laboratorio de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas Alcohoacutelicas de la
Universidad de Zagreb se ha trabajado anteriormente en el desarrollo de medio
solido selectivo con pruebas de diferentes concentraciones de los compuestos
como resultados se encuentra una buen relacioacuten entre las concentraciones de los
compuestos sin embargo como recomendaciones se encuentran la falta de
antibioacutetico para evitar contaminacioacuten por bacterias probar con diferentes fuentes
de carbono para comparacioacuten de tiempo de crecimiento positivo y un monitoreo
diario en el medio53
Los compuestos aromaacuteticos que libera la presencia de BrettanomycesDekkera
estaacute asociada a los compuestos 4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinilfenol y 4
viniguayacol a partir de esto los centros de investigacioacuten han hondado en la
identificacioacuten de dichos compuestos relacionados en la enologiacutea y especialmente
con BrettanomycesDekkera a partir de eso el Departamento de Quiacutemica
Universidad de La Rioja Espantildea este estudio presenta un meacutetodo basado en el
uso de Cromatografiacutea de Gas y micro extraccioacuten en fase solida para el anaacutelisis
cuantitativo de 4-etilfenol 4-etil guayacol 4-vinilfenol 4-vinilguayacol
Demostrando la existencia de un efecto matriz en el anaacutelisis de compuestos
responsables del ldquocaraacutecter Brettrdquo en vino Este nuevo meacutetodo fue
satisfactoriamente aplicado a cierto nuacutemero de vinos tintos comerciales vinos
52
JA Couto A Barbosa and T Hogg 2005 A simple cultural method for the presumptive detection of the yeasts BrettanomycesDekkera in wines Letters in Applied Microbiology No 41 pag 505-510 Porto
Portugal
53 Serkovic Dubravka Gracin Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac
Brettanomyces bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet pag 1-117 ZagrebCroatia
38
blancos y roseacute Este meacutetodo puede ser una alternativa para evitar el efecto matriz
en muestras de vino54
De acuerdo con este tema en la jornada cientiacutefica del 99 el grupo de investigacioacuten
enoloacutegica se estudio la formacioacuten de sustancias volaacutetiles por 13 cepas de S
cerevisiae con buenas aptitudes enoloacutegicas inoculadas individualmente en un
mosto homogeacuteneo de la variedad airen fermentado en las mismas condiciones
de aireacioacuten y a temperatura controlada55
54
C Pizarro N Perez-del-Notario JM Gonzalez-Saiz 2007 Determination of Brett character responsible
compounds in wines by using multiple headspace solid-phase micro extraction Journal of Chromatography
No 1143 pag 176-181 La Rioja Espantildea
55 E Pueyo P Hidalgo K Fernaacutendez y P Martiacuten-Aacutelvarez 1999 Anaacutelisis de compuestos volaacutetiles en vinos
obtenidos con distintas cepas de Saccharomyces cerevisiae Aplicacioacuten de la teacutecnica de microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientificas 99 Grupos de Investigacion Enologica Zaragoza Espana
39
7 MATERIALES Y METODOS
A continuacioacuten se presentan materiales y meacutetodos para la investigacioacuten
Este proyecto fue realizado en su gran mayoriacutea en las instalaciones de la
Universidad de Zagreb en la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos
(PBF) Laboratorios del Departamento de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas
Alcohoacutelicas ubicado en la ciudad de Zagreb Croacia
Los anaacutelisis fisicoquiacutemicos del vino tinto Babic fueron realizados en los
laboratorios de VINOLAB ubicado en Zagreb Croacia
71 MEDIO SOLIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera
711 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Autoclave de laboratorio
Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa Etanol peptona extracto de levadura
agar cicloheximida acido cumaacuterico ampicilina)
Balanza electroacutenica de precisioacuten
Microscopio oacuteptico
712 Metodologiacutea
Basados en estudios anteriores realizados en el laboratorio para el desarrollo de
medio solido selectivo para BrettanomycesDekkera (Serkovic Dubravka Gracin
40
Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac Brettanomyces
bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet Universidad de Zagreb pag 1-
117 Zagreb Croacia) se evaluaron las recomendaciones mencionadas en dicha
investigacioacuten para la mejoriacutea y desarrollo de otros medios soacutelidos selectivos
Se usoacute como base el medio YPD (Yeast Peptone Dextrose) el cual estaacute
compuesto de la siguiente forma 20gL peptona 10 gl extracto de levadura 20 gl
de agar56 este medio es selectivo para levaduras pero no es selectivo entre ellas
Es necesario el uso de una fuente de carbono para la levadura
BrettanomycesDekkera de acuerdo a la teoriacutea y revisando la tabla 1 (Relacioacuten de
los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) y seguacuten
facilidades de disponibilidad en el laboratorio se utiliza glucosa la cual es
utilizable por entre 75-100 de las cepas de BrettanomycesDekkera seguacuten la
tabla mencionada anteriormente
Esta fuente de carbono (Glucosa) fue probada en una concentracioacuten de 20 gL
Cicloheximida fue probada a 30 mgL para inhibir Saccharomyces en el medio y
darle mayor selectividad para Brettanomyces Dekkera Se antildeade acido p-
cumarico en una concentracioacuten de 100 mgL como precursor para la formacioacuten
del compuesto 4 etilfenol caracteriacutestico de la levadura BrettanomycesDekkera
Para inhibir bacterias en el medio se usa ampicilina a 10 mgL esta se agrega
despueacutes de realizada la esterilizacioacuten y cuando la temperatura del medio este
igual o menor a 40C El pH del medio se ajusto a 5
Paralelamente se crea el medio con Etanol como fuente de carbono en una
concentracioacuten de 6 o 60 mlL con la misma concentracioacuten de los otros
compuesto como cicloheximida 30mgL acido cumarico 100mgL 20 gL peptona
10 gL de extracto de levadura 16gL de agar Este medio se crea como
56
Concentraciones preestablecidas en el laboratorio de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas alcoholicas
41
comparativo para determinar cual fuente de carbono es la maacutes utilizada por la
levadura Brettanomyces bruxellensis para su reproduccioacuten Seguacuten la teoriacutea (ver
tabla 1) el etanol es utilizado por entre 25-75 de las cepas de
BrettanomycesDekkera pero es el azuacutecar que se encuentra en mayor
concentracioacuten presente en los vinos tintos aproximadamente 130 gl57
Estos medios fueron debidamente esterilizados para eliminar cualquier
microorganismo o espora presente en este Este procedimiento se realizo por el
meacutetodo de combinacioacuten de altas temperatura y presioacuten (Autoclave 121 C a 1034
kPa)
Se usaron colonias de BrettanomycesDekkera aisladas anteriormente de vinos
contaminados y guardas para investigaciones en el Departamento de Tecnologiacutea y
Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos
Universidad de Zagreb Croacia
Los medios fueron monitoreados visualmente todos los diacuteas y se toman
observaciones de macroscoacutepicas y microscoacutepicas Se comparan estos dos medios
en teacuterminos de rapidez de crecimiento de la levadura y selectividad Estas
muestras fueron incubadas a 28C por 10 diacuteas
La prueba fue realizada por duplicado en diferentes tiempos
57
Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
42
72 MEDIO LIacuteQUIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera
721 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Frascos de vidrio esteacuteriles
Autoclave de laboratorio
Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa peptona extracto de levadura
cicloheximida acido cumarico ampicilina etanol)
Microscopio oacuteptico
Balanza electroacutenica de precisioacuten
722 Metodologiacutea
En el mercado para enologiacutea existen medio liacutequidos selectivos para la deteccioacuten
de BrettanomycesDekkera en vinos sin embargo estos son de difiacutecil accesibilidad
por sus elevados precios es por esto que se desarrolla un medio liquido selectivo
para dicha levadura en el laboratorio del Departmaneto de Tecnologiacutea y Anaacutelisis
de Bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia
Para este medio se toma como base el medio selectivo con Glucosa como fuente
carbono desarrollado anteriormente sin usar agar para mantener el medio en su
estado liquido
43
La composicioacuten de este medio liacutequido es la siguiente
20 gL Glucosa
20 gL peptona
10gL extracto de levadura
30mgL de cicloheximida
100mgL acido p-cumarico
10 mgL ampicilina
Estos compuestos fueron medidos en una balanza electroacutenica de precisioacuten se
antildeade 250 ml de agua destilada y se mezcla constantemente se pasa a proceso
de esterilizacioacuten en autoclave a 120C y 1034 KPa por 45 minutos
De esta forma se asegura la usencia de microorganismos yo esporas en el
medio Despueacutes de bajar la Temperatura a 40C se agrega a la mezcla ampicilina
en una concentracioacuten de 10mgL
En frascos de vidrio esteacuteril se agrega 40 ml de medio liacutequido y diferentes
cantidades iniciales de levaduras BrettanomycesDekkera fueron inoculadas al
respectivo medio el primer frasco tiene una cantidad de 106 ceacutelulasml el segundo
tiene 104 ceacutelulasml el tercero tiene 102 celulasml y el cuarto con una cantidad
aproximada de 25 ceacutelulasml Estas cantidades estaacuten basadas en estudios
anteriores para medios liacutequidos selectivos en levaduras58
58 J Ungar A M James P W Muggleton H F Pegler y E G Tomich1950 The Cultivation of
Haemophilus pertussis in Partially Defined Liquid Media Journal of General Microbiology No 4
pag 345-359 Greenford
44
Este medio liacutequido inoculado fue inspeccionado diariamente visualmente revisioacuten
de turbidez microscoacutepicamente y olfativamente para deteccioacuten de olores del
ldquocaraacutecter Brettrdquo
Los diacuteas fueron contabilizados para determinar resultados positivos en estos
ensayos
73 INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN
VINO TINTO DE LA REGION DE DALMACIA CROACIA
731 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Medio selectivo solido para BretanomycesDekkera
Medio selectivo Liquido para BrettanomycesDekkera
Quiacutemicos de laboratorio (Dioxido de Azufre (SO2) Antibrettreg Glucosa)
Vino Babic 2007
Anallizador infrarojo Bacchius II microdom
732 Metodologiacutea
Con los medios desarrollados (solido y liquido) se quiere conocer el efecto del
dioacutexido de azufre (SO2) y el producto Antibrettreg en la levadura
BrettanomycesDekkera presente en el vino tinto de la regioacuten de Dalmacia
Con las herramientas que se tienen en el laboratorio del departamento de
tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia se quiere
determinar la influencia de estos productos en la levadura BrettanomycesDekkera
presente en vino tinto croata de la regioacuten de Dalmacia Babic
45
El primer paso es adaptar la levadura al vino tinto croata (Babic) para esto se
inoculan 20 colonias de BrettanomycesDekkera en 500 ml de vino se antildeadioacute
glucosa en una concentracioacuten de 2gL y se oxigena la mezcla Para este paso de
adaptacioacuten se dejan las muestras de 1 a 2 diacuteas a temperatura ambiente (20C)
Despueacutes de este periodo se revisa microscoacutepicamente la presencia positiva de
BrettanomycesDekkera en los 500 ml de vino en los que se estaba haciendo el
paso de adaptacioacuten en Babic al comprobar su presencia positiva se procede a
mezclar los 500 ml de vino contaminado con BrettanomycesDekkera con los 3
Litros de vino Babic que se disponen para esta prueba
Estos 3 litros de vino tinto Babic contaminado con la levadura
BrettanomycesDekkera se reparten en 8 frascos de vidrios esteacuteriles al siguiente
diacutea se toman dos frascos para agregar cada uno de los compuestos a evaluar
(SO2 y Antibrettreg)
Para SO2 se toman dos frascos uno de 600ml y uno de 100ml se agrega una
concentracioacuten de 40 mgl
Para el producto AntiBrettreg se toman cuatro frascos dos de 600 ml y dos de 100
ml seguacuten especificaciones del producto y la alta poblacioacuten de
BrettanomycesDekkera en las muestras se adiciono la maacutexima concentracioacuten de
AntiBrettreg a las muestras la cual fue de 40 gHl
Estas muestras se dejaron a temperatura ambiente simulando condiciones de
almacenamiento del vino en barricas temperatura aproximada de 20C evitando el
contacto con la luz solar y evitando movimientos fuertes Esto se mantuvo por 15
diacuteas que fue el tiempo de duracioacuten del experimento
Con el vino restante se mantuvo en las mismas condiciones de almacenamiento
de los demaacutes para hacer un paralelo de comparacioacuten
Previamente se analizaron las caracteriacutesticas del vino sin contaminar por medio
del analizador infrarrojo Bacchus II microdom antes de agregar los compuestos
46
SO2 y AntiBrettreg y despueacutes se volvioacute a realizar el anaacutelisis para determinar los
efectos de estos compuestos en el vino y asiacute mismo al de control
74 DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN
EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO
MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE
741 Materiales
Cromatografo de Gas HP5890 Serie II
Microextractor de fase solida (SPME)
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Quiacutemicos de laboratorio (p-cresolAcetaldehido Propanol diacetil etil-
acetato i-butanol acido aceacutetico i-amil-alcohol n-amil lactato de etilo
acetato amil metiacutelico 1-hexanol etil-hexanol linalol nerol citronelol
geraniol 2-feniletanol octanoato de etilo 4-etilfenol 2-feniletil acetato 4-
etilguaiacol)
Vino Tinto Babic
Agua destilada
742 Metodologiacutea
El meacutetodo fue desarrollado anteriormente en el Departamento de Tecnologiacutea y
Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos de
la Universidad de Zagreb Croacia Y despueacutes de modificaciones fue utilizado en el
desarrollo del trabajo El meacutetodo utilizado es descrito a continuacioacuten
47
Cromatografo de gas HP 5890 SERIES II
Programa HP-chem
a) Condiciones para analisis SPME-GC
Muestra diluida 5050 con adicion de estandar interno (p-cresol1mgl)
25ml de la muestra diluida con mezcla continua a temperatura ambiente
Tiempo de adsorcion 30 minutos
SPME es colocado en la muestra para la adsorcion durante el tiempo
previsto
b) Condiciones para el Cromatografo de gas (GC)
La columna usada en este experimento es RTXreg-5 (Restec USA sn 210627)
30m id=025mm 025μm
Gas portador Nitrogeno
Flujo del Nitrogeno 5 mlmin
Temperatura del inyector 240 C
Temperatura del detector 250 C
Temperaturas programadas 35 C5 min 150 C 34 Cmin 180 C
10Cmin 190 C 5 Cmin
Se conocen los resultados del cromatografiacutea de gases (ver tabla 10) y se hacen
necesarias varias correcciones del meacutetodo y algunas pruebas con unos
compuestos para determinar realmente su tiempo de retencioacuten en este tipo de
vino Se deben comprobar tiempos de retencioacuten
48
8 DISCUSIOacuteN Y RESULTADOS
81 RESULTADOS PARA EL DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO
Tabla 2 Medio Selectivo con Glucosa como fuente de carbono para
BrettanomycesDekkera en incubacioacuten por 5 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten
microscoacutepica
1 Negativo Negativo - No se realiza
2 Negativo Negativo - Presencia de levaduras
3 Negativo Negativo - Presencia de
Levaduras
4 Aparicioacuten de
algunas colonias
Negativo Transparente Presencia de levaduras
5 Colonias definidas Positivo-
Fenoles
Amarillo Presencia positiva de
BrettanomycesDekkera
49
Este medio tiene alto grado de selectividad para levaduras con un tiempo de
crecimiento de aproximadamente 5 diacuteas en 28C lo que lo hace raacutepido gracias al
antibioacutetico (ampicilina) que hace parte de la composicioacuten del medio no hay
presencia de bacterias Se hace confiable para resultados positivos de levaduras
BrettanomycesDekkera debido a que las levaduras Saccharomyces fueron
inhibidas con el compuesto cicloheximida su selectividad fue comprobada por
revisioacuten microscoacutepica macroscoacutepica y sensorial
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con glucosa como fuente de carboacuten son las
siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
50
Tabla 3 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono para Brettanomyces Dekkera en
incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica
1 Ninguno Negativo - -
2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras y
bacterias
9 Diminutas
colonias
transparentes
Negativo Transparentes Presencia de levaduras y
algunas bacterias
10 Positivo Positivo-
Fenoacutelicos
Amarillo Presencia de levaduras
BrettanomycesDekkera y
bacterias
El medio selectivo para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de
carbono tambieacuten es selectiva entre levaduras ya que solo se identifico la levadura
BrettanomycesDekkera en este sin embargo se evidencia una presencia de otro
microorganismo presuntamente bacteria ya que este medio no contiene agente
antibacteriano (ampicilina) Es necesaria la adicioacuten de ampicilina en una
concentracioacuten de 10mgl para inhibir la presencia de bacterias
Este medio presenta un tiempo maacutes prolongado para mostrar crecimiento de la
levadura BrettanomycesDekkera aproximadamente 10 diacuteas
51
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las
presentadas en el medio selectivo con glucosa como fuente de carbono y son las
siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
52
Tabla 4 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono y adicioacuten de ampicilina para
Brettanomyces Dekkera en incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica
1 Ninguno Negativo - -
2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
9 Diminutas
colonias
transparentes
Negativo Transparentes Presencia de levaduras
10 Positivo Positivo-
Fenoacutelicos
Amarillo Presencia de levaduras
BrettanomycesDekkera
El efecto de la ampicilina sobre el medio selectivo con etanol como fuente de
carbono fue el esperado inhibioacute completamente el crecimiento de colonias
bacterianas en el medio el tiempo de crecimiento de la levadura y presencia de
aromas fenoacutelicos fue el mismo de 10 diacuteas en incubacioacuten de 28C
53
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las
presentadas anteriormente y son las siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
82 RESULTADOS PRUEBAS MEDIO LIQUIDO
Tabla 5 Influencia de la concentracioacuten de levaduras BrettanomycesDekkera en el
tiempo necesario para detectar la produccioacuten de 4-etil-fenol en medio liquido
Nuacutemero de ceacutelulas ml
(concentracioacuten final)
Tiempo necesario para obtener resultados
positivos (diacuteas)
1 Experimento
32x106 le 3
3 X 104 3
33x102 7
40 No detectado
2 Experimento
43x106 le3
39x104 le3
37x102 8
62 No detectado
54
El nuacutemero de ceacutelulas de levadura de BrettanomycesDekkera fue contabilizado
usando contador de ceacutelulas Chamber
Los aromas fenoacutelicos son difiacuteciles de detectar debido al fuerte olor que tiene el
medio liquido caracteriacutestico de sus componentes esto dificulta la identificacioacuten del
ldquocaraacutecter Brettrdquo en especial cuando las concentraciones de
BrettanomycesDekkera no son elevadas Ademaacutes de los olores fenoacutelicos otros
compuestos volaacutetiles se detectan tales como acido aceacutetico y olores oxidativos
tambieacuten producido por la levadura BrettanomycesDekkera
En la inspeccioacuten visual se detecta alta turbidez en el medio Se compara con un
medio sin presencia de BrettanomycesDekkera
En las muestras con mayor concentracioacuten de la levadura es maacutes notoria la
turbidez Despueacutes de 3 diacuteas se presenta un precipitado blanco en todas las
muestras de altas concentraciones
La revisioacuten microbioloacutegica se realiza diariamente para determinar el nuacutemero de
ceacutelulas y la presencia positiva de la levadura a evaluar
Entre los dos experimentos realizados con el medio liquido el tiempo que se
demoro en detectar compuestos fenoacutelicos fue muy similar entre ellos
dependiendo del nuacutemero de ceacutelulas en el medio en mayores concentraciones el
tiempo de deteccioacuten fue menor
Hay que sentildealar que BrettanomycesDekkera debe alcanzar una concentracioacuten
miacutenima (denominada poblacioacuten criacutetica) de 103 UFCml para comenzar a liberar etil
fenoles Por debajo de esta concentracioacuten la levadura seriacutea metaboacutelicamente
activa pero no produciraacute compuestos alterantes a niveles detectables esto se ve
reflejado en los resultados en los que las concentraciones de ceacutelulas son muy
bajas
55
Estos resultados se comparan con los resultados dados en el medio solido Los
dos medios muestran altos grados de selectividad hacia la levadura
BrettanomycesDekkera y similar comportamiento para el crecimiento de dicha
levadura
En el medio liacutequido cuando hay altas concentraciones de BrettanomycesDekkera
el tiempo de deteccioacuten del microorganismo es menor que con el medio solido pues
en el liacutequido es aproximadamente 3 diacuteas y en el soacutelido son 5 diacuteas
83 RESULTADOS DE LA INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE
(SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO DE LA REGION DE
DALMACIA CROACIA
El vino fue analizado antes de la adicioacuten de los compuestos quiacutemicos a evaluar y
15 diacuteas despueacutes de adicioacuten para ver la reaccioacuten de este frente a SO2 y Antibrettreg
estas caracteriacutesticas se determinaron con el equipo de laboratorio Bacchus II
Microdom localizado en el laboratorio Vinolab doo Zagreb Croacia Los
resultados se muestran en la tabla
Tabla 6 Resultados de las muestras de vino inoculados con la levadura BrettanomycesDekkera
durante 15 diacuteas Comparativos con los diferentes compuestos
CFUml
Vino Day 1 Day 4 Day 10 Day 15
Control 130E+04 800E+03 700E+03 500E+03
Control 800E+03 640E+03 700E+03 280E+03
SO2 110E+04 400E+02 400E+02 67
SO2 900E+03 380E+03 270E+03 183
Antibrett 140E+05 920E+04 140E+04 400E+03
Antibrett 210E+05 181E+05 160E+04 900E+03
Antibrett 120E+05 990E+04 120E+04 100E+03
Antibrett 230E+05 204E+05 300E+03 200E+03
56
Tabla 7 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 antes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o
Antibrettreg Diacutea 0
Alcohol
()
Acidez Total
(gr Aci
Tartaacuterico L)
Acidez volaacutetil
(Aci
AceacuteticoL)
Densidad
(grml)
Azuacutecar residual
(grl)
Extracto
seco
(grl)
Acido
Laacutectico
(grl)
Glicerol
(grl)
Taninos
(grl)
Acetato
(grl)
1473
525
083
09928
473
332
164
799
305
117
1471
522
084
09927
479
329
162
786
299
116
Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
Tabla 8 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 despueacutes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o
Antibrettreg Diacutea 15
Alcohol
()
Acidez Total
(gr Aci
Tartaacuterico L)
Acidez volaacutetil
(Aci
AceacuteticoL)
Densidad
(grml)
Azuacutecar residual
(grl)
Extrac
to seco
(grl)
Acido
Laacutectico
(grl)
Glicerol
(grl)
Taninos
(grl)
Acetatos
(grl)
Control
1414
565
107
09935
436
364
177
827
259
136
Control
1415
556
108
09936
420
365
170
824
256
137
SO2
1456 543 108 09932 476 369 167 803 281 125
SO2
1457
542 108 09933 472 370 170 804 271 124
Antibrett 1454 533 106 09933 448 371 175 813 277 125
Antibrett 1455 534 105 09933 460 372 171 809 282 124
Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
57
Figura 4 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en el vino de control para
evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas
El comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en la prueba por
duplicado en el vino de control fue muy similar pues con el tiempo esta levadura
deja de reproducirse y va muriendo cuando las condiciones ya no son aptas para
su desarrollo debido a que la mayoriacutea de su fuente de carbono (Glucosa) esta
consumida sin embargo esta levadura no llega a su desaparicioacuten total lo que
representa uno de los mayores problemas en la elaboracioacuten del vino
Esta levadura tiene un metabolismo lento y el factor tiempo es un requisito
fundamental para su desarrollo este experimento se empezoacute con una alta
poblacioacuten de BrettanomycesDekkera (130 x 104 UFCml y 8 x 103 UFCml
respectivamente) y durante el transcurso del tiempo la poblacioacuten fue disminuyendo
debido a la perdida de las condiciones necesarias para la reproduccioacuten
58
Figura 5 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de SO2 en
concentracioacuten de 40 mgl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas
El SO2 tuvo un comportamiento efectivo y raacutepido contra las colonias de
BrettanomycesDekkera La poblacioacuten de esta levadura se redujo de forma
significativa entre el diacutea primero y el cuarto se encontroacute una diferencia porcentual
de 96 en la primera prueba y del 60 en la de duplicado al diacutea 15 ya la
poblacioacuten era casi nula pasando raacutepidamente de un numero por encima de la
poblacioacuten critica de la levadura BrettanomycesDekkera a un numero lt103 UFCml
siendo muy eficaz y raacutepido en el manejo de produccioacuten
Este compuesto ademaacutes de favorecer la extraccioacuten de los compuestos fenoacutelicos y
de su actividad antioxidante al inhibir la accioacuten de las polifenoloxidasas a dosis
adecuadas de un maacuteximo de 50gl inhibe la multiplicacioacuten bacteriana y de
levaduras
59
Figura 6 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de
Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo
de 15 diacuteas
Figura 7 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de
Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo
de 15 diacuteas
El compuesto Antibrettreg en la primera prueba tanto como en el duplicado tuvo su
mayor tiempo de reduccioacuten de UFCml entre los diacuteas 4-10 con una diferencia
porcentual de 91 en comparacioacuten con el diacutea cuarto al decimo a diferencia de
60
SO2 el cual presenta la gran disminucioacuten de colonias entre los primeros diacuteas de
agregarse el producto
El tiempo para que la poblacioacuten de la levadura llegara a la cantidad menor a la de
la poblacioacuten critica es mucho mayor que la del compuesto SO2 sabiendo que esta
poblacioacuten debe ser lt103 UFCml
El compuesto Antibrettreg puede tardarse 4-10 diacuteas en representar una reduccioacuten
de UFCml significativa en dicho tiempo puede representar grandes peacuterdidas
nutricionales y altos costos de produccioacuten para la fabricacioacuten
Figura 8 Comportamiento del contenido de alcohol en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin adicioacuten)
hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
BrettanomycesDekkera estaacute presente en vinos de alto contenido alcohoacutelico
aproximadamente entre 125 a 14 pues esta levadura toma a etanol como
fuente de carbono y este vino (Babic) procede de uvas muy maduras las cuales
presentan mayor cantidad de azuacutecares residuales (como glucosa y fructosa y
otras pentosas residuales)
138
14
142
144
146
148
Alcohol
Day 0 Day 15
61
Analizando el comportamiento del vino durante el experimento de 15 diacuteas sin
compuestos quiacutemicos y con SO2 y Antibrettreg a partir de las caracteriacutesticas
iniacuteciales que se determinaron seguacuten el equipo BACCHUS analizador infrarrojo se
presenta en general una reduccioacuten del contenido alcohoacutelico de este vino pero se
ve una mayor reduccioacuten en el vino de control el cual redujo en un 394 su
contenido alcohoacutelico desde el dia 0 hasta el diacutea 15 este vino no tiene ninguacuten
compuesto contra la levadura BrettanomycesDekkera y por su elevada presencia
en los 15 diacuteas de experimento consumioacute esta cantidad de etanol
Mientras en el vino que conteniacutea SO2 tras 15 diacuteas de tratamiento se vio una
reduccioacuten de alcohol de 1 ya que este compuesto redujo la cantidad de
BrettanomycesDekkera en los primeros diacuteas de tratamiento previniendo su
reproduccioacuten y protegiendo el contenido alcohoacutelico del vino Babic 2007
En los vinos de prueba con Antibrett reg la reduccioacuten alcohoacutelica se dio en un
porcentaje de 122 un poco maacutes alta que con SO2 y mucho maacutes baja en
comparacioacuten del vino de control este compuesto tambieacuten previno la gemacioacuten de
la levadura evitando la perdida de etanol en el vino sin embargo como este
compuesto duro mas en este proceso de eliminar BrettanomycesDekkera se
produjo una mayor peacuterdida alcohoacutelica
62
Figura 9 Comportamiento del contenido de acidez volatil en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin
adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
Debido a la presencia de oxigeno en los frascos la acidez volaacutetil aumento pero no
significativamente en las muestras No hubo grandes diferencias entre las
muestras con compuestos y las de control por lo que se deduce que estos
compuestos no ayudan a evitar esta acidez Esta acidez tan alta puede dantildear la
calidad del vino de forma casi irreparable Pero el factor oxigeno es de los maacutes
controlados en la produccioacuten de vinos
la alteracioacuten del aumento de la acidez volaacutetil no estaacute relacionada con la levadura
BrettanomycesDekkera sino a la presencia de oxigeno en el almacenamiento el
oxigeno fue usado en esta prueba para promover condiciones apropiadas para el
desarrollo de la levadura
002040608
112
Acidez Volatil
Day 0 Day 15
63
Figura 10 Comportamiento del contenido de Acido Acetico en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin
adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
Brettanomyces Dekkera son productores de aacutecido aceacutetico y elevan el contenido
de los vinos anormalmente en condiciones de anaerobiosis En condiciones de
aerobiosis producen concentraciones bajas o nulas de aacutecido aceacutetico
Este acido aceacutetico al igual que los fenoles afecta el sabor y el perfil olfativo del
vino tinto este efecto es tambieacuten producido por la levadura
BrettanomycesDekkera vemos en los resultados el gran crecimiento de este
compuesto en el vino control el cual no tenia compouestos en contra de
BrettanomycesDekkera lo que produjo este aumento significativo del acido aceacutetico
en comparacioacuten con estos que teniacutean SO2 y Antibrettreg entre ellos la diferencia en
este compuesto es muy reducida y no significativa pues estos compuestos no
permitieron la gemacioacuten de esta levadura y esta no produjo este acido en esa gran
cantidad
A este compuesto se le atribuye el olor y sabor a vinagre del vino tinto un defecto
muy comuacuten y poco agradable para el consumidor
105110115120125130135140
Acido Acetico
Day 0 Day 15
64
Figura 11 Comportamiento del contenido de Azucares reductores en vino Babic 2007
desde el diacutea 0 (sin adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en
comparacioacuten con el vino de control
BrettanomyesDekkera utiliza los azucares residuales como fuente de carbono
para su crecimiento en el vino este es el factor maacutes importante para su desarrollo
y este es el que determina en cierto caso la cantidad de levaduras de
BretanomycesDekkera presente en las graficas se determina claramente que en
el vino de control donde la cantidad de esta levadura es muy alta 15 diacuteas despueacutes
de empezar las pruebas la cantidad de azucares reductores es muy baja y ha
bajado en un porcentaje de 10 mientras que el vino que tiene SO2 bajo la
cantidad de azucares reductores en un 042 y el vino que tiene el compuesto
Antibrettreg redujo su nivel de azucares reductores en 462
38
4
42
44
46
48
5
Azucares Reductores
Day 0 Day 15
65
84 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE
CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON
EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID
PHASE
Tabla 10 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en
vino Babic 2007 con el meacutetodo propuesto
Compuesto Tiempos de
retencioacuten (min)
Acetaldehiacutedo 1437
Propanol 3759
Diacetil 4202
Etil-acetato 4523
i-butanol 6232
Acido Aceacutetico 7840
i-amil alcohol 11740
n-amil 13489
lactato de etiacutelico 15741
acetato amil metiacutelico 17796
1-hexanol 19101
etil-hexanol 24456
Linalol 30370
2-feniletanol 32768
p-cresol 33522
octanoato de etilo 34226
4-etilfenol 37100
2-feniletil acetato 32769
4-etilguayacol 39704
4 vinilfenol 40529
decanoato de etilo 42117
Refirieacutendose a estos resultados es necesaria la creacioacuten de soluciones estaacutendar
para determinar tiempos de retencioacuten con el meacutetodo y si es necesario ajustes a
este
66
Tabla 11 Soluciones estaacutendar para compuestos en vinos tintos Croatas
MODEL 0
(en volumen de 100 ml en 40 Etanol)
Compuesto Pureza Cantidad
(g)
Concentracioacuten (gl)
Acetaldehiacutedo 099 1623 160677
Propanol 0995 13849 137718
Diacetil 098 01071 104958
Etil-acetato 0995 30172 3002114
i-butanol 099 15016 1486584
Acido Acetico 0995 0 0
i-amil alcohol 099 20116 1991484
n-amil 098 15442 1513316
lactato de etilio 098 00507 049686
acetato amil metilico 098 01028 100744
1-hexanol 098 00367 035966
etil-hexanol 098 00308 029876
Linalol 097 00288 027936
Nerol 097 00311 030478
Citronelol 098 0031 03038
Geraniol 098 15803 1548694
2-feniletanol 098 00402 039396
4-etilfenol 098 00812 078764
octanoato de etilo 097 00597 059103
2-feniletil acetato 099 00315 031185
4-etilguayacol 098 00803 079674
Fuente Laboratorio de anaacutelisis e investigacioacuten de bebidas Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea
de Alimentos Universidad de Zagreb Zagreb Croacia 2009
Las soluciones estaacutendar se realizan teniendo como referencia las cantidades de
estos compuestos en los vinos tintos croatas datos suministrados por el Doctor
Leo Gracin en concentraciones de gl a partir de este dato y teniendo en cuenta
67
la pureza de los compuestos que se teniacutean en el laboratorio de anaacutelisis e
investigacioacuten de bebidas se crean las soluciones estaacutendar Ejemplo
Solucioacuten estaacutendar para 4 etil-fenol en un volumen de 100 ml
Con estas soluciones estaacutendar se realizo el tiempo de retencioacuten para corroborar el
meacutetodo Los resultados de esto fueron tiempos de retencioacuten diferentes a los del
meacutetodo primero con el que se realizaron los ensayos y a partir de esos resultados
se ajusto el meacutetodo con el que se trabajo
68
Tabla 12 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en
vino Babic 2007 con el meacutetodo modificado
Compuesto Tiempos de
retencioacuten (min)
Acetaldehiacutedo 1542
Propanol 4046
Diacetil 4733
Etil-acetato 4807
i-butanol 6659
Acido Acetico 8343
i-amil alcohol 12123
n-amil 13866
lactato de etilio 16072
acetato amil metilico 18336
1-hexanol 19447
etil-hexanol 24835
Linalol 31831
2-feniletanol 33305
p-cresol 33703
octanoato de etilo 34571
4-etilfenol 37724
Citronelol 38326
Nerol 38576
2-feniletil acetato 39012
Geraniol 39944
4-etilguayacol 40271
4 vilifenol 41168
decanoato de etilo 42657
69
DIA 0
Se coloca ISTD a todas las muestras respectivas para poder determinar
cantidades de los compuestos aromaacuteticos
Se realiza la cromatografiacutea de gas al vino Babic 2007 antes de ser inoculado con
BrettanomycesDekkera
Tabla 13 Resultados de la cromatografiacutea de gas del vino Babic 2007
Compuesto Tiempo de retencioacuten
min
Cantidad
mgl
Acetaldehiacutedo 1542 0
Propanol 4046 0
Diacetil 4733 37215204
Etil-acetato 4807 0
i-butanol 6659 0
Acido Aceacutetico 8343 2817465
i-amil alcohol 12123 16799019
n-amil 13866 26
lactato de etiacutelico 16072 10983961
acetato amil metiacutelico 18336 0185196
1-hexanol 19447 264655
etil-hexanol 24835 0158751
Linalol 31831 0
2-feniletanol 33305 4235560
p-cresol 33703 1
octanoato de etilo 34571 0152412
4-etilfenol 37724 00581345
Citronelol 38326 00439729
Nerol 38576 00344799
2-feniletil acetato 39012 00407983
Geraniol 39944 0
4-etilguayacol 40271 0
4 vilifenol 41168 0
Decanoato de etilo 42657 00190144
70
Basados en los compuestos aromaacuteticos que brinda el ldquoCaraacutecter Brettrdquo se van a
analizar detalladamente los siguientes aromas 4-Etilfenol 4-Etilguayacol 4-
Vinylfenol
Figura 12 Compuestos aromaticos en vino tinto Babic sin estar contaminado con la levadura
BrettanomycesDekkera
El vino a analizar esta por debajo de las concentraciones consideradas como
perjudiciales para el aroma del vino tinto (El umbral sensorial del 4-etilfenol es de
230 μgl y el del 4-etilguaiacol es de 47 μgl) pues posee una concentracion de
58microgL de 4etilfenol 0 microgL de 4 etilguayacol y 0 microgL de vinylfenol
841 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGUacuteN TEMPERATURAS
DE ALMACENAMIENTO
0
02
4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinylfenol
Vino 00581345 0 0
C (
mg
L)
Vino Babic 2007 Dia 0
71
Tabla 14 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el
ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 20C por 4 diacuteas Prueba por duplicado
MUESTRAS INCUBADA A 20C
Compuesto Day 1
Amount
(mgL)
Day 2
Amount
(mgL)
Day 3
Amount
(mgL)
Day 4
Amount
(mgL)
4-etilfenol 0260244 017294 0177547 020156
4-etilfenol 0260244 0245915 0204542 0262499
4-etilguayacol 0 0 0 0
4-etilguayacol 0 0 0 0
4 vinilifenol 1107096 781349 685317 460323
4 vinilifenol 1107096 1297465 621324 693225
72
Figura 13 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
BrettanomycesDekkera es la levadura responsable de la produccion de 4-etil-
fenol compuesto asociado con olores caracteristicos a ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 00581345 0260244 0172935 0177547 020156
C (
mg
L)
4 etilfenol
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 00581345 0260244 0245915 0204542 0262499
C (
mg
L)
4 etilfenol
73
caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo dantildeando la calidad sensorial del vino tinto Babic la
produccioacuten de este compuesto en esta muestra realizada por duplicado fue
ascendente y tuvo incremento muy grande en el primer dia de almacenamiento y
en el transcurso de los siguientes cuatro diacuteas se mantuvo relativamente estable lo
cual no concuerda con el comportamiento tiacutepico de esta levadura quien tiene un
crecimiento lento e incrementa la produccioacuten de fenoles con su gemacioacuten esto
genera muchas dudas sobre el buen funcionamiento del equipo GC o de la
estabilidad de las levaduras BrettanomycesDekkera en este almacenamiento
Figura 14 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar prueba por duplicado
002040608
1
Vino Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0 0 0
4 etilguayacol
002040608
1
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0 0 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
74
Presencia negativa de 4 etil guayacol durante todo el almacenamiento
probablemente las condiciones de almacenamiento y el medio no dieron lugar al
desarrollo de este compuesto el cual se considera menos conflictivo que el 4-etil-
fenol
Figura 15 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
Estos resultados tambieacuten dejan dudas del normal comportamiento de dicha
levadura pues indican que la levadura no convirtioacute este compuesto en etilfenol
0
2
4
6
8
10
12
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 110709781349685317460323
4 vinylfenol
0
2
4
6
8
10
12
14
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
Series1 0 11071 12974 62132 69322
C (
mg
l)
4 Vinylfenol
75
durante el almacenamiento caracteriacutestica que solo la levadura
BrettanomycesDekkera puede realizar se ve que las concentraciones de
vinylfenoles son mucho mas altas que las de fenoles lo que nos deja determinar
que la poblacioacuten de BrettanomycesDekkera es muy baja y existen otras levaduras
productoras de vinylfenoles en este tipo de vino en las condiciones de
almacenamiento dadas para estas pruebas
Tabla 16 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el
ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 28C por 4 diacuteas
MUESTRA 2 INCUBADA A 28C
Compuesto Day 1
Amount
(mgL)
Day 2
Amount
(mgL)
Day 3
Amount
(mgL)
Day 4
Amount
(mgL)
4-etilfenol 0260244 019612 0186614 019932
4-etilfenol 0260244 020576 0214917 0193554
4-etilguayacol 0 014304 0223836 0
4-etilguayacol 0 002287 00529832 0
4 vinilifenol 1107096 787068 665182 397847
4 vinilifenol 1107096 284389 00204392 0
76
Figura 16 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar
El desarrollo de este compuesto en el diacutea 1 fue significativo y luego relativamente
estable el comportamiento fue similar en las pruebas de diferentes temperaturas
de almacenamiento para este compuesto el cual es el maacutes problemaacutetico en la
industria viniacutecola
0
005
01
015
02
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 005813019932018661019611019932
4 etilfenol
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 005813 019355 021491 020576 026024
4 etilfenol
77
Figura 17 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar
Los resultados de la prueba son poco confiables y no entendibles por lo que
podemos verificar que el GC no estaacute trabajando de forma adecuada para la
deteccioacuten del compuesto
0001002003004005006
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 Etilguayacol 0 0 0022 0053 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
0005
01015
02025
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0223 0143 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
78
Figura 18 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
El comportamiento de este compuesto en la prueba es muy irregular y poco
confiable
0
2
4
6
8
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 397847665182787068397847
4 vinylfenol
0
2
4
6
8
10
12
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 11071 28438 00204 0
4 vinylfenol
79
Figura 19 Comportamiento del compuesto 4 etilfenol durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
La concentracioacuten de 4 etil fenol fue mayor al cuarto diacutea almacenado a
temperatura ambiente de 20C pero este compuesto no tuvo una actividad notoria
de ascenso durante su almacenamiento como se esperaba lo que deja muchas
dudas sobre los resultados de este ensayo
0
05
1
15
2
25
3
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etil fenol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 20C
80
Figura 20 Comportamiento del compuesto 4 etil guayacol durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
Comportamiento anormal del compuesto no se ve tendencias de aumento o
disminucioacuten de este en ninguna de las pruebas no tiene un comportamiento
regular pues se esperaba que la levadura BrettanomycesDekkera
descarboxinizara el compuesto 4-vinilguaiacol y aumentar las concentraciones de
4-etilguaiacol esta reaccioacuten no se hizo notoria en los compuestos aromaacuteticos
seguacuten lo determino el Cromatografo de Gas (GC)
0
005
01
015
02
025
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3
C (
mg
L)
4 etil guayacol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 20C
81
Figura 21 Comportamiento del compuesto 4 Vinyl fenoll durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
La no presencia de este compuesto en el vino original demuestra las baja o casi
nula presencia de la levadura BrettanomycesDekkera al diacutea primero este
compuesto incrementa de forma notoria en las muestras debido a la presencia de
acido cumaacuterico en el medio ya que sufre su carboxilacion convirtieacutendose en 4 vinyl
fenol sin embargo su comportamiento no fue regular y presento problemas de
lecturas
0
2
4
6
8
10
12
14
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
C (
mg
L)4 Vinyl fenol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 28C
82
9 CONCLUSIONES Y
RECOMENDACIONES
91 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO
Se desarrolloacute un medio selectivo soacutelido para BrettanomycesDekkera
accesible y faacutecil de elaborar
Se detectan colonias de la levadura BrettanomycesDekera en el agar
selectivo con glucosa como fuente de carbono en un lapso de 5 diacuteas en
incubacioacuten a 28C
El medio selectivo soacutelido con Glucosa como fuente de carbono fue maacutes
raacutepido y efectivo ya que toma 5 diacuteas para dar resultados positivos frente al
de Etanol como fuente de carbono el cual toma 10 diacuteas para mostrar
resultados positivos aunque ambos dieron resultados satisfactorios en la
selectividad de la levadura BrettanomycesDekkera
La levadura se adapto de forma satisfactoria a estos medios en
condiciones de almacenamiento propias para su desarrollo (28C)
Las colonias de la levadura BrettanomycesDekkera tiene un crecimiento
en estos medios soacutelidos de forma circular con topografiacutea convexa y borde
entero dimensiones 5-6 mm color Amarillo opacicidad oscuro
83
superficie lisa y suave siendo faacutecil de identificar y realizar los conteos
necesarios
El medio solido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten
de la levadura BrettanomycesDekkera en vino tinto es raacutepido econoacutemico
y uacutetil
El uso de azucares para fermentacioacuten de la levadura
BrettanomycesDekkera que Saccharomyces no puede fermentar para
mayor selectividad
Realizacioacuten de pruebas Bioquiacutemicas como meacutetodo raacutepido de selectividad
92 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DESARROLLO DEL MEDIO LIacuteQUIDO
Se desarrollo un medio selectivo liquido para BrettanomycesDekkera
accesible y faacutecil de elaborar
Este medio mostroacute resultados positivos de la presencia de
BrettanomycesDekkera en un lapso de tiempo menor (3 diacuteas) que con el
medio solido (5 diacuteas) en caso de que el nuacutemero de ceacutelulas de la levadura
BrettanomycesDekkera sea mayor a la poblacioacuten critica (103)
Cuando la poblacioacuten de ceacutelulas de la levadura BrettanomycesDekkera es
menor a la poblacioacuten critica el tiempo de identificacioacuten de esta levadura por
medio liquido es muy prolongado puede tomar maacutes de 10 diacuteas o incluso no
detectarlo
84
Los compuestos quiacutemicos usados para el desarrollo del medio liacutequido no
son los adecuados para este tipo de medios donde los resultados positivos
son olfativos pues estos compuestos emiten fuertes olores que confunden
los olores caracteriacutesticos del caraacutecter Brett
El medio liquido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten
de altas concentraciones de la levadura BrettanomycesDekkera en vino
tinto es raacutepido econoacutemico y uacutetil
93 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg
EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE DALMACIA
CROACIA
Este trabajo mostroacute que el dioacutexido de azufre (SO2) tiene buenos resultados
en contra de la levadura BrettanomycesDekkera en concentraciones
normales de 40mgl concentracioacuten en la que se trabaja este compuesto en
los vinos tintos
En Europa el dioacutexido de azufre es usado de forma tradicional en gran
nuacutemero de alimentos y especialmente en vinos sin embargo y a pesar de
su uso regulado se busca la sustitucioacuten de este o su maacutexima reduccioacuten
para hacer de este producto maacutes sano para las personas no tolerantes a
este tipo de compuestos sin embargo seguacuten el trabajo realizado en
comparacioacuten con el producto Antibrettreg el SO2 es maacutes eficaz en el control
85
de la levadura ayudando a evitarla y eliminarla de la cadena productiva del
vino tinto
Gracias a sus caracteriacutesticas el vino tinto Babic es muy vulnerable a la
levadura BrettanomycesDekkera pero a su vez se puede tratar faacutecilmente
con productos como SO2 y Antibrettreg aunque es maacutes efectivo contra
BrettanomycesDekkera el dioacutexido de azufre (SO2)
Antibrettreg es una buena opcioacuten para el control de BrettanomycesDekkera
para evitar el uso de productos alergenicos como SO2
94 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN
EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO
MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE
Al terminar la primera prueba con anaacutelisis en cromatografiacutea a gas y el SPME
queda como resultados
Es necesario repetir la prueba
No se determina el efecto de los estaacutendares internos sometidos a tiempos
de almacenamiento en temperaturas de 20C y 28C lo que puede dar falsos
resultados de cantidades de compuestos
86
Se debe crear un medio maacutes apto para el desarrollo de la levadura y un
control diario de crecimiento ( agregar maacutes Glucosa en caso de que se
haya consumido toda controlar presencia de Bacterias y otros
microorganismos que no se deseen en el medio)
Es necesario control de aromas con panel sensorial para determinar el
umbral de deteccioacuten en este vino
Control de crecimiento por medio solido Selectivo para
BrettanomycesDekekra conteo de colonias presentes en el vino inoculado
y su desarrollo durante almacenamiento a diferentes temperaturas
La segunda prueba no fue posible realizarla por dantildeos en el equipo de
cromatografiacutea de gas (GC)
87
ANEXOS
11
89
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientiacuteficas 99 Grupos de
Investigacioacuten Enoloacutegica Zaragoza Espantildea
93
11
GRACIAS es una palabra corta para todo lo que quiero expresar a todos aquellos que
hicieron parte de este suentildeo hecho realidadhellip
A Dios y a la virgen Auxiliadora por llevarme de su mano cada diacutea de mi carrera en cada
momento alegre y en cada momento difiacutecil fueron mi fortaleza
A mis papitos por hacer de mi estudio una realidad por su sacrificio y apoyo desinteresado y
sincero
A mi Hermanito por ser mi fortaleza mi ejemplo y mi amigo incondicional
A mi familia Blanco y Urrea por su compantildeiacutea durante esta etapa
A mi facultad (Decano Dr Camilo Rozo Dra Patricia Jimeacutenez y mis profesores) por
ensenarme mi profesioacuten y aportar lo mejor de ustedes para mi formacioacuten personal
A mis asesores de Tesis (Ing Patricia Chaparro y Dr Sc Leo Gracin) por su guiacutea y
colaboracioacuten oportuna
A mis queridos amigos quienes siempre han estado a mi lado en las dificultades y en las
alegriacuteas (Ingrid Mafe Cami G Cami R Harold Pipe Karla Andreacutes T Diego G)
A IAESTE en alianza con el ORI por hacer posible mi intercambio y poder hacer mi tesis en el
maravilloso paiacutes de Croacia
A Croacia por ser mi segundo hogar por abrirme sus puertas y su corazoacuten por brindarme
tan maravillosas personas en mi camino
Croatia Thank you for being my second home for opening your doors and your heart to me
and give me the opportunity to meet so many wonderful people
To my boss my teacher my mentor and specially my friend Leo
To the faculty of food technology and Biotechnology and the department of technology
and analysis of beverages for give me the opportunity to give all my knowledge to the
project and learn a lot more
To all the amazing people I met during this experience (Igor Karin Natka Josip Ana Matija
Daniel Pz Szilvia Dini Daniela Lidija Sanja and everybody else who I had the pleasure to
meet in this great trip) for give me the best of your hearts
I only have one thing to say hellipTHANK YOU
Solo me queda una palabra por decirhellipGRACIAS
6
RESUMEN Este estudio presenta el desarrollo y evaluacioacuten de simples meacutetodos para la deteccioacuten de
la levadura BrettanomycesDekkera en vino y su medio de produccioacuten con el uso de
medio solido y liquido selectivo ademaacutes se evaluacutea el efecto del Dioacutexido de Azufre SO2 y
AntiBrettreg en vino tinto de la regioacuten de Dalmacia Croacia El meacutetodo de deteccioacuten de
esta levadura emplea medios selectivos enriquecidos los cuales contienen Glucosa (20
grl) en comparacioacuten con Etanol (6ml l) como fuentes de carboacuten y energiacutea cicloheximida
(30 grl) para prevenir la presencia de Sachharomyces ampicilina (10 mgL) como
antibioacutetico para prevenir el crecimiento de bacterias y acido p-cumaacuterico (100 mgL) como
precursor de la produccioacuten de 4-etilfenol para el medio solido el uso de agar se realiza
en una concentracioacuten de 16 grL Despueacutes de la siembra realizada en los medios (solido y
liquido) de vino contaminado con la levadura BrettanomycesDekkera es monitoreado
diariamente micro y macroscoacutepicamente
Una muestra de vino tinto Babic de Croacia fue contaminado con colonias de la levadura
BrettanomycesDekkera y fue dividido en 8 muestras de las cuales 2 de estas fueron
monitoreadas como control sin adicioacuten de ninguacuten compuesto 2 con adicioacuten de dioacutexido de
azufre SO2 en una concentracioacuten de 40mgL y 4 de estos con AntiBrettreg en una
concentracioacuten de 40grHl El meacutetodo de este estudio se basa en la determinacioacuten del
comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en estas condiciones Este se
evaluoacute en teacuterminos de crecimiento de la citada levadura (UFCml) presentes en las
muestras y anaacutelisis fisicoquiacutemicos antes y despueacutes de 15 diacuteas de adicioacuten y monitoreo
7
ABSTRACT
This experiment presents the development and testing of a simple way to detect
BrettanomycesDekkera from wine and wine environments using selective media in solid
phase and liquid phase and the influence of Sulfur Dioxide (SO2) and Antibrett reg in red
wines from Dalmatian region The method of detection of this yeast employs selective
enrichment mediums These mediums contains glucose (20gl) and Ethanol (6) as
carbon and energy source cycloheximide (30 mgl) to prevent growth of Sachharomyces
ampicilin (10 mgl) to prevent growth of bacteria and p-coumaric acid (100 mgl) as a
precursor of the production of 4-etilphenol depending on the phase of the medium agar
compound is used in a concentration of 16 grl After putted on the medium wine
contaminated with BrettanomycesDekkera is monitored by micro and macro inspection
also with the liquid medium
A red wine from Dalmatian region was contaminated with BrettanomycesDekkera colonies
and divided in 8 different containers from these 8 containers we had two for control no
addition two with addition of Sulfur Dioxide (SO2) in a concentration of 40 mgl and four of
them with Antibrett reg in a concentration of 40gHl The method for this study is based in
following the behavior of the yeast BrettanomycesDekkera with these compounds in this
wine this behavior was monitored based in CFUml showing in the samples and physic
and chemical analysis before addition and 15 days after
8
INTRODUCCION
Las levaduras del geacutenero Brettanomyces o su forma telemoacuterfica (nombre que
reciben las especies que presentan reproduccioacuten sexual y en consecuencia
formacioacuten de esporas por meiosis) Dekkera fueron descritas por primera vez por
Claussen en 1903 en la produccioacuten de cerveza1
Este geacutenero se conoce desde hace tiempo como agente contaminante en la
industria cervecera de la sidra y de bebidas carbonatadas2 En la industria
enoloacutegica su descripcioacuten como alterante es maacutes reciente
Durante los antildeos 1950s muchos autores reportaron el aislamiento del genero
Brettanomyces en uvas francesas e italianas (Van der Walt y Van der Kerken
1958) Sin embargo en muchas regiones del mundo viniacutecola esta levadura no ha
sido identificada lo cual dificulta su deteccioacuten en materiales o productos
contaminadosEntre todos los microorganismos la levadura
BrettanomycesDekkera es una de las maacutes temidas por los vinicultores El
crecimiento y desarrollo de esta levadura causa alteraciones denominadas
ldquocaraacutecter Brettrdquo lo cual ocurre especialmente en vinos tintos3
1 Gilliland R Brettanomyces I Occurrence characteristics and effects on beer flavor J Inst Brew
1961
2 Deak T y Beuchat LR Handbook of spoilage yeast CRC Press Nova York 1996
3 Heresztyn T Archives of Microbiology 1986 Metabolism of phenolic compounds from
hydroxycinnamic acids by Brettanomyces yeast
9
El ldquocaraacutecter Brettrdquo produce un amplio espectro de sabores y aromas alterantes
entre los cuales estaacuten corral minerales tinta tabaco cuero faacutermacos y
ahumado estas alteraciones se le atribuyen a los compuestos 4-etilfenol y 4-
etiguayacol las cuales causan una supresioacuten de aromas atractivos en el vino
como de frutas y flores y perdida de sabores agradables para el consumidor como
acido salado amargo o picante 4
Esta levadura tiene distinto comportamiento seguacuten el tipo de vino al que esteacute
asociada pues cada tipo de vino tiene diferente composicioacuten de carbonos
nitroacutegenos vitaminas y minerales
Con este estudio se evaluacutea el comportamiento y caracterizacioacuten de la levadura
BrettanomycesDekkera en vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia con
el desarrollo de medios solido y liquido para la selectividad de la levadura
alteraciones aromaacuteticas del vino tinto Babic producidas por 4 etilfenol y 4
etilguayacol y el comportamiento de BrettanomycesDekkera en el vino al ser
tratado con Dioacutexido de azufre (SO2) comparativamente con tratamiento Antibrettreg
4 Boulton Singleton Bisson amp Kunkee 1996 Descripcioacuten de aromas fenoacutelicos
10
1 MARCO TEORICO
Las levaduras representan el grupo de microorganismos maacutes importante en la
industria viniacutecola porque sin Saccharomyces producir vinos de alta calidad seriacutea
imposible Ademas de Saccharomyces hay muchos otros geacuteneros y especies de
levaduras presentes durante la vinificacioacuten que afectan la calidad del vino positiva
o negativamente5
Las levaduras comprenden 39 geacuteneros y 350 especies Se identifican y clasifican
basaacutendose en caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas Entre los aspectos
morfoloacutegicos considerados se encuentran el tamantildeo y la forma de las ceacutelulas en
medios soacutelidos y liacutequidos especificados el modo de reproduccioacuten y si forma velo
en la superficie o sedimenta en un medio liacutequido Entre las caracteriacutesticas
fisioloacutegicas consideradas se encuentra si puede crecer (y fermentar) en un
determinado carbohidrato y si puede o no utilizar determinadas fuentes de
nitroacutegeno como los nitratos6
11 REPRODUCCION
Las levaduras son agrupadas en tres familias conocidas como
Saccharomycetaceae Sporobolomycetaceae y Cryptococcaceae Estas
5 H Erten June 2002 Relations between elevated temperatures and fermentation behavior of
Kloeckera apiculata and Saccharomyces cerevisiae associated with winemaking in mixed culture
World Journal of Microbiology and Biotechnology Volume 18 N 4 pag 1 Adana Turkey 6 Cerveceros de Argentina 2006 Levadura wwwcervezadeargentinacomararticuloslevadurahtm
11
representan el grupo de microorganismos entre bacterias y hongos respecto a su
tamantildeo de ceacutelula Este grupo es caracterizado por su forma de reproduccioacuten
vegetativa conocida como ldquogemacioacutenrdquo Bajo condiciones optimas una ceacutelula
madre puede gemar varias veces durante el periodo reproductivo Sin embargo
bajo estrictas condiciones de fermentacioacuten una levadura va a gemar solamente
entre tres o cuatro veces Aquiacute la disponibilidad de oxigeno la cual es necesaria
para la formacioacuten de precursores de la membrana de la ceacutelula limita la
replicacioacuten7
Estos microorganismos muestran varios tipos de gemacioacuten lo cual puede dar un
valor diagnostico Entre aquellas aisladas de fermentacioacuten y antildeejamiento del vino
se observan maacutes frecuentemente multilateral y gemacioacuten polar 8
La modalidad maacutes comuacuten es la gemacioacuten proceso asexual en el cual la ceacutelula
progenitora emite un conducto tubular desde la vacuola nuclear hacia un punto
perifeacuterico proacuteximo a la misma Entonces se forma en la direccioacuten del conducto
una pequentildea protuberancia en la superficie externa de la ceacutelula y el conducto
pasa atravesando la pared celular a dicha protuberancia la cual se ensancha
llenaacutendose con el material citoplaacutesmico y nuclear de la ceacutelula progenitora Cuando
el brote o yema formada llega a ser casi tan grande como la ceacutelula progenitora los
aparatos nucleares de ambas ceacutelulas se orientan de forma que sus centrosomas
respectivos equidisten del punto de unioacuten Al llegar este momento la ceacutelula madre
y la ceacutelula hija se separan y se inicia la formacioacuten de nuevas ymas En la
gemacioacuten normal no se forman tabiques de separacioacuten entre ceacutelula madre y
ceacutelulas hijas pero en algunos casos el proceso se inicia en la gemacioacuten y se
completa por divisioacuten con la separacioacuten definitiva de ambos individuos La ceacutelula
madura de puede producir por gemacioacuten durante el curso de vida un promedio de
7 Brinton M Miller and Warren Litsky PhD 1976 Industrial Microbiology Edi Mac Graw Hill United States
of America
8 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures
edi Springer second edition Fresno California United States of America
12
24 generaciones de ceacutelulas hijas Las yemas sucesivas se forman siempre en
sitios diferentes de la superficie de la ceacutelula9
111 Gemacioacuten multilateral
La gemacioacuten multilateral ocurre en el ldquohombrordquo o aacuterea de la levadura donde ocurre
la reproduccioacuten La gemacioacuten y ciclo de separacioacuten crea un problema para las
levaduras durante su fase fermentativa pues en este tiempo la ceacutelula madre se
reduce aproximadamente un medio Porque la siacutentesis de la membrana celular
ocurre bajo condiciones anaeroacutebicas lo que limita los ciclos asexuales
replicativos Como resultado la mayoriacutea de las fermentaciones se completan en la
fase estacionaria (no gemacioacuten) Un ejemplo de esta reproduccioacuten es
BrettanomycesDekkera10
112 Gemacioacuten Polar
A diferencia de la gemacioacuten multilateral la gemacioacuten polar puede ocurrir en uno o
dos polos En el caso de Kloeckera y Saccharomyces la gemacioacuten ocurre en
ambos polos aumentando la poblacioacuten de levaduras con forma de ldquolimoacutenrdquo 11
113 Fisioacuten
Esta reproduccioacuten es caracteriacutesticas del genero Schizosaccharomyces donde la
formacioacuten de la ceacutelula hija ocurre sin la reduccioacuten de la madre ceacutelula como en los
casos anteriores En este caso la formacioacuten de la microscoacutepica pared celular
ocurre entre la madre ceacutelula y la hija seguida por la separacioacuten12
9 Araya Pablo 2002 Reproduccioacuten de hongos unicelulares mediante gemacioacuten esporulacioacuten y
fisioacuten httphtmlrincondelvagocomreproduccion-asexualhtml
10 11 12 Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic
Publishers GmbH United States of America and Canada
13
114 Pseudomycelium
Cualquier fabricante de vinos ha tenido la oportunidad de notar la formacioacuten de
una peliacutecula en la superficie del vino Esto surge debido a la gemacioacuten repetida de
las levaduras oxidativas y fallas en el momento de la separacioacuten de la ceacutelula hija
de la madre Con el tiempo el lazo previo entre la madre ceacutelula e hija se ampliacutea
dando la impresioacuten de filamentos como si se tratase de mohos siendo que son
levaduras 13
12 TAXONOMIA
Para distinguir las levaduras que pueden producir ascoporas de aquellas que no
los micologistas usan doble taxonomiacutea para su clasificacioacuten Desafortunadamente
la nomenclatura para la combinacioacuten anamorfotelemorfo es frecuentemente
diferente Unos ejemplos de levaduras sexualasexual o telemorfoanamorfo son
DekeraBrettanomyces Metschnikowia pulcherrimaCandida pulcherrima
Hanseniaspora uvarumKloeckera apiculata Torulaspora delbruecki Candida
colliculosa 14
Sin embargo las levaduras son diferenciadas por los taxonomistas por asignacioacuten
de varios nombres de geacutenerosespecies varios vinicultores usan un sistema
informal para agrupar levaduras basadas en su morfologiacutea u otras caracteriacutesticas
Por ejemplo a Kloeckera apiculata se le refiere como ldquolevadura apiculadardquo
tiene forma de limoacuten Esta levaduras asi com muchas otras presentes en el mosto
de la uva como lo son Candida Cryptococcus Debaryomyces Hansenula
Issatchenkia Kluyveromyces Metschnikowia Pichia y Rhodotorula tambieacuten son
llamadas levaduras ldquonativasrdquo ldquonaturalesrdquo o ldquosalvajesrdquo por su origen el vintildeedo o en
13
Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers
GmbH United States of America and Canada
14 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
14
la vinera Algunos enoacutelogos han discutido contra el uso de estos teacuterminos porque
esta implicancia no sucede en todas las levaduras ya que estas son de alguna
forma ldquono-nativasrdquo o ldquono naturalesrdquo (Ej Saccharomyces o Brettanomyces) El
teacutermino ldquono Saccharomycesrdquo es maacutes comuacuten para nombrar aquellas levaduras
presentes en el mosto de la uva que no son del genero Saccharomyces15
Las levaduras encontradas despueacutes de la fermentacioacuten alcohoacutelica tambieacuten son
asignadas a un grupo informal Algunas veces las levaduras que conducen la
principal fermentacioacuten (Saccharomyces) son muchas veces llamadas ldquolevaduras
fermentativasrdquo basados en su metabolismo Durante su antildeejamiento algunas
levaduras (Candida Hansenula y Pichia) pueden crecer en la superficie en
presencia de oxigeno Esta peliacutecula superficial es comuacutenmente asociada a
deterioro del vino esta levadura se le conoce como ldquolevadura formadora de
peliacuteculardquo16
121 DekkeraBrettanomyces
La taxonomiacutea cientiacutefica sobre BrettanomycesDekkera ha cambiado en los uacuteltimos
antildeos Brettanomyces estaacute clasificado dentro de la misma familia que
Saccharomyces (familia Saccharomycetaceae) Actualmente dentro del geacutenero
Brettanomyces se aceptan cinco especies diferentes (B bruxellensis B
anomalus B custersianus B nanas y B naardenensis)17
Las teacutecnicas de biologiacutea molecular han demostrado que B intermedious B
lambicus B custerseii o D intermedia son sinoacutenimos de B bruxellensis por lo
que estas denominaciones han quedado en desuso Los microorganismos de este
geacutenero presentan dos formas una capaz de reproducirse sexualmente (Dekkera)
15
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
16 Kurtzman CP 1998 The industrial and agricultural significance of yeasts 4
th Edition Amsterdam
Holanda
17 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
15
y otra que lo hace asexualmente (Brettanomyces) Tambieacuten se llaman
respectivamente forma perfecta y forma imperfecta En algunos casos la forma
perfecta y la imperfecta reciben nombres diferentes como ocurre con B anomalus
y D anomala En otros casos el nombre es similar como las pertenecientes a la
especie bruxellensis que pueden parecer como D bruxellensis como B
bruxellensis o como BrettanomycesDekkera A efectos praacutecticos en la bodega
estos dos estados son similares Cuando vemos referencias a Brettanomyces
como contaminante en la mayor parte de los casos se refieren a
DekkeraBrettanomyces ya que este es el responsable de las alteraciones en el
vino18 y 19
La morfologiacutea celular de BrettanomycesDekkera es ojival o ciliacutendrica con
gemacioacuten multipolar en reproduccioacuten vegetativa Una de las caracteriacutesticas de
este geacutenero es su tamantildeo celular variable y la formacioacuten de filamentos19
18 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 23
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
19
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
16
Figura 1 Microfotografiacutea de cultivo de BrettanomycesDekkera a) Variabilidad morfoloacutegica y de
tamantildeo celular b) forma filamentosa
Fuente Lopez-Cordon Eva BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia wwwacenologiacom
Los defectos sensoriales asociados directamente a Brett aparecen
mayoritariamente en vinos tintos de calidad y las causas radican en la propia
fisiologiacutea del microorganismo Ademaacutes al ser una levadura de crecimiento muy
lento la alteracioacuten se presenta principalmente durante el almacenamiento y sobre
todo la crianza del vino habitual en los vinos tintos de gama alta En las barricas
de madera el microorganismo tiene a su disposicioacuten todo el sustrato y tiempo
suficiente para realizar su actividad La naturaleza porosa de la madera y su difiacutecil
limpieza contribuye a que las poblaciones existentes se mantengan incluso
despueacutes del lavado de la barrica Ademaacutes BrettanomycesDekkera tiene la
capacidad de degradar uno de sus componentes la celobiosa 20
13 CARACTERISTICAS FISIOLOGICAS
S cerevisiae y BrettanomycesDekkera tienen metabolismos similares muy
adaptados a las condiciones de vinificacioacuten Tras la fermentacioacuten alcohoacutelica S
cerevisiae es la levadura mayoritaria debido a que las condiciones nutricionales
20
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
17
del vino son muy estrictas (altas concentraciones de etanol y bajas
concentraciones de nutrientes) En este momento BrettanomycesDekkera
continuacutea creciendo gracias a que utiliza nutrientes que S cerevisiae no ha podido
consumir sobre todo algunos azuacutecares y fuentes de nitroacutegeno21
Una de las caracteriacutesticas que diferencia a BrettanomycesDekkera es la gran
diversidad de azuacutecares que puede fermentar (ver tabla de Relacioacuten de los
principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) La mayoriacutea de
las cepas pueden crecer utilizando trealosa y celobiosa azucares presentes en el
vino y no consumibles por S cerevisiae Otra de las ventajas que presenta frente
a S cerevisiae (y frente a la mayoriacutea de las levaduras) es que puede utilizar los
nitratos como fuente de nitroacutegeno Debido a que S cerevisiae soacutelo utiliza el
nitroacutegeno amoniacal y los aminoaacutecidos libres estos se consumen con relativa
rapidez Al final de la fermentacioacuten el nitroacutegeno moniacal es escaso y se favorece
el crecimiento de las levaduras que pueden utilizar otras fuentes de nitroacutegeno
Ademaacutes Brettanomyces puede crecer con concentraciones de fosfato diamoacutenico
tan bajas como 05gl o a partir de diversos aminoaacutecidos En resumen
BrettanomycesDekkera crece maacutes despacio que S cerevisiae es resistente a
concentraciones altas de alcohol puede utilizar otros azucares como fuentes de
energiacutea y nitrato como fuente de nitroacutegeno Esto explica que pueda reproducirse
cuando la fermentacioacuten alcohoacutelica ha terminado a partir de nutrientes no
consumibles por S cerevisiae y cuando no tiene competidores22
21
Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
22 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
18
Tabla 1 Relacioacuten de los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto
Fuente Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista
VINOTEQ N 38 pag 21 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
131 BrettanomycesDekkera y siacutentesis de fenoles volaacutetiles
El origen de los fenoles volaacutetiles estaacute relacionado con la actividad secuencial de
dos enzimas que descarboxilan los aacutecidos en hidroxiestirenos (vinilfenoles) que
19
son posteriormente reducidos a etilderivados (etilfenoles)23 como puede
observarse en la figura 2
Figura 2 Siacutentesis de etilfenoles de BrettanomycesDekkera
Fuente ACE revista de Enologia wwwacenologiacom
El primer paso de descaboxilacion de los aacutecidos hidroxicinamicos es comuacuten
tambieacuten en otros microorganismos como bacterias hongos y otras levaduras Sin
embargo el segundo paso reduccioacuten de vinilfenoles es caracteriacutestico de algunos
tipos de levaduras como Dekkera bruxelliensis D anomala Pichia guillermondi
Candida versarilis C halophila y C mannitofaciens24
Los fenoles volaacutetiles que se asocian al problema Brett en vinos son el 4-etilfenol y
el 4- etilguaiacol asiacute como sus precursores intermedios 4-vinilfenol y 4-
vinilguaiacol aunque estos uacuteltimos son menos importantes por ser muy reactivos y
raacutepidamente convertidos en etilfenoles por BrettanomycesDekkera o en su caso
23
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
24 Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
20
condensan con otras moleacuteculas como antocianos25 Los etilfenoles y
especialmente elevadas concentraciones de 4-vinilfenol en vinos se asocian con
aromas desagradables asociados a descriptores como ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de
caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo26
El umbral sensorial del 4-etilfenol es de 230 μg l-1 y el del 4-etilguaiacol es de 47
μgl Pese a su menor umbral sensorial el 4-etilguaiacol responde a descriptores
como ldquobaconrdquo o ldquoahumadordquo que a bajas concentraciones aportan complejidad por
lo que se puede considerar sensorialmente menos conflitivo que el 4-etilfenol 27
Figura 3 Defectos sensoriales producidos en el vino por BrettanomycesDekkera
Fuente Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
25 Morata A Goacutemez-Cordoveacutes M Calderoacuten F Suaacuterez J 2006 Effects of pH temperature and SO2 on the
formation of pyranoanthocyanins during red wine fermentation with two species of Saccharomyces Journal Food Microbiology No106 pag 4 Madrid Espana
26 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea 27 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
21
132 Identificacioacuten de BrettanomycesDekkera
Los Bioacutelogos usan sistemas de identificacioacuten basados en similitudes taxonoacutemicas
entre organismos dichas similitudes pueden ser morfoloacutegicas tipos capacidad de
produccioacuten de sustratos como azuacutecar yo nitratos caracteriacutesticas fisioloacutegicas y
bioquiacutemicas secuencia del material geneacutetico y respuestas inmunoloacutegicas28
En la industria viniacutecola es importante recurrir a diferentes tipos de pruebas para la
identificacioacuten de microorganismos una de estas y la maacutes realizada es la revisioacuten
del microorganismo bajo el microscopio Esta prueba brinda informacioacuten sobre la
morfologiacutea del microorganismo (cocos bacilos formas puntudas ojival entre
otros) tamantildeo (dimensiones) agrupaciones celulares (solas parejas triacuteos
grupos o cadenas) Sin embargo el uso del microscopio es una prueba raacutepida
para examinar mostos o vino pero no determina cantidades que muchas veces es
requerido para tratamientos de accioacuten otro de los inconvenientes es que los
microorganismos pueden variar su morfologiacutea en forma o tamantildeo dependiendo de
la edad y las condiciones de crecimiento por lo que puede no ser clara la
identificacioacuten de este29
14 Medios soacutelidos selectivos
Si se requiere de la confirmacioacuten del microorganismo este debe ser aislado del
vino para una caracterizacioacuten para esto se requiere de medios soacutelidos Cuando se
examina un microorganismo en un medio solido es importante revisar las
caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias (ver figura 4 Morfologiacuteas de colonias
en medios soacutelidos) Entre estas caracteriacutesticas estaacuten forma (circular irregular o
2829 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
22
rizada) tamantildeo (dimensiones estas normalmente se expresan en miliacutemetros)
topografiacutea (plano elevado convexo coacutencavo o embonado) presencia de
pigmentos opacidad (transparente traslucido u opaco) superficie (suave rugosa
lisa o aacutespero) bordes (entero ondulado crespo dentado rizado) o cualquier
cambio en el agar (color opacidad cambios en los indicadores de pH o CaCO3
respectivamente)30
Figura 4 Varias morfologiacuteas de crecimiento de colonias en medio solido
Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007
Gran nuacutemero de medios selectivos se han creado para la aislacioacuten deteccioacuten yo
conteo de levaduras provenientes de jugos de uva mostos o vinos El medio maacutes
utilizado en estos fines es YPD (Yeast Peptone Dextrose) pero dicho medio no
es selectivo entre levaduras y se usa comuacutenmente para el conteo de
Saccharomyces31 Las colonias empiezan a parecer con un periodo de incubacioacuten
30
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
31 Essia Ngang J Wolniewicz E Villa P2005 Stimulation of lactobacilli during alcoholic fermentation action
of sucrose hydrolysis by yeast Biotechnology letters No 8 pag 743 Amiens France
23
de 2 a 4 diacuteas a 22C a 25C Igualmente el agar de jugo de uva es no selectivo y
presenta faacutecil crecimiento de levaduras bacterias y mohos
Para la levadura Brettanomyces Dekkera se han elaborado diferentes medios
selectivos entre ellos el maacutes conocido es WL por sus siglas en ingles del
laboratorio que lo creo ldquoWallerstein Laboratoriesrdquo este medio contiene
cicloheximida compuesto selectivo para Brettanomyces e inhibe Saccharomyces
El punto criacutetico es encontrar la cantidad exacta de este compuesto para la
inhibicioacuten de las levaduras sin que afecte a BrettanomycesDekkera32
Ademaacutes del medio WL BrettanomycesDekkera puede ser cultivado en otros
medios selectivos como Brettanomyces medio A creado por Vilas en 1993
Brettanomyces medio B el cual contiene cicloeximida como agente selectivo
mientras que Brettanomyces medio C tiene cicloheximida y ampicilina este medio
fue creado por B Watson en 1998 Brettanomyces medio D fue creado
recientemente por Rodrigues en 2001 este medio es conocido como DBDM
(DekkeraBrettanomyces differential medium ) es un medio selectivo para
Brettanomyces en contra de Saccharomyces y otras levaduras este medio es el
maacutes utilizado en la vineras para caracterizacioacuten de BrettanomycesDekkera
actualmente33
15 Dioacutexido de azufre (SO2) en vinos
32
33
Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers
GmbH United States of America and Canada
24
El dioacutexido de azufre tambieacuten llamado oxido de azufre es un eficaz agente
conservante antioxidante y antimicrobiano en la industria viniacutecola34
Durante la vinificacioacuten SO2 ha representado histoacutericamente una herramienta muy
importante usada por los vinicultores para el control de crecimiento microbioloacutegico
Debido a preocupaciones por la salud del consumidor el uso de este producto ha
disminuido dramaacuteticamente con el posible riesgo de aumentar el riesgo
microbioloacutegico35
El actual liacutemite legal de SO2 en vinos en los Estados Unidos es de 350mgL una
concentracioacuten mucho mayor a la usada en la industria viniacutecola No obstante vinos
que contienen maacutes de 10mgL deben declarar este compuesto en la etiqueta
porque SO2 es un metabolito que las levaduras usan durante la fermentacioacuten Los
vinos siempre contienen algo de sulfitos aunque la adicioacuten no se realice durante el
proceso36
151 Formas del Dioacutexido de Azufre (SO2)
Una vez disuelto en agua el dioacutexido de azufre existe en equilibrio entre SO2
molecular (SO2H2O) bisulfito (HSO3) y sulfito (SO32-) Este equilibrio depende del
pH Ademaacutes de estar en equilibrio con el molecular y especies sulfito el bisulfito
tambieacuten existe en forma ldquolibrerdquo y en forma ldquoatadardquo Aquiacute la moleacutecula reaccionara
34
Orwine Eureka 2008Investigadores europeos buscan alternativas al dioxido de azufre en vinos
httpawprowordpresscom20081107investigadores-europeos-buscan-alternativas-al-dioxido-de-
azufre-en-el-vino
3536 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
25
con compuestos carbonilos (ej Acetaldehiacutedo) formando productos adicionales
como Acido Hydroxysulfonico 37
Ademaacutes de Acetaldehiacutedo algunas moleacuteculas presentes en el jugo de uva que
reaccionan con bisulfito son acido piruvico α-keto-glutaric dihidroxyacetona
diacetyl Pigmentos de antocianinas entre otros38
152 Inhibidor Microbiano
El sulfuro molecular es la forma antimicrobiana del dioacutexido de azufre La cantidad
de SO2 molecular presente en cualquier vino no se mide directamente La
concentracioacuten es calculada conociendo la concentracioacuten de SO2 libre y el pH del
vino basaacutendose en la siguiente foacutermula
Alternativamente la figura 5 Se puede utilizar como guiacutea para aproximar la
cantidad de SO2 libre necesitada a determinado valor de pH de valores entre 05 o
08 mgl de SO2 molecular 39
El SO2 inhibe microorganismos de varias formas incluyendo rupturas de puentes
bisulfitos en proteiacutenas y reaccionando con coofactores como NAD+ y FAD tambieacuten
reacciona con ATP
3739
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
38 Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi
Springer New York United States
26
Figura 5 Cantidades de SO2 libre a un pH determinado para obtener 05 o 08 mgl de SO2
molecular
Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007
La concentracioacuten de SO2 molecular necesario para prevenir el crecimiento de
microorganismos variacutea seguacuten vinojugo pH temperatura poblacioacuten densidad y
diversidad estado de crecimiento grado de alcohol entre otros factores Beech
1979 sugirioacute una adicioacuten de 08 mgl de SO2 molecular como la cantidad
necesaria del compuesto en vinos blancos de mesa para dar una reduccioacuten de
cerca de 104 UFCml de la poblacioacuten de diferente tipo de microorganismos en 24
horas Las diferencias que existen entre las levaduras y bacterias en base a la
27
sensibilidad a este compuesto son dadas a conocer por diferentes autores (Warth
1977 1985 Du Toit 2005 Davis 1988 Hood 1983)40
16 Antibrettreg como alternativa de prevencioacuten y eliminacioacuten de
BrettanomycesDekkera
Antibrettreg es un producto nuevo creado por Spindal SARL-Gretz - Armainvilliers
Francia Es una preparacioacuten enzimaacutetica para inactivar Brettanomyces y para
reducir olores producidos por fenoles volaacutetiles41
Antibrettreg es preparado a base de paredes celulares de levadura activados
enzimaacuteticamente que presentan elevadas propiedades adsorbentes frente al 4-
etilfeno y 4- etilguayacol compuestos asociados con olores desagradables en el
vino tales como sudor de caballo farmacia o barniz42
Antibrettreg inhibe la produccioacuten de la vinilreductasa que participa en la
transformacioacuten de los aacutecidos cinaacutemicos naturalmente presentes en los vinos en
los correspondientes derivados etilados responsables de los olores atribuidos a
BrettanomycesDekkera 43
40
Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi
Springer New York United States
41 Manual de instrucciones de producto Antibrett reg producido por Spindal SARL-Gretz -
Armainvilliers France
424344 AEB Group 2008 ANTIBRETT Preparado a base de paredes celulares de levadura para la inactivacioacuten
de Brettanomyces y la eliminacioacuten de los olores de estos productos httpwwwaeb-
groupcomimgsSPAGNOLODepliantANTIBRETT-lett-ESPpdf
28
El uso de Antibrettreg es efectivo incluso contra otros olores anoacutemalos como los
que se generan en las barricas sucias principalmente huacutemedas dantildeando la
calidad olfativa del vino44
29
2 PROBLEMA
La levadura BrettanomycesDekkera es una levadura de contaminacioacuten presente
en la mayoriacutea de industrias viniacutecolas en el mundo Afecta directamente la
produccioacuten y calidad sensorial de los vinos con el desarrollo de los compuestos 4
etilfenol y 4 etilguayacol los cuales dantildean el perfil olfativo del vino dando aromas
caracteriacutesticas a ldquoestablordquo ldquocuerordquo ldquosudor de caballordquo o ldquobarnizrdquo conocido como
ldquocaraacutecter Brettrdquo
Esta contaminacioacuten se da especialmente en los vinos tintos debido a sus
caracteriacutesticas de produccioacuten (fermentacioacuten crianza antildeejamiento) y sus
propiedades fisicoquiacutemicas (Grado alcohoacutelico pH Acidez total Acidez volaacutetil
entre otros)
En Croacia existe una gran produccioacuten de vinos tintos entre los cuales se
encuentra el vino tinto Babic proveniente de la isla de Hvar el cual es famoso por
ser un vino duro carnoso estructurado y casi sobre-maduro con un grado
alcohoacutelico que ronda los 15 vv siendo la primera denominacioacuten de origen que
se aproboacute en Croacia en el antildeo 1961 este vino es de gran importancia en la
regioacuten la mayoriacutea de sitios de elaboracioacuten son pequentildeas industrias que han sido
afectadas por el bdquocaraacutecter Brett‟ Muchas investigaciones se han realizado al
respecto de la levadura BrettanomycesDekkera pero se conoce muy poco sobre
sus efectos en el vino Babic debido a sus caracteriacutesticas particulares (alcohol
30
15 pH 35 Acidez total 520 gr Acido TartaricoL Acidez volaacutetil 08 gr Acido
AceticoL Azucar residual 47 grLt)45
La dificultad de la pequentildea industria para acceder a productos que lleven a la
identificacioacuten de la levadura mencionada y de esta manera conllevar a planes de
accioacuten contra el ldquocaraacutecter Brettrdquo es una de las grandes dificultades de la industria
vinera en este paiacutes en donde los productos para la industria enoacuteloga son
complicados y de alto precio para acceder a ellos y en consecuencia no se
realizan muchas de estas pruebas de deteccioacuten de BrettanomycesDekkera
llevando al mercado productos contaminados de baja calidad que inicialmente
podriacutea haber sido un vino de alta calidad debido a sus caracteriacutesticas uacutenicas y de
gran popularidad
45
Datos obtenidos en el laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
31
3 JUSTIFICACION
Actualmente Croacia cuenta con maacutes de 300 zonas vineras en las que se producen 67
de vino blanco 32 vino tinto y el restante 1 vino rosado De acuerdo a recientes datos
estadiacutesticos hay 650 km2 de vintildeedos en Croacia de los cuales 375 km2 son uvas con
indicacioacuten geograacutefica de origen que producen maacutes de 300 vinos y maacutes de la mitad de este
nuacutemero son vinos elaborados en microempresas con un total de 50000000 de botellas
de vino el 8 es vino superior 70 de calidad y el 22 es vino de mesa de produccioacuten
nacional46
Croacia es un fuerte productor de vino a nivel regional con sus diferentes variedades
propias (Merlot Plavac Dingač Postup Malvazija Pošip Kujundžuša Babic) pero dicha
produccioacuten ha sido fuertemente afectada por la presencia de la levadura
BrettanomycesDekkera trayendo consecuencias como perdidas de produccioacuten peacuterdida
de calidad sensorial del vino grandes peacuterdidas econoacutemicas y desprestigio a sus vinos de
denominacioacuten de origen
Es por esto que en este proyecto de investigacioacuten se busca una faacutecil y raacutepida
identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera causante del ldquocaraacutecter Brettrdquo con el
desarrollo de medios selectivos liquido y solido ademaacutes de opciones para el tratamiento
yo prevencioacuten de esta levadura en la cadena productiva comparativamente entre dioacutexido
de azufre (SO2 ) y Antibrettreg y la identificacioacuten de los aromas caracteriacutesticos del ldquocaraacutecter
Brettrdquo en el vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia
46
Hrvatski zavod za vinogradarstvo i vinasrtvo 2003 Pravilnik o vinu httpwwwhrzvvhrpropisihtm
32
4 OBJETIVOS
41 General
Caracterizar y evaluar el comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera
en teacuterminos de crecimiento y produccioacuten de aromas no deseados en vino tinto
Babic
42 Especiacuteficos
Desarrollar el medio solido y medio liacutequido selectivo para
BrettanomycesDekkera
Evaluar el comportamiento de la levadura en estos medios selectivos
Determinar la influencia del Dioacutexido de azufre (SO2) y el compuesto
Antibrettreg en la levadura BrettanomycesDekkera presente en vino tinto
Babic 2007
Identificar los compuestos aromaacuteticos producidos por Brettanomyces
bruxellensis en vino tinto Babic usando el meacutetodo ldquomultiple headspace
solid-phase microextraction (SPME)rdquo
33
5 ALCANCES
En este proyecto se pretende desarrollar un medio selectivo faacutecil de producir en
donde sea raacutepida la identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera en la
produccioacuten de vinos tintos se realizaran pruebas para corroborar el crecimiento de
esta levadura en el medio determinando el tiempo que esta levadura toma en
adaptarse en el medio y su comportamiento en este una vez comprobada su
adaptacioacuten al medio liquido se trabajara con el meacutetodo de cromatografiacutea de gas
(GC) y el uso de micro extraccioacuten en fase solida (SPME) para el anaacutelisis
cuantitativo de los compuestos volaacutetiles (4-etil-fenol 4-etil-guayacol4-vinilfenol y
4-vinil-guayacol) y posteriormente con el vino tinto Babic Ademaacutes se desea
comprobar la efectividad de los productos con que las vineras de Croacia inhiben
o eliminan la presencia de la levadura en los vinos tintos como lo son el producto
AntiBrettreg y el Dioacutexido de azufre (SO2)
34
6 ESTADO DEL ARTE
Sobre el campo problemico causado por la levadura BrettanomycesDekkera en la
industria viniacutecola se han realizado bastante investigaciones a nivel de
caracterizacioacuten de la levadura los factores fisicoquiacutemicos que favorecen el
crecimiento de la levadura meacutetodos de prevencioacuten y control evaluacioacuten de
dantildeos sensoriales en diferentes tipos de vinos formacioacuten de compuestos fenoacutelicos
en los diferentes tipos de vino otros compuestos no fenoacutelicos asociados al
ldquocaraacutecter Brettrdquo teacutecnicas de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera
evaluacioacuten de la teacutecnicas de control e inhibicioacuten de dicha levadura desarrollo de
nuevos medios de deteccioacuten y aislamiento de la levadura relacioacuten entre la
levadura BrettanomycesDekkera con las otras levaduras presentes en el vino
entre otros
Seguacuten estas investigaciones se analizan aquellas que pueden aportar datos
importantes para el desarrollo del trabajo que se quiere realizar y se tiene en
cuenta sus metodologiacuteas conclusiones recomendaciones y comentarios
Entre las importantes para el planteamiento de este trabajo se menciona el trabajo
realizado por la Universidad Politeacutecnica de Madrid Espantildea el cual analiza
algunas de las caracteriacutesticas maacutes relevantes de este geacutenero de levaduras su
crecimiento en bodega factores fisicoquiacutemicos que favorecen su crecimiento y
desarrollo en el vino los defectos sensoriales que presenta en los vinos y estudia
algunas de los meacutetodos fiacutesicos para el control de BrettanomycesDekkera en vino
35
(clarificacioacuten filtracioacuten amicrobica proteiacutenas clarificantes anhiacutedrido sulfuros
dimetil dicarbonato Aditivos)47
Para conocer maacutes sobre la levadura en condiciones de barrica y almacenamiento
se revisa el articulo elaborado en el Departamento Teacutecnico Guserbiot La rioja
Espantildea en este artiacuteculo se describe brevemente su metabolismo y su ecologiacutea en
las bodegas Igualmente se comparan las teacutecnicas utilizadas en los laboratorios
para su deteccioacuten y cuaacuteles son las limitaciones de los diferentes meacutetodos
Finalmente se analizan las estrategias desarrolladas para su eliminacioacuten de las
bodegas y se dan una serie de recomendaciones para su control48
El instituto de fermentaciones Industriales Consejo superior de investigaciones
cientiacuteficas Juan de Cierva Madrid Espantildea en el cual se revisa la formacioacuten de
etilfenoles (4 etil-fenol 4 etil guayacol) en vinos tintos anejos Los factores
fisicoquiacutemicos que favorecen el crecimiento de la levadura no deseada
BrettanomycesDekkera las teacutecnicas usadas para la detectar la presencia de esta
levadura en vinos ( Revisioacuten microscoacutepica fluorescente remocioacuten de aacutecidos
grasos de su membrana teacutecnicas moleculares como PCR y electroforesis) y de
control (Proteiacutenas fining Fining con gelatina liquida filtracioacuten variables
fisicoquiacutemicas adicioacuten de aditivos procedimientos de altas presiones
manipulacioacuten geneacutetica) con esta investigacioacuten se concluye que la combinacioacuten y el
uso de las numerosas teacutecnicas pueden ayudar a la prevencioacuten y reduccioacuten de la
levadura BrettanomycesDekkera 49 Este trabajo muestra las muacuteltiples opciones
47
A Morata S Benito F Palomero F Calderoacuten y J A Suaacuterez-Lepe Ecologiacutea y prevencioacuten de
BrettanomycesDekkera durante la elaboracioacuten y crianza de vinos tintos Revista enoacutelogos (Editada por la
Federacioacuten Espantildeola de Asociaciones de Enoacutelogos y Periodistas Asociados) No 50 paacuteg 1-12 Madrid Espantildea
48 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 20-
24 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
49 R Suarez JA Suarez-Lepe A Morata F Calderon 2006 The production of ethyl phenols in wine by yeasts
of the genera Brettanomyces and Dekkera A review Journal Food Chemistry No 102 pag 10-21 Madrid
Espantildea
36
existentes en el control y prevencioacuten de la levadura mencionada sin embargo deja
claro que la mayoriacutea de estas opciones son costosas y no de faacutecil adquisicioacuten para
una pequentildea industria
El anaacutelisis sensorial ha sido de los aspectos maacutes estudiados al respecto de
BrettanomycesDekkera una de estas investigaciones fue realizada en Centre
Europeacuteen des Sciences du Goucirct en Talence Francia en el cual se evaluaron 50
vinos bordeaux sensorialmente para demostrar la complejidad del ldquoCaraacutecter Brett‟‟
al cual se unen otros compuestos aromaacuteticos ademaacutes de los fenoacutelicos como acido
isobutirico e isovalerico en este tipo de vino debido a sus caracteriacutesticas
fisicoquiacutemicas50
De los meacutetodos de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera los medios
selectivos son muy populares es por esto que el Laboratorio de Microbiologiacutea
Departamento de Botanica e Engenharia Biologica Instituto Superior de
Agronomia Lisboa Portugal realizo un trabajo en el cual se pretendia desarrollar
un medio selectivo o diferencial capaz de aislar la levadura
BrettanomycesDekkera del vino y de la cadena productiva del vino con el fin de
detreminar la relacioacuten entre esta levadura y los compuestos 4-etilfenol y 4 etil-
guayacol51 otro estudio realizado para la deteccioacuten de dicha levadura fue
realizado en la Escola Superior de Biotecnologiacutea Universidade Catoacutelica
Portuguesa el desarrollo de un simple procedimiento compatible con las rutinas
50 Andrea Romano a Marie Claire Perello a Aline Lonvaud-Funel Gilles Sicard Gilles de Revel2008 Sensory
and analytical re-evaluation of lsquolsquoBrett characterrdquo Journal Food Chemestry No 114 pag 15-19 Talence
France
51 N Rodrigues G Gonccedilalves S Pereira-da-Silva M Malfeito-Ferreira and V Loureiro2001 Development
and use of a new medium to detect yeasts of the genera DekkeraBrettanomyces Journal of applied microbiology No 90 pag 588-599Lisboa Portugal
37
usadas en las vineras para la deteccioacuten de BrettanomycesDekkera en vino y en
maquinarias52
En el laboratorio de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas Alcohoacutelicas de la
Universidad de Zagreb se ha trabajado anteriormente en el desarrollo de medio
solido selectivo con pruebas de diferentes concentraciones de los compuestos
como resultados se encuentra una buen relacioacuten entre las concentraciones de los
compuestos sin embargo como recomendaciones se encuentran la falta de
antibioacutetico para evitar contaminacioacuten por bacterias probar con diferentes fuentes
de carbono para comparacioacuten de tiempo de crecimiento positivo y un monitoreo
diario en el medio53
Los compuestos aromaacuteticos que libera la presencia de BrettanomycesDekkera
estaacute asociada a los compuestos 4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinilfenol y 4
viniguayacol a partir de esto los centros de investigacioacuten han hondado en la
identificacioacuten de dichos compuestos relacionados en la enologiacutea y especialmente
con BrettanomycesDekkera a partir de eso el Departamento de Quiacutemica
Universidad de La Rioja Espantildea este estudio presenta un meacutetodo basado en el
uso de Cromatografiacutea de Gas y micro extraccioacuten en fase solida para el anaacutelisis
cuantitativo de 4-etilfenol 4-etil guayacol 4-vinilfenol 4-vinilguayacol
Demostrando la existencia de un efecto matriz en el anaacutelisis de compuestos
responsables del ldquocaraacutecter Brettrdquo en vino Este nuevo meacutetodo fue
satisfactoriamente aplicado a cierto nuacutemero de vinos tintos comerciales vinos
52
JA Couto A Barbosa and T Hogg 2005 A simple cultural method for the presumptive detection of the yeasts BrettanomycesDekkera in wines Letters in Applied Microbiology No 41 pag 505-510 Porto
Portugal
53 Serkovic Dubravka Gracin Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac
Brettanomyces bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet pag 1-117 ZagrebCroatia
38
blancos y roseacute Este meacutetodo puede ser una alternativa para evitar el efecto matriz
en muestras de vino54
De acuerdo con este tema en la jornada cientiacutefica del 99 el grupo de investigacioacuten
enoloacutegica se estudio la formacioacuten de sustancias volaacutetiles por 13 cepas de S
cerevisiae con buenas aptitudes enoloacutegicas inoculadas individualmente en un
mosto homogeacuteneo de la variedad airen fermentado en las mismas condiciones
de aireacioacuten y a temperatura controlada55
54
C Pizarro N Perez-del-Notario JM Gonzalez-Saiz 2007 Determination of Brett character responsible
compounds in wines by using multiple headspace solid-phase micro extraction Journal of Chromatography
No 1143 pag 176-181 La Rioja Espantildea
55 E Pueyo P Hidalgo K Fernaacutendez y P Martiacuten-Aacutelvarez 1999 Anaacutelisis de compuestos volaacutetiles en vinos
obtenidos con distintas cepas de Saccharomyces cerevisiae Aplicacioacuten de la teacutecnica de microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientificas 99 Grupos de Investigacion Enologica Zaragoza Espana
39
7 MATERIALES Y METODOS
A continuacioacuten se presentan materiales y meacutetodos para la investigacioacuten
Este proyecto fue realizado en su gran mayoriacutea en las instalaciones de la
Universidad de Zagreb en la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos
(PBF) Laboratorios del Departamento de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas
Alcohoacutelicas ubicado en la ciudad de Zagreb Croacia
Los anaacutelisis fisicoquiacutemicos del vino tinto Babic fueron realizados en los
laboratorios de VINOLAB ubicado en Zagreb Croacia
71 MEDIO SOLIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera
711 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Autoclave de laboratorio
Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa Etanol peptona extracto de levadura
agar cicloheximida acido cumaacuterico ampicilina)
Balanza electroacutenica de precisioacuten
Microscopio oacuteptico
712 Metodologiacutea
Basados en estudios anteriores realizados en el laboratorio para el desarrollo de
medio solido selectivo para BrettanomycesDekkera (Serkovic Dubravka Gracin
40
Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac Brettanomyces
bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet Universidad de Zagreb pag 1-
117 Zagreb Croacia) se evaluaron las recomendaciones mencionadas en dicha
investigacioacuten para la mejoriacutea y desarrollo de otros medios soacutelidos selectivos
Se usoacute como base el medio YPD (Yeast Peptone Dextrose) el cual estaacute
compuesto de la siguiente forma 20gL peptona 10 gl extracto de levadura 20 gl
de agar56 este medio es selectivo para levaduras pero no es selectivo entre ellas
Es necesario el uso de una fuente de carbono para la levadura
BrettanomycesDekkera de acuerdo a la teoriacutea y revisando la tabla 1 (Relacioacuten de
los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) y seguacuten
facilidades de disponibilidad en el laboratorio se utiliza glucosa la cual es
utilizable por entre 75-100 de las cepas de BrettanomycesDekkera seguacuten la
tabla mencionada anteriormente
Esta fuente de carbono (Glucosa) fue probada en una concentracioacuten de 20 gL
Cicloheximida fue probada a 30 mgL para inhibir Saccharomyces en el medio y
darle mayor selectividad para Brettanomyces Dekkera Se antildeade acido p-
cumarico en una concentracioacuten de 100 mgL como precursor para la formacioacuten
del compuesto 4 etilfenol caracteriacutestico de la levadura BrettanomycesDekkera
Para inhibir bacterias en el medio se usa ampicilina a 10 mgL esta se agrega
despueacutes de realizada la esterilizacioacuten y cuando la temperatura del medio este
igual o menor a 40C El pH del medio se ajusto a 5
Paralelamente se crea el medio con Etanol como fuente de carbono en una
concentracioacuten de 6 o 60 mlL con la misma concentracioacuten de los otros
compuesto como cicloheximida 30mgL acido cumarico 100mgL 20 gL peptona
10 gL de extracto de levadura 16gL de agar Este medio se crea como
56
Concentraciones preestablecidas en el laboratorio de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas alcoholicas
41
comparativo para determinar cual fuente de carbono es la maacutes utilizada por la
levadura Brettanomyces bruxellensis para su reproduccioacuten Seguacuten la teoriacutea (ver
tabla 1) el etanol es utilizado por entre 25-75 de las cepas de
BrettanomycesDekkera pero es el azuacutecar que se encuentra en mayor
concentracioacuten presente en los vinos tintos aproximadamente 130 gl57
Estos medios fueron debidamente esterilizados para eliminar cualquier
microorganismo o espora presente en este Este procedimiento se realizo por el
meacutetodo de combinacioacuten de altas temperatura y presioacuten (Autoclave 121 C a 1034
kPa)
Se usaron colonias de BrettanomycesDekkera aisladas anteriormente de vinos
contaminados y guardas para investigaciones en el Departamento de Tecnologiacutea y
Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos
Universidad de Zagreb Croacia
Los medios fueron monitoreados visualmente todos los diacuteas y se toman
observaciones de macroscoacutepicas y microscoacutepicas Se comparan estos dos medios
en teacuterminos de rapidez de crecimiento de la levadura y selectividad Estas
muestras fueron incubadas a 28C por 10 diacuteas
La prueba fue realizada por duplicado en diferentes tiempos
57
Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
42
72 MEDIO LIacuteQUIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera
721 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Frascos de vidrio esteacuteriles
Autoclave de laboratorio
Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa peptona extracto de levadura
cicloheximida acido cumarico ampicilina etanol)
Microscopio oacuteptico
Balanza electroacutenica de precisioacuten
722 Metodologiacutea
En el mercado para enologiacutea existen medio liacutequidos selectivos para la deteccioacuten
de BrettanomycesDekkera en vinos sin embargo estos son de difiacutecil accesibilidad
por sus elevados precios es por esto que se desarrolla un medio liquido selectivo
para dicha levadura en el laboratorio del Departmaneto de Tecnologiacutea y Anaacutelisis
de Bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia
Para este medio se toma como base el medio selectivo con Glucosa como fuente
carbono desarrollado anteriormente sin usar agar para mantener el medio en su
estado liquido
43
La composicioacuten de este medio liacutequido es la siguiente
20 gL Glucosa
20 gL peptona
10gL extracto de levadura
30mgL de cicloheximida
100mgL acido p-cumarico
10 mgL ampicilina
Estos compuestos fueron medidos en una balanza electroacutenica de precisioacuten se
antildeade 250 ml de agua destilada y se mezcla constantemente se pasa a proceso
de esterilizacioacuten en autoclave a 120C y 1034 KPa por 45 minutos
De esta forma se asegura la usencia de microorganismos yo esporas en el
medio Despueacutes de bajar la Temperatura a 40C se agrega a la mezcla ampicilina
en una concentracioacuten de 10mgL
En frascos de vidrio esteacuteril se agrega 40 ml de medio liacutequido y diferentes
cantidades iniciales de levaduras BrettanomycesDekkera fueron inoculadas al
respectivo medio el primer frasco tiene una cantidad de 106 ceacutelulasml el segundo
tiene 104 ceacutelulasml el tercero tiene 102 celulasml y el cuarto con una cantidad
aproximada de 25 ceacutelulasml Estas cantidades estaacuten basadas en estudios
anteriores para medios liacutequidos selectivos en levaduras58
58 J Ungar A M James P W Muggleton H F Pegler y E G Tomich1950 The Cultivation of
Haemophilus pertussis in Partially Defined Liquid Media Journal of General Microbiology No 4
pag 345-359 Greenford
44
Este medio liacutequido inoculado fue inspeccionado diariamente visualmente revisioacuten
de turbidez microscoacutepicamente y olfativamente para deteccioacuten de olores del
ldquocaraacutecter Brettrdquo
Los diacuteas fueron contabilizados para determinar resultados positivos en estos
ensayos
73 INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN
VINO TINTO DE LA REGION DE DALMACIA CROACIA
731 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Medio selectivo solido para BretanomycesDekkera
Medio selectivo Liquido para BrettanomycesDekkera
Quiacutemicos de laboratorio (Dioxido de Azufre (SO2) Antibrettreg Glucosa)
Vino Babic 2007
Anallizador infrarojo Bacchius II microdom
732 Metodologiacutea
Con los medios desarrollados (solido y liquido) se quiere conocer el efecto del
dioacutexido de azufre (SO2) y el producto Antibrettreg en la levadura
BrettanomycesDekkera presente en el vino tinto de la regioacuten de Dalmacia
Con las herramientas que se tienen en el laboratorio del departamento de
tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia se quiere
determinar la influencia de estos productos en la levadura BrettanomycesDekkera
presente en vino tinto croata de la regioacuten de Dalmacia Babic
45
El primer paso es adaptar la levadura al vino tinto croata (Babic) para esto se
inoculan 20 colonias de BrettanomycesDekkera en 500 ml de vino se antildeadioacute
glucosa en una concentracioacuten de 2gL y se oxigena la mezcla Para este paso de
adaptacioacuten se dejan las muestras de 1 a 2 diacuteas a temperatura ambiente (20C)
Despueacutes de este periodo se revisa microscoacutepicamente la presencia positiva de
BrettanomycesDekkera en los 500 ml de vino en los que se estaba haciendo el
paso de adaptacioacuten en Babic al comprobar su presencia positiva se procede a
mezclar los 500 ml de vino contaminado con BrettanomycesDekkera con los 3
Litros de vino Babic que se disponen para esta prueba
Estos 3 litros de vino tinto Babic contaminado con la levadura
BrettanomycesDekkera se reparten en 8 frascos de vidrios esteacuteriles al siguiente
diacutea se toman dos frascos para agregar cada uno de los compuestos a evaluar
(SO2 y Antibrettreg)
Para SO2 se toman dos frascos uno de 600ml y uno de 100ml se agrega una
concentracioacuten de 40 mgl
Para el producto AntiBrettreg se toman cuatro frascos dos de 600 ml y dos de 100
ml seguacuten especificaciones del producto y la alta poblacioacuten de
BrettanomycesDekkera en las muestras se adiciono la maacutexima concentracioacuten de
AntiBrettreg a las muestras la cual fue de 40 gHl
Estas muestras se dejaron a temperatura ambiente simulando condiciones de
almacenamiento del vino en barricas temperatura aproximada de 20C evitando el
contacto con la luz solar y evitando movimientos fuertes Esto se mantuvo por 15
diacuteas que fue el tiempo de duracioacuten del experimento
Con el vino restante se mantuvo en las mismas condiciones de almacenamiento
de los demaacutes para hacer un paralelo de comparacioacuten
Previamente se analizaron las caracteriacutesticas del vino sin contaminar por medio
del analizador infrarrojo Bacchus II microdom antes de agregar los compuestos
46
SO2 y AntiBrettreg y despueacutes se volvioacute a realizar el anaacutelisis para determinar los
efectos de estos compuestos en el vino y asiacute mismo al de control
74 DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN
EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO
MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE
741 Materiales
Cromatografo de Gas HP5890 Serie II
Microextractor de fase solida (SPME)
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Quiacutemicos de laboratorio (p-cresolAcetaldehido Propanol diacetil etil-
acetato i-butanol acido aceacutetico i-amil-alcohol n-amil lactato de etilo
acetato amil metiacutelico 1-hexanol etil-hexanol linalol nerol citronelol
geraniol 2-feniletanol octanoato de etilo 4-etilfenol 2-feniletil acetato 4-
etilguaiacol)
Vino Tinto Babic
Agua destilada
742 Metodologiacutea
El meacutetodo fue desarrollado anteriormente en el Departamento de Tecnologiacutea y
Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos de
la Universidad de Zagreb Croacia Y despueacutes de modificaciones fue utilizado en el
desarrollo del trabajo El meacutetodo utilizado es descrito a continuacioacuten
47
Cromatografo de gas HP 5890 SERIES II
Programa HP-chem
a) Condiciones para analisis SPME-GC
Muestra diluida 5050 con adicion de estandar interno (p-cresol1mgl)
25ml de la muestra diluida con mezcla continua a temperatura ambiente
Tiempo de adsorcion 30 minutos
SPME es colocado en la muestra para la adsorcion durante el tiempo
previsto
b) Condiciones para el Cromatografo de gas (GC)
La columna usada en este experimento es RTXreg-5 (Restec USA sn 210627)
30m id=025mm 025μm
Gas portador Nitrogeno
Flujo del Nitrogeno 5 mlmin
Temperatura del inyector 240 C
Temperatura del detector 250 C
Temperaturas programadas 35 C5 min 150 C 34 Cmin 180 C
10Cmin 190 C 5 Cmin
Se conocen los resultados del cromatografiacutea de gases (ver tabla 10) y se hacen
necesarias varias correcciones del meacutetodo y algunas pruebas con unos
compuestos para determinar realmente su tiempo de retencioacuten en este tipo de
vino Se deben comprobar tiempos de retencioacuten
48
8 DISCUSIOacuteN Y RESULTADOS
81 RESULTADOS PARA EL DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO
Tabla 2 Medio Selectivo con Glucosa como fuente de carbono para
BrettanomycesDekkera en incubacioacuten por 5 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten
microscoacutepica
1 Negativo Negativo - No se realiza
2 Negativo Negativo - Presencia de levaduras
3 Negativo Negativo - Presencia de
Levaduras
4 Aparicioacuten de
algunas colonias
Negativo Transparente Presencia de levaduras
5 Colonias definidas Positivo-
Fenoles
Amarillo Presencia positiva de
BrettanomycesDekkera
49
Este medio tiene alto grado de selectividad para levaduras con un tiempo de
crecimiento de aproximadamente 5 diacuteas en 28C lo que lo hace raacutepido gracias al
antibioacutetico (ampicilina) que hace parte de la composicioacuten del medio no hay
presencia de bacterias Se hace confiable para resultados positivos de levaduras
BrettanomycesDekkera debido a que las levaduras Saccharomyces fueron
inhibidas con el compuesto cicloheximida su selectividad fue comprobada por
revisioacuten microscoacutepica macroscoacutepica y sensorial
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con glucosa como fuente de carboacuten son las
siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
50
Tabla 3 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono para Brettanomyces Dekkera en
incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica
1 Ninguno Negativo - -
2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras y
bacterias
9 Diminutas
colonias
transparentes
Negativo Transparentes Presencia de levaduras y
algunas bacterias
10 Positivo Positivo-
Fenoacutelicos
Amarillo Presencia de levaduras
BrettanomycesDekkera y
bacterias
El medio selectivo para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de
carbono tambieacuten es selectiva entre levaduras ya que solo se identifico la levadura
BrettanomycesDekkera en este sin embargo se evidencia una presencia de otro
microorganismo presuntamente bacteria ya que este medio no contiene agente
antibacteriano (ampicilina) Es necesaria la adicioacuten de ampicilina en una
concentracioacuten de 10mgl para inhibir la presencia de bacterias
Este medio presenta un tiempo maacutes prolongado para mostrar crecimiento de la
levadura BrettanomycesDekkera aproximadamente 10 diacuteas
51
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las
presentadas en el medio selectivo con glucosa como fuente de carbono y son las
siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
52
Tabla 4 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono y adicioacuten de ampicilina para
Brettanomyces Dekkera en incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica
1 Ninguno Negativo - -
2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
9 Diminutas
colonias
transparentes
Negativo Transparentes Presencia de levaduras
10 Positivo Positivo-
Fenoacutelicos
Amarillo Presencia de levaduras
BrettanomycesDekkera
El efecto de la ampicilina sobre el medio selectivo con etanol como fuente de
carbono fue el esperado inhibioacute completamente el crecimiento de colonias
bacterianas en el medio el tiempo de crecimiento de la levadura y presencia de
aromas fenoacutelicos fue el mismo de 10 diacuteas en incubacioacuten de 28C
53
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las
presentadas anteriormente y son las siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
82 RESULTADOS PRUEBAS MEDIO LIQUIDO
Tabla 5 Influencia de la concentracioacuten de levaduras BrettanomycesDekkera en el
tiempo necesario para detectar la produccioacuten de 4-etil-fenol en medio liquido
Nuacutemero de ceacutelulas ml
(concentracioacuten final)
Tiempo necesario para obtener resultados
positivos (diacuteas)
1 Experimento
32x106 le 3
3 X 104 3
33x102 7
40 No detectado
2 Experimento
43x106 le3
39x104 le3
37x102 8
62 No detectado
54
El nuacutemero de ceacutelulas de levadura de BrettanomycesDekkera fue contabilizado
usando contador de ceacutelulas Chamber
Los aromas fenoacutelicos son difiacuteciles de detectar debido al fuerte olor que tiene el
medio liquido caracteriacutestico de sus componentes esto dificulta la identificacioacuten del
ldquocaraacutecter Brettrdquo en especial cuando las concentraciones de
BrettanomycesDekkera no son elevadas Ademaacutes de los olores fenoacutelicos otros
compuestos volaacutetiles se detectan tales como acido aceacutetico y olores oxidativos
tambieacuten producido por la levadura BrettanomycesDekkera
En la inspeccioacuten visual se detecta alta turbidez en el medio Se compara con un
medio sin presencia de BrettanomycesDekkera
En las muestras con mayor concentracioacuten de la levadura es maacutes notoria la
turbidez Despueacutes de 3 diacuteas se presenta un precipitado blanco en todas las
muestras de altas concentraciones
La revisioacuten microbioloacutegica se realiza diariamente para determinar el nuacutemero de
ceacutelulas y la presencia positiva de la levadura a evaluar
Entre los dos experimentos realizados con el medio liquido el tiempo que se
demoro en detectar compuestos fenoacutelicos fue muy similar entre ellos
dependiendo del nuacutemero de ceacutelulas en el medio en mayores concentraciones el
tiempo de deteccioacuten fue menor
Hay que sentildealar que BrettanomycesDekkera debe alcanzar una concentracioacuten
miacutenima (denominada poblacioacuten criacutetica) de 103 UFCml para comenzar a liberar etil
fenoles Por debajo de esta concentracioacuten la levadura seriacutea metaboacutelicamente
activa pero no produciraacute compuestos alterantes a niveles detectables esto se ve
reflejado en los resultados en los que las concentraciones de ceacutelulas son muy
bajas
55
Estos resultados se comparan con los resultados dados en el medio solido Los
dos medios muestran altos grados de selectividad hacia la levadura
BrettanomycesDekkera y similar comportamiento para el crecimiento de dicha
levadura
En el medio liacutequido cuando hay altas concentraciones de BrettanomycesDekkera
el tiempo de deteccioacuten del microorganismo es menor que con el medio solido pues
en el liacutequido es aproximadamente 3 diacuteas y en el soacutelido son 5 diacuteas
83 RESULTADOS DE LA INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE
(SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO DE LA REGION DE
DALMACIA CROACIA
El vino fue analizado antes de la adicioacuten de los compuestos quiacutemicos a evaluar y
15 diacuteas despueacutes de adicioacuten para ver la reaccioacuten de este frente a SO2 y Antibrettreg
estas caracteriacutesticas se determinaron con el equipo de laboratorio Bacchus II
Microdom localizado en el laboratorio Vinolab doo Zagreb Croacia Los
resultados se muestran en la tabla
Tabla 6 Resultados de las muestras de vino inoculados con la levadura BrettanomycesDekkera
durante 15 diacuteas Comparativos con los diferentes compuestos
CFUml
Vino Day 1 Day 4 Day 10 Day 15
Control 130E+04 800E+03 700E+03 500E+03
Control 800E+03 640E+03 700E+03 280E+03
SO2 110E+04 400E+02 400E+02 67
SO2 900E+03 380E+03 270E+03 183
Antibrett 140E+05 920E+04 140E+04 400E+03
Antibrett 210E+05 181E+05 160E+04 900E+03
Antibrett 120E+05 990E+04 120E+04 100E+03
Antibrett 230E+05 204E+05 300E+03 200E+03
56
Tabla 7 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 antes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o
Antibrettreg Diacutea 0
Alcohol
()
Acidez Total
(gr Aci
Tartaacuterico L)
Acidez volaacutetil
(Aci
AceacuteticoL)
Densidad
(grml)
Azuacutecar residual
(grl)
Extracto
seco
(grl)
Acido
Laacutectico
(grl)
Glicerol
(grl)
Taninos
(grl)
Acetato
(grl)
1473
525
083
09928
473
332
164
799
305
117
1471
522
084
09927
479
329
162
786
299
116
Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
Tabla 8 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 despueacutes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o
Antibrettreg Diacutea 15
Alcohol
()
Acidez Total
(gr Aci
Tartaacuterico L)
Acidez volaacutetil
(Aci
AceacuteticoL)
Densidad
(grml)
Azuacutecar residual
(grl)
Extrac
to seco
(grl)
Acido
Laacutectico
(grl)
Glicerol
(grl)
Taninos
(grl)
Acetatos
(grl)
Control
1414
565
107
09935
436
364
177
827
259
136
Control
1415
556
108
09936
420
365
170
824
256
137
SO2
1456 543 108 09932 476 369 167 803 281 125
SO2
1457
542 108 09933 472 370 170 804 271 124
Antibrett 1454 533 106 09933 448 371 175 813 277 125
Antibrett 1455 534 105 09933 460 372 171 809 282 124
Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
57
Figura 4 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en el vino de control para
evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas
El comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en la prueba por
duplicado en el vino de control fue muy similar pues con el tiempo esta levadura
deja de reproducirse y va muriendo cuando las condiciones ya no son aptas para
su desarrollo debido a que la mayoriacutea de su fuente de carbono (Glucosa) esta
consumida sin embargo esta levadura no llega a su desaparicioacuten total lo que
representa uno de los mayores problemas en la elaboracioacuten del vino
Esta levadura tiene un metabolismo lento y el factor tiempo es un requisito
fundamental para su desarrollo este experimento se empezoacute con una alta
poblacioacuten de BrettanomycesDekkera (130 x 104 UFCml y 8 x 103 UFCml
respectivamente) y durante el transcurso del tiempo la poblacioacuten fue disminuyendo
debido a la perdida de las condiciones necesarias para la reproduccioacuten
58
Figura 5 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de SO2 en
concentracioacuten de 40 mgl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas
El SO2 tuvo un comportamiento efectivo y raacutepido contra las colonias de
BrettanomycesDekkera La poblacioacuten de esta levadura se redujo de forma
significativa entre el diacutea primero y el cuarto se encontroacute una diferencia porcentual
de 96 en la primera prueba y del 60 en la de duplicado al diacutea 15 ya la
poblacioacuten era casi nula pasando raacutepidamente de un numero por encima de la
poblacioacuten critica de la levadura BrettanomycesDekkera a un numero lt103 UFCml
siendo muy eficaz y raacutepido en el manejo de produccioacuten
Este compuesto ademaacutes de favorecer la extraccioacuten de los compuestos fenoacutelicos y
de su actividad antioxidante al inhibir la accioacuten de las polifenoloxidasas a dosis
adecuadas de un maacuteximo de 50gl inhibe la multiplicacioacuten bacteriana y de
levaduras
59
Figura 6 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de
Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo
de 15 diacuteas
Figura 7 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de
Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo
de 15 diacuteas
El compuesto Antibrettreg en la primera prueba tanto como en el duplicado tuvo su
mayor tiempo de reduccioacuten de UFCml entre los diacuteas 4-10 con una diferencia
porcentual de 91 en comparacioacuten con el diacutea cuarto al decimo a diferencia de
60
SO2 el cual presenta la gran disminucioacuten de colonias entre los primeros diacuteas de
agregarse el producto
El tiempo para que la poblacioacuten de la levadura llegara a la cantidad menor a la de
la poblacioacuten critica es mucho mayor que la del compuesto SO2 sabiendo que esta
poblacioacuten debe ser lt103 UFCml
El compuesto Antibrettreg puede tardarse 4-10 diacuteas en representar una reduccioacuten
de UFCml significativa en dicho tiempo puede representar grandes peacuterdidas
nutricionales y altos costos de produccioacuten para la fabricacioacuten
Figura 8 Comportamiento del contenido de alcohol en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin adicioacuten)
hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
BrettanomycesDekkera estaacute presente en vinos de alto contenido alcohoacutelico
aproximadamente entre 125 a 14 pues esta levadura toma a etanol como
fuente de carbono y este vino (Babic) procede de uvas muy maduras las cuales
presentan mayor cantidad de azuacutecares residuales (como glucosa y fructosa y
otras pentosas residuales)
138
14
142
144
146
148
Alcohol
Day 0 Day 15
61
Analizando el comportamiento del vino durante el experimento de 15 diacuteas sin
compuestos quiacutemicos y con SO2 y Antibrettreg a partir de las caracteriacutesticas
iniacuteciales que se determinaron seguacuten el equipo BACCHUS analizador infrarrojo se
presenta en general una reduccioacuten del contenido alcohoacutelico de este vino pero se
ve una mayor reduccioacuten en el vino de control el cual redujo en un 394 su
contenido alcohoacutelico desde el dia 0 hasta el diacutea 15 este vino no tiene ninguacuten
compuesto contra la levadura BrettanomycesDekkera y por su elevada presencia
en los 15 diacuteas de experimento consumioacute esta cantidad de etanol
Mientras en el vino que conteniacutea SO2 tras 15 diacuteas de tratamiento se vio una
reduccioacuten de alcohol de 1 ya que este compuesto redujo la cantidad de
BrettanomycesDekkera en los primeros diacuteas de tratamiento previniendo su
reproduccioacuten y protegiendo el contenido alcohoacutelico del vino Babic 2007
En los vinos de prueba con Antibrett reg la reduccioacuten alcohoacutelica se dio en un
porcentaje de 122 un poco maacutes alta que con SO2 y mucho maacutes baja en
comparacioacuten del vino de control este compuesto tambieacuten previno la gemacioacuten de
la levadura evitando la perdida de etanol en el vino sin embargo como este
compuesto duro mas en este proceso de eliminar BrettanomycesDekkera se
produjo una mayor peacuterdida alcohoacutelica
62
Figura 9 Comportamiento del contenido de acidez volatil en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin
adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
Debido a la presencia de oxigeno en los frascos la acidez volaacutetil aumento pero no
significativamente en las muestras No hubo grandes diferencias entre las
muestras con compuestos y las de control por lo que se deduce que estos
compuestos no ayudan a evitar esta acidez Esta acidez tan alta puede dantildear la
calidad del vino de forma casi irreparable Pero el factor oxigeno es de los maacutes
controlados en la produccioacuten de vinos
la alteracioacuten del aumento de la acidez volaacutetil no estaacute relacionada con la levadura
BrettanomycesDekkera sino a la presencia de oxigeno en el almacenamiento el
oxigeno fue usado en esta prueba para promover condiciones apropiadas para el
desarrollo de la levadura
002040608
112
Acidez Volatil
Day 0 Day 15
63
Figura 10 Comportamiento del contenido de Acido Acetico en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin
adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
Brettanomyces Dekkera son productores de aacutecido aceacutetico y elevan el contenido
de los vinos anormalmente en condiciones de anaerobiosis En condiciones de
aerobiosis producen concentraciones bajas o nulas de aacutecido aceacutetico
Este acido aceacutetico al igual que los fenoles afecta el sabor y el perfil olfativo del
vino tinto este efecto es tambieacuten producido por la levadura
BrettanomycesDekkera vemos en los resultados el gran crecimiento de este
compuesto en el vino control el cual no tenia compouestos en contra de
BrettanomycesDekkera lo que produjo este aumento significativo del acido aceacutetico
en comparacioacuten con estos que teniacutean SO2 y Antibrettreg entre ellos la diferencia en
este compuesto es muy reducida y no significativa pues estos compuestos no
permitieron la gemacioacuten de esta levadura y esta no produjo este acido en esa gran
cantidad
A este compuesto se le atribuye el olor y sabor a vinagre del vino tinto un defecto
muy comuacuten y poco agradable para el consumidor
105110115120125130135140
Acido Acetico
Day 0 Day 15
64
Figura 11 Comportamiento del contenido de Azucares reductores en vino Babic 2007
desde el diacutea 0 (sin adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en
comparacioacuten con el vino de control
BrettanomyesDekkera utiliza los azucares residuales como fuente de carbono
para su crecimiento en el vino este es el factor maacutes importante para su desarrollo
y este es el que determina en cierto caso la cantidad de levaduras de
BretanomycesDekkera presente en las graficas se determina claramente que en
el vino de control donde la cantidad de esta levadura es muy alta 15 diacuteas despueacutes
de empezar las pruebas la cantidad de azucares reductores es muy baja y ha
bajado en un porcentaje de 10 mientras que el vino que tiene SO2 bajo la
cantidad de azucares reductores en un 042 y el vino que tiene el compuesto
Antibrettreg redujo su nivel de azucares reductores en 462
38
4
42
44
46
48
5
Azucares Reductores
Day 0 Day 15
65
84 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE
CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON
EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID
PHASE
Tabla 10 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en
vino Babic 2007 con el meacutetodo propuesto
Compuesto Tiempos de
retencioacuten (min)
Acetaldehiacutedo 1437
Propanol 3759
Diacetil 4202
Etil-acetato 4523
i-butanol 6232
Acido Aceacutetico 7840
i-amil alcohol 11740
n-amil 13489
lactato de etiacutelico 15741
acetato amil metiacutelico 17796
1-hexanol 19101
etil-hexanol 24456
Linalol 30370
2-feniletanol 32768
p-cresol 33522
octanoato de etilo 34226
4-etilfenol 37100
2-feniletil acetato 32769
4-etilguayacol 39704
4 vinilfenol 40529
decanoato de etilo 42117
Refirieacutendose a estos resultados es necesaria la creacioacuten de soluciones estaacutendar
para determinar tiempos de retencioacuten con el meacutetodo y si es necesario ajustes a
este
66
Tabla 11 Soluciones estaacutendar para compuestos en vinos tintos Croatas
MODEL 0
(en volumen de 100 ml en 40 Etanol)
Compuesto Pureza Cantidad
(g)
Concentracioacuten (gl)
Acetaldehiacutedo 099 1623 160677
Propanol 0995 13849 137718
Diacetil 098 01071 104958
Etil-acetato 0995 30172 3002114
i-butanol 099 15016 1486584
Acido Acetico 0995 0 0
i-amil alcohol 099 20116 1991484
n-amil 098 15442 1513316
lactato de etilio 098 00507 049686
acetato amil metilico 098 01028 100744
1-hexanol 098 00367 035966
etil-hexanol 098 00308 029876
Linalol 097 00288 027936
Nerol 097 00311 030478
Citronelol 098 0031 03038
Geraniol 098 15803 1548694
2-feniletanol 098 00402 039396
4-etilfenol 098 00812 078764
octanoato de etilo 097 00597 059103
2-feniletil acetato 099 00315 031185
4-etilguayacol 098 00803 079674
Fuente Laboratorio de anaacutelisis e investigacioacuten de bebidas Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea
de Alimentos Universidad de Zagreb Zagreb Croacia 2009
Las soluciones estaacutendar se realizan teniendo como referencia las cantidades de
estos compuestos en los vinos tintos croatas datos suministrados por el Doctor
Leo Gracin en concentraciones de gl a partir de este dato y teniendo en cuenta
67
la pureza de los compuestos que se teniacutean en el laboratorio de anaacutelisis e
investigacioacuten de bebidas se crean las soluciones estaacutendar Ejemplo
Solucioacuten estaacutendar para 4 etil-fenol en un volumen de 100 ml
Con estas soluciones estaacutendar se realizo el tiempo de retencioacuten para corroborar el
meacutetodo Los resultados de esto fueron tiempos de retencioacuten diferentes a los del
meacutetodo primero con el que se realizaron los ensayos y a partir de esos resultados
se ajusto el meacutetodo con el que se trabajo
68
Tabla 12 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en
vino Babic 2007 con el meacutetodo modificado
Compuesto Tiempos de
retencioacuten (min)
Acetaldehiacutedo 1542
Propanol 4046
Diacetil 4733
Etil-acetato 4807
i-butanol 6659
Acido Acetico 8343
i-amil alcohol 12123
n-amil 13866
lactato de etilio 16072
acetato amil metilico 18336
1-hexanol 19447
etil-hexanol 24835
Linalol 31831
2-feniletanol 33305
p-cresol 33703
octanoato de etilo 34571
4-etilfenol 37724
Citronelol 38326
Nerol 38576
2-feniletil acetato 39012
Geraniol 39944
4-etilguayacol 40271
4 vilifenol 41168
decanoato de etilo 42657
69
DIA 0
Se coloca ISTD a todas las muestras respectivas para poder determinar
cantidades de los compuestos aromaacuteticos
Se realiza la cromatografiacutea de gas al vino Babic 2007 antes de ser inoculado con
BrettanomycesDekkera
Tabla 13 Resultados de la cromatografiacutea de gas del vino Babic 2007
Compuesto Tiempo de retencioacuten
min
Cantidad
mgl
Acetaldehiacutedo 1542 0
Propanol 4046 0
Diacetil 4733 37215204
Etil-acetato 4807 0
i-butanol 6659 0
Acido Aceacutetico 8343 2817465
i-amil alcohol 12123 16799019
n-amil 13866 26
lactato de etiacutelico 16072 10983961
acetato amil metiacutelico 18336 0185196
1-hexanol 19447 264655
etil-hexanol 24835 0158751
Linalol 31831 0
2-feniletanol 33305 4235560
p-cresol 33703 1
octanoato de etilo 34571 0152412
4-etilfenol 37724 00581345
Citronelol 38326 00439729
Nerol 38576 00344799
2-feniletil acetato 39012 00407983
Geraniol 39944 0
4-etilguayacol 40271 0
4 vilifenol 41168 0
Decanoato de etilo 42657 00190144
70
Basados en los compuestos aromaacuteticos que brinda el ldquoCaraacutecter Brettrdquo se van a
analizar detalladamente los siguientes aromas 4-Etilfenol 4-Etilguayacol 4-
Vinylfenol
Figura 12 Compuestos aromaticos en vino tinto Babic sin estar contaminado con la levadura
BrettanomycesDekkera
El vino a analizar esta por debajo de las concentraciones consideradas como
perjudiciales para el aroma del vino tinto (El umbral sensorial del 4-etilfenol es de
230 μgl y el del 4-etilguaiacol es de 47 μgl) pues posee una concentracion de
58microgL de 4etilfenol 0 microgL de 4 etilguayacol y 0 microgL de vinylfenol
841 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGUacuteN TEMPERATURAS
DE ALMACENAMIENTO
0
02
4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinylfenol
Vino 00581345 0 0
C (
mg
L)
Vino Babic 2007 Dia 0
71
Tabla 14 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el
ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 20C por 4 diacuteas Prueba por duplicado
MUESTRAS INCUBADA A 20C
Compuesto Day 1
Amount
(mgL)
Day 2
Amount
(mgL)
Day 3
Amount
(mgL)
Day 4
Amount
(mgL)
4-etilfenol 0260244 017294 0177547 020156
4-etilfenol 0260244 0245915 0204542 0262499
4-etilguayacol 0 0 0 0
4-etilguayacol 0 0 0 0
4 vinilifenol 1107096 781349 685317 460323
4 vinilifenol 1107096 1297465 621324 693225
72
Figura 13 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
BrettanomycesDekkera es la levadura responsable de la produccion de 4-etil-
fenol compuesto asociado con olores caracteristicos a ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 00581345 0260244 0172935 0177547 020156
C (
mg
L)
4 etilfenol
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 00581345 0260244 0245915 0204542 0262499
C (
mg
L)
4 etilfenol
73
caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo dantildeando la calidad sensorial del vino tinto Babic la
produccioacuten de este compuesto en esta muestra realizada por duplicado fue
ascendente y tuvo incremento muy grande en el primer dia de almacenamiento y
en el transcurso de los siguientes cuatro diacuteas se mantuvo relativamente estable lo
cual no concuerda con el comportamiento tiacutepico de esta levadura quien tiene un
crecimiento lento e incrementa la produccioacuten de fenoles con su gemacioacuten esto
genera muchas dudas sobre el buen funcionamiento del equipo GC o de la
estabilidad de las levaduras BrettanomycesDekkera en este almacenamiento
Figura 14 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar prueba por duplicado
002040608
1
Vino Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0 0 0
4 etilguayacol
002040608
1
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0 0 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
74
Presencia negativa de 4 etil guayacol durante todo el almacenamiento
probablemente las condiciones de almacenamiento y el medio no dieron lugar al
desarrollo de este compuesto el cual se considera menos conflictivo que el 4-etil-
fenol
Figura 15 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
Estos resultados tambieacuten dejan dudas del normal comportamiento de dicha
levadura pues indican que la levadura no convirtioacute este compuesto en etilfenol
0
2
4
6
8
10
12
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 110709781349685317460323
4 vinylfenol
0
2
4
6
8
10
12
14
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
Series1 0 11071 12974 62132 69322
C (
mg
l)
4 Vinylfenol
75
durante el almacenamiento caracteriacutestica que solo la levadura
BrettanomycesDekkera puede realizar se ve que las concentraciones de
vinylfenoles son mucho mas altas que las de fenoles lo que nos deja determinar
que la poblacioacuten de BrettanomycesDekkera es muy baja y existen otras levaduras
productoras de vinylfenoles en este tipo de vino en las condiciones de
almacenamiento dadas para estas pruebas
Tabla 16 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el
ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 28C por 4 diacuteas
MUESTRA 2 INCUBADA A 28C
Compuesto Day 1
Amount
(mgL)
Day 2
Amount
(mgL)
Day 3
Amount
(mgL)
Day 4
Amount
(mgL)
4-etilfenol 0260244 019612 0186614 019932
4-etilfenol 0260244 020576 0214917 0193554
4-etilguayacol 0 014304 0223836 0
4-etilguayacol 0 002287 00529832 0
4 vinilifenol 1107096 787068 665182 397847
4 vinilifenol 1107096 284389 00204392 0
76
Figura 16 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar
El desarrollo de este compuesto en el diacutea 1 fue significativo y luego relativamente
estable el comportamiento fue similar en las pruebas de diferentes temperaturas
de almacenamiento para este compuesto el cual es el maacutes problemaacutetico en la
industria viniacutecola
0
005
01
015
02
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 005813019932018661019611019932
4 etilfenol
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 005813 019355 021491 020576 026024
4 etilfenol
77
Figura 17 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar
Los resultados de la prueba son poco confiables y no entendibles por lo que
podemos verificar que el GC no estaacute trabajando de forma adecuada para la
deteccioacuten del compuesto
0001002003004005006
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 Etilguayacol 0 0 0022 0053 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
0005
01015
02025
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0223 0143 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
78
Figura 18 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
El comportamiento de este compuesto en la prueba es muy irregular y poco
confiable
0
2
4
6
8
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 397847665182787068397847
4 vinylfenol
0
2
4
6
8
10
12
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 11071 28438 00204 0
4 vinylfenol
79
Figura 19 Comportamiento del compuesto 4 etilfenol durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
La concentracioacuten de 4 etil fenol fue mayor al cuarto diacutea almacenado a
temperatura ambiente de 20C pero este compuesto no tuvo una actividad notoria
de ascenso durante su almacenamiento como se esperaba lo que deja muchas
dudas sobre los resultados de este ensayo
0
05
1
15
2
25
3
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etil fenol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 20C
80
Figura 20 Comportamiento del compuesto 4 etil guayacol durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
Comportamiento anormal del compuesto no se ve tendencias de aumento o
disminucioacuten de este en ninguna de las pruebas no tiene un comportamiento
regular pues se esperaba que la levadura BrettanomycesDekkera
descarboxinizara el compuesto 4-vinilguaiacol y aumentar las concentraciones de
4-etilguaiacol esta reaccioacuten no se hizo notoria en los compuestos aromaacuteticos
seguacuten lo determino el Cromatografo de Gas (GC)
0
005
01
015
02
025
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3
C (
mg
L)
4 etil guayacol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 20C
81
Figura 21 Comportamiento del compuesto 4 Vinyl fenoll durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
La no presencia de este compuesto en el vino original demuestra las baja o casi
nula presencia de la levadura BrettanomycesDekkera al diacutea primero este
compuesto incrementa de forma notoria en las muestras debido a la presencia de
acido cumaacuterico en el medio ya que sufre su carboxilacion convirtieacutendose en 4 vinyl
fenol sin embargo su comportamiento no fue regular y presento problemas de
lecturas
0
2
4
6
8
10
12
14
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
C (
mg
L)4 Vinyl fenol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 28C
82
9 CONCLUSIONES Y
RECOMENDACIONES
91 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO
Se desarrolloacute un medio selectivo soacutelido para BrettanomycesDekkera
accesible y faacutecil de elaborar
Se detectan colonias de la levadura BrettanomycesDekera en el agar
selectivo con glucosa como fuente de carbono en un lapso de 5 diacuteas en
incubacioacuten a 28C
El medio selectivo soacutelido con Glucosa como fuente de carbono fue maacutes
raacutepido y efectivo ya que toma 5 diacuteas para dar resultados positivos frente al
de Etanol como fuente de carbono el cual toma 10 diacuteas para mostrar
resultados positivos aunque ambos dieron resultados satisfactorios en la
selectividad de la levadura BrettanomycesDekkera
La levadura se adapto de forma satisfactoria a estos medios en
condiciones de almacenamiento propias para su desarrollo (28C)
Las colonias de la levadura BrettanomycesDekkera tiene un crecimiento
en estos medios soacutelidos de forma circular con topografiacutea convexa y borde
entero dimensiones 5-6 mm color Amarillo opacicidad oscuro
83
superficie lisa y suave siendo faacutecil de identificar y realizar los conteos
necesarios
El medio solido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten
de la levadura BrettanomycesDekkera en vino tinto es raacutepido econoacutemico
y uacutetil
El uso de azucares para fermentacioacuten de la levadura
BrettanomycesDekkera que Saccharomyces no puede fermentar para
mayor selectividad
Realizacioacuten de pruebas Bioquiacutemicas como meacutetodo raacutepido de selectividad
92 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DESARROLLO DEL MEDIO LIacuteQUIDO
Se desarrollo un medio selectivo liquido para BrettanomycesDekkera
accesible y faacutecil de elaborar
Este medio mostroacute resultados positivos de la presencia de
BrettanomycesDekkera en un lapso de tiempo menor (3 diacuteas) que con el
medio solido (5 diacuteas) en caso de que el nuacutemero de ceacutelulas de la levadura
BrettanomycesDekkera sea mayor a la poblacioacuten critica (103)
Cuando la poblacioacuten de ceacutelulas de la levadura BrettanomycesDekkera es
menor a la poblacioacuten critica el tiempo de identificacioacuten de esta levadura por
medio liquido es muy prolongado puede tomar maacutes de 10 diacuteas o incluso no
detectarlo
84
Los compuestos quiacutemicos usados para el desarrollo del medio liacutequido no
son los adecuados para este tipo de medios donde los resultados positivos
son olfativos pues estos compuestos emiten fuertes olores que confunden
los olores caracteriacutesticos del caraacutecter Brett
El medio liquido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten
de altas concentraciones de la levadura BrettanomycesDekkera en vino
tinto es raacutepido econoacutemico y uacutetil
93 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg
EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE DALMACIA
CROACIA
Este trabajo mostroacute que el dioacutexido de azufre (SO2) tiene buenos resultados
en contra de la levadura BrettanomycesDekkera en concentraciones
normales de 40mgl concentracioacuten en la que se trabaja este compuesto en
los vinos tintos
En Europa el dioacutexido de azufre es usado de forma tradicional en gran
nuacutemero de alimentos y especialmente en vinos sin embargo y a pesar de
su uso regulado se busca la sustitucioacuten de este o su maacutexima reduccioacuten
para hacer de este producto maacutes sano para las personas no tolerantes a
este tipo de compuestos sin embargo seguacuten el trabajo realizado en
comparacioacuten con el producto Antibrettreg el SO2 es maacutes eficaz en el control
85
de la levadura ayudando a evitarla y eliminarla de la cadena productiva del
vino tinto
Gracias a sus caracteriacutesticas el vino tinto Babic es muy vulnerable a la
levadura BrettanomycesDekkera pero a su vez se puede tratar faacutecilmente
con productos como SO2 y Antibrettreg aunque es maacutes efectivo contra
BrettanomycesDekkera el dioacutexido de azufre (SO2)
Antibrettreg es una buena opcioacuten para el control de BrettanomycesDekkera
para evitar el uso de productos alergenicos como SO2
94 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN
EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO
MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE
Al terminar la primera prueba con anaacutelisis en cromatografiacutea a gas y el SPME
queda como resultados
Es necesario repetir la prueba
No se determina el efecto de los estaacutendares internos sometidos a tiempos
de almacenamiento en temperaturas de 20C y 28C lo que puede dar falsos
resultados de cantidades de compuestos
86
Se debe crear un medio maacutes apto para el desarrollo de la levadura y un
control diario de crecimiento ( agregar maacutes Glucosa en caso de que se
haya consumido toda controlar presencia de Bacterias y otros
microorganismos que no se deseen en el medio)
Es necesario control de aromas con panel sensorial para determinar el
umbral de deteccioacuten en este vino
Control de crecimiento por medio solido Selectivo para
BrettanomycesDekekra conteo de colonias presentes en el vino inoculado
y su desarrollo durante almacenamiento a diferentes temperaturas
La segunda prueba no fue posible realizarla por dantildeos en el equipo de
cromatografiacutea de gas (GC)
87
ANEXOS
11
89
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientiacuteficas 99 Grupos de
Investigacioacuten Enoloacutegica Zaragoza Espantildea
93
11
GRACIAS es una palabra corta para todo lo que quiero expresar a todos aquellos que
hicieron parte de este suentildeo hecho realidadhellip
A Dios y a la virgen Auxiliadora por llevarme de su mano cada diacutea de mi carrera en cada
momento alegre y en cada momento difiacutecil fueron mi fortaleza
A mis papitos por hacer de mi estudio una realidad por su sacrificio y apoyo desinteresado y
sincero
A mi Hermanito por ser mi fortaleza mi ejemplo y mi amigo incondicional
A mi familia Blanco y Urrea por su compantildeiacutea durante esta etapa
A mi facultad (Decano Dr Camilo Rozo Dra Patricia Jimeacutenez y mis profesores) por
ensenarme mi profesioacuten y aportar lo mejor de ustedes para mi formacioacuten personal
A mis asesores de Tesis (Ing Patricia Chaparro y Dr Sc Leo Gracin) por su guiacutea y
colaboracioacuten oportuna
A mis queridos amigos quienes siempre han estado a mi lado en las dificultades y en las
alegriacuteas (Ingrid Mafe Cami G Cami R Harold Pipe Karla Andreacutes T Diego G)
A IAESTE en alianza con el ORI por hacer posible mi intercambio y poder hacer mi tesis en el
maravilloso paiacutes de Croacia
A Croacia por ser mi segundo hogar por abrirme sus puertas y su corazoacuten por brindarme
tan maravillosas personas en mi camino
Croatia Thank you for being my second home for opening your doors and your heart to me
and give me the opportunity to meet so many wonderful people
To my boss my teacher my mentor and specially my friend Leo
To the faculty of food technology and Biotechnology and the department of technology
and analysis of beverages for give me the opportunity to give all my knowledge to the
project and learn a lot more
To all the amazing people I met during this experience (Igor Karin Natka Josip Ana Matija
Daniel Pz Szilvia Dini Daniela Lidija Sanja and everybody else who I had the pleasure to
meet in this great trip) for give me the best of your hearts
I only have one thing to say hellipTHANK YOU
Solo me queda una palabra por decirhellipGRACIAS
7
ABSTRACT
This experiment presents the development and testing of a simple way to detect
BrettanomycesDekkera from wine and wine environments using selective media in solid
phase and liquid phase and the influence of Sulfur Dioxide (SO2) and Antibrett reg in red
wines from Dalmatian region The method of detection of this yeast employs selective
enrichment mediums These mediums contains glucose (20gl) and Ethanol (6) as
carbon and energy source cycloheximide (30 mgl) to prevent growth of Sachharomyces
ampicilin (10 mgl) to prevent growth of bacteria and p-coumaric acid (100 mgl) as a
precursor of the production of 4-etilphenol depending on the phase of the medium agar
compound is used in a concentration of 16 grl After putted on the medium wine
contaminated with BrettanomycesDekkera is monitored by micro and macro inspection
also with the liquid medium
A red wine from Dalmatian region was contaminated with BrettanomycesDekkera colonies
and divided in 8 different containers from these 8 containers we had two for control no
addition two with addition of Sulfur Dioxide (SO2) in a concentration of 40 mgl and four of
them with Antibrett reg in a concentration of 40gHl The method for this study is based in
following the behavior of the yeast BrettanomycesDekkera with these compounds in this
wine this behavior was monitored based in CFUml showing in the samples and physic
and chemical analysis before addition and 15 days after
8
INTRODUCCION
Las levaduras del geacutenero Brettanomyces o su forma telemoacuterfica (nombre que
reciben las especies que presentan reproduccioacuten sexual y en consecuencia
formacioacuten de esporas por meiosis) Dekkera fueron descritas por primera vez por
Claussen en 1903 en la produccioacuten de cerveza1
Este geacutenero se conoce desde hace tiempo como agente contaminante en la
industria cervecera de la sidra y de bebidas carbonatadas2 En la industria
enoloacutegica su descripcioacuten como alterante es maacutes reciente
Durante los antildeos 1950s muchos autores reportaron el aislamiento del genero
Brettanomyces en uvas francesas e italianas (Van der Walt y Van der Kerken
1958) Sin embargo en muchas regiones del mundo viniacutecola esta levadura no ha
sido identificada lo cual dificulta su deteccioacuten en materiales o productos
contaminadosEntre todos los microorganismos la levadura
BrettanomycesDekkera es una de las maacutes temidas por los vinicultores El
crecimiento y desarrollo de esta levadura causa alteraciones denominadas
ldquocaraacutecter Brettrdquo lo cual ocurre especialmente en vinos tintos3
1 Gilliland R Brettanomyces I Occurrence characteristics and effects on beer flavor J Inst Brew
1961
2 Deak T y Beuchat LR Handbook of spoilage yeast CRC Press Nova York 1996
3 Heresztyn T Archives of Microbiology 1986 Metabolism of phenolic compounds from
hydroxycinnamic acids by Brettanomyces yeast
9
El ldquocaraacutecter Brettrdquo produce un amplio espectro de sabores y aromas alterantes
entre los cuales estaacuten corral minerales tinta tabaco cuero faacutermacos y
ahumado estas alteraciones se le atribuyen a los compuestos 4-etilfenol y 4-
etiguayacol las cuales causan una supresioacuten de aromas atractivos en el vino
como de frutas y flores y perdida de sabores agradables para el consumidor como
acido salado amargo o picante 4
Esta levadura tiene distinto comportamiento seguacuten el tipo de vino al que esteacute
asociada pues cada tipo de vino tiene diferente composicioacuten de carbonos
nitroacutegenos vitaminas y minerales
Con este estudio se evaluacutea el comportamiento y caracterizacioacuten de la levadura
BrettanomycesDekkera en vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia con
el desarrollo de medios solido y liquido para la selectividad de la levadura
alteraciones aromaacuteticas del vino tinto Babic producidas por 4 etilfenol y 4
etilguayacol y el comportamiento de BrettanomycesDekkera en el vino al ser
tratado con Dioacutexido de azufre (SO2) comparativamente con tratamiento Antibrettreg
4 Boulton Singleton Bisson amp Kunkee 1996 Descripcioacuten de aromas fenoacutelicos
10
1 MARCO TEORICO
Las levaduras representan el grupo de microorganismos maacutes importante en la
industria viniacutecola porque sin Saccharomyces producir vinos de alta calidad seriacutea
imposible Ademas de Saccharomyces hay muchos otros geacuteneros y especies de
levaduras presentes durante la vinificacioacuten que afectan la calidad del vino positiva
o negativamente5
Las levaduras comprenden 39 geacuteneros y 350 especies Se identifican y clasifican
basaacutendose en caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas Entre los aspectos
morfoloacutegicos considerados se encuentran el tamantildeo y la forma de las ceacutelulas en
medios soacutelidos y liacutequidos especificados el modo de reproduccioacuten y si forma velo
en la superficie o sedimenta en un medio liacutequido Entre las caracteriacutesticas
fisioloacutegicas consideradas se encuentra si puede crecer (y fermentar) en un
determinado carbohidrato y si puede o no utilizar determinadas fuentes de
nitroacutegeno como los nitratos6
11 REPRODUCCION
Las levaduras son agrupadas en tres familias conocidas como
Saccharomycetaceae Sporobolomycetaceae y Cryptococcaceae Estas
5 H Erten June 2002 Relations between elevated temperatures and fermentation behavior of
Kloeckera apiculata and Saccharomyces cerevisiae associated with winemaking in mixed culture
World Journal of Microbiology and Biotechnology Volume 18 N 4 pag 1 Adana Turkey 6 Cerveceros de Argentina 2006 Levadura wwwcervezadeargentinacomararticuloslevadurahtm
11
representan el grupo de microorganismos entre bacterias y hongos respecto a su
tamantildeo de ceacutelula Este grupo es caracterizado por su forma de reproduccioacuten
vegetativa conocida como ldquogemacioacutenrdquo Bajo condiciones optimas una ceacutelula
madre puede gemar varias veces durante el periodo reproductivo Sin embargo
bajo estrictas condiciones de fermentacioacuten una levadura va a gemar solamente
entre tres o cuatro veces Aquiacute la disponibilidad de oxigeno la cual es necesaria
para la formacioacuten de precursores de la membrana de la ceacutelula limita la
replicacioacuten7
Estos microorganismos muestran varios tipos de gemacioacuten lo cual puede dar un
valor diagnostico Entre aquellas aisladas de fermentacioacuten y antildeejamiento del vino
se observan maacutes frecuentemente multilateral y gemacioacuten polar 8
La modalidad maacutes comuacuten es la gemacioacuten proceso asexual en el cual la ceacutelula
progenitora emite un conducto tubular desde la vacuola nuclear hacia un punto
perifeacuterico proacuteximo a la misma Entonces se forma en la direccioacuten del conducto
una pequentildea protuberancia en la superficie externa de la ceacutelula y el conducto
pasa atravesando la pared celular a dicha protuberancia la cual se ensancha
llenaacutendose con el material citoplaacutesmico y nuclear de la ceacutelula progenitora Cuando
el brote o yema formada llega a ser casi tan grande como la ceacutelula progenitora los
aparatos nucleares de ambas ceacutelulas se orientan de forma que sus centrosomas
respectivos equidisten del punto de unioacuten Al llegar este momento la ceacutelula madre
y la ceacutelula hija se separan y se inicia la formacioacuten de nuevas ymas En la
gemacioacuten normal no se forman tabiques de separacioacuten entre ceacutelula madre y
ceacutelulas hijas pero en algunos casos el proceso se inicia en la gemacioacuten y se
completa por divisioacuten con la separacioacuten definitiva de ambos individuos La ceacutelula
madura de puede producir por gemacioacuten durante el curso de vida un promedio de
7 Brinton M Miller and Warren Litsky PhD 1976 Industrial Microbiology Edi Mac Graw Hill United States
of America
8 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures
edi Springer second edition Fresno California United States of America
12
24 generaciones de ceacutelulas hijas Las yemas sucesivas se forman siempre en
sitios diferentes de la superficie de la ceacutelula9
111 Gemacioacuten multilateral
La gemacioacuten multilateral ocurre en el ldquohombrordquo o aacuterea de la levadura donde ocurre
la reproduccioacuten La gemacioacuten y ciclo de separacioacuten crea un problema para las
levaduras durante su fase fermentativa pues en este tiempo la ceacutelula madre se
reduce aproximadamente un medio Porque la siacutentesis de la membrana celular
ocurre bajo condiciones anaeroacutebicas lo que limita los ciclos asexuales
replicativos Como resultado la mayoriacutea de las fermentaciones se completan en la
fase estacionaria (no gemacioacuten) Un ejemplo de esta reproduccioacuten es
BrettanomycesDekkera10
112 Gemacioacuten Polar
A diferencia de la gemacioacuten multilateral la gemacioacuten polar puede ocurrir en uno o
dos polos En el caso de Kloeckera y Saccharomyces la gemacioacuten ocurre en
ambos polos aumentando la poblacioacuten de levaduras con forma de ldquolimoacutenrdquo 11
113 Fisioacuten
Esta reproduccioacuten es caracteriacutesticas del genero Schizosaccharomyces donde la
formacioacuten de la ceacutelula hija ocurre sin la reduccioacuten de la madre ceacutelula como en los
casos anteriores En este caso la formacioacuten de la microscoacutepica pared celular
ocurre entre la madre ceacutelula y la hija seguida por la separacioacuten12
9 Araya Pablo 2002 Reproduccioacuten de hongos unicelulares mediante gemacioacuten esporulacioacuten y
fisioacuten httphtmlrincondelvagocomreproduccion-asexualhtml
10 11 12 Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic
Publishers GmbH United States of America and Canada
13
114 Pseudomycelium
Cualquier fabricante de vinos ha tenido la oportunidad de notar la formacioacuten de
una peliacutecula en la superficie del vino Esto surge debido a la gemacioacuten repetida de
las levaduras oxidativas y fallas en el momento de la separacioacuten de la ceacutelula hija
de la madre Con el tiempo el lazo previo entre la madre ceacutelula e hija se ampliacutea
dando la impresioacuten de filamentos como si se tratase de mohos siendo que son
levaduras 13
12 TAXONOMIA
Para distinguir las levaduras que pueden producir ascoporas de aquellas que no
los micologistas usan doble taxonomiacutea para su clasificacioacuten Desafortunadamente
la nomenclatura para la combinacioacuten anamorfotelemorfo es frecuentemente
diferente Unos ejemplos de levaduras sexualasexual o telemorfoanamorfo son
DekeraBrettanomyces Metschnikowia pulcherrimaCandida pulcherrima
Hanseniaspora uvarumKloeckera apiculata Torulaspora delbruecki Candida
colliculosa 14
Sin embargo las levaduras son diferenciadas por los taxonomistas por asignacioacuten
de varios nombres de geacutenerosespecies varios vinicultores usan un sistema
informal para agrupar levaduras basadas en su morfologiacutea u otras caracteriacutesticas
Por ejemplo a Kloeckera apiculata se le refiere como ldquolevadura apiculadardquo
tiene forma de limoacuten Esta levaduras asi com muchas otras presentes en el mosto
de la uva como lo son Candida Cryptococcus Debaryomyces Hansenula
Issatchenkia Kluyveromyces Metschnikowia Pichia y Rhodotorula tambieacuten son
llamadas levaduras ldquonativasrdquo ldquonaturalesrdquo o ldquosalvajesrdquo por su origen el vintildeedo o en
13
Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers
GmbH United States of America and Canada
14 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
14
la vinera Algunos enoacutelogos han discutido contra el uso de estos teacuterminos porque
esta implicancia no sucede en todas las levaduras ya que estas son de alguna
forma ldquono-nativasrdquo o ldquono naturalesrdquo (Ej Saccharomyces o Brettanomyces) El
teacutermino ldquono Saccharomycesrdquo es maacutes comuacuten para nombrar aquellas levaduras
presentes en el mosto de la uva que no son del genero Saccharomyces15
Las levaduras encontradas despueacutes de la fermentacioacuten alcohoacutelica tambieacuten son
asignadas a un grupo informal Algunas veces las levaduras que conducen la
principal fermentacioacuten (Saccharomyces) son muchas veces llamadas ldquolevaduras
fermentativasrdquo basados en su metabolismo Durante su antildeejamiento algunas
levaduras (Candida Hansenula y Pichia) pueden crecer en la superficie en
presencia de oxigeno Esta peliacutecula superficial es comuacutenmente asociada a
deterioro del vino esta levadura se le conoce como ldquolevadura formadora de
peliacuteculardquo16
121 DekkeraBrettanomyces
La taxonomiacutea cientiacutefica sobre BrettanomycesDekkera ha cambiado en los uacuteltimos
antildeos Brettanomyces estaacute clasificado dentro de la misma familia que
Saccharomyces (familia Saccharomycetaceae) Actualmente dentro del geacutenero
Brettanomyces se aceptan cinco especies diferentes (B bruxellensis B
anomalus B custersianus B nanas y B naardenensis)17
Las teacutecnicas de biologiacutea molecular han demostrado que B intermedious B
lambicus B custerseii o D intermedia son sinoacutenimos de B bruxellensis por lo
que estas denominaciones han quedado en desuso Los microorganismos de este
geacutenero presentan dos formas una capaz de reproducirse sexualmente (Dekkera)
15
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
16 Kurtzman CP 1998 The industrial and agricultural significance of yeasts 4
th Edition Amsterdam
Holanda
17 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
15
y otra que lo hace asexualmente (Brettanomyces) Tambieacuten se llaman
respectivamente forma perfecta y forma imperfecta En algunos casos la forma
perfecta y la imperfecta reciben nombres diferentes como ocurre con B anomalus
y D anomala En otros casos el nombre es similar como las pertenecientes a la
especie bruxellensis que pueden parecer como D bruxellensis como B
bruxellensis o como BrettanomycesDekkera A efectos praacutecticos en la bodega
estos dos estados son similares Cuando vemos referencias a Brettanomyces
como contaminante en la mayor parte de los casos se refieren a
DekkeraBrettanomyces ya que este es el responsable de las alteraciones en el
vino18 y 19
La morfologiacutea celular de BrettanomycesDekkera es ojival o ciliacutendrica con
gemacioacuten multipolar en reproduccioacuten vegetativa Una de las caracteriacutesticas de
este geacutenero es su tamantildeo celular variable y la formacioacuten de filamentos19
18 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 23
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
19
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
16
Figura 1 Microfotografiacutea de cultivo de BrettanomycesDekkera a) Variabilidad morfoloacutegica y de
tamantildeo celular b) forma filamentosa
Fuente Lopez-Cordon Eva BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia wwwacenologiacom
Los defectos sensoriales asociados directamente a Brett aparecen
mayoritariamente en vinos tintos de calidad y las causas radican en la propia
fisiologiacutea del microorganismo Ademaacutes al ser una levadura de crecimiento muy
lento la alteracioacuten se presenta principalmente durante el almacenamiento y sobre
todo la crianza del vino habitual en los vinos tintos de gama alta En las barricas
de madera el microorganismo tiene a su disposicioacuten todo el sustrato y tiempo
suficiente para realizar su actividad La naturaleza porosa de la madera y su difiacutecil
limpieza contribuye a que las poblaciones existentes se mantengan incluso
despueacutes del lavado de la barrica Ademaacutes BrettanomycesDekkera tiene la
capacidad de degradar uno de sus componentes la celobiosa 20
13 CARACTERISTICAS FISIOLOGICAS
S cerevisiae y BrettanomycesDekkera tienen metabolismos similares muy
adaptados a las condiciones de vinificacioacuten Tras la fermentacioacuten alcohoacutelica S
cerevisiae es la levadura mayoritaria debido a que las condiciones nutricionales
20
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
17
del vino son muy estrictas (altas concentraciones de etanol y bajas
concentraciones de nutrientes) En este momento BrettanomycesDekkera
continuacutea creciendo gracias a que utiliza nutrientes que S cerevisiae no ha podido
consumir sobre todo algunos azuacutecares y fuentes de nitroacutegeno21
Una de las caracteriacutesticas que diferencia a BrettanomycesDekkera es la gran
diversidad de azuacutecares que puede fermentar (ver tabla de Relacioacuten de los
principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) La mayoriacutea de
las cepas pueden crecer utilizando trealosa y celobiosa azucares presentes en el
vino y no consumibles por S cerevisiae Otra de las ventajas que presenta frente
a S cerevisiae (y frente a la mayoriacutea de las levaduras) es que puede utilizar los
nitratos como fuente de nitroacutegeno Debido a que S cerevisiae soacutelo utiliza el
nitroacutegeno amoniacal y los aminoaacutecidos libres estos se consumen con relativa
rapidez Al final de la fermentacioacuten el nitroacutegeno moniacal es escaso y se favorece
el crecimiento de las levaduras que pueden utilizar otras fuentes de nitroacutegeno
Ademaacutes Brettanomyces puede crecer con concentraciones de fosfato diamoacutenico
tan bajas como 05gl o a partir de diversos aminoaacutecidos En resumen
BrettanomycesDekkera crece maacutes despacio que S cerevisiae es resistente a
concentraciones altas de alcohol puede utilizar otros azucares como fuentes de
energiacutea y nitrato como fuente de nitroacutegeno Esto explica que pueda reproducirse
cuando la fermentacioacuten alcohoacutelica ha terminado a partir de nutrientes no
consumibles por S cerevisiae y cuando no tiene competidores22
21
Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
22 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
18
Tabla 1 Relacioacuten de los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto
Fuente Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista
VINOTEQ N 38 pag 21 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
131 BrettanomycesDekkera y siacutentesis de fenoles volaacutetiles
El origen de los fenoles volaacutetiles estaacute relacionado con la actividad secuencial de
dos enzimas que descarboxilan los aacutecidos en hidroxiestirenos (vinilfenoles) que
19
son posteriormente reducidos a etilderivados (etilfenoles)23 como puede
observarse en la figura 2
Figura 2 Siacutentesis de etilfenoles de BrettanomycesDekkera
Fuente ACE revista de Enologia wwwacenologiacom
El primer paso de descaboxilacion de los aacutecidos hidroxicinamicos es comuacuten
tambieacuten en otros microorganismos como bacterias hongos y otras levaduras Sin
embargo el segundo paso reduccioacuten de vinilfenoles es caracteriacutestico de algunos
tipos de levaduras como Dekkera bruxelliensis D anomala Pichia guillermondi
Candida versarilis C halophila y C mannitofaciens24
Los fenoles volaacutetiles que se asocian al problema Brett en vinos son el 4-etilfenol y
el 4- etilguaiacol asiacute como sus precursores intermedios 4-vinilfenol y 4-
vinilguaiacol aunque estos uacuteltimos son menos importantes por ser muy reactivos y
raacutepidamente convertidos en etilfenoles por BrettanomycesDekkera o en su caso
23
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
24 Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
20
condensan con otras moleacuteculas como antocianos25 Los etilfenoles y
especialmente elevadas concentraciones de 4-vinilfenol en vinos se asocian con
aromas desagradables asociados a descriptores como ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de
caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo26
El umbral sensorial del 4-etilfenol es de 230 μg l-1 y el del 4-etilguaiacol es de 47
μgl Pese a su menor umbral sensorial el 4-etilguaiacol responde a descriptores
como ldquobaconrdquo o ldquoahumadordquo que a bajas concentraciones aportan complejidad por
lo que se puede considerar sensorialmente menos conflitivo que el 4-etilfenol 27
Figura 3 Defectos sensoriales producidos en el vino por BrettanomycesDekkera
Fuente Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
25 Morata A Goacutemez-Cordoveacutes M Calderoacuten F Suaacuterez J 2006 Effects of pH temperature and SO2 on the
formation of pyranoanthocyanins during red wine fermentation with two species of Saccharomyces Journal Food Microbiology No106 pag 4 Madrid Espana
26 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea 27 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
21
132 Identificacioacuten de BrettanomycesDekkera
Los Bioacutelogos usan sistemas de identificacioacuten basados en similitudes taxonoacutemicas
entre organismos dichas similitudes pueden ser morfoloacutegicas tipos capacidad de
produccioacuten de sustratos como azuacutecar yo nitratos caracteriacutesticas fisioloacutegicas y
bioquiacutemicas secuencia del material geneacutetico y respuestas inmunoloacutegicas28
En la industria viniacutecola es importante recurrir a diferentes tipos de pruebas para la
identificacioacuten de microorganismos una de estas y la maacutes realizada es la revisioacuten
del microorganismo bajo el microscopio Esta prueba brinda informacioacuten sobre la
morfologiacutea del microorganismo (cocos bacilos formas puntudas ojival entre
otros) tamantildeo (dimensiones) agrupaciones celulares (solas parejas triacuteos
grupos o cadenas) Sin embargo el uso del microscopio es una prueba raacutepida
para examinar mostos o vino pero no determina cantidades que muchas veces es
requerido para tratamientos de accioacuten otro de los inconvenientes es que los
microorganismos pueden variar su morfologiacutea en forma o tamantildeo dependiendo de
la edad y las condiciones de crecimiento por lo que puede no ser clara la
identificacioacuten de este29
14 Medios soacutelidos selectivos
Si se requiere de la confirmacioacuten del microorganismo este debe ser aislado del
vino para una caracterizacioacuten para esto se requiere de medios soacutelidos Cuando se
examina un microorganismo en un medio solido es importante revisar las
caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias (ver figura 4 Morfologiacuteas de colonias
en medios soacutelidos) Entre estas caracteriacutesticas estaacuten forma (circular irregular o
2829 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
22
rizada) tamantildeo (dimensiones estas normalmente se expresan en miliacutemetros)
topografiacutea (plano elevado convexo coacutencavo o embonado) presencia de
pigmentos opacidad (transparente traslucido u opaco) superficie (suave rugosa
lisa o aacutespero) bordes (entero ondulado crespo dentado rizado) o cualquier
cambio en el agar (color opacidad cambios en los indicadores de pH o CaCO3
respectivamente)30
Figura 4 Varias morfologiacuteas de crecimiento de colonias en medio solido
Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007
Gran nuacutemero de medios selectivos se han creado para la aislacioacuten deteccioacuten yo
conteo de levaduras provenientes de jugos de uva mostos o vinos El medio maacutes
utilizado en estos fines es YPD (Yeast Peptone Dextrose) pero dicho medio no
es selectivo entre levaduras y se usa comuacutenmente para el conteo de
Saccharomyces31 Las colonias empiezan a parecer con un periodo de incubacioacuten
30
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
31 Essia Ngang J Wolniewicz E Villa P2005 Stimulation of lactobacilli during alcoholic fermentation action
of sucrose hydrolysis by yeast Biotechnology letters No 8 pag 743 Amiens France
23
de 2 a 4 diacuteas a 22C a 25C Igualmente el agar de jugo de uva es no selectivo y
presenta faacutecil crecimiento de levaduras bacterias y mohos
Para la levadura Brettanomyces Dekkera se han elaborado diferentes medios
selectivos entre ellos el maacutes conocido es WL por sus siglas en ingles del
laboratorio que lo creo ldquoWallerstein Laboratoriesrdquo este medio contiene
cicloheximida compuesto selectivo para Brettanomyces e inhibe Saccharomyces
El punto criacutetico es encontrar la cantidad exacta de este compuesto para la
inhibicioacuten de las levaduras sin que afecte a BrettanomycesDekkera32
Ademaacutes del medio WL BrettanomycesDekkera puede ser cultivado en otros
medios selectivos como Brettanomyces medio A creado por Vilas en 1993
Brettanomyces medio B el cual contiene cicloeximida como agente selectivo
mientras que Brettanomyces medio C tiene cicloheximida y ampicilina este medio
fue creado por B Watson en 1998 Brettanomyces medio D fue creado
recientemente por Rodrigues en 2001 este medio es conocido como DBDM
(DekkeraBrettanomyces differential medium ) es un medio selectivo para
Brettanomyces en contra de Saccharomyces y otras levaduras este medio es el
maacutes utilizado en la vineras para caracterizacioacuten de BrettanomycesDekkera
actualmente33
15 Dioacutexido de azufre (SO2) en vinos
32
33
Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers
GmbH United States of America and Canada
24
El dioacutexido de azufre tambieacuten llamado oxido de azufre es un eficaz agente
conservante antioxidante y antimicrobiano en la industria viniacutecola34
Durante la vinificacioacuten SO2 ha representado histoacutericamente una herramienta muy
importante usada por los vinicultores para el control de crecimiento microbioloacutegico
Debido a preocupaciones por la salud del consumidor el uso de este producto ha
disminuido dramaacuteticamente con el posible riesgo de aumentar el riesgo
microbioloacutegico35
El actual liacutemite legal de SO2 en vinos en los Estados Unidos es de 350mgL una
concentracioacuten mucho mayor a la usada en la industria viniacutecola No obstante vinos
que contienen maacutes de 10mgL deben declarar este compuesto en la etiqueta
porque SO2 es un metabolito que las levaduras usan durante la fermentacioacuten Los
vinos siempre contienen algo de sulfitos aunque la adicioacuten no se realice durante el
proceso36
151 Formas del Dioacutexido de Azufre (SO2)
Una vez disuelto en agua el dioacutexido de azufre existe en equilibrio entre SO2
molecular (SO2H2O) bisulfito (HSO3) y sulfito (SO32-) Este equilibrio depende del
pH Ademaacutes de estar en equilibrio con el molecular y especies sulfito el bisulfito
tambieacuten existe en forma ldquolibrerdquo y en forma ldquoatadardquo Aquiacute la moleacutecula reaccionara
34
Orwine Eureka 2008Investigadores europeos buscan alternativas al dioxido de azufre en vinos
httpawprowordpresscom20081107investigadores-europeos-buscan-alternativas-al-dioxido-de-
azufre-en-el-vino
3536 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
25
con compuestos carbonilos (ej Acetaldehiacutedo) formando productos adicionales
como Acido Hydroxysulfonico 37
Ademaacutes de Acetaldehiacutedo algunas moleacuteculas presentes en el jugo de uva que
reaccionan con bisulfito son acido piruvico α-keto-glutaric dihidroxyacetona
diacetyl Pigmentos de antocianinas entre otros38
152 Inhibidor Microbiano
El sulfuro molecular es la forma antimicrobiana del dioacutexido de azufre La cantidad
de SO2 molecular presente en cualquier vino no se mide directamente La
concentracioacuten es calculada conociendo la concentracioacuten de SO2 libre y el pH del
vino basaacutendose en la siguiente foacutermula
Alternativamente la figura 5 Se puede utilizar como guiacutea para aproximar la
cantidad de SO2 libre necesitada a determinado valor de pH de valores entre 05 o
08 mgl de SO2 molecular 39
El SO2 inhibe microorganismos de varias formas incluyendo rupturas de puentes
bisulfitos en proteiacutenas y reaccionando con coofactores como NAD+ y FAD tambieacuten
reacciona con ATP
3739
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
38 Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi
Springer New York United States
26
Figura 5 Cantidades de SO2 libre a un pH determinado para obtener 05 o 08 mgl de SO2
molecular
Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007
La concentracioacuten de SO2 molecular necesario para prevenir el crecimiento de
microorganismos variacutea seguacuten vinojugo pH temperatura poblacioacuten densidad y
diversidad estado de crecimiento grado de alcohol entre otros factores Beech
1979 sugirioacute una adicioacuten de 08 mgl de SO2 molecular como la cantidad
necesaria del compuesto en vinos blancos de mesa para dar una reduccioacuten de
cerca de 104 UFCml de la poblacioacuten de diferente tipo de microorganismos en 24
horas Las diferencias que existen entre las levaduras y bacterias en base a la
27
sensibilidad a este compuesto son dadas a conocer por diferentes autores (Warth
1977 1985 Du Toit 2005 Davis 1988 Hood 1983)40
16 Antibrettreg como alternativa de prevencioacuten y eliminacioacuten de
BrettanomycesDekkera
Antibrettreg es un producto nuevo creado por Spindal SARL-Gretz - Armainvilliers
Francia Es una preparacioacuten enzimaacutetica para inactivar Brettanomyces y para
reducir olores producidos por fenoles volaacutetiles41
Antibrettreg es preparado a base de paredes celulares de levadura activados
enzimaacuteticamente que presentan elevadas propiedades adsorbentes frente al 4-
etilfeno y 4- etilguayacol compuestos asociados con olores desagradables en el
vino tales como sudor de caballo farmacia o barniz42
Antibrettreg inhibe la produccioacuten de la vinilreductasa que participa en la
transformacioacuten de los aacutecidos cinaacutemicos naturalmente presentes en los vinos en
los correspondientes derivados etilados responsables de los olores atribuidos a
BrettanomycesDekkera 43
40
Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi
Springer New York United States
41 Manual de instrucciones de producto Antibrett reg producido por Spindal SARL-Gretz -
Armainvilliers France
424344 AEB Group 2008 ANTIBRETT Preparado a base de paredes celulares de levadura para la inactivacioacuten
de Brettanomyces y la eliminacioacuten de los olores de estos productos httpwwwaeb-
groupcomimgsSPAGNOLODepliantANTIBRETT-lett-ESPpdf
28
El uso de Antibrettreg es efectivo incluso contra otros olores anoacutemalos como los
que se generan en las barricas sucias principalmente huacutemedas dantildeando la
calidad olfativa del vino44
29
2 PROBLEMA
La levadura BrettanomycesDekkera es una levadura de contaminacioacuten presente
en la mayoriacutea de industrias viniacutecolas en el mundo Afecta directamente la
produccioacuten y calidad sensorial de los vinos con el desarrollo de los compuestos 4
etilfenol y 4 etilguayacol los cuales dantildean el perfil olfativo del vino dando aromas
caracteriacutesticas a ldquoestablordquo ldquocuerordquo ldquosudor de caballordquo o ldquobarnizrdquo conocido como
ldquocaraacutecter Brettrdquo
Esta contaminacioacuten se da especialmente en los vinos tintos debido a sus
caracteriacutesticas de produccioacuten (fermentacioacuten crianza antildeejamiento) y sus
propiedades fisicoquiacutemicas (Grado alcohoacutelico pH Acidez total Acidez volaacutetil
entre otros)
En Croacia existe una gran produccioacuten de vinos tintos entre los cuales se
encuentra el vino tinto Babic proveniente de la isla de Hvar el cual es famoso por
ser un vino duro carnoso estructurado y casi sobre-maduro con un grado
alcohoacutelico que ronda los 15 vv siendo la primera denominacioacuten de origen que
se aproboacute en Croacia en el antildeo 1961 este vino es de gran importancia en la
regioacuten la mayoriacutea de sitios de elaboracioacuten son pequentildeas industrias que han sido
afectadas por el bdquocaraacutecter Brett‟ Muchas investigaciones se han realizado al
respecto de la levadura BrettanomycesDekkera pero se conoce muy poco sobre
sus efectos en el vino Babic debido a sus caracteriacutesticas particulares (alcohol
30
15 pH 35 Acidez total 520 gr Acido TartaricoL Acidez volaacutetil 08 gr Acido
AceticoL Azucar residual 47 grLt)45
La dificultad de la pequentildea industria para acceder a productos que lleven a la
identificacioacuten de la levadura mencionada y de esta manera conllevar a planes de
accioacuten contra el ldquocaraacutecter Brettrdquo es una de las grandes dificultades de la industria
vinera en este paiacutes en donde los productos para la industria enoacuteloga son
complicados y de alto precio para acceder a ellos y en consecuencia no se
realizan muchas de estas pruebas de deteccioacuten de BrettanomycesDekkera
llevando al mercado productos contaminados de baja calidad que inicialmente
podriacutea haber sido un vino de alta calidad debido a sus caracteriacutesticas uacutenicas y de
gran popularidad
45
Datos obtenidos en el laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
31
3 JUSTIFICACION
Actualmente Croacia cuenta con maacutes de 300 zonas vineras en las que se producen 67
de vino blanco 32 vino tinto y el restante 1 vino rosado De acuerdo a recientes datos
estadiacutesticos hay 650 km2 de vintildeedos en Croacia de los cuales 375 km2 son uvas con
indicacioacuten geograacutefica de origen que producen maacutes de 300 vinos y maacutes de la mitad de este
nuacutemero son vinos elaborados en microempresas con un total de 50000000 de botellas
de vino el 8 es vino superior 70 de calidad y el 22 es vino de mesa de produccioacuten
nacional46
Croacia es un fuerte productor de vino a nivel regional con sus diferentes variedades
propias (Merlot Plavac Dingač Postup Malvazija Pošip Kujundžuša Babic) pero dicha
produccioacuten ha sido fuertemente afectada por la presencia de la levadura
BrettanomycesDekkera trayendo consecuencias como perdidas de produccioacuten peacuterdida
de calidad sensorial del vino grandes peacuterdidas econoacutemicas y desprestigio a sus vinos de
denominacioacuten de origen
Es por esto que en este proyecto de investigacioacuten se busca una faacutecil y raacutepida
identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera causante del ldquocaraacutecter Brettrdquo con el
desarrollo de medios selectivos liquido y solido ademaacutes de opciones para el tratamiento
yo prevencioacuten de esta levadura en la cadena productiva comparativamente entre dioacutexido
de azufre (SO2 ) y Antibrettreg y la identificacioacuten de los aromas caracteriacutesticos del ldquocaraacutecter
Brettrdquo en el vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia
46
Hrvatski zavod za vinogradarstvo i vinasrtvo 2003 Pravilnik o vinu httpwwwhrzvvhrpropisihtm
32
4 OBJETIVOS
41 General
Caracterizar y evaluar el comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera
en teacuterminos de crecimiento y produccioacuten de aromas no deseados en vino tinto
Babic
42 Especiacuteficos
Desarrollar el medio solido y medio liacutequido selectivo para
BrettanomycesDekkera
Evaluar el comportamiento de la levadura en estos medios selectivos
Determinar la influencia del Dioacutexido de azufre (SO2) y el compuesto
Antibrettreg en la levadura BrettanomycesDekkera presente en vino tinto
Babic 2007
Identificar los compuestos aromaacuteticos producidos por Brettanomyces
bruxellensis en vino tinto Babic usando el meacutetodo ldquomultiple headspace
solid-phase microextraction (SPME)rdquo
33
5 ALCANCES
En este proyecto se pretende desarrollar un medio selectivo faacutecil de producir en
donde sea raacutepida la identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera en la
produccioacuten de vinos tintos se realizaran pruebas para corroborar el crecimiento de
esta levadura en el medio determinando el tiempo que esta levadura toma en
adaptarse en el medio y su comportamiento en este una vez comprobada su
adaptacioacuten al medio liquido se trabajara con el meacutetodo de cromatografiacutea de gas
(GC) y el uso de micro extraccioacuten en fase solida (SPME) para el anaacutelisis
cuantitativo de los compuestos volaacutetiles (4-etil-fenol 4-etil-guayacol4-vinilfenol y
4-vinil-guayacol) y posteriormente con el vino tinto Babic Ademaacutes se desea
comprobar la efectividad de los productos con que las vineras de Croacia inhiben
o eliminan la presencia de la levadura en los vinos tintos como lo son el producto
AntiBrettreg y el Dioacutexido de azufre (SO2)
34
6 ESTADO DEL ARTE
Sobre el campo problemico causado por la levadura BrettanomycesDekkera en la
industria viniacutecola se han realizado bastante investigaciones a nivel de
caracterizacioacuten de la levadura los factores fisicoquiacutemicos que favorecen el
crecimiento de la levadura meacutetodos de prevencioacuten y control evaluacioacuten de
dantildeos sensoriales en diferentes tipos de vinos formacioacuten de compuestos fenoacutelicos
en los diferentes tipos de vino otros compuestos no fenoacutelicos asociados al
ldquocaraacutecter Brettrdquo teacutecnicas de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera
evaluacioacuten de la teacutecnicas de control e inhibicioacuten de dicha levadura desarrollo de
nuevos medios de deteccioacuten y aislamiento de la levadura relacioacuten entre la
levadura BrettanomycesDekkera con las otras levaduras presentes en el vino
entre otros
Seguacuten estas investigaciones se analizan aquellas que pueden aportar datos
importantes para el desarrollo del trabajo que se quiere realizar y se tiene en
cuenta sus metodologiacuteas conclusiones recomendaciones y comentarios
Entre las importantes para el planteamiento de este trabajo se menciona el trabajo
realizado por la Universidad Politeacutecnica de Madrid Espantildea el cual analiza
algunas de las caracteriacutesticas maacutes relevantes de este geacutenero de levaduras su
crecimiento en bodega factores fisicoquiacutemicos que favorecen su crecimiento y
desarrollo en el vino los defectos sensoriales que presenta en los vinos y estudia
algunas de los meacutetodos fiacutesicos para el control de BrettanomycesDekkera en vino
35
(clarificacioacuten filtracioacuten amicrobica proteiacutenas clarificantes anhiacutedrido sulfuros
dimetil dicarbonato Aditivos)47
Para conocer maacutes sobre la levadura en condiciones de barrica y almacenamiento
se revisa el articulo elaborado en el Departamento Teacutecnico Guserbiot La rioja
Espantildea en este artiacuteculo se describe brevemente su metabolismo y su ecologiacutea en
las bodegas Igualmente se comparan las teacutecnicas utilizadas en los laboratorios
para su deteccioacuten y cuaacuteles son las limitaciones de los diferentes meacutetodos
Finalmente se analizan las estrategias desarrolladas para su eliminacioacuten de las
bodegas y se dan una serie de recomendaciones para su control48
El instituto de fermentaciones Industriales Consejo superior de investigaciones
cientiacuteficas Juan de Cierva Madrid Espantildea en el cual se revisa la formacioacuten de
etilfenoles (4 etil-fenol 4 etil guayacol) en vinos tintos anejos Los factores
fisicoquiacutemicos que favorecen el crecimiento de la levadura no deseada
BrettanomycesDekkera las teacutecnicas usadas para la detectar la presencia de esta
levadura en vinos ( Revisioacuten microscoacutepica fluorescente remocioacuten de aacutecidos
grasos de su membrana teacutecnicas moleculares como PCR y electroforesis) y de
control (Proteiacutenas fining Fining con gelatina liquida filtracioacuten variables
fisicoquiacutemicas adicioacuten de aditivos procedimientos de altas presiones
manipulacioacuten geneacutetica) con esta investigacioacuten se concluye que la combinacioacuten y el
uso de las numerosas teacutecnicas pueden ayudar a la prevencioacuten y reduccioacuten de la
levadura BrettanomycesDekkera 49 Este trabajo muestra las muacuteltiples opciones
47
A Morata S Benito F Palomero F Calderoacuten y J A Suaacuterez-Lepe Ecologiacutea y prevencioacuten de
BrettanomycesDekkera durante la elaboracioacuten y crianza de vinos tintos Revista enoacutelogos (Editada por la
Federacioacuten Espantildeola de Asociaciones de Enoacutelogos y Periodistas Asociados) No 50 paacuteg 1-12 Madrid Espantildea
48 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 20-
24 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
49 R Suarez JA Suarez-Lepe A Morata F Calderon 2006 The production of ethyl phenols in wine by yeasts
of the genera Brettanomyces and Dekkera A review Journal Food Chemistry No 102 pag 10-21 Madrid
Espantildea
36
existentes en el control y prevencioacuten de la levadura mencionada sin embargo deja
claro que la mayoriacutea de estas opciones son costosas y no de faacutecil adquisicioacuten para
una pequentildea industria
El anaacutelisis sensorial ha sido de los aspectos maacutes estudiados al respecto de
BrettanomycesDekkera una de estas investigaciones fue realizada en Centre
Europeacuteen des Sciences du Goucirct en Talence Francia en el cual se evaluaron 50
vinos bordeaux sensorialmente para demostrar la complejidad del ldquoCaraacutecter Brett‟‟
al cual se unen otros compuestos aromaacuteticos ademaacutes de los fenoacutelicos como acido
isobutirico e isovalerico en este tipo de vino debido a sus caracteriacutesticas
fisicoquiacutemicas50
De los meacutetodos de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera los medios
selectivos son muy populares es por esto que el Laboratorio de Microbiologiacutea
Departamento de Botanica e Engenharia Biologica Instituto Superior de
Agronomia Lisboa Portugal realizo un trabajo en el cual se pretendia desarrollar
un medio selectivo o diferencial capaz de aislar la levadura
BrettanomycesDekkera del vino y de la cadena productiva del vino con el fin de
detreminar la relacioacuten entre esta levadura y los compuestos 4-etilfenol y 4 etil-
guayacol51 otro estudio realizado para la deteccioacuten de dicha levadura fue
realizado en la Escola Superior de Biotecnologiacutea Universidade Catoacutelica
Portuguesa el desarrollo de un simple procedimiento compatible con las rutinas
50 Andrea Romano a Marie Claire Perello a Aline Lonvaud-Funel Gilles Sicard Gilles de Revel2008 Sensory
and analytical re-evaluation of lsquolsquoBrett characterrdquo Journal Food Chemestry No 114 pag 15-19 Talence
France
51 N Rodrigues G Gonccedilalves S Pereira-da-Silva M Malfeito-Ferreira and V Loureiro2001 Development
and use of a new medium to detect yeasts of the genera DekkeraBrettanomyces Journal of applied microbiology No 90 pag 588-599Lisboa Portugal
37
usadas en las vineras para la deteccioacuten de BrettanomycesDekkera en vino y en
maquinarias52
En el laboratorio de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas Alcohoacutelicas de la
Universidad de Zagreb se ha trabajado anteriormente en el desarrollo de medio
solido selectivo con pruebas de diferentes concentraciones de los compuestos
como resultados se encuentra una buen relacioacuten entre las concentraciones de los
compuestos sin embargo como recomendaciones se encuentran la falta de
antibioacutetico para evitar contaminacioacuten por bacterias probar con diferentes fuentes
de carbono para comparacioacuten de tiempo de crecimiento positivo y un monitoreo
diario en el medio53
Los compuestos aromaacuteticos que libera la presencia de BrettanomycesDekkera
estaacute asociada a los compuestos 4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinilfenol y 4
viniguayacol a partir de esto los centros de investigacioacuten han hondado en la
identificacioacuten de dichos compuestos relacionados en la enologiacutea y especialmente
con BrettanomycesDekkera a partir de eso el Departamento de Quiacutemica
Universidad de La Rioja Espantildea este estudio presenta un meacutetodo basado en el
uso de Cromatografiacutea de Gas y micro extraccioacuten en fase solida para el anaacutelisis
cuantitativo de 4-etilfenol 4-etil guayacol 4-vinilfenol 4-vinilguayacol
Demostrando la existencia de un efecto matriz en el anaacutelisis de compuestos
responsables del ldquocaraacutecter Brettrdquo en vino Este nuevo meacutetodo fue
satisfactoriamente aplicado a cierto nuacutemero de vinos tintos comerciales vinos
52
JA Couto A Barbosa and T Hogg 2005 A simple cultural method for the presumptive detection of the yeasts BrettanomycesDekkera in wines Letters in Applied Microbiology No 41 pag 505-510 Porto
Portugal
53 Serkovic Dubravka Gracin Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac
Brettanomyces bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet pag 1-117 ZagrebCroatia
38
blancos y roseacute Este meacutetodo puede ser una alternativa para evitar el efecto matriz
en muestras de vino54
De acuerdo con este tema en la jornada cientiacutefica del 99 el grupo de investigacioacuten
enoloacutegica se estudio la formacioacuten de sustancias volaacutetiles por 13 cepas de S
cerevisiae con buenas aptitudes enoloacutegicas inoculadas individualmente en un
mosto homogeacuteneo de la variedad airen fermentado en las mismas condiciones
de aireacioacuten y a temperatura controlada55
54
C Pizarro N Perez-del-Notario JM Gonzalez-Saiz 2007 Determination of Brett character responsible
compounds in wines by using multiple headspace solid-phase micro extraction Journal of Chromatography
No 1143 pag 176-181 La Rioja Espantildea
55 E Pueyo P Hidalgo K Fernaacutendez y P Martiacuten-Aacutelvarez 1999 Anaacutelisis de compuestos volaacutetiles en vinos
obtenidos con distintas cepas de Saccharomyces cerevisiae Aplicacioacuten de la teacutecnica de microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientificas 99 Grupos de Investigacion Enologica Zaragoza Espana
39
7 MATERIALES Y METODOS
A continuacioacuten se presentan materiales y meacutetodos para la investigacioacuten
Este proyecto fue realizado en su gran mayoriacutea en las instalaciones de la
Universidad de Zagreb en la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos
(PBF) Laboratorios del Departamento de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas
Alcohoacutelicas ubicado en la ciudad de Zagreb Croacia
Los anaacutelisis fisicoquiacutemicos del vino tinto Babic fueron realizados en los
laboratorios de VINOLAB ubicado en Zagreb Croacia
71 MEDIO SOLIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera
711 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Autoclave de laboratorio
Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa Etanol peptona extracto de levadura
agar cicloheximida acido cumaacuterico ampicilina)
Balanza electroacutenica de precisioacuten
Microscopio oacuteptico
712 Metodologiacutea
Basados en estudios anteriores realizados en el laboratorio para el desarrollo de
medio solido selectivo para BrettanomycesDekkera (Serkovic Dubravka Gracin
40
Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac Brettanomyces
bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet Universidad de Zagreb pag 1-
117 Zagreb Croacia) se evaluaron las recomendaciones mencionadas en dicha
investigacioacuten para la mejoriacutea y desarrollo de otros medios soacutelidos selectivos
Se usoacute como base el medio YPD (Yeast Peptone Dextrose) el cual estaacute
compuesto de la siguiente forma 20gL peptona 10 gl extracto de levadura 20 gl
de agar56 este medio es selectivo para levaduras pero no es selectivo entre ellas
Es necesario el uso de una fuente de carbono para la levadura
BrettanomycesDekkera de acuerdo a la teoriacutea y revisando la tabla 1 (Relacioacuten de
los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) y seguacuten
facilidades de disponibilidad en el laboratorio se utiliza glucosa la cual es
utilizable por entre 75-100 de las cepas de BrettanomycesDekkera seguacuten la
tabla mencionada anteriormente
Esta fuente de carbono (Glucosa) fue probada en una concentracioacuten de 20 gL
Cicloheximida fue probada a 30 mgL para inhibir Saccharomyces en el medio y
darle mayor selectividad para Brettanomyces Dekkera Se antildeade acido p-
cumarico en una concentracioacuten de 100 mgL como precursor para la formacioacuten
del compuesto 4 etilfenol caracteriacutestico de la levadura BrettanomycesDekkera
Para inhibir bacterias en el medio se usa ampicilina a 10 mgL esta se agrega
despueacutes de realizada la esterilizacioacuten y cuando la temperatura del medio este
igual o menor a 40C El pH del medio se ajusto a 5
Paralelamente se crea el medio con Etanol como fuente de carbono en una
concentracioacuten de 6 o 60 mlL con la misma concentracioacuten de los otros
compuesto como cicloheximida 30mgL acido cumarico 100mgL 20 gL peptona
10 gL de extracto de levadura 16gL de agar Este medio se crea como
56
Concentraciones preestablecidas en el laboratorio de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas alcoholicas
41
comparativo para determinar cual fuente de carbono es la maacutes utilizada por la
levadura Brettanomyces bruxellensis para su reproduccioacuten Seguacuten la teoriacutea (ver
tabla 1) el etanol es utilizado por entre 25-75 de las cepas de
BrettanomycesDekkera pero es el azuacutecar que se encuentra en mayor
concentracioacuten presente en los vinos tintos aproximadamente 130 gl57
Estos medios fueron debidamente esterilizados para eliminar cualquier
microorganismo o espora presente en este Este procedimiento se realizo por el
meacutetodo de combinacioacuten de altas temperatura y presioacuten (Autoclave 121 C a 1034
kPa)
Se usaron colonias de BrettanomycesDekkera aisladas anteriormente de vinos
contaminados y guardas para investigaciones en el Departamento de Tecnologiacutea y
Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos
Universidad de Zagreb Croacia
Los medios fueron monitoreados visualmente todos los diacuteas y se toman
observaciones de macroscoacutepicas y microscoacutepicas Se comparan estos dos medios
en teacuterminos de rapidez de crecimiento de la levadura y selectividad Estas
muestras fueron incubadas a 28C por 10 diacuteas
La prueba fue realizada por duplicado en diferentes tiempos
57
Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
42
72 MEDIO LIacuteQUIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera
721 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Frascos de vidrio esteacuteriles
Autoclave de laboratorio
Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa peptona extracto de levadura
cicloheximida acido cumarico ampicilina etanol)
Microscopio oacuteptico
Balanza electroacutenica de precisioacuten
722 Metodologiacutea
En el mercado para enologiacutea existen medio liacutequidos selectivos para la deteccioacuten
de BrettanomycesDekkera en vinos sin embargo estos son de difiacutecil accesibilidad
por sus elevados precios es por esto que se desarrolla un medio liquido selectivo
para dicha levadura en el laboratorio del Departmaneto de Tecnologiacutea y Anaacutelisis
de Bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia
Para este medio se toma como base el medio selectivo con Glucosa como fuente
carbono desarrollado anteriormente sin usar agar para mantener el medio en su
estado liquido
43
La composicioacuten de este medio liacutequido es la siguiente
20 gL Glucosa
20 gL peptona
10gL extracto de levadura
30mgL de cicloheximida
100mgL acido p-cumarico
10 mgL ampicilina
Estos compuestos fueron medidos en una balanza electroacutenica de precisioacuten se
antildeade 250 ml de agua destilada y se mezcla constantemente se pasa a proceso
de esterilizacioacuten en autoclave a 120C y 1034 KPa por 45 minutos
De esta forma se asegura la usencia de microorganismos yo esporas en el
medio Despueacutes de bajar la Temperatura a 40C se agrega a la mezcla ampicilina
en una concentracioacuten de 10mgL
En frascos de vidrio esteacuteril se agrega 40 ml de medio liacutequido y diferentes
cantidades iniciales de levaduras BrettanomycesDekkera fueron inoculadas al
respectivo medio el primer frasco tiene una cantidad de 106 ceacutelulasml el segundo
tiene 104 ceacutelulasml el tercero tiene 102 celulasml y el cuarto con una cantidad
aproximada de 25 ceacutelulasml Estas cantidades estaacuten basadas en estudios
anteriores para medios liacutequidos selectivos en levaduras58
58 J Ungar A M James P W Muggleton H F Pegler y E G Tomich1950 The Cultivation of
Haemophilus pertussis in Partially Defined Liquid Media Journal of General Microbiology No 4
pag 345-359 Greenford
44
Este medio liacutequido inoculado fue inspeccionado diariamente visualmente revisioacuten
de turbidez microscoacutepicamente y olfativamente para deteccioacuten de olores del
ldquocaraacutecter Brettrdquo
Los diacuteas fueron contabilizados para determinar resultados positivos en estos
ensayos
73 INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN
VINO TINTO DE LA REGION DE DALMACIA CROACIA
731 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Medio selectivo solido para BretanomycesDekkera
Medio selectivo Liquido para BrettanomycesDekkera
Quiacutemicos de laboratorio (Dioxido de Azufre (SO2) Antibrettreg Glucosa)
Vino Babic 2007
Anallizador infrarojo Bacchius II microdom
732 Metodologiacutea
Con los medios desarrollados (solido y liquido) se quiere conocer el efecto del
dioacutexido de azufre (SO2) y el producto Antibrettreg en la levadura
BrettanomycesDekkera presente en el vino tinto de la regioacuten de Dalmacia
Con las herramientas que se tienen en el laboratorio del departamento de
tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia se quiere
determinar la influencia de estos productos en la levadura BrettanomycesDekkera
presente en vino tinto croata de la regioacuten de Dalmacia Babic
45
El primer paso es adaptar la levadura al vino tinto croata (Babic) para esto se
inoculan 20 colonias de BrettanomycesDekkera en 500 ml de vino se antildeadioacute
glucosa en una concentracioacuten de 2gL y se oxigena la mezcla Para este paso de
adaptacioacuten se dejan las muestras de 1 a 2 diacuteas a temperatura ambiente (20C)
Despueacutes de este periodo se revisa microscoacutepicamente la presencia positiva de
BrettanomycesDekkera en los 500 ml de vino en los que se estaba haciendo el
paso de adaptacioacuten en Babic al comprobar su presencia positiva se procede a
mezclar los 500 ml de vino contaminado con BrettanomycesDekkera con los 3
Litros de vino Babic que se disponen para esta prueba
Estos 3 litros de vino tinto Babic contaminado con la levadura
BrettanomycesDekkera se reparten en 8 frascos de vidrios esteacuteriles al siguiente
diacutea se toman dos frascos para agregar cada uno de los compuestos a evaluar
(SO2 y Antibrettreg)
Para SO2 se toman dos frascos uno de 600ml y uno de 100ml se agrega una
concentracioacuten de 40 mgl
Para el producto AntiBrettreg se toman cuatro frascos dos de 600 ml y dos de 100
ml seguacuten especificaciones del producto y la alta poblacioacuten de
BrettanomycesDekkera en las muestras se adiciono la maacutexima concentracioacuten de
AntiBrettreg a las muestras la cual fue de 40 gHl
Estas muestras se dejaron a temperatura ambiente simulando condiciones de
almacenamiento del vino en barricas temperatura aproximada de 20C evitando el
contacto con la luz solar y evitando movimientos fuertes Esto se mantuvo por 15
diacuteas que fue el tiempo de duracioacuten del experimento
Con el vino restante se mantuvo en las mismas condiciones de almacenamiento
de los demaacutes para hacer un paralelo de comparacioacuten
Previamente se analizaron las caracteriacutesticas del vino sin contaminar por medio
del analizador infrarrojo Bacchus II microdom antes de agregar los compuestos
46
SO2 y AntiBrettreg y despueacutes se volvioacute a realizar el anaacutelisis para determinar los
efectos de estos compuestos en el vino y asiacute mismo al de control
74 DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN
EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO
MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE
741 Materiales
Cromatografo de Gas HP5890 Serie II
Microextractor de fase solida (SPME)
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Quiacutemicos de laboratorio (p-cresolAcetaldehido Propanol diacetil etil-
acetato i-butanol acido aceacutetico i-amil-alcohol n-amil lactato de etilo
acetato amil metiacutelico 1-hexanol etil-hexanol linalol nerol citronelol
geraniol 2-feniletanol octanoato de etilo 4-etilfenol 2-feniletil acetato 4-
etilguaiacol)
Vino Tinto Babic
Agua destilada
742 Metodologiacutea
El meacutetodo fue desarrollado anteriormente en el Departamento de Tecnologiacutea y
Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos de
la Universidad de Zagreb Croacia Y despueacutes de modificaciones fue utilizado en el
desarrollo del trabajo El meacutetodo utilizado es descrito a continuacioacuten
47
Cromatografo de gas HP 5890 SERIES II
Programa HP-chem
a) Condiciones para analisis SPME-GC
Muestra diluida 5050 con adicion de estandar interno (p-cresol1mgl)
25ml de la muestra diluida con mezcla continua a temperatura ambiente
Tiempo de adsorcion 30 minutos
SPME es colocado en la muestra para la adsorcion durante el tiempo
previsto
b) Condiciones para el Cromatografo de gas (GC)
La columna usada en este experimento es RTXreg-5 (Restec USA sn 210627)
30m id=025mm 025μm
Gas portador Nitrogeno
Flujo del Nitrogeno 5 mlmin
Temperatura del inyector 240 C
Temperatura del detector 250 C
Temperaturas programadas 35 C5 min 150 C 34 Cmin 180 C
10Cmin 190 C 5 Cmin
Se conocen los resultados del cromatografiacutea de gases (ver tabla 10) y se hacen
necesarias varias correcciones del meacutetodo y algunas pruebas con unos
compuestos para determinar realmente su tiempo de retencioacuten en este tipo de
vino Se deben comprobar tiempos de retencioacuten
48
8 DISCUSIOacuteN Y RESULTADOS
81 RESULTADOS PARA EL DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO
Tabla 2 Medio Selectivo con Glucosa como fuente de carbono para
BrettanomycesDekkera en incubacioacuten por 5 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten
microscoacutepica
1 Negativo Negativo - No se realiza
2 Negativo Negativo - Presencia de levaduras
3 Negativo Negativo - Presencia de
Levaduras
4 Aparicioacuten de
algunas colonias
Negativo Transparente Presencia de levaduras
5 Colonias definidas Positivo-
Fenoles
Amarillo Presencia positiva de
BrettanomycesDekkera
49
Este medio tiene alto grado de selectividad para levaduras con un tiempo de
crecimiento de aproximadamente 5 diacuteas en 28C lo que lo hace raacutepido gracias al
antibioacutetico (ampicilina) que hace parte de la composicioacuten del medio no hay
presencia de bacterias Se hace confiable para resultados positivos de levaduras
BrettanomycesDekkera debido a que las levaduras Saccharomyces fueron
inhibidas con el compuesto cicloheximida su selectividad fue comprobada por
revisioacuten microscoacutepica macroscoacutepica y sensorial
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con glucosa como fuente de carboacuten son las
siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
50
Tabla 3 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono para Brettanomyces Dekkera en
incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica
1 Ninguno Negativo - -
2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras y
bacterias
9 Diminutas
colonias
transparentes
Negativo Transparentes Presencia de levaduras y
algunas bacterias
10 Positivo Positivo-
Fenoacutelicos
Amarillo Presencia de levaduras
BrettanomycesDekkera y
bacterias
El medio selectivo para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de
carbono tambieacuten es selectiva entre levaduras ya que solo se identifico la levadura
BrettanomycesDekkera en este sin embargo se evidencia una presencia de otro
microorganismo presuntamente bacteria ya que este medio no contiene agente
antibacteriano (ampicilina) Es necesaria la adicioacuten de ampicilina en una
concentracioacuten de 10mgl para inhibir la presencia de bacterias
Este medio presenta un tiempo maacutes prolongado para mostrar crecimiento de la
levadura BrettanomycesDekkera aproximadamente 10 diacuteas
51
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las
presentadas en el medio selectivo con glucosa como fuente de carbono y son las
siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
52
Tabla 4 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono y adicioacuten de ampicilina para
Brettanomyces Dekkera en incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica
1 Ninguno Negativo - -
2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
9 Diminutas
colonias
transparentes
Negativo Transparentes Presencia de levaduras
10 Positivo Positivo-
Fenoacutelicos
Amarillo Presencia de levaduras
BrettanomycesDekkera
El efecto de la ampicilina sobre el medio selectivo con etanol como fuente de
carbono fue el esperado inhibioacute completamente el crecimiento de colonias
bacterianas en el medio el tiempo de crecimiento de la levadura y presencia de
aromas fenoacutelicos fue el mismo de 10 diacuteas en incubacioacuten de 28C
53
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las
presentadas anteriormente y son las siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
82 RESULTADOS PRUEBAS MEDIO LIQUIDO
Tabla 5 Influencia de la concentracioacuten de levaduras BrettanomycesDekkera en el
tiempo necesario para detectar la produccioacuten de 4-etil-fenol en medio liquido
Nuacutemero de ceacutelulas ml
(concentracioacuten final)
Tiempo necesario para obtener resultados
positivos (diacuteas)
1 Experimento
32x106 le 3
3 X 104 3
33x102 7
40 No detectado
2 Experimento
43x106 le3
39x104 le3
37x102 8
62 No detectado
54
El nuacutemero de ceacutelulas de levadura de BrettanomycesDekkera fue contabilizado
usando contador de ceacutelulas Chamber
Los aromas fenoacutelicos son difiacuteciles de detectar debido al fuerte olor que tiene el
medio liquido caracteriacutestico de sus componentes esto dificulta la identificacioacuten del
ldquocaraacutecter Brettrdquo en especial cuando las concentraciones de
BrettanomycesDekkera no son elevadas Ademaacutes de los olores fenoacutelicos otros
compuestos volaacutetiles se detectan tales como acido aceacutetico y olores oxidativos
tambieacuten producido por la levadura BrettanomycesDekkera
En la inspeccioacuten visual se detecta alta turbidez en el medio Se compara con un
medio sin presencia de BrettanomycesDekkera
En las muestras con mayor concentracioacuten de la levadura es maacutes notoria la
turbidez Despueacutes de 3 diacuteas se presenta un precipitado blanco en todas las
muestras de altas concentraciones
La revisioacuten microbioloacutegica se realiza diariamente para determinar el nuacutemero de
ceacutelulas y la presencia positiva de la levadura a evaluar
Entre los dos experimentos realizados con el medio liquido el tiempo que se
demoro en detectar compuestos fenoacutelicos fue muy similar entre ellos
dependiendo del nuacutemero de ceacutelulas en el medio en mayores concentraciones el
tiempo de deteccioacuten fue menor
Hay que sentildealar que BrettanomycesDekkera debe alcanzar una concentracioacuten
miacutenima (denominada poblacioacuten criacutetica) de 103 UFCml para comenzar a liberar etil
fenoles Por debajo de esta concentracioacuten la levadura seriacutea metaboacutelicamente
activa pero no produciraacute compuestos alterantes a niveles detectables esto se ve
reflejado en los resultados en los que las concentraciones de ceacutelulas son muy
bajas
55
Estos resultados se comparan con los resultados dados en el medio solido Los
dos medios muestran altos grados de selectividad hacia la levadura
BrettanomycesDekkera y similar comportamiento para el crecimiento de dicha
levadura
En el medio liacutequido cuando hay altas concentraciones de BrettanomycesDekkera
el tiempo de deteccioacuten del microorganismo es menor que con el medio solido pues
en el liacutequido es aproximadamente 3 diacuteas y en el soacutelido son 5 diacuteas
83 RESULTADOS DE LA INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE
(SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO DE LA REGION DE
DALMACIA CROACIA
El vino fue analizado antes de la adicioacuten de los compuestos quiacutemicos a evaluar y
15 diacuteas despueacutes de adicioacuten para ver la reaccioacuten de este frente a SO2 y Antibrettreg
estas caracteriacutesticas se determinaron con el equipo de laboratorio Bacchus II
Microdom localizado en el laboratorio Vinolab doo Zagreb Croacia Los
resultados se muestran en la tabla
Tabla 6 Resultados de las muestras de vino inoculados con la levadura BrettanomycesDekkera
durante 15 diacuteas Comparativos con los diferentes compuestos
CFUml
Vino Day 1 Day 4 Day 10 Day 15
Control 130E+04 800E+03 700E+03 500E+03
Control 800E+03 640E+03 700E+03 280E+03
SO2 110E+04 400E+02 400E+02 67
SO2 900E+03 380E+03 270E+03 183
Antibrett 140E+05 920E+04 140E+04 400E+03
Antibrett 210E+05 181E+05 160E+04 900E+03
Antibrett 120E+05 990E+04 120E+04 100E+03
Antibrett 230E+05 204E+05 300E+03 200E+03
56
Tabla 7 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 antes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o
Antibrettreg Diacutea 0
Alcohol
()
Acidez Total
(gr Aci
Tartaacuterico L)
Acidez volaacutetil
(Aci
AceacuteticoL)
Densidad
(grml)
Azuacutecar residual
(grl)
Extracto
seco
(grl)
Acido
Laacutectico
(grl)
Glicerol
(grl)
Taninos
(grl)
Acetato
(grl)
1473
525
083
09928
473
332
164
799
305
117
1471
522
084
09927
479
329
162
786
299
116
Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
Tabla 8 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 despueacutes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o
Antibrettreg Diacutea 15
Alcohol
()
Acidez Total
(gr Aci
Tartaacuterico L)
Acidez volaacutetil
(Aci
AceacuteticoL)
Densidad
(grml)
Azuacutecar residual
(grl)
Extrac
to seco
(grl)
Acido
Laacutectico
(grl)
Glicerol
(grl)
Taninos
(grl)
Acetatos
(grl)
Control
1414
565
107
09935
436
364
177
827
259
136
Control
1415
556
108
09936
420
365
170
824
256
137
SO2
1456 543 108 09932 476 369 167 803 281 125
SO2
1457
542 108 09933 472 370 170 804 271 124
Antibrett 1454 533 106 09933 448 371 175 813 277 125
Antibrett 1455 534 105 09933 460 372 171 809 282 124
Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
57
Figura 4 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en el vino de control para
evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas
El comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en la prueba por
duplicado en el vino de control fue muy similar pues con el tiempo esta levadura
deja de reproducirse y va muriendo cuando las condiciones ya no son aptas para
su desarrollo debido a que la mayoriacutea de su fuente de carbono (Glucosa) esta
consumida sin embargo esta levadura no llega a su desaparicioacuten total lo que
representa uno de los mayores problemas en la elaboracioacuten del vino
Esta levadura tiene un metabolismo lento y el factor tiempo es un requisito
fundamental para su desarrollo este experimento se empezoacute con una alta
poblacioacuten de BrettanomycesDekkera (130 x 104 UFCml y 8 x 103 UFCml
respectivamente) y durante el transcurso del tiempo la poblacioacuten fue disminuyendo
debido a la perdida de las condiciones necesarias para la reproduccioacuten
58
Figura 5 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de SO2 en
concentracioacuten de 40 mgl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas
El SO2 tuvo un comportamiento efectivo y raacutepido contra las colonias de
BrettanomycesDekkera La poblacioacuten de esta levadura se redujo de forma
significativa entre el diacutea primero y el cuarto se encontroacute una diferencia porcentual
de 96 en la primera prueba y del 60 en la de duplicado al diacutea 15 ya la
poblacioacuten era casi nula pasando raacutepidamente de un numero por encima de la
poblacioacuten critica de la levadura BrettanomycesDekkera a un numero lt103 UFCml
siendo muy eficaz y raacutepido en el manejo de produccioacuten
Este compuesto ademaacutes de favorecer la extraccioacuten de los compuestos fenoacutelicos y
de su actividad antioxidante al inhibir la accioacuten de las polifenoloxidasas a dosis
adecuadas de un maacuteximo de 50gl inhibe la multiplicacioacuten bacteriana y de
levaduras
59
Figura 6 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de
Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo
de 15 diacuteas
Figura 7 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de
Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo
de 15 diacuteas
El compuesto Antibrettreg en la primera prueba tanto como en el duplicado tuvo su
mayor tiempo de reduccioacuten de UFCml entre los diacuteas 4-10 con una diferencia
porcentual de 91 en comparacioacuten con el diacutea cuarto al decimo a diferencia de
60
SO2 el cual presenta la gran disminucioacuten de colonias entre los primeros diacuteas de
agregarse el producto
El tiempo para que la poblacioacuten de la levadura llegara a la cantidad menor a la de
la poblacioacuten critica es mucho mayor que la del compuesto SO2 sabiendo que esta
poblacioacuten debe ser lt103 UFCml
El compuesto Antibrettreg puede tardarse 4-10 diacuteas en representar una reduccioacuten
de UFCml significativa en dicho tiempo puede representar grandes peacuterdidas
nutricionales y altos costos de produccioacuten para la fabricacioacuten
Figura 8 Comportamiento del contenido de alcohol en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin adicioacuten)
hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
BrettanomycesDekkera estaacute presente en vinos de alto contenido alcohoacutelico
aproximadamente entre 125 a 14 pues esta levadura toma a etanol como
fuente de carbono y este vino (Babic) procede de uvas muy maduras las cuales
presentan mayor cantidad de azuacutecares residuales (como glucosa y fructosa y
otras pentosas residuales)
138
14
142
144
146
148
Alcohol
Day 0 Day 15
61
Analizando el comportamiento del vino durante el experimento de 15 diacuteas sin
compuestos quiacutemicos y con SO2 y Antibrettreg a partir de las caracteriacutesticas
iniacuteciales que se determinaron seguacuten el equipo BACCHUS analizador infrarrojo se
presenta en general una reduccioacuten del contenido alcohoacutelico de este vino pero se
ve una mayor reduccioacuten en el vino de control el cual redujo en un 394 su
contenido alcohoacutelico desde el dia 0 hasta el diacutea 15 este vino no tiene ninguacuten
compuesto contra la levadura BrettanomycesDekkera y por su elevada presencia
en los 15 diacuteas de experimento consumioacute esta cantidad de etanol
Mientras en el vino que conteniacutea SO2 tras 15 diacuteas de tratamiento se vio una
reduccioacuten de alcohol de 1 ya que este compuesto redujo la cantidad de
BrettanomycesDekkera en los primeros diacuteas de tratamiento previniendo su
reproduccioacuten y protegiendo el contenido alcohoacutelico del vino Babic 2007
En los vinos de prueba con Antibrett reg la reduccioacuten alcohoacutelica se dio en un
porcentaje de 122 un poco maacutes alta que con SO2 y mucho maacutes baja en
comparacioacuten del vino de control este compuesto tambieacuten previno la gemacioacuten de
la levadura evitando la perdida de etanol en el vino sin embargo como este
compuesto duro mas en este proceso de eliminar BrettanomycesDekkera se
produjo una mayor peacuterdida alcohoacutelica
62
Figura 9 Comportamiento del contenido de acidez volatil en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin
adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
Debido a la presencia de oxigeno en los frascos la acidez volaacutetil aumento pero no
significativamente en las muestras No hubo grandes diferencias entre las
muestras con compuestos y las de control por lo que se deduce que estos
compuestos no ayudan a evitar esta acidez Esta acidez tan alta puede dantildear la
calidad del vino de forma casi irreparable Pero el factor oxigeno es de los maacutes
controlados en la produccioacuten de vinos
la alteracioacuten del aumento de la acidez volaacutetil no estaacute relacionada con la levadura
BrettanomycesDekkera sino a la presencia de oxigeno en el almacenamiento el
oxigeno fue usado en esta prueba para promover condiciones apropiadas para el
desarrollo de la levadura
002040608
112
Acidez Volatil
Day 0 Day 15
63
Figura 10 Comportamiento del contenido de Acido Acetico en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin
adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
Brettanomyces Dekkera son productores de aacutecido aceacutetico y elevan el contenido
de los vinos anormalmente en condiciones de anaerobiosis En condiciones de
aerobiosis producen concentraciones bajas o nulas de aacutecido aceacutetico
Este acido aceacutetico al igual que los fenoles afecta el sabor y el perfil olfativo del
vino tinto este efecto es tambieacuten producido por la levadura
BrettanomycesDekkera vemos en los resultados el gran crecimiento de este
compuesto en el vino control el cual no tenia compouestos en contra de
BrettanomycesDekkera lo que produjo este aumento significativo del acido aceacutetico
en comparacioacuten con estos que teniacutean SO2 y Antibrettreg entre ellos la diferencia en
este compuesto es muy reducida y no significativa pues estos compuestos no
permitieron la gemacioacuten de esta levadura y esta no produjo este acido en esa gran
cantidad
A este compuesto se le atribuye el olor y sabor a vinagre del vino tinto un defecto
muy comuacuten y poco agradable para el consumidor
105110115120125130135140
Acido Acetico
Day 0 Day 15
64
Figura 11 Comportamiento del contenido de Azucares reductores en vino Babic 2007
desde el diacutea 0 (sin adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en
comparacioacuten con el vino de control
BrettanomyesDekkera utiliza los azucares residuales como fuente de carbono
para su crecimiento en el vino este es el factor maacutes importante para su desarrollo
y este es el que determina en cierto caso la cantidad de levaduras de
BretanomycesDekkera presente en las graficas se determina claramente que en
el vino de control donde la cantidad de esta levadura es muy alta 15 diacuteas despueacutes
de empezar las pruebas la cantidad de azucares reductores es muy baja y ha
bajado en un porcentaje de 10 mientras que el vino que tiene SO2 bajo la
cantidad de azucares reductores en un 042 y el vino que tiene el compuesto
Antibrettreg redujo su nivel de azucares reductores en 462
38
4
42
44
46
48
5
Azucares Reductores
Day 0 Day 15
65
84 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE
CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON
EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID
PHASE
Tabla 10 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en
vino Babic 2007 con el meacutetodo propuesto
Compuesto Tiempos de
retencioacuten (min)
Acetaldehiacutedo 1437
Propanol 3759
Diacetil 4202
Etil-acetato 4523
i-butanol 6232
Acido Aceacutetico 7840
i-amil alcohol 11740
n-amil 13489
lactato de etiacutelico 15741
acetato amil metiacutelico 17796
1-hexanol 19101
etil-hexanol 24456
Linalol 30370
2-feniletanol 32768
p-cresol 33522
octanoato de etilo 34226
4-etilfenol 37100
2-feniletil acetato 32769
4-etilguayacol 39704
4 vinilfenol 40529
decanoato de etilo 42117
Refirieacutendose a estos resultados es necesaria la creacioacuten de soluciones estaacutendar
para determinar tiempos de retencioacuten con el meacutetodo y si es necesario ajustes a
este
66
Tabla 11 Soluciones estaacutendar para compuestos en vinos tintos Croatas
MODEL 0
(en volumen de 100 ml en 40 Etanol)
Compuesto Pureza Cantidad
(g)
Concentracioacuten (gl)
Acetaldehiacutedo 099 1623 160677
Propanol 0995 13849 137718
Diacetil 098 01071 104958
Etil-acetato 0995 30172 3002114
i-butanol 099 15016 1486584
Acido Acetico 0995 0 0
i-amil alcohol 099 20116 1991484
n-amil 098 15442 1513316
lactato de etilio 098 00507 049686
acetato amil metilico 098 01028 100744
1-hexanol 098 00367 035966
etil-hexanol 098 00308 029876
Linalol 097 00288 027936
Nerol 097 00311 030478
Citronelol 098 0031 03038
Geraniol 098 15803 1548694
2-feniletanol 098 00402 039396
4-etilfenol 098 00812 078764
octanoato de etilo 097 00597 059103
2-feniletil acetato 099 00315 031185
4-etilguayacol 098 00803 079674
Fuente Laboratorio de anaacutelisis e investigacioacuten de bebidas Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea
de Alimentos Universidad de Zagreb Zagreb Croacia 2009
Las soluciones estaacutendar se realizan teniendo como referencia las cantidades de
estos compuestos en los vinos tintos croatas datos suministrados por el Doctor
Leo Gracin en concentraciones de gl a partir de este dato y teniendo en cuenta
67
la pureza de los compuestos que se teniacutean en el laboratorio de anaacutelisis e
investigacioacuten de bebidas se crean las soluciones estaacutendar Ejemplo
Solucioacuten estaacutendar para 4 etil-fenol en un volumen de 100 ml
Con estas soluciones estaacutendar se realizo el tiempo de retencioacuten para corroborar el
meacutetodo Los resultados de esto fueron tiempos de retencioacuten diferentes a los del
meacutetodo primero con el que se realizaron los ensayos y a partir de esos resultados
se ajusto el meacutetodo con el que se trabajo
68
Tabla 12 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en
vino Babic 2007 con el meacutetodo modificado
Compuesto Tiempos de
retencioacuten (min)
Acetaldehiacutedo 1542
Propanol 4046
Diacetil 4733
Etil-acetato 4807
i-butanol 6659
Acido Acetico 8343
i-amil alcohol 12123
n-amil 13866
lactato de etilio 16072
acetato amil metilico 18336
1-hexanol 19447
etil-hexanol 24835
Linalol 31831
2-feniletanol 33305
p-cresol 33703
octanoato de etilo 34571
4-etilfenol 37724
Citronelol 38326
Nerol 38576
2-feniletil acetato 39012
Geraniol 39944
4-etilguayacol 40271
4 vilifenol 41168
decanoato de etilo 42657
69
DIA 0
Se coloca ISTD a todas las muestras respectivas para poder determinar
cantidades de los compuestos aromaacuteticos
Se realiza la cromatografiacutea de gas al vino Babic 2007 antes de ser inoculado con
BrettanomycesDekkera
Tabla 13 Resultados de la cromatografiacutea de gas del vino Babic 2007
Compuesto Tiempo de retencioacuten
min
Cantidad
mgl
Acetaldehiacutedo 1542 0
Propanol 4046 0
Diacetil 4733 37215204
Etil-acetato 4807 0
i-butanol 6659 0
Acido Aceacutetico 8343 2817465
i-amil alcohol 12123 16799019
n-amil 13866 26
lactato de etiacutelico 16072 10983961
acetato amil metiacutelico 18336 0185196
1-hexanol 19447 264655
etil-hexanol 24835 0158751
Linalol 31831 0
2-feniletanol 33305 4235560
p-cresol 33703 1
octanoato de etilo 34571 0152412
4-etilfenol 37724 00581345
Citronelol 38326 00439729
Nerol 38576 00344799
2-feniletil acetato 39012 00407983
Geraniol 39944 0
4-etilguayacol 40271 0
4 vilifenol 41168 0
Decanoato de etilo 42657 00190144
70
Basados en los compuestos aromaacuteticos que brinda el ldquoCaraacutecter Brettrdquo se van a
analizar detalladamente los siguientes aromas 4-Etilfenol 4-Etilguayacol 4-
Vinylfenol
Figura 12 Compuestos aromaticos en vino tinto Babic sin estar contaminado con la levadura
BrettanomycesDekkera
El vino a analizar esta por debajo de las concentraciones consideradas como
perjudiciales para el aroma del vino tinto (El umbral sensorial del 4-etilfenol es de
230 μgl y el del 4-etilguaiacol es de 47 μgl) pues posee una concentracion de
58microgL de 4etilfenol 0 microgL de 4 etilguayacol y 0 microgL de vinylfenol
841 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGUacuteN TEMPERATURAS
DE ALMACENAMIENTO
0
02
4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinylfenol
Vino 00581345 0 0
C (
mg
L)
Vino Babic 2007 Dia 0
71
Tabla 14 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el
ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 20C por 4 diacuteas Prueba por duplicado
MUESTRAS INCUBADA A 20C
Compuesto Day 1
Amount
(mgL)
Day 2
Amount
(mgL)
Day 3
Amount
(mgL)
Day 4
Amount
(mgL)
4-etilfenol 0260244 017294 0177547 020156
4-etilfenol 0260244 0245915 0204542 0262499
4-etilguayacol 0 0 0 0
4-etilguayacol 0 0 0 0
4 vinilifenol 1107096 781349 685317 460323
4 vinilifenol 1107096 1297465 621324 693225
72
Figura 13 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
BrettanomycesDekkera es la levadura responsable de la produccion de 4-etil-
fenol compuesto asociado con olores caracteristicos a ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 00581345 0260244 0172935 0177547 020156
C (
mg
L)
4 etilfenol
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 00581345 0260244 0245915 0204542 0262499
C (
mg
L)
4 etilfenol
73
caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo dantildeando la calidad sensorial del vino tinto Babic la
produccioacuten de este compuesto en esta muestra realizada por duplicado fue
ascendente y tuvo incremento muy grande en el primer dia de almacenamiento y
en el transcurso de los siguientes cuatro diacuteas se mantuvo relativamente estable lo
cual no concuerda con el comportamiento tiacutepico de esta levadura quien tiene un
crecimiento lento e incrementa la produccioacuten de fenoles con su gemacioacuten esto
genera muchas dudas sobre el buen funcionamiento del equipo GC o de la
estabilidad de las levaduras BrettanomycesDekkera en este almacenamiento
Figura 14 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar prueba por duplicado
002040608
1
Vino Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0 0 0
4 etilguayacol
002040608
1
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0 0 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
74
Presencia negativa de 4 etil guayacol durante todo el almacenamiento
probablemente las condiciones de almacenamiento y el medio no dieron lugar al
desarrollo de este compuesto el cual se considera menos conflictivo que el 4-etil-
fenol
Figura 15 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
Estos resultados tambieacuten dejan dudas del normal comportamiento de dicha
levadura pues indican que la levadura no convirtioacute este compuesto en etilfenol
0
2
4
6
8
10
12
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 110709781349685317460323
4 vinylfenol
0
2
4
6
8
10
12
14
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
Series1 0 11071 12974 62132 69322
C (
mg
l)
4 Vinylfenol
75
durante el almacenamiento caracteriacutestica que solo la levadura
BrettanomycesDekkera puede realizar se ve que las concentraciones de
vinylfenoles son mucho mas altas que las de fenoles lo que nos deja determinar
que la poblacioacuten de BrettanomycesDekkera es muy baja y existen otras levaduras
productoras de vinylfenoles en este tipo de vino en las condiciones de
almacenamiento dadas para estas pruebas
Tabla 16 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el
ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 28C por 4 diacuteas
MUESTRA 2 INCUBADA A 28C
Compuesto Day 1
Amount
(mgL)
Day 2
Amount
(mgL)
Day 3
Amount
(mgL)
Day 4
Amount
(mgL)
4-etilfenol 0260244 019612 0186614 019932
4-etilfenol 0260244 020576 0214917 0193554
4-etilguayacol 0 014304 0223836 0
4-etilguayacol 0 002287 00529832 0
4 vinilifenol 1107096 787068 665182 397847
4 vinilifenol 1107096 284389 00204392 0
76
Figura 16 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar
El desarrollo de este compuesto en el diacutea 1 fue significativo y luego relativamente
estable el comportamiento fue similar en las pruebas de diferentes temperaturas
de almacenamiento para este compuesto el cual es el maacutes problemaacutetico en la
industria viniacutecola
0
005
01
015
02
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 005813019932018661019611019932
4 etilfenol
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 005813 019355 021491 020576 026024
4 etilfenol
77
Figura 17 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar
Los resultados de la prueba son poco confiables y no entendibles por lo que
podemos verificar que el GC no estaacute trabajando de forma adecuada para la
deteccioacuten del compuesto
0001002003004005006
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 Etilguayacol 0 0 0022 0053 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
0005
01015
02025
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0223 0143 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
78
Figura 18 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
El comportamiento de este compuesto en la prueba es muy irregular y poco
confiable
0
2
4
6
8
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 397847665182787068397847
4 vinylfenol
0
2
4
6
8
10
12
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 11071 28438 00204 0
4 vinylfenol
79
Figura 19 Comportamiento del compuesto 4 etilfenol durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
La concentracioacuten de 4 etil fenol fue mayor al cuarto diacutea almacenado a
temperatura ambiente de 20C pero este compuesto no tuvo una actividad notoria
de ascenso durante su almacenamiento como se esperaba lo que deja muchas
dudas sobre los resultados de este ensayo
0
05
1
15
2
25
3
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etil fenol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 20C
80
Figura 20 Comportamiento del compuesto 4 etil guayacol durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
Comportamiento anormal del compuesto no se ve tendencias de aumento o
disminucioacuten de este en ninguna de las pruebas no tiene un comportamiento
regular pues se esperaba que la levadura BrettanomycesDekkera
descarboxinizara el compuesto 4-vinilguaiacol y aumentar las concentraciones de
4-etilguaiacol esta reaccioacuten no se hizo notoria en los compuestos aromaacuteticos
seguacuten lo determino el Cromatografo de Gas (GC)
0
005
01
015
02
025
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3
C (
mg
L)
4 etil guayacol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 20C
81
Figura 21 Comportamiento del compuesto 4 Vinyl fenoll durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
La no presencia de este compuesto en el vino original demuestra las baja o casi
nula presencia de la levadura BrettanomycesDekkera al diacutea primero este
compuesto incrementa de forma notoria en las muestras debido a la presencia de
acido cumaacuterico en el medio ya que sufre su carboxilacion convirtieacutendose en 4 vinyl
fenol sin embargo su comportamiento no fue regular y presento problemas de
lecturas
0
2
4
6
8
10
12
14
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
C (
mg
L)4 Vinyl fenol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 28C
82
9 CONCLUSIONES Y
RECOMENDACIONES
91 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO
Se desarrolloacute un medio selectivo soacutelido para BrettanomycesDekkera
accesible y faacutecil de elaborar
Se detectan colonias de la levadura BrettanomycesDekera en el agar
selectivo con glucosa como fuente de carbono en un lapso de 5 diacuteas en
incubacioacuten a 28C
El medio selectivo soacutelido con Glucosa como fuente de carbono fue maacutes
raacutepido y efectivo ya que toma 5 diacuteas para dar resultados positivos frente al
de Etanol como fuente de carbono el cual toma 10 diacuteas para mostrar
resultados positivos aunque ambos dieron resultados satisfactorios en la
selectividad de la levadura BrettanomycesDekkera
La levadura se adapto de forma satisfactoria a estos medios en
condiciones de almacenamiento propias para su desarrollo (28C)
Las colonias de la levadura BrettanomycesDekkera tiene un crecimiento
en estos medios soacutelidos de forma circular con topografiacutea convexa y borde
entero dimensiones 5-6 mm color Amarillo opacicidad oscuro
83
superficie lisa y suave siendo faacutecil de identificar y realizar los conteos
necesarios
El medio solido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten
de la levadura BrettanomycesDekkera en vino tinto es raacutepido econoacutemico
y uacutetil
El uso de azucares para fermentacioacuten de la levadura
BrettanomycesDekkera que Saccharomyces no puede fermentar para
mayor selectividad
Realizacioacuten de pruebas Bioquiacutemicas como meacutetodo raacutepido de selectividad
92 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DESARROLLO DEL MEDIO LIacuteQUIDO
Se desarrollo un medio selectivo liquido para BrettanomycesDekkera
accesible y faacutecil de elaborar
Este medio mostroacute resultados positivos de la presencia de
BrettanomycesDekkera en un lapso de tiempo menor (3 diacuteas) que con el
medio solido (5 diacuteas) en caso de que el nuacutemero de ceacutelulas de la levadura
BrettanomycesDekkera sea mayor a la poblacioacuten critica (103)
Cuando la poblacioacuten de ceacutelulas de la levadura BrettanomycesDekkera es
menor a la poblacioacuten critica el tiempo de identificacioacuten de esta levadura por
medio liquido es muy prolongado puede tomar maacutes de 10 diacuteas o incluso no
detectarlo
84
Los compuestos quiacutemicos usados para el desarrollo del medio liacutequido no
son los adecuados para este tipo de medios donde los resultados positivos
son olfativos pues estos compuestos emiten fuertes olores que confunden
los olores caracteriacutesticos del caraacutecter Brett
El medio liquido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten
de altas concentraciones de la levadura BrettanomycesDekkera en vino
tinto es raacutepido econoacutemico y uacutetil
93 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg
EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE DALMACIA
CROACIA
Este trabajo mostroacute que el dioacutexido de azufre (SO2) tiene buenos resultados
en contra de la levadura BrettanomycesDekkera en concentraciones
normales de 40mgl concentracioacuten en la que se trabaja este compuesto en
los vinos tintos
En Europa el dioacutexido de azufre es usado de forma tradicional en gran
nuacutemero de alimentos y especialmente en vinos sin embargo y a pesar de
su uso regulado se busca la sustitucioacuten de este o su maacutexima reduccioacuten
para hacer de este producto maacutes sano para las personas no tolerantes a
este tipo de compuestos sin embargo seguacuten el trabajo realizado en
comparacioacuten con el producto Antibrettreg el SO2 es maacutes eficaz en el control
85
de la levadura ayudando a evitarla y eliminarla de la cadena productiva del
vino tinto
Gracias a sus caracteriacutesticas el vino tinto Babic es muy vulnerable a la
levadura BrettanomycesDekkera pero a su vez se puede tratar faacutecilmente
con productos como SO2 y Antibrettreg aunque es maacutes efectivo contra
BrettanomycesDekkera el dioacutexido de azufre (SO2)
Antibrettreg es una buena opcioacuten para el control de BrettanomycesDekkera
para evitar el uso de productos alergenicos como SO2
94 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN
EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO
MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE
Al terminar la primera prueba con anaacutelisis en cromatografiacutea a gas y el SPME
queda como resultados
Es necesario repetir la prueba
No se determina el efecto de los estaacutendares internos sometidos a tiempos
de almacenamiento en temperaturas de 20C y 28C lo que puede dar falsos
resultados de cantidades de compuestos
86
Se debe crear un medio maacutes apto para el desarrollo de la levadura y un
control diario de crecimiento ( agregar maacutes Glucosa en caso de que se
haya consumido toda controlar presencia de Bacterias y otros
microorganismos que no se deseen en el medio)
Es necesario control de aromas con panel sensorial para determinar el
umbral de deteccioacuten en este vino
Control de crecimiento por medio solido Selectivo para
BrettanomycesDekekra conteo de colonias presentes en el vino inoculado
y su desarrollo durante almacenamiento a diferentes temperaturas
La segunda prueba no fue posible realizarla por dantildeos en el equipo de
cromatografiacutea de gas (GC)
87
ANEXOS
11
89
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientiacuteficas 99 Grupos de
Investigacioacuten Enoloacutegica Zaragoza Espantildea
93
11
GRACIAS es una palabra corta para todo lo que quiero expresar a todos aquellos que
hicieron parte de este suentildeo hecho realidadhellip
A Dios y a la virgen Auxiliadora por llevarme de su mano cada diacutea de mi carrera en cada
momento alegre y en cada momento difiacutecil fueron mi fortaleza
A mis papitos por hacer de mi estudio una realidad por su sacrificio y apoyo desinteresado y
sincero
A mi Hermanito por ser mi fortaleza mi ejemplo y mi amigo incondicional
A mi familia Blanco y Urrea por su compantildeiacutea durante esta etapa
A mi facultad (Decano Dr Camilo Rozo Dra Patricia Jimeacutenez y mis profesores) por
ensenarme mi profesioacuten y aportar lo mejor de ustedes para mi formacioacuten personal
A mis asesores de Tesis (Ing Patricia Chaparro y Dr Sc Leo Gracin) por su guiacutea y
colaboracioacuten oportuna
A mis queridos amigos quienes siempre han estado a mi lado en las dificultades y en las
alegriacuteas (Ingrid Mafe Cami G Cami R Harold Pipe Karla Andreacutes T Diego G)
A IAESTE en alianza con el ORI por hacer posible mi intercambio y poder hacer mi tesis en el
maravilloso paiacutes de Croacia
A Croacia por ser mi segundo hogar por abrirme sus puertas y su corazoacuten por brindarme
tan maravillosas personas en mi camino
Croatia Thank you for being my second home for opening your doors and your heart to me
and give me the opportunity to meet so many wonderful people
To my boss my teacher my mentor and specially my friend Leo
To the faculty of food technology and Biotechnology and the department of technology
and analysis of beverages for give me the opportunity to give all my knowledge to the
project and learn a lot more
To all the amazing people I met during this experience (Igor Karin Natka Josip Ana Matija
Daniel Pz Szilvia Dini Daniela Lidija Sanja and everybody else who I had the pleasure to
meet in this great trip) for give me the best of your hearts
I only have one thing to say hellipTHANK YOU
Solo me queda una palabra por decirhellipGRACIAS
8
INTRODUCCION
Las levaduras del geacutenero Brettanomyces o su forma telemoacuterfica (nombre que
reciben las especies que presentan reproduccioacuten sexual y en consecuencia
formacioacuten de esporas por meiosis) Dekkera fueron descritas por primera vez por
Claussen en 1903 en la produccioacuten de cerveza1
Este geacutenero se conoce desde hace tiempo como agente contaminante en la
industria cervecera de la sidra y de bebidas carbonatadas2 En la industria
enoloacutegica su descripcioacuten como alterante es maacutes reciente
Durante los antildeos 1950s muchos autores reportaron el aislamiento del genero
Brettanomyces en uvas francesas e italianas (Van der Walt y Van der Kerken
1958) Sin embargo en muchas regiones del mundo viniacutecola esta levadura no ha
sido identificada lo cual dificulta su deteccioacuten en materiales o productos
contaminadosEntre todos los microorganismos la levadura
BrettanomycesDekkera es una de las maacutes temidas por los vinicultores El
crecimiento y desarrollo de esta levadura causa alteraciones denominadas
ldquocaraacutecter Brettrdquo lo cual ocurre especialmente en vinos tintos3
1 Gilliland R Brettanomyces I Occurrence characteristics and effects on beer flavor J Inst Brew
1961
2 Deak T y Beuchat LR Handbook of spoilage yeast CRC Press Nova York 1996
3 Heresztyn T Archives of Microbiology 1986 Metabolism of phenolic compounds from
hydroxycinnamic acids by Brettanomyces yeast
9
El ldquocaraacutecter Brettrdquo produce un amplio espectro de sabores y aromas alterantes
entre los cuales estaacuten corral minerales tinta tabaco cuero faacutermacos y
ahumado estas alteraciones se le atribuyen a los compuestos 4-etilfenol y 4-
etiguayacol las cuales causan una supresioacuten de aromas atractivos en el vino
como de frutas y flores y perdida de sabores agradables para el consumidor como
acido salado amargo o picante 4
Esta levadura tiene distinto comportamiento seguacuten el tipo de vino al que esteacute
asociada pues cada tipo de vino tiene diferente composicioacuten de carbonos
nitroacutegenos vitaminas y minerales
Con este estudio se evaluacutea el comportamiento y caracterizacioacuten de la levadura
BrettanomycesDekkera en vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia con
el desarrollo de medios solido y liquido para la selectividad de la levadura
alteraciones aromaacuteticas del vino tinto Babic producidas por 4 etilfenol y 4
etilguayacol y el comportamiento de BrettanomycesDekkera en el vino al ser
tratado con Dioacutexido de azufre (SO2) comparativamente con tratamiento Antibrettreg
4 Boulton Singleton Bisson amp Kunkee 1996 Descripcioacuten de aromas fenoacutelicos
10
1 MARCO TEORICO
Las levaduras representan el grupo de microorganismos maacutes importante en la
industria viniacutecola porque sin Saccharomyces producir vinos de alta calidad seriacutea
imposible Ademas de Saccharomyces hay muchos otros geacuteneros y especies de
levaduras presentes durante la vinificacioacuten que afectan la calidad del vino positiva
o negativamente5
Las levaduras comprenden 39 geacuteneros y 350 especies Se identifican y clasifican
basaacutendose en caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas Entre los aspectos
morfoloacutegicos considerados se encuentran el tamantildeo y la forma de las ceacutelulas en
medios soacutelidos y liacutequidos especificados el modo de reproduccioacuten y si forma velo
en la superficie o sedimenta en un medio liacutequido Entre las caracteriacutesticas
fisioloacutegicas consideradas se encuentra si puede crecer (y fermentar) en un
determinado carbohidrato y si puede o no utilizar determinadas fuentes de
nitroacutegeno como los nitratos6
11 REPRODUCCION
Las levaduras son agrupadas en tres familias conocidas como
Saccharomycetaceae Sporobolomycetaceae y Cryptococcaceae Estas
5 H Erten June 2002 Relations between elevated temperatures and fermentation behavior of
Kloeckera apiculata and Saccharomyces cerevisiae associated with winemaking in mixed culture
World Journal of Microbiology and Biotechnology Volume 18 N 4 pag 1 Adana Turkey 6 Cerveceros de Argentina 2006 Levadura wwwcervezadeargentinacomararticuloslevadurahtm
11
representan el grupo de microorganismos entre bacterias y hongos respecto a su
tamantildeo de ceacutelula Este grupo es caracterizado por su forma de reproduccioacuten
vegetativa conocida como ldquogemacioacutenrdquo Bajo condiciones optimas una ceacutelula
madre puede gemar varias veces durante el periodo reproductivo Sin embargo
bajo estrictas condiciones de fermentacioacuten una levadura va a gemar solamente
entre tres o cuatro veces Aquiacute la disponibilidad de oxigeno la cual es necesaria
para la formacioacuten de precursores de la membrana de la ceacutelula limita la
replicacioacuten7
Estos microorganismos muestran varios tipos de gemacioacuten lo cual puede dar un
valor diagnostico Entre aquellas aisladas de fermentacioacuten y antildeejamiento del vino
se observan maacutes frecuentemente multilateral y gemacioacuten polar 8
La modalidad maacutes comuacuten es la gemacioacuten proceso asexual en el cual la ceacutelula
progenitora emite un conducto tubular desde la vacuola nuclear hacia un punto
perifeacuterico proacuteximo a la misma Entonces se forma en la direccioacuten del conducto
una pequentildea protuberancia en la superficie externa de la ceacutelula y el conducto
pasa atravesando la pared celular a dicha protuberancia la cual se ensancha
llenaacutendose con el material citoplaacutesmico y nuclear de la ceacutelula progenitora Cuando
el brote o yema formada llega a ser casi tan grande como la ceacutelula progenitora los
aparatos nucleares de ambas ceacutelulas se orientan de forma que sus centrosomas
respectivos equidisten del punto de unioacuten Al llegar este momento la ceacutelula madre
y la ceacutelula hija se separan y se inicia la formacioacuten de nuevas ymas En la
gemacioacuten normal no se forman tabiques de separacioacuten entre ceacutelula madre y
ceacutelulas hijas pero en algunos casos el proceso se inicia en la gemacioacuten y se
completa por divisioacuten con la separacioacuten definitiva de ambos individuos La ceacutelula
madura de puede producir por gemacioacuten durante el curso de vida un promedio de
7 Brinton M Miller and Warren Litsky PhD 1976 Industrial Microbiology Edi Mac Graw Hill United States
of America
8 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures
edi Springer second edition Fresno California United States of America
12
24 generaciones de ceacutelulas hijas Las yemas sucesivas se forman siempre en
sitios diferentes de la superficie de la ceacutelula9
111 Gemacioacuten multilateral
La gemacioacuten multilateral ocurre en el ldquohombrordquo o aacuterea de la levadura donde ocurre
la reproduccioacuten La gemacioacuten y ciclo de separacioacuten crea un problema para las
levaduras durante su fase fermentativa pues en este tiempo la ceacutelula madre se
reduce aproximadamente un medio Porque la siacutentesis de la membrana celular
ocurre bajo condiciones anaeroacutebicas lo que limita los ciclos asexuales
replicativos Como resultado la mayoriacutea de las fermentaciones se completan en la
fase estacionaria (no gemacioacuten) Un ejemplo de esta reproduccioacuten es
BrettanomycesDekkera10
112 Gemacioacuten Polar
A diferencia de la gemacioacuten multilateral la gemacioacuten polar puede ocurrir en uno o
dos polos En el caso de Kloeckera y Saccharomyces la gemacioacuten ocurre en
ambos polos aumentando la poblacioacuten de levaduras con forma de ldquolimoacutenrdquo 11
113 Fisioacuten
Esta reproduccioacuten es caracteriacutesticas del genero Schizosaccharomyces donde la
formacioacuten de la ceacutelula hija ocurre sin la reduccioacuten de la madre ceacutelula como en los
casos anteriores En este caso la formacioacuten de la microscoacutepica pared celular
ocurre entre la madre ceacutelula y la hija seguida por la separacioacuten12
9 Araya Pablo 2002 Reproduccioacuten de hongos unicelulares mediante gemacioacuten esporulacioacuten y
fisioacuten httphtmlrincondelvagocomreproduccion-asexualhtml
10 11 12 Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic
Publishers GmbH United States of America and Canada
13
114 Pseudomycelium
Cualquier fabricante de vinos ha tenido la oportunidad de notar la formacioacuten de
una peliacutecula en la superficie del vino Esto surge debido a la gemacioacuten repetida de
las levaduras oxidativas y fallas en el momento de la separacioacuten de la ceacutelula hija
de la madre Con el tiempo el lazo previo entre la madre ceacutelula e hija se ampliacutea
dando la impresioacuten de filamentos como si se tratase de mohos siendo que son
levaduras 13
12 TAXONOMIA
Para distinguir las levaduras que pueden producir ascoporas de aquellas que no
los micologistas usan doble taxonomiacutea para su clasificacioacuten Desafortunadamente
la nomenclatura para la combinacioacuten anamorfotelemorfo es frecuentemente
diferente Unos ejemplos de levaduras sexualasexual o telemorfoanamorfo son
DekeraBrettanomyces Metschnikowia pulcherrimaCandida pulcherrima
Hanseniaspora uvarumKloeckera apiculata Torulaspora delbruecki Candida
colliculosa 14
Sin embargo las levaduras son diferenciadas por los taxonomistas por asignacioacuten
de varios nombres de geacutenerosespecies varios vinicultores usan un sistema
informal para agrupar levaduras basadas en su morfologiacutea u otras caracteriacutesticas
Por ejemplo a Kloeckera apiculata se le refiere como ldquolevadura apiculadardquo
tiene forma de limoacuten Esta levaduras asi com muchas otras presentes en el mosto
de la uva como lo son Candida Cryptococcus Debaryomyces Hansenula
Issatchenkia Kluyveromyces Metschnikowia Pichia y Rhodotorula tambieacuten son
llamadas levaduras ldquonativasrdquo ldquonaturalesrdquo o ldquosalvajesrdquo por su origen el vintildeedo o en
13
Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers
GmbH United States of America and Canada
14 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
14
la vinera Algunos enoacutelogos han discutido contra el uso de estos teacuterminos porque
esta implicancia no sucede en todas las levaduras ya que estas son de alguna
forma ldquono-nativasrdquo o ldquono naturalesrdquo (Ej Saccharomyces o Brettanomyces) El
teacutermino ldquono Saccharomycesrdquo es maacutes comuacuten para nombrar aquellas levaduras
presentes en el mosto de la uva que no son del genero Saccharomyces15
Las levaduras encontradas despueacutes de la fermentacioacuten alcohoacutelica tambieacuten son
asignadas a un grupo informal Algunas veces las levaduras que conducen la
principal fermentacioacuten (Saccharomyces) son muchas veces llamadas ldquolevaduras
fermentativasrdquo basados en su metabolismo Durante su antildeejamiento algunas
levaduras (Candida Hansenula y Pichia) pueden crecer en la superficie en
presencia de oxigeno Esta peliacutecula superficial es comuacutenmente asociada a
deterioro del vino esta levadura se le conoce como ldquolevadura formadora de
peliacuteculardquo16
121 DekkeraBrettanomyces
La taxonomiacutea cientiacutefica sobre BrettanomycesDekkera ha cambiado en los uacuteltimos
antildeos Brettanomyces estaacute clasificado dentro de la misma familia que
Saccharomyces (familia Saccharomycetaceae) Actualmente dentro del geacutenero
Brettanomyces se aceptan cinco especies diferentes (B bruxellensis B
anomalus B custersianus B nanas y B naardenensis)17
Las teacutecnicas de biologiacutea molecular han demostrado que B intermedious B
lambicus B custerseii o D intermedia son sinoacutenimos de B bruxellensis por lo
que estas denominaciones han quedado en desuso Los microorganismos de este
geacutenero presentan dos formas una capaz de reproducirse sexualmente (Dekkera)
15
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
16 Kurtzman CP 1998 The industrial and agricultural significance of yeasts 4
th Edition Amsterdam
Holanda
17 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
15
y otra que lo hace asexualmente (Brettanomyces) Tambieacuten se llaman
respectivamente forma perfecta y forma imperfecta En algunos casos la forma
perfecta y la imperfecta reciben nombres diferentes como ocurre con B anomalus
y D anomala En otros casos el nombre es similar como las pertenecientes a la
especie bruxellensis que pueden parecer como D bruxellensis como B
bruxellensis o como BrettanomycesDekkera A efectos praacutecticos en la bodega
estos dos estados son similares Cuando vemos referencias a Brettanomyces
como contaminante en la mayor parte de los casos se refieren a
DekkeraBrettanomyces ya que este es el responsable de las alteraciones en el
vino18 y 19
La morfologiacutea celular de BrettanomycesDekkera es ojival o ciliacutendrica con
gemacioacuten multipolar en reproduccioacuten vegetativa Una de las caracteriacutesticas de
este geacutenero es su tamantildeo celular variable y la formacioacuten de filamentos19
18 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 23
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
19
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
16
Figura 1 Microfotografiacutea de cultivo de BrettanomycesDekkera a) Variabilidad morfoloacutegica y de
tamantildeo celular b) forma filamentosa
Fuente Lopez-Cordon Eva BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia wwwacenologiacom
Los defectos sensoriales asociados directamente a Brett aparecen
mayoritariamente en vinos tintos de calidad y las causas radican en la propia
fisiologiacutea del microorganismo Ademaacutes al ser una levadura de crecimiento muy
lento la alteracioacuten se presenta principalmente durante el almacenamiento y sobre
todo la crianza del vino habitual en los vinos tintos de gama alta En las barricas
de madera el microorganismo tiene a su disposicioacuten todo el sustrato y tiempo
suficiente para realizar su actividad La naturaleza porosa de la madera y su difiacutecil
limpieza contribuye a que las poblaciones existentes se mantengan incluso
despueacutes del lavado de la barrica Ademaacutes BrettanomycesDekkera tiene la
capacidad de degradar uno de sus componentes la celobiosa 20
13 CARACTERISTICAS FISIOLOGICAS
S cerevisiae y BrettanomycesDekkera tienen metabolismos similares muy
adaptados a las condiciones de vinificacioacuten Tras la fermentacioacuten alcohoacutelica S
cerevisiae es la levadura mayoritaria debido a que las condiciones nutricionales
20
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
17
del vino son muy estrictas (altas concentraciones de etanol y bajas
concentraciones de nutrientes) En este momento BrettanomycesDekkera
continuacutea creciendo gracias a que utiliza nutrientes que S cerevisiae no ha podido
consumir sobre todo algunos azuacutecares y fuentes de nitroacutegeno21
Una de las caracteriacutesticas que diferencia a BrettanomycesDekkera es la gran
diversidad de azuacutecares que puede fermentar (ver tabla de Relacioacuten de los
principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) La mayoriacutea de
las cepas pueden crecer utilizando trealosa y celobiosa azucares presentes en el
vino y no consumibles por S cerevisiae Otra de las ventajas que presenta frente
a S cerevisiae (y frente a la mayoriacutea de las levaduras) es que puede utilizar los
nitratos como fuente de nitroacutegeno Debido a que S cerevisiae soacutelo utiliza el
nitroacutegeno amoniacal y los aminoaacutecidos libres estos se consumen con relativa
rapidez Al final de la fermentacioacuten el nitroacutegeno moniacal es escaso y se favorece
el crecimiento de las levaduras que pueden utilizar otras fuentes de nitroacutegeno
Ademaacutes Brettanomyces puede crecer con concentraciones de fosfato diamoacutenico
tan bajas como 05gl o a partir de diversos aminoaacutecidos En resumen
BrettanomycesDekkera crece maacutes despacio que S cerevisiae es resistente a
concentraciones altas de alcohol puede utilizar otros azucares como fuentes de
energiacutea y nitrato como fuente de nitroacutegeno Esto explica que pueda reproducirse
cuando la fermentacioacuten alcohoacutelica ha terminado a partir de nutrientes no
consumibles por S cerevisiae y cuando no tiene competidores22
21
Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
22 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
18
Tabla 1 Relacioacuten de los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto
Fuente Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista
VINOTEQ N 38 pag 21 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
131 BrettanomycesDekkera y siacutentesis de fenoles volaacutetiles
El origen de los fenoles volaacutetiles estaacute relacionado con la actividad secuencial de
dos enzimas que descarboxilan los aacutecidos en hidroxiestirenos (vinilfenoles) que
19
son posteriormente reducidos a etilderivados (etilfenoles)23 como puede
observarse en la figura 2
Figura 2 Siacutentesis de etilfenoles de BrettanomycesDekkera
Fuente ACE revista de Enologia wwwacenologiacom
El primer paso de descaboxilacion de los aacutecidos hidroxicinamicos es comuacuten
tambieacuten en otros microorganismos como bacterias hongos y otras levaduras Sin
embargo el segundo paso reduccioacuten de vinilfenoles es caracteriacutestico de algunos
tipos de levaduras como Dekkera bruxelliensis D anomala Pichia guillermondi
Candida versarilis C halophila y C mannitofaciens24
Los fenoles volaacutetiles que se asocian al problema Brett en vinos son el 4-etilfenol y
el 4- etilguaiacol asiacute como sus precursores intermedios 4-vinilfenol y 4-
vinilguaiacol aunque estos uacuteltimos son menos importantes por ser muy reactivos y
raacutepidamente convertidos en etilfenoles por BrettanomycesDekkera o en su caso
23
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
24 Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
20
condensan con otras moleacuteculas como antocianos25 Los etilfenoles y
especialmente elevadas concentraciones de 4-vinilfenol en vinos se asocian con
aromas desagradables asociados a descriptores como ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de
caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo26
El umbral sensorial del 4-etilfenol es de 230 μg l-1 y el del 4-etilguaiacol es de 47
μgl Pese a su menor umbral sensorial el 4-etilguaiacol responde a descriptores
como ldquobaconrdquo o ldquoahumadordquo que a bajas concentraciones aportan complejidad por
lo que se puede considerar sensorialmente menos conflitivo que el 4-etilfenol 27
Figura 3 Defectos sensoriales producidos en el vino por BrettanomycesDekkera
Fuente Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
25 Morata A Goacutemez-Cordoveacutes M Calderoacuten F Suaacuterez J 2006 Effects of pH temperature and SO2 on the
formation of pyranoanthocyanins during red wine fermentation with two species of Saccharomyces Journal Food Microbiology No106 pag 4 Madrid Espana
26 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea 27 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
21
132 Identificacioacuten de BrettanomycesDekkera
Los Bioacutelogos usan sistemas de identificacioacuten basados en similitudes taxonoacutemicas
entre organismos dichas similitudes pueden ser morfoloacutegicas tipos capacidad de
produccioacuten de sustratos como azuacutecar yo nitratos caracteriacutesticas fisioloacutegicas y
bioquiacutemicas secuencia del material geneacutetico y respuestas inmunoloacutegicas28
En la industria viniacutecola es importante recurrir a diferentes tipos de pruebas para la
identificacioacuten de microorganismos una de estas y la maacutes realizada es la revisioacuten
del microorganismo bajo el microscopio Esta prueba brinda informacioacuten sobre la
morfologiacutea del microorganismo (cocos bacilos formas puntudas ojival entre
otros) tamantildeo (dimensiones) agrupaciones celulares (solas parejas triacuteos
grupos o cadenas) Sin embargo el uso del microscopio es una prueba raacutepida
para examinar mostos o vino pero no determina cantidades que muchas veces es
requerido para tratamientos de accioacuten otro de los inconvenientes es que los
microorganismos pueden variar su morfologiacutea en forma o tamantildeo dependiendo de
la edad y las condiciones de crecimiento por lo que puede no ser clara la
identificacioacuten de este29
14 Medios soacutelidos selectivos
Si se requiere de la confirmacioacuten del microorganismo este debe ser aislado del
vino para una caracterizacioacuten para esto se requiere de medios soacutelidos Cuando se
examina un microorganismo en un medio solido es importante revisar las
caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias (ver figura 4 Morfologiacuteas de colonias
en medios soacutelidos) Entre estas caracteriacutesticas estaacuten forma (circular irregular o
2829 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
22
rizada) tamantildeo (dimensiones estas normalmente se expresan en miliacutemetros)
topografiacutea (plano elevado convexo coacutencavo o embonado) presencia de
pigmentos opacidad (transparente traslucido u opaco) superficie (suave rugosa
lisa o aacutespero) bordes (entero ondulado crespo dentado rizado) o cualquier
cambio en el agar (color opacidad cambios en los indicadores de pH o CaCO3
respectivamente)30
Figura 4 Varias morfologiacuteas de crecimiento de colonias en medio solido
Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007
Gran nuacutemero de medios selectivos se han creado para la aislacioacuten deteccioacuten yo
conteo de levaduras provenientes de jugos de uva mostos o vinos El medio maacutes
utilizado en estos fines es YPD (Yeast Peptone Dextrose) pero dicho medio no
es selectivo entre levaduras y se usa comuacutenmente para el conteo de
Saccharomyces31 Las colonias empiezan a parecer con un periodo de incubacioacuten
30
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
31 Essia Ngang J Wolniewicz E Villa P2005 Stimulation of lactobacilli during alcoholic fermentation action
of sucrose hydrolysis by yeast Biotechnology letters No 8 pag 743 Amiens France
23
de 2 a 4 diacuteas a 22C a 25C Igualmente el agar de jugo de uva es no selectivo y
presenta faacutecil crecimiento de levaduras bacterias y mohos
Para la levadura Brettanomyces Dekkera se han elaborado diferentes medios
selectivos entre ellos el maacutes conocido es WL por sus siglas en ingles del
laboratorio que lo creo ldquoWallerstein Laboratoriesrdquo este medio contiene
cicloheximida compuesto selectivo para Brettanomyces e inhibe Saccharomyces
El punto criacutetico es encontrar la cantidad exacta de este compuesto para la
inhibicioacuten de las levaduras sin que afecte a BrettanomycesDekkera32
Ademaacutes del medio WL BrettanomycesDekkera puede ser cultivado en otros
medios selectivos como Brettanomyces medio A creado por Vilas en 1993
Brettanomyces medio B el cual contiene cicloeximida como agente selectivo
mientras que Brettanomyces medio C tiene cicloheximida y ampicilina este medio
fue creado por B Watson en 1998 Brettanomyces medio D fue creado
recientemente por Rodrigues en 2001 este medio es conocido como DBDM
(DekkeraBrettanomyces differential medium ) es un medio selectivo para
Brettanomyces en contra de Saccharomyces y otras levaduras este medio es el
maacutes utilizado en la vineras para caracterizacioacuten de BrettanomycesDekkera
actualmente33
15 Dioacutexido de azufre (SO2) en vinos
32
33
Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers
GmbH United States of America and Canada
24
El dioacutexido de azufre tambieacuten llamado oxido de azufre es un eficaz agente
conservante antioxidante y antimicrobiano en la industria viniacutecola34
Durante la vinificacioacuten SO2 ha representado histoacutericamente una herramienta muy
importante usada por los vinicultores para el control de crecimiento microbioloacutegico
Debido a preocupaciones por la salud del consumidor el uso de este producto ha
disminuido dramaacuteticamente con el posible riesgo de aumentar el riesgo
microbioloacutegico35
El actual liacutemite legal de SO2 en vinos en los Estados Unidos es de 350mgL una
concentracioacuten mucho mayor a la usada en la industria viniacutecola No obstante vinos
que contienen maacutes de 10mgL deben declarar este compuesto en la etiqueta
porque SO2 es un metabolito que las levaduras usan durante la fermentacioacuten Los
vinos siempre contienen algo de sulfitos aunque la adicioacuten no se realice durante el
proceso36
151 Formas del Dioacutexido de Azufre (SO2)
Una vez disuelto en agua el dioacutexido de azufre existe en equilibrio entre SO2
molecular (SO2H2O) bisulfito (HSO3) y sulfito (SO32-) Este equilibrio depende del
pH Ademaacutes de estar en equilibrio con el molecular y especies sulfito el bisulfito
tambieacuten existe en forma ldquolibrerdquo y en forma ldquoatadardquo Aquiacute la moleacutecula reaccionara
34
Orwine Eureka 2008Investigadores europeos buscan alternativas al dioxido de azufre en vinos
httpawprowordpresscom20081107investigadores-europeos-buscan-alternativas-al-dioxido-de-
azufre-en-el-vino
3536 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
25
con compuestos carbonilos (ej Acetaldehiacutedo) formando productos adicionales
como Acido Hydroxysulfonico 37
Ademaacutes de Acetaldehiacutedo algunas moleacuteculas presentes en el jugo de uva que
reaccionan con bisulfito son acido piruvico α-keto-glutaric dihidroxyacetona
diacetyl Pigmentos de antocianinas entre otros38
152 Inhibidor Microbiano
El sulfuro molecular es la forma antimicrobiana del dioacutexido de azufre La cantidad
de SO2 molecular presente en cualquier vino no se mide directamente La
concentracioacuten es calculada conociendo la concentracioacuten de SO2 libre y el pH del
vino basaacutendose en la siguiente foacutermula
Alternativamente la figura 5 Se puede utilizar como guiacutea para aproximar la
cantidad de SO2 libre necesitada a determinado valor de pH de valores entre 05 o
08 mgl de SO2 molecular 39
El SO2 inhibe microorganismos de varias formas incluyendo rupturas de puentes
bisulfitos en proteiacutenas y reaccionando con coofactores como NAD+ y FAD tambieacuten
reacciona con ATP
3739
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
38 Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi
Springer New York United States
26
Figura 5 Cantidades de SO2 libre a un pH determinado para obtener 05 o 08 mgl de SO2
molecular
Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007
La concentracioacuten de SO2 molecular necesario para prevenir el crecimiento de
microorganismos variacutea seguacuten vinojugo pH temperatura poblacioacuten densidad y
diversidad estado de crecimiento grado de alcohol entre otros factores Beech
1979 sugirioacute una adicioacuten de 08 mgl de SO2 molecular como la cantidad
necesaria del compuesto en vinos blancos de mesa para dar una reduccioacuten de
cerca de 104 UFCml de la poblacioacuten de diferente tipo de microorganismos en 24
horas Las diferencias que existen entre las levaduras y bacterias en base a la
27
sensibilidad a este compuesto son dadas a conocer por diferentes autores (Warth
1977 1985 Du Toit 2005 Davis 1988 Hood 1983)40
16 Antibrettreg como alternativa de prevencioacuten y eliminacioacuten de
BrettanomycesDekkera
Antibrettreg es un producto nuevo creado por Spindal SARL-Gretz - Armainvilliers
Francia Es una preparacioacuten enzimaacutetica para inactivar Brettanomyces y para
reducir olores producidos por fenoles volaacutetiles41
Antibrettreg es preparado a base de paredes celulares de levadura activados
enzimaacuteticamente que presentan elevadas propiedades adsorbentes frente al 4-
etilfeno y 4- etilguayacol compuestos asociados con olores desagradables en el
vino tales como sudor de caballo farmacia o barniz42
Antibrettreg inhibe la produccioacuten de la vinilreductasa que participa en la
transformacioacuten de los aacutecidos cinaacutemicos naturalmente presentes en los vinos en
los correspondientes derivados etilados responsables de los olores atribuidos a
BrettanomycesDekkera 43
40
Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi
Springer New York United States
41 Manual de instrucciones de producto Antibrett reg producido por Spindal SARL-Gretz -
Armainvilliers France
424344 AEB Group 2008 ANTIBRETT Preparado a base de paredes celulares de levadura para la inactivacioacuten
de Brettanomyces y la eliminacioacuten de los olores de estos productos httpwwwaeb-
groupcomimgsSPAGNOLODepliantANTIBRETT-lett-ESPpdf
28
El uso de Antibrettreg es efectivo incluso contra otros olores anoacutemalos como los
que se generan en las barricas sucias principalmente huacutemedas dantildeando la
calidad olfativa del vino44
29
2 PROBLEMA
La levadura BrettanomycesDekkera es una levadura de contaminacioacuten presente
en la mayoriacutea de industrias viniacutecolas en el mundo Afecta directamente la
produccioacuten y calidad sensorial de los vinos con el desarrollo de los compuestos 4
etilfenol y 4 etilguayacol los cuales dantildean el perfil olfativo del vino dando aromas
caracteriacutesticas a ldquoestablordquo ldquocuerordquo ldquosudor de caballordquo o ldquobarnizrdquo conocido como
ldquocaraacutecter Brettrdquo
Esta contaminacioacuten se da especialmente en los vinos tintos debido a sus
caracteriacutesticas de produccioacuten (fermentacioacuten crianza antildeejamiento) y sus
propiedades fisicoquiacutemicas (Grado alcohoacutelico pH Acidez total Acidez volaacutetil
entre otros)
En Croacia existe una gran produccioacuten de vinos tintos entre los cuales se
encuentra el vino tinto Babic proveniente de la isla de Hvar el cual es famoso por
ser un vino duro carnoso estructurado y casi sobre-maduro con un grado
alcohoacutelico que ronda los 15 vv siendo la primera denominacioacuten de origen que
se aproboacute en Croacia en el antildeo 1961 este vino es de gran importancia en la
regioacuten la mayoriacutea de sitios de elaboracioacuten son pequentildeas industrias que han sido
afectadas por el bdquocaraacutecter Brett‟ Muchas investigaciones se han realizado al
respecto de la levadura BrettanomycesDekkera pero se conoce muy poco sobre
sus efectos en el vino Babic debido a sus caracteriacutesticas particulares (alcohol
30
15 pH 35 Acidez total 520 gr Acido TartaricoL Acidez volaacutetil 08 gr Acido
AceticoL Azucar residual 47 grLt)45
La dificultad de la pequentildea industria para acceder a productos que lleven a la
identificacioacuten de la levadura mencionada y de esta manera conllevar a planes de
accioacuten contra el ldquocaraacutecter Brettrdquo es una de las grandes dificultades de la industria
vinera en este paiacutes en donde los productos para la industria enoacuteloga son
complicados y de alto precio para acceder a ellos y en consecuencia no se
realizan muchas de estas pruebas de deteccioacuten de BrettanomycesDekkera
llevando al mercado productos contaminados de baja calidad que inicialmente
podriacutea haber sido un vino de alta calidad debido a sus caracteriacutesticas uacutenicas y de
gran popularidad
45
Datos obtenidos en el laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
31
3 JUSTIFICACION
Actualmente Croacia cuenta con maacutes de 300 zonas vineras en las que se producen 67
de vino blanco 32 vino tinto y el restante 1 vino rosado De acuerdo a recientes datos
estadiacutesticos hay 650 km2 de vintildeedos en Croacia de los cuales 375 km2 son uvas con
indicacioacuten geograacutefica de origen que producen maacutes de 300 vinos y maacutes de la mitad de este
nuacutemero son vinos elaborados en microempresas con un total de 50000000 de botellas
de vino el 8 es vino superior 70 de calidad y el 22 es vino de mesa de produccioacuten
nacional46
Croacia es un fuerte productor de vino a nivel regional con sus diferentes variedades
propias (Merlot Plavac Dingač Postup Malvazija Pošip Kujundžuša Babic) pero dicha
produccioacuten ha sido fuertemente afectada por la presencia de la levadura
BrettanomycesDekkera trayendo consecuencias como perdidas de produccioacuten peacuterdida
de calidad sensorial del vino grandes peacuterdidas econoacutemicas y desprestigio a sus vinos de
denominacioacuten de origen
Es por esto que en este proyecto de investigacioacuten se busca una faacutecil y raacutepida
identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera causante del ldquocaraacutecter Brettrdquo con el
desarrollo de medios selectivos liquido y solido ademaacutes de opciones para el tratamiento
yo prevencioacuten de esta levadura en la cadena productiva comparativamente entre dioacutexido
de azufre (SO2 ) y Antibrettreg y la identificacioacuten de los aromas caracteriacutesticos del ldquocaraacutecter
Brettrdquo en el vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia
46
Hrvatski zavod za vinogradarstvo i vinasrtvo 2003 Pravilnik o vinu httpwwwhrzvvhrpropisihtm
32
4 OBJETIVOS
41 General
Caracterizar y evaluar el comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera
en teacuterminos de crecimiento y produccioacuten de aromas no deseados en vino tinto
Babic
42 Especiacuteficos
Desarrollar el medio solido y medio liacutequido selectivo para
BrettanomycesDekkera
Evaluar el comportamiento de la levadura en estos medios selectivos
Determinar la influencia del Dioacutexido de azufre (SO2) y el compuesto
Antibrettreg en la levadura BrettanomycesDekkera presente en vino tinto
Babic 2007
Identificar los compuestos aromaacuteticos producidos por Brettanomyces
bruxellensis en vino tinto Babic usando el meacutetodo ldquomultiple headspace
solid-phase microextraction (SPME)rdquo
33
5 ALCANCES
En este proyecto se pretende desarrollar un medio selectivo faacutecil de producir en
donde sea raacutepida la identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera en la
produccioacuten de vinos tintos se realizaran pruebas para corroborar el crecimiento de
esta levadura en el medio determinando el tiempo que esta levadura toma en
adaptarse en el medio y su comportamiento en este una vez comprobada su
adaptacioacuten al medio liquido se trabajara con el meacutetodo de cromatografiacutea de gas
(GC) y el uso de micro extraccioacuten en fase solida (SPME) para el anaacutelisis
cuantitativo de los compuestos volaacutetiles (4-etil-fenol 4-etil-guayacol4-vinilfenol y
4-vinil-guayacol) y posteriormente con el vino tinto Babic Ademaacutes se desea
comprobar la efectividad de los productos con que las vineras de Croacia inhiben
o eliminan la presencia de la levadura en los vinos tintos como lo son el producto
AntiBrettreg y el Dioacutexido de azufre (SO2)
34
6 ESTADO DEL ARTE
Sobre el campo problemico causado por la levadura BrettanomycesDekkera en la
industria viniacutecola se han realizado bastante investigaciones a nivel de
caracterizacioacuten de la levadura los factores fisicoquiacutemicos que favorecen el
crecimiento de la levadura meacutetodos de prevencioacuten y control evaluacioacuten de
dantildeos sensoriales en diferentes tipos de vinos formacioacuten de compuestos fenoacutelicos
en los diferentes tipos de vino otros compuestos no fenoacutelicos asociados al
ldquocaraacutecter Brettrdquo teacutecnicas de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera
evaluacioacuten de la teacutecnicas de control e inhibicioacuten de dicha levadura desarrollo de
nuevos medios de deteccioacuten y aislamiento de la levadura relacioacuten entre la
levadura BrettanomycesDekkera con las otras levaduras presentes en el vino
entre otros
Seguacuten estas investigaciones se analizan aquellas que pueden aportar datos
importantes para el desarrollo del trabajo que se quiere realizar y se tiene en
cuenta sus metodologiacuteas conclusiones recomendaciones y comentarios
Entre las importantes para el planteamiento de este trabajo se menciona el trabajo
realizado por la Universidad Politeacutecnica de Madrid Espantildea el cual analiza
algunas de las caracteriacutesticas maacutes relevantes de este geacutenero de levaduras su
crecimiento en bodega factores fisicoquiacutemicos que favorecen su crecimiento y
desarrollo en el vino los defectos sensoriales que presenta en los vinos y estudia
algunas de los meacutetodos fiacutesicos para el control de BrettanomycesDekkera en vino
35
(clarificacioacuten filtracioacuten amicrobica proteiacutenas clarificantes anhiacutedrido sulfuros
dimetil dicarbonato Aditivos)47
Para conocer maacutes sobre la levadura en condiciones de barrica y almacenamiento
se revisa el articulo elaborado en el Departamento Teacutecnico Guserbiot La rioja
Espantildea en este artiacuteculo se describe brevemente su metabolismo y su ecologiacutea en
las bodegas Igualmente se comparan las teacutecnicas utilizadas en los laboratorios
para su deteccioacuten y cuaacuteles son las limitaciones de los diferentes meacutetodos
Finalmente se analizan las estrategias desarrolladas para su eliminacioacuten de las
bodegas y se dan una serie de recomendaciones para su control48
El instituto de fermentaciones Industriales Consejo superior de investigaciones
cientiacuteficas Juan de Cierva Madrid Espantildea en el cual se revisa la formacioacuten de
etilfenoles (4 etil-fenol 4 etil guayacol) en vinos tintos anejos Los factores
fisicoquiacutemicos que favorecen el crecimiento de la levadura no deseada
BrettanomycesDekkera las teacutecnicas usadas para la detectar la presencia de esta
levadura en vinos ( Revisioacuten microscoacutepica fluorescente remocioacuten de aacutecidos
grasos de su membrana teacutecnicas moleculares como PCR y electroforesis) y de
control (Proteiacutenas fining Fining con gelatina liquida filtracioacuten variables
fisicoquiacutemicas adicioacuten de aditivos procedimientos de altas presiones
manipulacioacuten geneacutetica) con esta investigacioacuten se concluye que la combinacioacuten y el
uso de las numerosas teacutecnicas pueden ayudar a la prevencioacuten y reduccioacuten de la
levadura BrettanomycesDekkera 49 Este trabajo muestra las muacuteltiples opciones
47
A Morata S Benito F Palomero F Calderoacuten y J A Suaacuterez-Lepe Ecologiacutea y prevencioacuten de
BrettanomycesDekkera durante la elaboracioacuten y crianza de vinos tintos Revista enoacutelogos (Editada por la
Federacioacuten Espantildeola de Asociaciones de Enoacutelogos y Periodistas Asociados) No 50 paacuteg 1-12 Madrid Espantildea
48 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 20-
24 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
49 R Suarez JA Suarez-Lepe A Morata F Calderon 2006 The production of ethyl phenols in wine by yeasts
of the genera Brettanomyces and Dekkera A review Journal Food Chemistry No 102 pag 10-21 Madrid
Espantildea
36
existentes en el control y prevencioacuten de la levadura mencionada sin embargo deja
claro que la mayoriacutea de estas opciones son costosas y no de faacutecil adquisicioacuten para
una pequentildea industria
El anaacutelisis sensorial ha sido de los aspectos maacutes estudiados al respecto de
BrettanomycesDekkera una de estas investigaciones fue realizada en Centre
Europeacuteen des Sciences du Goucirct en Talence Francia en el cual se evaluaron 50
vinos bordeaux sensorialmente para demostrar la complejidad del ldquoCaraacutecter Brett‟‟
al cual se unen otros compuestos aromaacuteticos ademaacutes de los fenoacutelicos como acido
isobutirico e isovalerico en este tipo de vino debido a sus caracteriacutesticas
fisicoquiacutemicas50
De los meacutetodos de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera los medios
selectivos son muy populares es por esto que el Laboratorio de Microbiologiacutea
Departamento de Botanica e Engenharia Biologica Instituto Superior de
Agronomia Lisboa Portugal realizo un trabajo en el cual se pretendia desarrollar
un medio selectivo o diferencial capaz de aislar la levadura
BrettanomycesDekkera del vino y de la cadena productiva del vino con el fin de
detreminar la relacioacuten entre esta levadura y los compuestos 4-etilfenol y 4 etil-
guayacol51 otro estudio realizado para la deteccioacuten de dicha levadura fue
realizado en la Escola Superior de Biotecnologiacutea Universidade Catoacutelica
Portuguesa el desarrollo de un simple procedimiento compatible con las rutinas
50 Andrea Romano a Marie Claire Perello a Aline Lonvaud-Funel Gilles Sicard Gilles de Revel2008 Sensory
and analytical re-evaluation of lsquolsquoBrett characterrdquo Journal Food Chemestry No 114 pag 15-19 Talence
France
51 N Rodrigues G Gonccedilalves S Pereira-da-Silva M Malfeito-Ferreira and V Loureiro2001 Development
and use of a new medium to detect yeasts of the genera DekkeraBrettanomyces Journal of applied microbiology No 90 pag 588-599Lisboa Portugal
37
usadas en las vineras para la deteccioacuten de BrettanomycesDekkera en vino y en
maquinarias52
En el laboratorio de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas Alcohoacutelicas de la
Universidad de Zagreb se ha trabajado anteriormente en el desarrollo de medio
solido selectivo con pruebas de diferentes concentraciones de los compuestos
como resultados se encuentra una buen relacioacuten entre las concentraciones de los
compuestos sin embargo como recomendaciones se encuentran la falta de
antibioacutetico para evitar contaminacioacuten por bacterias probar con diferentes fuentes
de carbono para comparacioacuten de tiempo de crecimiento positivo y un monitoreo
diario en el medio53
Los compuestos aromaacuteticos que libera la presencia de BrettanomycesDekkera
estaacute asociada a los compuestos 4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinilfenol y 4
viniguayacol a partir de esto los centros de investigacioacuten han hondado en la
identificacioacuten de dichos compuestos relacionados en la enologiacutea y especialmente
con BrettanomycesDekkera a partir de eso el Departamento de Quiacutemica
Universidad de La Rioja Espantildea este estudio presenta un meacutetodo basado en el
uso de Cromatografiacutea de Gas y micro extraccioacuten en fase solida para el anaacutelisis
cuantitativo de 4-etilfenol 4-etil guayacol 4-vinilfenol 4-vinilguayacol
Demostrando la existencia de un efecto matriz en el anaacutelisis de compuestos
responsables del ldquocaraacutecter Brettrdquo en vino Este nuevo meacutetodo fue
satisfactoriamente aplicado a cierto nuacutemero de vinos tintos comerciales vinos
52
JA Couto A Barbosa and T Hogg 2005 A simple cultural method for the presumptive detection of the yeasts BrettanomycesDekkera in wines Letters in Applied Microbiology No 41 pag 505-510 Porto
Portugal
53 Serkovic Dubravka Gracin Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac
Brettanomyces bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet pag 1-117 ZagrebCroatia
38
blancos y roseacute Este meacutetodo puede ser una alternativa para evitar el efecto matriz
en muestras de vino54
De acuerdo con este tema en la jornada cientiacutefica del 99 el grupo de investigacioacuten
enoloacutegica se estudio la formacioacuten de sustancias volaacutetiles por 13 cepas de S
cerevisiae con buenas aptitudes enoloacutegicas inoculadas individualmente en un
mosto homogeacuteneo de la variedad airen fermentado en las mismas condiciones
de aireacioacuten y a temperatura controlada55
54
C Pizarro N Perez-del-Notario JM Gonzalez-Saiz 2007 Determination of Brett character responsible
compounds in wines by using multiple headspace solid-phase micro extraction Journal of Chromatography
No 1143 pag 176-181 La Rioja Espantildea
55 E Pueyo P Hidalgo K Fernaacutendez y P Martiacuten-Aacutelvarez 1999 Anaacutelisis de compuestos volaacutetiles en vinos
obtenidos con distintas cepas de Saccharomyces cerevisiae Aplicacioacuten de la teacutecnica de microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientificas 99 Grupos de Investigacion Enologica Zaragoza Espana
39
7 MATERIALES Y METODOS
A continuacioacuten se presentan materiales y meacutetodos para la investigacioacuten
Este proyecto fue realizado en su gran mayoriacutea en las instalaciones de la
Universidad de Zagreb en la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos
(PBF) Laboratorios del Departamento de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas
Alcohoacutelicas ubicado en la ciudad de Zagreb Croacia
Los anaacutelisis fisicoquiacutemicos del vino tinto Babic fueron realizados en los
laboratorios de VINOLAB ubicado en Zagreb Croacia
71 MEDIO SOLIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera
711 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Autoclave de laboratorio
Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa Etanol peptona extracto de levadura
agar cicloheximida acido cumaacuterico ampicilina)
Balanza electroacutenica de precisioacuten
Microscopio oacuteptico
712 Metodologiacutea
Basados en estudios anteriores realizados en el laboratorio para el desarrollo de
medio solido selectivo para BrettanomycesDekkera (Serkovic Dubravka Gracin
40
Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac Brettanomyces
bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet Universidad de Zagreb pag 1-
117 Zagreb Croacia) se evaluaron las recomendaciones mencionadas en dicha
investigacioacuten para la mejoriacutea y desarrollo de otros medios soacutelidos selectivos
Se usoacute como base el medio YPD (Yeast Peptone Dextrose) el cual estaacute
compuesto de la siguiente forma 20gL peptona 10 gl extracto de levadura 20 gl
de agar56 este medio es selectivo para levaduras pero no es selectivo entre ellas
Es necesario el uso de una fuente de carbono para la levadura
BrettanomycesDekkera de acuerdo a la teoriacutea y revisando la tabla 1 (Relacioacuten de
los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) y seguacuten
facilidades de disponibilidad en el laboratorio se utiliza glucosa la cual es
utilizable por entre 75-100 de las cepas de BrettanomycesDekkera seguacuten la
tabla mencionada anteriormente
Esta fuente de carbono (Glucosa) fue probada en una concentracioacuten de 20 gL
Cicloheximida fue probada a 30 mgL para inhibir Saccharomyces en el medio y
darle mayor selectividad para Brettanomyces Dekkera Se antildeade acido p-
cumarico en una concentracioacuten de 100 mgL como precursor para la formacioacuten
del compuesto 4 etilfenol caracteriacutestico de la levadura BrettanomycesDekkera
Para inhibir bacterias en el medio se usa ampicilina a 10 mgL esta se agrega
despueacutes de realizada la esterilizacioacuten y cuando la temperatura del medio este
igual o menor a 40C El pH del medio se ajusto a 5
Paralelamente se crea el medio con Etanol como fuente de carbono en una
concentracioacuten de 6 o 60 mlL con la misma concentracioacuten de los otros
compuesto como cicloheximida 30mgL acido cumarico 100mgL 20 gL peptona
10 gL de extracto de levadura 16gL de agar Este medio se crea como
56
Concentraciones preestablecidas en el laboratorio de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas alcoholicas
41
comparativo para determinar cual fuente de carbono es la maacutes utilizada por la
levadura Brettanomyces bruxellensis para su reproduccioacuten Seguacuten la teoriacutea (ver
tabla 1) el etanol es utilizado por entre 25-75 de las cepas de
BrettanomycesDekkera pero es el azuacutecar que se encuentra en mayor
concentracioacuten presente en los vinos tintos aproximadamente 130 gl57
Estos medios fueron debidamente esterilizados para eliminar cualquier
microorganismo o espora presente en este Este procedimiento se realizo por el
meacutetodo de combinacioacuten de altas temperatura y presioacuten (Autoclave 121 C a 1034
kPa)
Se usaron colonias de BrettanomycesDekkera aisladas anteriormente de vinos
contaminados y guardas para investigaciones en el Departamento de Tecnologiacutea y
Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos
Universidad de Zagreb Croacia
Los medios fueron monitoreados visualmente todos los diacuteas y se toman
observaciones de macroscoacutepicas y microscoacutepicas Se comparan estos dos medios
en teacuterminos de rapidez de crecimiento de la levadura y selectividad Estas
muestras fueron incubadas a 28C por 10 diacuteas
La prueba fue realizada por duplicado en diferentes tiempos
57
Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
42
72 MEDIO LIacuteQUIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera
721 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Frascos de vidrio esteacuteriles
Autoclave de laboratorio
Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa peptona extracto de levadura
cicloheximida acido cumarico ampicilina etanol)
Microscopio oacuteptico
Balanza electroacutenica de precisioacuten
722 Metodologiacutea
En el mercado para enologiacutea existen medio liacutequidos selectivos para la deteccioacuten
de BrettanomycesDekkera en vinos sin embargo estos son de difiacutecil accesibilidad
por sus elevados precios es por esto que se desarrolla un medio liquido selectivo
para dicha levadura en el laboratorio del Departmaneto de Tecnologiacutea y Anaacutelisis
de Bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia
Para este medio se toma como base el medio selectivo con Glucosa como fuente
carbono desarrollado anteriormente sin usar agar para mantener el medio en su
estado liquido
43
La composicioacuten de este medio liacutequido es la siguiente
20 gL Glucosa
20 gL peptona
10gL extracto de levadura
30mgL de cicloheximida
100mgL acido p-cumarico
10 mgL ampicilina
Estos compuestos fueron medidos en una balanza electroacutenica de precisioacuten se
antildeade 250 ml de agua destilada y se mezcla constantemente se pasa a proceso
de esterilizacioacuten en autoclave a 120C y 1034 KPa por 45 minutos
De esta forma se asegura la usencia de microorganismos yo esporas en el
medio Despueacutes de bajar la Temperatura a 40C se agrega a la mezcla ampicilina
en una concentracioacuten de 10mgL
En frascos de vidrio esteacuteril se agrega 40 ml de medio liacutequido y diferentes
cantidades iniciales de levaduras BrettanomycesDekkera fueron inoculadas al
respectivo medio el primer frasco tiene una cantidad de 106 ceacutelulasml el segundo
tiene 104 ceacutelulasml el tercero tiene 102 celulasml y el cuarto con una cantidad
aproximada de 25 ceacutelulasml Estas cantidades estaacuten basadas en estudios
anteriores para medios liacutequidos selectivos en levaduras58
58 J Ungar A M James P W Muggleton H F Pegler y E G Tomich1950 The Cultivation of
Haemophilus pertussis in Partially Defined Liquid Media Journal of General Microbiology No 4
pag 345-359 Greenford
44
Este medio liacutequido inoculado fue inspeccionado diariamente visualmente revisioacuten
de turbidez microscoacutepicamente y olfativamente para deteccioacuten de olores del
ldquocaraacutecter Brettrdquo
Los diacuteas fueron contabilizados para determinar resultados positivos en estos
ensayos
73 INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN
VINO TINTO DE LA REGION DE DALMACIA CROACIA
731 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Medio selectivo solido para BretanomycesDekkera
Medio selectivo Liquido para BrettanomycesDekkera
Quiacutemicos de laboratorio (Dioxido de Azufre (SO2) Antibrettreg Glucosa)
Vino Babic 2007
Anallizador infrarojo Bacchius II microdom
732 Metodologiacutea
Con los medios desarrollados (solido y liquido) se quiere conocer el efecto del
dioacutexido de azufre (SO2) y el producto Antibrettreg en la levadura
BrettanomycesDekkera presente en el vino tinto de la regioacuten de Dalmacia
Con las herramientas que se tienen en el laboratorio del departamento de
tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia se quiere
determinar la influencia de estos productos en la levadura BrettanomycesDekkera
presente en vino tinto croata de la regioacuten de Dalmacia Babic
45
El primer paso es adaptar la levadura al vino tinto croata (Babic) para esto se
inoculan 20 colonias de BrettanomycesDekkera en 500 ml de vino se antildeadioacute
glucosa en una concentracioacuten de 2gL y se oxigena la mezcla Para este paso de
adaptacioacuten se dejan las muestras de 1 a 2 diacuteas a temperatura ambiente (20C)
Despueacutes de este periodo se revisa microscoacutepicamente la presencia positiva de
BrettanomycesDekkera en los 500 ml de vino en los que se estaba haciendo el
paso de adaptacioacuten en Babic al comprobar su presencia positiva se procede a
mezclar los 500 ml de vino contaminado con BrettanomycesDekkera con los 3
Litros de vino Babic que se disponen para esta prueba
Estos 3 litros de vino tinto Babic contaminado con la levadura
BrettanomycesDekkera se reparten en 8 frascos de vidrios esteacuteriles al siguiente
diacutea se toman dos frascos para agregar cada uno de los compuestos a evaluar
(SO2 y Antibrettreg)
Para SO2 se toman dos frascos uno de 600ml y uno de 100ml se agrega una
concentracioacuten de 40 mgl
Para el producto AntiBrettreg se toman cuatro frascos dos de 600 ml y dos de 100
ml seguacuten especificaciones del producto y la alta poblacioacuten de
BrettanomycesDekkera en las muestras se adiciono la maacutexima concentracioacuten de
AntiBrettreg a las muestras la cual fue de 40 gHl
Estas muestras se dejaron a temperatura ambiente simulando condiciones de
almacenamiento del vino en barricas temperatura aproximada de 20C evitando el
contacto con la luz solar y evitando movimientos fuertes Esto se mantuvo por 15
diacuteas que fue el tiempo de duracioacuten del experimento
Con el vino restante se mantuvo en las mismas condiciones de almacenamiento
de los demaacutes para hacer un paralelo de comparacioacuten
Previamente se analizaron las caracteriacutesticas del vino sin contaminar por medio
del analizador infrarrojo Bacchus II microdom antes de agregar los compuestos
46
SO2 y AntiBrettreg y despueacutes se volvioacute a realizar el anaacutelisis para determinar los
efectos de estos compuestos en el vino y asiacute mismo al de control
74 DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN
EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO
MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE
741 Materiales
Cromatografo de Gas HP5890 Serie II
Microextractor de fase solida (SPME)
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Quiacutemicos de laboratorio (p-cresolAcetaldehido Propanol diacetil etil-
acetato i-butanol acido aceacutetico i-amil-alcohol n-amil lactato de etilo
acetato amil metiacutelico 1-hexanol etil-hexanol linalol nerol citronelol
geraniol 2-feniletanol octanoato de etilo 4-etilfenol 2-feniletil acetato 4-
etilguaiacol)
Vino Tinto Babic
Agua destilada
742 Metodologiacutea
El meacutetodo fue desarrollado anteriormente en el Departamento de Tecnologiacutea y
Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos de
la Universidad de Zagreb Croacia Y despueacutes de modificaciones fue utilizado en el
desarrollo del trabajo El meacutetodo utilizado es descrito a continuacioacuten
47
Cromatografo de gas HP 5890 SERIES II
Programa HP-chem
a) Condiciones para analisis SPME-GC
Muestra diluida 5050 con adicion de estandar interno (p-cresol1mgl)
25ml de la muestra diluida con mezcla continua a temperatura ambiente
Tiempo de adsorcion 30 minutos
SPME es colocado en la muestra para la adsorcion durante el tiempo
previsto
b) Condiciones para el Cromatografo de gas (GC)
La columna usada en este experimento es RTXreg-5 (Restec USA sn 210627)
30m id=025mm 025μm
Gas portador Nitrogeno
Flujo del Nitrogeno 5 mlmin
Temperatura del inyector 240 C
Temperatura del detector 250 C
Temperaturas programadas 35 C5 min 150 C 34 Cmin 180 C
10Cmin 190 C 5 Cmin
Se conocen los resultados del cromatografiacutea de gases (ver tabla 10) y se hacen
necesarias varias correcciones del meacutetodo y algunas pruebas con unos
compuestos para determinar realmente su tiempo de retencioacuten en este tipo de
vino Se deben comprobar tiempos de retencioacuten
48
8 DISCUSIOacuteN Y RESULTADOS
81 RESULTADOS PARA EL DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO
Tabla 2 Medio Selectivo con Glucosa como fuente de carbono para
BrettanomycesDekkera en incubacioacuten por 5 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten
microscoacutepica
1 Negativo Negativo - No se realiza
2 Negativo Negativo - Presencia de levaduras
3 Negativo Negativo - Presencia de
Levaduras
4 Aparicioacuten de
algunas colonias
Negativo Transparente Presencia de levaduras
5 Colonias definidas Positivo-
Fenoles
Amarillo Presencia positiva de
BrettanomycesDekkera
49
Este medio tiene alto grado de selectividad para levaduras con un tiempo de
crecimiento de aproximadamente 5 diacuteas en 28C lo que lo hace raacutepido gracias al
antibioacutetico (ampicilina) que hace parte de la composicioacuten del medio no hay
presencia de bacterias Se hace confiable para resultados positivos de levaduras
BrettanomycesDekkera debido a que las levaduras Saccharomyces fueron
inhibidas con el compuesto cicloheximida su selectividad fue comprobada por
revisioacuten microscoacutepica macroscoacutepica y sensorial
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con glucosa como fuente de carboacuten son las
siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
50
Tabla 3 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono para Brettanomyces Dekkera en
incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica
1 Ninguno Negativo - -
2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras y
bacterias
9 Diminutas
colonias
transparentes
Negativo Transparentes Presencia de levaduras y
algunas bacterias
10 Positivo Positivo-
Fenoacutelicos
Amarillo Presencia de levaduras
BrettanomycesDekkera y
bacterias
El medio selectivo para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de
carbono tambieacuten es selectiva entre levaduras ya que solo se identifico la levadura
BrettanomycesDekkera en este sin embargo se evidencia una presencia de otro
microorganismo presuntamente bacteria ya que este medio no contiene agente
antibacteriano (ampicilina) Es necesaria la adicioacuten de ampicilina en una
concentracioacuten de 10mgl para inhibir la presencia de bacterias
Este medio presenta un tiempo maacutes prolongado para mostrar crecimiento de la
levadura BrettanomycesDekkera aproximadamente 10 diacuteas
51
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las
presentadas en el medio selectivo con glucosa como fuente de carbono y son las
siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
52
Tabla 4 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono y adicioacuten de ampicilina para
Brettanomyces Dekkera en incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica
1 Ninguno Negativo - -
2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
9 Diminutas
colonias
transparentes
Negativo Transparentes Presencia de levaduras
10 Positivo Positivo-
Fenoacutelicos
Amarillo Presencia de levaduras
BrettanomycesDekkera
El efecto de la ampicilina sobre el medio selectivo con etanol como fuente de
carbono fue el esperado inhibioacute completamente el crecimiento de colonias
bacterianas en el medio el tiempo de crecimiento de la levadura y presencia de
aromas fenoacutelicos fue el mismo de 10 diacuteas en incubacioacuten de 28C
53
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las
presentadas anteriormente y son las siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
82 RESULTADOS PRUEBAS MEDIO LIQUIDO
Tabla 5 Influencia de la concentracioacuten de levaduras BrettanomycesDekkera en el
tiempo necesario para detectar la produccioacuten de 4-etil-fenol en medio liquido
Nuacutemero de ceacutelulas ml
(concentracioacuten final)
Tiempo necesario para obtener resultados
positivos (diacuteas)
1 Experimento
32x106 le 3
3 X 104 3
33x102 7
40 No detectado
2 Experimento
43x106 le3
39x104 le3
37x102 8
62 No detectado
54
El nuacutemero de ceacutelulas de levadura de BrettanomycesDekkera fue contabilizado
usando contador de ceacutelulas Chamber
Los aromas fenoacutelicos son difiacuteciles de detectar debido al fuerte olor que tiene el
medio liquido caracteriacutestico de sus componentes esto dificulta la identificacioacuten del
ldquocaraacutecter Brettrdquo en especial cuando las concentraciones de
BrettanomycesDekkera no son elevadas Ademaacutes de los olores fenoacutelicos otros
compuestos volaacutetiles se detectan tales como acido aceacutetico y olores oxidativos
tambieacuten producido por la levadura BrettanomycesDekkera
En la inspeccioacuten visual se detecta alta turbidez en el medio Se compara con un
medio sin presencia de BrettanomycesDekkera
En las muestras con mayor concentracioacuten de la levadura es maacutes notoria la
turbidez Despueacutes de 3 diacuteas se presenta un precipitado blanco en todas las
muestras de altas concentraciones
La revisioacuten microbioloacutegica se realiza diariamente para determinar el nuacutemero de
ceacutelulas y la presencia positiva de la levadura a evaluar
Entre los dos experimentos realizados con el medio liquido el tiempo que se
demoro en detectar compuestos fenoacutelicos fue muy similar entre ellos
dependiendo del nuacutemero de ceacutelulas en el medio en mayores concentraciones el
tiempo de deteccioacuten fue menor
Hay que sentildealar que BrettanomycesDekkera debe alcanzar una concentracioacuten
miacutenima (denominada poblacioacuten criacutetica) de 103 UFCml para comenzar a liberar etil
fenoles Por debajo de esta concentracioacuten la levadura seriacutea metaboacutelicamente
activa pero no produciraacute compuestos alterantes a niveles detectables esto se ve
reflejado en los resultados en los que las concentraciones de ceacutelulas son muy
bajas
55
Estos resultados se comparan con los resultados dados en el medio solido Los
dos medios muestran altos grados de selectividad hacia la levadura
BrettanomycesDekkera y similar comportamiento para el crecimiento de dicha
levadura
En el medio liacutequido cuando hay altas concentraciones de BrettanomycesDekkera
el tiempo de deteccioacuten del microorganismo es menor que con el medio solido pues
en el liacutequido es aproximadamente 3 diacuteas y en el soacutelido son 5 diacuteas
83 RESULTADOS DE LA INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE
(SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO DE LA REGION DE
DALMACIA CROACIA
El vino fue analizado antes de la adicioacuten de los compuestos quiacutemicos a evaluar y
15 diacuteas despueacutes de adicioacuten para ver la reaccioacuten de este frente a SO2 y Antibrettreg
estas caracteriacutesticas se determinaron con el equipo de laboratorio Bacchus II
Microdom localizado en el laboratorio Vinolab doo Zagreb Croacia Los
resultados se muestran en la tabla
Tabla 6 Resultados de las muestras de vino inoculados con la levadura BrettanomycesDekkera
durante 15 diacuteas Comparativos con los diferentes compuestos
CFUml
Vino Day 1 Day 4 Day 10 Day 15
Control 130E+04 800E+03 700E+03 500E+03
Control 800E+03 640E+03 700E+03 280E+03
SO2 110E+04 400E+02 400E+02 67
SO2 900E+03 380E+03 270E+03 183
Antibrett 140E+05 920E+04 140E+04 400E+03
Antibrett 210E+05 181E+05 160E+04 900E+03
Antibrett 120E+05 990E+04 120E+04 100E+03
Antibrett 230E+05 204E+05 300E+03 200E+03
56
Tabla 7 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 antes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o
Antibrettreg Diacutea 0
Alcohol
()
Acidez Total
(gr Aci
Tartaacuterico L)
Acidez volaacutetil
(Aci
AceacuteticoL)
Densidad
(grml)
Azuacutecar residual
(grl)
Extracto
seco
(grl)
Acido
Laacutectico
(grl)
Glicerol
(grl)
Taninos
(grl)
Acetato
(grl)
1473
525
083
09928
473
332
164
799
305
117
1471
522
084
09927
479
329
162
786
299
116
Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
Tabla 8 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 despueacutes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o
Antibrettreg Diacutea 15
Alcohol
()
Acidez Total
(gr Aci
Tartaacuterico L)
Acidez volaacutetil
(Aci
AceacuteticoL)
Densidad
(grml)
Azuacutecar residual
(grl)
Extrac
to seco
(grl)
Acido
Laacutectico
(grl)
Glicerol
(grl)
Taninos
(grl)
Acetatos
(grl)
Control
1414
565
107
09935
436
364
177
827
259
136
Control
1415
556
108
09936
420
365
170
824
256
137
SO2
1456 543 108 09932 476 369 167 803 281 125
SO2
1457
542 108 09933 472 370 170 804 271 124
Antibrett 1454 533 106 09933 448 371 175 813 277 125
Antibrett 1455 534 105 09933 460 372 171 809 282 124
Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
57
Figura 4 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en el vino de control para
evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas
El comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en la prueba por
duplicado en el vino de control fue muy similar pues con el tiempo esta levadura
deja de reproducirse y va muriendo cuando las condiciones ya no son aptas para
su desarrollo debido a que la mayoriacutea de su fuente de carbono (Glucosa) esta
consumida sin embargo esta levadura no llega a su desaparicioacuten total lo que
representa uno de los mayores problemas en la elaboracioacuten del vino
Esta levadura tiene un metabolismo lento y el factor tiempo es un requisito
fundamental para su desarrollo este experimento se empezoacute con una alta
poblacioacuten de BrettanomycesDekkera (130 x 104 UFCml y 8 x 103 UFCml
respectivamente) y durante el transcurso del tiempo la poblacioacuten fue disminuyendo
debido a la perdida de las condiciones necesarias para la reproduccioacuten
58
Figura 5 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de SO2 en
concentracioacuten de 40 mgl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas
El SO2 tuvo un comportamiento efectivo y raacutepido contra las colonias de
BrettanomycesDekkera La poblacioacuten de esta levadura se redujo de forma
significativa entre el diacutea primero y el cuarto se encontroacute una diferencia porcentual
de 96 en la primera prueba y del 60 en la de duplicado al diacutea 15 ya la
poblacioacuten era casi nula pasando raacutepidamente de un numero por encima de la
poblacioacuten critica de la levadura BrettanomycesDekkera a un numero lt103 UFCml
siendo muy eficaz y raacutepido en el manejo de produccioacuten
Este compuesto ademaacutes de favorecer la extraccioacuten de los compuestos fenoacutelicos y
de su actividad antioxidante al inhibir la accioacuten de las polifenoloxidasas a dosis
adecuadas de un maacuteximo de 50gl inhibe la multiplicacioacuten bacteriana y de
levaduras
59
Figura 6 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de
Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo
de 15 diacuteas
Figura 7 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de
Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo
de 15 diacuteas
El compuesto Antibrettreg en la primera prueba tanto como en el duplicado tuvo su
mayor tiempo de reduccioacuten de UFCml entre los diacuteas 4-10 con una diferencia
porcentual de 91 en comparacioacuten con el diacutea cuarto al decimo a diferencia de
60
SO2 el cual presenta la gran disminucioacuten de colonias entre los primeros diacuteas de
agregarse el producto
El tiempo para que la poblacioacuten de la levadura llegara a la cantidad menor a la de
la poblacioacuten critica es mucho mayor que la del compuesto SO2 sabiendo que esta
poblacioacuten debe ser lt103 UFCml
El compuesto Antibrettreg puede tardarse 4-10 diacuteas en representar una reduccioacuten
de UFCml significativa en dicho tiempo puede representar grandes peacuterdidas
nutricionales y altos costos de produccioacuten para la fabricacioacuten
Figura 8 Comportamiento del contenido de alcohol en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin adicioacuten)
hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
BrettanomycesDekkera estaacute presente en vinos de alto contenido alcohoacutelico
aproximadamente entre 125 a 14 pues esta levadura toma a etanol como
fuente de carbono y este vino (Babic) procede de uvas muy maduras las cuales
presentan mayor cantidad de azuacutecares residuales (como glucosa y fructosa y
otras pentosas residuales)
138
14
142
144
146
148
Alcohol
Day 0 Day 15
61
Analizando el comportamiento del vino durante el experimento de 15 diacuteas sin
compuestos quiacutemicos y con SO2 y Antibrettreg a partir de las caracteriacutesticas
iniacuteciales que se determinaron seguacuten el equipo BACCHUS analizador infrarrojo se
presenta en general una reduccioacuten del contenido alcohoacutelico de este vino pero se
ve una mayor reduccioacuten en el vino de control el cual redujo en un 394 su
contenido alcohoacutelico desde el dia 0 hasta el diacutea 15 este vino no tiene ninguacuten
compuesto contra la levadura BrettanomycesDekkera y por su elevada presencia
en los 15 diacuteas de experimento consumioacute esta cantidad de etanol
Mientras en el vino que conteniacutea SO2 tras 15 diacuteas de tratamiento se vio una
reduccioacuten de alcohol de 1 ya que este compuesto redujo la cantidad de
BrettanomycesDekkera en los primeros diacuteas de tratamiento previniendo su
reproduccioacuten y protegiendo el contenido alcohoacutelico del vino Babic 2007
En los vinos de prueba con Antibrett reg la reduccioacuten alcohoacutelica se dio en un
porcentaje de 122 un poco maacutes alta que con SO2 y mucho maacutes baja en
comparacioacuten del vino de control este compuesto tambieacuten previno la gemacioacuten de
la levadura evitando la perdida de etanol en el vino sin embargo como este
compuesto duro mas en este proceso de eliminar BrettanomycesDekkera se
produjo una mayor peacuterdida alcohoacutelica
62
Figura 9 Comportamiento del contenido de acidez volatil en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin
adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
Debido a la presencia de oxigeno en los frascos la acidez volaacutetil aumento pero no
significativamente en las muestras No hubo grandes diferencias entre las
muestras con compuestos y las de control por lo que se deduce que estos
compuestos no ayudan a evitar esta acidez Esta acidez tan alta puede dantildear la
calidad del vino de forma casi irreparable Pero el factor oxigeno es de los maacutes
controlados en la produccioacuten de vinos
la alteracioacuten del aumento de la acidez volaacutetil no estaacute relacionada con la levadura
BrettanomycesDekkera sino a la presencia de oxigeno en el almacenamiento el
oxigeno fue usado en esta prueba para promover condiciones apropiadas para el
desarrollo de la levadura
002040608
112
Acidez Volatil
Day 0 Day 15
63
Figura 10 Comportamiento del contenido de Acido Acetico en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin
adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
Brettanomyces Dekkera son productores de aacutecido aceacutetico y elevan el contenido
de los vinos anormalmente en condiciones de anaerobiosis En condiciones de
aerobiosis producen concentraciones bajas o nulas de aacutecido aceacutetico
Este acido aceacutetico al igual que los fenoles afecta el sabor y el perfil olfativo del
vino tinto este efecto es tambieacuten producido por la levadura
BrettanomycesDekkera vemos en los resultados el gran crecimiento de este
compuesto en el vino control el cual no tenia compouestos en contra de
BrettanomycesDekkera lo que produjo este aumento significativo del acido aceacutetico
en comparacioacuten con estos que teniacutean SO2 y Antibrettreg entre ellos la diferencia en
este compuesto es muy reducida y no significativa pues estos compuestos no
permitieron la gemacioacuten de esta levadura y esta no produjo este acido en esa gran
cantidad
A este compuesto se le atribuye el olor y sabor a vinagre del vino tinto un defecto
muy comuacuten y poco agradable para el consumidor
105110115120125130135140
Acido Acetico
Day 0 Day 15
64
Figura 11 Comportamiento del contenido de Azucares reductores en vino Babic 2007
desde el diacutea 0 (sin adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en
comparacioacuten con el vino de control
BrettanomyesDekkera utiliza los azucares residuales como fuente de carbono
para su crecimiento en el vino este es el factor maacutes importante para su desarrollo
y este es el que determina en cierto caso la cantidad de levaduras de
BretanomycesDekkera presente en las graficas se determina claramente que en
el vino de control donde la cantidad de esta levadura es muy alta 15 diacuteas despueacutes
de empezar las pruebas la cantidad de azucares reductores es muy baja y ha
bajado en un porcentaje de 10 mientras que el vino que tiene SO2 bajo la
cantidad de azucares reductores en un 042 y el vino que tiene el compuesto
Antibrettreg redujo su nivel de azucares reductores en 462
38
4
42
44
46
48
5
Azucares Reductores
Day 0 Day 15
65
84 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE
CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON
EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID
PHASE
Tabla 10 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en
vino Babic 2007 con el meacutetodo propuesto
Compuesto Tiempos de
retencioacuten (min)
Acetaldehiacutedo 1437
Propanol 3759
Diacetil 4202
Etil-acetato 4523
i-butanol 6232
Acido Aceacutetico 7840
i-amil alcohol 11740
n-amil 13489
lactato de etiacutelico 15741
acetato amil metiacutelico 17796
1-hexanol 19101
etil-hexanol 24456
Linalol 30370
2-feniletanol 32768
p-cresol 33522
octanoato de etilo 34226
4-etilfenol 37100
2-feniletil acetato 32769
4-etilguayacol 39704
4 vinilfenol 40529
decanoato de etilo 42117
Refirieacutendose a estos resultados es necesaria la creacioacuten de soluciones estaacutendar
para determinar tiempos de retencioacuten con el meacutetodo y si es necesario ajustes a
este
66
Tabla 11 Soluciones estaacutendar para compuestos en vinos tintos Croatas
MODEL 0
(en volumen de 100 ml en 40 Etanol)
Compuesto Pureza Cantidad
(g)
Concentracioacuten (gl)
Acetaldehiacutedo 099 1623 160677
Propanol 0995 13849 137718
Diacetil 098 01071 104958
Etil-acetato 0995 30172 3002114
i-butanol 099 15016 1486584
Acido Acetico 0995 0 0
i-amil alcohol 099 20116 1991484
n-amil 098 15442 1513316
lactato de etilio 098 00507 049686
acetato amil metilico 098 01028 100744
1-hexanol 098 00367 035966
etil-hexanol 098 00308 029876
Linalol 097 00288 027936
Nerol 097 00311 030478
Citronelol 098 0031 03038
Geraniol 098 15803 1548694
2-feniletanol 098 00402 039396
4-etilfenol 098 00812 078764
octanoato de etilo 097 00597 059103
2-feniletil acetato 099 00315 031185
4-etilguayacol 098 00803 079674
Fuente Laboratorio de anaacutelisis e investigacioacuten de bebidas Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea
de Alimentos Universidad de Zagreb Zagreb Croacia 2009
Las soluciones estaacutendar se realizan teniendo como referencia las cantidades de
estos compuestos en los vinos tintos croatas datos suministrados por el Doctor
Leo Gracin en concentraciones de gl a partir de este dato y teniendo en cuenta
67
la pureza de los compuestos que se teniacutean en el laboratorio de anaacutelisis e
investigacioacuten de bebidas se crean las soluciones estaacutendar Ejemplo
Solucioacuten estaacutendar para 4 etil-fenol en un volumen de 100 ml
Con estas soluciones estaacutendar se realizo el tiempo de retencioacuten para corroborar el
meacutetodo Los resultados de esto fueron tiempos de retencioacuten diferentes a los del
meacutetodo primero con el que se realizaron los ensayos y a partir de esos resultados
se ajusto el meacutetodo con el que se trabajo
68
Tabla 12 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en
vino Babic 2007 con el meacutetodo modificado
Compuesto Tiempos de
retencioacuten (min)
Acetaldehiacutedo 1542
Propanol 4046
Diacetil 4733
Etil-acetato 4807
i-butanol 6659
Acido Acetico 8343
i-amil alcohol 12123
n-amil 13866
lactato de etilio 16072
acetato amil metilico 18336
1-hexanol 19447
etil-hexanol 24835
Linalol 31831
2-feniletanol 33305
p-cresol 33703
octanoato de etilo 34571
4-etilfenol 37724
Citronelol 38326
Nerol 38576
2-feniletil acetato 39012
Geraniol 39944
4-etilguayacol 40271
4 vilifenol 41168
decanoato de etilo 42657
69
DIA 0
Se coloca ISTD a todas las muestras respectivas para poder determinar
cantidades de los compuestos aromaacuteticos
Se realiza la cromatografiacutea de gas al vino Babic 2007 antes de ser inoculado con
BrettanomycesDekkera
Tabla 13 Resultados de la cromatografiacutea de gas del vino Babic 2007
Compuesto Tiempo de retencioacuten
min
Cantidad
mgl
Acetaldehiacutedo 1542 0
Propanol 4046 0
Diacetil 4733 37215204
Etil-acetato 4807 0
i-butanol 6659 0
Acido Aceacutetico 8343 2817465
i-amil alcohol 12123 16799019
n-amil 13866 26
lactato de etiacutelico 16072 10983961
acetato amil metiacutelico 18336 0185196
1-hexanol 19447 264655
etil-hexanol 24835 0158751
Linalol 31831 0
2-feniletanol 33305 4235560
p-cresol 33703 1
octanoato de etilo 34571 0152412
4-etilfenol 37724 00581345
Citronelol 38326 00439729
Nerol 38576 00344799
2-feniletil acetato 39012 00407983
Geraniol 39944 0
4-etilguayacol 40271 0
4 vilifenol 41168 0
Decanoato de etilo 42657 00190144
70
Basados en los compuestos aromaacuteticos que brinda el ldquoCaraacutecter Brettrdquo se van a
analizar detalladamente los siguientes aromas 4-Etilfenol 4-Etilguayacol 4-
Vinylfenol
Figura 12 Compuestos aromaticos en vino tinto Babic sin estar contaminado con la levadura
BrettanomycesDekkera
El vino a analizar esta por debajo de las concentraciones consideradas como
perjudiciales para el aroma del vino tinto (El umbral sensorial del 4-etilfenol es de
230 μgl y el del 4-etilguaiacol es de 47 μgl) pues posee una concentracion de
58microgL de 4etilfenol 0 microgL de 4 etilguayacol y 0 microgL de vinylfenol
841 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGUacuteN TEMPERATURAS
DE ALMACENAMIENTO
0
02
4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinylfenol
Vino 00581345 0 0
C (
mg
L)
Vino Babic 2007 Dia 0
71
Tabla 14 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el
ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 20C por 4 diacuteas Prueba por duplicado
MUESTRAS INCUBADA A 20C
Compuesto Day 1
Amount
(mgL)
Day 2
Amount
(mgL)
Day 3
Amount
(mgL)
Day 4
Amount
(mgL)
4-etilfenol 0260244 017294 0177547 020156
4-etilfenol 0260244 0245915 0204542 0262499
4-etilguayacol 0 0 0 0
4-etilguayacol 0 0 0 0
4 vinilifenol 1107096 781349 685317 460323
4 vinilifenol 1107096 1297465 621324 693225
72
Figura 13 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
BrettanomycesDekkera es la levadura responsable de la produccion de 4-etil-
fenol compuesto asociado con olores caracteristicos a ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 00581345 0260244 0172935 0177547 020156
C (
mg
L)
4 etilfenol
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 00581345 0260244 0245915 0204542 0262499
C (
mg
L)
4 etilfenol
73
caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo dantildeando la calidad sensorial del vino tinto Babic la
produccioacuten de este compuesto en esta muestra realizada por duplicado fue
ascendente y tuvo incremento muy grande en el primer dia de almacenamiento y
en el transcurso de los siguientes cuatro diacuteas se mantuvo relativamente estable lo
cual no concuerda con el comportamiento tiacutepico de esta levadura quien tiene un
crecimiento lento e incrementa la produccioacuten de fenoles con su gemacioacuten esto
genera muchas dudas sobre el buen funcionamiento del equipo GC o de la
estabilidad de las levaduras BrettanomycesDekkera en este almacenamiento
Figura 14 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar prueba por duplicado
002040608
1
Vino Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0 0 0
4 etilguayacol
002040608
1
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0 0 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
74
Presencia negativa de 4 etil guayacol durante todo el almacenamiento
probablemente las condiciones de almacenamiento y el medio no dieron lugar al
desarrollo de este compuesto el cual se considera menos conflictivo que el 4-etil-
fenol
Figura 15 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
Estos resultados tambieacuten dejan dudas del normal comportamiento de dicha
levadura pues indican que la levadura no convirtioacute este compuesto en etilfenol
0
2
4
6
8
10
12
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 110709781349685317460323
4 vinylfenol
0
2
4
6
8
10
12
14
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
Series1 0 11071 12974 62132 69322
C (
mg
l)
4 Vinylfenol
75
durante el almacenamiento caracteriacutestica que solo la levadura
BrettanomycesDekkera puede realizar se ve que las concentraciones de
vinylfenoles son mucho mas altas que las de fenoles lo que nos deja determinar
que la poblacioacuten de BrettanomycesDekkera es muy baja y existen otras levaduras
productoras de vinylfenoles en este tipo de vino en las condiciones de
almacenamiento dadas para estas pruebas
Tabla 16 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el
ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 28C por 4 diacuteas
MUESTRA 2 INCUBADA A 28C
Compuesto Day 1
Amount
(mgL)
Day 2
Amount
(mgL)
Day 3
Amount
(mgL)
Day 4
Amount
(mgL)
4-etilfenol 0260244 019612 0186614 019932
4-etilfenol 0260244 020576 0214917 0193554
4-etilguayacol 0 014304 0223836 0
4-etilguayacol 0 002287 00529832 0
4 vinilifenol 1107096 787068 665182 397847
4 vinilifenol 1107096 284389 00204392 0
76
Figura 16 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar
El desarrollo de este compuesto en el diacutea 1 fue significativo y luego relativamente
estable el comportamiento fue similar en las pruebas de diferentes temperaturas
de almacenamiento para este compuesto el cual es el maacutes problemaacutetico en la
industria viniacutecola
0
005
01
015
02
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 005813019932018661019611019932
4 etilfenol
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 005813 019355 021491 020576 026024
4 etilfenol
77
Figura 17 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar
Los resultados de la prueba son poco confiables y no entendibles por lo que
podemos verificar que el GC no estaacute trabajando de forma adecuada para la
deteccioacuten del compuesto
0001002003004005006
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 Etilguayacol 0 0 0022 0053 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
0005
01015
02025
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0223 0143 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
78
Figura 18 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
El comportamiento de este compuesto en la prueba es muy irregular y poco
confiable
0
2
4
6
8
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 397847665182787068397847
4 vinylfenol
0
2
4
6
8
10
12
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 11071 28438 00204 0
4 vinylfenol
79
Figura 19 Comportamiento del compuesto 4 etilfenol durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
La concentracioacuten de 4 etil fenol fue mayor al cuarto diacutea almacenado a
temperatura ambiente de 20C pero este compuesto no tuvo una actividad notoria
de ascenso durante su almacenamiento como se esperaba lo que deja muchas
dudas sobre los resultados de este ensayo
0
05
1
15
2
25
3
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etil fenol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 20C
80
Figura 20 Comportamiento del compuesto 4 etil guayacol durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
Comportamiento anormal del compuesto no se ve tendencias de aumento o
disminucioacuten de este en ninguna de las pruebas no tiene un comportamiento
regular pues se esperaba que la levadura BrettanomycesDekkera
descarboxinizara el compuesto 4-vinilguaiacol y aumentar las concentraciones de
4-etilguaiacol esta reaccioacuten no se hizo notoria en los compuestos aromaacuteticos
seguacuten lo determino el Cromatografo de Gas (GC)
0
005
01
015
02
025
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3
C (
mg
L)
4 etil guayacol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 20C
81
Figura 21 Comportamiento del compuesto 4 Vinyl fenoll durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
La no presencia de este compuesto en el vino original demuestra las baja o casi
nula presencia de la levadura BrettanomycesDekkera al diacutea primero este
compuesto incrementa de forma notoria en las muestras debido a la presencia de
acido cumaacuterico en el medio ya que sufre su carboxilacion convirtieacutendose en 4 vinyl
fenol sin embargo su comportamiento no fue regular y presento problemas de
lecturas
0
2
4
6
8
10
12
14
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
C (
mg
L)4 Vinyl fenol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 28C
82
9 CONCLUSIONES Y
RECOMENDACIONES
91 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO
Se desarrolloacute un medio selectivo soacutelido para BrettanomycesDekkera
accesible y faacutecil de elaborar
Se detectan colonias de la levadura BrettanomycesDekera en el agar
selectivo con glucosa como fuente de carbono en un lapso de 5 diacuteas en
incubacioacuten a 28C
El medio selectivo soacutelido con Glucosa como fuente de carbono fue maacutes
raacutepido y efectivo ya que toma 5 diacuteas para dar resultados positivos frente al
de Etanol como fuente de carbono el cual toma 10 diacuteas para mostrar
resultados positivos aunque ambos dieron resultados satisfactorios en la
selectividad de la levadura BrettanomycesDekkera
La levadura se adapto de forma satisfactoria a estos medios en
condiciones de almacenamiento propias para su desarrollo (28C)
Las colonias de la levadura BrettanomycesDekkera tiene un crecimiento
en estos medios soacutelidos de forma circular con topografiacutea convexa y borde
entero dimensiones 5-6 mm color Amarillo opacicidad oscuro
83
superficie lisa y suave siendo faacutecil de identificar y realizar los conteos
necesarios
El medio solido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten
de la levadura BrettanomycesDekkera en vino tinto es raacutepido econoacutemico
y uacutetil
El uso de azucares para fermentacioacuten de la levadura
BrettanomycesDekkera que Saccharomyces no puede fermentar para
mayor selectividad
Realizacioacuten de pruebas Bioquiacutemicas como meacutetodo raacutepido de selectividad
92 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DESARROLLO DEL MEDIO LIacuteQUIDO
Se desarrollo un medio selectivo liquido para BrettanomycesDekkera
accesible y faacutecil de elaborar
Este medio mostroacute resultados positivos de la presencia de
BrettanomycesDekkera en un lapso de tiempo menor (3 diacuteas) que con el
medio solido (5 diacuteas) en caso de que el nuacutemero de ceacutelulas de la levadura
BrettanomycesDekkera sea mayor a la poblacioacuten critica (103)
Cuando la poblacioacuten de ceacutelulas de la levadura BrettanomycesDekkera es
menor a la poblacioacuten critica el tiempo de identificacioacuten de esta levadura por
medio liquido es muy prolongado puede tomar maacutes de 10 diacuteas o incluso no
detectarlo
84
Los compuestos quiacutemicos usados para el desarrollo del medio liacutequido no
son los adecuados para este tipo de medios donde los resultados positivos
son olfativos pues estos compuestos emiten fuertes olores que confunden
los olores caracteriacutesticos del caraacutecter Brett
El medio liquido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten
de altas concentraciones de la levadura BrettanomycesDekkera en vino
tinto es raacutepido econoacutemico y uacutetil
93 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg
EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE DALMACIA
CROACIA
Este trabajo mostroacute que el dioacutexido de azufre (SO2) tiene buenos resultados
en contra de la levadura BrettanomycesDekkera en concentraciones
normales de 40mgl concentracioacuten en la que se trabaja este compuesto en
los vinos tintos
En Europa el dioacutexido de azufre es usado de forma tradicional en gran
nuacutemero de alimentos y especialmente en vinos sin embargo y a pesar de
su uso regulado se busca la sustitucioacuten de este o su maacutexima reduccioacuten
para hacer de este producto maacutes sano para las personas no tolerantes a
este tipo de compuestos sin embargo seguacuten el trabajo realizado en
comparacioacuten con el producto Antibrettreg el SO2 es maacutes eficaz en el control
85
de la levadura ayudando a evitarla y eliminarla de la cadena productiva del
vino tinto
Gracias a sus caracteriacutesticas el vino tinto Babic es muy vulnerable a la
levadura BrettanomycesDekkera pero a su vez se puede tratar faacutecilmente
con productos como SO2 y Antibrettreg aunque es maacutes efectivo contra
BrettanomycesDekkera el dioacutexido de azufre (SO2)
Antibrettreg es una buena opcioacuten para el control de BrettanomycesDekkera
para evitar el uso de productos alergenicos como SO2
94 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN
EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO
MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE
Al terminar la primera prueba con anaacutelisis en cromatografiacutea a gas y el SPME
queda como resultados
Es necesario repetir la prueba
No se determina el efecto de los estaacutendares internos sometidos a tiempos
de almacenamiento en temperaturas de 20C y 28C lo que puede dar falsos
resultados de cantidades de compuestos
86
Se debe crear un medio maacutes apto para el desarrollo de la levadura y un
control diario de crecimiento ( agregar maacutes Glucosa en caso de que se
haya consumido toda controlar presencia de Bacterias y otros
microorganismos que no se deseen en el medio)
Es necesario control de aromas con panel sensorial para determinar el
umbral de deteccioacuten en este vino
Control de crecimiento por medio solido Selectivo para
BrettanomycesDekekra conteo de colonias presentes en el vino inoculado
y su desarrollo durante almacenamiento a diferentes temperaturas
La segunda prueba no fue posible realizarla por dantildeos en el equipo de
cromatografiacutea de gas (GC)
87
ANEXOS
11
89
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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of ethyl phenols in wine by yeasts of the genera Brettanomyces and
Dekkera A review Journal Food Chemistry No 102 pag 10-21 Madrid
Espantildea
Andrea Romano a Marie Claire Perello a Aline Lonvaud-Funel Gilles
Sicard Gilles de Revel2008 Sensory and analytical re-evaluation of bdquobdquoBrett
characterrdquo Journal Food Chemestry No 114 pag 15-19 Talence France
N Rodrigues G Gonccedilalves S Pereira-da-Silva M Malfeito-Ferreira and
V Loureiro2001 Development and use of a new medium to detect yeasts
of the genera DekkeraBrettanomyces Journal of applied microbiology No
90 pag 588-599Lisboa Portugal
JA Couto A Barbosa and T Hogg 2005 A simple cultural method for the
presumptive detection of the yeasts BrettanomycesDekkera in wines
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92
Serkovic Dubravka Gracin Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od
kvasac Brettanomyces bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet
pag 1-117 ZagrebCroatia
C Pizarro N Perez-del-Notario JM Gonzales-Saiz 2007 Determination
of Brett character responsible compounds in wines by using multiple
headspace solid-phase micro extraction Journal of Chromatography No
1143 pag 176-181 La Rioja Espantildea
E Pueyo P Hidalgo K Fernaacutendez y P Martiacuten-Aacutelvarez 1999 Anaacutelisis de
compuestos volaacutetiles en vinos obtenidos con distintas cepas de
Saccharomyces cerevisiae Aplicacioacuten de la teacutecnica de micro extraccioacuten en
fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientiacuteficas 99 Grupos de
Investigacioacuten Enoloacutegica Zaragoza Espantildea
93
11
GRACIAS es una palabra corta para todo lo que quiero expresar a todos aquellos que
hicieron parte de este suentildeo hecho realidadhellip
A Dios y a la virgen Auxiliadora por llevarme de su mano cada diacutea de mi carrera en cada
momento alegre y en cada momento difiacutecil fueron mi fortaleza
A mis papitos por hacer de mi estudio una realidad por su sacrificio y apoyo desinteresado y
sincero
A mi Hermanito por ser mi fortaleza mi ejemplo y mi amigo incondicional
A mi familia Blanco y Urrea por su compantildeiacutea durante esta etapa
A mi facultad (Decano Dr Camilo Rozo Dra Patricia Jimeacutenez y mis profesores) por
ensenarme mi profesioacuten y aportar lo mejor de ustedes para mi formacioacuten personal
A mis asesores de Tesis (Ing Patricia Chaparro y Dr Sc Leo Gracin) por su guiacutea y
colaboracioacuten oportuna
A mis queridos amigos quienes siempre han estado a mi lado en las dificultades y en las
alegriacuteas (Ingrid Mafe Cami G Cami R Harold Pipe Karla Andreacutes T Diego G)
A IAESTE en alianza con el ORI por hacer posible mi intercambio y poder hacer mi tesis en el
maravilloso paiacutes de Croacia
A Croacia por ser mi segundo hogar por abrirme sus puertas y su corazoacuten por brindarme
tan maravillosas personas en mi camino
Croatia Thank you for being my second home for opening your doors and your heart to me
and give me the opportunity to meet so many wonderful people
To my boss my teacher my mentor and specially my friend Leo
To the faculty of food technology and Biotechnology and the department of technology
and analysis of beverages for give me the opportunity to give all my knowledge to the
project and learn a lot more
To all the amazing people I met during this experience (Igor Karin Natka Josip Ana Matija
Daniel Pz Szilvia Dini Daniela Lidija Sanja and everybody else who I had the pleasure to
meet in this great trip) for give me the best of your hearts
I only have one thing to say hellipTHANK YOU
Solo me queda una palabra por decirhellipGRACIAS
9
El ldquocaraacutecter Brettrdquo produce un amplio espectro de sabores y aromas alterantes
entre los cuales estaacuten corral minerales tinta tabaco cuero faacutermacos y
ahumado estas alteraciones se le atribuyen a los compuestos 4-etilfenol y 4-
etiguayacol las cuales causan una supresioacuten de aromas atractivos en el vino
como de frutas y flores y perdida de sabores agradables para el consumidor como
acido salado amargo o picante 4
Esta levadura tiene distinto comportamiento seguacuten el tipo de vino al que esteacute
asociada pues cada tipo de vino tiene diferente composicioacuten de carbonos
nitroacutegenos vitaminas y minerales
Con este estudio se evaluacutea el comportamiento y caracterizacioacuten de la levadura
BrettanomycesDekkera en vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia con
el desarrollo de medios solido y liquido para la selectividad de la levadura
alteraciones aromaacuteticas del vino tinto Babic producidas por 4 etilfenol y 4
etilguayacol y el comportamiento de BrettanomycesDekkera en el vino al ser
tratado con Dioacutexido de azufre (SO2) comparativamente con tratamiento Antibrettreg
4 Boulton Singleton Bisson amp Kunkee 1996 Descripcioacuten de aromas fenoacutelicos
10
1 MARCO TEORICO
Las levaduras representan el grupo de microorganismos maacutes importante en la
industria viniacutecola porque sin Saccharomyces producir vinos de alta calidad seriacutea
imposible Ademas de Saccharomyces hay muchos otros geacuteneros y especies de
levaduras presentes durante la vinificacioacuten que afectan la calidad del vino positiva
o negativamente5
Las levaduras comprenden 39 geacuteneros y 350 especies Se identifican y clasifican
basaacutendose en caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas Entre los aspectos
morfoloacutegicos considerados se encuentran el tamantildeo y la forma de las ceacutelulas en
medios soacutelidos y liacutequidos especificados el modo de reproduccioacuten y si forma velo
en la superficie o sedimenta en un medio liacutequido Entre las caracteriacutesticas
fisioloacutegicas consideradas se encuentra si puede crecer (y fermentar) en un
determinado carbohidrato y si puede o no utilizar determinadas fuentes de
nitroacutegeno como los nitratos6
11 REPRODUCCION
Las levaduras son agrupadas en tres familias conocidas como
Saccharomycetaceae Sporobolomycetaceae y Cryptococcaceae Estas
5 H Erten June 2002 Relations between elevated temperatures and fermentation behavior of
Kloeckera apiculata and Saccharomyces cerevisiae associated with winemaking in mixed culture
World Journal of Microbiology and Biotechnology Volume 18 N 4 pag 1 Adana Turkey 6 Cerveceros de Argentina 2006 Levadura wwwcervezadeargentinacomararticuloslevadurahtm
11
representan el grupo de microorganismos entre bacterias y hongos respecto a su
tamantildeo de ceacutelula Este grupo es caracterizado por su forma de reproduccioacuten
vegetativa conocida como ldquogemacioacutenrdquo Bajo condiciones optimas una ceacutelula
madre puede gemar varias veces durante el periodo reproductivo Sin embargo
bajo estrictas condiciones de fermentacioacuten una levadura va a gemar solamente
entre tres o cuatro veces Aquiacute la disponibilidad de oxigeno la cual es necesaria
para la formacioacuten de precursores de la membrana de la ceacutelula limita la
replicacioacuten7
Estos microorganismos muestran varios tipos de gemacioacuten lo cual puede dar un
valor diagnostico Entre aquellas aisladas de fermentacioacuten y antildeejamiento del vino
se observan maacutes frecuentemente multilateral y gemacioacuten polar 8
La modalidad maacutes comuacuten es la gemacioacuten proceso asexual en el cual la ceacutelula
progenitora emite un conducto tubular desde la vacuola nuclear hacia un punto
perifeacuterico proacuteximo a la misma Entonces se forma en la direccioacuten del conducto
una pequentildea protuberancia en la superficie externa de la ceacutelula y el conducto
pasa atravesando la pared celular a dicha protuberancia la cual se ensancha
llenaacutendose con el material citoplaacutesmico y nuclear de la ceacutelula progenitora Cuando
el brote o yema formada llega a ser casi tan grande como la ceacutelula progenitora los
aparatos nucleares de ambas ceacutelulas se orientan de forma que sus centrosomas
respectivos equidisten del punto de unioacuten Al llegar este momento la ceacutelula madre
y la ceacutelula hija se separan y se inicia la formacioacuten de nuevas ymas En la
gemacioacuten normal no se forman tabiques de separacioacuten entre ceacutelula madre y
ceacutelulas hijas pero en algunos casos el proceso se inicia en la gemacioacuten y se
completa por divisioacuten con la separacioacuten definitiva de ambos individuos La ceacutelula
madura de puede producir por gemacioacuten durante el curso de vida un promedio de
7 Brinton M Miller and Warren Litsky PhD 1976 Industrial Microbiology Edi Mac Graw Hill United States
of America
8 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures
edi Springer second edition Fresno California United States of America
12
24 generaciones de ceacutelulas hijas Las yemas sucesivas se forman siempre en
sitios diferentes de la superficie de la ceacutelula9
111 Gemacioacuten multilateral
La gemacioacuten multilateral ocurre en el ldquohombrordquo o aacuterea de la levadura donde ocurre
la reproduccioacuten La gemacioacuten y ciclo de separacioacuten crea un problema para las
levaduras durante su fase fermentativa pues en este tiempo la ceacutelula madre se
reduce aproximadamente un medio Porque la siacutentesis de la membrana celular
ocurre bajo condiciones anaeroacutebicas lo que limita los ciclos asexuales
replicativos Como resultado la mayoriacutea de las fermentaciones se completan en la
fase estacionaria (no gemacioacuten) Un ejemplo de esta reproduccioacuten es
BrettanomycesDekkera10
112 Gemacioacuten Polar
A diferencia de la gemacioacuten multilateral la gemacioacuten polar puede ocurrir en uno o
dos polos En el caso de Kloeckera y Saccharomyces la gemacioacuten ocurre en
ambos polos aumentando la poblacioacuten de levaduras con forma de ldquolimoacutenrdquo 11
113 Fisioacuten
Esta reproduccioacuten es caracteriacutesticas del genero Schizosaccharomyces donde la
formacioacuten de la ceacutelula hija ocurre sin la reduccioacuten de la madre ceacutelula como en los
casos anteriores En este caso la formacioacuten de la microscoacutepica pared celular
ocurre entre la madre ceacutelula y la hija seguida por la separacioacuten12
9 Araya Pablo 2002 Reproduccioacuten de hongos unicelulares mediante gemacioacuten esporulacioacuten y
fisioacuten httphtmlrincondelvagocomreproduccion-asexualhtml
10 11 12 Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic
Publishers GmbH United States of America and Canada
13
114 Pseudomycelium
Cualquier fabricante de vinos ha tenido la oportunidad de notar la formacioacuten de
una peliacutecula en la superficie del vino Esto surge debido a la gemacioacuten repetida de
las levaduras oxidativas y fallas en el momento de la separacioacuten de la ceacutelula hija
de la madre Con el tiempo el lazo previo entre la madre ceacutelula e hija se ampliacutea
dando la impresioacuten de filamentos como si se tratase de mohos siendo que son
levaduras 13
12 TAXONOMIA
Para distinguir las levaduras que pueden producir ascoporas de aquellas que no
los micologistas usan doble taxonomiacutea para su clasificacioacuten Desafortunadamente
la nomenclatura para la combinacioacuten anamorfotelemorfo es frecuentemente
diferente Unos ejemplos de levaduras sexualasexual o telemorfoanamorfo son
DekeraBrettanomyces Metschnikowia pulcherrimaCandida pulcherrima
Hanseniaspora uvarumKloeckera apiculata Torulaspora delbruecki Candida
colliculosa 14
Sin embargo las levaduras son diferenciadas por los taxonomistas por asignacioacuten
de varios nombres de geacutenerosespecies varios vinicultores usan un sistema
informal para agrupar levaduras basadas en su morfologiacutea u otras caracteriacutesticas
Por ejemplo a Kloeckera apiculata se le refiere como ldquolevadura apiculadardquo
tiene forma de limoacuten Esta levaduras asi com muchas otras presentes en el mosto
de la uva como lo son Candida Cryptococcus Debaryomyces Hansenula
Issatchenkia Kluyveromyces Metschnikowia Pichia y Rhodotorula tambieacuten son
llamadas levaduras ldquonativasrdquo ldquonaturalesrdquo o ldquosalvajesrdquo por su origen el vintildeedo o en
13
Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers
GmbH United States of America and Canada
14 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
14
la vinera Algunos enoacutelogos han discutido contra el uso de estos teacuterminos porque
esta implicancia no sucede en todas las levaduras ya que estas son de alguna
forma ldquono-nativasrdquo o ldquono naturalesrdquo (Ej Saccharomyces o Brettanomyces) El
teacutermino ldquono Saccharomycesrdquo es maacutes comuacuten para nombrar aquellas levaduras
presentes en el mosto de la uva que no son del genero Saccharomyces15
Las levaduras encontradas despueacutes de la fermentacioacuten alcohoacutelica tambieacuten son
asignadas a un grupo informal Algunas veces las levaduras que conducen la
principal fermentacioacuten (Saccharomyces) son muchas veces llamadas ldquolevaduras
fermentativasrdquo basados en su metabolismo Durante su antildeejamiento algunas
levaduras (Candida Hansenula y Pichia) pueden crecer en la superficie en
presencia de oxigeno Esta peliacutecula superficial es comuacutenmente asociada a
deterioro del vino esta levadura se le conoce como ldquolevadura formadora de
peliacuteculardquo16
121 DekkeraBrettanomyces
La taxonomiacutea cientiacutefica sobre BrettanomycesDekkera ha cambiado en los uacuteltimos
antildeos Brettanomyces estaacute clasificado dentro de la misma familia que
Saccharomyces (familia Saccharomycetaceae) Actualmente dentro del geacutenero
Brettanomyces se aceptan cinco especies diferentes (B bruxellensis B
anomalus B custersianus B nanas y B naardenensis)17
Las teacutecnicas de biologiacutea molecular han demostrado que B intermedious B
lambicus B custerseii o D intermedia son sinoacutenimos de B bruxellensis por lo
que estas denominaciones han quedado en desuso Los microorganismos de este
geacutenero presentan dos formas una capaz de reproducirse sexualmente (Dekkera)
15
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
16 Kurtzman CP 1998 The industrial and agricultural significance of yeasts 4
th Edition Amsterdam
Holanda
17 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
15
y otra que lo hace asexualmente (Brettanomyces) Tambieacuten se llaman
respectivamente forma perfecta y forma imperfecta En algunos casos la forma
perfecta y la imperfecta reciben nombres diferentes como ocurre con B anomalus
y D anomala En otros casos el nombre es similar como las pertenecientes a la
especie bruxellensis que pueden parecer como D bruxellensis como B
bruxellensis o como BrettanomycesDekkera A efectos praacutecticos en la bodega
estos dos estados son similares Cuando vemos referencias a Brettanomyces
como contaminante en la mayor parte de los casos se refieren a
DekkeraBrettanomyces ya que este es el responsable de las alteraciones en el
vino18 y 19
La morfologiacutea celular de BrettanomycesDekkera es ojival o ciliacutendrica con
gemacioacuten multipolar en reproduccioacuten vegetativa Una de las caracteriacutesticas de
este geacutenero es su tamantildeo celular variable y la formacioacuten de filamentos19
18 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 23
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
19
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
16
Figura 1 Microfotografiacutea de cultivo de BrettanomycesDekkera a) Variabilidad morfoloacutegica y de
tamantildeo celular b) forma filamentosa
Fuente Lopez-Cordon Eva BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia wwwacenologiacom
Los defectos sensoriales asociados directamente a Brett aparecen
mayoritariamente en vinos tintos de calidad y las causas radican en la propia
fisiologiacutea del microorganismo Ademaacutes al ser una levadura de crecimiento muy
lento la alteracioacuten se presenta principalmente durante el almacenamiento y sobre
todo la crianza del vino habitual en los vinos tintos de gama alta En las barricas
de madera el microorganismo tiene a su disposicioacuten todo el sustrato y tiempo
suficiente para realizar su actividad La naturaleza porosa de la madera y su difiacutecil
limpieza contribuye a que las poblaciones existentes se mantengan incluso
despueacutes del lavado de la barrica Ademaacutes BrettanomycesDekkera tiene la
capacidad de degradar uno de sus componentes la celobiosa 20
13 CARACTERISTICAS FISIOLOGICAS
S cerevisiae y BrettanomycesDekkera tienen metabolismos similares muy
adaptados a las condiciones de vinificacioacuten Tras la fermentacioacuten alcohoacutelica S
cerevisiae es la levadura mayoritaria debido a que las condiciones nutricionales
20
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
17
del vino son muy estrictas (altas concentraciones de etanol y bajas
concentraciones de nutrientes) En este momento BrettanomycesDekkera
continuacutea creciendo gracias a que utiliza nutrientes que S cerevisiae no ha podido
consumir sobre todo algunos azuacutecares y fuentes de nitroacutegeno21
Una de las caracteriacutesticas que diferencia a BrettanomycesDekkera es la gran
diversidad de azuacutecares que puede fermentar (ver tabla de Relacioacuten de los
principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) La mayoriacutea de
las cepas pueden crecer utilizando trealosa y celobiosa azucares presentes en el
vino y no consumibles por S cerevisiae Otra de las ventajas que presenta frente
a S cerevisiae (y frente a la mayoriacutea de las levaduras) es que puede utilizar los
nitratos como fuente de nitroacutegeno Debido a que S cerevisiae soacutelo utiliza el
nitroacutegeno amoniacal y los aminoaacutecidos libres estos se consumen con relativa
rapidez Al final de la fermentacioacuten el nitroacutegeno moniacal es escaso y se favorece
el crecimiento de las levaduras que pueden utilizar otras fuentes de nitroacutegeno
Ademaacutes Brettanomyces puede crecer con concentraciones de fosfato diamoacutenico
tan bajas como 05gl o a partir de diversos aminoaacutecidos En resumen
BrettanomycesDekkera crece maacutes despacio que S cerevisiae es resistente a
concentraciones altas de alcohol puede utilizar otros azucares como fuentes de
energiacutea y nitrato como fuente de nitroacutegeno Esto explica que pueda reproducirse
cuando la fermentacioacuten alcohoacutelica ha terminado a partir de nutrientes no
consumibles por S cerevisiae y cuando no tiene competidores22
21
Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
22 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
18
Tabla 1 Relacioacuten de los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto
Fuente Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista
VINOTEQ N 38 pag 21 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
131 BrettanomycesDekkera y siacutentesis de fenoles volaacutetiles
El origen de los fenoles volaacutetiles estaacute relacionado con la actividad secuencial de
dos enzimas que descarboxilan los aacutecidos en hidroxiestirenos (vinilfenoles) que
19
son posteriormente reducidos a etilderivados (etilfenoles)23 como puede
observarse en la figura 2
Figura 2 Siacutentesis de etilfenoles de BrettanomycesDekkera
Fuente ACE revista de Enologia wwwacenologiacom
El primer paso de descaboxilacion de los aacutecidos hidroxicinamicos es comuacuten
tambieacuten en otros microorganismos como bacterias hongos y otras levaduras Sin
embargo el segundo paso reduccioacuten de vinilfenoles es caracteriacutestico de algunos
tipos de levaduras como Dekkera bruxelliensis D anomala Pichia guillermondi
Candida versarilis C halophila y C mannitofaciens24
Los fenoles volaacutetiles que se asocian al problema Brett en vinos son el 4-etilfenol y
el 4- etilguaiacol asiacute como sus precursores intermedios 4-vinilfenol y 4-
vinilguaiacol aunque estos uacuteltimos son menos importantes por ser muy reactivos y
raacutepidamente convertidos en etilfenoles por BrettanomycesDekkera o en su caso
23
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
24 Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
20
condensan con otras moleacuteculas como antocianos25 Los etilfenoles y
especialmente elevadas concentraciones de 4-vinilfenol en vinos se asocian con
aromas desagradables asociados a descriptores como ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de
caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo26
El umbral sensorial del 4-etilfenol es de 230 μg l-1 y el del 4-etilguaiacol es de 47
μgl Pese a su menor umbral sensorial el 4-etilguaiacol responde a descriptores
como ldquobaconrdquo o ldquoahumadordquo que a bajas concentraciones aportan complejidad por
lo que se puede considerar sensorialmente menos conflitivo que el 4-etilfenol 27
Figura 3 Defectos sensoriales producidos en el vino por BrettanomycesDekkera
Fuente Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
25 Morata A Goacutemez-Cordoveacutes M Calderoacuten F Suaacuterez J 2006 Effects of pH temperature and SO2 on the
formation of pyranoanthocyanins during red wine fermentation with two species of Saccharomyces Journal Food Microbiology No106 pag 4 Madrid Espana
26 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea 27 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
21
132 Identificacioacuten de BrettanomycesDekkera
Los Bioacutelogos usan sistemas de identificacioacuten basados en similitudes taxonoacutemicas
entre organismos dichas similitudes pueden ser morfoloacutegicas tipos capacidad de
produccioacuten de sustratos como azuacutecar yo nitratos caracteriacutesticas fisioloacutegicas y
bioquiacutemicas secuencia del material geneacutetico y respuestas inmunoloacutegicas28
En la industria viniacutecola es importante recurrir a diferentes tipos de pruebas para la
identificacioacuten de microorganismos una de estas y la maacutes realizada es la revisioacuten
del microorganismo bajo el microscopio Esta prueba brinda informacioacuten sobre la
morfologiacutea del microorganismo (cocos bacilos formas puntudas ojival entre
otros) tamantildeo (dimensiones) agrupaciones celulares (solas parejas triacuteos
grupos o cadenas) Sin embargo el uso del microscopio es una prueba raacutepida
para examinar mostos o vino pero no determina cantidades que muchas veces es
requerido para tratamientos de accioacuten otro de los inconvenientes es que los
microorganismos pueden variar su morfologiacutea en forma o tamantildeo dependiendo de
la edad y las condiciones de crecimiento por lo que puede no ser clara la
identificacioacuten de este29
14 Medios soacutelidos selectivos
Si se requiere de la confirmacioacuten del microorganismo este debe ser aislado del
vino para una caracterizacioacuten para esto se requiere de medios soacutelidos Cuando se
examina un microorganismo en un medio solido es importante revisar las
caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias (ver figura 4 Morfologiacuteas de colonias
en medios soacutelidos) Entre estas caracteriacutesticas estaacuten forma (circular irregular o
2829 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
22
rizada) tamantildeo (dimensiones estas normalmente se expresan en miliacutemetros)
topografiacutea (plano elevado convexo coacutencavo o embonado) presencia de
pigmentos opacidad (transparente traslucido u opaco) superficie (suave rugosa
lisa o aacutespero) bordes (entero ondulado crespo dentado rizado) o cualquier
cambio en el agar (color opacidad cambios en los indicadores de pH o CaCO3
respectivamente)30
Figura 4 Varias morfologiacuteas de crecimiento de colonias en medio solido
Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007
Gran nuacutemero de medios selectivos se han creado para la aislacioacuten deteccioacuten yo
conteo de levaduras provenientes de jugos de uva mostos o vinos El medio maacutes
utilizado en estos fines es YPD (Yeast Peptone Dextrose) pero dicho medio no
es selectivo entre levaduras y se usa comuacutenmente para el conteo de
Saccharomyces31 Las colonias empiezan a parecer con un periodo de incubacioacuten
30
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
31 Essia Ngang J Wolniewicz E Villa P2005 Stimulation of lactobacilli during alcoholic fermentation action
of sucrose hydrolysis by yeast Biotechnology letters No 8 pag 743 Amiens France
23
de 2 a 4 diacuteas a 22C a 25C Igualmente el agar de jugo de uva es no selectivo y
presenta faacutecil crecimiento de levaduras bacterias y mohos
Para la levadura Brettanomyces Dekkera se han elaborado diferentes medios
selectivos entre ellos el maacutes conocido es WL por sus siglas en ingles del
laboratorio que lo creo ldquoWallerstein Laboratoriesrdquo este medio contiene
cicloheximida compuesto selectivo para Brettanomyces e inhibe Saccharomyces
El punto criacutetico es encontrar la cantidad exacta de este compuesto para la
inhibicioacuten de las levaduras sin que afecte a BrettanomycesDekkera32
Ademaacutes del medio WL BrettanomycesDekkera puede ser cultivado en otros
medios selectivos como Brettanomyces medio A creado por Vilas en 1993
Brettanomyces medio B el cual contiene cicloeximida como agente selectivo
mientras que Brettanomyces medio C tiene cicloheximida y ampicilina este medio
fue creado por B Watson en 1998 Brettanomyces medio D fue creado
recientemente por Rodrigues en 2001 este medio es conocido como DBDM
(DekkeraBrettanomyces differential medium ) es un medio selectivo para
Brettanomyces en contra de Saccharomyces y otras levaduras este medio es el
maacutes utilizado en la vineras para caracterizacioacuten de BrettanomycesDekkera
actualmente33
15 Dioacutexido de azufre (SO2) en vinos
32
33
Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers
GmbH United States of America and Canada
24
El dioacutexido de azufre tambieacuten llamado oxido de azufre es un eficaz agente
conservante antioxidante y antimicrobiano en la industria viniacutecola34
Durante la vinificacioacuten SO2 ha representado histoacutericamente una herramienta muy
importante usada por los vinicultores para el control de crecimiento microbioloacutegico
Debido a preocupaciones por la salud del consumidor el uso de este producto ha
disminuido dramaacuteticamente con el posible riesgo de aumentar el riesgo
microbioloacutegico35
El actual liacutemite legal de SO2 en vinos en los Estados Unidos es de 350mgL una
concentracioacuten mucho mayor a la usada en la industria viniacutecola No obstante vinos
que contienen maacutes de 10mgL deben declarar este compuesto en la etiqueta
porque SO2 es un metabolito que las levaduras usan durante la fermentacioacuten Los
vinos siempre contienen algo de sulfitos aunque la adicioacuten no se realice durante el
proceso36
151 Formas del Dioacutexido de Azufre (SO2)
Una vez disuelto en agua el dioacutexido de azufre existe en equilibrio entre SO2
molecular (SO2H2O) bisulfito (HSO3) y sulfito (SO32-) Este equilibrio depende del
pH Ademaacutes de estar en equilibrio con el molecular y especies sulfito el bisulfito
tambieacuten existe en forma ldquolibrerdquo y en forma ldquoatadardquo Aquiacute la moleacutecula reaccionara
34
Orwine Eureka 2008Investigadores europeos buscan alternativas al dioxido de azufre en vinos
httpawprowordpresscom20081107investigadores-europeos-buscan-alternativas-al-dioxido-de-
azufre-en-el-vino
3536 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
25
con compuestos carbonilos (ej Acetaldehiacutedo) formando productos adicionales
como Acido Hydroxysulfonico 37
Ademaacutes de Acetaldehiacutedo algunas moleacuteculas presentes en el jugo de uva que
reaccionan con bisulfito son acido piruvico α-keto-glutaric dihidroxyacetona
diacetyl Pigmentos de antocianinas entre otros38
152 Inhibidor Microbiano
El sulfuro molecular es la forma antimicrobiana del dioacutexido de azufre La cantidad
de SO2 molecular presente en cualquier vino no se mide directamente La
concentracioacuten es calculada conociendo la concentracioacuten de SO2 libre y el pH del
vino basaacutendose en la siguiente foacutermula
Alternativamente la figura 5 Se puede utilizar como guiacutea para aproximar la
cantidad de SO2 libre necesitada a determinado valor de pH de valores entre 05 o
08 mgl de SO2 molecular 39
El SO2 inhibe microorganismos de varias formas incluyendo rupturas de puentes
bisulfitos en proteiacutenas y reaccionando con coofactores como NAD+ y FAD tambieacuten
reacciona con ATP
3739
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
38 Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi
Springer New York United States
26
Figura 5 Cantidades de SO2 libre a un pH determinado para obtener 05 o 08 mgl de SO2
molecular
Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007
La concentracioacuten de SO2 molecular necesario para prevenir el crecimiento de
microorganismos variacutea seguacuten vinojugo pH temperatura poblacioacuten densidad y
diversidad estado de crecimiento grado de alcohol entre otros factores Beech
1979 sugirioacute una adicioacuten de 08 mgl de SO2 molecular como la cantidad
necesaria del compuesto en vinos blancos de mesa para dar una reduccioacuten de
cerca de 104 UFCml de la poblacioacuten de diferente tipo de microorganismos en 24
horas Las diferencias que existen entre las levaduras y bacterias en base a la
27
sensibilidad a este compuesto son dadas a conocer por diferentes autores (Warth
1977 1985 Du Toit 2005 Davis 1988 Hood 1983)40
16 Antibrettreg como alternativa de prevencioacuten y eliminacioacuten de
BrettanomycesDekkera
Antibrettreg es un producto nuevo creado por Spindal SARL-Gretz - Armainvilliers
Francia Es una preparacioacuten enzimaacutetica para inactivar Brettanomyces y para
reducir olores producidos por fenoles volaacutetiles41
Antibrettreg es preparado a base de paredes celulares de levadura activados
enzimaacuteticamente que presentan elevadas propiedades adsorbentes frente al 4-
etilfeno y 4- etilguayacol compuestos asociados con olores desagradables en el
vino tales como sudor de caballo farmacia o barniz42
Antibrettreg inhibe la produccioacuten de la vinilreductasa que participa en la
transformacioacuten de los aacutecidos cinaacutemicos naturalmente presentes en los vinos en
los correspondientes derivados etilados responsables de los olores atribuidos a
BrettanomycesDekkera 43
40
Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi
Springer New York United States
41 Manual de instrucciones de producto Antibrett reg producido por Spindal SARL-Gretz -
Armainvilliers France
424344 AEB Group 2008 ANTIBRETT Preparado a base de paredes celulares de levadura para la inactivacioacuten
de Brettanomyces y la eliminacioacuten de los olores de estos productos httpwwwaeb-
groupcomimgsSPAGNOLODepliantANTIBRETT-lett-ESPpdf
28
El uso de Antibrettreg es efectivo incluso contra otros olores anoacutemalos como los
que se generan en las barricas sucias principalmente huacutemedas dantildeando la
calidad olfativa del vino44
29
2 PROBLEMA
La levadura BrettanomycesDekkera es una levadura de contaminacioacuten presente
en la mayoriacutea de industrias viniacutecolas en el mundo Afecta directamente la
produccioacuten y calidad sensorial de los vinos con el desarrollo de los compuestos 4
etilfenol y 4 etilguayacol los cuales dantildean el perfil olfativo del vino dando aromas
caracteriacutesticas a ldquoestablordquo ldquocuerordquo ldquosudor de caballordquo o ldquobarnizrdquo conocido como
ldquocaraacutecter Brettrdquo
Esta contaminacioacuten se da especialmente en los vinos tintos debido a sus
caracteriacutesticas de produccioacuten (fermentacioacuten crianza antildeejamiento) y sus
propiedades fisicoquiacutemicas (Grado alcohoacutelico pH Acidez total Acidez volaacutetil
entre otros)
En Croacia existe una gran produccioacuten de vinos tintos entre los cuales se
encuentra el vino tinto Babic proveniente de la isla de Hvar el cual es famoso por
ser un vino duro carnoso estructurado y casi sobre-maduro con un grado
alcohoacutelico que ronda los 15 vv siendo la primera denominacioacuten de origen que
se aproboacute en Croacia en el antildeo 1961 este vino es de gran importancia en la
regioacuten la mayoriacutea de sitios de elaboracioacuten son pequentildeas industrias que han sido
afectadas por el bdquocaraacutecter Brett‟ Muchas investigaciones se han realizado al
respecto de la levadura BrettanomycesDekkera pero se conoce muy poco sobre
sus efectos en el vino Babic debido a sus caracteriacutesticas particulares (alcohol
30
15 pH 35 Acidez total 520 gr Acido TartaricoL Acidez volaacutetil 08 gr Acido
AceticoL Azucar residual 47 grLt)45
La dificultad de la pequentildea industria para acceder a productos que lleven a la
identificacioacuten de la levadura mencionada y de esta manera conllevar a planes de
accioacuten contra el ldquocaraacutecter Brettrdquo es una de las grandes dificultades de la industria
vinera en este paiacutes en donde los productos para la industria enoacuteloga son
complicados y de alto precio para acceder a ellos y en consecuencia no se
realizan muchas de estas pruebas de deteccioacuten de BrettanomycesDekkera
llevando al mercado productos contaminados de baja calidad que inicialmente
podriacutea haber sido un vino de alta calidad debido a sus caracteriacutesticas uacutenicas y de
gran popularidad
45
Datos obtenidos en el laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
31
3 JUSTIFICACION
Actualmente Croacia cuenta con maacutes de 300 zonas vineras en las que se producen 67
de vino blanco 32 vino tinto y el restante 1 vino rosado De acuerdo a recientes datos
estadiacutesticos hay 650 km2 de vintildeedos en Croacia de los cuales 375 km2 son uvas con
indicacioacuten geograacutefica de origen que producen maacutes de 300 vinos y maacutes de la mitad de este
nuacutemero son vinos elaborados en microempresas con un total de 50000000 de botellas
de vino el 8 es vino superior 70 de calidad y el 22 es vino de mesa de produccioacuten
nacional46
Croacia es un fuerte productor de vino a nivel regional con sus diferentes variedades
propias (Merlot Plavac Dingač Postup Malvazija Pošip Kujundžuša Babic) pero dicha
produccioacuten ha sido fuertemente afectada por la presencia de la levadura
BrettanomycesDekkera trayendo consecuencias como perdidas de produccioacuten peacuterdida
de calidad sensorial del vino grandes peacuterdidas econoacutemicas y desprestigio a sus vinos de
denominacioacuten de origen
Es por esto que en este proyecto de investigacioacuten se busca una faacutecil y raacutepida
identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera causante del ldquocaraacutecter Brettrdquo con el
desarrollo de medios selectivos liquido y solido ademaacutes de opciones para el tratamiento
yo prevencioacuten de esta levadura en la cadena productiva comparativamente entre dioacutexido
de azufre (SO2 ) y Antibrettreg y la identificacioacuten de los aromas caracteriacutesticos del ldquocaraacutecter
Brettrdquo en el vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia
46
Hrvatski zavod za vinogradarstvo i vinasrtvo 2003 Pravilnik o vinu httpwwwhrzvvhrpropisihtm
32
4 OBJETIVOS
41 General
Caracterizar y evaluar el comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera
en teacuterminos de crecimiento y produccioacuten de aromas no deseados en vino tinto
Babic
42 Especiacuteficos
Desarrollar el medio solido y medio liacutequido selectivo para
BrettanomycesDekkera
Evaluar el comportamiento de la levadura en estos medios selectivos
Determinar la influencia del Dioacutexido de azufre (SO2) y el compuesto
Antibrettreg en la levadura BrettanomycesDekkera presente en vino tinto
Babic 2007
Identificar los compuestos aromaacuteticos producidos por Brettanomyces
bruxellensis en vino tinto Babic usando el meacutetodo ldquomultiple headspace
solid-phase microextraction (SPME)rdquo
33
5 ALCANCES
En este proyecto se pretende desarrollar un medio selectivo faacutecil de producir en
donde sea raacutepida la identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera en la
produccioacuten de vinos tintos se realizaran pruebas para corroborar el crecimiento de
esta levadura en el medio determinando el tiempo que esta levadura toma en
adaptarse en el medio y su comportamiento en este una vez comprobada su
adaptacioacuten al medio liquido se trabajara con el meacutetodo de cromatografiacutea de gas
(GC) y el uso de micro extraccioacuten en fase solida (SPME) para el anaacutelisis
cuantitativo de los compuestos volaacutetiles (4-etil-fenol 4-etil-guayacol4-vinilfenol y
4-vinil-guayacol) y posteriormente con el vino tinto Babic Ademaacutes se desea
comprobar la efectividad de los productos con que las vineras de Croacia inhiben
o eliminan la presencia de la levadura en los vinos tintos como lo son el producto
AntiBrettreg y el Dioacutexido de azufre (SO2)
34
6 ESTADO DEL ARTE
Sobre el campo problemico causado por la levadura BrettanomycesDekkera en la
industria viniacutecola se han realizado bastante investigaciones a nivel de
caracterizacioacuten de la levadura los factores fisicoquiacutemicos que favorecen el
crecimiento de la levadura meacutetodos de prevencioacuten y control evaluacioacuten de
dantildeos sensoriales en diferentes tipos de vinos formacioacuten de compuestos fenoacutelicos
en los diferentes tipos de vino otros compuestos no fenoacutelicos asociados al
ldquocaraacutecter Brettrdquo teacutecnicas de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera
evaluacioacuten de la teacutecnicas de control e inhibicioacuten de dicha levadura desarrollo de
nuevos medios de deteccioacuten y aislamiento de la levadura relacioacuten entre la
levadura BrettanomycesDekkera con las otras levaduras presentes en el vino
entre otros
Seguacuten estas investigaciones se analizan aquellas que pueden aportar datos
importantes para el desarrollo del trabajo que se quiere realizar y se tiene en
cuenta sus metodologiacuteas conclusiones recomendaciones y comentarios
Entre las importantes para el planteamiento de este trabajo se menciona el trabajo
realizado por la Universidad Politeacutecnica de Madrid Espantildea el cual analiza
algunas de las caracteriacutesticas maacutes relevantes de este geacutenero de levaduras su
crecimiento en bodega factores fisicoquiacutemicos que favorecen su crecimiento y
desarrollo en el vino los defectos sensoriales que presenta en los vinos y estudia
algunas de los meacutetodos fiacutesicos para el control de BrettanomycesDekkera en vino
35
(clarificacioacuten filtracioacuten amicrobica proteiacutenas clarificantes anhiacutedrido sulfuros
dimetil dicarbonato Aditivos)47
Para conocer maacutes sobre la levadura en condiciones de barrica y almacenamiento
se revisa el articulo elaborado en el Departamento Teacutecnico Guserbiot La rioja
Espantildea en este artiacuteculo se describe brevemente su metabolismo y su ecologiacutea en
las bodegas Igualmente se comparan las teacutecnicas utilizadas en los laboratorios
para su deteccioacuten y cuaacuteles son las limitaciones de los diferentes meacutetodos
Finalmente se analizan las estrategias desarrolladas para su eliminacioacuten de las
bodegas y se dan una serie de recomendaciones para su control48
El instituto de fermentaciones Industriales Consejo superior de investigaciones
cientiacuteficas Juan de Cierva Madrid Espantildea en el cual se revisa la formacioacuten de
etilfenoles (4 etil-fenol 4 etil guayacol) en vinos tintos anejos Los factores
fisicoquiacutemicos que favorecen el crecimiento de la levadura no deseada
BrettanomycesDekkera las teacutecnicas usadas para la detectar la presencia de esta
levadura en vinos ( Revisioacuten microscoacutepica fluorescente remocioacuten de aacutecidos
grasos de su membrana teacutecnicas moleculares como PCR y electroforesis) y de
control (Proteiacutenas fining Fining con gelatina liquida filtracioacuten variables
fisicoquiacutemicas adicioacuten de aditivos procedimientos de altas presiones
manipulacioacuten geneacutetica) con esta investigacioacuten se concluye que la combinacioacuten y el
uso de las numerosas teacutecnicas pueden ayudar a la prevencioacuten y reduccioacuten de la
levadura BrettanomycesDekkera 49 Este trabajo muestra las muacuteltiples opciones
47
A Morata S Benito F Palomero F Calderoacuten y J A Suaacuterez-Lepe Ecologiacutea y prevencioacuten de
BrettanomycesDekkera durante la elaboracioacuten y crianza de vinos tintos Revista enoacutelogos (Editada por la
Federacioacuten Espantildeola de Asociaciones de Enoacutelogos y Periodistas Asociados) No 50 paacuteg 1-12 Madrid Espantildea
48 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 20-
24 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
49 R Suarez JA Suarez-Lepe A Morata F Calderon 2006 The production of ethyl phenols in wine by yeasts
of the genera Brettanomyces and Dekkera A review Journal Food Chemistry No 102 pag 10-21 Madrid
Espantildea
36
existentes en el control y prevencioacuten de la levadura mencionada sin embargo deja
claro que la mayoriacutea de estas opciones son costosas y no de faacutecil adquisicioacuten para
una pequentildea industria
El anaacutelisis sensorial ha sido de los aspectos maacutes estudiados al respecto de
BrettanomycesDekkera una de estas investigaciones fue realizada en Centre
Europeacuteen des Sciences du Goucirct en Talence Francia en el cual se evaluaron 50
vinos bordeaux sensorialmente para demostrar la complejidad del ldquoCaraacutecter Brett‟‟
al cual se unen otros compuestos aromaacuteticos ademaacutes de los fenoacutelicos como acido
isobutirico e isovalerico en este tipo de vino debido a sus caracteriacutesticas
fisicoquiacutemicas50
De los meacutetodos de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera los medios
selectivos son muy populares es por esto que el Laboratorio de Microbiologiacutea
Departamento de Botanica e Engenharia Biologica Instituto Superior de
Agronomia Lisboa Portugal realizo un trabajo en el cual se pretendia desarrollar
un medio selectivo o diferencial capaz de aislar la levadura
BrettanomycesDekkera del vino y de la cadena productiva del vino con el fin de
detreminar la relacioacuten entre esta levadura y los compuestos 4-etilfenol y 4 etil-
guayacol51 otro estudio realizado para la deteccioacuten de dicha levadura fue
realizado en la Escola Superior de Biotecnologiacutea Universidade Catoacutelica
Portuguesa el desarrollo de un simple procedimiento compatible con las rutinas
50 Andrea Romano a Marie Claire Perello a Aline Lonvaud-Funel Gilles Sicard Gilles de Revel2008 Sensory
and analytical re-evaluation of lsquolsquoBrett characterrdquo Journal Food Chemestry No 114 pag 15-19 Talence
France
51 N Rodrigues G Gonccedilalves S Pereira-da-Silva M Malfeito-Ferreira and V Loureiro2001 Development
and use of a new medium to detect yeasts of the genera DekkeraBrettanomyces Journal of applied microbiology No 90 pag 588-599Lisboa Portugal
37
usadas en las vineras para la deteccioacuten de BrettanomycesDekkera en vino y en
maquinarias52
En el laboratorio de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas Alcohoacutelicas de la
Universidad de Zagreb se ha trabajado anteriormente en el desarrollo de medio
solido selectivo con pruebas de diferentes concentraciones de los compuestos
como resultados se encuentra una buen relacioacuten entre las concentraciones de los
compuestos sin embargo como recomendaciones se encuentran la falta de
antibioacutetico para evitar contaminacioacuten por bacterias probar con diferentes fuentes
de carbono para comparacioacuten de tiempo de crecimiento positivo y un monitoreo
diario en el medio53
Los compuestos aromaacuteticos que libera la presencia de BrettanomycesDekkera
estaacute asociada a los compuestos 4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinilfenol y 4
viniguayacol a partir de esto los centros de investigacioacuten han hondado en la
identificacioacuten de dichos compuestos relacionados en la enologiacutea y especialmente
con BrettanomycesDekkera a partir de eso el Departamento de Quiacutemica
Universidad de La Rioja Espantildea este estudio presenta un meacutetodo basado en el
uso de Cromatografiacutea de Gas y micro extraccioacuten en fase solida para el anaacutelisis
cuantitativo de 4-etilfenol 4-etil guayacol 4-vinilfenol 4-vinilguayacol
Demostrando la existencia de un efecto matriz en el anaacutelisis de compuestos
responsables del ldquocaraacutecter Brettrdquo en vino Este nuevo meacutetodo fue
satisfactoriamente aplicado a cierto nuacutemero de vinos tintos comerciales vinos
52
JA Couto A Barbosa and T Hogg 2005 A simple cultural method for the presumptive detection of the yeasts BrettanomycesDekkera in wines Letters in Applied Microbiology No 41 pag 505-510 Porto
Portugal
53 Serkovic Dubravka Gracin Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac
Brettanomyces bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet pag 1-117 ZagrebCroatia
38
blancos y roseacute Este meacutetodo puede ser una alternativa para evitar el efecto matriz
en muestras de vino54
De acuerdo con este tema en la jornada cientiacutefica del 99 el grupo de investigacioacuten
enoloacutegica se estudio la formacioacuten de sustancias volaacutetiles por 13 cepas de S
cerevisiae con buenas aptitudes enoloacutegicas inoculadas individualmente en un
mosto homogeacuteneo de la variedad airen fermentado en las mismas condiciones
de aireacioacuten y a temperatura controlada55
54
C Pizarro N Perez-del-Notario JM Gonzalez-Saiz 2007 Determination of Brett character responsible
compounds in wines by using multiple headspace solid-phase micro extraction Journal of Chromatography
No 1143 pag 176-181 La Rioja Espantildea
55 E Pueyo P Hidalgo K Fernaacutendez y P Martiacuten-Aacutelvarez 1999 Anaacutelisis de compuestos volaacutetiles en vinos
obtenidos con distintas cepas de Saccharomyces cerevisiae Aplicacioacuten de la teacutecnica de microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientificas 99 Grupos de Investigacion Enologica Zaragoza Espana
39
7 MATERIALES Y METODOS
A continuacioacuten se presentan materiales y meacutetodos para la investigacioacuten
Este proyecto fue realizado en su gran mayoriacutea en las instalaciones de la
Universidad de Zagreb en la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos
(PBF) Laboratorios del Departamento de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas
Alcohoacutelicas ubicado en la ciudad de Zagreb Croacia
Los anaacutelisis fisicoquiacutemicos del vino tinto Babic fueron realizados en los
laboratorios de VINOLAB ubicado en Zagreb Croacia
71 MEDIO SOLIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera
711 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Autoclave de laboratorio
Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa Etanol peptona extracto de levadura
agar cicloheximida acido cumaacuterico ampicilina)
Balanza electroacutenica de precisioacuten
Microscopio oacuteptico
712 Metodologiacutea
Basados en estudios anteriores realizados en el laboratorio para el desarrollo de
medio solido selectivo para BrettanomycesDekkera (Serkovic Dubravka Gracin
40
Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac Brettanomyces
bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet Universidad de Zagreb pag 1-
117 Zagreb Croacia) se evaluaron las recomendaciones mencionadas en dicha
investigacioacuten para la mejoriacutea y desarrollo de otros medios soacutelidos selectivos
Se usoacute como base el medio YPD (Yeast Peptone Dextrose) el cual estaacute
compuesto de la siguiente forma 20gL peptona 10 gl extracto de levadura 20 gl
de agar56 este medio es selectivo para levaduras pero no es selectivo entre ellas
Es necesario el uso de una fuente de carbono para la levadura
BrettanomycesDekkera de acuerdo a la teoriacutea y revisando la tabla 1 (Relacioacuten de
los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) y seguacuten
facilidades de disponibilidad en el laboratorio se utiliza glucosa la cual es
utilizable por entre 75-100 de las cepas de BrettanomycesDekkera seguacuten la
tabla mencionada anteriormente
Esta fuente de carbono (Glucosa) fue probada en una concentracioacuten de 20 gL
Cicloheximida fue probada a 30 mgL para inhibir Saccharomyces en el medio y
darle mayor selectividad para Brettanomyces Dekkera Se antildeade acido p-
cumarico en una concentracioacuten de 100 mgL como precursor para la formacioacuten
del compuesto 4 etilfenol caracteriacutestico de la levadura BrettanomycesDekkera
Para inhibir bacterias en el medio se usa ampicilina a 10 mgL esta se agrega
despueacutes de realizada la esterilizacioacuten y cuando la temperatura del medio este
igual o menor a 40C El pH del medio se ajusto a 5
Paralelamente se crea el medio con Etanol como fuente de carbono en una
concentracioacuten de 6 o 60 mlL con la misma concentracioacuten de los otros
compuesto como cicloheximida 30mgL acido cumarico 100mgL 20 gL peptona
10 gL de extracto de levadura 16gL de agar Este medio se crea como
56
Concentraciones preestablecidas en el laboratorio de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas alcoholicas
41
comparativo para determinar cual fuente de carbono es la maacutes utilizada por la
levadura Brettanomyces bruxellensis para su reproduccioacuten Seguacuten la teoriacutea (ver
tabla 1) el etanol es utilizado por entre 25-75 de las cepas de
BrettanomycesDekkera pero es el azuacutecar que se encuentra en mayor
concentracioacuten presente en los vinos tintos aproximadamente 130 gl57
Estos medios fueron debidamente esterilizados para eliminar cualquier
microorganismo o espora presente en este Este procedimiento se realizo por el
meacutetodo de combinacioacuten de altas temperatura y presioacuten (Autoclave 121 C a 1034
kPa)
Se usaron colonias de BrettanomycesDekkera aisladas anteriormente de vinos
contaminados y guardas para investigaciones en el Departamento de Tecnologiacutea y
Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos
Universidad de Zagreb Croacia
Los medios fueron monitoreados visualmente todos los diacuteas y se toman
observaciones de macroscoacutepicas y microscoacutepicas Se comparan estos dos medios
en teacuterminos de rapidez de crecimiento de la levadura y selectividad Estas
muestras fueron incubadas a 28C por 10 diacuteas
La prueba fue realizada por duplicado en diferentes tiempos
57
Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
42
72 MEDIO LIacuteQUIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera
721 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Frascos de vidrio esteacuteriles
Autoclave de laboratorio
Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa peptona extracto de levadura
cicloheximida acido cumarico ampicilina etanol)
Microscopio oacuteptico
Balanza electroacutenica de precisioacuten
722 Metodologiacutea
En el mercado para enologiacutea existen medio liacutequidos selectivos para la deteccioacuten
de BrettanomycesDekkera en vinos sin embargo estos son de difiacutecil accesibilidad
por sus elevados precios es por esto que se desarrolla un medio liquido selectivo
para dicha levadura en el laboratorio del Departmaneto de Tecnologiacutea y Anaacutelisis
de Bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia
Para este medio se toma como base el medio selectivo con Glucosa como fuente
carbono desarrollado anteriormente sin usar agar para mantener el medio en su
estado liquido
43
La composicioacuten de este medio liacutequido es la siguiente
20 gL Glucosa
20 gL peptona
10gL extracto de levadura
30mgL de cicloheximida
100mgL acido p-cumarico
10 mgL ampicilina
Estos compuestos fueron medidos en una balanza electroacutenica de precisioacuten se
antildeade 250 ml de agua destilada y se mezcla constantemente se pasa a proceso
de esterilizacioacuten en autoclave a 120C y 1034 KPa por 45 minutos
De esta forma se asegura la usencia de microorganismos yo esporas en el
medio Despueacutes de bajar la Temperatura a 40C se agrega a la mezcla ampicilina
en una concentracioacuten de 10mgL
En frascos de vidrio esteacuteril se agrega 40 ml de medio liacutequido y diferentes
cantidades iniciales de levaduras BrettanomycesDekkera fueron inoculadas al
respectivo medio el primer frasco tiene una cantidad de 106 ceacutelulasml el segundo
tiene 104 ceacutelulasml el tercero tiene 102 celulasml y el cuarto con una cantidad
aproximada de 25 ceacutelulasml Estas cantidades estaacuten basadas en estudios
anteriores para medios liacutequidos selectivos en levaduras58
58 J Ungar A M James P W Muggleton H F Pegler y E G Tomich1950 The Cultivation of
Haemophilus pertussis in Partially Defined Liquid Media Journal of General Microbiology No 4
pag 345-359 Greenford
44
Este medio liacutequido inoculado fue inspeccionado diariamente visualmente revisioacuten
de turbidez microscoacutepicamente y olfativamente para deteccioacuten de olores del
ldquocaraacutecter Brettrdquo
Los diacuteas fueron contabilizados para determinar resultados positivos en estos
ensayos
73 INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN
VINO TINTO DE LA REGION DE DALMACIA CROACIA
731 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Medio selectivo solido para BretanomycesDekkera
Medio selectivo Liquido para BrettanomycesDekkera
Quiacutemicos de laboratorio (Dioxido de Azufre (SO2) Antibrettreg Glucosa)
Vino Babic 2007
Anallizador infrarojo Bacchius II microdom
732 Metodologiacutea
Con los medios desarrollados (solido y liquido) se quiere conocer el efecto del
dioacutexido de azufre (SO2) y el producto Antibrettreg en la levadura
BrettanomycesDekkera presente en el vino tinto de la regioacuten de Dalmacia
Con las herramientas que se tienen en el laboratorio del departamento de
tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia se quiere
determinar la influencia de estos productos en la levadura BrettanomycesDekkera
presente en vino tinto croata de la regioacuten de Dalmacia Babic
45
El primer paso es adaptar la levadura al vino tinto croata (Babic) para esto se
inoculan 20 colonias de BrettanomycesDekkera en 500 ml de vino se antildeadioacute
glucosa en una concentracioacuten de 2gL y se oxigena la mezcla Para este paso de
adaptacioacuten se dejan las muestras de 1 a 2 diacuteas a temperatura ambiente (20C)
Despueacutes de este periodo se revisa microscoacutepicamente la presencia positiva de
BrettanomycesDekkera en los 500 ml de vino en los que se estaba haciendo el
paso de adaptacioacuten en Babic al comprobar su presencia positiva se procede a
mezclar los 500 ml de vino contaminado con BrettanomycesDekkera con los 3
Litros de vino Babic que se disponen para esta prueba
Estos 3 litros de vino tinto Babic contaminado con la levadura
BrettanomycesDekkera se reparten en 8 frascos de vidrios esteacuteriles al siguiente
diacutea se toman dos frascos para agregar cada uno de los compuestos a evaluar
(SO2 y Antibrettreg)
Para SO2 se toman dos frascos uno de 600ml y uno de 100ml se agrega una
concentracioacuten de 40 mgl
Para el producto AntiBrettreg se toman cuatro frascos dos de 600 ml y dos de 100
ml seguacuten especificaciones del producto y la alta poblacioacuten de
BrettanomycesDekkera en las muestras se adiciono la maacutexima concentracioacuten de
AntiBrettreg a las muestras la cual fue de 40 gHl
Estas muestras se dejaron a temperatura ambiente simulando condiciones de
almacenamiento del vino en barricas temperatura aproximada de 20C evitando el
contacto con la luz solar y evitando movimientos fuertes Esto se mantuvo por 15
diacuteas que fue el tiempo de duracioacuten del experimento
Con el vino restante se mantuvo en las mismas condiciones de almacenamiento
de los demaacutes para hacer un paralelo de comparacioacuten
Previamente se analizaron las caracteriacutesticas del vino sin contaminar por medio
del analizador infrarrojo Bacchus II microdom antes de agregar los compuestos
46
SO2 y AntiBrettreg y despueacutes se volvioacute a realizar el anaacutelisis para determinar los
efectos de estos compuestos en el vino y asiacute mismo al de control
74 DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN
EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO
MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE
741 Materiales
Cromatografo de Gas HP5890 Serie II
Microextractor de fase solida (SPME)
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Quiacutemicos de laboratorio (p-cresolAcetaldehido Propanol diacetil etil-
acetato i-butanol acido aceacutetico i-amil-alcohol n-amil lactato de etilo
acetato amil metiacutelico 1-hexanol etil-hexanol linalol nerol citronelol
geraniol 2-feniletanol octanoato de etilo 4-etilfenol 2-feniletil acetato 4-
etilguaiacol)
Vino Tinto Babic
Agua destilada
742 Metodologiacutea
El meacutetodo fue desarrollado anteriormente en el Departamento de Tecnologiacutea y
Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos de
la Universidad de Zagreb Croacia Y despueacutes de modificaciones fue utilizado en el
desarrollo del trabajo El meacutetodo utilizado es descrito a continuacioacuten
47
Cromatografo de gas HP 5890 SERIES II
Programa HP-chem
a) Condiciones para analisis SPME-GC
Muestra diluida 5050 con adicion de estandar interno (p-cresol1mgl)
25ml de la muestra diluida con mezcla continua a temperatura ambiente
Tiempo de adsorcion 30 minutos
SPME es colocado en la muestra para la adsorcion durante el tiempo
previsto
b) Condiciones para el Cromatografo de gas (GC)
La columna usada en este experimento es RTXreg-5 (Restec USA sn 210627)
30m id=025mm 025μm
Gas portador Nitrogeno
Flujo del Nitrogeno 5 mlmin
Temperatura del inyector 240 C
Temperatura del detector 250 C
Temperaturas programadas 35 C5 min 150 C 34 Cmin 180 C
10Cmin 190 C 5 Cmin
Se conocen los resultados del cromatografiacutea de gases (ver tabla 10) y se hacen
necesarias varias correcciones del meacutetodo y algunas pruebas con unos
compuestos para determinar realmente su tiempo de retencioacuten en este tipo de
vino Se deben comprobar tiempos de retencioacuten
48
8 DISCUSIOacuteN Y RESULTADOS
81 RESULTADOS PARA EL DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO
Tabla 2 Medio Selectivo con Glucosa como fuente de carbono para
BrettanomycesDekkera en incubacioacuten por 5 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten
microscoacutepica
1 Negativo Negativo - No se realiza
2 Negativo Negativo - Presencia de levaduras
3 Negativo Negativo - Presencia de
Levaduras
4 Aparicioacuten de
algunas colonias
Negativo Transparente Presencia de levaduras
5 Colonias definidas Positivo-
Fenoles
Amarillo Presencia positiva de
BrettanomycesDekkera
49
Este medio tiene alto grado de selectividad para levaduras con un tiempo de
crecimiento de aproximadamente 5 diacuteas en 28C lo que lo hace raacutepido gracias al
antibioacutetico (ampicilina) que hace parte de la composicioacuten del medio no hay
presencia de bacterias Se hace confiable para resultados positivos de levaduras
BrettanomycesDekkera debido a que las levaduras Saccharomyces fueron
inhibidas con el compuesto cicloheximida su selectividad fue comprobada por
revisioacuten microscoacutepica macroscoacutepica y sensorial
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con glucosa como fuente de carboacuten son las
siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
50
Tabla 3 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono para Brettanomyces Dekkera en
incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica
1 Ninguno Negativo - -
2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras y
bacterias
9 Diminutas
colonias
transparentes
Negativo Transparentes Presencia de levaduras y
algunas bacterias
10 Positivo Positivo-
Fenoacutelicos
Amarillo Presencia de levaduras
BrettanomycesDekkera y
bacterias
El medio selectivo para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de
carbono tambieacuten es selectiva entre levaduras ya que solo se identifico la levadura
BrettanomycesDekkera en este sin embargo se evidencia una presencia de otro
microorganismo presuntamente bacteria ya que este medio no contiene agente
antibacteriano (ampicilina) Es necesaria la adicioacuten de ampicilina en una
concentracioacuten de 10mgl para inhibir la presencia de bacterias
Este medio presenta un tiempo maacutes prolongado para mostrar crecimiento de la
levadura BrettanomycesDekkera aproximadamente 10 diacuteas
51
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las
presentadas en el medio selectivo con glucosa como fuente de carbono y son las
siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
52
Tabla 4 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono y adicioacuten de ampicilina para
Brettanomyces Dekkera en incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica
1 Ninguno Negativo - -
2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
9 Diminutas
colonias
transparentes
Negativo Transparentes Presencia de levaduras
10 Positivo Positivo-
Fenoacutelicos
Amarillo Presencia de levaduras
BrettanomycesDekkera
El efecto de la ampicilina sobre el medio selectivo con etanol como fuente de
carbono fue el esperado inhibioacute completamente el crecimiento de colonias
bacterianas en el medio el tiempo de crecimiento de la levadura y presencia de
aromas fenoacutelicos fue el mismo de 10 diacuteas en incubacioacuten de 28C
53
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las
presentadas anteriormente y son las siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
82 RESULTADOS PRUEBAS MEDIO LIQUIDO
Tabla 5 Influencia de la concentracioacuten de levaduras BrettanomycesDekkera en el
tiempo necesario para detectar la produccioacuten de 4-etil-fenol en medio liquido
Nuacutemero de ceacutelulas ml
(concentracioacuten final)
Tiempo necesario para obtener resultados
positivos (diacuteas)
1 Experimento
32x106 le 3
3 X 104 3
33x102 7
40 No detectado
2 Experimento
43x106 le3
39x104 le3
37x102 8
62 No detectado
54
El nuacutemero de ceacutelulas de levadura de BrettanomycesDekkera fue contabilizado
usando contador de ceacutelulas Chamber
Los aromas fenoacutelicos son difiacuteciles de detectar debido al fuerte olor que tiene el
medio liquido caracteriacutestico de sus componentes esto dificulta la identificacioacuten del
ldquocaraacutecter Brettrdquo en especial cuando las concentraciones de
BrettanomycesDekkera no son elevadas Ademaacutes de los olores fenoacutelicos otros
compuestos volaacutetiles se detectan tales como acido aceacutetico y olores oxidativos
tambieacuten producido por la levadura BrettanomycesDekkera
En la inspeccioacuten visual se detecta alta turbidez en el medio Se compara con un
medio sin presencia de BrettanomycesDekkera
En las muestras con mayor concentracioacuten de la levadura es maacutes notoria la
turbidez Despueacutes de 3 diacuteas se presenta un precipitado blanco en todas las
muestras de altas concentraciones
La revisioacuten microbioloacutegica se realiza diariamente para determinar el nuacutemero de
ceacutelulas y la presencia positiva de la levadura a evaluar
Entre los dos experimentos realizados con el medio liquido el tiempo que se
demoro en detectar compuestos fenoacutelicos fue muy similar entre ellos
dependiendo del nuacutemero de ceacutelulas en el medio en mayores concentraciones el
tiempo de deteccioacuten fue menor
Hay que sentildealar que BrettanomycesDekkera debe alcanzar una concentracioacuten
miacutenima (denominada poblacioacuten criacutetica) de 103 UFCml para comenzar a liberar etil
fenoles Por debajo de esta concentracioacuten la levadura seriacutea metaboacutelicamente
activa pero no produciraacute compuestos alterantes a niveles detectables esto se ve
reflejado en los resultados en los que las concentraciones de ceacutelulas son muy
bajas
55
Estos resultados se comparan con los resultados dados en el medio solido Los
dos medios muestran altos grados de selectividad hacia la levadura
BrettanomycesDekkera y similar comportamiento para el crecimiento de dicha
levadura
En el medio liacutequido cuando hay altas concentraciones de BrettanomycesDekkera
el tiempo de deteccioacuten del microorganismo es menor que con el medio solido pues
en el liacutequido es aproximadamente 3 diacuteas y en el soacutelido son 5 diacuteas
83 RESULTADOS DE LA INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE
(SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO DE LA REGION DE
DALMACIA CROACIA
El vino fue analizado antes de la adicioacuten de los compuestos quiacutemicos a evaluar y
15 diacuteas despueacutes de adicioacuten para ver la reaccioacuten de este frente a SO2 y Antibrettreg
estas caracteriacutesticas se determinaron con el equipo de laboratorio Bacchus II
Microdom localizado en el laboratorio Vinolab doo Zagreb Croacia Los
resultados se muestran en la tabla
Tabla 6 Resultados de las muestras de vino inoculados con la levadura BrettanomycesDekkera
durante 15 diacuteas Comparativos con los diferentes compuestos
CFUml
Vino Day 1 Day 4 Day 10 Day 15
Control 130E+04 800E+03 700E+03 500E+03
Control 800E+03 640E+03 700E+03 280E+03
SO2 110E+04 400E+02 400E+02 67
SO2 900E+03 380E+03 270E+03 183
Antibrett 140E+05 920E+04 140E+04 400E+03
Antibrett 210E+05 181E+05 160E+04 900E+03
Antibrett 120E+05 990E+04 120E+04 100E+03
Antibrett 230E+05 204E+05 300E+03 200E+03
56
Tabla 7 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 antes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o
Antibrettreg Diacutea 0
Alcohol
()
Acidez Total
(gr Aci
Tartaacuterico L)
Acidez volaacutetil
(Aci
AceacuteticoL)
Densidad
(grml)
Azuacutecar residual
(grl)
Extracto
seco
(grl)
Acido
Laacutectico
(grl)
Glicerol
(grl)
Taninos
(grl)
Acetato
(grl)
1473
525
083
09928
473
332
164
799
305
117
1471
522
084
09927
479
329
162
786
299
116
Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
Tabla 8 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 despueacutes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o
Antibrettreg Diacutea 15
Alcohol
()
Acidez Total
(gr Aci
Tartaacuterico L)
Acidez volaacutetil
(Aci
AceacuteticoL)
Densidad
(grml)
Azuacutecar residual
(grl)
Extrac
to seco
(grl)
Acido
Laacutectico
(grl)
Glicerol
(grl)
Taninos
(grl)
Acetatos
(grl)
Control
1414
565
107
09935
436
364
177
827
259
136
Control
1415
556
108
09936
420
365
170
824
256
137
SO2
1456 543 108 09932 476 369 167 803 281 125
SO2
1457
542 108 09933 472 370 170 804 271 124
Antibrett 1454 533 106 09933 448 371 175 813 277 125
Antibrett 1455 534 105 09933 460 372 171 809 282 124
Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
57
Figura 4 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en el vino de control para
evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas
El comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en la prueba por
duplicado en el vino de control fue muy similar pues con el tiempo esta levadura
deja de reproducirse y va muriendo cuando las condiciones ya no son aptas para
su desarrollo debido a que la mayoriacutea de su fuente de carbono (Glucosa) esta
consumida sin embargo esta levadura no llega a su desaparicioacuten total lo que
representa uno de los mayores problemas en la elaboracioacuten del vino
Esta levadura tiene un metabolismo lento y el factor tiempo es un requisito
fundamental para su desarrollo este experimento se empezoacute con una alta
poblacioacuten de BrettanomycesDekkera (130 x 104 UFCml y 8 x 103 UFCml
respectivamente) y durante el transcurso del tiempo la poblacioacuten fue disminuyendo
debido a la perdida de las condiciones necesarias para la reproduccioacuten
58
Figura 5 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de SO2 en
concentracioacuten de 40 mgl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas
El SO2 tuvo un comportamiento efectivo y raacutepido contra las colonias de
BrettanomycesDekkera La poblacioacuten de esta levadura se redujo de forma
significativa entre el diacutea primero y el cuarto se encontroacute una diferencia porcentual
de 96 en la primera prueba y del 60 en la de duplicado al diacutea 15 ya la
poblacioacuten era casi nula pasando raacutepidamente de un numero por encima de la
poblacioacuten critica de la levadura BrettanomycesDekkera a un numero lt103 UFCml
siendo muy eficaz y raacutepido en el manejo de produccioacuten
Este compuesto ademaacutes de favorecer la extraccioacuten de los compuestos fenoacutelicos y
de su actividad antioxidante al inhibir la accioacuten de las polifenoloxidasas a dosis
adecuadas de un maacuteximo de 50gl inhibe la multiplicacioacuten bacteriana y de
levaduras
59
Figura 6 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de
Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo
de 15 diacuteas
Figura 7 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de
Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo
de 15 diacuteas
El compuesto Antibrettreg en la primera prueba tanto como en el duplicado tuvo su
mayor tiempo de reduccioacuten de UFCml entre los diacuteas 4-10 con una diferencia
porcentual de 91 en comparacioacuten con el diacutea cuarto al decimo a diferencia de
60
SO2 el cual presenta la gran disminucioacuten de colonias entre los primeros diacuteas de
agregarse el producto
El tiempo para que la poblacioacuten de la levadura llegara a la cantidad menor a la de
la poblacioacuten critica es mucho mayor que la del compuesto SO2 sabiendo que esta
poblacioacuten debe ser lt103 UFCml
El compuesto Antibrettreg puede tardarse 4-10 diacuteas en representar una reduccioacuten
de UFCml significativa en dicho tiempo puede representar grandes peacuterdidas
nutricionales y altos costos de produccioacuten para la fabricacioacuten
Figura 8 Comportamiento del contenido de alcohol en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin adicioacuten)
hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
BrettanomycesDekkera estaacute presente en vinos de alto contenido alcohoacutelico
aproximadamente entre 125 a 14 pues esta levadura toma a etanol como
fuente de carbono y este vino (Babic) procede de uvas muy maduras las cuales
presentan mayor cantidad de azuacutecares residuales (como glucosa y fructosa y
otras pentosas residuales)
138
14
142
144
146
148
Alcohol
Day 0 Day 15
61
Analizando el comportamiento del vino durante el experimento de 15 diacuteas sin
compuestos quiacutemicos y con SO2 y Antibrettreg a partir de las caracteriacutesticas
iniacuteciales que se determinaron seguacuten el equipo BACCHUS analizador infrarrojo se
presenta en general una reduccioacuten del contenido alcohoacutelico de este vino pero se
ve una mayor reduccioacuten en el vino de control el cual redujo en un 394 su
contenido alcohoacutelico desde el dia 0 hasta el diacutea 15 este vino no tiene ninguacuten
compuesto contra la levadura BrettanomycesDekkera y por su elevada presencia
en los 15 diacuteas de experimento consumioacute esta cantidad de etanol
Mientras en el vino que conteniacutea SO2 tras 15 diacuteas de tratamiento se vio una
reduccioacuten de alcohol de 1 ya que este compuesto redujo la cantidad de
BrettanomycesDekkera en los primeros diacuteas de tratamiento previniendo su
reproduccioacuten y protegiendo el contenido alcohoacutelico del vino Babic 2007
En los vinos de prueba con Antibrett reg la reduccioacuten alcohoacutelica se dio en un
porcentaje de 122 un poco maacutes alta que con SO2 y mucho maacutes baja en
comparacioacuten del vino de control este compuesto tambieacuten previno la gemacioacuten de
la levadura evitando la perdida de etanol en el vino sin embargo como este
compuesto duro mas en este proceso de eliminar BrettanomycesDekkera se
produjo una mayor peacuterdida alcohoacutelica
62
Figura 9 Comportamiento del contenido de acidez volatil en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin
adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
Debido a la presencia de oxigeno en los frascos la acidez volaacutetil aumento pero no
significativamente en las muestras No hubo grandes diferencias entre las
muestras con compuestos y las de control por lo que se deduce que estos
compuestos no ayudan a evitar esta acidez Esta acidez tan alta puede dantildear la
calidad del vino de forma casi irreparable Pero el factor oxigeno es de los maacutes
controlados en la produccioacuten de vinos
la alteracioacuten del aumento de la acidez volaacutetil no estaacute relacionada con la levadura
BrettanomycesDekkera sino a la presencia de oxigeno en el almacenamiento el
oxigeno fue usado en esta prueba para promover condiciones apropiadas para el
desarrollo de la levadura
002040608
112
Acidez Volatil
Day 0 Day 15
63
Figura 10 Comportamiento del contenido de Acido Acetico en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin
adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
Brettanomyces Dekkera son productores de aacutecido aceacutetico y elevan el contenido
de los vinos anormalmente en condiciones de anaerobiosis En condiciones de
aerobiosis producen concentraciones bajas o nulas de aacutecido aceacutetico
Este acido aceacutetico al igual que los fenoles afecta el sabor y el perfil olfativo del
vino tinto este efecto es tambieacuten producido por la levadura
BrettanomycesDekkera vemos en los resultados el gran crecimiento de este
compuesto en el vino control el cual no tenia compouestos en contra de
BrettanomycesDekkera lo que produjo este aumento significativo del acido aceacutetico
en comparacioacuten con estos que teniacutean SO2 y Antibrettreg entre ellos la diferencia en
este compuesto es muy reducida y no significativa pues estos compuestos no
permitieron la gemacioacuten de esta levadura y esta no produjo este acido en esa gran
cantidad
A este compuesto se le atribuye el olor y sabor a vinagre del vino tinto un defecto
muy comuacuten y poco agradable para el consumidor
105110115120125130135140
Acido Acetico
Day 0 Day 15
64
Figura 11 Comportamiento del contenido de Azucares reductores en vino Babic 2007
desde el diacutea 0 (sin adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en
comparacioacuten con el vino de control
BrettanomyesDekkera utiliza los azucares residuales como fuente de carbono
para su crecimiento en el vino este es el factor maacutes importante para su desarrollo
y este es el que determina en cierto caso la cantidad de levaduras de
BretanomycesDekkera presente en las graficas se determina claramente que en
el vino de control donde la cantidad de esta levadura es muy alta 15 diacuteas despueacutes
de empezar las pruebas la cantidad de azucares reductores es muy baja y ha
bajado en un porcentaje de 10 mientras que el vino que tiene SO2 bajo la
cantidad de azucares reductores en un 042 y el vino que tiene el compuesto
Antibrettreg redujo su nivel de azucares reductores en 462
38
4
42
44
46
48
5
Azucares Reductores
Day 0 Day 15
65
84 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE
CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON
EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID
PHASE
Tabla 10 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en
vino Babic 2007 con el meacutetodo propuesto
Compuesto Tiempos de
retencioacuten (min)
Acetaldehiacutedo 1437
Propanol 3759
Diacetil 4202
Etil-acetato 4523
i-butanol 6232
Acido Aceacutetico 7840
i-amil alcohol 11740
n-amil 13489
lactato de etiacutelico 15741
acetato amil metiacutelico 17796
1-hexanol 19101
etil-hexanol 24456
Linalol 30370
2-feniletanol 32768
p-cresol 33522
octanoato de etilo 34226
4-etilfenol 37100
2-feniletil acetato 32769
4-etilguayacol 39704
4 vinilfenol 40529
decanoato de etilo 42117
Refirieacutendose a estos resultados es necesaria la creacioacuten de soluciones estaacutendar
para determinar tiempos de retencioacuten con el meacutetodo y si es necesario ajustes a
este
66
Tabla 11 Soluciones estaacutendar para compuestos en vinos tintos Croatas
MODEL 0
(en volumen de 100 ml en 40 Etanol)
Compuesto Pureza Cantidad
(g)
Concentracioacuten (gl)
Acetaldehiacutedo 099 1623 160677
Propanol 0995 13849 137718
Diacetil 098 01071 104958
Etil-acetato 0995 30172 3002114
i-butanol 099 15016 1486584
Acido Acetico 0995 0 0
i-amil alcohol 099 20116 1991484
n-amil 098 15442 1513316
lactato de etilio 098 00507 049686
acetato amil metilico 098 01028 100744
1-hexanol 098 00367 035966
etil-hexanol 098 00308 029876
Linalol 097 00288 027936
Nerol 097 00311 030478
Citronelol 098 0031 03038
Geraniol 098 15803 1548694
2-feniletanol 098 00402 039396
4-etilfenol 098 00812 078764
octanoato de etilo 097 00597 059103
2-feniletil acetato 099 00315 031185
4-etilguayacol 098 00803 079674
Fuente Laboratorio de anaacutelisis e investigacioacuten de bebidas Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea
de Alimentos Universidad de Zagreb Zagreb Croacia 2009
Las soluciones estaacutendar se realizan teniendo como referencia las cantidades de
estos compuestos en los vinos tintos croatas datos suministrados por el Doctor
Leo Gracin en concentraciones de gl a partir de este dato y teniendo en cuenta
67
la pureza de los compuestos que se teniacutean en el laboratorio de anaacutelisis e
investigacioacuten de bebidas se crean las soluciones estaacutendar Ejemplo
Solucioacuten estaacutendar para 4 etil-fenol en un volumen de 100 ml
Con estas soluciones estaacutendar se realizo el tiempo de retencioacuten para corroborar el
meacutetodo Los resultados de esto fueron tiempos de retencioacuten diferentes a los del
meacutetodo primero con el que se realizaron los ensayos y a partir de esos resultados
se ajusto el meacutetodo con el que se trabajo
68
Tabla 12 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en
vino Babic 2007 con el meacutetodo modificado
Compuesto Tiempos de
retencioacuten (min)
Acetaldehiacutedo 1542
Propanol 4046
Diacetil 4733
Etil-acetato 4807
i-butanol 6659
Acido Acetico 8343
i-amil alcohol 12123
n-amil 13866
lactato de etilio 16072
acetato amil metilico 18336
1-hexanol 19447
etil-hexanol 24835
Linalol 31831
2-feniletanol 33305
p-cresol 33703
octanoato de etilo 34571
4-etilfenol 37724
Citronelol 38326
Nerol 38576
2-feniletil acetato 39012
Geraniol 39944
4-etilguayacol 40271
4 vilifenol 41168
decanoato de etilo 42657
69
DIA 0
Se coloca ISTD a todas las muestras respectivas para poder determinar
cantidades de los compuestos aromaacuteticos
Se realiza la cromatografiacutea de gas al vino Babic 2007 antes de ser inoculado con
BrettanomycesDekkera
Tabla 13 Resultados de la cromatografiacutea de gas del vino Babic 2007
Compuesto Tiempo de retencioacuten
min
Cantidad
mgl
Acetaldehiacutedo 1542 0
Propanol 4046 0
Diacetil 4733 37215204
Etil-acetato 4807 0
i-butanol 6659 0
Acido Aceacutetico 8343 2817465
i-amil alcohol 12123 16799019
n-amil 13866 26
lactato de etiacutelico 16072 10983961
acetato amil metiacutelico 18336 0185196
1-hexanol 19447 264655
etil-hexanol 24835 0158751
Linalol 31831 0
2-feniletanol 33305 4235560
p-cresol 33703 1
octanoato de etilo 34571 0152412
4-etilfenol 37724 00581345
Citronelol 38326 00439729
Nerol 38576 00344799
2-feniletil acetato 39012 00407983
Geraniol 39944 0
4-etilguayacol 40271 0
4 vilifenol 41168 0
Decanoato de etilo 42657 00190144
70
Basados en los compuestos aromaacuteticos que brinda el ldquoCaraacutecter Brettrdquo se van a
analizar detalladamente los siguientes aromas 4-Etilfenol 4-Etilguayacol 4-
Vinylfenol
Figura 12 Compuestos aromaticos en vino tinto Babic sin estar contaminado con la levadura
BrettanomycesDekkera
El vino a analizar esta por debajo de las concentraciones consideradas como
perjudiciales para el aroma del vino tinto (El umbral sensorial del 4-etilfenol es de
230 μgl y el del 4-etilguaiacol es de 47 μgl) pues posee una concentracion de
58microgL de 4etilfenol 0 microgL de 4 etilguayacol y 0 microgL de vinylfenol
841 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGUacuteN TEMPERATURAS
DE ALMACENAMIENTO
0
02
4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinylfenol
Vino 00581345 0 0
C (
mg
L)
Vino Babic 2007 Dia 0
71
Tabla 14 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el
ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 20C por 4 diacuteas Prueba por duplicado
MUESTRAS INCUBADA A 20C
Compuesto Day 1
Amount
(mgL)
Day 2
Amount
(mgL)
Day 3
Amount
(mgL)
Day 4
Amount
(mgL)
4-etilfenol 0260244 017294 0177547 020156
4-etilfenol 0260244 0245915 0204542 0262499
4-etilguayacol 0 0 0 0
4-etilguayacol 0 0 0 0
4 vinilifenol 1107096 781349 685317 460323
4 vinilifenol 1107096 1297465 621324 693225
72
Figura 13 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
BrettanomycesDekkera es la levadura responsable de la produccion de 4-etil-
fenol compuesto asociado con olores caracteristicos a ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 00581345 0260244 0172935 0177547 020156
C (
mg
L)
4 etilfenol
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 00581345 0260244 0245915 0204542 0262499
C (
mg
L)
4 etilfenol
73
caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo dantildeando la calidad sensorial del vino tinto Babic la
produccioacuten de este compuesto en esta muestra realizada por duplicado fue
ascendente y tuvo incremento muy grande en el primer dia de almacenamiento y
en el transcurso de los siguientes cuatro diacuteas se mantuvo relativamente estable lo
cual no concuerda con el comportamiento tiacutepico de esta levadura quien tiene un
crecimiento lento e incrementa la produccioacuten de fenoles con su gemacioacuten esto
genera muchas dudas sobre el buen funcionamiento del equipo GC o de la
estabilidad de las levaduras BrettanomycesDekkera en este almacenamiento
Figura 14 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar prueba por duplicado
002040608
1
Vino Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0 0 0
4 etilguayacol
002040608
1
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0 0 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
74
Presencia negativa de 4 etil guayacol durante todo el almacenamiento
probablemente las condiciones de almacenamiento y el medio no dieron lugar al
desarrollo de este compuesto el cual se considera menos conflictivo que el 4-etil-
fenol
Figura 15 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
Estos resultados tambieacuten dejan dudas del normal comportamiento de dicha
levadura pues indican que la levadura no convirtioacute este compuesto en etilfenol
0
2
4
6
8
10
12
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 110709781349685317460323
4 vinylfenol
0
2
4
6
8
10
12
14
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
Series1 0 11071 12974 62132 69322
C (
mg
l)
4 Vinylfenol
75
durante el almacenamiento caracteriacutestica que solo la levadura
BrettanomycesDekkera puede realizar se ve que las concentraciones de
vinylfenoles son mucho mas altas que las de fenoles lo que nos deja determinar
que la poblacioacuten de BrettanomycesDekkera es muy baja y existen otras levaduras
productoras de vinylfenoles en este tipo de vino en las condiciones de
almacenamiento dadas para estas pruebas
Tabla 16 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el
ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 28C por 4 diacuteas
MUESTRA 2 INCUBADA A 28C
Compuesto Day 1
Amount
(mgL)
Day 2
Amount
(mgL)
Day 3
Amount
(mgL)
Day 4
Amount
(mgL)
4-etilfenol 0260244 019612 0186614 019932
4-etilfenol 0260244 020576 0214917 0193554
4-etilguayacol 0 014304 0223836 0
4-etilguayacol 0 002287 00529832 0
4 vinilifenol 1107096 787068 665182 397847
4 vinilifenol 1107096 284389 00204392 0
76
Figura 16 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar
El desarrollo de este compuesto en el diacutea 1 fue significativo y luego relativamente
estable el comportamiento fue similar en las pruebas de diferentes temperaturas
de almacenamiento para este compuesto el cual es el maacutes problemaacutetico en la
industria viniacutecola
0
005
01
015
02
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 005813019932018661019611019932
4 etilfenol
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 005813 019355 021491 020576 026024
4 etilfenol
77
Figura 17 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar
Los resultados de la prueba son poco confiables y no entendibles por lo que
podemos verificar que el GC no estaacute trabajando de forma adecuada para la
deteccioacuten del compuesto
0001002003004005006
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 Etilguayacol 0 0 0022 0053 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
0005
01015
02025
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0223 0143 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
78
Figura 18 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
El comportamiento de este compuesto en la prueba es muy irregular y poco
confiable
0
2
4
6
8
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 397847665182787068397847
4 vinylfenol
0
2
4
6
8
10
12
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 11071 28438 00204 0
4 vinylfenol
79
Figura 19 Comportamiento del compuesto 4 etilfenol durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
La concentracioacuten de 4 etil fenol fue mayor al cuarto diacutea almacenado a
temperatura ambiente de 20C pero este compuesto no tuvo una actividad notoria
de ascenso durante su almacenamiento como se esperaba lo que deja muchas
dudas sobre los resultados de este ensayo
0
05
1
15
2
25
3
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etil fenol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 20C
80
Figura 20 Comportamiento del compuesto 4 etil guayacol durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
Comportamiento anormal del compuesto no se ve tendencias de aumento o
disminucioacuten de este en ninguna de las pruebas no tiene un comportamiento
regular pues se esperaba que la levadura BrettanomycesDekkera
descarboxinizara el compuesto 4-vinilguaiacol y aumentar las concentraciones de
4-etilguaiacol esta reaccioacuten no se hizo notoria en los compuestos aromaacuteticos
seguacuten lo determino el Cromatografo de Gas (GC)
0
005
01
015
02
025
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3
C (
mg
L)
4 etil guayacol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 20C
81
Figura 21 Comportamiento del compuesto 4 Vinyl fenoll durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
La no presencia de este compuesto en el vino original demuestra las baja o casi
nula presencia de la levadura BrettanomycesDekkera al diacutea primero este
compuesto incrementa de forma notoria en las muestras debido a la presencia de
acido cumaacuterico en el medio ya que sufre su carboxilacion convirtieacutendose en 4 vinyl
fenol sin embargo su comportamiento no fue regular y presento problemas de
lecturas
0
2
4
6
8
10
12
14
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
C (
mg
L)4 Vinyl fenol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 28C
82
9 CONCLUSIONES Y
RECOMENDACIONES
91 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO
Se desarrolloacute un medio selectivo soacutelido para BrettanomycesDekkera
accesible y faacutecil de elaborar
Se detectan colonias de la levadura BrettanomycesDekera en el agar
selectivo con glucosa como fuente de carbono en un lapso de 5 diacuteas en
incubacioacuten a 28C
El medio selectivo soacutelido con Glucosa como fuente de carbono fue maacutes
raacutepido y efectivo ya que toma 5 diacuteas para dar resultados positivos frente al
de Etanol como fuente de carbono el cual toma 10 diacuteas para mostrar
resultados positivos aunque ambos dieron resultados satisfactorios en la
selectividad de la levadura BrettanomycesDekkera
La levadura se adapto de forma satisfactoria a estos medios en
condiciones de almacenamiento propias para su desarrollo (28C)
Las colonias de la levadura BrettanomycesDekkera tiene un crecimiento
en estos medios soacutelidos de forma circular con topografiacutea convexa y borde
entero dimensiones 5-6 mm color Amarillo opacicidad oscuro
83
superficie lisa y suave siendo faacutecil de identificar y realizar los conteos
necesarios
El medio solido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten
de la levadura BrettanomycesDekkera en vino tinto es raacutepido econoacutemico
y uacutetil
El uso de azucares para fermentacioacuten de la levadura
BrettanomycesDekkera que Saccharomyces no puede fermentar para
mayor selectividad
Realizacioacuten de pruebas Bioquiacutemicas como meacutetodo raacutepido de selectividad
92 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DESARROLLO DEL MEDIO LIacuteQUIDO
Se desarrollo un medio selectivo liquido para BrettanomycesDekkera
accesible y faacutecil de elaborar
Este medio mostroacute resultados positivos de la presencia de
BrettanomycesDekkera en un lapso de tiempo menor (3 diacuteas) que con el
medio solido (5 diacuteas) en caso de que el nuacutemero de ceacutelulas de la levadura
BrettanomycesDekkera sea mayor a la poblacioacuten critica (103)
Cuando la poblacioacuten de ceacutelulas de la levadura BrettanomycesDekkera es
menor a la poblacioacuten critica el tiempo de identificacioacuten de esta levadura por
medio liquido es muy prolongado puede tomar maacutes de 10 diacuteas o incluso no
detectarlo
84
Los compuestos quiacutemicos usados para el desarrollo del medio liacutequido no
son los adecuados para este tipo de medios donde los resultados positivos
son olfativos pues estos compuestos emiten fuertes olores que confunden
los olores caracteriacutesticos del caraacutecter Brett
El medio liquido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten
de altas concentraciones de la levadura BrettanomycesDekkera en vino
tinto es raacutepido econoacutemico y uacutetil
93 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg
EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE DALMACIA
CROACIA
Este trabajo mostroacute que el dioacutexido de azufre (SO2) tiene buenos resultados
en contra de la levadura BrettanomycesDekkera en concentraciones
normales de 40mgl concentracioacuten en la que se trabaja este compuesto en
los vinos tintos
En Europa el dioacutexido de azufre es usado de forma tradicional en gran
nuacutemero de alimentos y especialmente en vinos sin embargo y a pesar de
su uso regulado se busca la sustitucioacuten de este o su maacutexima reduccioacuten
para hacer de este producto maacutes sano para las personas no tolerantes a
este tipo de compuestos sin embargo seguacuten el trabajo realizado en
comparacioacuten con el producto Antibrettreg el SO2 es maacutes eficaz en el control
85
de la levadura ayudando a evitarla y eliminarla de la cadena productiva del
vino tinto
Gracias a sus caracteriacutesticas el vino tinto Babic es muy vulnerable a la
levadura BrettanomycesDekkera pero a su vez se puede tratar faacutecilmente
con productos como SO2 y Antibrettreg aunque es maacutes efectivo contra
BrettanomycesDekkera el dioacutexido de azufre (SO2)
Antibrettreg es una buena opcioacuten para el control de BrettanomycesDekkera
para evitar el uso de productos alergenicos como SO2
94 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN
EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO
MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE
Al terminar la primera prueba con anaacutelisis en cromatografiacutea a gas y el SPME
queda como resultados
Es necesario repetir la prueba
No se determina el efecto de los estaacutendares internos sometidos a tiempos
de almacenamiento en temperaturas de 20C y 28C lo que puede dar falsos
resultados de cantidades de compuestos
86
Se debe crear un medio maacutes apto para el desarrollo de la levadura y un
control diario de crecimiento ( agregar maacutes Glucosa en caso de que se
haya consumido toda controlar presencia de Bacterias y otros
microorganismos que no se deseen en el medio)
Es necesario control de aromas con panel sensorial para determinar el
umbral de deteccioacuten en este vino
Control de crecimiento por medio solido Selectivo para
BrettanomycesDekekra conteo de colonias presentes en el vino inoculado
y su desarrollo durante almacenamiento a diferentes temperaturas
La segunda prueba no fue posible realizarla por dantildeos en el equipo de
cromatografiacutea de gas (GC)
87
ANEXOS
11
89
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientiacuteficas 99 Grupos de
Investigacioacuten Enoloacutegica Zaragoza Espantildea
93
11
GRACIAS es una palabra corta para todo lo que quiero expresar a todos aquellos que
hicieron parte de este suentildeo hecho realidadhellip
A Dios y a la virgen Auxiliadora por llevarme de su mano cada diacutea de mi carrera en cada
momento alegre y en cada momento difiacutecil fueron mi fortaleza
A mis papitos por hacer de mi estudio una realidad por su sacrificio y apoyo desinteresado y
sincero
A mi Hermanito por ser mi fortaleza mi ejemplo y mi amigo incondicional
A mi familia Blanco y Urrea por su compantildeiacutea durante esta etapa
A mi facultad (Decano Dr Camilo Rozo Dra Patricia Jimeacutenez y mis profesores) por
ensenarme mi profesioacuten y aportar lo mejor de ustedes para mi formacioacuten personal
A mis asesores de Tesis (Ing Patricia Chaparro y Dr Sc Leo Gracin) por su guiacutea y
colaboracioacuten oportuna
A mis queridos amigos quienes siempre han estado a mi lado en las dificultades y en las
alegriacuteas (Ingrid Mafe Cami G Cami R Harold Pipe Karla Andreacutes T Diego G)
A IAESTE en alianza con el ORI por hacer posible mi intercambio y poder hacer mi tesis en el
maravilloso paiacutes de Croacia
A Croacia por ser mi segundo hogar por abrirme sus puertas y su corazoacuten por brindarme
tan maravillosas personas en mi camino
Croatia Thank you for being my second home for opening your doors and your heart to me
and give me the opportunity to meet so many wonderful people
To my boss my teacher my mentor and specially my friend Leo
To the faculty of food technology and Biotechnology and the department of technology
and analysis of beverages for give me the opportunity to give all my knowledge to the
project and learn a lot more
To all the amazing people I met during this experience (Igor Karin Natka Josip Ana Matija
Daniel Pz Szilvia Dini Daniela Lidija Sanja and everybody else who I had the pleasure to
meet in this great trip) for give me the best of your hearts
I only have one thing to say hellipTHANK YOU
Solo me queda una palabra por decirhellipGRACIAS
10
1 MARCO TEORICO
Las levaduras representan el grupo de microorganismos maacutes importante en la
industria viniacutecola porque sin Saccharomyces producir vinos de alta calidad seriacutea
imposible Ademas de Saccharomyces hay muchos otros geacuteneros y especies de
levaduras presentes durante la vinificacioacuten que afectan la calidad del vino positiva
o negativamente5
Las levaduras comprenden 39 geacuteneros y 350 especies Se identifican y clasifican
basaacutendose en caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas Entre los aspectos
morfoloacutegicos considerados se encuentran el tamantildeo y la forma de las ceacutelulas en
medios soacutelidos y liacutequidos especificados el modo de reproduccioacuten y si forma velo
en la superficie o sedimenta en un medio liacutequido Entre las caracteriacutesticas
fisioloacutegicas consideradas se encuentra si puede crecer (y fermentar) en un
determinado carbohidrato y si puede o no utilizar determinadas fuentes de
nitroacutegeno como los nitratos6
11 REPRODUCCION
Las levaduras son agrupadas en tres familias conocidas como
Saccharomycetaceae Sporobolomycetaceae y Cryptococcaceae Estas
5 H Erten June 2002 Relations between elevated temperatures and fermentation behavior of
Kloeckera apiculata and Saccharomyces cerevisiae associated with winemaking in mixed culture
World Journal of Microbiology and Biotechnology Volume 18 N 4 pag 1 Adana Turkey 6 Cerveceros de Argentina 2006 Levadura wwwcervezadeargentinacomararticuloslevadurahtm
11
representan el grupo de microorganismos entre bacterias y hongos respecto a su
tamantildeo de ceacutelula Este grupo es caracterizado por su forma de reproduccioacuten
vegetativa conocida como ldquogemacioacutenrdquo Bajo condiciones optimas una ceacutelula
madre puede gemar varias veces durante el periodo reproductivo Sin embargo
bajo estrictas condiciones de fermentacioacuten una levadura va a gemar solamente
entre tres o cuatro veces Aquiacute la disponibilidad de oxigeno la cual es necesaria
para la formacioacuten de precursores de la membrana de la ceacutelula limita la
replicacioacuten7
Estos microorganismos muestran varios tipos de gemacioacuten lo cual puede dar un
valor diagnostico Entre aquellas aisladas de fermentacioacuten y antildeejamiento del vino
se observan maacutes frecuentemente multilateral y gemacioacuten polar 8
La modalidad maacutes comuacuten es la gemacioacuten proceso asexual en el cual la ceacutelula
progenitora emite un conducto tubular desde la vacuola nuclear hacia un punto
perifeacuterico proacuteximo a la misma Entonces se forma en la direccioacuten del conducto
una pequentildea protuberancia en la superficie externa de la ceacutelula y el conducto
pasa atravesando la pared celular a dicha protuberancia la cual se ensancha
llenaacutendose con el material citoplaacutesmico y nuclear de la ceacutelula progenitora Cuando
el brote o yema formada llega a ser casi tan grande como la ceacutelula progenitora los
aparatos nucleares de ambas ceacutelulas se orientan de forma que sus centrosomas
respectivos equidisten del punto de unioacuten Al llegar este momento la ceacutelula madre
y la ceacutelula hija se separan y se inicia la formacioacuten de nuevas ymas En la
gemacioacuten normal no se forman tabiques de separacioacuten entre ceacutelula madre y
ceacutelulas hijas pero en algunos casos el proceso se inicia en la gemacioacuten y se
completa por divisioacuten con la separacioacuten definitiva de ambos individuos La ceacutelula
madura de puede producir por gemacioacuten durante el curso de vida un promedio de
7 Brinton M Miller and Warren Litsky PhD 1976 Industrial Microbiology Edi Mac Graw Hill United States
of America
8 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures
edi Springer second edition Fresno California United States of America
12
24 generaciones de ceacutelulas hijas Las yemas sucesivas se forman siempre en
sitios diferentes de la superficie de la ceacutelula9
111 Gemacioacuten multilateral
La gemacioacuten multilateral ocurre en el ldquohombrordquo o aacuterea de la levadura donde ocurre
la reproduccioacuten La gemacioacuten y ciclo de separacioacuten crea un problema para las
levaduras durante su fase fermentativa pues en este tiempo la ceacutelula madre se
reduce aproximadamente un medio Porque la siacutentesis de la membrana celular
ocurre bajo condiciones anaeroacutebicas lo que limita los ciclos asexuales
replicativos Como resultado la mayoriacutea de las fermentaciones se completan en la
fase estacionaria (no gemacioacuten) Un ejemplo de esta reproduccioacuten es
BrettanomycesDekkera10
112 Gemacioacuten Polar
A diferencia de la gemacioacuten multilateral la gemacioacuten polar puede ocurrir en uno o
dos polos En el caso de Kloeckera y Saccharomyces la gemacioacuten ocurre en
ambos polos aumentando la poblacioacuten de levaduras con forma de ldquolimoacutenrdquo 11
113 Fisioacuten
Esta reproduccioacuten es caracteriacutesticas del genero Schizosaccharomyces donde la
formacioacuten de la ceacutelula hija ocurre sin la reduccioacuten de la madre ceacutelula como en los
casos anteriores En este caso la formacioacuten de la microscoacutepica pared celular
ocurre entre la madre ceacutelula y la hija seguida por la separacioacuten12
9 Araya Pablo 2002 Reproduccioacuten de hongos unicelulares mediante gemacioacuten esporulacioacuten y
fisioacuten httphtmlrincondelvagocomreproduccion-asexualhtml
10 11 12 Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic
Publishers GmbH United States of America and Canada
13
114 Pseudomycelium
Cualquier fabricante de vinos ha tenido la oportunidad de notar la formacioacuten de
una peliacutecula en la superficie del vino Esto surge debido a la gemacioacuten repetida de
las levaduras oxidativas y fallas en el momento de la separacioacuten de la ceacutelula hija
de la madre Con el tiempo el lazo previo entre la madre ceacutelula e hija se ampliacutea
dando la impresioacuten de filamentos como si se tratase de mohos siendo que son
levaduras 13
12 TAXONOMIA
Para distinguir las levaduras que pueden producir ascoporas de aquellas que no
los micologistas usan doble taxonomiacutea para su clasificacioacuten Desafortunadamente
la nomenclatura para la combinacioacuten anamorfotelemorfo es frecuentemente
diferente Unos ejemplos de levaduras sexualasexual o telemorfoanamorfo son
DekeraBrettanomyces Metschnikowia pulcherrimaCandida pulcherrima
Hanseniaspora uvarumKloeckera apiculata Torulaspora delbruecki Candida
colliculosa 14
Sin embargo las levaduras son diferenciadas por los taxonomistas por asignacioacuten
de varios nombres de geacutenerosespecies varios vinicultores usan un sistema
informal para agrupar levaduras basadas en su morfologiacutea u otras caracteriacutesticas
Por ejemplo a Kloeckera apiculata se le refiere como ldquolevadura apiculadardquo
tiene forma de limoacuten Esta levaduras asi com muchas otras presentes en el mosto
de la uva como lo son Candida Cryptococcus Debaryomyces Hansenula
Issatchenkia Kluyveromyces Metschnikowia Pichia y Rhodotorula tambieacuten son
llamadas levaduras ldquonativasrdquo ldquonaturalesrdquo o ldquosalvajesrdquo por su origen el vintildeedo o en
13
Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers
GmbH United States of America and Canada
14 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
14
la vinera Algunos enoacutelogos han discutido contra el uso de estos teacuterminos porque
esta implicancia no sucede en todas las levaduras ya que estas son de alguna
forma ldquono-nativasrdquo o ldquono naturalesrdquo (Ej Saccharomyces o Brettanomyces) El
teacutermino ldquono Saccharomycesrdquo es maacutes comuacuten para nombrar aquellas levaduras
presentes en el mosto de la uva que no son del genero Saccharomyces15
Las levaduras encontradas despueacutes de la fermentacioacuten alcohoacutelica tambieacuten son
asignadas a un grupo informal Algunas veces las levaduras que conducen la
principal fermentacioacuten (Saccharomyces) son muchas veces llamadas ldquolevaduras
fermentativasrdquo basados en su metabolismo Durante su antildeejamiento algunas
levaduras (Candida Hansenula y Pichia) pueden crecer en la superficie en
presencia de oxigeno Esta peliacutecula superficial es comuacutenmente asociada a
deterioro del vino esta levadura se le conoce como ldquolevadura formadora de
peliacuteculardquo16
121 DekkeraBrettanomyces
La taxonomiacutea cientiacutefica sobre BrettanomycesDekkera ha cambiado en los uacuteltimos
antildeos Brettanomyces estaacute clasificado dentro de la misma familia que
Saccharomyces (familia Saccharomycetaceae) Actualmente dentro del geacutenero
Brettanomyces se aceptan cinco especies diferentes (B bruxellensis B
anomalus B custersianus B nanas y B naardenensis)17
Las teacutecnicas de biologiacutea molecular han demostrado que B intermedious B
lambicus B custerseii o D intermedia son sinoacutenimos de B bruxellensis por lo
que estas denominaciones han quedado en desuso Los microorganismos de este
geacutenero presentan dos formas una capaz de reproducirse sexualmente (Dekkera)
15
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
16 Kurtzman CP 1998 The industrial and agricultural significance of yeasts 4
th Edition Amsterdam
Holanda
17 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
15
y otra que lo hace asexualmente (Brettanomyces) Tambieacuten se llaman
respectivamente forma perfecta y forma imperfecta En algunos casos la forma
perfecta y la imperfecta reciben nombres diferentes como ocurre con B anomalus
y D anomala En otros casos el nombre es similar como las pertenecientes a la
especie bruxellensis que pueden parecer como D bruxellensis como B
bruxellensis o como BrettanomycesDekkera A efectos praacutecticos en la bodega
estos dos estados son similares Cuando vemos referencias a Brettanomyces
como contaminante en la mayor parte de los casos se refieren a
DekkeraBrettanomyces ya que este es el responsable de las alteraciones en el
vino18 y 19
La morfologiacutea celular de BrettanomycesDekkera es ojival o ciliacutendrica con
gemacioacuten multipolar en reproduccioacuten vegetativa Una de las caracteriacutesticas de
este geacutenero es su tamantildeo celular variable y la formacioacuten de filamentos19
18 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 23
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
19
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
16
Figura 1 Microfotografiacutea de cultivo de BrettanomycesDekkera a) Variabilidad morfoloacutegica y de
tamantildeo celular b) forma filamentosa
Fuente Lopez-Cordon Eva BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia wwwacenologiacom
Los defectos sensoriales asociados directamente a Brett aparecen
mayoritariamente en vinos tintos de calidad y las causas radican en la propia
fisiologiacutea del microorganismo Ademaacutes al ser una levadura de crecimiento muy
lento la alteracioacuten se presenta principalmente durante el almacenamiento y sobre
todo la crianza del vino habitual en los vinos tintos de gama alta En las barricas
de madera el microorganismo tiene a su disposicioacuten todo el sustrato y tiempo
suficiente para realizar su actividad La naturaleza porosa de la madera y su difiacutecil
limpieza contribuye a que las poblaciones existentes se mantengan incluso
despueacutes del lavado de la barrica Ademaacutes BrettanomycesDekkera tiene la
capacidad de degradar uno de sus componentes la celobiosa 20
13 CARACTERISTICAS FISIOLOGICAS
S cerevisiae y BrettanomycesDekkera tienen metabolismos similares muy
adaptados a las condiciones de vinificacioacuten Tras la fermentacioacuten alcohoacutelica S
cerevisiae es la levadura mayoritaria debido a que las condiciones nutricionales
20
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
17
del vino son muy estrictas (altas concentraciones de etanol y bajas
concentraciones de nutrientes) En este momento BrettanomycesDekkera
continuacutea creciendo gracias a que utiliza nutrientes que S cerevisiae no ha podido
consumir sobre todo algunos azuacutecares y fuentes de nitroacutegeno21
Una de las caracteriacutesticas que diferencia a BrettanomycesDekkera es la gran
diversidad de azuacutecares que puede fermentar (ver tabla de Relacioacuten de los
principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) La mayoriacutea de
las cepas pueden crecer utilizando trealosa y celobiosa azucares presentes en el
vino y no consumibles por S cerevisiae Otra de las ventajas que presenta frente
a S cerevisiae (y frente a la mayoriacutea de las levaduras) es que puede utilizar los
nitratos como fuente de nitroacutegeno Debido a que S cerevisiae soacutelo utiliza el
nitroacutegeno amoniacal y los aminoaacutecidos libres estos se consumen con relativa
rapidez Al final de la fermentacioacuten el nitroacutegeno moniacal es escaso y se favorece
el crecimiento de las levaduras que pueden utilizar otras fuentes de nitroacutegeno
Ademaacutes Brettanomyces puede crecer con concentraciones de fosfato diamoacutenico
tan bajas como 05gl o a partir de diversos aminoaacutecidos En resumen
BrettanomycesDekkera crece maacutes despacio que S cerevisiae es resistente a
concentraciones altas de alcohol puede utilizar otros azucares como fuentes de
energiacutea y nitrato como fuente de nitroacutegeno Esto explica que pueda reproducirse
cuando la fermentacioacuten alcohoacutelica ha terminado a partir de nutrientes no
consumibles por S cerevisiae y cuando no tiene competidores22
21
Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
22 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
18
Tabla 1 Relacioacuten de los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto
Fuente Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista
VINOTEQ N 38 pag 21 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
131 BrettanomycesDekkera y siacutentesis de fenoles volaacutetiles
El origen de los fenoles volaacutetiles estaacute relacionado con la actividad secuencial de
dos enzimas que descarboxilan los aacutecidos en hidroxiestirenos (vinilfenoles) que
19
son posteriormente reducidos a etilderivados (etilfenoles)23 como puede
observarse en la figura 2
Figura 2 Siacutentesis de etilfenoles de BrettanomycesDekkera
Fuente ACE revista de Enologia wwwacenologiacom
El primer paso de descaboxilacion de los aacutecidos hidroxicinamicos es comuacuten
tambieacuten en otros microorganismos como bacterias hongos y otras levaduras Sin
embargo el segundo paso reduccioacuten de vinilfenoles es caracteriacutestico de algunos
tipos de levaduras como Dekkera bruxelliensis D anomala Pichia guillermondi
Candida versarilis C halophila y C mannitofaciens24
Los fenoles volaacutetiles que se asocian al problema Brett en vinos son el 4-etilfenol y
el 4- etilguaiacol asiacute como sus precursores intermedios 4-vinilfenol y 4-
vinilguaiacol aunque estos uacuteltimos son menos importantes por ser muy reactivos y
raacutepidamente convertidos en etilfenoles por BrettanomycesDekkera o en su caso
23
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
24 Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
20
condensan con otras moleacuteculas como antocianos25 Los etilfenoles y
especialmente elevadas concentraciones de 4-vinilfenol en vinos se asocian con
aromas desagradables asociados a descriptores como ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de
caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo26
El umbral sensorial del 4-etilfenol es de 230 μg l-1 y el del 4-etilguaiacol es de 47
μgl Pese a su menor umbral sensorial el 4-etilguaiacol responde a descriptores
como ldquobaconrdquo o ldquoahumadordquo que a bajas concentraciones aportan complejidad por
lo que se puede considerar sensorialmente menos conflitivo que el 4-etilfenol 27
Figura 3 Defectos sensoriales producidos en el vino por BrettanomycesDekkera
Fuente Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
25 Morata A Goacutemez-Cordoveacutes M Calderoacuten F Suaacuterez J 2006 Effects of pH temperature and SO2 on the
formation of pyranoanthocyanins during red wine fermentation with two species of Saccharomyces Journal Food Microbiology No106 pag 4 Madrid Espana
26 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea 27 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
21
132 Identificacioacuten de BrettanomycesDekkera
Los Bioacutelogos usan sistemas de identificacioacuten basados en similitudes taxonoacutemicas
entre organismos dichas similitudes pueden ser morfoloacutegicas tipos capacidad de
produccioacuten de sustratos como azuacutecar yo nitratos caracteriacutesticas fisioloacutegicas y
bioquiacutemicas secuencia del material geneacutetico y respuestas inmunoloacutegicas28
En la industria viniacutecola es importante recurrir a diferentes tipos de pruebas para la
identificacioacuten de microorganismos una de estas y la maacutes realizada es la revisioacuten
del microorganismo bajo el microscopio Esta prueba brinda informacioacuten sobre la
morfologiacutea del microorganismo (cocos bacilos formas puntudas ojival entre
otros) tamantildeo (dimensiones) agrupaciones celulares (solas parejas triacuteos
grupos o cadenas) Sin embargo el uso del microscopio es una prueba raacutepida
para examinar mostos o vino pero no determina cantidades que muchas veces es
requerido para tratamientos de accioacuten otro de los inconvenientes es que los
microorganismos pueden variar su morfologiacutea en forma o tamantildeo dependiendo de
la edad y las condiciones de crecimiento por lo que puede no ser clara la
identificacioacuten de este29
14 Medios soacutelidos selectivos
Si se requiere de la confirmacioacuten del microorganismo este debe ser aislado del
vino para una caracterizacioacuten para esto se requiere de medios soacutelidos Cuando se
examina un microorganismo en un medio solido es importante revisar las
caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias (ver figura 4 Morfologiacuteas de colonias
en medios soacutelidos) Entre estas caracteriacutesticas estaacuten forma (circular irregular o
2829 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
22
rizada) tamantildeo (dimensiones estas normalmente se expresan en miliacutemetros)
topografiacutea (plano elevado convexo coacutencavo o embonado) presencia de
pigmentos opacidad (transparente traslucido u opaco) superficie (suave rugosa
lisa o aacutespero) bordes (entero ondulado crespo dentado rizado) o cualquier
cambio en el agar (color opacidad cambios en los indicadores de pH o CaCO3
respectivamente)30
Figura 4 Varias morfologiacuteas de crecimiento de colonias en medio solido
Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007
Gran nuacutemero de medios selectivos se han creado para la aislacioacuten deteccioacuten yo
conteo de levaduras provenientes de jugos de uva mostos o vinos El medio maacutes
utilizado en estos fines es YPD (Yeast Peptone Dextrose) pero dicho medio no
es selectivo entre levaduras y se usa comuacutenmente para el conteo de
Saccharomyces31 Las colonias empiezan a parecer con un periodo de incubacioacuten
30
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
31 Essia Ngang J Wolniewicz E Villa P2005 Stimulation of lactobacilli during alcoholic fermentation action
of sucrose hydrolysis by yeast Biotechnology letters No 8 pag 743 Amiens France
23
de 2 a 4 diacuteas a 22C a 25C Igualmente el agar de jugo de uva es no selectivo y
presenta faacutecil crecimiento de levaduras bacterias y mohos
Para la levadura Brettanomyces Dekkera se han elaborado diferentes medios
selectivos entre ellos el maacutes conocido es WL por sus siglas en ingles del
laboratorio que lo creo ldquoWallerstein Laboratoriesrdquo este medio contiene
cicloheximida compuesto selectivo para Brettanomyces e inhibe Saccharomyces
El punto criacutetico es encontrar la cantidad exacta de este compuesto para la
inhibicioacuten de las levaduras sin que afecte a BrettanomycesDekkera32
Ademaacutes del medio WL BrettanomycesDekkera puede ser cultivado en otros
medios selectivos como Brettanomyces medio A creado por Vilas en 1993
Brettanomyces medio B el cual contiene cicloeximida como agente selectivo
mientras que Brettanomyces medio C tiene cicloheximida y ampicilina este medio
fue creado por B Watson en 1998 Brettanomyces medio D fue creado
recientemente por Rodrigues en 2001 este medio es conocido como DBDM
(DekkeraBrettanomyces differential medium ) es un medio selectivo para
Brettanomyces en contra de Saccharomyces y otras levaduras este medio es el
maacutes utilizado en la vineras para caracterizacioacuten de BrettanomycesDekkera
actualmente33
15 Dioacutexido de azufre (SO2) en vinos
32
33
Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers
GmbH United States of America and Canada
24
El dioacutexido de azufre tambieacuten llamado oxido de azufre es un eficaz agente
conservante antioxidante y antimicrobiano en la industria viniacutecola34
Durante la vinificacioacuten SO2 ha representado histoacutericamente una herramienta muy
importante usada por los vinicultores para el control de crecimiento microbioloacutegico
Debido a preocupaciones por la salud del consumidor el uso de este producto ha
disminuido dramaacuteticamente con el posible riesgo de aumentar el riesgo
microbioloacutegico35
El actual liacutemite legal de SO2 en vinos en los Estados Unidos es de 350mgL una
concentracioacuten mucho mayor a la usada en la industria viniacutecola No obstante vinos
que contienen maacutes de 10mgL deben declarar este compuesto en la etiqueta
porque SO2 es un metabolito que las levaduras usan durante la fermentacioacuten Los
vinos siempre contienen algo de sulfitos aunque la adicioacuten no se realice durante el
proceso36
151 Formas del Dioacutexido de Azufre (SO2)
Una vez disuelto en agua el dioacutexido de azufre existe en equilibrio entre SO2
molecular (SO2H2O) bisulfito (HSO3) y sulfito (SO32-) Este equilibrio depende del
pH Ademaacutes de estar en equilibrio con el molecular y especies sulfito el bisulfito
tambieacuten existe en forma ldquolibrerdquo y en forma ldquoatadardquo Aquiacute la moleacutecula reaccionara
34
Orwine Eureka 2008Investigadores europeos buscan alternativas al dioxido de azufre en vinos
httpawprowordpresscom20081107investigadores-europeos-buscan-alternativas-al-dioxido-de-
azufre-en-el-vino
3536 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
25
con compuestos carbonilos (ej Acetaldehiacutedo) formando productos adicionales
como Acido Hydroxysulfonico 37
Ademaacutes de Acetaldehiacutedo algunas moleacuteculas presentes en el jugo de uva que
reaccionan con bisulfito son acido piruvico α-keto-glutaric dihidroxyacetona
diacetyl Pigmentos de antocianinas entre otros38
152 Inhibidor Microbiano
El sulfuro molecular es la forma antimicrobiana del dioacutexido de azufre La cantidad
de SO2 molecular presente en cualquier vino no se mide directamente La
concentracioacuten es calculada conociendo la concentracioacuten de SO2 libre y el pH del
vino basaacutendose en la siguiente foacutermula
Alternativamente la figura 5 Se puede utilizar como guiacutea para aproximar la
cantidad de SO2 libre necesitada a determinado valor de pH de valores entre 05 o
08 mgl de SO2 molecular 39
El SO2 inhibe microorganismos de varias formas incluyendo rupturas de puentes
bisulfitos en proteiacutenas y reaccionando con coofactores como NAD+ y FAD tambieacuten
reacciona con ATP
3739
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
38 Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi
Springer New York United States
26
Figura 5 Cantidades de SO2 libre a un pH determinado para obtener 05 o 08 mgl de SO2
molecular
Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007
La concentracioacuten de SO2 molecular necesario para prevenir el crecimiento de
microorganismos variacutea seguacuten vinojugo pH temperatura poblacioacuten densidad y
diversidad estado de crecimiento grado de alcohol entre otros factores Beech
1979 sugirioacute una adicioacuten de 08 mgl de SO2 molecular como la cantidad
necesaria del compuesto en vinos blancos de mesa para dar una reduccioacuten de
cerca de 104 UFCml de la poblacioacuten de diferente tipo de microorganismos en 24
horas Las diferencias que existen entre las levaduras y bacterias en base a la
27
sensibilidad a este compuesto son dadas a conocer por diferentes autores (Warth
1977 1985 Du Toit 2005 Davis 1988 Hood 1983)40
16 Antibrettreg como alternativa de prevencioacuten y eliminacioacuten de
BrettanomycesDekkera
Antibrettreg es un producto nuevo creado por Spindal SARL-Gretz - Armainvilliers
Francia Es una preparacioacuten enzimaacutetica para inactivar Brettanomyces y para
reducir olores producidos por fenoles volaacutetiles41
Antibrettreg es preparado a base de paredes celulares de levadura activados
enzimaacuteticamente que presentan elevadas propiedades adsorbentes frente al 4-
etilfeno y 4- etilguayacol compuestos asociados con olores desagradables en el
vino tales como sudor de caballo farmacia o barniz42
Antibrettreg inhibe la produccioacuten de la vinilreductasa que participa en la
transformacioacuten de los aacutecidos cinaacutemicos naturalmente presentes en los vinos en
los correspondientes derivados etilados responsables de los olores atribuidos a
BrettanomycesDekkera 43
40
Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi
Springer New York United States
41 Manual de instrucciones de producto Antibrett reg producido por Spindal SARL-Gretz -
Armainvilliers France
424344 AEB Group 2008 ANTIBRETT Preparado a base de paredes celulares de levadura para la inactivacioacuten
de Brettanomyces y la eliminacioacuten de los olores de estos productos httpwwwaeb-
groupcomimgsSPAGNOLODepliantANTIBRETT-lett-ESPpdf
28
El uso de Antibrettreg es efectivo incluso contra otros olores anoacutemalos como los
que se generan en las barricas sucias principalmente huacutemedas dantildeando la
calidad olfativa del vino44
29
2 PROBLEMA
La levadura BrettanomycesDekkera es una levadura de contaminacioacuten presente
en la mayoriacutea de industrias viniacutecolas en el mundo Afecta directamente la
produccioacuten y calidad sensorial de los vinos con el desarrollo de los compuestos 4
etilfenol y 4 etilguayacol los cuales dantildean el perfil olfativo del vino dando aromas
caracteriacutesticas a ldquoestablordquo ldquocuerordquo ldquosudor de caballordquo o ldquobarnizrdquo conocido como
ldquocaraacutecter Brettrdquo
Esta contaminacioacuten se da especialmente en los vinos tintos debido a sus
caracteriacutesticas de produccioacuten (fermentacioacuten crianza antildeejamiento) y sus
propiedades fisicoquiacutemicas (Grado alcohoacutelico pH Acidez total Acidez volaacutetil
entre otros)
En Croacia existe una gran produccioacuten de vinos tintos entre los cuales se
encuentra el vino tinto Babic proveniente de la isla de Hvar el cual es famoso por
ser un vino duro carnoso estructurado y casi sobre-maduro con un grado
alcohoacutelico que ronda los 15 vv siendo la primera denominacioacuten de origen que
se aproboacute en Croacia en el antildeo 1961 este vino es de gran importancia en la
regioacuten la mayoriacutea de sitios de elaboracioacuten son pequentildeas industrias que han sido
afectadas por el bdquocaraacutecter Brett‟ Muchas investigaciones se han realizado al
respecto de la levadura BrettanomycesDekkera pero se conoce muy poco sobre
sus efectos en el vino Babic debido a sus caracteriacutesticas particulares (alcohol
30
15 pH 35 Acidez total 520 gr Acido TartaricoL Acidez volaacutetil 08 gr Acido
AceticoL Azucar residual 47 grLt)45
La dificultad de la pequentildea industria para acceder a productos que lleven a la
identificacioacuten de la levadura mencionada y de esta manera conllevar a planes de
accioacuten contra el ldquocaraacutecter Brettrdquo es una de las grandes dificultades de la industria
vinera en este paiacutes en donde los productos para la industria enoacuteloga son
complicados y de alto precio para acceder a ellos y en consecuencia no se
realizan muchas de estas pruebas de deteccioacuten de BrettanomycesDekkera
llevando al mercado productos contaminados de baja calidad que inicialmente
podriacutea haber sido un vino de alta calidad debido a sus caracteriacutesticas uacutenicas y de
gran popularidad
45
Datos obtenidos en el laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
31
3 JUSTIFICACION
Actualmente Croacia cuenta con maacutes de 300 zonas vineras en las que se producen 67
de vino blanco 32 vino tinto y el restante 1 vino rosado De acuerdo a recientes datos
estadiacutesticos hay 650 km2 de vintildeedos en Croacia de los cuales 375 km2 son uvas con
indicacioacuten geograacutefica de origen que producen maacutes de 300 vinos y maacutes de la mitad de este
nuacutemero son vinos elaborados en microempresas con un total de 50000000 de botellas
de vino el 8 es vino superior 70 de calidad y el 22 es vino de mesa de produccioacuten
nacional46
Croacia es un fuerte productor de vino a nivel regional con sus diferentes variedades
propias (Merlot Plavac Dingač Postup Malvazija Pošip Kujundžuša Babic) pero dicha
produccioacuten ha sido fuertemente afectada por la presencia de la levadura
BrettanomycesDekkera trayendo consecuencias como perdidas de produccioacuten peacuterdida
de calidad sensorial del vino grandes peacuterdidas econoacutemicas y desprestigio a sus vinos de
denominacioacuten de origen
Es por esto que en este proyecto de investigacioacuten se busca una faacutecil y raacutepida
identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera causante del ldquocaraacutecter Brettrdquo con el
desarrollo de medios selectivos liquido y solido ademaacutes de opciones para el tratamiento
yo prevencioacuten de esta levadura en la cadena productiva comparativamente entre dioacutexido
de azufre (SO2 ) y Antibrettreg y la identificacioacuten de los aromas caracteriacutesticos del ldquocaraacutecter
Brettrdquo en el vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia
46
Hrvatski zavod za vinogradarstvo i vinasrtvo 2003 Pravilnik o vinu httpwwwhrzvvhrpropisihtm
32
4 OBJETIVOS
41 General
Caracterizar y evaluar el comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera
en teacuterminos de crecimiento y produccioacuten de aromas no deseados en vino tinto
Babic
42 Especiacuteficos
Desarrollar el medio solido y medio liacutequido selectivo para
BrettanomycesDekkera
Evaluar el comportamiento de la levadura en estos medios selectivos
Determinar la influencia del Dioacutexido de azufre (SO2) y el compuesto
Antibrettreg en la levadura BrettanomycesDekkera presente en vino tinto
Babic 2007
Identificar los compuestos aromaacuteticos producidos por Brettanomyces
bruxellensis en vino tinto Babic usando el meacutetodo ldquomultiple headspace
solid-phase microextraction (SPME)rdquo
33
5 ALCANCES
En este proyecto se pretende desarrollar un medio selectivo faacutecil de producir en
donde sea raacutepida la identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera en la
produccioacuten de vinos tintos se realizaran pruebas para corroborar el crecimiento de
esta levadura en el medio determinando el tiempo que esta levadura toma en
adaptarse en el medio y su comportamiento en este una vez comprobada su
adaptacioacuten al medio liquido se trabajara con el meacutetodo de cromatografiacutea de gas
(GC) y el uso de micro extraccioacuten en fase solida (SPME) para el anaacutelisis
cuantitativo de los compuestos volaacutetiles (4-etil-fenol 4-etil-guayacol4-vinilfenol y
4-vinil-guayacol) y posteriormente con el vino tinto Babic Ademaacutes se desea
comprobar la efectividad de los productos con que las vineras de Croacia inhiben
o eliminan la presencia de la levadura en los vinos tintos como lo son el producto
AntiBrettreg y el Dioacutexido de azufre (SO2)
34
6 ESTADO DEL ARTE
Sobre el campo problemico causado por la levadura BrettanomycesDekkera en la
industria viniacutecola se han realizado bastante investigaciones a nivel de
caracterizacioacuten de la levadura los factores fisicoquiacutemicos que favorecen el
crecimiento de la levadura meacutetodos de prevencioacuten y control evaluacioacuten de
dantildeos sensoriales en diferentes tipos de vinos formacioacuten de compuestos fenoacutelicos
en los diferentes tipos de vino otros compuestos no fenoacutelicos asociados al
ldquocaraacutecter Brettrdquo teacutecnicas de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera
evaluacioacuten de la teacutecnicas de control e inhibicioacuten de dicha levadura desarrollo de
nuevos medios de deteccioacuten y aislamiento de la levadura relacioacuten entre la
levadura BrettanomycesDekkera con las otras levaduras presentes en el vino
entre otros
Seguacuten estas investigaciones se analizan aquellas que pueden aportar datos
importantes para el desarrollo del trabajo que se quiere realizar y se tiene en
cuenta sus metodologiacuteas conclusiones recomendaciones y comentarios
Entre las importantes para el planteamiento de este trabajo se menciona el trabajo
realizado por la Universidad Politeacutecnica de Madrid Espantildea el cual analiza
algunas de las caracteriacutesticas maacutes relevantes de este geacutenero de levaduras su
crecimiento en bodega factores fisicoquiacutemicos que favorecen su crecimiento y
desarrollo en el vino los defectos sensoriales que presenta en los vinos y estudia
algunas de los meacutetodos fiacutesicos para el control de BrettanomycesDekkera en vino
35
(clarificacioacuten filtracioacuten amicrobica proteiacutenas clarificantes anhiacutedrido sulfuros
dimetil dicarbonato Aditivos)47
Para conocer maacutes sobre la levadura en condiciones de barrica y almacenamiento
se revisa el articulo elaborado en el Departamento Teacutecnico Guserbiot La rioja
Espantildea en este artiacuteculo se describe brevemente su metabolismo y su ecologiacutea en
las bodegas Igualmente se comparan las teacutecnicas utilizadas en los laboratorios
para su deteccioacuten y cuaacuteles son las limitaciones de los diferentes meacutetodos
Finalmente se analizan las estrategias desarrolladas para su eliminacioacuten de las
bodegas y se dan una serie de recomendaciones para su control48
El instituto de fermentaciones Industriales Consejo superior de investigaciones
cientiacuteficas Juan de Cierva Madrid Espantildea en el cual se revisa la formacioacuten de
etilfenoles (4 etil-fenol 4 etil guayacol) en vinos tintos anejos Los factores
fisicoquiacutemicos que favorecen el crecimiento de la levadura no deseada
BrettanomycesDekkera las teacutecnicas usadas para la detectar la presencia de esta
levadura en vinos ( Revisioacuten microscoacutepica fluorescente remocioacuten de aacutecidos
grasos de su membrana teacutecnicas moleculares como PCR y electroforesis) y de
control (Proteiacutenas fining Fining con gelatina liquida filtracioacuten variables
fisicoquiacutemicas adicioacuten de aditivos procedimientos de altas presiones
manipulacioacuten geneacutetica) con esta investigacioacuten se concluye que la combinacioacuten y el
uso de las numerosas teacutecnicas pueden ayudar a la prevencioacuten y reduccioacuten de la
levadura BrettanomycesDekkera 49 Este trabajo muestra las muacuteltiples opciones
47
A Morata S Benito F Palomero F Calderoacuten y J A Suaacuterez-Lepe Ecologiacutea y prevencioacuten de
BrettanomycesDekkera durante la elaboracioacuten y crianza de vinos tintos Revista enoacutelogos (Editada por la
Federacioacuten Espantildeola de Asociaciones de Enoacutelogos y Periodistas Asociados) No 50 paacuteg 1-12 Madrid Espantildea
48 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 20-
24 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
49 R Suarez JA Suarez-Lepe A Morata F Calderon 2006 The production of ethyl phenols in wine by yeasts
of the genera Brettanomyces and Dekkera A review Journal Food Chemistry No 102 pag 10-21 Madrid
Espantildea
36
existentes en el control y prevencioacuten de la levadura mencionada sin embargo deja
claro que la mayoriacutea de estas opciones son costosas y no de faacutecil adquisicioacuten para
una pequentildea industria
El anaacutelisis sensorial ha sido de los aspectos maacutes estudiados al respecto de
BrettanomycesDekkera una de estas investigaciones fue realizada en Centre
Europeacuteen des Sciences du Goucirct en Talence Francia en el cual se evaluaron 50
vinos bordeaux sensorialmente para demostrar la complejidad del ldquoCaraacutecter Brett‟‟
al cual se unen otros compuestos aromaacuteticos ademaacutes de los fenoacutelicos como acido
isobutirico e isovalerico en este tipo de vino debido a sus caracteriacutesticas
fisicoquiacutemicas50
De los meacutetodos de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera los medios
selectivos son muy populares es por esto que el Laboratorio de Microbiologiacutea
Departamento de Botanica e Engenharia Biologica Instituto Superior de
Agronomia Lisboa Portugal realizo un trabajo en el cual se pretendia desarrollar
un medio selectivo o diferencial capaz de aislar la levadura
BrettanomycesDekkera del vino y de la cadena productiva del vino con el fin de
detreminar la relacioacuten entre esta levadura y los compuestos 4-etilfenol y 4 etil-
guayacol51 otro estudio realizado para la deteccioacuten de dicha levadura fue
realizado en la Escola Superior de Biotecnologiacutea Universidade Catoacutelica
Portuguesa el desarrollo de un simple procedimiento compatible con las rutinas
50 Andrea Romano a Marie Claire Perello a Aline Lonvaud-Funel Gilles Sicard Gilles de Revel2008 Sensory
and analytical re-evaluation of lsquolsquoBrett characterrdquo Journal Food Chemestry No 114 pag 15-19 Talence
France
51 N Rodrigues G Gonccedilalves S Pereira-da-Silva M Malfeito-Ferreira and V Loureiro2001 Development
and use of a new medium to detect yeasts of the genera DekkeraBrettanomyces Journal of applied microbiology No 90 pag 588-599Lisboa Portugal
37
usadas en las vineras para la deteccioacuten de BrettanomycesDekkera en vino y en
maquinarias52
En el laboratorio de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas Alcohoacutelicas de la
Universidad de Zagreb se ha trabajado anteriormente en el desarrollo de medio
solido selectivo con pruebas de diferentes concentraciones de los compuestos
como resultados se encuentra una buen relacioacuten entre las concentraciones de los
compuestos sin embargo como recomendaciones se encuentran la falta de
antibioacutetico para evitar contaminacioacuten por bacterias probar con diferentes fuentes
de carbono para comparacioacuten de tiempo de crecimiento positivo y un monitoreo
diario en el medio53
Los compuestos aromaacuteticos que libera la presencia de BrettanomycesDekkera
estaacute asociada a los compuestos 4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinilfenol y 4
viniguayacol a partir de esto los centros de investigacioacuten han hondado en la
identificacioacuten de dichos compuestos relacionados en la enologiacutea y especialmente
con BrettanomycesDekkera a partir de eso el Departamento de Quiacutemica
Universidad de La Rioja Espantildea este estudio presenta un meacutetodo basado en el
uso de Cromatografiacutea de Gas y micro extraccioacuten en fase solida para el anaacutelisis
cuantitativo de 4-etilfenol 4-etil guayacol 4-vinilfenol 4-vinilguayacol
Demostrando la existencia de un efecto matriz en el anaacutelisis de compuestos
responsables del ldquocaraacutecter Brettrdquo en vino Este nuevo meacutetodo fue
satisfactoriamente aplicado a cierto nuacutemero de vinos tintos comerciales vinos
52
JA Couto A Barbosa and T Hogg 2005 A simple cultural method for the presumptive detection of the yeasts BrettanomycesDekkera in wines Letters in Applied Microbiology No 41 pag 505-510 Porto
Portugal
53 Serkovic Dubravka Gracin Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac
Brettanomyces bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet pag 1-117 ZagrebCroatia
38
blancos y roseacute Este meacutetodo puede ser una alternativa para evitar el efecto matriz
en muestras de vino54
De acuerdo con este tema en la jornada cientiacutefica del 99 el grupo de investigacioacuten
enoloacutegica se estudio la formacioacuten de sustancias volaacutetiles por 13 cepas de S
cerevisiae con buenas aptitudes enoloacutegicas inoculadas individualmente en un
mosto homogeacuteneo de la variedad airen fermentado en las mismas condiciones
de aireacioacuten y a temperatura controlada55
54
C Pizarro N Perez-del-Notario JM Gonzalez-Saiz 2007 Determination of Brett character responsible
compounds in wines by using multiple headspace solid-phase micro extraction Journal of Chromatography
No 1143 pag 176-181 La Rioja Espantildea
55 E Pueyo P Hidalgo K Fernaacutendez y P Martiacuten-Aacutelvarez 1999 Anaacutelisis de compuestos volaacutetiles en vinos
obtenidos con distintas cepas de Saccharomyces cerevisiae Aplicacioacuten de la teacutecnica de microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientificas 99 Grupos de Investigacion Enologica Zaragoza Espana
39
7 MATERIALES Y METODOS
A continuacioacuten se presentan materiales y meacutetodos para la investigacioacuten
Este proyecto fue realizado en su gran mayoriacutea en las instalaciones de la
Universidad de Zagreb en la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos
(PBF) Laboratorios del Departamento de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas
Alcohoacutelicas ubicado en la ciudad de Zagreb Croacia
Los anaacutelisis fisicoquiacutemicos del vino tinto Babic fueron realizados en los
laboratorios de VINOLAB ubicado en Zagreb Croacia
71 MEDIO SOLIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera
711 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Autoclave de laboratorio
Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa Etanol peptona extracto de levadura
agar cicloheximida acido cumaacuterico ampicilina)
Balanza electroacutenica de precisioacuten
Microscopio oacuteptico
712 Metodologiacutea
Basados en estudios anteriores realizados en el laboratorio para el desarrollo de
medio solido selectivo para BrettanomycesDekkera (Serkovic Dubravka Gracin
40
Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac Brettanomyces
bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet Universidad de Zagreb pag 1-
117 Zagreb Croacia) se evaluaron las recomendaciones mencionadas en dicha
investigacioacuten para la mejoriacutea y desarrollo de otros medios soacutelidos selectivos
Se usoacute como base el medio YPD (Yeast Peptone Dextrose) el cual estaacute
compuesto de la siguiente forma 20gL peptona 10 gl extracto de levadura 20 gl
de agar56 este medio es selectivo para levaduras pero no es selectivo entre ellas
Es necesario el uso de una fuente de carbono para la levadura
BrettanomycesDekkera de acuerdo a la teoriacutea y revisando la tabla 1 (Relacioacuten de
los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) y seguacuten
facilidades de disponibilidad en el laboratorio se utiliza glucosa la cual es
utilizable por entre 75-100 de las cepas de BrettanomycesDekkera seguacuten la
tabla mencionada anteriormente
Esta fuente de carbono (Glucosa) fue probada en una concentracioacuten de 20 gL
Cicloheximida fue probada a 30 mgL para inhibir Saccharomyces en el medio y
darle mayor selectividad para Brettanomyces Dekkera Se antildeade acido p-
cumarico en una concentracioacuten de 100 mgL como precursor para la formacioacuten
del compuesto 4 etilfenol caracteriacutestico de la levadura BrettanomycesDekkera
Para inhibir bacterias en el medio se usa ampicilina a 10 mgL esta se agrega
despueacutes de realizada la esterilizacioacuten y cuando la temperatura del medio este
igual o menor a 40C El pH del medio se ajusto a 5
Paralelamente se crea el medio con Etanol como fuente de carbono en una
concentracioacuten de 6 o 60 mlL con la misma concentracioacuten de los otros
compuesto como cicloheximida 30mgL acido cumarico 100mgL 20 gL peptona
10 gL de extracto de levadura 16gL de agar Este medio se crea como
56
Concentraciones preestablecidas en el laboratorio de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas alcoholicas
41
comparativo para determinar cual fuente de carbono es la maacutes utilizada por la
levadura Brettanomyces bruxellensis para su reproduccioacuten Seguacuten la teoriacutea (ver
tabla 1) el etanol es utilizado por entre 25-75 de las cepas de
BrettanomycesDekkera pero es el azuacutecar que se encuentra en mayor
concentracioacuten presente en los vinos tintos aproximadamente 130 gl57
Estos medios fueron debidamente esterilizados para eliminar cualquier
microorganismo o espora presente en este Este procedimiento se realizo por el
meacutetodo de combinacioacuten de altas temperatura y presioacuten (Autoclave 121 C a 1034
kPa)
Se usaron colonias de BrettanomycesDekkera aisladas anteriormente de vinos
contaminados y guardas para investigaciones en el Departamento de Tecnologiacutea y
Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos
Universidad de Zagreb Croacia
Los medios fueron monitoreados visualmente todos los diacuteas y se toman
observaciones de macroscoacutepicas y microscoacutepicas Se comparan estos dos medios
en teacuterminos de rapidez de crecimiento de la levadura y selectividad Estas
muestras fueron incubadas a 28C por 10 diacuteas
La prueba fue realizada por duplicado en diferentes tiempos
57
Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
42
72 MEDIO LIacuteQUIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera
721 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Frascos de vidrio esteacuteriles
Autoclave de laboratorio
Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa peptona extracto de levadura
cicloheximida acido cumarico ampicilina etanol)
Microscopio oacuteptico
Balanza electroacutenica de precisioacuten
722 Metodologiacutea
En el mercado para enologiacutea existen medio liacutequidos selectivos para la deteccioacuten
de BrettanomycesDekkera en vinos sin embargo estos son de difiacutecil accesibilidad
por sus elevados precios es por esto que se desarrolla un medio liquido selectivo
para dicha levadura en el laboratorio del Departmaneto de Tecnologiacutea y Anaacutelisis
de Bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia
Para este medio se toma como base el medio selectivo con Glucosa como fuente
carbono desarrollado anteriormente sin usar agar para mantener el medio en su
estado liquido
43
La composicioacuten de este medio liacutequido es la siguiente
20 gL Glucosa
20 gL peptona
10gL extracto de levadura
30mgL de cicloheximida
100mgL acido p-cumarico
10 mgL ampicilina
Estos compuestos fueron medidos en una balanza electroacutenica de precisioacuten se
antildeade 250 ml de agua destilada y se mezcla constantemente se pasa a proceso
de esterilizacioacuten en autoclave a 120C y 1034 KPa por 45 minutos
De esta forma se asegura la usencia de microorganismos yo esporas en el
medio Despueacutes de bajar la Temperatura a 40C se agrega a la mezcla ampicilina
en una concentracioacuten de 10mgL
En frascos de vidrio esteacuteril se agrega 40 ml de medio liacutequido y diferentes
cantidades iniciales de levaduras BrettanomycesDekkera fueron inoculadas al
respectivo medio el primer frasco tiene una cantidad de 106 ceacutelulasml el segundo
tiene 104 ceacutelulasml el tercero tiene 102 celulasml y el cuarto con una cantidad
aproximada de 25 ceacutelulasml Estas cantidades estaacuten basadas en estudios
anteriores para medios liacutequidos selectivos en levaduras58
58 J Ungar A M James P W Muggleton H F Pegler y E G Tomich1950 The Cultivation of
Haemophilus pertussis in Partially Defined Liquid Media Journal of General Microbiology No 4
pag 345-359 Greenford
44
Este medio liacutequido inoculado fue inspeccionado diariamente visualmente revisioacuten
de turbidez microscoacutepicamente y olfativamente para deteccioacuten de olores del
ldquocaraacutecter Brettrdquo
Los diacuteas fueron contabilizados para determinar resultados positivos en estos
ensayos
73 INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN
VINO TINTO DE LA REGION DE DALMACIA CROACIA
731 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Medio selectivo solido para BretanomycesDekkera
Medio selectivo Liquido para BrettanomycesDekkera
Quiacutemicos de laboratorio (Dioxido de Azufre (SO2) Antibrettreg Glucosa)
Vino Babic 2007
Anallizador infrarojo Bacchius II microdom
732 Metodologiacutea
Con los medios desarrollados (solido y liquido) se quiere conocer el efecto del
dioacutexido de azufre (SO2) y el producto Antibrettreg en la levadura
BrettanomycesDekkera presente en el vino tinto de la regioacuten de Dalmacia
Con las herramientas que se tienen en el laboratorio del departamento de
tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia se quiere
determinar la influencia de estos productos en la levadura BrettanomycesDekkera
presente en vino tinto croata de la regioacuten de Dalmacia Babic
45
El primer paso es adaptar la levadura al vino tinto croata (Babic) para esto se
inoculan 20 colonias de BrettanomycesDekkera en 500 ml de vino se antildeadioacute
glucosa en una concentracioacuten de 2gL y se oxigena la mezcla Para este paso de
adaptacioacuten se dejan las muestras de 1 a 2 diacuteas a temperatura ambiente (20C)
Despueacutes de este periodo se revisa microscoacutepicamente la presencia positiva de
BrettanomycesDekkera en los 500 ml de vino en los que se estaba haciendo el
paso de adaptacioacuten en Babic al comprobar su presencia positiva se procede a
mezclar los 500 ml de vino contaminado con BrettanomycesDekkera con los 3
Litros de vino Babic que se disponen para esta prueba
Estos 3 litros de vino tinto Babic contaminado con la levadura
BrettanomycesDekkera se reparten en 8 frascos de vidrios esteacuteriles al siguiente
diacutea se toman dos frascos para agregar cada uno de los compuestos a evaluar
(SO2 y Antibrettreg)
Para SO2 se toman dos frascos uno de 600ml y uno de 100ml se agrega una
concentracioacuten de 40 mgl
Para el producto AntiBrettreg se toman cuatro frascos dos de 600 ml y dos de 100
ml seguacuten especificaciones del producto y la alta poblacioacuten de
BrettanomycesDekkera en las muestras se adiciono la maacutexima concentracioacuten de
AntiBrettreg a las muestras la cual fue de 40 gHl
Estas muestras se dejaron a temperatura ambiente simulando condiciones de
almacenamiento del vino en barricas temperatura aproximada de 20C evitando el
contacto con la luz solar y evitando movimientos fuertes Esto se mantuvo por 15
diacuteas que fue el tiempo de duracioacuten del experimento
Con el vino restante se mantuvo en las mismas condiciones de almacenamiento
de los demaacutes para hacer un paralelo de comparacioacuten
Previamente se analizaron las caracteriacutesticas del vino sin contaminar por medio
del analizador infrarrojo Bacchus II microdom antes de agregar los compuestos
46
SO2 y AntiBrettreg y despueacutes se volvioacute a realizar el anaacutelisis para determinar los
efectos de estos compuestos en el vino y asiacute mismo al de control
74 DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN
EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO
MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE
741 Materiales
Cromatografo de Gas HP5890 Serie II
Microextractor de fase solida (SPME)
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Quiacutemicos de laboratorio (p-cresolAcetaldehido Propanol diacetil etil-
acetato i-butanol acido aceacutetico i-amil-alcohol n-amil lactato de etilo
acetato amil metiacutelico 1-hexanol etil-hexanol linalol nerol citronelol
geraniol 2-feniletanol octanoato de etilo 4-etilfenol 2-feniletil acetato 4-
etilguaiacol)
Vino Tinto Babic
Agua destilada
742 Metodologiacutea
El meacutetodo fue desarrollado anteriormente en el Departamento de Tecnologiacutea y
Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos de
la Universidad de Zagreb Croacia Y despueacutes de modificaciones fue utilizado en el
desarrollo del trabajo El meacutetodo utilizado es descrito a continuacioacuten
47
Cromatografo de gas HP 5890 SERIES II
Programa HP-chem
a) Condiciones para analisis SPME-GC
Muestra diluida 5050 con adicion de estandar interno (p-cresol1mgl)
25ml de la muestra diluida con mezcla continua a temperatura ambiente
Tiempo de adsorcion 30 minutos
SPME es colocado en la muestra para la adsorcion durante el tiempo
previsto
b) Condiciones para el Cromatografo de gas (GC)
La columna usada en este experimento es RTXreg-5 (Restec USA sn 210627)
30m id=025mm 025μm
Gas portador Nitrogeno
Flujo del Nitrogeno 5 mlmin
Temperatura del inyector 240 C
Temperatura del detector 250 C
Temperaturas programadas 35 C5 min 150 C 34 Cmin 180 C
10Cmin 190 C 5 Cmin
Se conocen los resultados del cromatografiacutea de gases (ver tabla 10) y se hacen
necesarias varias correcciones del meacutetodo y algunas pruebas con unos
compuestos para determinar realmente su tiempo de retencioacuten en este tipo de
vino Se deben comprobar tiempos de retencioacuten
48
8 DISCUSIOacuteN Y RESULTADOS
81 RESULTADOS PARA EL DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO
Tabla 2 Medio Selectivo con Glucosa como fuente de carbono para
BrettanomycesDekkera en incubacioacuten por 5 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten
microscoacutepica
1 Negativo Negativo - No se realiza
2 Negativo Negativo - Presencia de levaduras
3 Negativo Negativo - Presencia de
Levaduras
4 Aparicioacuten de
algunas colonias
Negativo Transparente Presencia de levaduras
5 Colonias definidas Positivo-
Fenoles
Amarillo Presencia positiva de
BrettanomycesDekkera
49
Este medio tiene alto grado de selectividad para levaduras con un tiempo de
crecimiento de aproximadamente 5 diacuteas en 28C lo que lo hace raacutepido gracias al
antibioacutetico (ampicilina) que hace parte de la composicioacuten del medio no hay
presencia de bacterias Se hace confiable para resultados positivos de levaduras
BrettanomycesDekkera debido a que las levaduras Saccharomyces fueron
inhibidas con el compuesto cicloheximida su selectividad fue comprobada por
revisioacuten microscoacutepica macroscoacutepica y sensorial
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con glucosa como fuente de carboacuten son las
siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
50
Tabla 3 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono para Brettanomyces Dekkera en
incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica
1 Ninguno Negativo - -
2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras y
bacterias
9 Diminutas
colonias
transparentes
Negativo Transparentes Presencia de levaduras y
algunas bacterias
10 Positivo Positivo-
Fenoacutelicos
Amarillo Presencia de levaduras
BrettanomycesDekkera y
bacterias
El medio selectivo para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de
carbono tambieacuten es selectiva entre levaduras ya que solo se identifico la levadura
BrettanomycesDekkera en este sin embargo se evidencia una presencia de otro
microorganismo presuntamente bacteria ya que este medio no contiene agente
antibacteriano (ampicilina) Es necesaria la adicioacuten de ampicilina en una
concentracioacuten de 10mgl para inhibir la presencia de bacterias
Este medio presenta un tiempo maacutes prolongado para mostrar crecimiento de la
levadura BrettanomycesDekkera aproximadamente 10 diacuteas
51
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las
presentadas en el medio selectivo con glucosa como fuente de carbono y son las
siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
52
Tabla 4 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono y adicioacuten de ampicilina para
Brettanomyces Dekkera en incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica
1 Ninguno Negativo - -
2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
9 Diminutas
colonias
transparentes
Negativo Transparentes Presencia de levaduras
10 Positivo Positivo-
Fenoacutelicos
Amarillo Presencia de levaduras
BrettanomycesDekkera
El efecto de la ampicilina sobre el medio selectivo con etanol como fuente de
carbono fue el esperado inhibioacute completamente el crecimiento de colonias
bacterianas en el medio el tiempo de crecimiento de la levadura y presencia de
aromas fenoacutelicos fue el mismo de 10 diacuteas en incubacioacuten de 28C
53
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las
presentadas anteriormente y son las siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
82 RESULTADOS PRUEBAS MEDIO LIQUIDO
Tabla 5 Influencia de la concentracioacuten de levaduras BrettanomycesDekkera en el
tiempo necesario para detectar la produccioacuten de 4-etil-fenol en medio liquido
Nuacutemero de ceacutelulas ml
(concentracioacuten final)
Tiempo necesario para obtener resultados
positivos (diacuteas)
1 Experimento
32x106 le 3
3 X 104 3
33x102 7
40 No detectado
2 Experimento
43x106 le3
39x104 le3
37x102 8
62 No detectado
54
El nuacutemero de ceacutelulas de levadura de BrettanomycesDekkera fue contabilizado
usando contador de ceacutelulas Chamber
Los aromas fenoacutelicos son difiacuteciles de detectar debido al fuerte olor que tiene el
medio liquido caracteriacutestico de sus componentes esto dificulta la identificacioacuten del
ldquocaraacutecter Brettrdquo en especial cuando las concentraciones de
BrettanomycesDekkera no son elevadas Ademaacutes de los olores fenoacutelicos otros
compuestos volaacutetiles se detectan tales como acido aceacutetico y olores oxidativos
tambieacuten producido por la levadura BrettanomycesDekkera
En la inspeccioacuten visual se detecta alta turbidez en el medio Se compara con un
medio sin presencia de BrettanomycesDekkera
En las muestras con mayor concentracioacuten de la levadura es maacutes notoria la
turbidez Despueacutes de 3 diacuteas se presenta un precipitado blanco en todas las
muestras de altas concentraciones
La revisioacuten microbioloacutegica se realiza diariamente para determinar el nuacutemero de
ceacutelulas y la presencia positiva de la levadura a evaluar
Entre los dos experimentos realizados con el medio liquido el tiempo que se
demoro en detectar compuestos fenoacutelicos fue muy similar entre ellos
dependiendo del nuacutemero de ceacutelulas en el medio en mayores concentraciones el
tiempo de deteccioacuten fue menor
Hay que sentildealar que BrettanomycesDekkera debe alcanzar una concentracioacuten
miacutenima (denominada poblacioacuten criacutetica) de 103 UFCml para comenzar a liberar etil
fenoles Por debajo de esta concentracioacuten la levadura seriacutea metaboacutelicamente
activa pero no produciraacute compuestos alterantes a niveles detectables esto se ve
reflejado en los resultados en los que las concentraciones de ceacutelulas son muy
bajas
55
Estos resultados se comparan con los resultados dados en el medio solido Los
dos medios muestran altos grados de selectividad hacia la levadura
BrettanomycesDekkera y similar comportamiento para el crecimiento de dicha
levadura
En el medio liacutequido cuando hay altas concentraciones de BrettanomycesDekkera
el tiempo de deteccioacuten del microorganismo es menor que con el medio solido pues
en el liacutequido es aproximadamente 3 diacuteas y en el soacutelido son 5 diacuteas
83 RESULTADOS DE LA INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE
(SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO DE LA REGION DE
DALMACIA CROACIA
El vino fue analizado antes de la adicioacuten de los compuestos quiacutemicos a evaluar y
15 diacuteas despueacutes de adicioacuten para ver la reaccioacuten de este frente a SO2 y Antibrettreg
estas caracteriacutesticas se determinaron con el equipo de laboratorio Bacchus II
Microdom localizado en el laboratorio Vinolab doo Zagreb Croacia Los
resultados se muestran en la tabla
Tabla 6 Resultados de las muestras de vino inoculados con la levadura BrettanomycesDekkera
durante 15 diacuteas Comparativos con los diferentes compuestos
CFUml
Vino Day 1 Day 4 Day 10 Day 15
Control 130E+04 800E+03 700E+03 500E+03
Control 800E+03 640E+03 700E+03 280E+03
SO2 110E+04 400E+02 400E+02 67
SO2 900E+03 380E+03 270E+03 183
Antibrett 140E+05 920E+04 140E+04 400E+03
Antibrett 210E+05 181E+05 160E+04 900E+03
Antibrett 120E+05 990E+04 120E+04 100E+03
Antibrett 230E+05 204E+05 300E+03 200E+03
56
Tabla 7 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 antes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o
Antibrettreg Diacutea 0
Alcohol
()
Acidez Total
(gr Aci
Tartaacuterico L)
Acidez volaacutetil
(Aci
AceacuteticoL)
Densidad
(grml)
Azuacutecar residual
(grl)
Extracto
seco
(grl)
Acido
Laacutectico
(grl)
Glicerol
(grl)
Taninos
(grl)
Acetato
(grl)
1473
525
083
09928
473
332
164
799
305
117
1471
522
084
09927
479
329
162
786
299
116
Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
Tabla 8 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 despueacutes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o
Antibrettreg Diacutea 15
Alcohol
()
Acidez Total
(gr Aci
Tartaacuterico L)
Acidez volaacutetil
(Aci
AceacuteticoL)
Densidad
(grml)
Azuacutecar residual
(grl)
Extrac
to seco
(grl)
Acido
Laacutectico
(grl)
Glicerol
(grl)
Taninos
(grl)
Acetatos
(grl)
Control
1414
565
107
09935
436
364
177
827
259
136
Control
1415
556
108
09936
420
365
170
824
256
137
SO2
1456 543 108 09932 476 369 167 803 281 125
SO2
1457
542 108 09933 472 370 170 804 271 124
Antibrett 1454 533 106 09933 448 371 175 813 277 125
Antibrett 1455 534 105 09933 460 372 171 809 282 124
Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
57
Figura 4 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en el vino de control para
evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas
El comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en la prueba por
duplicado en el vino de control fue muy similar pues con el tiempo esta levadura
deja de reproducirse y va muriendo cuando las condiciones ya no son aptas para
su desarrollo debido a que la mayoriacutea de su fuente de carbono (Glucosa) esta
consumida sin embargo esta levadura no llega a su desaparicioacuten total lo que
representa uno de los mayores problemas en la elaboracioacuten del vino
Esta levadura tiene un metabolismo lento y el factor tiempo es un requisito
fundamental para su desarrollo este experimento se empezoacute con una alta
poblacioacuten de BrettanomycesDekkera (130 x 104 UFCml y 8 x 103 UFCml
respectivamente) y durante el transcurso del tiempo la poblacioacuten fue disminuyendo
debido a la perdida de las condiciones necesarias para la reproduccioacuten
58
Figura 5 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de SO2 en
concentracioacuten de 40 mgl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas
El SO2 tuvo un comportamiento efectivo y raacutepido contra las colonias de
BrettanomycesDekkera La poblacioacuten de esta levadura se redujo de forma
significativa entre el diacutea primero y el cuarto se encontroacute una diferencia porcentual
de 96 en la primera prueba y del 60 en la de duplicado al diacutea 15 ya la
poblacioacuten era casi nula pasando raacutepidamente de un numero por encima de la
poblacioacuten critica de la levadura BrettanomycesDekkera a un numero lt103 UFCml
siendo muy eficaz y raacutepido en el manejo de produccioacuten
Este compuesto ademaacutes de favorecer la extraccioacuten de los compuestos fenoacutelicos y
de su actividad antioxidante al inhibir la accioacuten de las polifenoloxidasas a dosis
adecuadas de un maacuteximo de 50gl inhibe la multiplicacioacuten bacteriana y de
levaduras
59
Figura 6 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de
Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo
de 15 diacuteas
Figura 7 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de
Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo
de 15 diacuteas
El compuesto Antibrettreg en la primera prueba tanto como en el duplicado tuvo su
mayor tiempo de reduccioacuten de UFCml entre los diacuteas 4-10 con una diferencia
porcentual de 91 en comparacioacuten con el diacutea cuarto al decimo a diferencia de
60
SO2 el cual presenta la gran disminucioacuten de colonias entre los primeros diacuteas de
agregarse el producto
El tiempo para que la poblacioacuten de la levadura llegara a la cantidad menor a la de
la poblacioacuten critica es mucho mayor que la del compuesto SO2 sabiendo que esta
poblacioacuten debe ser lt103 UFCml
El compuesto Antibrettreg puede tardarse 4-10 diacuteas en representar una reduccioacuten
de UFCml significativa en dicho tiempo puede representar grandes peacuterdidas
nutricionales y altos costos de produccioacuten para la fabricacioacuten
Figura 8 Comportamiento del contenido de alcohol en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin adicioacuten)
hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
BrettanomycesDekkera estaacute presente en vinos de alto contenido alcohoacutelico
aproximadamente entre 125 a 14 pues esta levadura toma a etanol como
fuente de carbono y este vino (Babic) procede de uvas muy maduras las cuales
presentan mayor cantidad de azuacutecares residuales (como glucosa y fructosa y
otras pentosas residuales)
138
14
142
144
146
148
Alcohol
Day 0 Day 15
61
Analizando el comportamiento del vino durante el experimento de 15 diacuteas sin
compuestos quiacutemicos y con SO2 y Antibrettreg a partir de las caracteriacutesticas
iniacuteciales que se determinaron seguacuten el equipo BACCHUS analizador infrarrojo se
presenta en general una reduccioacuten del contenido alcohoacutelico de este vino pero se
ve una mayor reduccioacuten en el vino de control el cual redujo en un 394 su
contenido alcohoacutelico desde el dia 0 hasta el diacutea 15 este vino no tiene ninguacuten
compuesto contra la levadura BrettanomycesDekkera y por su elevada presencia
en los 15 diacuteas de experimento consumioacute esta cantidad de etanol
Mientras en el vino que conteniacutea SO2 tras 15 diacuteas de tratamiento se vio una
reduccioacuten de alcohol de 1 ya que este compuesto redujo la cantidad de
BrettanomycesDekkera en los primeros diacuteas de tratamiento previniendo su
reproduccioacuten y protegiendo el contenido alcohoacutelico del vino Babic 2007
En los vinos de prueba con Antibrett reg la reduccioacuten alcohoacutelica se dio en un
porcentaje de 122 un poco maacutes alta que con SO2 y mucho maacutes baja en
comparacioacuten del vino de control este compuesto tambieacuten previno la gemacioacuten de
la levadura evitando la perdida de etanol en el vino sin embargo como este
compuesto duro mas en este proceso de eliminar BrettanomycesDekkera se
produjo una mayor peacuterdida alcohoacutelica
62
Figura 9 Comportamiento del contenido de acidez volatil en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin
adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
Debido a la presencia de oxigeno en los frascos la acidez volaacutetil aumento pero no
significativamente en las muestras No hubo grandes diferencias entre las
muestras con compuestos y las de control por lo que se deduce que estos
compuestos no ayudan a evitar esta acidez Esta acidez tan alta puede dantildear la
calidad del vino de forma casi irreparable Pero el factor oxigeno es de los maacutes
controlados en la produccioacuten de vinos
la alteracioacuten del aumento de la acidez volaacutetil no estaacute relacionada con la levadura
BrettanomycesDekkera sino a la presencia de oxigeno en el almacenamiento el
oxigeno fue usado en esta prueba para promover condiciones apropiadas para el
desarrollo de la levadura
002040608
112
Acidez Volatil
Day 0 Day 15
63
Figura 10 Comportamiento del contenido de Acido Acetico en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin
adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
Brettanomyces Dekkera son productores de aacutecido aceacutetico y elevan el contenido
de los vinos anormalmente en condiciones de anaerobiosis En condiciones de
aerobiosis producen concentraciones bajas o nulas de aacutecido aceacutetico
Este acido aceacutetico al igual que los fenoles afecta el sabor y el perfil olfativo del
vino tinto este efecto es tambieacuten producido por la levadura
BrettanomycesDekkera vemos en los resultados el gran crecimiento de este
compuesto en el vino control el cual no tenia compouestos en contra de
BrettanomycesDekkera lo que produjo este aumento significativo del acido aceacutetico
en comparacioacuten con estos que teniacutean SO2 y Antibrettreg entre ellos la diferencia en
este compuesto es muy reducida y no significativa pues estos compuestos no
permitieron la gemacioacuten de esta levadura y esta no produjo este acido en esa gran
cantidad
A este compuesto se le atribuye el olor y sabor a vinagre del vino tinto un defecto
muy comuacuten y poco agradable para el consumidor
105110115120125130135140
Acido Acetico
Day 0 Day 15
64
Figura 11 Comportamiento del contenido de Azucares reductores en vino Babic 2007
desde el diacutea 0 (sin adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en
comparacioacuten con el vino de control
BrettanomyesDekkera utiliza los azucares residuales como fuente de carbono
para su crecimiento en el vino este es el factor maacutes importante para su desarrollo
y este es el que determina en cierto caso la cantidad de levaduras de
BretanomycesDekkera presente en las graficas se determina claramente que en
el vino de control donde la cantidad de esta levadura es muy alta 15 diacuteas despueacutes
de empezar las pruebas la cantidad de azucares reductores es muy baja y ha
bajado en un porcentaje de 10 mientras que el vino que tiene SO2 bajo la
cantidad de azucares reductores en un 042 y el vino que tiene el compuesto
Antibrettreg redujo su nivel de azucares reductores en 462
38
4
42
44
46
48
5
Azucares Reductores
Day 0 Day 15
65
84 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE
CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON
EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID
PHASE
Tabla 10 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en
vino Babic 2007 con el meacutetodo propuesto
Compuesto Tiempos de
retencioacuten (min)
Acetaldehiacutedo 1437
Propanol 3759
Diacetil 4202
Etil-acetato 4523
i-butanol 6232
Acido Aceacutetico 7840
i-amil alcohol 11740
n-amil 13489
lactato de etiacutelico 15741
acetato amil metiacutelico 17796
1-hexanol 19101
etil-hexanol 24456
Linalol 30370
2-feniletanol 32768
p-cresol 33522
octanoato de etilo 34226
4-etilfenol 37100
2-feniletil acetato 32769
4-etilguayacol 39704
4 vinilfenol 40529
decanoato de etilo 42117
Refirieacutendose a estos resultados es necesaria la creacioacuten de soluciones estaacutendar
para determinar tiempos de retencioacuten con el meacutetodo y si es necesario ajustes a
este
66
Tabla 11 Soluciones estaacutendar para compuestos en vinos tintos Croatas
MODEL 0
(en volumen de 100 ml en 40 Etanol)
Compuesto Pureza Cantidad
(g)
Concentracioacuten (gl)
Acetaldehiacutedo 099 1623 160677
Propanol 0995 13849 137718
Diacetil 098 01071 104958
Etil-acetato 0995 30172 3002114
i-butanol 099 15016 1486584
Acido Acetico 0995 0 0
i-amil alcohol 099 20116 1991484
n-amil 098 15442 1513316
lactato de etilio 098 00507 049686
acetato amil metilico 098 01028 100744
1-hexanol 098 00367 035966
etil-hexanol 098 00308 029876
Linalol 097 00288 027936
Nerol 097 00311 030478
Citronelol 098 0031 03038
Geraniol 098 15803 1548694
2-feniletanol 098 00402 039396
4-etilfenol 098 00812 078764
octanoato de etilo 097 00597 059103
2-feniletil acetato 099 00315 031185
4-etilguayacol 098 00803 079674
Fuente Laboratorio de anaacutelisis e investigacioacuten de bebidas Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea
de Alimentos Universidad de Zagreb Zagreb Croacia 2009
Las soluciones estaacutendar se realizan teniendo como referencia las cantidades de
estos compuestos en los vinos tintos croatas datos suministrados por el Doctor
Leo Gracin en concentraciones de gl a partir de este dato y teniendo en cuenta
67
la pureza de los compuestos que se teniacutean en el laboratorio de anaacutelisis e
investigacioacuten de bebidas se crean las soluciones estaacutendar Ejemplo
Solucioacuten estaacutendar para 4 etil-fenol en un volumen de 100 ml
Con estas soluciones estaacutendar se realizo el tiempo de retencioacuten para corroborar el
meacutetodo Los resultados de esto fueron tiempos de retencioacuten diferentes a los del
meacutetodo primero con el que se realizaron los ensayos y a partir de esos resultados
se ajusto el meacutetodo con el que se trabajo
68
Tabla 12 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en
vino Babic 2007 con el meacutetodo modificado
Compuesto Tiempos de
retencioacuten (min)
Acetaldehiacutedo 1542
Propanol 4046
Diacetil 4733
Etil-acetato 4807
i-butanol 6659
Acido Acetico 8343
i-amil alcohol 12123
n-amil 13866
lactato de etilio 16072
acetato amil metilico 18336
1-hexanol 19447
etil-hexanol 24835
Linalol 31831
2-feniletanol 33305
p-cresol 33703
octanoato de etilo 34571
4-etilfenol 37724
Citronelol 38326
Nerol 38576
2-feniletil acetato 39012
Geraniol 39944
4-etilguayacol 40271
4 vilifenol 41168
decanoato de etilo 42657
69
DIA 0
Se coloca ISTD a todas las muestras respectivas para poder determinar
cantidades de los compuestos aromaacuteticos
Se realiza la cromatografiacutea de gas al vino Babic 2007 antes de ser inoculado con
BrettanomycesDekkera
Tabla 13 Resultados de la cromatografiacutea de gas del vino Babic 2007
Compuesto Tiempo de retencioacuten
min
Cantidad
mgl
Acetaldehiacutedo 1542 0
Propanol 4046 0
Diacetil 4733 37215204
Etil-acetato 4807 0
i-butanol 6659 0
Acido Aceacutetico 8343 2817465
i-amil alcohol 12123 16799019
n-amil 13866 26
lactato de etiacutelico 16072 10983961
acetato amil metiacutelico 18336 0185196
1-hexanol 19447 264655
etil-hexanol 24835 0158751
Linalol 31831 0
2-feniletanol 33305 4235560
p-cresol 33703 1
octanoato de etilo 34571 0152412
4-etilfenol 37724 00581345
Citronelol 38326 00439729
Nerol 38576 00344799
2-feniletil acetato 39012 00407983
Geraniol 39944 0
4-etilguayacol 40271 0
4 vilifenol 41168 0
Decanoato de etilo 42657 00190144
70
Basados en los compuestos aromaacuteticos que brinda el ldquoCaraacutecter Brettrdquo se van a
analizar detalladamente los siguientes aromas 4-Etilfenol 4-Etilguayacol 4-
Vinylfenol
Figura 12 Compuestos aromaticos en vino tinto Babic sin estar contaminado con la levadura
BrettanomycesDekkera
El vino a analizar esta por debajo de las concentraciones consideradas como
perjudiciales para el aroma del vino tinto (El umbral sensorial del 4-etilfenol es de
230 μgl y el del 4-etilguaiacol es de 47 μgl) pues posee una concentracion de
58microgL de 4etilfenol 0 microgL de 4 etilguayacol y 0 microgL de vinylfenol
841 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGUacuteN TEMPERATURAS
DE ALMACENAMIENTO
0
02
4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinylfenol
Vino 00581345 0 0
C (
mg
L)
Vino Babic 2007 Dia 0
71
Tabla 14 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el
ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 20C por 4 diacuteas Prueba por duplicado
MUESTRAS INCUBADA A 20C
Compuesto Day 1
Amount
(mgL)
Day 2
Amount
(mgL)
Day 3
Amount
(mgL)
Day 4
Amount
(mgL)
4-etilfenol 0260244 017294 0177547 020156
4-etilfenol 0260244 0245915 0204542 0262499
4-etilguayacol 0 0 0 0
4-etilguayacol 0 0 0 0
4 vinilifenol 1107096 781349 685317 460323
4 vinilifenol 1107096 1297465 621324 693225
72
Figura 13 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
BrettanomycesDekkera es la levadura responsable de la produccion de 4-etil-
fenol compuesto asociado con olores caracteristicos a ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 00581345 0260244 0172935 0177547 020156
C (
mg
L)
4 etilfenol
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 00581345 0260244 0245915 0204542 0262499
C (
mg
L)
4 etilfenol
73
caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo dantildeando la calidad sensorial del vino tinto Babic la
produccioacuten de este compuesto en esta muestra realizada por duplicado fue
ascendente y tuvo incremento muy grande en el primer dia de almacenamiento y
en el transcurso de los siguientes cuatro diacuteas se mantuvo relativamente estable lo
cual no concuerda con el comportamiento tiacutepico de esta levadura quien tiene un
crecimiento lento e incrementa la produccioacuten de fenoles con su gemacioacuten esto
genera muchas dudas sobre el buen funcionamiento del equipo GC o de la
estabilidad de las levaduras BrettanomycesDekkera en este almacenamiento
Figura 14 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar prueba por duplicado
002040608
1
Vino Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0 0 0
4 etilguayacol
002040608
1
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0 0 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
74
Presencia negativa de 4 etil guayacol durante todo el almacenamiento
probablemente las condiciones de almacenamiento y el medio no dieron lugar al
desarrollo de este compuesto el cual se considera menos conflictivo que el 4-etil-
fenol
Figura 15 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
Estos resultados tambieacuten dejan dudas del normal comportamiento de dicha
levadura pues indican que la levadura no convirtioacute este compuesto en etilfenol
0
2
4
6
8
10
12
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 110709781349685317460323
4 vinylfenol
0
2
4
6
8
10
12
14
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
Series1 0 11071 12974 62132 69322
C (
mg
l)
4 Vinylfenol
75
durante el almacenamiento caracteriacutestica que solo la levadura
BrettanomycesDekkera puede realizar se ve que las concentraciones de
vinylfenoles son mucho mas altas que las de fenoles lo que nos deja determinar
que la poblacioacuten de BrettanomycesDekkera es muy baja y existen otras levaduras
productoras de vinylfenoles en este tipo de vino en las condiciones de
almacenamiento dadas para estas pruebas
Tabla 16 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el
ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 28C por 4 diacuteas
MUESTRA 2 INCUBADA A 28C
Compuesto Day 1
Amount
(mgL)
Day 2
Amount
(mgL)
Day 3
Amount
(mgL)
Day 4
Amount
(mgL)
4-etilfenol 0260244 019612 0186614 019932
4-etilfenol 0260244 020576 0214917 0193554
4-etilguayacol 0 014304 0223836 0
4-etilguayacol 0 002287 00529832 0
4 vinilifenol 1107096 787068 665182 397847
4 vinilifenol 1107096 284389 00204392 0
76
Figura 16 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar
El desarrollo de este compuesto en el diacutea 1 fue significativo y luego relativamente
estable el comportamiento fue similar en las pruebas de diferentes temperaturas
de almacenamiento para este compuesto el cual es el maacutes problemaacutetico en la
industria viniacutecola
0
005
01
015
02
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 005813019932018661019611019932
4 etilfenol
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 005813 019355 021491 020576 026024
4 etilfenol
77
Figura 17 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar
Los resultados de la prueba son poco confiables y no entendibles por lo que
podemos verificar que el GC no estaacute trabajando de forma adecuada para la
deteccioacuten del compuesto
0001002003004005006
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 Etilguayacol 0 0 0022 0053 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
0005
01015
02025
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0223 0143 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
78
Figura 18 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
El comportamiento de este compuesto en la prueba es muy irregular y poco
confiable
0
2
4
6
8
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 397847665182787068397847
4 vinylfenol
0
2
4
6
8
10
12
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 11071 28438 00204 0
4 vinylfenol
79
Figura 19 Comportamiento del compuesto 4 etilfenol durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
La concentracioacuten de 4 etil fenol fue mayor al cuarto diacutea almacenado a
temperatura ambiente de 20C pero este compuesto no tuvo una actividad notoria
de ascenso durante su almacenamiento como se esperaba lo que deja muchas
dudas sobre los resultados de este ensayo
0
05
1
15
2
25
3
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etil fenol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 20C
80
Figura 20 Comportamiento del compuesto 4 etil guayacol durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
Comportamiento anormal del compuesto no se ve tendencias de aumento o
disminucioacuten de este en ninguna de las pruebas no tiene un comportamiento
regular pues se esperaba que la levadura BrettanomycesDekkera
descarboxinizara el compuesto 4-vinilguaiacol y aumentar las concentraciones de
4-etilguaiacol esta reaccioacuten no se hizo notoria en los compuestos aromaacuteticos
seguacuten lo determino el Cromatografo de Gas (GC)
0
005
01
015
02
025
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3
C (
mg
L)
4 etil guayacol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 20C
81
Figura 21 Comportamiento del compuesto 4 Vinyl fenoll durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
La no presencia de este compuesto en el vino original demuestra las baja o casi
nula presencia de la levadura BrettanomycesDekkera al diacutea primero este
compuesto incrementa de forma notoria en las muestras debido a la presencia de
acido cumaacuterico en el medio ya que sufre su carboxilacion convirtieacutendose en 4 vinyl
fenol sin embargo su comportamiento no fue regular y presento problemas de
lecturas
0
2
4
6
8
10
12
14
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
C (
mg
L)4 Vinyl fenol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 28C
82
9 CONCLUSIONES Y
RECOMENDACIONES
91 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO
Se desarrolloacute un medio selectivo soacutelido para BrettanomycesDekkera
accesible y faacutecil de elaborar
Se detectan colonias de la levadura BrettanomycesDekera en el agar
selectivo con glucosa como fuente de carbono en un lapso de 5 diacuteas en
incubacioacuten a 28C
El medio selectivo soacutelido con Glucosa como fuente de carbono fue maacutes
raacutepido y efectivo ya que toma 5 diacuteas para dar resultados positivos frente al
de Etanol como fuente de carbono el cual toma 10 diacuteas para mostrar
resultados positivos aunque ambos dieron resultados satisfactorios en la
selectividad de la levadura BrettanomycesDekkera
La levadura se adapto de forma satisfactoria a estos medios en
condiciones de almacenamiento propias para su desarrollo (28C)
Las colonias de la levadura BrettanomycesDekkera tiene un crecimiento
en estos medios soacutelidos de forma circular con topografiacutea convexa y borde
entero dimensiones 5-6 mm color Amarillo opacicidad oscuro
83
superficie lisa y suave siendo faacutecil de identificar y realizar los conteos
necesarios
El medio solido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten
de la levadura BrettanomycesDekkera en vino tinto es raacutepido econoacutemico
y uacutetil
El uso de azucares para fermentacioacuten de la levadura
BrettanomycesDekkera que Saccharomyces no puede fermentar para
mayor selectividad
Realizacioacuten de pruebas Bioquiacutemicas como meacutetodo raacutepido de selectividad
92 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DESARROLLO DEL MEDIO LIacuteQUIDO
Se desarrollo un medio selectivo liquido para BrettanomycesDekkera
accesible y faacutecil de elaborar
Este medio mostroacute resultados positivos de la presencia de
BrettanomycesDekkera en un lapso de tiempo menor (3 diacuteas) que con el
medio solido (5 diacuteas) en caso de que el nuacutemero de ceacutelulas de la levadura
BrettanomycesDekkera sea mayor a la poblacioacuten critica (103)
Cuando la poblacioacuten de ceacutelulas de la levadura BrettanomycesDekkera es
menor a la poblacioacuten critica el tiempo de identificacioacuten de esta levadura por
medio liquido es muy prolongado puede tomar maacutes de 10 diacuteas o incluso no
detectarlo
84
Los compuestos quiacutemicos usados para el desarrollo del medio liacutequido no
son los adecuados para este tipo de medios donde los resultados positivos
son olfativos pues estos compuestos emiten fuertes olores que confunden
los olores caracteriacutesticos del caraacutecter Brett
El medio liquido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten
de altas concentraciones de la levadura BrettanomycesDekkera en vino
tinto es raacutepido econoacutemico y uacutetil
93 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg
EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE DALMACIA
CROACIA
Este trabajo mostroacute que el dioacutexido de azufre (SO2) tiene buenos resultados
en contra de la levadura BrettanomycesDekkera en concentraciones
normales de 40mgl concentracioacuten en la que se trabaja este compuesto en
los vinos tintos
En Europa el dioacutexido de azufre es usado de forma tradicional en gran
nuacutemero de alimentos y especialmente en vinos sin embargo y a pesar de
su uso regulado se busca la sustitucioacuten de este o su maacutexima reduccioacuten
para hacer de este producto maacutes sano para las personas no tolerantes a
este tipo de compuestos sin embargo seguacuten el trabajo realizado en
comparacioacuten con el producto Antibrettreg el SO2 es maacutes eficaz en el control
85
de la levadura ayudando a evitarla y eliminarla de la cadena productiva del
vino tinto
Gracias a sus caracteriacutesticas el vino tinto Babic es muy vulnerable a la
levadura BrettanomycesDekkera pero a su vez se puede tratar faacutecilmente
con productos como SO2 y Antibrettreg aunque es maacutes efectivo contra
BrettanomycesDekkera el dioacutexido de azufre (SO2)
Antibrettreg es una buena opcioacuten para el control de BrettanomycesDekkera
para evitar el uso de productos alergenicos como SO2
94 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN
EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO
MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE
Al terminar la primera prueba con anaacutelisis en cromatografiacutea a gas y el SPME
queda como resultados
Es necesario repetir la prueba
No se determina el efecto de los estaacutendares internos sometidos a tiempos
de almacenamiento en temperaturas de 20C y 28C lo que puede dar falsos
resultados de cantidades de compuestos
86
Se debe crear un medio maacutes apto para el desarrollo de la levadura y un
control diario de crecimiento ( agregar maacutes Glucosa en caso de que se
haya consumido toda controlar presencia de Bacterias y otros
microorganismos que no se deseen en el medio)
Es necesario control de aromas con panel sensorial para determinar el
umbral de deteccioacuten en este vino
Control de crecimiento por medio solido Selectivo para
BrettanomycesDekekra conteo de colonias presentes en el vino inoculado
y su desarrollo durante almacenamiento a diferentes temperaturas
La segunda prueba no fue posible realizarla por dantildeos en el equipo de
cromatografiacutea de gas (GC)
87
ANEXOS
11
89
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientiacuteficas 99 Grupos de
Investigacioacuten Enoloacutegica Zaragoza Espantildea
93
11
GRACIAS es una palabra corta para todo lo que quiero expresar a todos aquellos que
hicieron parte de este suentildeo hecho realidadhellip
A Dios y a la virgen Auxiliadora por llevarme de su mano cada diacutea de mi carrera en cada
momento alegre y en cada momento difiacutecil fueron mi fortaleza
A mis papitos por hacer de mi estudio una realidad por su sacrificio y apoyo desinteresado y
sincero
A mi Hermanito por ser mi fortaleza mi ejemplo y mi amigo incondicional
A mi familia Blanco y Urrea por su compantildeiacutea durante esta etapa
A mi facultad (Decano Dr Camilo Rozo Dra Patricia Jimeacutenez y mis profesores) por
ensenarme mi profesioacuten y aportar lo mejor de ustedes para mi formacioacuten personal
A mis asesores de Tesis (Ing Patricia Chaparro y Dr Sc Leo Gracin) por su guiacutea y
colaboracioacuten oportuna
A mis queridos amigos quienes siempre han estado a mi lado en las dificultades y en las
alegriacuteas (Ingrid Mafe Cami G Cami R Harold Pipe Karla Andreacutes T Diego G)
A IAESTE en alianza con el ORI por hacer posible mi intercambio y poder hacer mi tesis en el
maravilloso paiacutes de Croacia
A Croacia por ser mi segundo hogar por abrirme sus puertas y su corazoacuten por brindarme
tan maravillosas personas en mi camino
Croatia Thank you for being my second home for opening your doors and your heart to me
and give me the opportunity to meet so many wonderful people
To my boss my teacher my mentor and specially my friend Leo
To the faculty of food technology and Biotechnology and the department of technology
and analysis of beverages for give me the opportunity to give all my knowledge to the
project and learn a lot more
To all the amazing people I met during this experience (Igor Karin Natka Josip Ana Matija
Daniel Pz Szilvia Dini Daniela Lidija Sanja and everybody else who I had the pleasure to
meet in this great trip) for give me the best of your hearts
I only have one thing to say hellipTHANK YOU
Solo me queda una palabra por decirhellipGRACIAS
11
representan el grupo de microorganismos entre bacterias y hongos respecto a su
tamantildeo de ceacutelula Este grupo es caracterizado por su forma de reproduccioacuten
vegetativa conocida como ldquogemacioacutenrdquo Bajo condiciones optimas una ceacutelula
madre puede gemar varias veces durante el periodo reproductivo Sin embargo
bajo estrictas condiciones de fermentacioacuten una levadura va a gemar solamente
entre tres o cuatro veces Aquiacute la disponibilidad de oxigeno la cual es necesaria
para la formacioacuten de precursores de la membrana de la ceacutelula limita la
replicacioacuten7
Estos microorganismos muestran varios tipos de gemacioacuten lo cual puede dar un
valor diagnostico Entre aquellas aisladas de fermentacioacuten y antildeejamiento del vino
se observan maacutes frecuentemente multilateral y gemacioacuten polar 8
La modalidad maacutes comuacuten es la gemacioacuten proceso asexual en el cual la ceacutelula
progenitora emite un conducto tubular desde la vacuola nuclear hacia un punto
perifeacuterico proacuteximo a la misma Entonces se forma en la direccioacuten del conducto
una pequentildea protuberancia en la superficie externa de la ceacutelula y el conducto
pasa atravesando la pared celular a dicha protuberancia la cual se ensancha
llenaacutendose con el material citoplaacutesmico y nuclear de la ceacutelula progenitora Cuando
el brote o yema formada llega a ser casi tan grande como la ceacutelula progenitora los
aparatos nucleares de ambas ceacutelulas se orientan de forma que sus centrosomas
respectivos equidisten del punto de unioacuten Al llegar este momento la ceacutelula madre
y la ceacutelula hija se separan y se inicia la formacioacuten de nuevas ymas En la
gemacioacuten normal no se forman tabiques de separacioacuten entre ceacutelula madre y
ceacutelulas hijas pero en algunos casos el proceso se inicia en la gemacioacuten y se
completa por divisioacuten con la separacioacuten definitiva de ambos individuos La ceacutelula
madura de puede producir por gemacioacuten durante el curso de vida un promedio de
7 Brinton M Miller and Warren Litsky PhD 1976 Industrial Microbiology Edi Mac Graw Hill United States
of America
8 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures
edi Springer second edition Fresno California United States of America
12
24 generaciones de ceacutelulas hijas Las yemas sucesivas se forman siempre en
sitios diferentes de la superficie de la ceacutelula9
111 Gemacioacuten multilateral
La gemacioacuten multilateral ocurre en el ldquohombrordquo o aacuterea de la levadura donde ocurre
la reproduccioacuten La gemacioacuten y ciclo de separacioacuten crea un problema para las
levaduras durante su fase fermentativa pues en este tiempo la ceacutelula madre se
reduce aproximadamente un medio Porque la siacutentesis de la membrana celular
ocurre bajo condiciones anaeroacutebicas lo que limita los ciclos asexuales
replicativos Como resultado la mayoriacutea de las fermentaciones se completan en la
fase estacionaria (no gemacioacuten) Un ejemplo de esta reproduccioacuten es
BrettanomycesDekkera10
112 Gemacioacuten Polar
A diferencia de la gemacioacuten multilateral la gemacioacuten polar puede ocurrir en uno o
dos polos En el caso de Kloeckera y Saccharomyces la gemacioacuten ocurre en
ambos polos aumentando la poblacioacuten de levaduras con forma de ldquolimoacutenrdquo 11
113 Fisioacuten
Esta reproduccioacuten es caracteriacutesticas del genero Schizosaccharomyces donde la
formacioacuten de la ceacutelula hija ocurre sin la reduccioacuten de la madre ceacutelula como en los
casos anteriores En este caso la formacioacuten de la microscoacutepica pared celular
ocurre entre la madre ceacutelula y la hija seguida por la separacioacuten12
9 Araya Pablo 2002 Reproduccioacuten de hongos unicelulares mediante gemacioacuten esporulacioacuten y
fisioacuten httphtmlrincondelvagocomreproduccion-asexualhtml
10 11 12 Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic
Publishers GmbH United States of America and Canada
13
114 Pseudomycelium
Cualquier fabricante de vinos ha tenido la oportunidad de notar la formacioacuten de
una peliacutecula en la superficie del vino Esto surge debido a la gemacioacuten repetida de
las levaduras oxidativas y fallas en el momento de la separacioacuten de la ceacutelula hija
de la madre Con el tiempo el lazo previo entre la madre ceacutelula e hija se ampliacutea
dando la impresioacuten de filamentos como si se tratase de mohos siendo que son
levaduras 13
12 TAXONOMIA
Para distinguir las levaduras que pueden producir ascoporas de aquellas que no
los micologistas usan doble taxonomiacutea para su clasificacioacuten Desafortunadamente
la nomenclatura para la combinacioacuten anamorfotelemorfo es frecuentemente
diferente Unos ejemplos de levaduras sexualasexual o telemorfoanamorfo son
DekeraBrettanomyces Metschnikowia pulcherrimaCandida pulcherrima
Hanseniaspora uvarumKloeckera apiculata Torulaspora delbruecki Candida
colliculosa 14
Sin embargo las levaduras son diferenciadas por los taxonomistas por asignacioacuten
de varios nombres de geacutenerosespecies varios vinicultores usan un sistema
informal para agrupar levaduras basadas en su morfologiacutea u otras caracteriacutesticas
Por ejemplo a Kloeckera apiculata se le refiere como ldquolevadura apiculadardquo
tiene forma de limoacuten Esta levaduras asi com muchas otras presentes en el mosto
de la uva como lo son Candida Cryptococcus Debaryomyces Hansenula
Issatchenkia Kluyveromyces Metschnikowia Pichia y Rhodotorula tambieacuten son
llamadas levaduras ldquonativasrdquo ldquonaturalesrdquo o ldquosalvajesrdquo por su origen el vintildeedo o en
13
Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers
GmbH United States of America and Canada
14 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
14
la vinera Algunos enoacutelogos han discutido contra el uso de estos teacuterminos porque
esta implicancia no sucede en todas las levaduras ya que estas son de alguna
forma ldquono-nativasrdquo o ldquono naturalesrdquo (Ej Saccharomyces o Brettanomyces) El
teacutermino ldquono Saccharomycesrdquo es maacutes comuacuten para nombrar aquellas levaduras
presentes en el mosto de la uva que no son del genero Saccharomyces15
Las levaduras encontradas despueacutes de la fermentacioacuten alcohoacutelica tambieacuten son
asignadas a un grupo informal Algunas veces las levaduras que conducen la
principal fermentacioacuten (Saccharomyces) son muchas veces llamadas ldquolevaduras
fermentativasrdquo basados en su metabolismo Durante su antildeejamiento algunas
levaduras (Candida Hansenula y Pichia) pueden crecer en la superficie en
presencia de oxigeno Esta peliacutecula superficial es comuacutenmente asociada a
deterioro del vino esta levadura se le conoce como ldquolevadura formadora de
peliacuteculardquo16
121 DekkeraBrettanomyces
La taxonomiacutea cientiacutefica sobre BrettanomycesDekkera ha cambiado en los uacuteltimos
antildeos Brettanomyces estaacute clasificado dentro de la misma familia que
Saccharomyces (familia Saccharomycetaceae) Actualmente dentro del geacutenero
Brettanomyces se aceptan cinco especies diferentes (B bruxellensis B
anomalus B custersianus B nanas y B naardenensis)17
Las teacutecnicas de biologiacutea molecular han demostrado que B intermedious B
lambicus B custerseii o D intermedia son sinoacutenimos de B bruxellensis por lo
que estas denominaciones han quedado en desuso Los microorganismos de este
geacutenero presentan dos formas una capaz de reproducirse sexualmente (Dekkera)
15
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
16 Kurtzman CP 1998 The industrial and agricultural significance of yeasts 4
th Edition Amsterdam
Holanda
17 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
15
y otra que lo hace asexualmente (Brettanomyces) Tambieacuten se llaman
respectivamente forma perfecta y forma imperfecta En algunos casos la forma
perfecta y la imperfecta reciben nombres diferentes como ocurre con B anomalus
y D anomala En otros casos el nombre es similar como las pertenecientes a la
especie bruxellensis que pueden parecer como D bruxellensis como B
bruxellensis o como BrettanomycesDekkera A efectos praacutecticos en la bodega
estos dos estados son similares Cuando vemos referencias a Brettanomyces
como contaminante en la mayor parte de los casos se refieren a
DekkeraBrettanomyces ya que este es el responsable de las alteraciones en el
vino18 y 19
La morfologiacutea celular de BrettanomycesDekkera es ojival o ciliacutendrica con
gemacioacuten multipolar en reproduccioacuten vegetativa Una de las caracteriacutesticas de
este geacutenero es su tamantildeo celular variable y la formacioacuten de filamentos19
18 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 23
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
19
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
16
Figura 1 Microfotografiacutea de cultivo de BrettanomycesDekkera a) Variabilidad morfoloacutegica y de
tamantildeo celular b) forma filamentosa
Fuente Lopez-Cordon Eva BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia wwwacenologiacom
Los defectos sensoriales asociados directamente a Brett aparecen
mayoritariamente en vinos tintos de calidad y las causas radican en la propia
fisiologiacutea del microorganismo Ademaacutes al ser una levadura de crecimiento muy
lento la alteracioacuten se presenta principalmente durante el almacenamiento y sobre
todo la crianza del vino habitual en los vinos tintos de gama alta En las barricas
de madera el microorganismo tiene a su disposicioacuten todo el sustrato y tiempo
suficiente para realizar su actividad La naturaleza porosa de la madera y su difiacutecil
limpieza contribuye a que las poblaciones existentes se mantengan incluso
despueacutes del lavado de la barrica Ademaacutes BrettanomycesDekkera tiene la
capacidad de degradar uno de sus componentes la celobiosa 20
13 CARACTERISTICAS FISIOLOGICAS
S cerevisiae y BrettanomycesDekkera tienen metabolismos similares muy
adaptados a las condiciones de vinificacioacuten Tras la fermentacioacuten alcohoacutelica S
cerevisiae es la levadura mayoritaria debido a que las condiciones nutricionales
20
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
17
del vino son muy estrictas (altas concentraciones de etanol y bajas
concentraciones de nutrientes) En este momento BrettanomycesDekkera
continuacutea creciendo gracias a que utiliza nutrientes que S cerevisiae no ha podido
consumir sobre todo algunos azuacutecares y fuentes de nitroacutegeno21
Una de las caracteriacutesticas que diferencia a BrettanomycesDekkera es la gran
diversidad de azuacutecares que puede fermentar (ver tabla de Relacioacuten de los
principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) La mayoriacutea de
las cepas pueden crecer utilizando trealosa y celobiosa azucares presentes en el
vino y no consumibles por S cerevisiae Otra de las ventajas que presenta frente
a S cerevisiae (y frente a la mayoriacutea de las levaduras) es que puede utilizar los
nitratos como fuente de nitroacutegeno Debido a que S cerevisiae soacutelo utiliza el
nitroacutegeno amoniacal y los aminoaacutecidos libres estos se consumen con relativa
rapidez Al final de la fermentacioacuten el nitroacutegeno moniacal es escaso y se favorece
el crecimiento de las levaduras que pueden utilizar otras fuentes de nitroacutegeno
Ademaacutes Brettanomyces puede crecer con concentraciones de fosfato diamoacutenico
tan bajas como 05gl o a partir de diversos aminoaacutecidos En resumen
BrettanomycesDekkera crece maacutes despacio que S cerevisiae es resistente a
concentraciones altas de alcohol puede utilizar otros azucares como fuentes de
energiacutea y nitrato como fuente de nitroacutegeno Esto explica que pueda reproducirse
cuando la fermentacioacuten alcohoacutelica ha terminado a partir de nutrientes no
consumibles por S cerevisiae y cuando no tiene competidores22
21
Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
22 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
18
Tabla 1 Relacioacuten de los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto
Fuente Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista
VINOTEQ N 38 pag 21 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
131 BrettanomycesDekkera y siacutentesis de fenoles volaacutetiles
El origen de los fenoles volaacutetiles estaacute relacionado con la actividad secuencial de
dos enzimas que descarboxilan los aacutecidos en hidroxiestirenos (vinilfenoles) que
19
son posteriormente reducidos a etilderivados (etilfenoles)23 como puede
observarse en la figura 2
Figura 2 Siacutentesis de etilfenoles de BrettanomycesDekkera
Fuente ACE revista de Enologia wwwacenologiacom
El primer paso de descaboxilacion de los aacutecidos hidroxicinamicos es comuacuten
tambieacuten en otros microorganismos como bacterias hongos y otras levaduras Sin
embargo el segundo paso reduccioacuten de vinilfenoles es caracteriacutestico de algunos
tipos de levaduras como Dekkera bruxelliensis D anomala Pichia guillermondi
Candida versarilis C halophila y C mannitofaciens24
Los fenoles volaacutetiles que se asocian al problema Brett en vinos son el 4-etilfenol y
el 4- etilguaiacol asiacute como sus precursores intermedios 4-vinilfenol y 4-
vinilguaiacol aunque estos uacuteltimos son menos importantes por ser muy reactivos y
raacutepidamente convertidos en etilfenoles por BrettanomycesDekkera o en su caso
23
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
24 Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
20
condensan con otras moleacuteculas como antocianos25 Los etilfenoles y
especialmente elevadas concentraciones de 4-vinilfenol en vinos se asocian con
aromas desagradables asociados a descriptores como ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de
caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo26
El umbral sensorial del 4-etilfenol es de 230 μg l-1 y el del 4-etilguaiacol es de 47
μgl Pese a su menor umbral sensorial el 4-etilguaiacol responde a descriptores
como ldquobaconrdquo o ldquoahumadordquo que a bajas concentraciones aportan complejidad por
lo que se puede considerar sensorialmente menos conflitivo que el 4-etilfenol 27
Figura 3 Defectos sensoriales producidos en el vino por BrettanomycesDekkera
Fuente Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
25 Morata A Goacutemez-Cordoveacutes M Calderoacuten F Suaacuterez J 2006 Effects of pH temperature and SO2 on the
formation of pyranoanthocyanins during red wine fermentation with two species of Saccharomyces Journal Food Microbiology No106 pag 4 Madrid Espana
26 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea 27 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
21
132 Identificacioacuten de BrettanomycesDekkera
Los Bioacutelogos usan sistemas de identificacioacuten basados en similitudes taxonoacutemicas
entre organismos dichas similitudes pueden ser morfoloacutegicas tipos capacidad de
produccioacuten de sustratos como azuacutecar yo nitratos caracteriacutesticas fisioloacutegicas y
bioquiacutemicas secuencia del material geneacutetico y respuestas inmunoloacutegicas28
En la industria viniacutecola es importante recurrir a diferentes tipos de pruebas para la
identificacioacuten de microorganismos una de estas y la maacutes realizada es la revisioacuten
del microorganismo bajo el microscopio Esta prueba brinda informacioacuten sobre la
morfologiacutea del microorganismo (cocos bacilos formas puntudas ojival entre
otros) tamantildeo (dimensiones) agrupaciones celulares (solas parejas triacuteos
grupos o cadenas) Sin embargo el uso del microscopio es una prueba raacutepida
para examinar mostos o vino pero no determina cantidades que muchas veces es
requerido para tratamientos de accioacuten otro de los inconvenientes es que los
microorganismos pueden variar su morfologiacutea en forma o tamantildeo dependiendo de
la edad y las condiciones de crecimiento por lo que puede no ser clara la
identificacioacuten de este29
14 Medios soacutelidos selectivos
Si se requiere de la confirmacioacuten del microorganismo este debe ser aislado del
vino para una caracterizacioacuten para esto se requiere de medios soacutelidos Cuando se
examina un microorganismo en un medio solido es importante revisar las
caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias (ver figura 4 Morfologiacuteas de colonias
en medios soacutelidos) Entre estas caracteriacutesticas estaacuten forma (circular irregular o
2829 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
22
rizada) tamantildeo (dimensiones estas normalmente se expresan en miliacutemetros)
topografiacutea (plano elevado convexo coacutencavo o embonado) presencia de
pigmentos opacidad (transparente traslucido u opaco) superficie (suave rugosa
lisa o aacutespero) bordes (entero ondulado crespo dentado rizado) o cualquier
cambio en el agar (color opacidad cambios en los indicadores de pH o CaCO3
respectivamente)30
Figura 4 Varias morfologiacuteas de crecimiento de colonias en medio solido
Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007
Gran nuacutemero de medios selectivos se han creado para la aislacioacuten deteccioacuten yo
conteo de levaduras provenientes de jugos de uva mostos o vinos El medio maacutes
utilizado en estos fines es YPD (Yeast Peptone Dextrose) pero dicho medio no
es selectivo entre levaduras y se usa comuacutenmente para el conteo de
Saccharomyces31 Las colonias empiezan a parecer con un periodo de incubacioacuten
30
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
31 Essia Ngang J Wolniewicz E Villa P2005 Stimulation of lactobacilli during alcoholic fermentation action
of sucrose hydrolysis by yeast Biotechnology letters No 8 pag 743 Amiens France
23
de 2 a 4 diacuteas a 22C a 25C Igualmente el agar de jugo de uva es no selectivo y
presenta faacutecil crecimiento de levaduras bacterias y mohos
Para la levadura Brettanomyces Dekkera se han elaborado diferentes medios
selectivos entre ellos el maacutes conocido es WL por sus siglas en ingles del
laboratorio que lo creo ldquoWallerstein Laboratoriesrdquo este medio contiene
cicloheximida compuesto selectivo para Brettanomyces e inhibe Saccharomyces
El punto criacutetico es encontrar la cantidad exacta de este compuesto para la
inhibicioacuten de las levaduras sin que afecte a BrettanomycesDekkera32
Ademaacutes del medio WL BrettanomycesDekkera puede ser cultivado en otros
medios selectivos como Brettanomyces medio A creado por Vilas en 1993
Brettanomyces medio B el cual contiene cicloeximida como agente selectivo
mientras que Brettanomyces medio C tiene cicloheximida y ampicilina este medio
fue creado por B Watson en 1998 Brettanomyces medio D fue creado
recientemente por Rodrigues en 2001 este medio es conocido como DBDM
(DekkeraBrettanomyces differential medium ) es un medio selectivo para
Brettanomyces en contra de Saccharomyces y otras levaduras este medio es el
maacutes utilizado en la vineras para caracterizacioacuten de BrettanomycesDekkera
actualmente33
15 Dioacutexido de azufre (SO2) en vinos
32
33
Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers
GmbH United States of America and Canada
24
El dioacutexido de azufre tambieacuten llamado oxido de azufre es un eficaz agente
conservante antioxidante y antimicrobiano en la industria viniacutecola34
Durante la vinificacioacuten SO2 ha representado histoacutericamente una herramienta muy
importante usada por los vinicultores para el control de crecimiento microbioloacutegico
Debido a preocupaciones por la salud del consumidor el uso de este producto ha
disminuido dramaacuteticamente con el posible riesgo de aumentar el riesgo
microbioloacutegico35
El actual liacutemite legal de SO2 en vinos en los Estados Unidos es de 350mgL una
concentracioacuten mucho mayor a la usada en la industria viniacutecola No obstante vinos
que contienen maacutes de 10mgL deben declarar este compuesto en la etiqueta
porque SO2 es un metabolito que las levaduras usan durante la fermentacioacuten Los
vinos siempre contienen algo de sulfitos aunque la adicioacuten no se realice durante el
proceso36
151 Formas del Dioacutexido de Azufre (SO2)
Una vez disuelto en agua el dioacutexido de azufre existe en equilibrio entre SO2
molecular (SO2H2O) bisulfito (HSO3) y sulfito (SO32-) Este equilibrio depende del
pH Ademaacutes de estar en equilibrio con el molecular y especies sulfito el bisulfito
tambieacuten existe en forma ldquolibrerdquo y en forma ldquoatadardquo Aquiacute la moleacutecula reaccionara
34
Orwine Eureka 2008Investigadores europeos buscan alternativas al dioxido de azufre en vinos
httpawprowordpresscom20081107investigadores-europeos-buscan-alternativas-al-dioxido-de-
azufre-en-el-vino
3536 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
25
con compuestos carbonilos (ej Acetaldehiacutedo) formando productos adicionales
como Acido Hydroxysulfonico 37
Ademaacutes de Acetaldehiacutedo algunas moleacuteculas presentes en el jugo de uva que
reaccionan con bisulfito son acido piruvico α-keto-glutaric dihidroxyacetona
diacetyl Pigmentos de antocianinas entre otros38
152 Inhibidor Microbiano
El sulfuro molecular es la forma antimicrobiana del dioacutexido de azufre La cantidad
de SO2 molecular presente en cualquier vino no se mide directamente La
concentracioacuten es calculada conociendo la concentracioacuten de SO2 libre y el pH del
vino basaacutendose en la siguiente foacutermula
Alternativamente la figura 5 Se puede utilizar como guiacutea para aproximar la
cantidad de SO2 libre necesitada a determinado valor de pH de valores entre 05 o
08 mgl de SO2 molecular 39
El SO2 inhibe microorganismos de varias formas incluyendo rupturas de puentes
bisulfitos en proteiacutenas y reaccionando con coofactores como NAD+ y FAD tambieacuten
reacciona con ATP
3739
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
38 Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi
Springer New York United States
26
Figura 5 Cantidades de SO2 libre a un pH determinado para obtener 05 o 08 mgl de SO2
molecular
Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007
La concentracioacuten de SO2 molecular necesario para prevenir el crecimiento de
microorganismos variacutea seguacuten vinojugo pH temperatura poblacioacuten densidad y
diversidad estado de crecimiento grado de alcohol entre otros factores Beech
1979 sugirioacute una adicioacuten de 08 mgl de SO2 molecular como la cantidad
necesaria del compuesto en vinos blancos de mesa para dar una reduccioacuten de
cerca de 104 UFCml de la poblacioacuten de diferente tipo de microorganismos en 24
horas Las diferencias que existen entre las levaduras y bacterias en base a la
27
sensibilidad a este compuesto son dadas a conocer por diferentes autores (Warth
1977 1985 Du Toit 2005 Davis 1988 Hood 1983)40
16 Antibrettreg como alternativa de prevencioacuten y eliminacioacuten de
BrettanomycesDekkera
Antibrettreg es un producto nuevo creado por Spindal SARL-Gretz - Armainvilliers
Francia Es una preparacioacuten enzimaacutetica para inactivar Brettanomyces y para
reducir olores producidos por fenoles volaacutetiles41
Antibrettreg es preparado a base de paredes celulares de levadura activados
enzimaacuteticamente que presentan elevadas propiedades adsorbentes frente al 4-
etilfeno y 4- etilguayacol compuestos asociados con olores desagradables en el
vino tales como sudor de caballo farmacia o barniz42
Antibrettreg inhibe la produccioacuten de la vinilreductasa que participa en la
transformacioacuten de los aacutecidos cinaacutemicos naturalmente presentes en los vinos en
los correspondientes derivados etilados responsables de los olores atribuidos a
BrettanomycesDekkera 43
40
Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi
Springer New York United States
41 Manual de instrucciones de producto Antibrett reg producido por Spindal SARL-Gretz -
Armainvilliers France
424344 AEB Group 2008 ANTIBRETT Preparado a base de paredes celulares de levadura para la inactivacioacuten
de Brettanomyces y la eliminacioacuten de los olores de estos productos httpwwwaeb-
groupcomimgsSPAGNOLODepliantANTIBRETT-lett-ESPpdf
28
El uso de Antibrettreg es efectivo incluso contra otros olores anoacutemalos como los
que se generan en las barricas sucias principalmente huacutemedas dantildeando la
calidad olfativa del vino44
29
2 PROBLEMA
La levadura BrettanomycesDekkera es una levadura de contaminacioacuten presente
en la mayoriacutea de industrias viniacutecolas en el mundo Afecta directamente la
produccioacuten y calidad sensorial de los vinos con el desarrollo de los compuestos 4
etilfenol y 4 etilguayacol los cuales dantildean el perfil olfativo del vino dando aromas
caracteriacutesticas a ldquoestablordquo ldquocuerordquo ldquosudor de caballordquo o ldquobarnizrdquo conocido como
ldquocaraacutecter Brettrdquo
Esta contaminacioacuten se da especialmente en los vinos tintos debido a sus
caracteriacutesticas de produccioacuten (fermentacioacuten crianza antildeejamiento) y sus
propiedades fisicoquiacutemicas (Grado alcohoacutelico pH Acidez total Acidez volaacutetil
entre otros)
En Croacia existe una gran produccioacuten de vinos tintos entre los cuales se
encuentra el vino tinto Babic proveniente de la isla de Hvar el cual es famoso por
ser un vino duro carnoso estructurado y casi sobre-maduro con un grado
alcohoacutelico que ronda los 15 vv siendo la primera denominacioacuten de origen que
se aproboacute en Croacia en el antildeo 1961 este vino es de gran importancia en la
regioacuten la mayoriacutea de sitios de elaboracioacuten son pequentildeas industrias que han sido
afectadas por el bdquocaraacutecter Brett‟ Muchas investigaciones se han realizado al
respecto de la levadura BrettanomycesDekkera pero se conoce muy poco sobre
sus efectos en el vino Babic debido a sus caracteriacutesticas particulares (alcohol
30
15 pH 35 Acidez total 520 gr Acido TartaricoL Acidez volaacutetil 08 gr Acido
AceticoL Azucar residual 47 grLt)45
La dificultad de la pequentildea industria para acceder a productos que lleven a la
identificacioacuten de la levadura mencionada y de esta manera conllevar a planes de
accioacuten contra el ldquocaraacutecter Brettrdquo es una de las grandes dificultades de la industria
vinera en este paiacutes en donde los productos para la industria enoacuteloga son
complicados y de alto precio para acceder a ellos y en consecuencia no se
realizan muchas de estas pruebas de deteccioacuten de BrettanomycesDekkera
llevando al mercado productos contaminados de baja calidad que inicialmente
podriacutea haber sido un vino de alta calidad debido a sus caracteriacutesticas uacutenicas y de
gran popularidad
45
Datos obtenidos en el laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
31
3 JUSTIFICACION
Actualmente Croacia cuenta con maacutes de 300 zonas vineras en las que se producen 67
de vino blanco 32 vino tinto y el restante 1 vino rosado De acuerdo a recientes datos
estadiacutesticos hay 650 km2 de vintildeedos en Croacia de los cuales 375 km2 son uvas con
indicacioacuten geograacutefica de origen que producen maacutes de 300 vinos y maacutes de la mitad de este
nuacutemero son vinos elaborados en microempresas con un total de 50000000 de botellas
de vino el 8 es vino superior 70 de calidad y el 22 es vino de mesa de produccioacuten
nacional46
Croacia es un fuerte productor de vino a nivel regional con sus diferentes variedades
propias (Merlot Plavac Dingač Postup Malvazija Pošip Kujundžuša Babic) pero dicha
produccioacuten ha sido fuertemente afectada por la presencia de la levadura
BrettanomycesDekkera trayendo consecuencias como perdidas de produccioacuten peacuterdida
de calidad sensorial del vino grandes peacuterdidas econoacutemicas y desprestigio a sus vinos de
denominacioacuten de origen
Es por esto que en este proyecto de investigacioacuten se busca una faacutecil y raacutepida
identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera causante del ldquocaraacutecter Brettrdquo con el
desarrollo de medios selectivos liquido y solido ademaacutes de opciones para el tratamiento
yo prevencioacuten de esta levadura en la cadena productiva comparativamente entre dioacutexido
de azufre (SO2 ) y Antibrettreg y la identificacioacuten de los aromas caracteriacutesticos del ldquocaraacutecter
Brettrdquo en el vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia
46
Hrvatski zavod za vinogradarstvo i vinasrtvo 2003 Pravilnik o vinu httpwwwhrzvvhrpropisihtm
32
4 OBJETIVOS
41 General
Caracterizar y evaluar el comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera
en teacuterminos de crecimiento y produccioacuten de aromas no deseados en vino tinto
Babic
42 Especiacuteficos
Desarrollar el medio solido y medio liacutequido selectivo para
BrettanomycesDekkera
Evaluar el comportamiento de la levadura en estos medios selectivos
Determinar la influencia del Dioacutexido de azufre (SO2) y el compuesto
Antibrettreg en la levadura BrettanomycesDekkera presente en vino tinto
Babic 2007
Identificar los compuestos aromaacuteticos producidos por Brettanomyces
bruxellensis en vino tinto Babic usando el meacutetodo ldquomultiple headspace
solid-phase microextraction (SPME)rdquo
33
5 ALCANCES
En este proyecto se pretende desarrollar un medio selectivo faacutecil de producir en
donde sea raacutepida la identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera en la
produccioacuten de vinos tintos se realizaran pruebas para corroborar el crecimiento de
esta levadura en el medio determinando el tiempo que esta levadura toma en
adaptarse en el medio y su comportamiento en este una vez comprobada su
adaptacioacuten al medio liquido se trabajara con el meacutetodo de cromatografiacutea de gas
(GC) y el uso de micro extraccioacuten en fase solida (SPME) para el anaacutelisis
cuantitativo de los compuestos volaacutetiles (4-etil-fenol 4-etil-guayacol4-vinilfenol y
4-vinil-guayacol) y posteriormente con el vino tinto Babic Ademaacutes se desea
comprobar la efectividad de los productos con que las vineras de Croacia inhiben
o eliminan la presencia de la levadura en los vinos tintos como lo son el producto
AntiBrettreg y el Dioacutexido de azufre (SO2)
34
6 ESTADO DEL ARTE
Sobre el campo problemico causado por la levadura BrettanomycesDekkera en la
industria viniacutecola se han realizado bastante investigaciones a nivel de
caracterizacioacuten de la levadura los factores fisicoquiacutemicos que favorecen el
crecimiento de la levadura meacutetodos de prevencioacuten y control evaluacioacuten de
dantildeos sensoriales en diferentes tipos de vinos formacioacuten de compuestos fenoacutelicos
en los diferentes tipos de vino otros compuestos no fenoacutelicos asociados al
ldquocaraacutecter Brettrdquo teacutecnicas de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera
evaluacioacuten de la teacutecnicas de control e inhibicioacuten de dicha levadura desarrollo de
nuevos medios de deteccioacuten y aislamiento de la levadura relacioacuten entre la
levadura BrettanomycesDekkera con las otras levaduras presentes en el vino
entre otros
Seguacuten estas investigaciones se analizan aquellas que pueden aportar datos
importantes para el desarrollo del trabajo que se quiere realizar y se tiene en
cuenta sus metodologiacuteas conclusiones recomendaciones y comentarios
Entre las importantes para el planteamiento de este trabajo se menciona el trabajo
realizado por la Universidad Politeacutecnica de Madrid Espantildea el cual analiza
algunas de las caracteriacutesticas maacutes relevantes de este geacutenero de levaduras su
crecimiento en bodega factores fisicoquiacutemicos que favorecen su crecimiento y
desarrollo en el vino los defectos sensoriales que presenta en los vinos y estudia
algunas de los meacutetodos fiacutesicos para el control de BrettanomycesDekkera en vino
35
(clarificacioacuten filtracioacuten amicrobica proteiacutenas clarificantes anhiacutedrido sulfuros
dimetil dicarbonato Aditivos)47
Para conocer maacutes sobre la levadura en condiciones de barrica y almacenamiento
se revisa el articulo elaborado en el Departamento Teacutecnico Guserbiot La rioja
Espantildea en este artiacuteculo se describe brevemente su metabolismo y su ecologiacutea en
las bodegas Igualmente se comparan las teacutecnicas utilizadas en los laboratorios
para su deteccioacuten y cuaacuteles son las limitaciones de los diferentes meacutetodos
Finalmente se analizan las estrategias desarrolladas para su eliminacioacuten de las
bodegas y se dan una serie de recomendaciones para su control48
El instituto de fermentaciones Industriales Consejo superior de investigaciones
cientiacuteficas Juan de Cierva Madrid Espantildea en el cual se revisa la formacioacuten de
etilfenoles (4 etil-fenol 4 etil guayacol) en vinos tintos anejos Los factores
fisicoquiacutemicos que favorecen el crecimiento de la levadura no deseada
BrettanomycesDekkera las teacutecnicas usadas para la detectar la presencia de esta
levadura en vinos ( Revisioacuten microscoacutepica fluorescente remocioacuten de aacutecidos
grasos de su membrana teacutecnicas moleculares como PCR y electroforesis) y de
control (Proteiacutenas fining Fining con gelatina liquida filtracioacuten variables
fisicoquiacutemicas adicioacuten de aditivos procedimientos de altas presiones
manipulacioacuten geneacutetica) con esta investigacioacuten se concluye que la combinacioacuten y el
uso de las numerosas teacutecnicas pueden ayudar a la prevencioacuten y reduccioacuten de la
levadura BrettanomycesDekkera 49 Este trabajo muestra las muacuteltiples opciones
47
A Morata S Benito F Palomero F Calderoacuten y J A Suaacuterez-Lepe Ecologiacutea y prevencioacuten de
BrettanomycesDekkera durante la elaboracioacuten y crianza de vinos tintos Revista enoacutelogos (Editada por la
Federacioacuten Espantildeola de Asociaciones de Enoacutelogos y Periodistas Asociados) No 50 paacuteg 1-12 Madrid Espantildea
48 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 20-
24 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
49 R Suarez JA Suarez-Lepe A Morata F Calderon 2006 The production of ethyl phenols in wine by yeasts
of the genera Brettanomyces and Dekkera A review Journal Food Chemistry No 102 pag 10-21 Madrid
Espantildea
36
existentes en el control y prevencioacuten de la levadura mencionada sin embargo deja
claro que la mayoriacutea de estas opciones son costosas y no de faacutecil adquisicioacuten para
una pequentildea industria
El anaacutelisis sensorial ha sido de los aspectos maacutes estudiados al respecto de
BrettanomycesDekkera una de estas investigaciones fue realizada en Centre
Europeacuteen des Sciences du Goucirct en Talence Francia en el cual se evaluaron 50
vinos bordeaux sensorialmente para demostrar la complejidad del ldquoCaraacutecter Brett‟‟
al cual se unen otros compuestos aromaacuteticos ademaacutes de los fenoacutelicos como acido
isobutirico e isovalerico en este tipo de vino debido a sus caracteriacutesticas
fisicoquiacutemicas50
De los meacutetodos de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera los medios
selectivos son muy populares es por esto que el Laboratorio de Microbiologiacutea
Departamento de Botanica e Engenharia Biologica Instituto Superior de
Agronomia Lisboa Portugal realizo un trabajo en el cual se pretendia desarrollar
un medio selectivo o diferencial capaz de aislar la levadura
BrettanomycesDekkera del vino y de la cadena productiva del vino con el fin de
detreminar la relacioacuten entre esta levadura y los compuestos 4-etilfenol y 4 etil-
guayacol51 otro estudio realizado para la deteccioacuten de dicha levadura fue
realizado en la Escola Superior de Biotecnologiacutea Universidade Catoacutelica
Portuguesa el desarrollo de un simple procedimiento compatible con las rutinas
50 Andrea Romano a Marie Claire Perello a Aline Lonvaud-Funel Gilles Sicard Gilles de Revel2008 Sensory
and analytical re-evaluation of lsquolsquoBrett characterrdquo Journal Food Chemestry No 114 pag 15-19 Talence
France
51 N Rodrigues G Gonccedilalves S Pereira-da-Silva M Malfeito-Ferreira and V Loureiro2001 Development
and use of a new medium to detect yeasts of the genera DekkeraBrettanomyces Journal of applied microbiology No 90 pag 588-599Lisboa Portugal
37
usadas en las vineras para la deteccioacuten de BrettanomycesDekkera en vino y en
maquinarias52
En el laboratorio de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas Alcohoacutelicas de la
Universidad de Zagreb se ha trabajado anteriormente en el desarrollo de medio
solido selectivo con pruebas de diferentes concentraciones de los compuestos
como resultados se encuentra una buen relacioacuten entre las concentraciones de los
compuestos sin embargo como recomendaciones se encuentran la falta de
antibioacutetico para evitar contaminacioacuten por bacterias probar con diferentes fuentes
de carbono para comparacioacuten de tiempo de crecimiento positivo y un monitoreo
diario en el medio53
Los compuestos aromaacuteticos que libera la presencia de BrettanomycesDekkera
estaacute asociada a los compuestos 4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinilfenol y 4
viniguayacol a partir de esto los centros de investigacioacuten han hondado en la
identificacioacuten de dichos compuestos relacionados en la enologiacutea y especialmente
con BrettanomycesDekkera a partir de eso el Departamento de Quiacutemica
Universidad de La Rioja Espantildea este estudio presenta un meacutetodo basado en el
uso de Cromatografiacutea de Gas y micro extraccioacuten en fase solida para el anaacutelisis
cuantitativo de 4-etilfenol 4-etil guayacol 4-vinilfenol 4-vinilguayacol
Demostrando la existencia de un efecto matriz en el anaacutelisis de compuestos
responsables del ldquocaraacutecter Brettrdquo en vino Este nuevo meacutetodo fue
satisfactoriamente aplicado a cierto nuacutemero de vinos tintos comerciales vinos
52
JA Couto A Barbosa and T Hogg 2005 A simple cultural method for the presumptive detection of the yeasts BrettanomycesDekkera in wines Letters in Applied Microbiology No 41 pag 505-510 Porto
Portugal
53 Serkovic Dubravka Gracin Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac
Brettanomyces bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet pag 1-117 ZagrebCroatia
38
blancos y roseacute Este meacutetodo puede ser una alternativa para evitar el efecto matriz
en muestras de vino54
De acuerdo con este tema en la jornada cientiacutefica del 99 el grupo de investigacioacuten
enoloacutegica se estudio la formacioacuten de sustancias volaacutetiles por 13 cepas de S
cerevisiae con buenas aptitudes enoloacutegicas inoculadas individualmente en un
mosto homogeacuteneo de la variedad airen fermentado en las mismas condiciones
de aireacioacuten y a temperatura controlada55
54
C Pizarro N Perez-del-Notario JM Gonzalez-Saiz 2007 Determination of Brett character responsible
compounds in wines by using multiple headspace solid-phase micro extraction Journal of Chromatography
No 1143 pag 176-181 La Rioja Espantildea
55 E Pueyo P Hidalgo K Fernaacutendez y P Martiacuten-Aacutelvarez 1999 Anaacutelisis de compuestos volaacutetiles en vinos
obtenidos con distintas cepas de Saccharomyces cerevisiae Aplicacioacuten de la teacutecnica de microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientificas 99 Grupos de Investigacion Enologica Zaragoza Espana
39
7 MATERIALES Y METODOS
A continuacioacuten se presentan materiales y meacutetodos para la investigacioacuten
Este proyecto fue realizado en su gran mayoriacutea en las instalaciones de la
Universidad de Zagreb en la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos
(PBF) Laboratorios del Departamento de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas
Alcohoacutelicas ubicado en la ciudad de Zagreb Croacia
Los anaacutelisis fisicoquiacutemicos del vino tinto Babic fueron realizados en los
laboratorios de VINOLAB ubicado en Zagreb Croacia
71 MEDIO SOLIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera
711 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Autoclave de laboratorio
Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa Etanol peptona extracto de levadura
agar cicloheximida acido cumaacuterico ampicilina)
Balanza electroacutenica de precisioacuten
Microscopio oacuteptico
712 Metodologiacutea
Basados en estudios anteriores realizados en el laboratorio para el desarrollo de
medio solido selectivo para BrettanomycesDekkera (Serkovic Dubravka Gracin
40
Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac Brettanomyces
bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet Universidad de Zagreb pag 1-
117 Zagreb Croacia) se evaluaron las recomendaciones mencionadas en dicha
investigacioacuten para la mejoriacutea y desarrollo de otros medios soacutelidos selectivos
Se usoacute como base el medio YPD (Yeast Peptone Dextrose) el cual estaacute
compuesto de la siguiente forma 20gL peptona 10 gl extracto de levadura 20 gl
de agar56 este medio es selectivo para levaduras pero no es selectivo entre ellas
Es necesario el uso de una fuente de carbono para la levadura
BrettanomycesDekkera de acuerdo a la teoriacutea y revisando la tabla 1 (Relacioacuten de
los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) y seguacuten
facilidades de disponibilidad en el laboratorio se utiliza glucosa la cual es
utilizable por entre 75-100 de las cepas de BrettanomycesDekkera seguacuten la
tabla mencionada anteriormente
Esta fuente de carbono (Glucosa) fue probada en una concentracioacuten de 20 gL
Cicloheximida fue probada a 30 mgL para inhibir Saccharomyces en el medio y
darle mayor selectividad para Brettanomyces Dekkera Se antildeade acido p-
cumarico en una concentracioacuten de 100 mgL como precursor para la formacioacuten
del compuesto 4 etilfenol caracteriacutestico de la levadura BrettanomycesDekkera
Para inhibir bacterias en el medio se usa ampicilina a 10 mgL esta se agrega
despueacutes de realizada la esterilizacioacuten y cuando la temperatura del medio este
igual o menor a 40C El pH del medio se ajusto a 5
Paralelamente se crea el medio con Etanol como fuente de carbono en una
concentracioacuten de 6 o 60 mlL con la misma concentracioacuten de los otros
compuesto como cicloheximida 30mgL acido cumarico 100mgL 20 gL peptona
10 gL de extracto de levadura 16gL de agar Este medio se crea como
56
Concentraciones preestablecidas en el laboratorio de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas alcoholicas
41
comparativo para determinar cual fuente de carbono es la maacutes utilizada por la
levadura Brettanomyces bruxellensis para su reproduccioacuten Seguacuten la teoriacutea (ver
tabla 1) el etanol es utilizado por entre 25-75 de las cepas de
BrettanomycesDekkera pero es el azuacutecar que se encuentra en mayor
concentracioacuten presente en los vinos tintos aproximadamente 130 gl57
Estos medios fueron debidamente esterilizados para eliminar cualquier
microorganismo o espora presente en este Este procedimiento se realizo por el
meacutetodo de combinacioacuten de altas temperatura y presioacuten (Autoclave 121 C a 1034
kPa)
Se usaron colonias de BrettanomycesDekkera aisladas anteriormente de vinos
contaminados y guardas para investigaciones en el Departamento de Tecnologiacutea y
Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos
Universidad de Zagreb Croacia
Los medios fueron monitoreados visualmente todos los diacuteas y se toman
observaciones de macroscoacutepicas y microscoacutepicas Se comparan estos dos medios
en teacuterminos de rapidez de crecimiento de la levadura y selectividad Estas
muestras fueron incubadas a 28C por 10 diacuteas
La prueba fue realizada por duplicado en diferentes tiempos
57
Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
42
72 MEDIO LIacuteQUIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera
721 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Frascos de vidrio esteacuteriles
Autoclave de laboratorio
Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa peptona extracto de levadura
cicloheximida acido cumarico ampicilina etanol)
Microscopio oacuteptico
Balanza electroacutenica de precisioacuten
722 Metodologiacutea
En el mercado para enologiacutea existen medio liacutequidos selectivos para la deteccioacuten
de BrettanomycesDekkera en vinos sin embargo estos son de difiacutecil accesibilidad
por sus elevados precios es por esto que se desarrolla un medio liquido selectivo
para dicha levadura en el laboratorio del Departmaneto de Tecnologiacutea y Anaacutelisis
de Bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia
Para este medio se toma como base el medio selectivo con Glucosa como fuente
carbono desarrollado anteriormente sin usar agar para mantener el medio en su
estado liquido
43
La composicioacuten de este medio liacutequido es la siguiente
20 gL Glucosa
20 gL peptona
10gL extracto de levadura
30mgL de cicloheximida
100mgL acido p-cumarico
10 mgL ampicilina
Estos compuestos fueron medidos en una balanza electroacutenica de precisioacuten se
antildeade 250 ml de agua destilada y se mezcla constantemente se pasa a proceso
de esterilizacioacuten en autoclave a 120C y 1034 KPa por 45 minutos
De esta forma se asegura la usencia de microorganismos yo esporas en el
medio Despueacutes de bajar la Temperatura a 40C se agrega a la mezcla ampicilina
en una concentracioacuten de 10mgL
En frascos de vidrio esteacuteril se agrega 40 ml de medio liacutequido y diferentes
cantidades iniciales de levaduras BrettanomycesDekkera fueron inoculadas al
respectivo medio el primer frasco tiene una cantidad de 106 ceacutelulasml el segundo
tiene 104 ceacutelulasml el tercero tiene 102 celulasml y el cuarto con una cantidad
aproximada de 25 ceacutelulasml Estas cantidades estaacuten basadas en estudios
anteriores para medios liacutequidos selectivos en levaduras58
58 J Ungar A M James P W Muggleton H F Pegler y E G Tomich1950 The Cultivation of
Haemophilus pertussis in Partially Defined Liquid Media Journal of General Microbiology No 4
pag 345-359 Greenford
44
Este medio liacutequido inoculado fue inspeccionado diariamente visualmente revisioacuten
de turbidez microscoacutepicamente y olfativamente para deteccioacuten de olores del
ldquocaraacutecter Brettrdquo
Los diacuteas fueron contabilizados para determinar resultados positivos en estos
ensayos
73 INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN
VINO TINTO DE LA REGION DE DALMACIA CROACIA
731 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Medio selectivo solido para BretanomycesDekkera
Medio selectivo Liquido para BrettanomycesDekkera
Quiacutemicos de laboratorio (Dioxido de Azufre (SO2) Antibrettreg Glucosa)
Vino Babic 2007
Anallizador infrarojo Bacchius II microdom
732 Metodologiacutea
Con los medios desarrollados (solido y liquido) se quiere conocer el efecto del
dioacutexido de azufre (SO2) y el producto Antibrettreg en la levadura
BrettanomycesDekkera presente en el vino tinto de la regioacuten de Dalmacia
Con las herramientas que se tienen en el laboratorio del departamento de
tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia se quiere
determinar la influencia de estos productos en la levadura BrettanomycesDekkera
presente en vino tinto croata de la regioacuten de Dalmacia Babic
45
El primer paso es adaptar la levadura al vino tinto croata (Babic) para esto se
inoculan 20 colonias de BrettanomycesDekkera en 500 ml de vino se antildeadioacute
glucosa en una concentracioacuten de 2gL y se oxigena la mezcla Para este paso de
adaptacioacuten se dejan las muestras de 1 a 2 diacuteas a temperatura ambiente (20C)
Despueacutes de este periodo se revisa microscoacutepicamente la presencia positiva de
BrettanomycesDekkera en los 500 ml de vino en los que se estaba haciendo el
paso de adaptacioacuten en Babic al comprobar su presencia positiva se procede a
mezclar los 500 ml de vino contaminado con BrettanomycesDekkera con los 3
Litros de vino Babic que se disponen para esta prueba
Estos 3 litros de vino tinto Babic contaminado con la levadura
BrettanomycesDekkera se reparten en 8 frascos de vidrios esteacuteriles al siguiente
diacutea se toman dos frascos para agregar cada uno de los compuestos a evaluar
(SO2 y Antibrettreg)
Para SO2 se toman dos frascos uno de 600ml y uno de 100ml se agrega una
concentracioacuten de 40 mgl
Para el producto AntiBrettreg se toman cuatro frascos dos de 600 ml y dos de 100
ml seguacuten especificaciones del producto y la alta poblacioacuten de
BrettanomycesDekkera en las muestras se adiciono la maacutexima concentracioacuten de
AntiBrettreg a las muestras la cual fue de 40 gHl
Estas muestras se dejaron a temperatura ambiente simulando condiciones de
almacenamiento del vino en barricas temperatura aproximada de 20C evitando el
contacto con la luz solar y evitando movimientos fuertes Esto se mantuvo por 15
diacuteas que fue el tiempo de duracioacuten del experimento
Con el vino restante se mantuvo en las mismas condiciones de almacenamiento
de los demaacutes para hacer un paralelo de comparacioacuten
Previamente se analizaron las caracteriacutesticas del vino sin contaminar por medio
del analizador infrarrojo Bacchus II microdom antes de agregar los compuestos
46
SO2 y AntiBrettreg y despueacutes se volvioacute a realizar el anaacutelisis para determinar los
efectos de estos compuestos en el vino y asiacute mismo al de control
74 DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN
EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO
MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE
741 Materiales
Cromatografo de Gas HP5890 Serie II
Microextractor de fase solida (SPME)
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Quiacutemicos de laboratorio (p-cresolAcetaldehido Propanol diacetil etil-
acetato i-butanol acido aceacutetico i-amil-alcohol n-amil lactato de etilo
acetato amil metiacutelico 1-hexanol etil-hexanol linalol nerol citronelol
geraniol 2-feniletanol octanoato de etilo 4-etilfenol 2-feniletil acetato 4-
etilguaiacol)
Vino Tinto Babic
Agua destilada
742 Metodologiacutea
El meacutetodo fue desarrollado anteriormente en el Departamento de Tecnologiacutea y
Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos de
la Universidad de Zagreb Croacia Y despueacutes de modificaciones fue utilizado en el
desarrollo del trabajo El meacutetodo utilizado es descrito a continuacioacuten
47
Cromatografo de gas HP 5890 SERIES II
Programa HP-chem
a) Condiciones para analisis SPME-GC
Muestra diluida 5050 con adicion de estandar interno (p-cresol1mgl)
25ml de la muestra diluida con mezcla continua a temperatura ambiente
Tiempo de adsorcion 30 minutos
SPME es colocado en la muestra para la adsorcion durante el tiempo
previsto
b) Condiciones para el Cromatografo de gas (GC)
La columna usada en este experimento es RTXreg-5 (Restec USA sn 210627)
30m id=025mm 025μm
Gas portador Nitrogeno
Flujo del Nitrogeno 5 mlmin
Temperatura del inyector 240 C
Temperatura del detector 250 C
Temperaturas programadas 35 C5 min 150 C 34 Cmin 180 C
10Cmin 190 C 5 Cmin
Se conocen los resultados del cromatografiacutea de gases (ver tabla 10) y se hacen
necesarias varias correcciones del meacutetodo y algunas pruebas con unos
compuestos para determinar realmente su tiempo de retencioacuten en este tipo de
vino Se deben comprobar tiempos de retencioacuten
48
8 DISCUSIOacuteN Y RESULTADOS
81 RESULTADOS PARA EL DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO
Tabla 2 Medio Selectivo con Glucosa como fuente de carbono para
BrettanomycesDekkera en incubacioacuten por 5 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten
microscoacutepica
1 Negativo Negativo - No se realiza
2 Negativo Negativo - Presencia de levaduras
3 Negativo Negativo - Presencia de
Levaduras
4 Aparicioacuten de
algunas colonias
Negativo Transparente Presencia de levaduras
5 Colonias definidas Positivo-
Fenoles
Amarillo Presencia positiva de
BrettanomycesDekkera
49
Este medio tiene alto grado de selectividad para levaduras con un tiempo de
crecimiento de aproximadamente 5 diacuteas en 28C lo que lo hace raacutepido gracias al
antibioacutetico (ampicilina) que hace parte de la composicioacuten del medio no hay
presencia de bacterias Se hace confiable para resultados positivos de levaduras
BrettanomycesDekkera debido a que las levaduras Saccharomyces fueron
inhibidas con el compuesto cicloheximida su selectividad fue comprobada por
revisioacuten microscoacutepica macroscoacutepica y sensorial
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con glucosa como fuente de carboacuten son las
siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
50
Tabla 3 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono para Brettanomyces Dekkera en
incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica
1 Ninguno Negativo - -
2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras y
bacterias
9 Diminutas
colonias
transparentes
Negativo Transparentes Presencia de levaduras y
algunas bacterias
10 Positivo Positivo-
Fenoacutelicos
Amarillo Presencia de levaduras
BrettanomycesDekkera y
bacterias
El medio selectivo para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de
carbono tambieacuten es selectiva entre levaduras ya que solo se identifico la levadura
BrettanomycesDekkera en este sin embargo se evidencia una presencia de otro
microorganismo presuntamente bacteria ya que este medio no contiene agente
antibacteriano (ampicilina) Es necesaria la adicioacuten de ampicilina en una
concentracioacuten de 10mgl para inhibir la presencia de bacterias
Este medio presenta un tiempo maacutes prolongado para mostrar crecimiento de la
levadura BrettanomycesDekkera aproximadamente 10 diacuteas
51
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las
presentadas en el medio selectivo con glucosa como fuente de carbono y son las
siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
52
Tabla 4 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono y adicioacuten de ampicilina para
Brettanomyces Dekkera en incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica
1 Ninguno Negativo - -
2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
9 Diminutas
colonias
transparentes
Negativo Transparentes Presencia de levaduras
10 Positivo Positivo-
Fenoacutelicos
Amarillo Presencia de levaduras
BrettanomycesDekkera
El efecto de la ampicilina sobre el medio selectivo con etanol como fuente de
carbono fue el esperado inhibioacute completamente el crecimiento de colonias
bacterianas en el medio el tiempo de crecimiento de la levadura y presencia de
aromas fenoacutelicos fue el mismo de 10 diacuteas en incubacioacuten de 28C
53
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las
presentadas anteriormente y son las siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
82 RESULTADOS PRUEBAS MEDIO LIQUIDO
Tabla 5 Influencia de la concentracioacuten de levaduras BrettanomycesDekkera en el
tiempo necesario para detectar la produccioacuten de 4-etil-fenol en medio liquido
Nuacutemero de ceacutelulas ml
(concentracioacuten final)
Tiempo necesario para obtener resultados
positivos (diacuteas)
1 Experimento
32x106 le 3
3 X 104 3
33x102 7
40 No detectado
2 Experimento
43x106 le3
39x104 le3
37x102 8
62 No detectado
54
El nuacutemero de ceacutelulas de levadura de BrettanomycesDekkera fue contabilizado
usando contador de ceacutelulas Chamber
Los aromas fenoacutelicos son difiacuteciles de detectar debido al fuerte olor que tiene el
medio liquido caracteriacutestico de sus componentes esto dificulta la identificacioacuten del
ldquocaraacutecter Brettrdquo en especial cuando las concentraciones de
BrettanomycesDekkera no son elevadas Ademaacutes de los olores fenoacutelicos otros
compuestos volaacutetiles se detectan tales como acido aceacutetico y olores oxidativos
tambieacuten producido por la levadura BrettanomycesDekkera
En la inspeccioacuten visual se detecta alta turbidez en el medio Se compara con un
medio sin presencia de BrettanomycesDekkera
En las muestras con mayor concentracioacuten de la levadura es maacutes notoria la
turbidez Despueacutes de 3 diacuteas se presenta un precipitado blanco en todas las
muestras de altas concentraciones
La revisioacuten microbioloacutegica se realiza diariamente para determinar el nuacutemero de
ceacutelulas y la presencia positiva de la levadura a evaluar
Entre los dos experimentos realizados con el medio liquido el tiempo que se
demoro en detectar compuestos fenoacutelicos fue muy similar entre ellos
dependiendo del nuacutemero de ceacutelulas en el medio en mayores concentraciones el
tiempo de deteccioacuten fue menor
Hay que sentildealar que BrettanomycesDekkera debe alcanzar una concentracioacuten
miacutenima (denominada poblacioacuten criacutetica) de 103 UFCml para comenzar a liberar etil
fenoles Por debajo de esta concentracioacuten la levadura seriacutea metaboacutelicamente
activa pero no produciraacute compuestos alterantes a niveles detectables esto se ve
reflejado en los resultados en los que las concentraciones de ceacutelulas son muy
bajas
55
Estos resultados se comparan con los resultados dados en el medio solido Los
dos medios muestran altos grados de selectividad hacia la levadura
BrettanomycesDekkera y similar comportamiento para el crecimiento de dicha
levadura
En el medio liacutequido cuando hay altas concentraciones de BrettanomycesDekkera
el tiempo de deteccioacuten del microorganismo es menor que con el medio solido pues
en el liacutequido es aproximadamente 3 diacuteas y en el soacutelido son 5 diacuteas
83 RESULTADOS DE LA INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE
(SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO DE LA REGION DE
DALMACIA CROACIA
El vino fue analizado antes de la adicioacuten de los compuestos quiacutemicos a evaluar y
15 diacuteas despueacutes de adicioacuten para ver la reaccioacuten de este frente a SO2 y Antibrettreg
estas caracteriacutesticas se determinaron con el equipo de laboratorio Bacchus II
Microdom localizado en el laboratorio Vinolab doo Zagreb Croacia Los
resultados se muestran en la tabla
Tabla 6 Resultados de las muestras de vino inoculados con la levadura BrettanomycesDekkera
durante 15 diacuteas Comparativos con los diferentes compuestos
CFUml
Vino Day 1 Day 4 Day 10 Day 15
Control 130E+04 800E+03 700E+03 500E+03
Control 800E+03 640E+03 700E+03 280E+03
SO2 110E+04 400E+02 400E+02 67
SO2 900E+03 380E+03 270E+03 183
Antibrett 140E+05 920E+04 140E+04 400E+03
Antibrett 210E+05 181E+05 160E+04 900E+03
Antibrett 120E+05 990E+04 120E+04 100E+03
Antibrett 230E+05 204E+05 300E+03 200E+03
56
Tabla 7 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 antes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o
Antibrettreg Diacutea 0
Alcohol
()
Acidez Total
(gr Aci
Tartaacuterico L)
Acidez volaacutetil
(Aci
AceacuteticoL)
Densidad
(grml)
Azuacutecar residual
(grl)
Extracto
seco
(grl)
Acido
Laacutectico
(grl)
Glicerol
(grl)
Taninos
(grl)
Acetato
(grl)
1473
525
083
09928
473
332
164
799
305
117
1471
522
084
09927
479
329
162
786
299
116
Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
Tabla 8 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 despueacutes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o
Antibrettreg Diacutea 15
Alcohol
()
Acidez Total
(gr Aci
Tartaacuterico L)
Acidez volaacutetil
(Aci
AceacuteticoL)
Densidad
(grml)
Azuacutecar residual
(grl)
Extrac
to seco
(grl)
Acido
Laacutectico
(grl)
Glicerol
(grl)
Taninos
(grl)
Acetatos
(grl)
Control
1414
565
107
09935
436
364
177
827
259
136
Control
1415
556
108
09936
420
365
170
824
256
137
SO2
1456 543 108 09932 476 369 167 803 281 125
SO2
1457
542 108 09933 472 370 170 804 271 124
Antibrett 1454 533 106 09933 448 371 175 813 277 125
Antibrett 1455 534 105 09933 460 372 171 809 282 124
Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
57
Figura 4 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en el vino de control para
evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas
El comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en la prueba por
duplicado en el vino de control fue muy similar pues con el tiempo esta levadura
deja de reproducirse y va muriendo cuando las condiciones ya no son aptas para
su desarrollo debido a que la mayoriacutea de su fuente de carbono (Glucosa) esta
consumida sin embargo esta levadura no llega a su desaparicioacuten total lo que
representa uno de los mayores problemas en la elaboracioacuten del vino
Esta levadura tiene un metabolismo lento y el factor tiempo es un requisito
fundamental para su desarrollo este experimento se empezoacute con una alta
poblacioacuten de BrettanomycesDekkera (130 x 104 UFCml y 8 x 103 UFCml
respectivamente) y durante el transcurso del tiempo la poblacioacuten fue disminuyendo
debido a la perdida de las condiciones necesarias para la reproduccioacuten
58
Figura 5 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de SO2 en
concentracioacuten de 40 mgl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas
El SO2 tuvo un comportamiento efectivo y raacutepido contra las colonias de
BrettanomycesDekkera La poblacioacuten de esta levadura se redujo de forma
significativa entre el diacutea primero y el cuarto se encontroacute una diferencia porcentual
de 96 en la primera prueba y del 60 en la de duplicado al diacutea 15 ya la
poblacioacuten era casi nula pasando raacutepidamente de un numero por encima de la
poblacioacuten critica de la levadura BrettanomycesDekkera a un numero lt103 UFCml
siendo muy eficaz y raacutepido en el manejo de produccioacuten
Este compuesto ademaacutes de favorecer la extraccioacuten de los compuestos fenoacutelicos y
de su actividad antioxidante al inhibir la accioacuten de las polifenoloxidasas a dosis
adecuadas de un maacuteximo de 50gl inhibe la multiplicacioacuten bacteriana y de
levaduras
59
Figura 6 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de
Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo
de 15 diacuteas
Figura 7 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de
Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo
de 15 diacuteas
El compuesto Antibrettreg en la primera prueba tanto como en el duplicado tuvo su
mayor tiempo de reduccioacuten de UFCml entre los diacuteas 4-10 con una diferencia
porcentual de 91 en comparacioacuten con el diacutea cuarto al decimo a diferencia de
60
SO2 el cual presenta la gran disminucioacuten de colonias entre los primeros diacuteas de
agregarse el producto
El tiempo para que la poblacioacuten de la levadura llegara a la cantidad menor a la de
la poblacioacuten critica es mucho mayor que la del compuesto SO2 sabiendo que esta
poblacioacuten debe ser lt103 UFCml
El compuesto Antibrettreg puede tardarse 4-10 diacuteas en representar una reduccioacuten
de UFCml significativa en dicho tiempo puede representar grandes peacuterdidas
nutricionales y altos costos de produccioacuten para la fabricacioacuten
Figura 8 Comportamiento del contenido de alcohol en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin adicioacuten)
hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
BrettanomycesDekkera estaacute presente en vinos de alto contenido alcohoacutelico
aproximadamente entre 125 a 14 pues esta levadura toma a etanol como
fuente de carbono y este vino (Babic) procede de uvas muy maduras las cuales
presentan mayor cantidad de azuacutecares residuales (como glucosa y fructosa y
otras pentosas residuales)
138
14
142
144
146
148
Alcohol
Day 0 Day 15
61
Analizando el comportamiento del vino durante el experimento de 15 diacuteas sin
compuestos quiacutemicos y con SO2 y Antibrettreg a partir de las caracteriacutesticas
iniacuteciales que se determinaron seguacuten el equipo BACCHUS analizador infrarrojo se
presenta en general una reduccioacuten del contenido alcohoacutelico de este vino pero se
ve una mayor reduccioacuten en el vino de control el cual redujo en un 394 su
contenido alcohoacutelico desde el dia 0 hasta el diacutea 15 este vino no tiene ninguacuten
compuesto contra la levadura BrettanomycesDekkera y por su elevada presencia
en los 15 diacuteas de experimento consumioacute esta cantidad de etanol
Mientras en el vino que conteniacutea SO2 tras 15 diacuteas de tratamiento se vio una
reduccioacuten de alcohol de 1 ya que este compuesto redujo la cantidad de
BrettanomycesDekkera en los primeros diacuteas de tratamiento previniendo su
reproduccioacuten y protegiendo el contenido alcohoacutelico del vino Babic 2007
En los vinos de prueba con Antibrett reg la reduccioacuten alcohoacutelica se dio en un
porcentaje de 122 un poco maacutes alta que con SO2 y mucho maacutes baja en
comparacioacuten del vino de control este compuesto tambieacuten previno la gemacioacuten de
la levadura evitando la perdida de etanol en el vino sin embargo como este
compuesto duro mas en este proceso de eliminar BrettanomycesDekkera se
produjo una mayor peacuterdida alcohoacutelica
62
Figura 9 Comportamiento del contenido de acidez volatil en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin
adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
Debido a la presencia de oxigeno en los frascos la acidez volaacutetil aumento pero no
significativamente en las muestras No hubo grandes diferencias entre las
muestras con compuestos y las de control por lo que se deduce que estos
compuestos no ayudan a evitar esta acidez Esta acidez tan alta puede dantildear la
calidad del vino de forma casi irreparable Pero el factor oxigeno es de los maacutes
controlados en la produccioacuten de vinos
la alteracioacuten del aumento de la acidez volaacutetil no estaacute relacionada con la levadura
BrettanomycesDekkera sino a la presencia de oxigeno en el almacenamiento el
oxigeno fue usado en esta prueba para promover condiciones apropiadas para el
desarrollo de la levadura
002040608
112
Acidez Volatil
Day 0 Day 15
63
Figura 10 Comportamiento del contenido de Acido Acetico en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin
adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
Brettanomyces Dekkera son productores de aacutecido aceacutetico y elevan el contenido
de los vinos anormalmente en condiciones de anaerobiosis En condiciones de
aerobiosis producen concentraciones bajas o nulas de aacutecido aceacutetico
Este acido aceacutetico al igual que los fenoles afecta el sabor y el perfil olfativo del
vino tinto este efecto es tambieacuten producido por la levadura
BrettanomycesDekkera vemos en los resultados el gran crecimiento de este
compuesto en el vino control el cual no tenia compouestos en contra de
BrettanomycesDekkera lo que produjo este aumento significativo del acido aceacutetico
en comparacioacuten con estos que teniacutean SO2 y Antibrettreg entre ellos la diferencia en
este compuesto es muy reducida y no significativa pues estos compuestos no
permitieron la gemacioacuten de esta levadura y esta no produjo este acido en esa gran
cantidad
A este compuesto se le atribuye el olor y sabor a vinagre del vino tinto un defecto
muy comuacuten y poco agradable para el consumidor
105110115120125130135140
Acido Acetico
Day 0 Day 15
64
Figura 11 Comportamiento del contenido de Azucares reductores en vino Babic 2007
desde el diacutea 0 (sin adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en
comparacioacuten con el vino de control
BrettanomyesDekkera utiliza los azucares residuales como fuente de carbono
para su crecimiento en el vino este es el factor maacutes importante para su desarrollo
y este es el que determina en cierto caso la cantidad de levaduras de
BretanomycesDekkera presente en las graficas se determina claramente que en
el vino de control donde la cantidad de esta levadura es muy alta 15 diacuteas despueacutes
de empezar las pruebas la cantidad de azucares reductores es muy baja y ha
bajado en un porcentaje de 10 mientras que el vino que tiene SO2 bajo la
cantidad de azucares reductores en un 042 y el vino que tiene el compuesto
Antibrettreg redujo su nivel de azucares reductores en 462
38
4
42
44
46
48
5
Azucares Reductores
Day 0 Day 15
65
84 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE
CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON
EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID
PHASE
Tabla 10 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en
vino Babic 2007 con el meacutetodo propuesto
Compuesto Tiempos de
retencioacuten (min)
Acetaldehiacutedo 1437
Propanol 3759
Diacetil 4202
Etil-acetato 4523
i-butanol 6232
Acido Aceacutetico 7840
i-amil alcohol 11740
n-amil 13489
lactato de etiacutelico 15741
acetato amil metiacutelico 17796
1-hexanol 19101
etil-hexanol 24456
Linalol 30370
2-feniletanol 32768
p-cresol 33522
octanoato de etilo 34226
4-etilfenol 37100
2-feniletil acetato 32769
4-etilguayacol 39704
4 vinilfenol 40529
decanoato de etilo 42117
Refirieacutendose a estos resultados es necesaria la creacioacuten de soluciones estaacutendar
para determinar tiempos de retencioacuten con el meacutetodo y si es necesario ajustes a
este
66
Tabla 11 Soluciones estaacutendar para compuestos en vinos tintos Croatas
MODEL 0
(en volumen de 100 ml en 40 Etanol)
Compuesto Pureza Cantidad
(g)
Concentracioacuten (gl)
Acetaldehiacutedo 099 1623 160677
Propanol 0995 13849 137718
Diacetil 098 01071 104958
Etil-acetato 0995 30172 3002114
i-butanol 099 15016 1486584
Acido Acetico 0995 0 0
i-amil alcohol 099 20116 1991484
n-amil 098 15442 1513316
lactato de etilio 098 00507 049686
acetato amil metilico 098 01028 100744
1-hexanol 098 00367 035966
etil-hexanol 098 00308 029876
Linalol 097 00288 027936
Nerol 097 00311 030478
Citronelol 098 0031 03038
Geraniol 098 15803 1548694
2-feniletanol 098 00402 039396
4-etilfenol 098 00812 078764
octanoato de etilo 097 00597 059103
2-feniletil acetato 099 00315 031185
4-etilguayacol 098 00803 079674
Fuente Laboratorio de anaacutelisis e investigacioacuten de bebidas Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea
de Alimentos Universidad de Zagreb Zagreb Croacia 2009
Las soluciones estaacutendar se realizan teniendo como referencia las cantidades de
estos compuestos en los vinos tintos croatas datos suministrados por el Doctor
Leo Gracin en concentraciones de gl a partir de este dato y teniendo en cuenta
67
la pureza de los compuestos que se teniacutean en el laboratorio de anaacutelisis e
investigacioacuten de bebidas se crean las soluciones estaacutendar Ejemplo
Solucioacuten estaacutendar para 4 etil-fenol en un volumen de 100 ml
Con estas soluciones estaacutendar se realizo el tiempo de retencioacuten para corroborar el
meacutetodo Los resultados de esto fueron tiempos de retencioacuten diferentes a los del
meacutetodo primero con el que se realizaron los ensayos y a partir de esos resultados
se ajusto el meacutetodo con el que se trabajo
68
Tabla 12 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en
vino Babic 2007 con el meacutetodo modificado
Compuesto Tiempos de
retencioacuten (min)
Acetaldehiacutedo 1542
Propanol 4046
Diacetil 4733
Etil-acetato 4807
i-butanol 6659
Acido Acetico 8343
i-amil alcohol 12123
n-amil 13866
lactato de etilio 16072
acetato amil metilico 18336
1-hexanol 19447
etil-hexanol 24835
Linalol 31831
2-feniletanol 33305
p-cresol 33703
octanoato de etilo 34571
4-etilfenol 37724
Citronelol 38326
Nerol 38576
2-feniletil acetato 39012
Geraniol 39944
4-etilguayacol 40271
4 vilifenol 41168
decanoato de etilo 42657
69
DIA 0
Se coloca ISTD a todas las muestras respectivas para poder determinar
cantidades de los compuestos aromaacuteticos
Se realiza la cromatografiacutea de gas al vino Babic 2007 antes de ser inoculado con
BrettanomycesDekkera
Tabla 13 Resultados de la cromatografiacutea de gas del vino Babic 2007
Compuesto Tiempo de retencioacuten
min
Cantidad
mgl
Acetaldehiacutedo 1542 0
Propanol 4046 0
Diacetil 4733 37215204
Etil-acetato 4807 0
i-butanol 6659 0
Acido Aceacutetico 8343 2817465
i-amil alcohol 12123 16799019
n-amil 13866 26
lactato de etiacutelico 16072 10983961
acetato amil metiacutelico 18336 0185196
1-hexanol 19447 264655
etil-hexanol 24835 0158751
Linalol 31831 0
2-feniletanol 33305 4235560
p-cresol 33703 1
octanoato de etilo 34571 0152412
4-etilfenol 37724 00581345
Citronelol 38326 00439729
Nerol 38576 00344799
2-feniletil acetato 39012 00407983
Geraniol 39944 0
4-etilguayacol 40271 0
4 vilifenol 41168 0
Decanoato de etilo 42657 00190144
70
Basados en los compuestos aromaacuteticos que brinda el ldquoCaraacutecter Brettrdquo se van a
analizar detalladamente los siguientes aromas 4-Etilfenol 4-Etilguayacol 4-
Vinylfenol
Figura 12 Compuestos aromaticos en vino tinto Babic sin estar contaminado con la levadura
BrettanomycesDekkera
El vino a analizar esta por debajo de las concentraciones consideradas como
perjudiciales para el aroma del vino tinto (El umbral sensorial del 4-etilfenol es de
230 μgl y el del 4-etilguaiacol es de 47 μgl) pues posee una concentracion de
58microgL de 4etilfenol 0 microgL de 4 etilguayacol y 0 microgL de vinylfenol
841 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGUacuteN TEMPERATURAS
DE ALMACENAMIENTO
0
02
4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinylfenol
Vino 00581345 0 0
C (
mg
L)
Vino Babic 2007 Dia 0
71
Tabla 14 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el
ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 20C por 4 diacuteas Prueba por duplicado
MUESTRAS INCUBADA A 20C
Compuesto Day 1
Amount
(mgL)
Day 2
Amount
(mgL)
Day 3
Amount
(mgL)
Day 4
Amount
(mgL)
4-etilfenol 0260244 017294 0177547 020156
4-etilfenol 0260244 0245915 0204542 0262499
4-etilguayacol 0 0 0 0
4-etilguayacol 0 0 0 0
4 vinilifenol 1107096 781349 685317 460323
4 vinilifenol 1107096 1297465 621324 693225
72
Figura 13 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
BrettanomycesDekkera es la levadura responsable de la produccion de 4-etil-
fenol compuesto asociado con olores caracteristicos a ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 00581345 0260244 0172935 0177547 020156
C (
mg
L)
4 etilfenol
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 00581345 0260244 0245915 0204542 0262499
C (
mg
L)
4 etilfenol
73
caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo dantildeando la calidad sensorial del vino tinto Babic la
produccioacuten de este compuesto en esta muestra realizada por duplicado fue
ascendente y tuvo incremento muy grande en el primer dia de almacenamiento y
en el transcurso de los siguientes cuatro diacuteas se mantuvo relativamente estable lo
cual no concuerda con el comportamiento tiacutepico de esta levadura quien tiene un
crecimiento lento e incrementa la produccioacuten de fenoles con su gemacioacuten esto
genera muchas dudas sobre el buen funcionamiento del equipo GC o de la
estabilidad de las levaduras BrettanomycesDekkera en este almacenamiento
Figura 14 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar prueba por duplicado
002040608
1
Vino Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0 0 0
4 etilguayacol
002040608
1
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0 0 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
74
Presencia negativa de 4 etil guayacol durante todo el almacenamiento
probablemente las condiciones de almacenamiento y el medio no dieron lugar al
desarrollo de este compuesto el cual se considera menos conflictivo que el 4-etil-
fenol
Figura 15 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
Estos resultados tambieacuten dejan dudas del normal comportamiento de dicha
levadura pues indican que la levadura no convirtioacute este compuesto en etilfenol
0
2
4
6
8
10
12
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 110709781349685317460323
4 vinylfenol
0
2
4
6
8
10
12
14
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
Series1 0 11071 12974 62132 69322
C (
mg
l)
4 Vinylfenol
75
durante el almacenamiento caracteriacutestica que solo la levadura
BrettanomycesDekkera puede realizar se ve que las concentraciones de
vinylfenoles son mucho mas altas que las de fenoles lo que nos deja determinar
que la poblacioacuten de BrettanomycesDekkera es muy baja y existen otras levaduras
productoras de vinylfenoles en este tipo de vino en las condiciones de
almacenamiento dadas para estas pruebas
Tabla 16 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el
ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 28C por 4 diacuteas
MUESTRA 2 INCUBADA A 28C
Compuesto Day 1
Amount
(mgL)
Day 2
Amount
(mgL)
Day 3
Amount
(mgL)
Day 4
Amount
(mgL)
4-etilfenol 0260244 019612 0186614 019932
4-etilfenol 0260244 020576 0214917 0193554
4-etilguayacol 0 014304 0223836 0
4-etilguayacol 0 002287 00529832 0
4 vinilifenol 1107096 787068 665182 397847
4 vinilifenol 1107096 284389 00204392 0
76
Figura 16 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar
El desarrollo de este compuesto en el diacutea 1 fue significativo y luego relativamente
estable el comportamiento fue similar en las pruebas de diferentes temperaturas
de almacenamiento para este compuesto el cual es el maacutes problemaacutetico en la
industria viniacutecola
0
005
01
015
02
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 005813019932018661019611019932
4 etilfenol
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 005813 019355 021491 020576 026024
4 etilfenol
77
Figura 17 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar
Los resultados de la prueba son poco confiables y no entendibles por lo que
podemos verificar que el GC no estaacute trabajando de forma adecuada para la
deteccioacuten del compuesto
0001002003004005006
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 Etilguayacol 0 0 0022 0053 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
0005
01015
02025
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0223 0143 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
78
Figura 18 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
El comportamiento de este compuesto en la prueba es muy irregular y poco
confiable
0
2
4
6
8
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 397847665182787068397847
4 vinylfenol
0
2
4
6
8
10
12
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 11071 28438 00204 0
4 vinylfenol
79
Figura 19 Comportamiento del compuesto 4 etilfenol durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
La concentracioacuten de 4 etil fenol fue mayor al cuarto diacutea almacenado a
temperatura ambiente de 20C pero este compuesto no tuvo una actividad notoria
de ascenso durante su almacenamiento como se esperaba lo que deja muchas
dudas sobre los resultados de este ensayo
0
05
1
15
2
25
3
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etil fenol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 20C
80
Figura 20 Comportamiento del compuesto 4 etil guayacol durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
Comportamiento anormal del compuesto no se ve tendencias de aumento o
disminucioacuten de este en ninguna de las pruebas no tiene un comportamiento
regular pues se esperaba que la levadura BrettanomycesDekkera
descarboxinizara el compuesto 4-vinilguaiacol y aumentar las concentraciones de
4-etilguaiacol esta reaccioacuten no se hizo notoria en los compuestos aromaacuteticos
seguacuten lo determino el Cromatografo de Gas (GC)
0
005
01
015
02
025
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3
C (
mg
L)
4 etil guayacol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 20C
81
Figura 21 Comportamiento del compuesto 4 Vinyl fenoll durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
La no presencia de este compuesto en el vino original demuestra las baja o casi
nula presencia de la levadura BrettanomycesDekkera al diacutea primero este
compuesto incrementa de forma notoria en las muestras debido a la presencia de
acido cumaacuterico en el medio ya que sufre su carboxilacion convirtieacutendose en 4 vinyl
fenol sin embargo su comportamiento no fue regular y presento problemas de
lecturas
0
2
4
6
8
10
12
14
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
C (
mg
L)4 Vinyl fenol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 28C
82
9 CONCLUSIONES Y
RECOMENDACIONES
91 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO
Se desarrolloacute un medio selectivo soacutelido para BrettanomycesDekkera
accesible y faacutecil de elaborar
Se detectan colonias de la levadura BrettanomycesDekera en el agar
selectivo con glucosa como fuente de carbono en un lapso de 5 diacuteas en
incubacioacuten a 28C
El medio selectivo soacutelido con Glucosa como fuente de carbono fue maacutes
raacutepido y efectivo ya que toma 5 diacuteas para dar resultados positivos frente al
de Etanol como fuente de carbono el cual toma 10 diacuteas para mostrar
resultados positivos aunque ambos dieron resultados satisfactorios en la
selectividad de la levadura BrettanomycesDekkera
La levadura se adapto de forma satisfactoria a estos medios en
condiciones de almacenamiento propias para su desarrollo (28C)
Las colonias de la levadura BrettanomycesDekkera tiene un crecimiento
en estos medios soacutelidos de forma circular con topografiacutea convexa y borde
entero dimensiones 5-6 mm color Amarillo opacicidad oscuro
83
superficie lisa y suave siendo faacutecil de identificar y realizar los conteos
necesarios
El medio solido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten
de la levadura BrettanomycesDekkera en vino tinto es raacutepido econoacutemico
y uacutetil
El uso de azucares para fermentacioacuten de la levadura
BrettanomycesDekkera que Saccharomyces no puede fermentar para
mayor selectividad
Realizacioacuten de pruebas Bioquiacutemicas como meacutetodo raacutepido de selectividad
92 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DESARROLLO DEL MEDIO LIacuteQUIDO
Se desarrollo un medio selectivo liquido para BrettanomycesDekkera
accesible y faacutecil de elaborar
Este medio mostroacute resultados positivos de la presencia de
BrettanomycesDekkera en un lapso de tiempo menor (3 diacuteas) que con el
medio solido (5 diacuteas) en caso de que el nuacutemero de ceacutelulas de la levadura
BrettanomycesDekkera sea mayor a la poblacioacuten critica (103)
Cuando la poblacioacuten de ceacutelulas de la levadura BrettanomycesDekkera es
menor a la poblacioacuten critica el tiempo de identificacioacuten de esta levadura por
medio liquido es muy prolongado puede tomar maacutes de 10 diacuteas o incluso no
detectarlo
84
Los compuestos quiacutemicos usados para el desarrollo del medio liacutequido no
son los adecuados para este tipo de medios donde los resultados positivos
son olfativos pues estos compuestos emiten fuertes olores que confunden
los olores caracteriacutesticos del caraacutecter Brett
El medio liquido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten
de altas concentraciones de la levadura BrettanomycesDekkera en vino
tinto es raacutepido econoacutemico y uacutetil
93 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg
EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE DALMACIA
CROACIA
Este trabajo mostroacute que el dioacutexido de azufre (SO2) tiene buenos resultados
en contra de la levadura BrettanomycesDekkera en concentraciones
normales de 40mgl concentracioacuten en la que se trabaja este compuesto en
los vinos tintos
En Europa el dioacutexido de azufre es usado de forma tradicional en gran
nuacutemero de alimentos y especialmente en vinos sin embargo y a pesar de
su uso regulado se busca la sustitucioacuten de este o su maacutexima reduccioacuten
para hacer de este producto maacutes sano para las personas no tolerantes a
este tipo de compuestos sin embargo seguacuten el trabajo realizado en
comparacioacuten con el producto Antibrettreg el SO2 es maacutes eficaz en el control
85
de la levadura ayudando a evitarla y eliminarla de la cadena productiva del
vino tinto
Gracias a sus caracteriacutesticas el vino tinto Babic es muy vulnerable a la
levadura BrettanomycesDekkera pero a su vez se puede tratar faacutecilmente
con productos como SO2 y Antibrettreg aunque es maacutes efectivo contra
BrettanomycesDekkera el dioacutexido de azufre (SO2)
Antibrettreg es una buena opcioacuten para el control de BrettanomycesDekkera
para evitar el uso de productos alergenicos como SO2
94 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN
EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO
MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE
Al terminar la primera prueba con anaacutelisis en cromatografiacutea a gas y el SPME
queda como resultados
Es necesario repetir la prueba
No se determina el efecto de los estaacutendares internos sometidos a tiempos
de almacenamiento en temperaturas de 20C y 28C lo que puede dar falsos
resultados de cantidades de compuestos
86
Se debe crear un medio maacutes apto para el desarrollo de la levadura y un
control diario de crecimiento ( agregar maacutes Glucosa en caso de que se
haya consumido toda controlar presencia de Bacterias y otros
microorganismos que no se deseen en el medio)
Es necesario control de aromas con panel sensorial para determinar el
umbral de deteccioacuten en este vino
Control de crecimiento por medio solido Selectivo para
BrettanomycesDekekra conteo de colonias presentes en el vino inoculado
y su desarrollo durante almacenamiento a diferentes temperaturas
La segunda prueba no fue posible realizarla por dantildeos en el equipo de
cromatografiacutea de gas (GC)
87
ANEXOS
11
89
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientiacuteficas 99 Grupos de
Investigacioacuten Enoloacutegica Zaragoza Espantildea
93
11
GRACIAS es una palabra corta para todo lo que quiero expresar a todos aquellos que
hicieron parte de este suentildeo hecho realidadhellip
A Dios y a la virgen Auxiliadora por llevarme de su mano cada diacutea de mi carrera en cada
momento alegre y en cada momento difiacutecil fueron mi fortaleza
A mis papitos por hacer de mi estudio una realidad por su sacrificio y apoyo desinteresado y
sincero
A mi Hermanito por ser mi fortaleza mi ejemplo y mi amigo incondicional
A mi familia Blanco y Urrea por su compantildeiacutea durante esta etapa
A mi facultad (Decano Dr Camilo Rozo Dra Patricia Jimeacutenez y mis profesores) por
ensenarme mi profesioacuten y aportar lo mejor de ustedes para mi formacioacuten personal
A mis asesores de Tesis (Ing Patricia Chaparro y Dr Sc Leo Gracin) por su guiacutea y
colaboracioacuten oportuna
A mis queridos amigos quienes siempre han estado a mi lado en las dificultades y en las
alegriacuteas (Ingrid Mafe Cami G Cami R Harold Pipe Karla Andreacutes T Diego G)
A IAESTE en alianza con el ORI por hacer posible mi intercambio y poder hacer mi tesis en el
maravilloso paiacutes de Croacia
A Croacia por ser mi segundo hogar por abrirme sus puertas y su corazoacuten por brindarme
tan maravillosas personas en mi camino
Croatia Thank you for being my second home for opening your doors and your heart to me
and give me the opportunity to meet so many wonderful people
To my boss my teacher my mentor and specially my friend Leo
To the faculty of food technology and Biotechnology and the department of technology
and analysis of beverages for give me the opportunity to give all my knowledge to the
project and learn a lot more
To all the amazing people I met during this experience (Igor Karin Natka Josip Ana Matija
Daniel Pz Szilvia Dini Daniela Lidija Sanja and everybody else who I had the pleasure to
meet in this great trip) for give me the best of your hearts
I only have one thing to say hellipTHANK YOU
Solo me queda una palabra por decirhellipGRACIAS
12
24 generaciones de ceacutelulas hijas Las yemas sucesivas se forman siempre en
sitios diferentes de la superficie de la ceacutelula9
111 Gemacioacuten multilateral
La gemacioacuten multilateral ocurre en el ldquohombrordquo o aacuterea de la levadura donde ocurre
la reproduccioacuten La gemacioacuten y ciclo de separacioacuten crea un problema para las
levaduras durante su fase fermentativa pues en este tiempo la ceacutelula madre se
reduce aproximadamente un medio Porque la siacutentesis de la membrana celular
ocurre bajo condiciones anaeroacutebicas lo que limita los ciclos asexuales
replicativos Como resultado la mayoriacutea de las fermentaciones se completan en la
fase estacionaria (no gemacioacuten) Un ejemplo de esta reproduccioacuten es
BrettanomycesDekkera10
112 Gemacioacuten Polar
A diferencia de la gemacioacuten multilateral la gemacioacuten polar puede ocurrir en uno o
dos polos En el caso de Kloeckera y Saccharomyces la gemacioacuten ocurre en
ambos polos aumentando la poblacioacuten de levaduras con forma de ldquolimoacutenrdquo 11
113 Fisioacuten
Esta reproduccioacuten es caracteriacutesticas del genero Schizosaccharomyces donde la
formacioacuten de la ceacutelula hija ocurre sin la reduccioacuten de la madre ceacutelula como en los
casos anteriores En este caso la formacioacuten de la microscoacutepica pared celular
ocurre entre la madre ceacutelula y la hija seguida por la separacioacuten12
9 Araya Pablo 2002 Reproduccioacuten de hongos unicelulares mediante gemacioacuten esporulacioacuten y
fisioacuten httphtmlrincondelvagocomreproduccion-asexualhtml
10 11 12 Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic
Publishers GmbH United States of America and Canada
13
114 Pseudomycelium
Cualquier fabricante de vinos ha tenido la oportunidad de notar la formacioacuten de
una peliacutecula en la superficie del vino Esto surge debido a la gemacioacuten repetida de
las levaduras oxidativas y fallas en el momento de la separacioacuten de la ceacutelula hija
de la madre Con el tiempo el lazo previo entre la madre ceacutelula e hija se ampliacutea
dando la impresioacuten de filamentos como si se tratase de mohos siendo que son
levaduras 13
12 TAXONOMIA
Para distinguir las levaduras que pueden producir ascoporas de aquellas que no
los micologistas usan doble taxonomiacutea para su clasificacioacuten Desafortunadamente
la nomenclatura para la combinacioacuten anamorfotelemorfo es frecuentemente
diferente Unos ejemplos de levaduras sexualasexual o telemorfoanamorfo son
DekeraBrettanomyces Metschnikowia pulcherrimaCandida pulcherrima
Hanseniaspora uvarumKloeckera apiculata Torulaspora delbruecki Candida
colliculosa 14
Sin embargo las levaduras son diferenciadas por los taxonomistas por asignacioacuten
de varios nombres de geacutenerosespecies varios vinicultores usan un sistema
informal para agrupar levaduras basadas en su morfologiacutea u otras caracteriacutesticas
Por ejemplo a Kloeckera apiculata se le refiere como ldquolevadura apiculadardquo
tiene forma de limoacuten Esta levaduras asi com muchas otras presentes en el mosto
de la uva como lo son Candida Cryptococcus Debaryomyces Hansenula
Issatchenkia Kluyveromyces Metschnikowia Pichia y Rhodotorula tambieacuten son
llamadas levaduras ldquonativasrdquo ldquonaturalesrdquo o ldquosalvajesrdquo por su origen el vintildeedo o en
13
Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers
GmbH United States of America and Canada
14 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
14
la vinera Algunos enoacutelogos han discutido contra el uso de estos teacuterminos porque
esta implicancia no sucede en todas las levaduras ya que estas son de alguna
forma ldquono-nativasrdquo o ldquono naturalesrdquo (Ej Saccharomyces o Brettanomyces) El
teacutermino ldquono Saccharomycesrdquo es maacutes comuacuten para nombrar aquellas levaduras
presentes en el mosto de la uva que no son del genero Saccharomyces15
Las levaduras encontradas despueacutes de la fermentacioacuten alcohoacutelica tambieacuten son
asignadas a un grupo informal Algunas veces las levaduras que conducen la
principal fermentacioacuten (Saccharomyces) son muchas veces llamadas ldquolevaduras
fermentativasrdquo basados en su metabolismo Durante su antildeejamiento algunas
levaduras (Candida Hansenula y Pichia) pueden crecer en la superficie en
presencia de oxigeno Esta peliacutecula superficial es comuacutenmente asociada a
deterioro del vino esta levadura se le conoce como ldquolevadura formadora de
peliacuteculardquo16
121 DekkeraBrettanomyces
La taxonomiacutea cientiacutefica sobre BrettanomycesDekkera ha cambiado en los uacuteltimos
antildeos Brettanomyces estaacute clasificado dentro de la misma familia que
Saccharomyces (familia Saccharomycetaceae) Actualmente dentro del geacutenero
Brettanomyces se aceptan cinco especies diferentes (B bruxellensis B
anomalus B custersianus B nanas y B naardenensis)17
Las teacutecnicas de biologiacutea molecular han demostrado que B intermedious B
lambicus B custerseii o D intermedia son sinoacutenimos de B bruxellensis por lo
que estas denominaciones han quedado en desuso Los microorganismos de este
geacutenero presentan dos formas una capaz de reproducirse sexualmente (Dekkera)
15
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
16 Kurtzman CP 1998 The industrial and agricultural significance of yeasts 4
th Edition Amsterdam
Holanda
17 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
15
y otra que lo hace asexualmente (Brettanomyces) Tambieacuten se llaman
respectivamente forma perfecta y forma imperfecta En algunos casos la forma
perfecta y la imperfecta reciben nombres diferentes como ocurre con B anomalus
y D anomala En otros casos el nombre es similar como las pertenecientes a la
especie bruxellensis que pueden parecer como D bruxellensis como B
bruxellensis o como BrettanomycesDekkera A efectos praacutecticos en la bodega
estos dos estados son similares Cuando vemos referencias a Brettanomyces
como contaminante en la mayor parte de los casos se refieren a
DekkeraBrettanomyces ya que este es el responsable de las alteraciones en el
vino18 y 19
La morfologiacutea celular de BrettanomycesDekkera es ojival o ciliacutendrica con
gemacioacuten multipolar en reproduccioacuten vegetativa Una de las caracteriacutesticas de
este geacutenero es su tamantildeo celular variable y la formacioacuten de filamentos19
18 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 23
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
19
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
16
Figura 1 Microfotografiacutea de cultivo de BrettanomycesDekkera a) Variabilidad morfoloacutegica y de
tamantildeo celular b) forma filamentosa
Fuente Lopez-Cordon Eva BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia wwwacenologiacom
Los defectos sensoriales asociados directamente a Brett aparecen
mayoritariamente en vinos tintos de calidad y las causas radican en la propia
fisiologiacutea del microorganismo Ademaacutes al ser una levadura de crecimiento muy
lento la alteracioacuten se presenta principalmente durante el almacenamiento y sobre
todo la crianza del vino habitual en los vinos tintos de gama alta En las barricas
de madera el microorganismo tiene a su disposicioacuten todo el sustrato y tiempo
suficiente para realizar su actividad La naturaleza porosa de la madera y su difiacutecil
limpieza contribuye a que las poblaciones existentes se mantengan incluso
despueacutes del lavado de la barrica Ademaacutes BrettanomycesDekkera tiene la
capacidad de degradar uno de sus componentes la celobiosa 20
13 CARACTERISTICAS FISIOLOGICAS
S cerevisiae y BrettanomycesDekkera tienen metabolismos similares muy
adaptados a las condiciones de vinificacioacuten Tras la fermentacioacuten alcohoacutelica S
cerevisiae es la levadura mayoritaria debido a que las condiciones nutricionales
20
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
17
del vino son muy estrictas (altas concentraciones de etanol y bajas
concentraciones de nutrientes) En este momento BrettanomycesDekkera
continuacutea creciendo gracias a que utiliza nutrientes que S cerevisiae no ha podido
consumir sobre todo algunos azuacutecares y fuentes de nitroacutegeno21
Una de las caracteriacutesticas que diferencia a BrettanomycesDekkera es la gran
diversidad de azuacutecares que puede fermentar (ver tabla de Relacioacuten de los
principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) La mayoriacutea de
las cepas pueden crecer utilizando trealosa y celobiosa azucares presentes en el
vino y no consumibles por S cerevisiae Otra de las ventajas que presenta frente
a S cerevisiae (y frente a la mayoriacutea de las levaduras) es que puede utilizar los
nitratos como fuente de nitroacutegeno Debido a que S cerevisiae soacutelo utiliza el
nitroacutegeno amoniacal y los aminoaacutecidos libres estos se consumen con relativa
rapidez Al final de la fermentacioacuten el nitroacutegeno moniacal es escaso y se favorece
el crecimiento de las levaduras que pueden utilizar otras fuentes de nitroacutegeno
Ademaacutes Brettanomyces puede crecer con concentraciones de fosfato diamoacutenico
tan bajas como 05gl o a partir de diversos aminoaacutecidos En resumen
BrettanomycesDekkera crece maacutes despacio que S cerevisiae es resistente a
concentraciones altas de alcohol puede utilizar otros azucares como fuentes de
energiacutea y nitrato como fuente de nitroacutegeno Esto explica que pueda reproducirse
cuando la fermentacioacuten alcohoacutelica ha terminado a partir de nutrientes no
consumibles por S cerevisiae y cuando no tiene competidores22
21
Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
22 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
18
Tabla 1 Relacioacuten de los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto
Fuente Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista
VINOTEQ N 38 pag 21 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
131 BrettanomycesDekkera y siacutentesis de fenoles volaacutetiles
El origen de los fenoles volaacutetiles estaacute relacionado con la actividad secuencial de
dos enzimas que descarboxilan los aacutecidos en hidroxiestirenos (vinilfenoles) que
19
son posteriormente reducidos a etilderivados (etilfenoles)23 como puede
observarse en la figura 2
Figura 2 Siacutentesis de etilfenoles de BrettanomycesDekkera
Fuente ACE revista de Enologia wwwacenologiacom
El primer paso de descaboxilacion de los aacutecidos hidroxicinamicos es comuacuten
tambieacuten en otros microorganismos como bacterias hongos y otras levaduras Sin
embargo el segundo paso reduccioacuten de vinilfenoles es caracteriacutestico de algunos
tipos de levaduras como Dekkera bruxelliensis D anomala Pichia guillermondi
Candida versarilis C halophila y C mannitofaciens24
Los fenoles volaacutetiles que se asocian al problema Brett en vinos son el 4-etilfenol y
el 4- etilguaiacol asiacute como sus precursores intermedios 4-vinilfenol y 4-
vinilguaiacol aunque estos uacuteltimos son menos importantes por ser muy reactivos y
raacutepidamente convertidos en etilfenoles por BrettanomycesDekkera o en su caso
23
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
24 Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
20
condensan con otras moleacuteculas como antocianos25 Los etilfenoles y
especialmente elevadas concentraciones de 4-vinilfenol en vinos se asocian con
aromas desagradables asociados a descriptores como ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de
caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo26
El umbral sensorial del 4-etilfenol es de 230 μg l-1 y el del 4-etilguaiacol es de 47
μgl Pese a su menor umbral sensorial el 4-etilguaiacol responde a descriptores
como ldquobaconrdquo o ldquoahumadordquo que a bajas concentraciones aportan complejidad por
lo que se puede considerar sensorialmente menos conflitivo que el 4-etilfenol 27
Figura 3 Defectos sensoriales producidos en el vino por BrettanomycesDekkera
Fuente Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
25 Morata A Goacutemez-Cordoveacutes M Calderoacuten F Suaacuterez J 2006 Effects of pH temperature and SO2 on the
formation of pyranoanthocyanins during red wine fermentation with two species of Saccharomyces Journal Food Microbiology No106 pag 4 Madrid Espana
26 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea 27 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
21
132 Identificacioacuten de BrettanomycesDekkera
Los Bioacutelogos usan sistemas de identificacioacuten basados en similitudes taxonoacutemicas
entre organismos dichas similitudes pueden ser morfoloacutegicas tipos capacidad de
produccioacuten de sustratos como azuacutecar yo nitratos caracteriacutesticas fisioloacutegicas y
bioquiacutemicas secuencia del material geneacutetico y respuestas inmunoloacutegicas28
En la industria viniacutecola es importante recurrir a diferentes tipos de pruebas para la
identificacioacuten de microorganismos una de estas y la maacutes realizada es la revisioacuten
del microorganismo bajo el microscopio Esta prueba brinda informacioacuten sobre la
morfologiacutea del microorganismo (cocos bacilos formas puntudas ojival entre
otros) tamantildeo (dimensiones) agrupaciones celulares (solas parejas triacuteos
grupos o cadenas) Sin embargo el uso del microscopio es una prueba raacutepida
para examinar mostos o vino pero no determina cantidades que muchas veces es
requerido para tratamientos de accioacuten otro de los inconvenientes es que los
microorganismos pueden variar su morfologiacutea en forma o tamantildeo dependiendo de
la edad y las condiciones de crecimiento por lo que puede no ser clara la
identificacioacuten de este29
14 Medios soacutelidos selectivos
Si se requiere de la confirmacioacuten del microorganismo este debe ser aislado del
vino para una caracterizacioacuten para esto se requiere de medios soacutelidos Cuando se
examina un microorganismo en un medio solido es importante revisar las
caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias (ver figura 4 Morfologiacuteas de colonias
en medios soacutelidos) Entre estas caracteriacutesticas estaacuten forma (circular irregular o
2829 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
22
rizada) tamantildeo (dimensiones estas normalmente se expresan en miliacutemetros)
topografiacutea (plano elevado convexo coacutencavo o embonado) presencia de
pigmentos opacidad (transparente traslucido u opaco) superficie (suave rugosa
lisa o aacutespero) bordes (entero ondulado crespo dentado rizado) o cualquier
cambio en el agar (color opacidad cambios en los indicadores de pH o CaCO3
respectivamente)30
Figura 4 Varias morfologiacuteas de crecimiento de colonias en medio solido
Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007
Gran nuacutemero de medios selectivos se han creado para la aislacioacuten deteccioacuten yo
conteo de levaduras provenientes de jugos de uva mostos o vinos El medio maacutes
utilizado en estos fines es YPD (Yeast Peptone Dextrose) pero dicho medio no
es selectivo entre levaduras y se usa comuacutenmente para el conteo de
Saccharomyces31 Las colonias empiezan a parecer con un periodo de incubacioacuten
30
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
31 Essia Ngang J Wolniewicz E Villa P2005 Stimulation of lactobacilli during alcoholic fermentation action
of sucrose hydrolysis by yeast Biotechnology letters No 8 pag 743 Amiens France
23
de 2 a 4 diacuteas a 22C a 25C Igualmente el agar de jugo de uva es no selectivo y
presenta faacutecil crecimiento de levaduras bacterias y mohos
Para la levadura Brettanomyces Dekkera se han elaborado diferentes medios
selectivos entre ellos el maacutes conocido es WL por sus siglas en ingles del
laboratorio que lo creo ldquoWallerstein Laboratoriesrdquo este medio contiene
cicloheximida compuesto selectivo para Brettanomyces e inhibe Saccharomyces
El punto criacutetico es encontrar la cantidad exacta de este compuesto para la
inhibicioacuten de las levaduras sin que afecte a BrettanomycesDekkera32
Ademaacutes del medio WL BrettanomycesDekkera puede ser cultivado en otros
medios selectivos como Brettanomyces medio A creado por Vilas en 1993
Brettanomyces medio B el cual contiene cicloeximida como agente selectivo
mientras que Brettanomyces medio C tiene cicloheximida y ampicilina este medio
fue creado por B Watson en 1998 Brettanomyces medio D fue creado
recientemente por Rodrigues en 2001 este medio es conocido como DBDM
(DekkeraBrettanomyces differential medium ) es un medio selectivo para
Brettanomyces en contra de Saccharomyces y otras levaduras este medio es el
maacutes utilizado en la vineras para caracterizacioacuten de BrettanomycesDekkera
actualmente33
15 Dioacutexido de azufre (SO2) en vinos
32
33
Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers
GmbH United States of America and Canada
24
El dioacutexido de azufre tambieacuten llamado oxido de azufre es un eficaz agente
conservante antioxidante y antimicrobiano en la industria viniacutecola34
Durante la vinificacioacuten SO2 ha representado histoacutericamente una herramienta muy
importante usada por los vinicultores para el control de crecimiento microbioloacutegico
Debido a preocupaciones por la salud del consumidor el uso de este producto ha
disminuido dramaacuteticamente con el posible riesgo de aumentar el riesgo
microbioloacutegico35
El actual liacutemite legal de SO2 en vinos en los Estados Unidos es de 350mgL una
concentracioacuten mucho mayor a la usada en la industria viniacutecola No obstante vinos
que contienen maacutes de 10mgL deben declarar este compuesto en la etiqueta
porque SO2 es un metabolito que las levaduras usan durante la fermentacioacuten Los
vinos siempre contienen algo de sulfitos aunque la adicioacuten no se realice durante el
proceso36
151 Formas del Dioacutexido de Azufre (SO2)
Una vez disuelto en agua el dioacutexido de azufre existe en equilibrio entre SO2
molecular (SO2H2O) bisulfito (HSO3) y sulfito (SO32-) Este equilibrio depende del
pH Ademaacutes de estar en equilibrio con el molecular y especies sulfito el bisulfito
tambieacuten existe en forma ldquolibrerdquo y en forma ldquoatadardquo Aquiacute la moleacutecula reaccionara
34
Orwine Eureka 2008Investigadores europeos buscan alternativas al dioxido de azufre en vinos
httpawprowordpresscom20081107investigadores-europeos-buscan-alternativas-al-dioxido-de-
azufre-en-el-vino
3536 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
25
con compuestos carbonilos (ej Acetaldehiacutedo) formando productos adicionales
como Acido Hydroxysulfonico 37
Ademaacutes de Acetaldehiacutedo algunas moleacuteculas presentes en el jugo de uva que
reaccionan con bisulfito son acido piruvico α-keto-glutaric dihidroxyacetona
diacetyl Pigmentos de antocianinas entre otros38
152 Inhibidor Microbiano
El sulfuro molecular es la forma antimicrobiana del dioacutexido de azufre La cantidad
de SO2 molecular presente en cualquier vino no se mide directamente La
concentracioacuten es calculada conociendo la concentracioacuten de SO2 libre y el pH del
vino basaacutendose en la siguiente foacutermula
Alternativamente la figura 5 Se puede utilizar como guiacutea para aproximar la
cantidad de SO2 libre necesitada a determinado valor de pH de valores entre 05 o
08 mgl de SO2 molecular 39
El SO2 inhibe microorganismos de varias formas incluyendo rupturas de puentes
bisulfitos en proteiacutenas y reaccionando con coofactores como NAD+ y FAD tambieacuten
reacciona con ATP
3739
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
38 Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi
Springer New York United States
26
Figura 5 Cantidades de SO2 libre a un pH determinado para obtener 05 o 08 mgl de SO2
molecular
Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007
La concentracioacuten de SO2 molecular necesario para prevenir el crecimiento de
microorganismos variacutea seguacuten vinojugo pH temperatura poblacioacuten densidad y
diversidad estado de crecimiento grado de alcohol entre otros factores Beech
1979 sugirioacute una adicioacuten de 08 mgl de SO2 molecular como la cantidad
necesaria del compuesto en vinos blancos de mesa para dar una reduccioacuten de
cerca de 104 UFCml de la poblacioacuten de diferente tipo de microorganismos en 24
horas Las diferencias que existen entre las levaduras y bacterias en base a la
27
sensibilidad a este compuesto son dadas a conocer por diferentes autores (Warth
1977 1985 Du Toit 2005 Davis 1988 Hood 1983)40
16 Antibrettreg como alternativa de prevencioacuten y eliminacioacuten de
BrettanomycesDekkera
Antibrettreg es un producto nuevo creado por Spindal SARL-Gretz - Armainvilliers
Francia Es una preparacioacuten enzimaacutetica para inactivar Brettanomyces y para
reducir olores producidos por fenoles volaacutetiles41
Antibrettreg es preparado a base de paredes celulares de levadura activados
enzimaacuteticamente que presentan elevadas propiedades adsorbentes frente al 4-
etilfeno y 4- etilguayacol compuestos asociados con olores desagradables en el
vino tales como sudor de caballo farmacia o barniz42
Antibrettreg inhibe la produccioacuten de la vinilreductasa que participa en la
transformacioacuten de los aacutecidos cinaacutemicos naturalmente presentes en los vinos en
los correspondientes derivados etilados responsables de los olores atribuidos a
BrettanomycesDekkera 43
40
Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi
Springer New York United States
41 Manual de instrucciones de producto Antibrett reg producido por Spindal SARL-Gretz -
Armainvilliers France
424344 AEB Group 2008 ANTIBRETT Preparado a base de paredes celulares de levadura para la inactivacioacuten
de Brettanomyces y la eliminacioacuten de los olores de estos productos httpwwwaeb-
groupcomimgsSPAGNOLODepliantANTIBRETT-lett-ESPpdf
28
El uso de Antibrettreg es efectivo incluso contra otros olores anoacutemalos como los
que se generan en las barricas sucias principalmente huacutemedas dantildeando la
calidad olfativa del vino44
29
2 PROBLEMA
La levadura BrettanomycesDekkera es una levadura de contaminacioacuten presente
en la mayoriacutea de industrias viniacutecolas en el mundo Afecta directamente la
produccioacuten y calidad sensorial de los vinos con el desarrollo de los compuestos 4
etilfenol y 4 etilguayacol los cuales dantildean el perfil olfativo del vino dando aromas
caracteriacutesticas a ldquoestablordquo ldquocuerordquo ldquosudor de caballordquo o ldquobarnizrdquo conocido como
ldquocaraacutecter Brettrdquo
Esta contaminacioacuten se da especialmente en los vinos tintos debido a sus
caracteriacutesticas de produccioacuten (fermentacioacuten crianza antildeejamiento) y sus
propiedades fisicoquiacutemicas (Grado alcohoacutelico pH Acidez total Acidez volaacutetil
entre otros)
En Croacia existe una gran produccioacuten de vinos tintos entre los cuales se
encuentra el vino tinto Babic proveniente de la isla de Hvar el cual es famoso por
ser un vino duro carnoso estructurado y casi sobre-maduro con un grado
alcohoacutelico que ronda los 15 vv siendo la primera denominacioacuten de origen que
se aproboacute en Croacia en el antildeo 1961 este vino es de gran importancia en la
regioacuten la mayoriacutea de sitios de elaboracioacuten son pequentildeas industrias que han sido
afectadas por el bdquocaraacutecter Brett‟ Muchas investigaciones se han realizado al
respecto de la levadura BrettanomycesDekkera pero se conoce muy poco sobre
sus efectos en el vino Babic debido a sus caracteriacutesticas particulares (alcohol
30
15 pH 35 Acidez total 520 gr Acido TartaricoL Acidez volaacutetil 08 gr Acido
AceticoL Azucar residual 47 grLt)45
La dificultad de la pequentildea industria para acceder a productos que lleven a la
identificacioacuten de la levadura mencionada y de esta manera conllevar a planes de
accioacuten contra el ldquocaraacutecter Brettrdquo es una de las grandes dificultades de la industria
vinera en este paiacutes en donde los productos para la industria enoacuteloga son
complicados y de alto precio para acceder a ellos y en consecuencia no se
realizan muchas de estas pruebas de deteccioacuten de BrettanomycesDekkera
llevando al mercado productos contaminados de baja calidad que inicialmente
podriacutea haber sido un vino de alta calidad debido a sus caracteriacutesticas uacutenicas y de
gran popularidad
45
Datos obtenidos en el laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
31
3 JUSTIFICACION
Actualmente Croacia cuenta con maacutes de 300 zonas vineras en las que se producen 67
de vino blanco 32 vino tinto y el restante 1 vino rosado De acuerdo a recientes datos
estadiacutesticos hay 650 km2 de vintildeedos en Croacia de los cuales 375 km2 son uvas con
indicacioacuten geograacutefica de origen que producen maacutes de 300 vinos y maacutes de la mitad de este
nuacutemero son vinos elaborados en microempresas con un total de 50000000 de botellas
de vino el 8 es vino superior 70 de calidad y el 22 es vino de mesa de produccioacuten
nacional46
Croacia es un fuerte productor de vino a nivel regional con sus diferentes variedades
propias (Merlot Plavac Dingač Postup Malvazija Pošip Kujundžuša Babic) pero dicha
produccioacuten ha sido fuertemente afectada por la presencia de la levadura
BrettanomycesDekkera trayendo consecuencias como perdidas de produccioacuten peacuterdida
de calidad sensorial del vino grandes peacuterdidas econoacutemicas y desprestigio a sus vinos de
denominacioacuten de origen
Es por esto que en este proyecto de investigacioacuten se busca una faacutecil y raacutepida
identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera causante del ldquocaraacutecter Brettrdquo con el
desarrollo de medios selectivos liquido y solido ademaacutes de opciones para el tratamiento
yo prevencioacuten de esta levadura en la cadena productiva comparativamente entre dioacutexido
de azufre (SO2 ) y Antibrettreg y la identificacioacuten de los aromas caracteriacutesticos del ldquocaraacutecter
Brettrdquo en el vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia
46
Hrvatski zavod za vinogradarstvo i vinasrtvo 2003 Pravilnik o vinu httpwwwhrzvvhrpropisihtm
32
4 OBJETIVOS
41 General
Caracterizar y evaluar el comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera
en teacuterminos de crecimiento y produccioacuten de aromas no deseados en vino tinto
Babic
42 Especiacuteficos
Desarrollar el medio solido y medio liacutequido selectivo para
BrettanomycesDekkera
Evaluar el comportamiento de la levadura en estos medios selectivos
Determinar la influencia del Dioacutexido de azufre (SO2) y el compuesto
Antibrettreg en la levadura BrettanomycesDekkera presente en vino tinto
Babic 2007
Identificar los compuestos aromaacuteticos producidos por Brettanomyces
bruxellensis en vino tinto Babic usando el meacutetodo ldquomultiple headspace
solid-phase microextraction (SPME)rdquo
33
5 ALCANCES
En este proyecto se pretende desarrollar un medio selectivo faacutecil de producir en
donde sea raacutepida la identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera en la
produccioacuten de vinos tintos se realizaran pruebas para corroborar el crecimiento de
esta levadura en el medio determinando el tiempo que esta levadura toma en
adaptarse en el medio y su comportamiento en este una vez comprobada su
adaptacioacuten al medio liquido se trabajara con el meacutetodo de cromatografiacutea de gas
(GC) y el uso de micro extraccioacuten en fase solida (SPME) para el anaacutelisis
cuantitativo de los compuestos volaacutetiles (4-etil-fenol 4-etil-guayacol4-vinilfenol y
4-vinil-guayacol) y posteriormente con el vino tinto Babic Ademaacutes se desea
comprobar la efectividad de los productos con que las vineras de Croacia inhiben
o eliminan la presencia de la levadura en los vinos tintos como lo son el producto
AntiBrettreg y el Dioacutexido de azufre (SO2)
34
6 ESTADO DEL ARTE
Sobre el campo problemico causado por la levadura BrettanomycesDekkera en la
industria viniacutecola se han realizado bastante investigaciones a nivel de
caracterizacioacuten de la levadura los factores fisicoquiacutemicos que favorecen el
crecimiento de la levadura meacutetodos de prevencioacuten y control evaluacioacuten de
dantildeos sensoriales en diferentes tipos de vinos formacioacuten de compuestos fenoacutelicos
en los diferentes tipos de vino otros compuestos no fenoacutelicos asociados al
ldquocaraacutecter Brettrdquo teacutecnicas de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera
evaluacioacuten de la teacutecnicas de control e inhibicioacuten de dicha levadura desarrollo de
nuevos medios de deteccioacuten y aislamiento de la levadura relacioacuten entre la
levadura BrettanomycesDekkera con las otras levaduras presentes en el vino
entre otros
Seguacuten estas investigaciones se analizan aquellas que pueden aportar datos
importantes para el desarrollo del trabajo que se quiere realizar y se tiene en
cuenta sus metodologiacuteas conclusiones recomendaciones y comentarios
Entre las importantes para el planteamiento de este trabajo se menciona el trabajo
realizado por la Universidad Politeacutecnica de Madrid Espantildea el cual analiza
algunas de las caracteriacutesticas maacutes relevantes de este geacutenero de levaduras su
crecimiento en bodega factores fisicoquiacutemicos que favorecen su crecimiento y
desarrollo en el vino los defectos sensoriales que presenta en los vinos y estudia
algunas de los meacutetodos fiacutesicos para el control de BrettanomycesDekkera en vino
35
(clarificacioacuten filtracioacuten amicrobica proteiacutenas clarificantes anhiacutedrido sulfuros
dimetil dicarbonato Aditivos)47
Para conocer maacutes sobre la levadura en condiciones de barrica y almacenamiento
se revisa el articulo elaborado en el Departamento Teacutecnico Guserbiot La rioja
Espantildea en este artiacuteculo se describe brevemente su metabolismo y su ecologiacutea en
las bodegas Igualmente se comparan las teacutecnicas utilizadas en los laboratorios
para su deteccioacuten y cuaacuteles son las limitaciones de los diferentes meacutetodos
Finalmente se analizan las estrategias desarrolladas para su eliminacioacuten de las
bodegas y se dan una serie de recomendaciones para su control48
El instituto de fermentaciones Industriales Consejo superior de investigaciones
cientiacuteficas Juan de Cierva Madrid Espantildea en el cual se revisa la formacioacuten de
etilfenoles (4 etil-fenol 4 etil guayacol) en vinos tintos anejos Los factores
fisicoquiacutemicos que favorecen el crecimiento de la levadura no deseada
BrettanomycesDekkera las teacutecnicas usadas para la detectar la presencia de esta
levadura en vinos ( Revisioacuten microscoacutepica fluorescente remocioacuten de aacutecidos
grasos de su membrana teacutecnicas moleculares como PCR y electroforesis) y de
control (Proteiacutenas fining Fining con gelatina liquida filtracioacuten variables
fisicoquiacutemicas adicioacuten de aditivos procedimientos de altas presiones
manipulacioacuten geneacutetica) con esta investigacioacuten se concluye que la combinacioacuten y el
uso de las numerosas teacutecnicas pueden ayudar a la prevencioacuten y reduccioacuten de la
levadura BrettanomycesDekkera 49 Este trabajo muestra las muacuteltiples opciones
47
A Morata S Benito F Palomero F Calderoacuten y J A Suaacuterez-Lepe Ecologiacutea y prevencioacuten de
BrettanomycesDekkera durante la elaboracioacuten y crianza de vinos tintos Revista enoacutelogos (Editada por la
Federacioacuten Espantildeola de Asociaciones de Enoacutelogos y Periodistas Asociados) No 50 paacuteg 1-12 Madrid Espantildea
48 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 20-
24 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
49 R Suarez JA Suarez-Lepe A Morata F Calderon 2006 The production of ethyl phenols in wine by yeasts
of the genera Brettanomyces and Dekkera A review Journal Food Chemistry No 102 pag 10-21 Madrid
Espantildea
36
existentes en el control y prevencioacuten de la levadura mencionada sin embargo deja
claro que la mayoriacutea de estas opciones son costosas y no de faacutecil adquisicioacuten para
una pequentildea industria
El anaacutelisis sensorial ha sido de los aspectos maacutes estudiados al respecto de
BrettanomycesDekkera una de estas investigaciones fue realizada en Centre
Europeacuteen des Sciences du Goucirct en Talence Francia en el cual se evaluaron 50
vinos bordeaux sensorialmente para demostrar la complejidad del ldquoCaraacutecter Brett‟‟
al cual se unen otros compuestos aromaacuteticos ademaacutes de los fenoacutelicos como acido
isobutirico e isovalerico en este tipo de vino debido a sus caracteriacutesticas
fisicoquiacutemicas50
De los meacutetodos de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera los medios
selectivos son muy populares es por esto que el Laboratorio de Microbiologiacutea
Departamento de Botanica e Engenharia Biologica Instituto Superior de
Agronomia Lisboa Portugal realizo un trabajo en el cual se pretendia desarrollar
un medio selectivo o diferencial capaz de aislar la levadura
BrettanomycesDekkera del vino y de la cadena productiva del vino con el fin de
detreminar la relacioacuten entre esta levadura y los compuestos 4-etilfenol y 4 etil-
guayacol51 otro estudio realizado para la deteccioacuten de dicha levadura fue
realizado en la Escola Superior de Biotecnologiacutea Universidade Catoacutelica
Portuguesa el desarrollo de un simple procedimiento compatible con las rutinas
50 Andrea Romano a Marie Claire Perello a Aline Lonvaud-Funel Gilles Sicard Gilles de Revel2008 Sensory
and analytical re-evaluation of lsquolsquoBrett characterrdquo Journal Food Chemestry No 114 pag 15-19 Talence
France
51 N Rodrigues G Gonccedilalves S Pereira-da-Silva M Malfeito-Ferreira and V Loureiro2001 Development
and use of a new medium to detect yeasts of the genera DekkeraBrettanomyces Journal of applied microbiology No 90 pag 588-599Lisboa Portugal
37
usadas en las vineras para la deteccioacuten de BrettanomycesDekkera en vino y en
maquinarias52
En el laboratorio de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas Alcohoacutelicas de la
Universidad de Zagreb se ha trabajado anteriormente en el desarrollo de medio
solido selectivo con pruebas de diferentes concentraciones de los compuestos
como resultados se encuentra una buen relacioacuten entre las concentraciones de los
compuestos sin embargo como recomendaciones se encuentran la falta de
antibioacutetico para evitar contaminacioacuten por bacterias probar con diferentes fuentes
de carbono para comparacioacuten de tiempo de crecimiento positivo y un monitoreo
diario en el medio53
Los compuestos aromaacuteticos que libera la presencia de BrettanomycesDekkera
estaacute asociada a los compuestos 4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinilfenol y 4
viniguayacol a partir de esto los centros de investigacioacuten han hondado en la
identificacioacuten de dichos compuestos relacionados en la enologiacutea y especialmente
con BrettanomycesDekkera a partir de eso el Departamento de Quiacutemica
Universidad de La Rioja Espantildea este estudio presenta un meacutetodo basado en el
uso de Cromatografiacutea de Gas y micro extraccioacuten en fase solida para el anaacutelisis
cuantitativo de 4-etilfenol 4-etil guayacol 4-vinilfenol 4-vinilguayacol
Demostrando la existencia de un efecto matriz en el anaacutelisis de compuestos
responsables del ldquocaraacutecter Brettrdquo en vino Este nuevo meacutetodo fue
satisfactoriamente aplicado a cierto nuacutemero de vinos tintos comerciales vinos
52
JA Couto A Barbosa and T Hogg 2005 A simple cultural method for the presumptive detection of the yeasts BrettanomycesDekkera in wines Letters in Applied Microbiology No 41 pag 505-510 Porto
Portugal
53 Serkovic Dubravka Gracin Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac
Brettanomyces bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet pag 1-117 ZagrebCroatia
38
blancos y roseacute Este meacutetodo puede ser una alternativa para evitar el efecto matriz
en muestras de vino54
De acuerdo con este tema en la jornada cientiacutefica del 99 el grupo de investigacioacuten
enoloacutegica se estudio la formacioacuten de sustancias volaacutetiles por 13 cepas de S
cerevisiae con buenas aptitudes enoloacutegicas inoculadas individualmente en un
mosto homogeacuteneo de la variedad airen fermentado en las mismas condiciones
de aireacioacuten y a temperatura controlada55
54
C Pizarro N Perez-del-Notario JM Gonzalez-Saiz 2007 Determination of Brett character responsible
compounds in wines by using multiple headspace solid-phase micro extraction Journal of Chromatography
No 1143 pag 176-181 La Rioja Espantildea
55 E Pueyo P Hidalgo K Fernaacutendez y P Martiacuten-Aacutelvarez 1999 Anaacutelisis de compuestos volaacutetiles en vinos
obtenidos con distintas cepas de Saccharomyces cerevisiae Aplicacioacuten de la teacutecnica de microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientificas 99 Grupos de Investigacion Enologica Zaragoza Espana
39
7 MATERIALES Y METODOS
A continuacioacuten se presentan materiales y meacutetodos para la investigacioacuten
Este proyecto fue realizado en su gran mayoriacutea en las instalaciones de la
Universidad de Zagreb en la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos
(PBF) Laboratorios del Departamento de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas
Alcohoacutelicas ubicado en la ciudad de Zagreb Croacia
Los anaacutelisis fisicoquiacutemicos del vino tinto Babic fueron realizados en los
laboratorios de VINOLAB ubicado en Zagreb Croacia
71 MEDIO SOLIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera
711 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Autoclave de laboratorio
Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa Etanol peptona extracto de levadura
agar cicloheximida acido cumaacuterico ampicilina)
Balanza electroacutenica de precisioacuten
Microscopio oacuteptico
712 Metodologiacutea
Basados en estudios anteriores realizados en el laboratorio para el desarrollo de
medio solido selectivo para BrettanomycesDekkera (Serkovic Dubravka Gracin
40
Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac Brettanomyces
bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet Universidad de Zagreb pag 1-
117 Zagreb Croacia) se evaluaron las recomendaciones mencionadas en dicha
investigacioacuten para la mejoriacutea y desarrollo de otros medios soacutelidos selectivos
Se usoacute como base el medio YPD (Yeast Peptone Dextrose) el cual estaacute
compuesto de la siguiente forma 20gL peptona 10 gl extracto de levadura 20 gl
de agar56 este medio es selectivo para levaduras pero no es selectivo entre ellas
Es necesario el uso de una fuente de carbono para la levadura
BrettanomycesDekkera de acuerdo a la teoriacutea y revisando la tabla 1 (Relacioacuten de
los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) y seguacuten
facilidades de disponibilidad en el laboratorio se utiliza glucosa la cual es
utilizable por entre 75-100 de las cepas de BrettanomycesDekkera seguacuten la
tabla mencionada anteriormente
Esta fuente de carbono (Glucosa) fue probada en una concentracioacuten de 20 gL
Cicloheximida fue probada a 30 mgL para inhibir Saccharomyces en el medio y
darle mayor selectividad para Brettanomyces Dekkera Se antildeade acido p-
cumarico en una concentracioacuten de 100 mgL como precursor para la formacioacuten
del compuesto 4 etilfenol caracteriacutestico de la levadura BrettanomycesDekkera
Para inhibir bacterias en el medio se usa ampicilina a 10 mgL esta se agrega
despueacutes de realizada la esterilizacioacuten y cuando la temperatura del medio este
igual o menor a 40C El pH del medio se ajusto a 5
Paralelamente se crea el medio con Etanol como fuente de carbono en una
concentracioacuten de 6 o 60 mlL con la misma concentracioacuten de los otros
compuesto como cicloheximida 30mgL acido cumarico 100mgL 20 gL peptona
10 gL de extracto de levadura 16gL de agar Este medio se crea como
56
Concentraciones preestablecidas en el laboratorio de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas alcoholicas
41
comparativo para determinar cual fuente de carbono es la maacutes utilizada por la
levadura Brettanomyces bruxellensis para su reproduccioacuten Seguacuten la teoriacutea (ver
tabla 1) el etanol es utilizado por entre 25-75 de las cepas de
BrettanomycesDekkera pero es el azuacutecar que se encuentra en mayor
concentracioacuten presente en los vinos tintos aproximadamente 130 gl57
Estos medios fueron debidamente esterilizados para eliminar cualquier
microorganismo o espora presente en este Este procedimiento se realizo por el
meacutetodo de combinacioacuten de altas temperatura y presioacuten (Autoclave 121 C a 1034
kPa)
Se usaron colonias de BrettanomycesDekkera aisladas anteriormente de vinos
contaminados y guardas para investigaciones en el Departamento de Tecnologiacutea y
Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos
Universidad de Zagreb Croacia
Los medios fueron monitoreados visualmente todos los diacuteas y se toman
observaciones de macroscoacutepicas y microscoacutepicas Se comparan estos dos medios
en teacuterminos de rapidez de crecimiento de la levadura y selectividad Estas
muestras fueron incubadas a 28C por 10 diacuteas
La prueba fue realizada por duplicado en diferentes tiempos
57
Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
42
72 MEDIO LIacuteQUIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera
721 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Frascos de vidrio esteacuteriles
Autoclave de laboratorio
Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa peptona extracto de levadura
cicloheximida acido cumarico ampicilina etanol)
Microscopio oacuteptico
Balanza electroacutenica de precisioacuten
722 Metodologiacutea
En el mercado para enologiacutea existen medio liacutequidos selectivos para la deteccioacuten
de BrettanomycesDekkera en vinos sin embargo estos son de difiacutecil accesibilidad
por sus elevados precios es por esto que se desarrolla un medio liquido selectivo
para dicha levadura en el laboratorio del Departmaneto de Tecnologiacutea y Anaacutelisis
de Bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia
Para este medio se toma como base el medio selectivo con Glucosa como fuente
carbono desarrollado anteriormente sin usar agar para mantener el medio en su
estado liquido
43
La composicioacuten de este medio liacutequido es la siguiente
20 gL Glucosa
20 gL peptona
10gL extracto de levadura
30mgL de cicloheximida
100mgL acido p-cumarico
10 mgL ampicilina
Estos compuestos fueron medidos en una balanza electroacutenica de precisioacuten se
antildeade 250 ml de agua destilada y se mezcla constantemente se pasa a proceso
de esterilizacioacuten en autoclave a 120C y 1034 KPa por 45 minutos
De esta forma se asegura la usencia de microorganismos yo esporas en el
medio Despueacutes de bajar la Temperatura a 40C se agrega a la mezcla ampicilina
en una concentracioacuten de 10mgL
En frascos de vidrio esteacuteril se agrega 40 ml de medio liacutequido y diferentes
cantidades iniciales de levaduras BrettanomycesDekkera fueron inoculadas al
respectivo medio el primer frasco tiene una cantidad de 106 ceacutelulasml el segundo
tiene 104 ceacutelulasml el tercero tiene 102 celulasml y el cuarto con una cantidad
aproximada de 25 ceacutelulasml Estas cantidades estaacuten basadas en estudios
anteriores para medios liacutequidos selectivos en levaduras58
58 J Ungar A M James P W Muggleton H F Pegler y E G Tomich1950 The Cultivation of
Haemophilus pertussis in Partially Defined Liquid Media Journal of General Microbiology No 4
pag 345-359 Greenford
44
Este medio liacutequido inoculado fue inspeccionado diariamente visualmente revisioacuten
de turbidez microscoacutepicamente y olfativamente para deteccioacuten de olores del
ldquocaraacutecter Brettrdquo
Los diacuteas fueron contabilizados para determinar resultados positivos en estos
ensayos
73 INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN
VINO TINTO DE LA REGION DE DALMACIA CROACIA
731 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Medio selectivo solido para BretanomycesDekkera
Medio selectivo Liquido para BrettanomycesDekkera
Quiacutemicos de laboratorio (Dioxido de Azufre (SO2) Antibrettreg Glucosa)
Vino Babic 2007
Anallizador infrarojo Bacchius II microdom
732 Metodologiacutea
Con los medios desarrollados (solido y liquido) se quiere conocer el efecto del
dioacutexido de azufre (SO2) y el producto Antibrettreg en la levadura
BrettanomycesDekkera presente en el vino tinto de la regioacuten de Dalmacia
Con las herramientas que se tienen en el laboratorio del departamento de
tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia se quiere
determinar la influencia de estos productos en la levadura BrettanomycesDekkera
presente en vino tinto croata de la regioacuten de Dalmacia Babic
45
El primer paso es adaptar la levadura al vino tinto croata (Babic) para esto se
inoculan 20 colonias de BrettanomycesDekkera en 500 ml de vino se antildeadioacute
glucosa en una concentracioacuten de 2gL y se oxigena la mezcla Para este paso de
adaptacioacuten se dejan las muestras de 1 a 2 diacuteas a temperatura ambiente (20C)
Despueacutes de este periodo se revisa microscoacutepicamente la presencia positiva de
BrettanomycesDekkera en los 500 ml de vino en los que se estaba haciendo el
paso de adaptacioacuten en Babic al comprobar su presencia positiva se procede a
mezclar los 500 ml de vino contaminado con BrettanomycesDekkera con los 3
Litros de vino Babic que se disponen para esta prueba
Estos 3 litros de vino tinto Babic contaminado con la levadura
BrettanomycesDekkera se reparten en 8 frascos de vidrios esteacuteriles al siguiente
diacutea se toman dos frascos para agregar cada uno de los compuestos a evaluar
(SO2 y Antibrettreg)
Para SO2 se toman dos frascos uno de 600ml y uno de 100ml se agrega una
concentracioacuten de 40 mgl
Para el producto AntiBrettreg se toman cuatro frascos dos de 600 ml y dos de 100
ml seguacuten especificaciones del producto y la alta poblacioacuten de
BrettanomycesDekkera en las muestras se adiciono la maacutexima concentracioacuten de
AntiBrettreg a las muestras la cual fue de 40 gHl
Estas muestras se dejaron a temperatura ambiente simulando condiciones de
almacenamiento del vino en barricas temperatura aproximada de 20C evitando el
contacto con la luz solar y evitando movimientos fuertes Esto se mantuvo por 15
diacuteas que fue el tiempo de duracioacuten del experimento
Con el vino restante se mantuvo en las mismas condiciones de almacenamiento
de los demaacutes para hacer un paralelo de comparacioacuten
Previamente se analizaron las caracteriacutesticas del vino sin contaminar por medio
del analizador infrarrojo Bacchus II microdom antes de agregar los compuestos
46
SO2 y AntiBrettreg y despueacutes se volvioacute a realizar el anaacutelisis para determinar los
efectos de estos compuestos en el vino y asiacute mismo al de control
74 DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN
EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO
MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE
741 Materiales
Cromatografo de Gas HP5890 Serie II
Microextractor de fase solida (SPME)
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Quiacutemicos de laboratorio (p-cresolAcetaldehido Propanol diacetil etil-
acetato i-butanol acido aceacutetico i-amil-alcohol n-amil lactato de etilo
acetato amil metiacutelico 1-hexanol etil-hexanol linalol nerol citronelol
geraniol 2-feniletanol octanoato de etilo 4-etilfenol 2-feniletil acetato 4-
etilguaiacol)
Vino Tinto Babic
Agua destilada
742 Metodologiacutea
El meacutetodo fue desarrollado anteriormente en el Departamento de Tecnologiacutea y
Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos de
la Universidad de Zagreb Croacia Y despueacutes de modificaciones fue utilizado en el
desarrollo del trabajo El meacutetodo utilizado es descrito a continuacioacuten
47
Cromatografo de gas HP 5890 SERIES II
Programa HP-chem
a) Condiciones para analisis SPME-GC
Muestra diluida 5050 con adicion de estandar interno (p-cresol1mgl)
25ml de la muestra diluida con mezcla continua a temperatura ambiente
Tiempo de adsorcion 30 minutos
SPME es colocado en la muestra para la adsorcion durante el tiempo
previsto
b) Condiciones para el Cromatografo de gas (GC)
La columna usada en este experimento es RTXreg-5 (Restec USA sn 210627)
30m id=025mm 025μm
Gas portador Nitrogeno
Flujo del Nitrogeno 5 mlmin
Temperatura del inyector 240 C
Temperatura del detector 250 C
Temperaturas programadas 35 C5 min 150 C 34 Cmin 180 C
10Cmin 190 C 5 Cmin
Se conocen los resultados del cromatografiacutea de gases (ver tabla 10) y se hacen
necesarias varias correcciones del meacutetodo y algunas pruebas con unos
compuestos para determinar realmente su tiempo de retencioacuten en este tipo de
vino Se deben comprobar tiempos de retencioacuten
48
8 DISCUSIOacuteN Y RESULTADOS
81 RESULTADOS PARA EL DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO
Tabla 2 Medio Selectivo con Glucosa como fuente de carbono para
BrettanomycesDekkera en incubacioacuten por 5 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten
microscoacutepica
1 Negativo Negativo - No se realiza
2 Negativo Negativo - Presencia de levaduras
3 Negativo Negativo - Presencia de
Levaduras
4 Aparicioacuten de
algunas colonias
Negativo Transparente Presencia de levaduras
5 Colonias definidas Positivo-
Fenoles
Amarillo Presencia positiva de
BrettanomycesDekkera
49
Este medio tiene alto grado de selectividad para levaduras con un tiempo de
crecimiento de aproximadamente 5 diacuteas en 28C lo que lo hace raacutepido gracias al
antibioacutetico (ampicilina) que hace parte de la composicioacuten del medio no hay
presencia de bacterias Se hace confiable para resultados positivos de levaduras
BrettanomycesDekkera debido a que las levaduras Saccharomyces fueron
inhibidas con el compuesto cicloheximida su selectividad fue comprobada por
revisioacuten microscoacutepica macroscoacutepica y sensorial
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con glucosa como fuente de carboacuten son las
siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
50
Tabla 3 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono para Brettanomyces Dekkera en
incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica
1 Ninguno Negativo - -
2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras y
bacterias
9 Diminutas
colonias
transparentes
Negativo Transparentes Presencia de levaduras y
algunas bacterias
10 Positivo Positivo-
Fenoacutelicos
Amarillo Presencia de levaduras
BrettanomycesDekkera y
bacterias
El medio selectivo para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de
carbono tambieacuten es selectiva entre levaduras ya que solo se identifico la levadura
BrettanomycesDekkera en este sin embargo se evidencia una presencia de otro
microorganismo presuntamente bacteria ya que este medio no contiene agente
antibacteriano (ampicilina) Es necesaria la adicioacuten de ampicilina en una
concentracioacuten de 10mgl para inhibir la presencia de bacterias
Este medio presenta un tiempo maacutes prolongado para mostrar crecimiento de la
levadura BrettanomycesDekkera aproximadamente 10 diacuteas
51
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las
presentadas en el medio selectivo con glucosa como fuente de carbono y son las
siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
52
Tabla 4 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono y adicioacuten de ampicilina para
Brettanomyces Dekkera en incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica
1 Ninguno Negativo - -
2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
9 Diminutas
colonias
transparentes
Negativo Transparentes Presencia de levaduras
10 Positivo Positivo-
Fenoacutelicos
Amarillo Presencia de levaduras
BrettanomycesDekkera
El efecto de la ampicilina sobre el medio selectivo con etanol como fuente de
carbono fue el esperado inhibioacute completamente el crecimiento de colonias
bacterianas en el medio el tiempo de crecimiento de la levadura y presencia de
aromas fenoacutelicos fue el mismo de 10 diacuteas en incubacioacuten de 28C
53
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las
presentadas anteriormente y son las siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
82 RESULTADOS PRUEBAS MEDIO LIQUIDO
Tabla 5 Influencia de la concentracioacuten de levaduras BrettanomycesDekkera en el
tiempo necesario para detectar la produccioacuten de 4-etil-fenol en medio liquido
Nuacutemero de ceacutelulas ml
(concentracioacuten final)
Tiempo necesario para obtener resultados
positivos (diacuteas)
1 Experimento
32x106 le 3
3 X 104 3
33x102 7
40 No detectado
2 Experimento
43x106 le3
39x104 le3
37x102 8
62 No detectado
54
El nuacutemero de ceacutelulas de levadura de BrettanomycesDekkera fue contabilizado
usando contador de ceacutelulas Chamber
Los aromas fenoacutelicos son difiacuteciles de detectar debido al fuerte olor que tiene el
medio liquido caracteriacutestico de sus componentes esto dificulta la identificacioacuten del
ldquocaraacutecter Brettrdquo en especial cuando las concentraciones de
BrettanomycesDekkera no son elevadas Ademaacutes de los olores fenoacutelicos otros
compuestos volaacutetiles se detectan tales como acido aceacutetico y olores oxidativos
tambieacuten producido por la levadura BrettanomycesDekkera
En la inspeccioacuten visual se detecta alta turbidez en el medio Se compara con un
medio sin presencia de BrettanomycesDekkera
En las muestras con mayor concentracioacuten de la levadura es maacutes notoria la
turbidez Despueacutes de 3 diacuteas se presenta un precipitado blanco en todas las
muestras de altas concentraciones
La revisioacuten microbioloacutegica se realiza diariamente para determinar el nuacutemero de
ceacutelulas y la presencia positiva de la levadura a evaluar
Entre los dos experimentos realizados con el medio liquido el tiempo que se
demoro en detectar compuestos fenoacutelicos fue muy similar entre ellos
dependiendo del nuacutemero de ceacutelulas en el medio en mayores concentraciones el
tiempo de deteccioacuten fue menor
Hay que sentildealar que BrettanomycesDekkera debe alcanzar una concentracioacuten
miacutenima (denominada poblacioacuten criacutetica) de 103 UFCml para comenzar a liberar etil
fenoles Por debajo de esta concentracioacuten la levadura seriacutea metaboacutelicamente
activa pero no produciraacute compuestos alterantes a niveles detectables esto se ve
reflejado en los resultados en los que las concentraciones de ceacutelulas son muy
bajas
55
Estos resultados se comparan con los resultados dados en el medio solido Los
dos medios muestran altos grados de selectividad hacia la levadura
BrettanomycesDekkera y similar comportamiento para el crecimiento de dicha
levadura
En el medio liacutequido cuando hay altas concentraciones de BrettanomycesDekkera
el tiempo de deteccioacuten del microorganismo es menor que con el medio solido pues
en el liacutequido es aproximadamente 3 diacuteas y en el soacutelido son 5 diacuteas
83 RESULTADOS DE LA INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE
(SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO DE LA REGION DE
DALMACIA CROACIA
El vino fue analizado antes de la adicioacuten de los compuestos quiacutemicos a evaluar y
15 diacuteas despueacutes de adicioacuten para ver la reaccioacuten de este frente a SO2 y Antibrettreg
estas caracteriacutesticas se determinaron con el equipo de laboratorio Bacchus II
Microdom localizado en el laboratorio Vinolab doo Zagreb Croacia Los
resultados se muestran en la tabla
Tabla 6 Resultados de las muestras de vino inoculados con la levadura BrettanomycesDekkera
durante 15 diacuteas Comparativos con los diferentes compuestos
CFUml
Vino Day 1 Day 4 Day 10 Day 15
Control 130E+04 800E+03 700E+03 500E+03
Control 800E+03 640E+03 700E+03 280E+03
SO2 110E+04 400E+02 400E+02 67
SO2 900E+03 380E+03 270E+03 183
Antibrett 140E+05 920E+04 140E+04 400E+03
Antibrett 210E+05 181E+05 160E+04 900E+03
Antibrett 120E+05 990E+04 120E+04 100E+03
Antibrett 230E+05 204E+05 300E+03 200E+03
56
Tabla 7 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 antes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o
Antibrettreg Diacutea 0
Alcohol
()
Acidez Total
(gr Aci
Tartaacuterico L)
Acidez volaacutetil
(Aci
AceacuteticoL)
Densidad
(grml)
Azuacutecar residual
(grl)
Extracto
seco
(grl)
Acido
Laacutectico
(grl)
Glicerol
(grl)
Taninos
(grl)
Acetato
(grl)
1473
525
083
09928
473
332
164
799
305
117
1471
522
084
09927
479
329
162
786
299
116
Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
Tabla 8 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 despueacutes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o
Antibrettreg Diacutea 15
Alcohol
()
Acidez Total
(gr Aci
Tartaacuterico L)
Acidez volaacutetil
(Aci
AceacuteticoL)
Densidad
(grml)
Azuacutecar residual
(grl)
Extrac
to seco
(grl)
Acido
Laacutectico
(grl)
Glicerol
(grl)
Taninos
(grl)
Acetatos
(grl)
Control
1414
565
107
09935
436
364
177
827
259
136
Control
1415
556
108
09936
420
365
170
824
256
137
SO2
1456 543 108 09932 476 369 167 803 281 125
SO2
1457
542 108 09933 472 370 170 804 271 124
Antibrett 1454 533 106 09933 448 371 175 813 277 125
Antibrett 1455 534 105 09933 460 372 171 809 282 124
Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
57
Figura 4 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en el vino de control para
evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas
El comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en la prueba por
duplicado en el vino de control fue muy similar pues con el tiempo esta levadura
deja de reproducirse y va muriendo cuando las condiciones ya no son aptas para
su desarrollo debido a que la mayoriacutea de su fuente de carbono (Glucosa) esta
consumida sin embargo esta levadura no llega a su desaparicioacuten total lo que
representa uno de los mayores problemas en la elaboracioacuten del vino
Esta levadura tiene un metabolismo lento y el factor tiempo es un requisito
fundamental para su desarrollo este experimento se empezoacute con una alta
poblacioacuten de BrettanomycesDekkera (130 x 104 UFCml y 8 x 103 UFCml
respectivamente) y durante el transcurso del tiempo la poblacioacuten fue disminuyendo
debido a la perdida de las condiciones necesarias para la reproduccioacuten
58
Figura 5 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de SO2 en
concentracioacuten de 40 mgl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas
El SO2 tuvo un comportamiento efectivo y raacutepido contra las colonias de
BrettanomycesDekkera La poblacioacuten de esta levadura se redujo de forma
significativa entre el diacutea primero y el cuarto se encontroacute una diferencia porcentual
de 96 en la primera prueba y del 60 en la de duplicado al diacutea 15 ya la
poblacioacuten era casi nula pasando raacutepidamente de un numero por encima de la
poblacioacuten critica de la levadura BrettanomycesDekkera a un numero lt103 UFCml
siendo muy eficaz y raacutepido en el manejo de produccioacuten
Este compuesto ademaacutes de favorecer la extraccioacuten de los compuestos fenoacutelicos y
de su actividad antioxidante al inhibir la accioacuten de las polifenoloxidasas a dosis
adecuadas de un maacuteximo de 50gl inhibe la multiplicacioacuten bacteriana y de
levaduras
59
Figura 6 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de
Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo
de 15 diacuteas
Figura 7 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de
Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo
de 15 diacuteas
El compuesto Antibrettreg en la primera prueba tanto como en el duplicado tuvo su
mayor tiempo de reduccioacuten de UFCml entre los diacuteas 4-10 con una diferencia
porcentual de 91 en comparacioacuten con el diacutea cuarto al decimo a diferencia de
60
SO2 el cual presenta la gran disminucioacuten de colonias entre los primeros diacuteas de
agregarse el producto
El tiempo para que la poblacioacuten de la levadura llegara a la cantidad menor a la de
la poblacioacuten critica es mucho mayor que la del compuesto SO2 sabiendo que esta
poblacioacuten debe ser lt103 UFCml
El compuesto Antibrettreg puede tardarse 4-10 diacuteas en representar una reduccioacuten
de UFCml significativa en dicho tiempo puede representar grandes peacuterdidas
nutricionales y altos costos de produccioacuten para la fabricacioacuten
Figura 8 Comportamiento del contenido de alcohol en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin adicioacuten)
hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
BrettanomycesDekkera estaacute presente en vinos de alto contenido alcohoacutelico
aproximadamente entre 125 a 14 pues esta levadura toma a etanol como
fuente de carbono y este vino (Babic) procede de uvas muy maduras las cuales
presentan mayor cantidad de azuacutecares residuales (como glucosa y fructosa y
otras pentosas residuales)
138
14
142
144
146
148
Alcohol
Day 0 Day 15
61
Analizando el comportamiento del vino durante el experimento de 15 diacuteas sin
compuestos quiacutemicos y con SO2 y Antibrettreg a partir de las caracteriacutesticas
iniacuteciales que se determinaron seguacuten el equipo BACCHUS analizador infrarrojo se
presenta en general una reduccioacuten del contenido alcohoacutelico de este vino pero se
ve una mayor reduccioacuten en el vino de control el cual redujo en un 394 su
contenido alcohoacutelico desde el dia 0 hasta el diacutea 15 este vino no tiene ninguacuten
compuesto contra la levadura BrettanomycesDekkera y por su elevada presencia
en los 15 diacuteas de experimento consumioacute esta cantidad de etanol
Mientras en el vino que conteniacutea SO2 tras 15 diacuteas de tratamiento se vio una
reduccioacuten de alcohol de 1 ya que este compuesto redujo la cantidad de
BrettanomycesDekkera en los primeros diacuteas de tratamiento previniendo su
reproduccioacuten y protegiendo el contenido alcohoacutelico del vino Babic 2007
En los vinos de prueba con Antibrett reg la reduccioacuten alcohoacutelica se dio en un
porcentaje de 122 un poco maacutes alta que con SO2 y mucho maacutes baja en
comparacioacuten del vino de control este compuesto tambieacuten previno la gemacioacuten de
la levadura evitando la perdida de etanol en el vino sin embargo como este
compuesto duro mas en este proceso de eliminar BrettanomycesDekkera se
produjo una mayor peacuterdida alcohoacutelica
62
Figura 9 Comportamiento del contenido de acidez volatil en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin
adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
Debido a la presencia de oxigeno en los frascos la acidez volaacutetil aumento pero no
significativamente en las muestras No hubo grandes diferencias entre las
muestras con compuestos y las de control por lo que se deduce que estos
compuestos no ayudan a evitar esta acidez Esta acidez tan alta puede dantildear la
calidad del vino de forma casi irreparable Pero el factor oxigeno es de los maacutes
controlados en la produccioacuten de vinos
la alteracioacuten del aumento de la acidez volaacutetil no estaacute relacionada con la levadura
BrettanomycesDekkera sino a la presencia de oxigeno en el almacenamiento el
oxigeno fue usado en esta prueba para promover condiciones apropiadas para el
desarrollo de la levadura
002040608
112
Acidez Volatil
Day 0 Day 15
63
Figura 10 Comportamiento del contenido de Acido Acetico en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin
adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
Brettanomyces Dekkera son productores de aacutecido aceacutetico y elevan el contenido
de los vinos anormalmente en condiciones de anaerobiosis En condiciones de
aerobiosis producen concentraciones bajas o nulas de aacutecido aceacutetico
Este acido aceacutetico al igual que los fenoles afecta el sabor y el perfil olfativo del
vino tinto este efecto es tambieacuten producido por la levadura
BrettanomycesDekkera vemos en los resultados el gran crecimiento de este
compuesto en el vino control el cual no tenia compouestos en contra de
BrettanomycesDekkera lo que produjo este aumento significativo del acido aceacutetico
en comparacioacuten con estos que teniacutean SO2 y Antibrettreg entre ellos la diferencia en
este compuesto es muy reducida y no significativa pues estos compuestos no
permitieron la gemacioacuten de esta levadura y esta no produjo este acido en esa gran
cantidad
A este compuesto se le atribuye el olor y sabor a vinagre del vino tinto un defecto
muy comuacuten y poco agradable para el consumidor
105110115120125130135140
Acido Acetico
Day 0 Day 15
64
Figura 11 Comportamiento del contenido de Azucares reductores en vino Babic 2007
desde el diacutea 0 (sin adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en
comparacioacuten con el vino de control
BrettanomyesDekkera utiliza los azucares residuales como fuente de carbono
para su crecimiento en el vino este es el factor maacutes importante para su desarrollo
y este es el que determina en cierto caso la cantidad de levaduras de
BretanomycesDekkera presente en las graficas se determina claramente que en
el vino de control donde la cantidad de esta levadura es muy alta 15 diacuteas despueacutes
de empezar las pruebas la cantidad de azucares reductores es muy baja y ha
bajado en un porcentaje de 10 mientras que el vino que tiene SO2 bajo la
cantidad de azucares reductores en un 042 y el vino que tiene el compuesto
Antibrettreg redujo su nivel de azucares reductores en 462
38
4
42
44
46
48
5
Azucares Reductores
Day 0 Day 15
65
84 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE
CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON
EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID
PHASE
Tabla 10 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en
vino Babic 2007 con el meacutetodo propuesto
Compuesto Tiempos de
retencioacuten (min)
Acetaldehiacutedo 1437
Propanol 3759
Diacetil 4202
Etil-acetato 4523
i-butanol 6232
Acido Aceacutetico 7840
i-amil alcohol 11740
n-amil 13489
lactato de etiacutelico 15741
acetato amil metiacutelico 17796
1-hexanol 19101
etil-hexanol 24456
Linalol 30370
2-feniletanol 32768
p-cresol 33522
octanoato de etilo 34226
4-etilfenol 37100
2-feniletil acetato 32769
4-etilguayacol 39704
4 vinilfenol 40529
decanoato de etilo 42117
Refirieacutendose a estos resultados es necesaria la creacioacuten de soluciones estaacutendar
para determinar tiempos de retencioacuten con el meacutetodo y si es necesario ajustes a
este
66
Tabla 11 Soluciones estaacutendar para compuestos en vinos tintos Croatas
MODEL 0
(en volumen de 100 ml en 40 Etanol)
Compuesto Pureza Cantidad
(g)
Concentracioacuten (gl)
Acetaldehiacutedo 099 1623 160677
Propanol 0995 13849 137718
Diacetil 098 01071 104958
Etil-acetato 0995 30172 3002114
i-butanol 099 15016 1486584
Acido Acetico 0995 0 0
i-amil alcohol 099 20116 1991484
n-amil 098 15442 1513316
lactato de etilio 098 00507 049686
acetato amil metilico 098 01028 100744
1-hexanol 098 00367 035966
etil-hexanol 098 00308 029876
Linalol 097 00288 027936
Nerol 097 00311 030478
Citronelol 098 0031 03038
Geraniol 098 15803 1548694
2-feniletanol 098 00402 039396
4-etilfenol 098 00812 078764
octanoato de etilo 097 00597 059103
2-feniletil acetato 099 00315 031185
4-etilguayacol 098 00803 079674
Fuente Laboratorio de anaacutelisis e investigacioacuten de bebidas Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea
de Alimentos Universidad de Zagreb Zagreb Croacia 2009
Las soluciones estaacutendar se realizan teniendo como referencia las cantidades de
estos compuestos en los vinos tintos croatas datos suministrados por el Doctor
Leo Gracin en concentraciones de gl a partir de este dato y teniendo en cuenta
67
la pureza de los compuestos que se teniacutean en el laboratorio de anaacutelisis e
investigacioacuten de bebidas se crean las soluciones estaacutendar Ejemplo
Solucioacuten estaacutendar para 4 etil-fenol en un volumen de 100 ml
Con estas soluciones estaacutendar se realizo el tiempo de retencioacuten para corroborar el
meacutetodo Los resultados de esto fueron tiempos de retencioacuten diferentes a los del
meacutetodo primero con el que se realizaron los ensayos y a partir de esos resultados
se ajusto el meacutetodo con el que se trabajo
68
Tabla 12 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en
vino Babic 2007 con el meacutetodo modificado
Compuesto Tiempos de
retencioacuten (min)
Acetaldehiacutedo 1542
Propanol 4046
Diacetil 4733
Etil-acetato 4807
i-butanol 6659
Acido Acetico 8343
i-amil alcohol 12123
n-amil 13866
lactato de etilio 16072
acetato amil metilico 18336
1-hexanol 19447
etil-hexanol 24835
Linalol 31831
2-feniletanol 33305
p-cresol 33703
octanoato de etilo 34571
4-etilfenol 37724
Citronelol 38326
Nerol 38576
2-feniletil acetato 39012
Geraniol 39944
4-etilguayacol 40271
4 vilifenol 41168
decanoato de etilo 42657
69
DIA 0
Se coloca ISTD a todas las muestras respectivas para poder determinar
cantidades de los compuestos aromaacuteticos
Se realiza la cromatografiacutea de gas al vino Babic 2007 antes de ser inoculado con
BrettanomycesDekkera
Tabla 13 Resultados de la cromatografiacutea de gas del vino Babic 2007
Compuesto Tiempo de retencioacuten
min
Cantidad
mgl
Acetaldehiacutedo 1542 0
Propanol 4046 0
Diacetil 4733 37215204
Etil-acetato 4807 0
i-butanol 6659 0
Acido Aceacutetico 8343 2817465
i-amil alcohol 12123 16799019
n-amil 13866 26
lactato de etiacutelico 16072 10983961
acetato amil metiacutelico 18336 0185196
1-hexanol 19447 264655
etil-hexanol 24835 0158751
Linalol 31831 0
2-feniletanol 33305 4235560
p-cresol 33703 1
octanoato de etilo 34571 0152412
4-etilfenol 37724 00581345
Citronelol 38326 00439729
Nerol 38576 00344799
2-feniletil acetato 39012 00407983
Geraniol 39944 0
4-etilguayacol 40271 0
4 vilifenol 41168 0
Decanoato de etilo 42657 00190144
70
Basados en los compuestos aromaacuteticos que brinda el ldquoCaraacutecter Brettrdquo se van a
analizar detalladamente los siguientes aromas 4-Etilfenol 4-Etilguayacol 4-
Vinylfenol
Figura 12 Compuestos aromaticos en vino tinto Babic sin estar contaminado con la levadura
BrettanomycesDekkera
El vino a analizar esta por debajo de las concentraciones consideradas como
perjudiciales para el aroma del vino tinto (El umbral sensorial del 4-etilfenol es de
230 μgl y el del 4-etilguaiacol es de 47 μgl) pues posee una concentracion de
58microgL de 4etilfenol 0 microgL de 4 etilguayacol y 0 microgL de vinylfenol
841 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGUacuteN TEMPERATURAS
DE ALMACENAMIENTO
0
02
4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinylfenol
Vino 00581345 0 0
C (
mg
L)
Vino Babic 2007 Dia 0
71
Tabla 14 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el
ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 20C por 4 diacuteas Prueba por duplicado
MUESTRAS INCUBADA A 20C
Compuesto Day 1
Amount
(mgL)
Day 2
Amount
(mgL)
Day 3
Amount
(mgL)
Day 4
Amount
(mgL)
4-etilfenol 0260244 017294 0177547 020156
4-etilfenol 0260244 0245915 0204542 0262499
4-etilguayacol 0 0 0 0
4-etilguayacol 0 0 0 0
4 vinilifenol 1107096 781349 685317 460323
4 vinilifenol 1107096 1297465 621324 693225
72
Figura 13 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
BrettanomycesDekkera es la levadura responsable de la produccion de 4-etil-
fenol compuesto asociado con olores caracteristicos a ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 00581345 0260244 0172935 0177547 020156
C (
mg
L)
4 etilfenol
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 00581345 0260244 0245915 0204542 0262499
C (
mg
L)
4 etilfenol
73
caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo dantildeando la calidad sensorial del vino tinto Babic la
produccioacuten de este compuesto en esta muestra realizada por duplicado fue
ascendente y tuvo incremento muy grande en el primer dia de almacenamiento y
en el transcurso de los siguientes cuatro diacuteas se mantuvo relativamente estable lo
cual no concuerda con el comportamiento tiacutepico de esta levadura quien tiene un
crecimiento lento e incrementa la produccioacuten de fenoles con su gemacioacuten esto
genera muchas dudas sobre el buen funcionamiento del equipo GC o de la
estabilidad de las levaduras BrettanomycesDekkera en este almacenamiento
Figura 14 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar prueba por duplicado
002040608
1
Vino Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0 0 0
4 etilguayacol
002040608
1
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0 0 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
74
Presencia negativa de 4 etil guayacol durante todo el almacenamiento
probablemente las condiciones de almacenamiento y el medio no dieron lugar al
desarrollo de este compuesto el cual se considera menos conflictivo que el 4-etil-
fenol
Figura 15 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
Estos resultados tambieacuten dejan dudas del normal comportamiento de dicha
levadura pues indican que la levadura no convirtioacute este compuesto en etilfenol
0
2
4
6
8
10
12
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 110709781349685317460323
4 vinylfenol
0
2
4
6
8
10
12
14
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
Series1 0 11071 12974 62132 69322
C (
mg
l)
4 Vinylfenol
75
durante el almacenamiento caracteriacutestica que solo la levadura
BrettanomycesDekkera puede realizar se ve que las concentraciones de
vinylfenoles son mucho mas altas que las de fenoles lo que nos deja determinar
que la poblacioacuten de BrettanomycesDekkera es muy baja y existen otras levaduras
productoras de vinylfenoles en este tipo de vino en las condiciones de
almacenamiento dadas para estas pruebas
Tabla 16 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el
ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 28C por 4 diacuteas
MUESTRA 2 INCUBADA A 28C
Compuesto Day 1
Amount
(mgL)
Day 2
Amount
(mgL)
Day 3
Amount
(mgL)
Day 4
Amount
(mgL)
4-etilfenol 0260244 019612 0186614 019932
4-etilfenol 0260244 020576 0214917 0193554
4-etilguayacol 0 014304 0223836 0
4-etilguayacol 0 002287 00529832 0
4 vinilifenol 1107096 787068 665182 397847
4 vinilifenol 1107096 284389 00204392 0
76
Figura 16 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar
El desarrollo de este compuesto en el diacutea 1 fue significativo y luego relativamente
estable el comportamiento fue similar en las pruebas de diferentes temperaturas
de almacenamiento para este compuesto el cual es el maacutes problemaacutetico en la
industria viniacutecola
0
005
01
015
02
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 005813019932018661019611019932
4 etilfenol
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 005813 019355 021491 020576 026024
4 etilfenol
77
Figura 17 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar
Los resultados de la prueba son poco confiables y no entendibles por lo que
podemos verificar que el GC no estaacute trabajando de forma adecuada para la
deteccioacuten del compuesto
0001002003004005006
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 Etilguayacol 0 0 0022 0053 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
0005
01015
02025
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0223 0143 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
78
Figura 18 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
El comportamiento de este compuesto en la prueba es muy irregular y poco
confiable
0
2
4
6
8
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 397847665182787068397847
4 vinylfenol
0
2
4
6
8
10
12
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 11071 28438 00204 0
4 vinylfenol
79
Figura 19 Comportamiento del compuesto 4 etilfenol durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
La concentracioacuten de 4 etil fenol fue mayor al cuarto diacutea almacenado a
temperatura ambiente de 20C pero este compuesto no tuvo una actividad notoria
de ascenso durante su almacenamiento como se esperaba lo que deja muchas
dudas sobre los resultados de este ensayo
0
05
1
15
2
25
3
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etil fenol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 20C
80
Figura 20 Comportamiento del compuesto 4 etil guayacol durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
Comportamiento anormal del compuesto no se ve tendencias de aumento o
disminucioacuten de este en ninguna de las pruebas no tiene un comportamiento
regular pues se esperaba que la levadura BrettanomycesDekkera
descarboxinizara el compuesto 4-vinilguaiacol y aumentar las concentraciones de
4-etilguaiacol esta reaccioacuten no se hizo notoria en los compuestos aromaacuteticos
seguacuten lo determino el Cromatografo de Gas (GC)
0
005
01
015
02
025
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3
C (
mg
L)
4 etil guayacol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 20C
81
Figura 21 Comportamiento del compuesto 4 Vinyl fenoll durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
La no presencia de este compuesto en el vino original demuestra las baja o casi
nula presencia de la levadura BrettanomycesDekkera al diacutea primero este
compuesto incrementa de forma notoria en las muestras debido a la presencia de
acido cumaacuterico en el medio ya que sufre su carboxilacion convirtieacutendose en 4 vinyl
fenol sin embargo su comportamiento no fue regular y presento problemas de
lecturas
0
2
4
6
8
10
12
14
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
C (
mg
L)4 Vinyl fenol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 28C
82
9 CONCLUSIONES Y
RECOMENDACIONES
91 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO
Se desarrolloacute un medio selectivo soacutelido para BrettanomycesDekkera
accesible y faacutecil de elaborar
Se detectan colonias de la levadura BrettanomycesDekera en el agar
selectivo con glucosa como fuente de carbono en un lapso de 5 diacuteas en
incubacioacuten a 28C
El medio selectivo soacutelido con Glucosa como fuente de carbono fue maacutes
raacutepido y efectivo ya que toma 5 diacuteas para dar resultados positivos frente al
de Etanol como fuente de carbono el cual toma 10 diacuteas para mostrar
resultados positivos aunque ambos dieron resultados satisfactorios en la
selectividad de la levadura BrettanomycesDekkera
La levadura se adapto de forma satisfactoria a estos medios en
condiciones de almacenamiento propias para su desarrollo (28C)
Las colonias de la levadura BrettanomycesDekkera tiene un crecimiento
en estos medios soacutelidos de forma circular con topografiacutea convexa y borde
entero dimensiones 5-6 mm color Amarillo opacicidad oscuro
83
superficie lisa y suave siendo faacutecil de identificar y realizar los conteos
necesarios
El medio solido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten
de la levadura BrettanomycesDekkera en vino tinto es raacutepido econoacutemico
y uacutetil
El uso de azucares para fermentacioacuten de la levadura
BrettanomycesDekkera que Saccharomyces no puede fermentar para
mayor selectividad
Realizacioacuten de pruebas Bioquiacutemicas como meacutetodo raacutepido de selectividad
92 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DESARROLLO DEL MEDIO LIacuteQUIDO
Se desarrollo un medio selectivo liquido para BrettanomycesDekkera
accesible y faacutecil de elaborar
Este medio mostroacute resultados positivos de la presencia de
BrettanomycesDekkera en un lapso de tiempo menor (3 diacuteas) que con el
medio solido (5 diacuteas) en caso de que el nuacutemero de ceacutelulas de la levadura
BrettanomycesDekkera sea mayor a la poblacioacuten critica (103)
Cuando la poblacioacuten de ceacutelulas de la levadura BrettanomycesDekkera es
menor a la poblacioacuten critica el tiempo de identificacioacuten de esta levadura por
medio liquido es muy prolongado puede tomar maacutes de 10 diacuteas o incluso no
detectarlo
84
Los compuestos quiacutemicos usados para el desarrollo del medio liacutequido no
son los adecuados para este tipo de medios donde los resultados positivos
son olfativos pues estos compuestos emiten fuertes olores que confunden
los olores caracteriacutesticos del caraacutecter Brett
El medio liquido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten
de altas concentraciones de la levadura BrettanomycesDekkera en vino
tinto es raacutepido econoacutemico y uacutetil
93 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg
EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE DALMACIA
CROACIA
Este trabajo mostroacute que el dioacutexido de azufre (SO2) tiene buenos resultados
en contra de la levadura BrettanomycesDekkera en concentraciones
normales de 40mgl concentracioacuten en la que se trabaja este compuesto en
los vinos tintos
En Europa el dioacutexido de azufre es usado de forma tradicional en gran
nuacutemero de alimentos y especialmente en vinos sin embargo y a pesar de
su uso regulado se busca la sustitucioacuten de este o su maacutexima reduccioacuten
para hacer de este producto maacutes sano para las personas no tolerantes a
este tipo de compuestos sin embargo seguacuten el trabajo realizado en
comparacioacuten con el producto Antibrettreg el SO2 es maacutes eficaz en el control
85
de la levadura ayudando a evitarla y eliminarla de la cadena productiva del
vino tinto
Gracias a sus caracteriacutesticas el vino tinto Babic es muy vulnerable a la
levadura BrettanomycesDekkera pero a su vez se puede tratar faacutecilmente
con productos como SO2 y Antibrettreg aunque es maacutes efectivo contra
BrettanomycesDekkera el dioacutexido de azufre (SO2)
Antibrettreg es una buena opcioacuten para el control de BrettanomycesDekkera
para evitar el uso de productos alergenicos como SO2
94 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN
EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO
MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE
Al terminar la primera prueba con anaacutelisis en cromatografiacutea a gas y el SPME
queda como resultados
Es necesario repetir la prueba
No se determina el efecto de los estaacutendares internos sometidos a tiempos
de almacenamiento en temperaturas de 20C y 28C lo que puede dar falsos
resultados de cantidades de compuestos
86
Se debe crear un medio maacutes apto para el desarrollo de la levadura y un
control diario de crecimiento ( agregar maacutes Glucosa en caso de que se
haya consumido toda controlar presencia de Bacterias y otros
microorganismos que no se deseen en el medio)
Es necesario control de aromas con panel sensorial para determinar el
umbral de deteccioacuten en este vino
Control de crecimiento por medio solido Selectivo para
BrettanomycesDekekra conteo de colonias presentes en el vino inoculado
y su desarrollo durante almacenamiento a diferentes temperaturas
La segunda prueba no fue posible realizarla por dantildeos en el equipo de
cromatografiacutea de gas (GC)
87
ANEXOS
11
89
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientiacuteficas 99 Grupos de
Investigacioacuten Enoloacutegica Zaragoza Espantildea
93
11
GRACIAS es una palabra corta para todo lo que quiero expresar a todos aquellos que
hicieron parte de este suentildeo hecho realidadhellip
A Dios y a la virgen Auxiliadora por llevarme de su mano cada diacutea de mi carrera en cada
momento alegre y en cada momento difiacutecil fueron mi fortaleza
A mis papitos por hacer de mi estudio una realidad por su sacrificio y apoyo desinteresado y
sincero
A mi Hermanito por ser mi fortaleza mi ejemplo y mi amigo incondicional
A mi familia Blanco y Urrea por su compantildeiacutea durante esta etapa
A mi facultad (Decano Dr Camilo Rozo Dra Patricia Jimeacutenez y mis profesores) por
ensenarme mi profesioacuten y aportar lo mejor de ustedes para mi formacioacuten personal
A mis asesores de Tesis (Ing Patricia Chaparro y Dr Sc Leo Gracin) por su guiacutea y
colaboracioacuten oportuna
A mis queridos amigos quienes siempre han estado a mi lado en las dificultades y en las
alegriacuteas (Ingrid Mafe Cami G Cami R Harold Pipe Karla Andreacutes T Diego G)
A IAESTE en alianza con el ORI por hacer posible mi intercambio y poder hacer mi tesis en el
maravilloso paiacutes de Croacia
A Croacia por ser mi segundo hogar por abrirme sus puertas y su corazoacuten por brindarme
tan maravillosas personas en mi camino
Croatia Thank you for being my second home for opening your doors and your heart to me
and give me the opportunity to meet so many wonderful people
To my boss my teacher my mentor and specially my friend Leo
To the faculty of food technology and Biotechnology and the department of technology
and analysis of beverages for give me the opportunity to give all my knowledge to the
project and learn a lot more
To all the amazing people I met during this experience (Igor Karin Natka Josip Ana Matija
Daniel Pz Szilvia Dini Daniela Lidija Sanja and everybody else who I had the pleasure to
meet in this great trip) for give me the best of your hearts
I only have one thing to say hellipTHANK YOU
Solo me queda una palabra por decirhellipGRACIAS
13
114 Pseudomycelium
Cualquier fabricante de vinos ha tenido la oportunidad de notar la formacioacuten de
una peliacutecula en la superficie del vino Esto surge debido a la gemacioacuten repetida de
las levaduras oxidativas y fallas en el momento de la separacioacuten de la ceacutelula hija
de la madre Con el tiempo el lazo previo entre la madre ceacutelula e hija se ampliacutea
dando la impresioacuten de filamentos como si se tratase de mohos siendo que son
levaduras 13
12 TAXONOMIA
Para distinguir las levaduras que pueden producir ascoporas de aquellas que no
los micologistas usan doble taxonomiacutea para su clasificacioacuten Desafortunadamente
la nomenclatura para la combinacioacuten anamorfotelemorfo es frecuentemente
diferente Unos ejemplos de levaduras sexualasexual o telemorfoanamorfo son
DekeraBrettanomyces Metschnikowia pulcherrimaCandida pulcherrima
Hanseniaspora uvarumKloeckera apiculata Torulaspora delbruecki Candida
colliculosa 14
Sin embargo las levaduras son diferenciadas por los taxonomistas por asignacioacuten
de varios nombres de geacutenerosespecies varios vinicultores usan un sistema
informal para agrupar levaduras basadas en su morfologiacutea u otras caracteriacutesticas
Por ejemplo a Kloeckera apiculata se le refiere como ldquolevadura apiculadardquo
tiene forma de limoacuten Esta levaduras asi com muchas otras presentes en el mosto
de la uva como lo son Candida Cryptococcus Debaryomyces Hansenula
Issatchenkia Kluyveromyces Metschnikowia Pichia y Rhodotorula tambieacuten son
llamadas levaduras ldquonativasrdquo ldquonaturalesrdquo o ldquosalvajesrdquo por su origen el vintildeedo o en
13
Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers
GmbH United States of America and Canada
14 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
14
la vinera Algunos enoacutelogos han discutido contra el uso de estos teacuterminos porque
esta implicancia no sucede en todas las levaduras ya que estas son de alguna
forma ldquono-nativasrdquo o ldquono naturalesrdquo (Ej Saccharomyces o Brettanomyces) El
teacutermino ldquono Saccharomycesrdquo es maacutes comuacuten para nombrar aquellas levaduras
presentes en el mosto de la uva que no son del genero Saccharomyces15
Las levaduras encontradas despueacutes de la fermentacioacuten alcohoacutelica tambieacuten son
asignadas a un grupo informal Algunas veces las levaduras que conducen la
principal fermentacioacuten (Saccharomyces) son muchas veces llamadas ldquolevaduras
fermentativasrdquo basados en su metabolismo Durante su antildeejamiento algunas
levaduras (Candida Hansenula y Pichia) pueden crecer en la superficie en
presencia de oxigeno Esta peliacutecula superficial es comuacutenmente asociada a
deterioro del vino esta levadura se le conoce como ldquolevadura formadora de
peliacuteculardquo16
121 DekkeraBrettanomyces
La taxonomiacutea cientiacutefica sobre BrettanomycesDekkera ha cambiado en los uacuteltimos
antildeos Brettanomyces estaacute clasificado dentro de la misma familia que
Saccharomyces (familia Saccharomycetaceae) Actualmente dentro del geacutenero
Brettanomyces se aceptan cinco especies diferentes (B bruxellensis B
anomalus B custersianus B nanas y B naardenensis)17
Las teacutecnicas de biologiacutea molecular han demostrado que B intermedious B
lambicus B custerseii o D intermedia son sinoacutenimos de B bruxellensis por lo
que estas denominaciones han quedado en desuso Los microorganismos de este
geacutenero presentan dos formas una capaz de reproducirse sexualmente (Dekkera)
15
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
16 Kurtzman CP 1998 The industrial and agricultural significance of yeasts 4
th Edition Amsterdam
Holanda
17 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
15
y otra que lo hace asexualmente (Brettanomyces) Tambieacuten se llaman
respectivamente forma perfecta y forma imperfecta En algunos casos la forma
perfecta y la imperfecta reciben nombres diferentes como ocurre con B anomalus
y D anomala En otros casos el nombre es similar como las pertenecientes a la
especie bruxellensis que pueden parecer como D bruxellensis como B
bruxellensis o como BrettanomycesDekkera A efectos praacutecticos en la bodega
estos dos estados son similares Cuando vemos referencias a Brettanomyces
como contaminante en la mayor parte de los casos se refieren a
DekkeraBrettanomyces ya que este es el responsable de las alteraciones en el
vino18 y 19
La morfologiacutea celular de BrettanomycesDekkera es ojival o ciliacutendrica con
gemacioacuten multipolar en reproduccioacuten vegetativa Una de las caracteriacutesticas de
este geacutenero es su tamantildeo celular variable y la formacioacuten de filamentos19
18 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 23
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
19
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
16
Figura 1 Microfotografiacutea de cultivo de BrettanomycesDekkera a) Variabilidad morfoloacutegica y de
tamantildeo celular b) forma filamentosa
Fuente Lopez-Cordon Eva BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia wwwacenologiacom
Los defectos sensoriales asociados directamente a Brett aparecen
mayoritariamente en vinos tintos de calidad y las causas radican en la propia
fisiologiacutea del microorganismo Ademaacutes al ser una levadura de crecimiento muy
lento la alteracioacuten se presenta principalmente durante el almacenamiento y sobre
todo la crianza del vino habitual en los vinos tintos de gama alta En las barricas
de madera el microorganismo tiene a su disposicioacuten todo el sustrato y tiempo
suficiente para realizar su actividad La naturaleza porosa de la madera y su difiacutecil
limpieza contribuye a que las poblaciones existentes se mantengan incluso
despueacutes del lavado de la barrica Ademaacutes BrettanomycesDekkera tiene la
capacidad de degradar uno de sus componentes la celobiosa 20
13 CARACTERISTICAS FISIOLOGICAS
S cerevisiae y BrettanomycesDekkera tienen metabolismos similares muy
adaptados a las condiciones de vinificacioacuten Tras la fermentacioacuten alcohoacutelica S
cerevisiae es la levadura mayoritaria debido a que las condiciones nutricionales
20
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
17
del vino son muy estrictas (altas concentraciones de etanol y bajas
concentraciones de nutrientes) En este momento BrettanomycesDekkera
continuacutea creciendo gracias a que utiliza nutrientes que S cerevisiae no ha podido
consumir sobre todo algunos azuacutecares y fuentes de nitroacutegeno21
Una de las caracteriacutesticas que diferencia a BrettanomycesDekkera es la gran
diversidad de azuacutecares que puede fermentar (ver tabla de Relacioacuten de los
principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) La mayoriacutea de
las cepas pueden crecer utilizando trealosa y celobiosa azucares presentes en el
vino y no consumibles por S cerevisiae Otra de las ventajas que presenta frente
a S cerevisiae (y frente a la mayoriacutea de las levaduras) es que puede utilizar los
nitratos como fuente de nitroacutegeno Debido a que S cerevisiae soacutelo utiliza el
nitroacutegeno amoniacal y los aminoaacutecidos libres estos se consumen con relativa
rapidez Al final de la fermentacioacuten el nitroacutegeno moniacal es escaso y se favorece
el crecimiento de las levaduras que pueden utilizar otras fuentes de nitroacutegeno
Ademaacutes Brettanomyces puede crecer con concentraciones de fosfato diamoacutenico
tan bajas como 05gl o a partir de diversos aminoaacutecidos En resumen
BrettanomycesDekkera crece maacutes despacio que S cerevisiae es resistente a
concentraciones altas de alcohol puede utilizar otros azucares como fuentes de
energiacutea y nitrato como fuente de nitroacutegeno Esto explica que pueda reproducirse
cuando la fermentacioacuten alcohoacutelica ha terminado a partir de nutrientes no
consumibles por S cerevisiae y cuando no tiene competidores22
21
Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
22 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
18
Tabla 1 Relacioacuten de los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto
Fuente Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista
VINOTEQ N 38 pag 21 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
131 BrettanomycesDekkera y siacutentesis de fenoles volaacutetiles
El origen de los fenoles volaacutetiles estaacute relacionado con la actividad secuencial de
dos enzimas que descarboxilan los aacutecidos en hidroxiestirenos (vinilfenoles) que
19
son posteriormente reducidos a etilderivados (etilfenoles)23 como puede
observarse en la figura 2
Figura 2 Siacutentesis de etilfenoles de BrettanomycesDekkera
Fuente ACE revista de Enologia wwwacenologiacom
El primer paso de descaboxilacion de los aacutecidos hidroxicinamicos es comuacuten
tambieacuten en otros microorganismos como bacterias hongos y otras levaduras Sin
embargo el segundo paso reduccioacuten de vinilfenoles es caracteriacutestico de algunos
tipos de levaduras como Dekkera bruxelliensis D anomala Pichia guillermondi
Candida versarilis C halophila y C mannitofaciens24
Los fenoles volaacutetiles que se asocian al problema Brett en vinos son el 4-etilfenol y
el 4- etilguaiacol asiacute como sus precursores intermedios 4-vinilfenol y 4-
vinilguaiacol aunque estos uacuteltimos son menos importantes por ser muy reactivos y
raacutepidamente convertidos en etilfenoles por BrettanomycesDekkera o en su caso
23
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
24 Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
20
condensan con otras moleacuteculas como antocianos25 Los etilfenoles y
especialmente elevadas concentraciones de 4-vinilfenol en vinos se asocian con
aromas desagradables asociados a descriptores como ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de
caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo26
El umbral sensorial del 4-etilfenol es de 230 μg l-1 y el del 4-etilguaiacol es de 47
μgl Pese a su menor umbral sensorial el 4-etilguaiacol responde a descriptores
como ldquobaconrdquo o ldquoahumadordquo que a bajas concentraciones aportan complejidad por
lo que se puede considerar sensorialmente menos conflitivo que el 4-etilfenol 27
Figura 3 Defectos sensoriales producidos en el vino por BrettanomycesDekkera
Fuente Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
25 Morata A Goacutemez-Cordoveacutes M Calderoacuten F Suaacuterez J 2006 Effects of pH temperature and SO2 on the
formation of pyranoanthocyanins during red wine fermentation with two species of Saccharomyces Journal Food Microbiology No106 pag 4 Madrid Espana
26 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea 27 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
21
132 Identificacioacuten de BrettanomycesDekkera
Los Bioacutelogos usan sistemas de identificacioacuten basados en similitudes taxonoacutemicas
entre organismos dichas similitudes pueden ser morfoloacutegicas tipos capacidad de
produccioacuten de sustratos como azuacutecar yo nitratos caracteriacutesticas fisioloacutegicas y
bioquiacutemicas secuencia del material geneacutetico y respuestas inmunoloacutegicas28
En la industria viniacutecola es importante recurrir a diferentes tipos de pruebas para la
identificacioacuten de microorganismos una de estas y la maacutes realizada es la revisioacuten
del microorganismo bajo el microscopio Esta prueba brinda informacioacuten sobre la
morfologiacutea del microorganismo (cocos bacilos formas puntudas ojival entre
otros) tamantildeo (dimensiones) agrupaciones celulares (solas parejas triacuteos
grupos o cadenas) Sin embargo el uso del microscopio es una prueba raacutepida
para examinar mostos o vino pero no determina cantidades que muchas veces es
requerido para tratamientos de accioacuten otro de los inconvenientes es que los
microorganismos pueden variar su morfologiacutea en forma o tamantildeo dependiendo de
la edad y las condiciones de crecimiento por lo que puede no ser clara la
identificacioacuten de este29
14 Medios soacutelidos selectivos
Si se requiere de la confirmacioacuten del microorganismo este debe ser aislado del
vino para una caracterizacioacuten para esto se requiere de medios soacutelidos Cuando se
examina un microorganismo en un medio solido es importante revisar las
caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias (ver figura 4 Morfologiacuteas de colonias
en medios soacutelidos) Entre estas caracteriacutesticas estaacuten forma (circular irregular o
2829 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
22
rizada) tamantildeo (dimensiones estas normalmente se expresan en miliacutemetros)
topografiacutea (plano elevado convexo coacutencavo o embonado) presencia de
pigmentos opacidad (transparente traslucido u opaco) superficie (suave rugosa
lisa o aacutespero) bordes (entero ondulado crespo dentado rizado) o cualquier
cambio en el agar (color opacidad cambios en los indicadores de pH o CaCO3
respectivamente)30
Figura 4 Varias morfologiacuteas de crecimiento de colonias en medio solido
Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007
Gran nuacutemero de medios selectivos se han creado para la aislacioacuten deteccioacuten yo
conteo de levaduras provenientes de jugos de uva mostos o vinos El medio maacutes
utilizado en estos fines es YPD (Yeast Peptone Dextrose) pero dicho medio no
es selectivo entre levaduras y se usa comuacutenmente para el conteo de
Saccharomyces31 Las colonias empiezan a parecer con un periodo de incubacioacuten
30
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
31 Essia Ngang J Wolniewicz E Villa P2005 Stimulation of lactobacilli during alcoholic fermentation action
of sucrose hydrolysis by yeast Biotechnology letters No 8 pag 743 Amiens France
23
de 2 a 4 diacuteas a 22C a 25C Igualmente el agar de jugo de uva es no selectivo y
presenta faacutecil crecimiento de levaduras bacterias y mohos
Para la levadura Brettanomyces Dekkera se han elaborado diferentes medios
selectivos entre ellos el maacutes conocido es WL por sus siglas en ingles del
laboratorio que lo creo ldquoWallerstein Laboratoriesrdquo este medio contiene
cicloheximida compuesto selectivo para Brettanomyces e inhibe Saccharomyces
El punto criacutetico es encontrar la cantidad exacta de este compuesto para la
inhibicioacuten de las levaduras sin que afecte a BrettanomycesDekkera32
Ademaacutes del medio WL BrettanomycesDekkera puede ser cultivado en otros
medios selectivos como Brettanomyces medio A creado por Vilas en 1993
Brettanomyces medio B el cual contiene cicloeximida como agente selectivo
mientras que Brettanomyces medio C tiene cicloheximida y ampicilina este medio
fue creado por B Watson en 1998 Brettanomyces medio D fue creado
recientemente por Rodrigues en 2001 este medio es conocido como DBDM
(DekkeraBrettanomyces differential medium ) es un medio selectivo para
Brettanomyces en contra de Saccharomyces y otras levaduras este medio es el
maacutes utilizado en la vineras para caracterizacioacuten de BrettanomycesDekkera
actualmente33
15 Dioacutexido de azufre (SO2) en vinos
32
33
Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers
GmbH United States of America and Canada
24
El dioacutexido de azufre tambieacuten llamado oxido de azufre es un eficaz agente
conservante antioxidante y antimicrobiano en la industria viniacutecola34
Durante la vinificacioacuten SO2 ha representado histoacutericamente una herramienta muy
importante usada por los vinicultores para el control de crecimiento microbioloacutegico
Debido a preocupaciones por la salud del consumidor el uso de este producto ha
disminuido dramaacuteticamente con el posible riesgo de aumentar el riesgo
microbioloacutegico35
El actual liacutemite legal de SO2 en vinos en los Estados Unidos es de 350mgL una
concentracioacuten mucho mayor a la usada en la industria viniacutecola No obstante vinos
que contienen maacutes de 10mgL deben declarar este compuesto en la etiqueta
porque SO2 es un metabolito que las levaduras usan durante la fermentacioacuten Los
vinos siempre contienen algo de sulfitos aunque la adicioacuten no se realice durante el
proceso36
151 Formas del Dioacutexido de Azufre (SO2)
Una vez disuelto en agua el dioacutexido de azufre existe en equilibrio entre SO2
molecular (SO2H2O) bisulfito (HSO3) y sulfito (SO32-) Este equilibrio depende del
pH Ademaacutes de estar en equilibrio con el molecular y especies sulfito el bisulfito
tambieacuten existe en forma ldquolibrerdquo y en forma ldquoatadardquo Aquiacute la moleacutecula reaccionara
34
Orwine Eureka 2008Investigadores europeos buscan alternativas al dioxido de azufre en vinos
httpawprowordpresscom20081107investigadores-europeos-buscan-alternativas-al-dioxido-de-
azufre-en-el-vino
3536 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
25
con compuestos carbonilos (ej Acetaldehiacutedo) formando productos adicionales
como Acido Hydroxysulfonico 37
Ademaacutes de Acetaldehiacutedo algunas moleacuteculas presentes en el jugo de uva que
reaccionan con bisulfito son acido piruvico α-keto-glutaric dihidroxyacetona
diacetyl Pigmentos de antocianinas entre otros38
152 Inhibidor Microbiano
El sulfuro molecular es la forma antimicrobiana del dioacutexido de azufre La cantidad
de SO2 molecular presente en cualquier vino no se mide directamente La
concentracioacuten es calculada conociendo la concentracioacuten de SO2 libre y el pH del
vino basaacutendose en la siguiente foacutermula
Alternativamente la figura 5 Se puede utilizar como guiacutea para aproximar la
cantidad de SO2 libre necesitada a determinado valor de pH de valores entre 05 o
08 mgl de SO2 molecular 39
El SO2 inhibe microorganismos de varias formas incluyendo rupturas de puentes
bisulfitos en proteiacutenas y reaccionando con coofactores como NAD+ y FAD tambieacuten
reacciona con ATP
3739
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
38 Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi
Springer New York United States
26
Figura 5 Cantidades de SO2 libre a un pH determinado para obtener 05 o 08 mgl de SO2
molecular
Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007
La concentracioacuten de SO2 molecular necesario para prevenir el crecimiento de
microorganismos variacutea seguacuten vinojugo pH temperatura poblacioacuten densidad y
diversidad estado de crecimiento grado de alcohol entre otros factores Beech
1979 sugirioacute una adicioacuten de 08 mgl de SO2 molecular como la cantidad
necesaria del compuesto en vinos blancos de mesa para dar una reduccioacuten de
cerca de 104 UFCml de la poblacioacuten de diferente tipo de microorganismos en 24
horas Las diferencias que existen entre las levaduras y bacterias en base a la
27
sensibilidad a este compuesto son dadas a conocer por diferentes autores (Warth
1977 1985 Du Toit 2005 Davis 1988 Hood 1983)40
16 Antibrettreg como alternativa de prevencioacuten y eliminacioacuten de
BrettanomycesDekkera
Antibrettreg es un producto nuevo creado por Spindal SARL-Gretz - Armainvilliers
Francia Es una preparacioacuten enzimaacutetica para inactivar Brettanomyces y para
reducir olores producidos por fenoles volaacutetiles41
Antibrettreg es preparado a base de paredes celulares de levadura activados
enzimaacuteticamente que presentan elevadas propiedades adsorbentes frente al 4-
etilfeno y 4- etilguayacol compuestos asociados con olores desagradables en el
vino tales como sudor de caballo farmacia o barniz42
Antibrettreg inhibe la produccioacuten de la vinilreductasa que participa en la
transformacioacuten de los aacutecidos cinaacutemicos naturalmente presentes en los vinos en
los correspondientes derivados etilados responsables de los olores atribuidos a
BrettanomycesDekkera 43
40
Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi
Springer New York United States
41 Manual de instrucciones de producto Antibrett reg producido por Spindal SARL-Gretz -
Armainvilliers France
424344 AEB Group 2008 ANTIBRETT Preparado a base de paredes celulares de levadura para la inactivacioacuten
de Brettanomyces y la eliminacioacuten de los olores de estos productos httpwwwaeb-
groupcomimgsSPAGNOLODepliantANTIBRETT-lett-ESPpdf
28
El uso de Antibrettreg es efectivo incluso contra otros olores anoacutemalos como los
que se generan en las barricas sucias principalmente huacutemedas dantildeando la
calidad olfativa del vino44
29
2 PROBLEMA
La levadura BrettanomycesDekkera es una levadura de contaminacioacuten presente
en la mayoriacutea de industrias viniacutecolas en el mundo Afecta directamente la
produccioacuten y calidad sensorial de los vinos con el desarrollo de los compuestos 4
etilfenol y 4 etilguayacol los cuales dantildean el perfil olfativo del vino dando aromas
caracteriacutesticas a ldquoestablordquo ldquocuerordquo ldquosudor de caballordquo o ldquobarnizrdquo conocido como
ldquocaraacutecter Brettrdquo
Esta contaminacioacuten se da especialmente en los vinos tintos debido a sus
caracteriacutesticas de produccioacuten (fermentacioacuten crianza antildeejamiento) y sus
propiedades fisicoquiacutemicas (Grado alcohoacutelico pH Acidez total Acidez volaacutetil
entre otros)
En Croacia existe una gran produccioacuten de vinos tintos entre los cuales se
encuentra el vino tinto Babic proveniente de la isla de Hvar el cual es famoso por
ser un vino duro carnoso estructurado y casi sobre-maduro con un grado
alcohoacutelico que ronda los 15 vv siendo la primera denominacioacuten de origen que
se aproboacute en Croacia en el antildeo 1961 este vino es de gran importancia en la
regioacuten la mayoriacutea de sitios de elaboracioacuten son pequentildeas industrias que han sido
afectadas por el bdquocaraacutecter Brett‟ Muchas investigaciones se han realizado al
respecto de la levadura BrettanomycesDekkera pero se conoce muy poco sobre
sus efectos en el vino Babic debido a sus caracteriacutesticas particulares (alcohol
30
15 pH 35 Acidez total 520 gr Acido TartaricoL Acidez volaacutetil 08 gr Acido
AceticoL Azucar residual 47 grLt)45
La dificultad de la pequentildea industria para acceder a productos que lleven a la
identificacioacuten de la levadura mencionada y de esta manera conllevar a planes de
accioacuten contra el ldquocaraacutecter Brettrdquo es una de las grandes dificultades de la industria
vinera en este paiacutes en donde los productos para la industria enoacuteloga son
complicados y de alto precio para acceder a ellos y en consecuencia no se
realizan muchas de estas pruebas de deteccioacuten de BrettanomycesDekkera
llevando al mercado productos contaminados de baja calidad que inicialmente
podriacutea haber sido un vino de alta calidad debido a sus caracteriacutesticas uacutenicas y de
gran popularidad
45
Datos obtenidos en el laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
31
3 JUSTIFICACION
Actualmente Croacia cuenta con maacutes de 300 zonas vineras en las que se producen 67
de vino blanco 32 vino tinto y el restante 1 vino rosado De acuerdo a recientes datos
estadiacutesticos hay 650 km2 de vintildeedos en Croacia de los cuales 375 km2 son uvas con
indicacioacuten geograacutefica de origen que producen maacutes de 300 vinos y maacutes de la mitad de este
nuacutemero son vinos elaborados en microempresas con un total de 50000000 de botellas
de vino el 8 es vino superior 70 de calidad y el 22 es vino de mesa de produccioacuten
nacional46
Croacia es un fuerte productor de vino a nivel regional con sus diferentes variedades
propias (Merlot Plavac Dingač Postup Malvazija Pošip Kujundžuša Babic) pero dicha
produccioacuten ha sido fuertemente afectada por la presencia de la levadura
BrettanomycesDekkera trayendo consecuencias como perdidas de produccioacuten peacuterdida
de calidad sensorial del vino grandes peacuterdidas econoacutemicas y desprestigio a sus vinos de
denominacioacuten de origen
Es por esto que en este proyecto de investigacioacuten se busca una faacutecil y raacutepida
identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera causante del ldquocaraacutecter Brettrdquo con el
desarrollo de medios selectivos liquido y solido ademaacutes de opciones para el tratamiento
yo prevencioacuten de esta levadura en la cadena productiva comparativamente entre dioacutexido
de azufre (SO2 ) y Antibrettreg y la identificacioacuten de los aromas caracteriacutesticos del ldquocaraacutecter
Brettrdquo en el vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia
46
Hrvatski zavod za vinogradarstvo i vinasrtvo 2003 Pravilnik o vinu httpwwwhrzvvhrpropisihtm
32
4 OBJETIVOS
41 General
Caracterizar y evaluar el comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera
en teacuterminos de crecimiento y produccioacuten de aromas no deseados en vino tinto
Babic
42 Especiacuteficos
Desarrollar el medio solido y medio liacutequido selectivo para
BrettanomycesDekkera
Evaluar el comportamiento de la levadura en estos medios selectivos
Determinar la influencia del Dioacutexido de azufre (SO2) y el compuesto
Antibrettreg en la levadura BrettanomycesDekkera presente en vino tinto
Babic 2007
Identificar los compuestos aromaacuteticos producidos por Brettanomyces
bruxellensis en vino tinto Babic usando el meacutetodo ldquomultiple headspace
solid-phase microextraction (SPME)rdquo
33
5 ALCANCES
En este proyecto se pretende desarrollar un medio selectivo faacutecil de producir en
donde sea raacutepida la identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera en la
produccioacuten de vinos tintos se realizaran pruebas para corroborar el crecimiento de
esta levadura en el medio determinando el tiempo que esta levadura toma en
adaptarse en el medio y su comportamiento en este una vez comprobada su
adaptacioacuten al medio liquido se trabajara con el meacutetodo de cromatografiacutea de gas
(GC) y el uso de micro extraccioacuten en fase solida (SPME) para el anaacutelisis
cuantitativo de los compuestos volaacutetiles (4-etil-fenol 4-etil-guayacol4-vinilfenol y
4-vinil-guayacol) y posteriormente con el vino tinto Babic Ademaacutes se desea
comprobar la efectividad de los productos con que las vineras de Croacia inhiben
o eliminan la presencia de la levadura en los vinos tintos como lo son el producto
AntiBrettreg y el Dioacutexido de azufre (SO2)
34
6 ESTADO DEL ARTE
Sobre el campo problemico causado por la levadura BrettanomycesDekkera en la
industria viniacutecola se han realizado bastante investigaciones a nivel de
caracterizacioacuten de la levadura los factores fisicoquiacutemicos que favorecen el
crecimiento de la levadura meacutetodos de prevencioacuten y control evaluacioacuten de
dantildeos sensoriales en diferentes tipos de vinos formacioacuten de compuestos fenoacutelicos
en los diferentes tipos de vino otros compuestos no fenoacutelicos asociados al
ldquocaraacutecter Brettrdquo teacutecnicas de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera
evaluacioacuten de la teacutecnicas de control e inhibicioacuten de dicha levadura desarrollo de
nuevos medios de deteccioacuten y aislamiento de la levadura relacioacuten entre la
levadura BrettanomycesDekkera con las otras levaduras presentes en el vino
entre otros
Seguacuten estas investigaciones se analizan aquellas que pueden aportar datos
importantes para el desarrollo del trabajo que se quiere realizar y se tiene en
cuenta sus metodologiacuteas conclusiones recomendaciones y comentarios
Entre las importantes para el planteamiento de este trabajo se menciona el trabajo
realizado por la Universidad Politeacutecnica de Madrid Espantildea el cual analiza
algunas de las caracteriacutesticas maacutes relevantes de este geacutenero de levaduras su
crecimiento en bodega factores fisicoquiacutemicos que favorecen su crecimiento y
desarrollo en el vino los defectos sensoriales que presenta en los vinos y estudia
algunas de los meacutetodos fiacutesicos para el control de BrettanomycesDekkera en vino
35
(clarificacioacuten filtracioacuten amicrobica proteiacutenas clarificantes anhiacutedrido sulfuros
dimetil dicarbonato Aditivos)47
Para conocer maacutes sobre la levadura en condiciones de barrica y almacenamiento
se revisa el articulo elaborado en el Departamento Teacutecnico Guserbiot La rioja
Espantildea en este artiacuteculo se describe brevemente su metabolismo y su ecologiacutea en
las bodegas Igualmente se comparan las teacutecnicas utilizadas en los laboratorios
para su deteccioacuten y cuaacuteles son las limitaciones de los diferentes meacutetodos
Finalmente se analizan las estrategias desarrolladas para su eliminacioacuten de las
bodegas y se dan una serie de recomendaciones para su control48
El instituto de fermentaciones Industriales Consejo superior de investigaciones
cientiacuteficas Juan de Cierva Madrid Espantildea en el cual se revisa la formacioacuten de
etilfenoles (4 etil-fenol 4 etil guayacol) en vinos tintos anejos Los factores
fisicoquiacutemicos que favorecen el crecimiento de la levadura no deseada
BrettanomycesDekkera las teacutecnicas usadas para la detectar la presencia de esta
levadura en vinos ( Revisioacuten microscoacutepica fluorescente remocioacuten de aacutecidos
grasos de su membrana teacutecnicas moleculares como PCR y electroforesis) y de
control (Proteiacutenas fining Fining con gelatina liquida filtracioacuten variables
fisicoquiacutemicas adicioacuten de aditivos procedimientos de altas presiones
manipulacioacuten geneacutetica) con esta investigacioacuten se concluye que la combinacioacuten y el
uso de las numerosas teacutecnicas pueden ayudar a la prevencioacuten y reduccioacuten de la
levadura BrettanomycesDekkera 49 Este trabajo muestra las muacuteltiples opciones
47
A Morata S Benito F Palomero F Calderoacuten y J A Suaacuterez-Lepe Ecologiacutea y prevencioacuten de
BrettanomycesDekkera durante la elaboracioacuten y crianza de vinos tintos Revista enoacutelogos (Editada por la
Federacioacuten Espantildeola de Asociaciones de Enoacutelogos y Periodistas Asociados) No 50 paacuteg 1-12 Madrid Espantildea
48 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 20-
24 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
49 R Suarez JA Suarez-Lepe A Morata F Calderon 2006 The production of ethyl phenols in wine by yeasts
of the genera Brettanomyces and Dekkera A review Journal Food Chemistry No 102 pag 10-21 Madrid
Espantildea
36
existentes en el control y prevencioacuten de la levadura mencionada sin embargo deja
claro que la mayoriacutea de estas opciones son costosas y no de faacutecil adquisicioacuten para
una pequentildea industria
El anaacutelisis sensorial ha sido de los aspectos maacutes estudiados al respecto de
BrettanomycesDekkera una de estas investigaciones fue realizada en Centre
Europeacuteen des Sciences du Goucirct en Talence Francia en el cual se evaluaron 50
vinos bordeaux sensorialmente para demostrar la complejidad del ldquoCaraacutecter Brett‟‟
al cual se unen otros compuestos aromaacuteticos ademaacutes de los fenoacutelicos como acido
isobutirico e isovalerico en este tipo de vino debido a sus caracteriacutesticas
fisicoquiacutemicas50
De los meacutetodos de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera los medios
selectivos son muy populares es por esto que el Laboratorio de Microbiologiacutea
Departamento de Botanica e Engenharia Biologica Instituto Superior de
Agronomia Lisboa Portugal realizo un trabajo en el cual se pretendia desarrollar
un medio selectivo o diferencial capaz de aislar la levadura
BrettanomycesDekkera del vino y de la cadena productiva del vino con el fin de
detreminar la relacioacuten entre esta levadura y los compuestos 4-etilfenol y 4 etil-
guayacol51 otro estudio realizado para la deteccioacuten de dicha levadura fue
realizado en la Escola Superior de Biotecnologiacutea Universidade Catoacutelica
Portuguesa el desarrollo de un simple procedimiento compatible con las rutinas
50 Andrea Romano a Marie Claire Perello a Aline Lonvaud-Funel Gilles Sicard Gilles de Revel2008 Sensory
and analytical re-evaluation of lsquolsquoBrett characterrdquo Journal Food Chemestry No 114 pag 15-19 Talence
France
51 N Rodrigues G Gonccedilalves S Pereira-da-Silva M Malfeito-Ferreira and V Loureiro2001 Development
and use of a new medium to detect yeasts of the genera DekkeraBrettanomyces Journal of applied microbiology No 90 pag 588-599Lisboa Portugal
37
usadas en las vineras para la deteccioacuten de BrettanomycesDekkera en vino y en
maquinarias52
En el laboratorio de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas Alcohoacutelicas de la
Universidad de Zagreb se ha trabajado anteriormente en el desarrollo de medio
solido selectivo con pruebas de diferentes concentraciones de los compuestos
como resultados se encuentra una buen relacioacuten entre las concentraciones de los
compuestos sin embargo como recomendaciones se encuentran la falta de
antibioacutetico para evitar contaminacioacuten por bacterias probar con diferentes fuentes
de carbono para comparacioacuten de tiempo de crecimiento positivo y un monitoreo
diario en el medio53
Los compuestos aromaacuteticos que libera la presencia de BrettanomycesDekkera
estaacute asociada a los compuestos 4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinilfenol y 4
viniguayacol a partir de esto los centros de investigacioacuten han hondado en la
identificacioacuten de dichos compuestos relacionados en la enologiacutea y especialmente
con BrettanomycesDekkera a partir de eso el Departamento de Quiacutemica
Universidad de La Rioja Espantildea este estudio presenta un meacutetodo basado en el
uso de Cromatografiacutea de Gas y micro extraccioacuten en fase solida para el anaacutelisis
cuantitativo de 4-etilfenol 4-etil guayacol 4-vinilfenol 4-vinilguayacol
Demostrando la existencia de un efecto matriz en el anaacutelisis de compuestos
responsables del ldquocaraacutecter Brettrdquo en vino Este nuevo meacutetodo fue
satisfactoriamente aplicado a cierto nuacutemero de vinos tintos comerciales vinos
52
JA Couto A Barbosa and T Hogg 2005 A simple cultural method for the presumptive detection of the yeasts BrettanomycesDekkera in wines Letters in Applied Microbiology No 41 pag 505-510 Porto
Portugal
53 Serkovic Dubravka Gracin Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac
Brettanomyces bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet pag 1-117 ZagrebCroatia
38
blancos y roseacute Este meacutetodo puede ser una alternativa para evitar el efecto matriz
en muestras de vino54
De acuerdo con este tema en la jornada cientiacutefica del 99 el grupo de investigacioacuten
enoloacutegica se estudio la formacioacuten de sustancias volaacutetiles por 13 cepas de S
cerevisiae con buenas aptitudes enoloacutegicas inoculadas individualmente en un
mosto homogeacuteneo de la variedad airen fermentado en las mismas condiciones
de aireacioacuten y a temperatura controlada55
54
C Pizarro N Perez-del-Notario JM Gonzalez-Saiz 2007 Determination of Brett character responsible
compounds in wines by using multiple headspace solid-phase micro extraction Journal of Chromatography
No 1143 pag 176-181 La Rioja Espantildea
55 E Pueyo P Hidalgo K Fernaacutendez y P Martiacuten-Aacutelvarez 1999 Anaacutelisis de compuestos volaacutetiles en vinos
obtenidos con distintas cepas de Saccharomyces cerevisiae Aplicacioacuten de la teacutecnica de microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientificas 99 Grupos de Investigacion Enologica Zaragoza Espana
39
7 MATERIALES Y METODOS
A continuacioacuten se presentan materiales y meacutetodos para la investigacioacuten
Este proyecto fue realizado en su gran mayoriacutea en las instalaciones de la
Universidad de Zagreb en la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos
(PBF) Laboratorios del Departamento de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas
Alcohoacutelicas ubicado en la ciudad de Zagreb Croacia
Los anaacutelisis fisicoquiacutemicos del vino tinto Babic fueron realizados en los
laboratorios de VINOLAB ubicado en Zagreb Croacia
71 MEDIO SOLIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera
711 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Autoclave de laboratorio
Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa Etanol peptona extracto de levadura
agar cicloheximida acido cumaacuterico ampicilina)
Balanza electroacutenica de precisioacuten
Microscopio oacuteptico
712 Metodologiacutea
Basados en estudios anteriores realizados en el laboratorio para el desarrollo de
medio solido selectivo para BrettanomycesDekkera (Serkovic Dubravka Gracin
40
Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac Brettanomyces
bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet Universidad de Zagreb pag 1-
117 Zagreb Croacia) se evaluaron las recomendaciones mencionadas en dicha
investigacioacuten para la mejoriacutea y desarrollo de otros medios soacutelidos selectivos
Se usoacute como base el medio YPD (Yeast Peptone Dextrose) el cual estaacute
compuesto de la siguiente forma 20gL peptona 10 gl extracto de levadura 20 gl
de agar56 este medio es selectivo para levaduras pero no es selectivo entre ellas
Es necesario el uso de una fuente de carbono para la levadura
BrettanomycesDekkera de acuerdo a la teoriacutea y revisando la tabla 1 (Relacioacuten de
los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) y seguacuten
facilidades de disponibilidad en el laboratorio se utiliza glucosa la cual es
utilizable por entre 75-100 de las cepas de BrettanomycesDekkera seguacuten la
tabla mencionada anteriormente
Esta fuente de carbono (Glucosa) fue probada en una concentracioacuten de 20 gL
Cicloheximida fue probada a 30 mgL para inhibir Saccharomyces en el medio y
darle mayor selectividad para Brettanomyces Dekkera Se antildeade acido p-
cumarico en una concentracioacuten de 100 mgL como precursor para la formacioacuten
del compuesto 4 etilfenol caracteriacutestico de la levadura BrettanomycesDekkera
Para inhibir bacterias en el medio se usa ampicilina a 10 mgL esta se agrega
despueacutes de realizada la esterilizacioacuten y cuando la temperatura del medio este
igual o menor a 40C El pH del medio se ajusto a 5
Paralelamente se crea el medio con Etanol como fuente de carbono en una
concentracioacuten de 6 o 60 mlL con la misma concentracioacuten de los otros
compuesto como cicloheximida 30mgL acido cumarico 100mgL 20 gL peptona
10 gL de extracto de levadura 16gL de agar Este medio se crea como
56
Concentraciones preestablecidas en el laboratorio de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas alcoholicas
41
comparativo para determinar cual fuente de carbono es la maacutes utilizada por la
levadura Brettanomyces bruxellensis para su reproduccioacuten Seguacuten la teoriacutea (ver
tabla 1) el etanol es utilizado por entre 25-75 de las cepas de
BrettanomycesDekkera pero es el azuacutecar que se encuentra en mayor
concentracioacuten presente en los vinos tintos aproximadamente 130 gl57
Estos medios fueron debidamente esterilizados para eliminar cualquier
microorganismo o espora presente en este Este procedimiento se realizo por el
meacutetodo de combinacioacuten de altas temperatura y presioacuten (Autoclave 121 C a 1034
kPa)
Se usaron colonias de BrettanomycesDekkera aisladas anteriormente de vinos
contaminados y guardas para investigaciones en el Departamento de Tecnologiacutea y
Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos
Universidad de Zagreb Croacia
Los medios fueron monitoreados visualmente todos los diacuteas y se toman
observaciones de macroscoacutepicas y microscoacutepicas Se comparan estos dos medios
en teacuterminos de rapidez de crecimiento de la levadura y selectividad Estas
muestras fueron incubadas a 28C por 10 diacuteas
La prueba fue realizada por duplicado en diferentes tiempos
57
Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
42
72 MEDIO LIacuteQUIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera
721 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Frascos de vidrio esteacuteriles
Autoclave de laboratorio
Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa peptona extracto de levadura
cicloheximida acido cumarico ampicilina etanol)
Microscopio oacuteptico
Balanza electroacutenica de precisioacuten
722 Metodologiacutea
En el mercado para enologiacutea existen medio liacutequidos selectivos para la deteccioacuten
de BrettanomycesDekkera en vinos sin embargo estos son de difiacutecil accesibilidad
por sus elevados precios es por esto que se desarrolla un medio liquido selectivo
para dicha levadura en el laboratorio del Departmaneto de Tecnologiacutea y Anaacutelisis
de Bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia
Para este medio se toma como base el medio selectivo con Glucosa como fuente
carbono desarrollado anteriormente sin usar agar para mantener el medio en su
estado liquido
43
La composicioacuten de este medio liacutequido es la siguiente
20 gL Glucosa
20 gL peptona
10gL extracto de levadura
30mgL de cicloheximida
100mgL acido p-cumarico
10 mgL ampicilina
Estos compuestos fueron medidos en una balanza electroacutenica de precisioacuten se
antildeade 250 ml de agua destilada y se mezcla constantemente se pasa a proceso
de esterilizacioacuten en autoclave a 120C y 1034 KPa por 45 minutos
De esta forma se asegura la usencia de microorganismos yo esporas en el
medio Despueacutes de bajar la Temperatura a 40C se agrega a la mezcla ampicilina
en una concentracioacuten de 10mgL
En frascos de vidrio esteacuteril se agrega 40 ml de medio liacutequido y diferentes
cantidades iniciales de levaduras BrettanomycesDekkera fueron inoculadas al
respectivo medio el primer frasco tiene una cantidad de 106 ceacutelulasml el segundo
tiene 104 ceacutelulasml el tercero tiene 102 celulasml y el cuarto con una cantidad
aproximada de 25 ceacutelulasml Estas cantidades estaacuten basadas en estudios
anteriores para medios liacutequidos selectivos en levaduras58
58 J Ungar A M James P W Muggleton H F Pegler y E G Tomich1950 The Cultivation of
Haemophilus pertussis in Partially Defined Liquid Media Journal of General Microbiology No 4
pag 345-359 Greenford
44
Este medio liacutequido inoculado fue inspeccionado diariamente visualmente revisioacuten
de turbidez microscoacutepicamente y olfativamente para deteccioacuten de olores del
ldquocaraacutecter Brettrdquo
Los diacuteas fueron contabilizados para determinar resultados positivos en estos
ensayos
73 INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN
VINO TINTO DE LA REGION DE DALMACIA CROACIA
731 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Medio selectivo solido para BretanomycesDekkera
Medio selectivo Liquido para BrettanomycesDekkera
Quiacutemicos de laboratorio (Dioxido de Azufre (SO2) Antibrettreg Glucosa)
Vino Babic 2007
Anallizador infrarojo Bacchius II microdom
732 Metodologiacutea
Con los medios desarrollados (solido y liquido) se quiere conocer el efecto del
dioacutexido de azufre (SO2) y el producto Antibrettreg en la levadura
BrettanomycesDekkera presente en el vino tinto de la regioacuten de Dalmacia
Con las herramientas que se tienen en el laboratorio del departamento de
tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia se quiere
determinar la influencia de estos productos en la levadura BrettanomycesDekkera
presente en vino tinto croata de la regioacuten de Dalmacia Babic
45
El primer paso es adaptar la levadura al vino tinto croata (Babic) para esto se
inoculan 20 colonias de BrettanomycesDekkera en 500 ml de vino se antildeadioacute
glucosa en una concentracioacuten de 2gL y se oxigena la mezcla Para este paso de
adaptacioacuten se dejan las muestras de 1 a 2 diacuteas a temperatura ambiente (20C)
Despueacutes de este periodo se revisa microscoacutepicamente la presencia positiva de
BrettanomycesDekkera en los 500 ml de vino en los que se estaba haciendo el
paso de adaptacioacuten en Babic al comprobar su presencia positiva se procede a
mezclar los 500 ml de vino contaminado con BrettanomycesDekkera con los 3
Litros de vino Babic que se disponen para esta prueba
Estos 3 litros de vino tinto Babic contaminado con la levadura
BrettanomycesDekkera se reparten en 8 frascos de vidrios esteacuteriles al siguiente
diacutea se toman dos frascos para agregar cada uno de los compuestos a evaluar
(SO2 y Antibrettreg)
Para SO2 se toman dos frascos uno de 600ml y uno de 100ml se agrega una
concentracioacuten de 40 mgl
Para el producto AntiBrettreg se toman cuatro frascos dos de 600 ml y dos de 100
ml seguacuten especificaciones del producto y la alta poblacioacuten de
BrettanomycesDekkera en las muestras se adiciono la maacutexima concentracioacuten de
AntiBrettreg a las muestras la cual fue de 40 gHl
Estas muestras se dejaron a temperatura ambiente simulando condiciones de
almacenamiento del vino en barricas temperatura aproximada de 20C evitando el
contacto con la luz solar y evitando movimientos fuertes Esto se mantuvo por 15
diacuteas que fue el tiempo de duracioacuten del experimento
Con el vino restante se mantuvo en las mismas condiciones de almacenamiento
de los demaacutes para hacer un paralelo de comparacioacuten
Previamente se analizaron las caracteriacutesticas del vino sin contaminar por medio
del analizador infrarrojo Bacchus II microdom antes de agregar los compuestos
46
SO2 y AntiBrettreg y despueacutes se volvioacute a realizar el anaacutelisis para determinar los
efectos de estos compuestos en el vino y asiacute mismo al de control
74 DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN
EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO
MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE
741 Materiales
Cromatografo de Gas HP5890 Serie II
Microextractor de fase solida (SPME)
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Quiacutemicos de laboratorio (p-cresolAcetaldehido Propanol diacetil etil-
acetato i-butanol acido aceacutetico i-amil-alcohol n-amil lactato de etilo
acetato amil metiacutelico 1-hexanol etil-hexanol linalol nerol citronelol
geraniol 2-feniletanol octanoato de etilo 4-etilfenol 2-feniletil acetato 4-
etilguaiacol)
Vino Tinto Babic
Agua destilada
742 Metodologiacutea
El meacutetodo fue desarrollado anteriormente en el Departamento de Tecnologiacutea y
Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos de
la Universidad de Zagreb Croacia Y despueacutes de modificaciones fue utilizado en el
desarrollo del trabajo El meacutetodo utilizado es descrito a continuacioacuten
47
Cromatografo de gas HP 5890 SERIES II
Programa HP-chem
a) Condiciones para analisis SPME-GC
Muestra diluida 5050 con adicion de estandar interno (p-cresol1mgl)
25ml de la muestra diluida con mezcla continua a temperatura ambiente
Tiempo de adsorcion 30 minutos
SPME es colocado en la muestra para la adsorcion durante el tiempo
previsto
b) Condiciones para el Cromatografo de gas (GC)
La columna usada en este experimento es RTXreg-5 (Restec USA sn 210627)
30m id=025mm 025μm
Gas portador Nitrogeno
Flujo del Nitrogeno 5 mlmin
Temperatura del inyector 240 C
Temperatura del detector 250 C
Temperaturas programadas 35 C5 min 150 C 34 Cmin 180 C
10Cmin 190 C 5 Cmin
Se conocen los resultados del cromatografiacutea de gases (ver tabla 10) y se hacen
necesarias varias correcciones del meacutetodo y algunas pruebas con unos
compuestos para determinar realmente su tiempo de retencioacuten en este tipo de
vino Se deben comprobar tiempos de retencioacuten
48
8 DISCUSIOacuteN Y RESULTADOS
81 RESULTADOS PARA EL DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO
Tabla 2 Medio Selectivo con Glucosa como fuente de carbono para
BrettanomycesDekkera en incubacioacuten por 5 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten
microscoacutepica
1 Negativo Negativo - No se realiza
2 Negativo Negativo - Presencia de levaduras
3 Negativo Negativo - Presencia de
Levaduras
4 Aparicioacuten de
algunas colonias
Negativo Transparente Presencia de levaduras
5 Colonias definidas Positivo-
Fenoles
Amarillo Presencia positiva de
BrettanomycesDekkera
49
Este medio tiene alto grado de selectividad para levaduras con un tiempo de
crecimiento de aproximadamente 5 diacuteas en 28C lo que lo hace raacutepido gracias al
antibioacutetico (ampicilina) que hace parte de la composicioacuten del medio no hay
presencia de bacterias Se hace confiable para resultados positivos de levaduras
BrettanomycesDekkera debido a que las levaduras Saccharomyces fueron
inhibidas con el compuesto cicloheximida su selectividad fue comprobada por
revisioacuten microscoacutepica macroscoacutepica y sensorial
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con glucosa como fuente de carboacuten son las
siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
50
Tabla 3 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono para Brettanomyces Dekkera en
incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica
1 Ninguno Negativo - -
2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras y
bacterias
9 Diminutas
colonias
transparentes
Negativo Transparentes Presencia de levaduras y
algunas bacterias
10 Positivo Positivo-
Fenoacutelicos
Amarillo Presencia de levaduras
BrettanomycesDekkera y
bacterias
El medio selectivo para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de
carbono tambieacuten es selectiva entre levaduras ya que solo se identifico la levadura
BrettanomycesDekkera en este sin embargo se evidencia una presencia de otro
microorganismo presuntamente bacteria ya que este medio no contiene agente
antibacteriano (ampicilina) Es necesaria la adicioacuten de ampicilina en una
concentracioacuten de 10mgl para inhibir la presencia de bacterias
Este medio presenta un tiempo maacutes prolongado para mostrar crecimiento de la
levadura BrettanomycesDekkera aproximadamente 10 diacuteas
51
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las
presentadas en el medio selectivo con glucosa como fuente de carbono y son las
siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
52
Tabla 4 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono y adicioacuten de ampicilina para
Brettanomyces Dekkera en incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica
1 Ninguno Negativo - -
2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
9 Diminutas
colonias
transparentes
Negativo Transparentes Presencia de levaduras
10 Positivo Positivo-
Fenoacutelicos
Amarillo Presencia de levaduras
BrettanomycesDekkera
El efecto de la ampicilina sobre el medio selectivo con etanol como fuente de
carbono fue el esperado inhibioacute completamente el crecimiento de colonias
bacterianas en el medio el tiempo de crecimiento de la levadura y presencia de
aromas fenoacutelicos fue el mismo de 10 diacuteas en incubacioacuten de 28C
53
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las
presentadas anteriormente y son las siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
82 RESULTADOS PRUEBAS MEDIO LIQUIDO
Tabla 5 Influencia de la concentracioacuten de levaduras BrettanomycesDekkera en el
tiempo necesario para detectar la produccioacuten de 4-etil-fenol en medio liquido
Nuacutemero de ceacutelulas ml
(concentracioacuten final)
Tiempo necesario para obtener resultados
positivos (diacuteas)
1 Experimento
32x106 le 3
3 X 104 3
33x102 7
40 No detectado
2 Experimento
43x106 le3
39x104 le3
37x102 8
62 No detectado
54
El nuacutemero de ceacutelulas de levadura de BrettanomycesDekkera fue contabilizado
usando contador de ceacutelulas Chamber
Los aromas fenoacutelicos son difiacuteciles de detectar debido al fuerte olor que tiene el
medio liquido caracteriacutestico de sus componentes esto dificulta la identificacioacuten del
ldquocaraacutecter Brettrdquo en especial cuando las concentraciones de
BrettanomycesDekkera no son elevadas Ademaacutes de los olores fenoacutelicos otros
compuestos volaacutetiles se detectan tales como acido aceacutetico y olores oxidativos
tambieacuten producido por la levadura BrettanomycesDekkera
En la inspeccioacuten visual se detecta alta turbidez en el medio Se compara con un
medio sin presencia de BrettanomycesDekkera
En las muestras con mayor concentracioacuten de la levadura es maacutes notoria la
turbidez Despueacutes de 3 diacuteas se presenta un precipitado blanco en todas las
muestras de altas concentraciones
La revisioacuten microbioloacutegica se realiza diariamente para determinar el nuacutemero de
ceacutelulas y la presencia positiva de la levadura a evaluar
Entre los dos experimentos realizados con el medio liquido el tiempo que se
demoro en detectar compuestos fenoacutelicos fue muy similar entre ellos
dependiendo del nuacutemero de ceacutelulas en el medio en mayores concentraciones el
tiempo de deteccioacuten fue menor
Hay que sentildealar que BrettanomycesDekkera debe alcanzar una concentracioacuten
miacutenima (denominada poblacioacuten criacutetica) de 103 UFCml para comenzar a liberar etil
fenoles Por debajo de esta concentracioacuten la levadura seriacutea metaboacutelicamente
activa pero no produciraacute compuestos alterantes a niveles detectables esto se ve
reflejado en los resultados en los que las concentraciones de ceacutelulas son muy
bajas
55
Estos resultados se comparan con los resultados dados en el medio solido Los
dos medios muestran altos grados de selectividad hacia la levadura
BrettanomycesDekkera y similar comportamiento para el crecimiento de dicha
levadura
En el medio liacutequido cuando hay altas concentraciones de BrettanomycesDekkera
el tiempo de deteccioacuten del microorganismo es menor que con el medio solido pues
en el liacutequido es aproximadamente 3 diacuteas y en el soacutelido son 5 diacuteas
83 RESULTADOS DE LA INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE
(SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO DE LA REGION DE
DALMACIA CROACIA
El vino fue analizado antes de la adicioacuten de los compuestos quiacutemicos a evaluar y
15 diacuteas despueacutes de adicioacuten para ver la reaccioacuten de este frente a SO2 y Antibrettreg
estas caracteriacutesticas se determinaron con el equipo de laboratorio Bacchus II
Microdom localizado en el laboratorio Vinolab doo Zagreb Croacia Los
resultados se muestran en la tabla
Tabla 6 Resultados de las muestras de vino inoculados con la levadura BrettanomycesDekkera
durante 15 diacuteas Comparativos con los diferentes compuestos
CFUml
Vino Day 1 Day 4 Day 10 Day 15
Control 130E+04 800E+03 700E+03 500E+03
Control 800E+03 640E+03 700E+03 280E+03
SO2 110E+04 400E+02 400E+02 67
SO2 900E+03 380E+03 270E+03 183
Antibrett 140E+05 920E+04 140E+04 400E+03
Antibrett 210E+05 181E+05 160E+04 900E+03
Antibrett 120E+05 990E+04 120E+04 100E+03
Antibrett 230E+05 204E+05 300E+03 200E+03
56
Tabla 7 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 antes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o
Antibrettreg Diacutea 0
Alcohol
()
Acidez Total
(gr Aci
Tartaacuterico L)
Acidez volaacutetil
(Aci
AceacuteticoL)
Densidad
(grml)
Azuacutecar residual
(grl)
Extracto
seco
(grl)
Acido
Laacutectico
(grl)
Glicerol
(grl)
Taninos
(grl)
Acetato
(grl)
1473
525
083
09928
473
332
164
799
305
117
1471
522
084
09927
479
329
162
786
299
116
Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
Tabla 8 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 despueacutes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o
Antibrettreg Diacutea 15
Alcohol
()
Acidez Total
(gr Aci
Tartaacuterico L)
Acidez volaacutetil
(Aci
AceacuteticoL)
Densidad
(grml)
Azuacutecar residual
(grl)
Extrac
to seco
(grl)
Acido
Laacutectico
(grl)
Glicerol
(grl)
Taninos
(grl)
Acetatos
(grl)
Control
1414
565
107
09935
436
364
177
827
259
136
Control
1415
556
108
09936
420
365
170
824
256
137
SO2
1456 543 108 09932 476 369 167 803 281 125
SO2
1457
542 108 09933 472 370 170 804 271 124
Antibrett 1454 533 106 09933 448 371 175 813 277 125
Antibrett 1455 534 105 09933 460 372 171 809 282 124
Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
57
Figura 4 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en el vino de control para
evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas
El comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en la prueba por
duplicado en el vino de control fue muy similar pues con el tiempo esta levadura
deja de reproducirse y va muriendo cuando las condiciones ya no son aptas para
su desarrollo debido a que la mayoriacutea de su fuente de carbono (Glucosa) esta
consumida sin embargo esta levadura no llega a su desaparicioacuten total lo que
representa uno de los mayores problemas en la elaboracioacuten del vino
Esta levadura tiene un metabolismo lento y el factor tiempo es un requisito
fundamental para su desarrollo este experimento se empezoacute con una alta
poblacioacuten de BrettanomycesDekkera (130 x 104 UFCml y 8 x 103 UFCml
respectivamente) y durante el transcurso del tiempo la poblacioacuten fue disminuyendo
debido a la perdida de las condiciones necesarias para la reproduccioacuten
58
Figura 5 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de SO2 en
concentracioacuten de 40 mgl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas
El SO2 tuvo un comportamiento efectivo y raacutepido contra las colonias de
BrettanomycesDekkera La poblacioacuten de esta levadura se redujo de forma
significativa entre el diacutea primero y el cuarto se encontroacute una diferencia porcentual
de 96 en la primera prueba y del 60 en la de duplicado al diacutea 15 ya la
poblacioacuten era casi nula pasando raacutepidamente de un numero por encima de la
poblacioacuten critica de la levadura BrettanomycesDekkera a un numero lt103 UFCml
siendo muy eficaz y raacutepido en el manejo de produccioacuten
Este compuesto ademaacutes de favorecer la extraccioacuten de los compuestos fenoacutelicos y
de su actividad antioxidante al inhibir la accioacuten de las polifenoloxidasas a dosis
adecuadas de un maacuteximo de 50gl inhibe la multiplicacioacuten bacteriana y de
levaduras
59
Figura 6 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de
Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo
de 15 diacuteas
Figura 7 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de
Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo
de 15 diacuteas
El compuesto Antibrettreg en la primera prueba tanto como en el duplicado tuvo su
mayor tiempo de reduccioacuten de UFCml entre los diacuteas 4-10 con una diferencia
porcentual de 91 en comparacioacuten con el diacutea cuarto al decimo a diferencia de
60
SO2 el cual presenta la gran disminucioacuten de colonias entre los primeros diacuteas de
agregarse el producto
El tiempo para que la poblacioacuten de la levadura llegara a la cantidad menor a la de
la poblacioacuten critica es mucho mayor que la del compuesto SO2 sabiendo que esta
poblacioacuten debe ser lt103 UFCml
El compuesto Antibrettreg puede tardarse 4-10 diacuteas en representar una reduccioacuten
de UFCml significativa en dicho tiempo puede representar grandes peacuterdidas
nutricionales y altos costos de produccioacuten para la fabricacioacuten
Figura 8 Comportamiento del contenido de alcohol en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin adicioacuten)
hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
BrettanomycesDekkera estaacute presente en vinos de alto contenido alcohoacutelico
aproximadamente entre 125 a 14 pues esta levadura toma a etanol como
fuente de carbono y este vino (Babic) procede de uvas muy maduras las cuales
presentan mayor cantidad de azuacutecares residuales (como glucosa y fructosa y
otras pentosas residuales)
138
14
142
144
146
148
Alcohol
Day 0 Day 15
61
Analizando el comportamiento del vino durante el experimento de 15 diacuteas sin
compuestos quiacutemicos y con SO2 y Antibrettreg a partir de las caracteriacutesticas
iniacuteciales que se determinaron seguacuten el equipo BACCHUS analizador infrarrojo se
presenta en general una reduccioacuten del contenido alcohoacutelico de este vino pero se
ve una mayor reduccioacuten en el vino de control el cual redujo en un 394 su
contenido alcohoacutelico desde el dia 0 hasta el diacutea 15 este vino no tiene ninguacuten
compuesto contra la levadura BrettanomycesDekkera y por su elevada presencia
en los 15 diacuteas de experimento consumioacute esta cantidad de etanol
Mientras en el vino que conteniacutea SO2 tras 15 diacuteas de tratamiento se vio una
reduccioacuten de alcohol de 1 ya que este compuesto redujo la cantidad de
BrettanomycesDekkera en los primeros diacuteas de tratamiento previniendo su
reproduccioacuten y protegiendo el contenido alcohoacutelico del vino Babic 2007
En los vinos de prueba con Antibrett reg la reduccioacuten alcohoacutelica se dio en un
porcentaje de 122 un poco maacutes alta que con SO2 y mucho maacutes baja en
comparacioacuten del vino de control este compuesto tambieacuten previno la gemacioacuten de
la levadura evitando la perdida de etanol en el vino sin embargo como este
compuesto duro mas en este proceso de eliminar BrettanomycesDekkera se
produjo una mayor peacuterdida alcohoacutelica
62
Figura 9 Comportamiento del contenido de acidez volatil en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin
adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
Debido a la presencia de oxigeno en los frascos la acidez volaacutetil aumento pero no
significativamente en las muestras No hubo grandes diferencias entre las
muestras con compuestos y las de control por lo que se deduce que estos
compuestos no ayudan a evitar esta acidez Esta acidez tan alta puede dantildear la
calidad del vino de forma casi irreparable Pero el factor oxigeno es de los maacutes
controlados en la produccioacuten de vinos
la alteracioacuten del aumento de la acidez volaacutetil no estaacute relacionada con la levadura
BrettanomycesDekkera sino a la presencia de oxigeno en el almacenamiento el
oxigeno fue usado en esta prueba para promover condiciones apropiadas para el
desarrollo de la levadura
002040608
112
Acidez Volatil
Day 0 Day 15
63
Figura 10 Comportamiento del contenido de Acido Acetico en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin
adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
Brettanomyces Dekkera son productores de aacutecido aceacutetico y elevan el contenido
de los vinos anormalmente en condiciones de anaerobiosis En condiciones de
aerobiosis producen concentraciones bajas o nulas de aacutecido aceacutetico
Este acido aceacutetico al igual que los fenoles afecta el sabor y el perfil olfativo del
vino tinto este efecto es tambieacuten producido por la levadura
BrettanomycesDekkera vemos en los resultados el gran crecimiento de este
compuesto en el vino control el cual no tenia compouestos en contra de
BrettanomycesDekkera lo que produjo este aumento significativo del acido aceacutetico
en comparacioacuten con estos que teniacutean SO2 y Antibrettreg entre ellos la diferencia en
este compuesto es muy reducida y no significativa pues estos compuestos no
permitieron la gemacioacuten de esta levadura y esta no produjo este acido en esa gran
cantidad
A este compuesto se le atribuye el olor y sabor a vinagre del vino tinto un defecto
muy comuacuten y poco agradable para el consumidor
105110115120125130135140
Acido Acetico
Day 0 Day 15
64
Figura 11 Comportamiento del contenido de Azucares reductores en vino Babic 2007
desde el diacutea 0 (sin adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en
comparacioacuten con el vino de control
BrettanomyesDekkera utiliza los azucares residuales como fuente de carbono
para su crecimiento en el vino este es el factor maacutes importante para su desarrollo
y este es el que determina en cierto caso la cantidad de levaduras de
BretanomycesDekkera presente en las graficas se determina claramente que en
el vino de control donde la cantidad de esta levadura es muy alta 15 diacuteas despueacutes
de empezar las pruebas la cantidad de azucares reductores es muy baja y ha
bajado en un porcentaje de 10 mientras que el vino que tiene SO2 bajo la
cantidad de azucares reductores en un 042 y el vino que tiene el compuesto
Antibrettreg redujo su nivel de azucares reductores en 462
38
4
42
44
46
48
5
Azucares Reductores
Day 0 Day 15
65
84 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE
CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON
EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID
PHASE
Tabla 10 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en
vino Babic 2007 con el meacutetodo propuesto
Compuesto Tiempos de
retencioacuten (min)
Acetaldehiacutedo 1437
Propanol 3759
Diacetil 4202
Etil-acetato 4523
i-butanol 6232
Acido Aceacutetico 7840
i-amil alcohol 11740
n-amil 13489
lactato de etiacutelico 15741
acetato amil metiacutelico 17796
1-hexanol 19101
etil-hexanol 24456
Linalol 30370
2-feniletanol 32768
p-cresol 33522
octanoato de etilo 34226
4-etilfenol 37100
2-feniletil acetato 32769
4-etilguayacol 39704
4 vinilfenol 40529
decanoato de etilo 42117
Refirieacutendose a estos resultados es necesaria la creacioacuten de soluciones estaacutendar
para determinar tiempos de retencioacuten con el meacutetodo y si es necesario ajustes a
este
66
Tabla 11 Soluciones estaacutendar para compuestos en vinos tintos Croatas
MODEL 0
(en volumen de 100 ml en 40 Etanol)
Compuesto Pureza Cantidad
(g)
Concentracioacuten (gl)
Acetaldehiacutedo 099 1623 160677
Propanol 0995 13849 137718
Diacetil 098 01071 104958
Etil-acetato 0995 30172 3002114
i-butanol 099 15016 1486584
Acido Acetico 0995 0 0
i-amil alcohol 099 20116 1991484
n-amil 098 15442 1513316
lactato de etilio 098 00507 049686
acetato amil metilico 098 01028 100744
1-hexanol 098 00367 035966
etil-hexanol 098 00308 029876
Linalol 097 00288 027936
Nerol 097 00311 030478
Citronelol 098 0031 03038
Geraniol 098 15803 1548694
2-feniletanol 098 00402 039396
4-etilfenol 098 00812 078764
octanoato de etilo 097 00597 059103
2-feniletil acetato 099 00315 031185
4-etilguayacol 098 00803 079674
Fuente Laboratorio de anaacutelisis e investigacioacuten de bebidas Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea
de Alimentos Universidad de Zagreb Zagreb Croacia 2009
Las soluciones estaacutendar se realizan teniendo como referencia las cantidades de
estos compuestos en los vinos tintos croatas datos suministrados por el Doctor
Leo Gracin en concentraciones de gl a partir de este dato y teniendo en cuenta
67
la pureza de los compuestos que se teniacutean en el laboratorio de anaacutelisis e
investigacioacuten de bebidas se crean las soluciones estaacutendar Ejemplo
Solucioacuten estaacutendar para 4 etil-fenol en un volumen de 100 ml
Con estas soluciones estaacutendar se realizo el tiempo de retencioacuten para corroborar el
meacutetodo Los resultados de esto fueron tiempos de retencioacuten diferentes a los del
meacutetodo primero con el que se realizaron los ensayos y a partir de esos resultados
se ajusto el meacutetodo con el que se trabajo
68
Tabla 12 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en
vino Babic 2007 con el meacutetodo modificado
Compuesto Tiempos de
retencioacuten (min)
Acetaldehiacutedo 1542
Propanol 4046
Diacetil 4733
Etil-acetato 4807
i-butanol 6659
Acido Acetico 8343
i-amil alcohol 12123
n-amil 13866
lactato de etilio 16072
acetato amil metilico 18336
1-hexanol 19447
etil-hexanol 24835
Linalol 31831
2-feniletanol 33305
p-cresol 33703
octanoato de etilo 34571
4-etilfenol 37724
Citronelol 38326
Nerol 38576
2-feniletil acetato 39012
Geraniol 39944
4-etilguayacol 40271
4 vilifenol 41168
decanoato de etilo 42657
69
DIA 0
Se coloca ISTD a todas las muestras respectivas para poder determinar
cantidades de los compuestos aromaacuteticos
Se realiza la cromatografiacutea de gas al vino Babic 2007 antes de ser inoculado con
BrettanomycesDekkera
Tabla 13 Resultados de la cromatografiacutea de gas del vino Babic 2007
Compuesto Tiempo de retencioacuten
min
Cantidad
mgl
Acetaldehiacutedo 1542 0
Propanol 4046 0
Diacetil 4733 37215204
Etil-acetato 4807 0
i-butanol 6659 0
Acido Aceacutetico 8343 2817465
i-amil alcohol 12123 16799019
n-amil 13866 26
lactato de etiacutelico 16072 10983961
acetato amil metiacutelico 18336 0185196
1-hexanol 19447 264655
etil-hexanol 24835 0158751
Linalol 31831 0
2-feniletanol 33305 4235560
p-cresol 33703 1
octanoato de etilo 34571 0152412
4-etilfenol 37724 00581345
Citronelol 38326 00439729
Nerol 38576 00344799
2-feniletil acetato 39012 00407983
Geraniol 39944 0
4-etilguayacol 40271 0
4 vilifenol 41168 0
Decanoato de etilo 42657 00190144
70
Basados en los compuestos aromaacuteticos que brinda el ldquoCaraacutecter Brettrdquo se van a
analizar detalladamente los siguientes aromas 4-Etilfenol 4-Etilguayacol 4-
Vinylfenol
Figura 12 Compuestos aromaticos en vino tinto Babic sin estar contaminado con la levadura
BrettanomycesDekkera
El vino a analizar esta por debajo de las concentraciones consideradas como
perjudiciales para el aroma del vino tinto (El umbral sensorial del 4-etilfenol es de
230 μgl y el del 4-etilguaiacol es de 47 μgl) pues posee una concentracion de
58microgL de 4etilfenol 0 microgL de 4 etilguayacol y 0 microgL de vinylfenol
841 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGUacuteN TEMPERATURAS
DE ALMACENAMIENTO
0
02
4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinylfenol
Vino 00581345 0 0
C (
mg
L)
Vino Babic 2007 Dia 0
71
Tabla 14 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el
ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 20C por 4 diacuteas Prueba por duplicado
MUESTRAS INCUBADA A 20C
Compuesto Day 1
Amount
(mgL)
Day 2
Amount
(mgL)
Day 3
Amount
(mgL)
Day 4
Amount
(mgL)
4-etilfenol 0260244 017294 0177547 020156
4-etilfenol 0260244 0245915 0204542 0262499
4-etilguayacol 0 0 0 0
4-etilguayacol 0 0 0 0
4 vinilifenol 1107096 781349 685317 460323
4 vinilifenol 1107096 1297465 621324 693225
72
Figura 13 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
BrettanomycesDekkera es la levadura responsable de la produccion de 4-etil-
fenol compuesto asociado con olores caracteristicos a ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 00581345 0260244 0172935 0177547 020156
C (
mg
L)
4 etilfenol
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 00581345 0260244 0245915 0204542 0262499
C (
mg
L)
4 etilfenol
73
caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo dantildeando la calidad sensorial del vino tinto Babic la
produccioacuten de este compuesto en esta muestra realizada por duplicado fue
ascendente y tuvo incremento muy grande en el primer dia de almacenamiento y
en el transcurso de los siguientes cuatro diacuteas se mantuvo relativamente estable lo
cual no concuerda con el comportamiento tiacutepico de esta levadura quien tiene un
crecimiento lento e incrementa la produccioacuten de fenoles con su gemacioacuten esto
genera muchas dudas sobre el buen funcionamiento del equipo GC o de la
estabilidad de las levaduras BrettanomycesDekkera en este almacenamiento
Figura 14 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar prueba por duplicado
002040608
1
Vino Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0 0 0
4 etilguayacol
002040608
1
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0 0 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
74
Presencia negativa de 4 etil guayacol durante todo el almacenamiento
probablemente las condiciones de almacenamiento y el medio no dieron lugar al
desarrollo de este compuesto el cual se considera menos conflictivo que el 4-etil-
fenol
Figura 15 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
Estos resultados tambieacuten dejan dudas del normal comportamiento de dicha
levadura pues indican que la levadura no convirtioacute este compuesto en etilfenol
0
2
4
6
8
10
12
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 110709781349685317460323
4 vinylfenol
0
2
4
6
8
10
12
14
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
Series1 0 11071 12974 62132 69322
C (
mg
l)
4 Vinylfenol
75
durante el almacenamiento caracteriacutestica que solo la levadura
BrettanomycesDekkera puede realizar se ve que las concentraciones de
vinylfenoles son mucho mas altas que las de fenoles lo que nos deja determinar
que la poblacioacuten de BrettanomycesDekkera es muy baja y existen otras levaduras
productoras de vinylfenoles en este tipo de vino en las condiciones de
almacenamiento dadas para estas pruebas
Tabla 16 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el
ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 28C por 4 diacuteas
MUESTRA 2 INCUBADA A 28C
Compuesto Day 1
Amount
(mgL)
Day 2
Amount
(mgL)
Day 3
Amount
(mgL)
Day 4
Amount
(mgL)
4-etilfenol 0260244 019612 0186614 019932
4-etilfenol 0260244 020576 0214917 0193554
4-etilguayacol 0 014304 0223836 0
4-etilguayacol 0 002287 00529832 0
4 vinilifenol 1107096 787068 665182 397847
4 vinilifenol 1107096 284389 00204392 0
76
Figura 16 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar
El desarrollo de este compuesto en el diacutea 1 fue significativo y luego relativamente
estable el comportamiento fue similar en las pruebas de diferentes temperaturas
de almacenamiento para este compuesto el cual es el maacutes problemaacutetico en la
industria viniacutecola
0
005
01
015
02
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 005813019932018661019611019932
4 etilfenol
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 005813 019355 021491 020576 026024
4 etilfenol
77
Figura 17 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar
Los resultados de la prueba son poco confiables y no entendibles por lo que
podemos verificar que el GC no estaacute trabajando de forma adecuada para la
deteccioacuten del compuesto
0001002003004005006
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 Etilguayacol 0 0 0022 0053 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
0005
01015
02025
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0223 0143 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
78
Figura 18 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
El comportamiento de este compuesto en la prueba es muy irregular y poco
confiable
0
2
4
6
8
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 397847665182787068397847
4 vinylfenol
0
2
4
6
8
10
12
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 11071 28438 00204 0
4 vinylfenol
79
Figura 19 Comportamiento del compuesto 4 etilfenol durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
La concentracioacuten de 4 etil fenol fue mayor al cuarto diacutea almacenado a
temperatura ambiente de 20C pero este compuesto no tuvo una actividad notoria
de ascenso durante su almacenamiento como se esperaba lo que deja muchas
dudas sobre los resultados de este ensayo
0
05
1
15
2
25
3
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etil fenol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 20C
80
Figura 20 Comportamiento del compuesto 4 etil guayacol durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
Comportamiento anormal del compuesto no se ve tendencias de aumento o
disminucioacuten de este en ninguna de las pruebas no tiene un comportamiento
regular pues se esperaba que la levadura BrettanomycesDekkera
descarboxinizara el compuesto 4-vinilguaiacol y aumentar las concentraciones de
4-etilguaiacol esta reaccioacuten no se hizo notoria en los compuestos aromaacuteticos
seguacuten lo determino el Cromatografo de Gas (GC)
0
005
01
015
02
025
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3
C (
mg
L)
4 etil guayacol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 20C
81
Figura 21 Comportamiento del compuesto 4 Vinyl fenoll durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
La no presencia de este compuesto en el vino original demuestra las baja o casi
nula presencia de la levadura BrettanomycesDekkera al diacutea primero este
compuesto incrementa de forma notoria en las muestras debido a la presencia de
acido cumaacuterico en el medio ya que sufre su carboxilacion convirtieacutendose en 4 vinyl
fenol sin embargo su comportamiento no fue regular y presento problemas de
lecturas
0
2
4
6
8
10
12
14
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
C (
mg
L)4 Vinyl fenol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 28C
82
9 CONCLUSIONES Y
RECOMENDACIONES
91 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO
Se desarrolloacute un medio selectivo soacutelido para BrettanomycesDekkera
accesible y faacutecil de elaborar
Se detectan colonias de la levadura BrettanomycesDekera en el agar
selectivo con glucosa como fuente de carbono en un lapso de 5 diacuteas en
incubacioacuten a 28C
El medio selectivo soacutelido con Glucosa como fuente de carbono fue maacutes
raacutepido y efectivo ya que toma 5 diacuteas para dar resultados positivos frente al
de Etanol como fuente de carbono el cual toma 10 diacuteas para mostrar
resultados positivos aunque ambos dieron resultados satisfactorios en la
selectividad de la levadura BrettanomycesDekkera
La levadura se adapto de forma satisfactoria a estos medios en
condiciones de almacenamiento propias para su desarrollo (28C)
Las colonias de la levadura BrettanomycesDekkera tiene un crecimiento
en estos medios soacutelidos de forma circular con topografiacutea convexa y borde
entero dimensiones 5-6 mm color Amarillo opacicidad oscuro
83
superficie lisa y suave siendo faacutecil de identificar y realizar los conteos
necesarios
El medio solido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten
de la levadura BrettanomycesDekkera en vino tinto es raacutepido econoacutemico
y uacutetil
El uso de azucares para fermentacioacuten de la levadura
BrettanomycesDekkera que Saccharomyces no puede fermentar para
mayor selectividad
Realizacioacuten de pruebas Bioquiacutemicas como meacutetodo raacutepido de selectividad
92 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DESARROLLO DEL MEDIO LIacuteQUIDO
Se desarrollo un medio selectivo liquido para BrettanomycesDekkera
accesible y faacutecil de elaborar
Este medio mostroacute resultados positivos de la presencia de
BrettanomycesDekkera en un lapso de tiempo menor (3 diacuteas) que con el
medio solido (5 diacuteas) en caso de que el nuacutemero de ceacutelulas de la levadura
BrettanomycesDekkera sea mayor a la poblacioacuten critica (103)
Cuando la poblacioacuten de ceacutelulas de la levadura BrettanomycesDekkera es
menor a la poblacioacuten critica el tiempo de identificacioacuten de esta levadura por
medio liquido es muy prolongado puede tomar maacutes de 10 diacuteas o incluso no
detectarlo
84
Los compuestos quiacutemicos usados para el desarrollo del medio liacutequido no
son los adecuados para este tipo de medios donde los resultados positivos
son olfativos pues estos compuestos emiten fuertes olores que confunden
los olores caracteriacutesticos del caraacutecter Brett
El medio liquido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten
de altas concentraciones de la levadura BrettanomycesDekkera en vino
tinto es raacutepido econoacutemico y uacutetil
93 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg
EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE DALMACIA
CROACIA
Este trabajo mostroacute que el dioacutexido de azufre (SO2) tiene buenos resultados
en contra de la levadura BrettanomycesDekkera en concentraciones
normales de 40mgl concentracioacuten en la que se trabaja este compuesto en
los vinos tintos
En Europa el dioacutexido de azufre es usado de forma tradicional en gran
nuacutemero de alimentos y especialmente en vinos sin embargo y a pesar de
su uso regulado se busca la sustitucioacuten de este o su maacutexima reduccioacuten
para hacer de este producto maacutes sano para las personas no tolerantes a
este tipo de compuestos sin embargo seguacuten el trabajo realizado en
comparacioacuten con el producto Antibrettreg el SO2 es maacutes eficaz en el control
85
de la levadura ayudando a evitarla y eliminarla de la cadena productiva del
vino tinto
Gracias a sus caracteriacutesticas el vino tinto Babic es muy vulnerable a la
levadura BrettanomycesDekkera pero a su vez se puede tratar faacutecilmente
con productos como SO2 y Antibrettreg aunque es maacutes efectivo contra
BrettanomycesDekkera el dioacutexido de azufre (SO2)
Antibrettreg es una buena opcioacuten para el control de BrettanomycesDekkera
para evitar el uso de productos alergenicos como SO2
94 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN
EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO
MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE
Al terminar la primera prueba con anaacutelisis en cromatografiacutea a gas y el SPME
queda como resultados
Es necesario repetir la prueba
No se determina el efecto de los estaacutendares internos sometidos a tiempos
de almacenamiento en temperaturas de 20C y 28C lo que puede dar falsos
resultados de cantidades de compuestos
86
Se debe crear un medio maacutes apto para el desarrollo de la levadura y un
control diario de crecimiento ( agregar maacutes Glucosa en caso de que se
haya consumido toda controlar presencia de Bacterias y otros
microorganismos que no se deseen en el medio)
Es necesario control de aromas con panel sensorial para determinar el
umbral de deteccioacuten en este vino
Control de crecimiento por medio solido Selectivo para
BrettanomycesDekekra conteo de colonias presentes en el vino inoculado
y su desarrollo durante almacenamiento a diferentes temperaturas
La segunda prueba no fue posible realizarla por dantildeos en el equipo de
cromatografiacutea de gas (GC)
87
ANEXOS
11
89
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientiacuteficas 99 Grupos de
Investigacioacuten Enoloacutegica Zaragoza Espantildea
93
11
GRACIAS es una palabra corta para todo lo que quiero expresar a todos aquellos que
hicieron parte de este suentildeo hecho realidadhellip
A Dios y a la virgen Auxiliadora por llevarme de su mano cada diacutea de mi carrera en cada
momento alegre y en cada momento difiacutecil fueron mi fortaleza
A mis papitos por hacer de mi estudio una realidad por su sacrificio y apoyo desinteresado y
sincero
A mi Hermanito por ser mi fortaleza mi ejemplo y mi amigo incondicional
A mi familia Blanco y Urrea por su compantildeiacutea durante esta etapa
A mi facultad (Decano Dr Camilo Rozo Dra Patricia Jimeacutenez y mis profesores) por
ensenarme mi profesioacuten y aportar lo mejor de ustedes para mi formacioacuten personal
A mis asesores de Tesis (Ing Patricia Chaparro y Dr Sc Leo Gracin) por su guiacutea y
colaboracioacuten oportuna
A mis queridos amigos quienes siempre han estado a mi lado en las dificultades y en las
alegriacuteas (Ingrid Mafe Cami G Cami R Harold Pipe Karla Andreacutes T Diego G)
A IAESTE en alianza con el ORI por hacer posible mi intercambio y poder hacer mi tesis en el
maravilloso paiacutes de Croacia
A Croacia por ser mi segundo hogar por abrirme sus puertas y su corazoacuten por brindarme
tan maravillosas personas en mi camino
Croatia Thank you for being my second home for opening your doors and your heart to me
and give me the opportunity to meet so many wonderful people
To my boss my teacher my mentor and specially my friend Leo
To the faculty of food technology and Biotechnology and the department of technology
and analysis of beverages for give me the opportunity to give all my knowledge to the
project and learn a lot more
To all the amazing people I met during this experience (Igor Karin Natka Josip Ana Matija
Daniel Pz Szilvia Dini Daniela Lidija Sanja and everybody else who I had the pleasure to
meet in this great trip) for give me the best of your hearts
I only have one thing to say hellipTHANK YOU
Solo me queda una palabra por decirhellipGRACIAS
14
la vinera Algunos enoacutelogos han discutido contra el uso de estos teacuterminos porque
esta implicancia no sucede en todas las levaduras ya que estas son de alguna
forma ldquono-nativasrdquo o ldquono naturalesrdquo (Ej Saccharomyces o Brettanomyces) El
teacutermino ldquono Saccharomycesrdquo es maacutes comuacuten para nombrar aquellas levaduras
presentes en el mosto de la uva que no son del genero Saccharomyces15
Las levaduras encontradas despueacutes de la fermentacioacuten alcohoacutelica tambieacuten son
asignadas a un grupo informal Algunas veces las levaduras que conducen la
principal fermentacioacuten (Saccharomyces) son muchas veces llamadas ldquolevaduras
fermentativasrdquo basados en su metabolismo Durante su antildeejamiento algunas
levaduras (Candida Hansenula y Pichia) pueden crecer en la superficie en
presencia de oxigeno Esta peliacutecula superficial es comuacutenmente asociada a
deterioro del vino esta levadura se le conoce como ldquolevadura formadora de
peliacuteculardquo16
121 DekkeraBrettanomyces
La taxonomiacutea cientiacutefica sobre BrettanomycesDekkera ha cambiado en los uacuteltimos
antildeos Brettanomyces estaacute clasificado dentro de la misma familia que
Saccharomyces (familia Saccharomycetaceae) Actualmente dentro del geacutenero
Brettanomyces se aceptan cinco especies diferentes (B bruxellensis B
anomalus B custersianus B nanas y B naardenensis)17
Las teacutecnicas de biologiacutea molecular han demostrado que B intermedious B
lambicus B custerseii o D intermedia son sinoacutenimos de B bruxellensis por lo
que estas denominaciones han quedado en desuso Los microorganismos de este
geacutenero presentan dos formas una capaz de reproducirse sexualmente (Dekkera)
15
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
16 Kurtzman CP 1998 The industrial and agricultural significance of yeasts 4
th Edition Amsterdam
Holanda
17 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
15
y otra que lo hace asexualmente (Brettanomyces) Tambieacuten se llaman
respectivamente forma perfecta y forma imperfecta En algunos casos la forma
perfecta y la imperfecta reciben nombres diferentes como ocurre con B anomalus
y D anomala En otros casos el nombre es similar como las pertenecientes a la
especie bruxellensis que pueden parecer como D bruxellensis como B
bruxellensis o como BrettanomycesDekkera A efectos praacutecticos en la bodega
estos dos estados son similares Cuando vemos referencias a Brettanomyces
como contaminante en la mayor parte de los casos se refieren a
DekkeraBrettanomyces ya que este es el responsable de las alteraciones en el
vino18 y 19
La morfologiacutea celular de BrettanomycesDekkera es ojival o ciliacutendrica con
gemacioacuten multipolar en reproduccioacuten vegetativa Una de las caracteriacutesticas de
este geacutenero es su tamantildeo celular variable y la formacioacuten de filamentos19
18 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 23
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
19
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
16
Figura 1 Microfotografiacutea de cultivo de BrettanomycesDekkera a) Variabilidad morfoloacutegica y de
tamantildeo celular b) forma filamentosa
Fuente Lopez-Cordon Eva BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia wwwacenologiacom
Los defectos sensoriales asociados directamente a Brett aparecen
mayoritariamente en vinos tintos de calidad y las causas radican en la propia
fisiologiacutea del microorganismo Ademaacutes al ser una levadura de crecimiento muy
lento la alteracioacuten se presenta principalmente durante el almacenamiento y sobre
todo la crianza del vino habitual en los vinos tintos de gama alta En las barricas
de madera el microorganismo tiene a su disposicioacuten todo el sustrato y tiempo
suficiente para realizar su actividad La naturaleza porosa de la madera y su difiacutecil
limpieza contribuye a que las poblaciones existentes se mantengan incluso
despueacutes del lavado de la barrica Ademaacutes BrettanomycesDekkera tiene la
capacidad de degradar uno de sus componentes la celobiosa 20
13 CARACTERISTICAS FISIOLOGICAS
S cerevisiae y BrettanomycesDekkera tienen metabolismos similares muy
adaptados a las condiciones de vinificacioacuten Tras la fermentacioacuten alcohoacutelica S
cerevisiae es la levadura mayoritaria debido a que las condiciones nutricionales
20
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
17
del vino son muy estrictas (altas concentraciones de etanol y bajas
concentraciones de nutrientes) En este momento BrettanomycesDekkera
continuacutea creciendo gracias a que utiliza nutrientes que S cerevisiae no ha podido
consumir sobre todo algunos azuacutecares y fuentes de nitroacutegeno21
Una de las caracteriacutesticas que diferencia a BrettanomycesDekkera es la gran
diversidad de azuacutecares que puede fermentar (ver tabla de Relacioacuten de los
principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) La mayoriacutea de
las cepas pueden crecer utilizando trealosa y celobiosa azucares presentes en el
vino y no consumibles por S cerevisiae Otra de las ventajas que presenta frente
a S cerevisiae (y frente a la mayoriacutea de las levaduras) es que puede utilizar los
nitratos como fuente de nitroacutegeno Debido a que S cerevisiae soacutelo utiliza el
nitroacutegeno amoniacal y los aminoaacutecidos libres estos se consumen con relativa
rapidez Al final de la fermentacioacuten el nitroacutegeno moniacal es escaso y se favorece
el crecimiento de las levaduras que pueden utilizar otras fuentes de nitroacutegeno
Ademaacutes Brettanomyces puede crecer con concentraciones de fosfato diamoacutenico
tan bajas como 05gl o a partir de diversos aminoaacutecidos En resumen
BrettanomycesDekkera crece maacutes despacio que S cerevisiae es resistente a
concentraciones altas de alcohol puede utilizar otros azucares como fuentes de
energiacutea y nitrato como fuente de nitroacutegeno Esto explica que pueda reproducirse
cuando la fermentacioacuten alcohoacutelica ha terminado a partir de nutrientes no
consumibles por S cerevisiae y cuando no tiene competidores22
21
Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
22 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
18
Tabla 1 Relacioacuten de los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto
Fuente Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista
VINOTEQ N 38 pag 21 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
131 BrettanomycesDekkera y siacutentesis de fenoles volaacutetiles
El origen de los fenoles volaacutetiles estaacute relacionado con la actividad secuencial de
dos enzimas que descarboxilan los aacutecidos en hidroxiestirenos (vinilfenoles) que
19
son posteriormente reducidos a etilderivados (etilfenoles)23 como puede
observarse en la figura 2
Figura 2 Siacutentesis de etilfenoles de BrettanomycesDekkera
Fuente ACE revista de Enologia wwwacenologiacom
El primer paso de descaboxilacion de los aacutecidos hidroxicinamicos es comuacuten
tambieacuten en otros microorganismos como bacterias hongos y otras levaduras Sin
embargo el segundo paso reduccioacuten de vinilfenoles es caracteriacutestico de algunos
tipos de levaduras como Dekkera bruxelliensis D anomala Pichia guillermondi
Candida versarilis C halophila y C mannitofaciens24
Los fenoles volaacutetiles que se asocian al problema Brett en vinos son el 4-etilfenol y
el 4- etilguaiacol asiacute como sus precursores intermedios 4-vinilfenol y 4-
vinilguaiacol aunque estos uacuteltimos son menos importantes por ser muy reactivos y
raacutepidamente convertidos en etilfenoles por BrettanomycesDekkera o en su caso
23
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
24 Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
20
condensan con otras moleacuteculas como antocianos25 Los etilfenoles y
especialmente elevadas concentraciones de 4-vinilfenol en vinos se asocian con
aromas desagradables asociados a descriptores como ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de
caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo26
El umbral sensorial del 4-etilfenol es de 230 μg l-1 y el del 4-etilguaiacol es de 47
μgl Pese a su menor umbral sensorial el 4-etilguaiacol responde a descriptores
como ldquobaconrdquo o ldquoahumadordquo que a bajas concentraciones aportan complejidad por
lo que se puede considerar sensorialmente menos conflitivo que el 4-etilfenol 27
Figura 3 Defectos sensoriales producidos en el vino por BrettanomycesDekkera
Fuente Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
25 Morata A Goacutemez-Cordoveacutes M Calderoacuten F Suaacuterez J 2006 Effects of pH temperature and SO2 on the
formation of pyranoanthocyanins during red wine fermentation with two species of Saccharomyces Journal Food Microbiology No106 pag 4 Madrid Espana
26 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea 27 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
21
132 Identificacioacuten de BrettanomycesDekkera
Los Bioacutelogos usan sistemas de identificacioacuten basados en similitudes taxonoacutemicas
entre organismos dichas similitudes pueden ser morfoloacutegicas tipos capacidad de
produccioacuten de sustratos como azuacutecar yo nitratos caracteriacutesticas fisioloacutegicas y
bioquiacutemicas secuencia del material geneacutetico y respuestas inmunoloacutegicas28
En la industria viniacutecola es importante recurrir a diferentes tipos de pruebas para la
identificacioacuten de microorganismos una de estas y la maacutes realizada es la revisioacuten
del microorganismo bajo el microscopio Esta prueba brinda informacioacuten sobre la
morfologiacutea del microorganismo (cocos bacilos formas puntudas ojival entre
otros) tamantildeo (dimensiones) agrupaciones celulares (solas parejas triacuteos
grupos o cadenas) Sin embargo el uso del microscopio es una prueba raacutepida
para examinar mostos o vino pero no determina cantidades que muchas veces es
requerido para tratamientos de accioacuten otro de los inconvenientes es que los
microorganismos pueden variar su morfologiacutea en forma o tamantildeo dependiendo de
la edad y las condiciones de crecimiento por lo que puede no ser clara la
identificacioacuten de este29
14 Medios soacutelidos selectivos
Si se requiere de la confirmacioacuten del microorganismo este debe ser aislado del
vino para una caracterizacioacuten para esto se requiere de medios soacutelidos Cuando se
examina un microorganismo en un medio solido es importante revisar las
caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias (ver figura 4 Morfologiacuteas de colonias
en medios soacutelidos) Entre estas caracteriacutesticas estaacuten forma (circular irregular o
2829 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
22
rizada) tamantildeo (dimensiones estas normalmente se expresan en miliacutemetros)
topografiacutea (plano elevado convexo coacutencavo o embonado) presencia de
pigmentos opacidad (transparente traslucido u opaco) superficie (suave rugosa
lisa o aacutespero) bordes (entero ondulado crespo dentado rizado) o cualquier
cambio en el agar (color opacidad cambios en los indicadores de pH o CaCO3
respectivamente)30
Figura 4 Varias morfologiacuteas de crecimiento de colonias en medio solido
Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007
Gran nuacutemero de medios selectivos se han creado para la aislacioacuten deteccioacuten yo
conteo de levaduras provenientes de jugos de uva mostos o vinos El medio maacutes
utilizado en estos fines es YPD (Yeast Peptone Dextrose) pero dicho medio no
es selectivo entre levaduras y se usa comuacutenmente para el conteo de
Saccharomyces31 Las colonias empiezan a parecer con un periodo de incubacioacuten
30
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
31 Essia Ngang J Wolniewicz E Villa P2005 Stimulation of lactobacilli during alcoholic fermentation action
of sucrose hydrolysis by yeast Biotechnology letters No 8 pag 743 Amiens France
23
de 2 a 4 diacuteas a 22C a 25C Igualmente el agar de jugo de uva es no selectivo y
presenta faacutecil crecimiento de levaduras bacterias y mohos
Para la levadura Brettanomyces Dekkera se han elaborado diferentes medios
selectivos entre ellos el maacutes conocido es WL por sus siglas en ingles del
laboratorio que lo creo ldquoWallerstein Laboratoriesrdquo este medio contiene
cicloheximida compuesto selectivo para Brettanomyces e inhibe Saccharomyces
El punto criacutetico es encontrar la cantidad exacta de este compuesto para la
inhibicioacuten de las levaduras sin que afecte a BrettanomycesDekkera32
Ademaacutes del medio WL BrettanomycesDekkera puede ser cultivado en otros
medios selectivos como Brettanomyces medio A creado por Vilas en 1993
Brettanomyces medio B el cual contiene cicloeximida como agente selectivo
mientras que Brettanomyces medio C tiene cicloheximida y ampicilina este medio
fue creado por B Watson en 1998 Brettanomyces medio D fue creado
recientemente por Rodrigues en 2001 este medio es conocido como DBDM
(DekkeraBrettanomyces differential medium ) es un medio selectivo para
Brettanomyces en contra de Saccharomyces y otras levaduras este medio es el
maacutes utilizado en la vineras para caracterizacioacuten de BrettanomycesDekkera
actualmente33
15 Dioacutexido de azufre (SO2) en vinos
32
33
Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers
GmbH United States of America and Canada
24
El dioacutexido de azufre tambieacuten llamado oxido de azufre es un eficaz agente
conservante antioxidante y antimicrobiano en la industria viniacutecola34
Durante la vinificacioacuten SO2 ha representado histoacutericamente una herramienta muy
importante usada por los vinicultores para el control de crecimiento microbioloacutegico
Debido a preocupaciones por la salud del consumidor el uso de este producto ha
disminuido dramaacuteticamente con el posible riesgo de aumentar el riesgo
microbioloacutegico35
El actual liacutemite legal de SO2 en vinos en los Estados Unidos es de 350mgL una
concentracioacuten mucho mayor a la usada en la industria viniacutecola No obstante vinos
que contienen maacutes de 10mgL deben declarar este compuesto en la etiqueta
porque SO2 es un metabolito que las levaduras usan durante la fermentacioacuten Los
vinos siempre contienen algo de sulfitos aunque la adicioacuten no se realice durante el
proceso36
151 Formas del Dioacutexido de Azufre (SO2)
Una vez disuelto en agua el dioacutexido de azufre existe en equilibrio entre SO2
molecular (SO2H2O) bisulfito (HSO3) y sulfito (SO32-) Este equilibrio depende del
pH Ademaacutes de estar en equilibrio con el molecular y especies sulfito el bisulfito
tambieacuten existe en forma ldquolibrerdquo y en forma ldquoatadardquo Aquiacute la moleacutecula reaccionara
34
Orwine Eureka 2008Investigadores europeos buscan alternativas al dioxido de azufre en vinos
httpawprowordpresscom20081107investigadores-europeos-buscan-alternativas-al-dioxido-de-
azufre-en-el-vino
3536 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
25
con compuestos carbonilos (ej Acetaldehiacutedo) formando productos adicionales
como Acido Hydroxysulfonico 37
Ademaacutes de Acetaldehiacutedo algunas moleacuteculas presentes en el jugo de uva que
reaccionan con bisulfito son acido piruvico α-keto-glutaric dihidroxyacetona
diacetyl Pigmentos de antocianinas entre otros38
152 Inhibidor Microbiano
El sulfuro molecular es la forma antimicrobiana del dioacutexido de azufre La cantidad
de SO2 molecular presente en cualquier vino no se mide directamente La
concentracioacuten es calculada conociendo la concentracioacuten de SO2 libre y el pH del
vino basaacutendose en la siguiente foacutermula
Alternativamente la figura 5 Se puede utilizar como guiacutea para aproximar la
cantidad de SO2 libre necesitada a determinado valor de pH de valores entre 05 o
08 mgl de SO2 molecular 39
El SO2 inhibe microorganismos de varias formas incluyendo rupturas de puentes
bisulfitos en proteiacutenas y reaccionando con coofactores como NAD+ y FAD tambieacuten
reacciona con ATP
3739
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
38 Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi
Springer New York United States
26
Figura 5 Cantidades de SO2 libre a un pH determinado para obtener 05 o 08 mgl de SO2
molecular
Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007
La concentracioacuten de SO2 molecular necesario para prevenir el crecimiento de
microorganismos variacutea seguacuten vinojugo pH temperatura poblacioacuten densidad y
diversidad estado de crecimiento grado de alcohol entre otros factores Beech
1979 sugirioacute una adicioacuten de 08 mgl de SO2 molecular como la cantidad
necesaria del compuesto en vinos blancos de mesa para dar una reduccioacuten de
cerca de 104 UFCml de la poblacioacuten de diferente tipo de microorganismos en 24
horas Las diferencias que existen entre las levaduras y bacterias en base a la
27
sensibilidad a este compuesto son dadas a conocer por diferentes autores (Warth
1977 1985 Du Toit 2005 Davis 1988 Hood 1983)40
16 Antibrettreg como alternativa de prevencioacuten y eliminacioacuten de
BrettanomycesDekkera
Antibrettreg es un producto nuevo creado por Spindal SARL-Gretz - Armainvilliers
Francia Es una preparacioacuten enzimaacutetica para inactivar Brettanomyces y para
reducir olores producidos por fenoles volaacutetiles41
Antibrettreg es preparado a base de paredes celulares de levadura activados
enzimaacuteticamente que presentan elevadas propiedades adsorbentes frente al 4-
etilfeno y 4- etilguayacol compuestos asociados con olores desagradables en el
vino tales como sudor de caballo farmacia o barniz42
Antibrettreg inhibe la produccioacuten de la vinilreductasa que participa en la
transformacioacuten de los aacutecidos cinaacutemicos naturalmente presentes en los vinos en
los correspondientes derivados etilados responsables de los olores atribuidos a
BrettanomycesDekkera 43
40
Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi
Springer New York United States
41 Manual de instrucciones de producto Antibrett reg producido por Spindal SARL-Gretz -
Armainvilliers France
424344 AEB Group 2008 ANTIBRETT Preparado a base de paredes celulares de levadura para la inactivacioacuten
de Brettanomyces y la eliminacioacuten de los olores de estos productos httpwwwaeb-
groupcomimgsSPAGNOLODepliantANTIBRETT-lett-ESPpdf
28
El uso de Antibrettreg es efectivo incluso contra otros olores anoacutemalos como los
que se generan en las barricas sucias principalmente huacutemedas dantildeando la
calidad olfativa del vino44
29
2 PROBLEMA
La levadura BrettanomycesDekkera es una levadura de contaminacioacuten presente
en la mayoriacutea de industrias viniacutecolas en el mundo Afecta directamente la
produccioacuten y calidad sensorial de los vinos con el desarrollo de los compuestos 4
etilfenol y 4 etilguayacol los cuales dantildean el perfil olfativo del vino dando aromas
caracteriacutesticas a ldquoestablordquo ldquocuerordquo ldquosudor de caballordquo o ldquobarnizrdquo conocido como
ldquocaraacutecter Brettrdquo
Esta contaminacioacuten se da especialmente en los vinos tintos debido a sus
caracteriacutesticas de produccioacuten (fermentacioacuten crianza antildeejamiento) y sus
propiedades fisicoquiacutemicas (Grado alcohoacutelico pH Acidez total Acidez volaacutetil
entre otros)
En Croacia existe una gran produccioacuten de vinos tintos entre los cuales se
encuentra el vino tinto Babic proveniente de la isla de Hvar el cual es famoso por
ser un vino duro carnoso estructurado y casi sobre-maduro con un grado
alcohoacutelico que ronda los 15 vv siendo la primera denominacioacuten de origen que
se aproboacute en Croacia en el antildeo 1961 este vino es de gran importancia en la
regioacuten la mayoriacutea de sitios de elaboracioacuten son pequentildeas industrias que han sido
afectadas por el bdquocaraacutecter Brett‟ Muchas investigaciones se han realizado al
respecto de la levadura BrettanomycesDekkera pero se conoce muy poco sobre
sus efectos en el vino Babic debido a sus caracteriacutesticas particulares (alcohol
30
15 pH 35 Acidez total 520 gr Acido TartaricoL Acidez volaacutetil 08 gr Acido
AceticoL Azucar residual 47 grLt)45
La dificultad de la pequentildea industria para acceder a productos que lleven a la
identificacioacuten de la levadura mencionada y de esta manera conllevar a planes de
accioacuten contra el ldquocaraacutecter Brettrdquo es una de las grandes dificultades de la industria
vinera en este paiacutes en donde los productos para la industria enoacuteloga son
complicados y de alto precio para acceder a ellos y en consecuencia no se
realizan muchas de estas pruebas de deteccioacuten de BrettanomycesDekkera
llevando al mercado productos contaminados de baja calidad que inicialmente
podriacutea haber sido un vino de alta calidad debido a sus caracteriacutesticas uacutenicas y de
gran popularidad
45
Datos obtenidos en el laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
31
3 JUSTIFICACION
Actualmente Croacia cuenta con maacutes de 300 zonas vineras en las que se producen 67
de vino blanco 32 vino tinto y el restante 1 vino rosado De acuerdo a recientes datos
estadiacutesticos hay 650 km2 de vintildeedos en Croacia de los cuales 375 km2 son uvas con
indicacioacuten geograacutefica de origen que producen maacutes de 300 vinos y maacutes de la mitad de este
nuacutemero son vinos elaborados en microempresas con un total de 50000000 de botellas
de vino el 8 es vino superior 70 de calidad y el 22 es vino de mesa de produccioacuten
nacional46
Croacia es un fuerte productor de vino a nivel regional con sus diferentes variedades
propias (Merlot Plavac Dingač Postup Malvazija Pošip Kujundžuša Babic) pero dicha
produccioacuten ha sido fuertemente afectada por la presencia de la levadura
BrettanomycesDekkera trayendo consecuencias como perdidas de produccioacuten peacuterdida
de calidad sensorial del vino grandes peacuterdidas econoacutemicas y desprestigio a sus vinos de
denominacioacuten de origen
Es por esto que en este proyecto de investigacioacuten se busca una faacutecil y raacutepida
identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera causante del ldquocaraacutecter Brettrdquo con el
desarrollo de medios selectivos liquido y solido ademaacutes de opciones para el tratamiento
yo prevencioacuten de esta levadura en la cadena productiva comparativamente entre dioacutexido
de azufre (SO2 ) y Antibrettreg y la identificacioacuten de los aromas caracteriacutesticos del ldquocaraacutecter
Brettrdquo en el vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia
46
Hrvatski zavod za vinogradarstvo i vinasrtvo 2003 Pravilnik o vinu httpwwwhrzvvhrpropisihtm
32
4 OBJETIVOS
41 General
Caracterizar y evaluar el comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera
en teacuterminos de crecimiento y produccioacuten de aromas no deseados en vino tinto
Babic
42 Especiacuteficos
Desarrollar el medio solido y medio liacutequido selectivo para
BrettanomycesDekkera
Evaluar el comportamiento de la levadura en estos medios selectivos
Determinar la influencia del Dioacutexido de azufre (SO2) y el compuesto
Antibrettreg en la levadura BrettanomycesDekkera presente en vino tinto
Babic 2007
Identificar los compuestos aromaacuteticos producidos por Brettanomyces
bruxellensis en vino tinto Babic usando el meacutetodo ldquomultiple headspace
solid-phase microextraction (SPME)rdquo
33
5 ALCANCES
En este proyecto se pretende desarrollar un medio selectivo faacutecil de producir en
donde sea raacutepida la identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera en la
produccioacuten de vinos tintos se realizaran pruebas para corroborar el crecimiento de
esta levadura en el medio determinando el tiempo que esta levadura toma en
adaptarse en el medio y su comportamiento en este una vez comprobada su
adaptacioacuten al medio liquido se trabajara con el meacutetodo de cromatografiacutea de gas
(GC) y el uso de micro extraccioacuten en fase solida (SPME) para el anaacutelisis
cuantitativo de los compuestos volaacutetiles (4-etil-fenol 4-etil-guayacol4-vinilfenol y
4-vinil-guayacol) y posteriormente con el vino tinto Babic Ademaacutes se desea
comprobar la efectividad de los productos con que las vineras de Croacia inhiben
o eliminan la presencia de la levadura en los vinos tintos como lo son el producto
AntiBrettreg y el Dioacutexido de azufre (SO2)
34
6 ESTADO DEL ARTE
Sobre el campo problemico causado por la levadura BrettanomycesDekkera en la
industria viniacutecola se han realizado bastante investigaciones a nivel de
caracterizacioacuten de la levadura los factores fisicoquiacutemicos que favorecen el
crecimiento de la levadura meacutetodos de prevencioacuten y control evaluacioacuten de
dantildeos sensoriales en diferentes tipos de vinos formacioacuten de compuestos fenoacutelicos
en los diferentes tipos de vino otros compuestos no fenoacutelicos asociados al
ldquocaraacutecter Brettrdquo teacutecnicas de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera
evaluacioacuten de la teacutecnicas de control e inhibicioacuten de dicha levadura desarrollo de
nuevos medios de deteccioacuten y aislamiento de la levadura relacioacuten entre la
levadura BrettanomycesDekkera con las otras levaduras presentes en el vino
entre otros
Seguacuten estas investigaciones se analizan aquellas que pueden aportar datos
importantes para el desarrollo del trabajo que se quiere realizar y se tiene en
cuenta sus metodologiacuteas conclusiones recomendaciones y comentarios
Entre las importantes para el planteamiento de este trabajo se menciona el trabajo
realizado por la Universidad Politeacutecnica de Madrid Espantildea el cual analiza
algunas de las caracteriacutesticas maacutes relevantes de este geacutenero de levaduras su
crecimiento en bodega factores fisicoquiacutemicos que favorecen su crecimiento y
desarrollo en el vino los defectos sensoriales que presenta en los vinos y estudia
algunas de los meacutetodos fiacutesicos para el control de BrettanomycesDekkera en vino
35
(clarificacioacuten filtracioacuten amicrobica proteiacutenas clarificantes anhiacutedrido sulfuros
dimetil dicarbonato Aditivos)47
Para conocer maacutes sobre la levadura en condiciones de barrica y almacenamiento
se revisa el articulo elaborado en el Departamento Teacutecnico Guserbiot La rioja
Espantildea en este artiacuteculo se describe brevemente su metabolismo y su ecologiacutea en
las bodegas Igualmente se comparan las teacutecnicas utilizadas en los laboratorios
para su deteccioacuten y cuaacuteles son las limitaciones de los diferentes meacutetodos
Finalmente se analizan las estrategias desarrolladas para su eliminacioacuten de las
bodegas y se dan una serie de recomendaciones para su control48
El instituto de fermentaciones Industriales Consejo superior de investigaciones
cientiacuteficas Juan de Cierva Madrid Espantildea en el cual se revisa la formacioacuten de
etilfenoles (4 etil-fenol 4 etil guayacol) en vinos tintos anejos Los factores
fisicoquiacutemicos que favorecen el crecimiento de la levadura no deseada
BrettanomycesDekkera las teacutecnicas usadas para la detectar la presencia de esta
levadura en vinos ( Revisioacuten microscoacutepica fluorescente remocioacuten de aacutecidos
grasos de su membrana teacutecnicas moleculares como PCR y electroforesis) y de
control (Proteiacutenas fining Fining con gelatina liquida filtracioacuten variables
fisicoquiacutemicas adicioacuten de aditivos procedimientos de altas presiones
manipulacioacuten geneacutetica) con esta investigacioacuten se concluye que la combinacioacuten y el
uso de las numerosas teacutecnicas pueden ayudar a la prevencioacuten y reduccioacuten de la
levadura BrettanomycesDekkera 49 Este trabajo muestra las muacuteltiples opciones
47
A Morata S Benito F Palomero F Calderoacuten y J A Suaacuterez-Lepe Ecologiacutea y prevencioacuten de
BrettanomycesDekkera durante la elaboracioacuten y crianza de vinos tintos Revista enoacutelogos (Editada por la
Federacioacuten Espantildeola de Asociaciones de Enoacutelogos y Periodistas Asociados) No 50 paacuteg 1-12 Madrid Espantildea
48 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 20-
24 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
49 R Suarez JA Suarez-Lepe A Morata F Calderon 2006 The production of ethyl phenols in wine by yeasts
of the genera Brettanomyces and Dekkera A review Journal Food Chemistry No 102 pag 10-21 Madrid
Espantildea
36
existentes en el control y prevencioacuten de la levadura mencionada sin embargo deja
claro que la mayoriacutea de estas opciones son costosas y no de faacutecil adquisicioacuten para
una pequentildea industria
El anaacutelisis sensorial ha sido de los aspectos maacutes estudiados al respecto de
BrettanomycesDekkera una de estas investigaciones fue realizada en Centre
Europeacuteen des Sciences du Goucirct en Talence Francia en el cual se evaluaron 50
vinos bordeaux sensorialmente para demostrar la complejidad del ldquoCaraacutecter Brett‟‟
al cual se unen otros compuestos aromaacuteticos ademaacutes de los fenoacutelicos como acido
isobutirico e isovalerico en este tipo de vino debido a sus caracteriacutesticas
fisicoquiacutemicas50
De los meacutetodos de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera los medios
selectivos son muy populares es por esto que el Laboratorio de Microbiologiacutea
Departamento de Botanica e Engenharia Biologica Instituto Superior de
Agronomia Lisboa Portugal realizo un trabajo en el cual se pretendia desarrollar
un medio selectivo o diferencial capaz de aislar la levadura
BrettanomycesDekkera del vino y de la cadena productiva del vino con el fin de
detreminar la relacioacuten entre esta levadura y los compuestos 4-etilfenol y 4 etil-
guayacol51 otro estudio realizado para la deteccioacuten de dicha levadura fue
realizado en la Escola Superior de Biotecnologiacutea Universidade Catoacutelica
Portuguesa el desarrollo de un simple procedimiento compatible con las rutinas
50 Andrea Romano a Marie Claire Perello a Aline Lonvaud-Funel Gilles Sicard Gilles de Revel2008 Sensory
and analytical re-evaluation of lsquolsquoBrett characterrdquo Journal Food Chemestry No 114 pag 15-19 Talence
France
51 N Rodrigues G Gonccedilalves S Pereira-da-Silva M Malfeito-Ferreira and V Loureiro2001 Development
and use of a new medium to detect yeasts of the genera DekkeraBrettanomyces Journal of applied microbiology No 90 pag 588-599Lisboa Portugal
37
usadas en las vineras para la deteccioacuten de BrettanomycesDekkera en vino y en
maquinarias52
En el laboratorio de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas Alcohoacutelicas de la
Universidad de Zagreb se ha trabajado anteriormente en el desarrollo de medio
solido selectivo con pruebas de diferentes concentraciones de los compuestos
como resultados se encuentra una buen relacioacuten entre las concentraciones de los
compuestos sin embargo como recomendaciones se encuentran la falta de
antibioacutetico para evitar contaminacioacuten por bacterias probar con diferentes fuentes
de carbono para comparacioacuten de tiempo de crecimiento positivo y un monitoreo
diario en el medio53
Los compuestos aromaacuteticos que libera la presencia de BrettanomycesDekkera
estaacute asociada a los compuestos 4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinilfenol y 4
viniguayacol a partir de esto los centros de investigacioacuten han hondado en la
identificacioacuten de dichos compuestos relacionados en la enologiacutea y especialmente
con BrettanomycesDekkera a partir de eso el Departamento de Quiacutemica
Universidad de La Rioja Espantildea este estudio presenta un meacutetodo basado en el
uso de Cromatografiacutea de Gas y micro extraccioacuten en fase solida para el anaacutelisis
cuantitativo de 4-etilfenol 4-etil guayacol 4-vinilfenol 4-vinilguayacol
Demostrando la existencia de un efecto matriz en el anaacutelisis de compuestos
responsables del ldquocaraacutecter Brettrdquo en vino Este nuevo meacutetodo fue
satisfactoriamente aplicado a cierto nuacutemero de vinos tintos comerciales vinos
52
JA Couto A Barbosa and T Hogg 2005 A simple cultural method for the presumptive detection of the yeasts BrettanomycesDekkera in wines Letters in Applied Microbiology No 41 pag 505-510 Porto
Portugal
53 Serkovic Dubravka Gracin Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac
Brettanomyces bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet pag 1-117 ZagrebCroatia
38
blancos y roseacute Este meacutetodo puede ser una alternativa para evitar el efecto matriz
en muestras de vino54
De acuerdo con este tema en la jornada cientiacutefica del 99 el grupo de investigacioacuten
enoloacutegica se estudio la formacioacuten de sustancias volaacutetiles por 13 cepas de S
cerevisiae con buenas aptitudes enoloacutegicas inoculadas individualmente en un
mosto homogeacuteneo de la variedad airen fermentado en las mismas condiciones
de aireacioacuten y a temperatura controlada55
54
C Pizarro N Perez-del-Notario JM Gonzalez-Saiz 2007 Determination of Brett character responsible
compounds in wines by using multiple headspace solid-phase micro extraction Journal of Chromatography
No 1143 pag 176-181 La Rioja Espantildea
55 E Pueyo P Hidalgo K Fernaacutendez y P Martiacuten-Aacutelvarez 1999 Anaacutelisis de compuestos volaacutetiles en vinos
obtenidos con distintas cepas de Saccharomyces cerevisiae Aplicacioacuten de la teacutecnica de microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientificas 99 Grupos de Investigacion Enologica Zaragoza Espana
39
7 MATERIALES Y METODOS
A continuacioacuten se presentan materiales y meacutetodos para la investigacioacuten
Este proyecto fue realizado en su gran mayoriacutea en las instalaciones de la
Universidad de Zagreb en la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos
(PBF) Laboratorios del Departamento de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas
Alcohoacutelicas ubicado en la ciudad de Zagreb Croacia
Los anaacutelisis fisicoquiacutemicos del vino tinto Babic fueron realizados en los
laboratorios de VINOLAB ubicado en Zagreb Croacia
71 MEDIO SOLIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera
711 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Autoclave de laboratorio
Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa Etanol peptona extracto de levadura
agar cicloheximida acido cumaacuterico ampicilina)
Balanza electroacutenica de precisioacuten
Microscopio oacuteptico
712 Metodologiacutea
Basados en estudios anteriores realizados en el laboratorio para el desarrollo de
medio solido selectivo para BrettanomycesDekkera (Serkovic Dubravka Gracin
40
Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac Brettanomyces
bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet Universidad de Zagreb pag 1-
117 Zagreb Croacia) se evaluaron las recomendaciones mencionadas en dicha
investigacioacuten para la mejoriacutea y desarrollo de otros medios soacutelidos selectivos
Se usoacute como base el medio YPD (Yeast Peptone Dextrose) el cual estaacute
compuesto de la siguiente forma 20gL peptona 10 gl extracto de levadura 20 gl
de agar56 este medio es selectivo para levaduras pero no es selectivo entre ellas
Es necesario el uso de una fuente de carbono para la levadura
BrettanomycesDekkera de acuerdo a la teoriacutea y revisando la tabla 1 (Relacioacuten de
los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) y seguacuten
facilidades de disponibilidad en el laboratorio se utiliza glucosa la cual es
utilizable por entre 75-100 de las cepas de BrettanomycesDekkera seguacuten la
tabla mencionada anteriormente
Esta fuente de carbono (Glucosa) fue probada en una concentracioacuten de 20 gL
Cicloheximida fue probada a 30 mgL para inhibir Saccharomyces en el medio y
darle mayor selectividad para Brettanomyces Dekkera Se antildeade acido p-
cumarico en una concentracioacuten de 100 mgL como precursor para la formacioacuten
del compuesto 4 etilfenol caracteriacutestico de la levadura BrettanomycesDekkera
Para inhibir bacterias en el medio se usa ampicilina a 10 mgL esta se agrega
despueacutes de realizada la esterilizacioacuten y cuando la temperatura del medio este
igual o menor a 40C El pH del medio se ajusto a 5
Paralelamente se crea el medio con Etanol como fuente de carbono en una
concentracioacuten de 6 o 60 mlL con la misma concentracioacuten de los otros
compuesto como cicloheximida 30mgL acido cumarico 100mgL 20 gL peptona
10 gL de extracto de levadura 16gL de agar Este medio se crea como
56
Concentraciones preestablecidas en el laboratorio de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas alcoholicas
41
comparativo para determinar cual fuente de carbono es la maacutes utilizada por la
levadura Brettanomyces bruxellensis para su reproduccioacuten Seguacuten la teoriacutea (ver
tabla 1) el etanol es utilizado por entre 25-75 de las cepas de
BrettanomycesDekkera pero es el azuacutecar que se encuentra en mayor
concentracioacuten presente en los vinos tintos aproximadamente 130 gl57
Estos medios fueron debidamente esterilizados para eliminar cualquier
microorganismo o espora presente en este Este procedimiento se realizo por el
meacutetodo de combinacioacuten de altas temperatura y presioacuten (Autoclave 121 C a 1034
kPa)
Se usaron colonias de BrettanomycesDekkera aisladas anteriormente de vinos
contaminados y guardas para investigaciones en el Departamento de Tecnologiacutea y
Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos
Universidad de Zagreb Croacia
Los medios fueron monitoreados visualmente todos los diacuteas y se toman
observaciones de macroscoacutepicas y microscoacutepicas Se comparan estos dos medios
en teacuterminos de rapidez de crecimiento de la levadura y selectividad Estas
muestras fueron incubadas a 28C por 10 diacuteas
La prueba fue realizada por duplicado en diferentes tiempos
57
Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
42
72 MEDIO LIacuteQUIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera
721 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Frascos de vidrio esteacuteriles
Autoclave de laboratorio
Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa peptona extracto de levadura
cicloheximida acido cumarico ampicilina etanol)
Microscopio oacuteptico
Balanza electroacutenica de precisioacuten
722 Metodologiacutea
En el mercado para enologiacutea existen medio liacutequidos selectivos para la deteccioacuten
de BrettanomycesDekkera en vinos sin embargo estos son de difiacutecil accesibilidad
por sus elevados precios es por esto que se desarrolla un medio liquido selectivo
para dicha levadura en el laboratorio del Departmaneto de Tecnologiacutea y Anaacutelisis
de Bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia
Para este medio se toma como base el medio selectivo con Glucosa como fuente
carbono desarrollado anteriormente sin usar agar para mantener el medio en su
estado liquido
43
La composicioacuten de este medio liacutequido es la siguiente
20 gL Glucosa
20 gL peptona
10gL extracto de levadura
30mgL de cicloheximida
100mgL acido p-cumarico
10 mgL ampicilina
Estos compuestos fueron medidos en una balanza electroacutenica de precisioacuten se
antildeade 250 ml de agua destilada y se mezcla constantemente se pasa a proceso
de esterilizacioacuten en autoclave a 120C y 1034 KPa por 45 minutos
De esta forma se asegura la usencia de microorganismos yo esporas en el
medio Despueacutes de bajar la Temperatura a 40C se agrega a la mezcla ampicilina
en una concentracioacuten de 10mgL
En frascos de vidrio esteacuteril se agrega 40 ml de medio liacutequido y diferentes
cantidades iniciales de levaduras BrettanomycesDekkera fueron inoculadas al
respectivo medio el primer frasco tiene una cantidad de 106 ceacutelulasml el segundo
tiene 104 ceacutelulasml el tercero tiene 102 celulasml y el cuarto con una cantidad
aproximada de 25 ceacutelulasml Estas cantidades estaacuten basadas en estudios
anteriores para medios liacutequidos selectivos en levaduras58
58 J Ungar A M James P W Muggleton H F Pegler y E G Tomich1950 The Cultivation of
Haemophilus pertussis in Partially Defined Liquid Media Journal of General Microbiology No 4
pag 345-359 Greenford
44
Este medio liacutequido inoculado fue inspeccionado diariamente visualmente revisioacuten
de turbidez microscoacutepicamente y olfativamente para deteccioacuten de olores del
ldquocaraacutecter Brettrdquo
Los diacuteas fueron contabilizados para determinar resultados positivos en estos
ensayos
73 INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN
VINO TINTO DE LA REGION DE DALMACIA CROACIA
731 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Medio selectivo solido para BretanomycesDekkera
Medio selectivo Liquido para BrettanomycesDekkera
Quiacutemicos de laboratorio (Dioxido de Azufre (SO2) Antibrettreg Glucosa)
Vino Babic 2007
Anallizador infrarojo Bacchius II microdom
732 Metodologiacutea
Con los medios desarrollados (solido y liquido) se quiere conocer el efecto del
dioacutexido de azufre (SO2) y el producto Antibrettreg en la levadura
BrettanomycesDekkera presente en el vino tinto de la regioacuten de Dalmacia
Con las herramientas que se tienen en el laboratorio del departamento de
tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia se quiere
determinar la influencia de estos productos en la levadura BrettanomycesDekkera
presente en vino tinto croata de la regioacuten de Dalmacia Babic
45
El primer paso es adaptar la levadura al vino tinto croata (Babic) para esto se
inoculan 20 colonias de BrettanomycesDekkera en 500 ml de vino se antildeadioacute
glucosa en una concentracioacuten de 2gL y se oxigena la mezcla Para este paso de
adaptacioacuten se dejan las muestras de 1 a 2 diacuteas a temperatura ambiente (20C)
Despueacutes de este periodo se revisa microscoacutepicamente la presencia positiva de
BrettanomycesDekkera en los 500 ml de vino en los que se estaba haciendo el
paso de adaptacioacuten en Babic al comprobar su presencia positiva se procede a
mezclar los 500 ml de vino contaminado con BrettanomycesDekkera con los 3
Litros de vino Babic que se disponen para esta prueba
Estos 3 litros de vino tinto Babic contaminado con la levadura
BrettanomycesDekkera se reparten en 8 frascos de vidrios esteacuteriles al siguiente
diacutea se toman dos frascos para agregar cada uno de los compuestos a evaluar
(SO2 y Antibrettreg)
Para SO2 se toman dos frascos uno de 600ml y uno de 100ml se agrega una
concentracioacuten de 40 mgl
Para el producto AntiBrettreg se toman cuatro frascos dos de 600 ml y dos de 100
ml seguacuten especificaciones del producto y la alta poblacioacuten de
BrettanomycesDekkera en las muestras se adiciono la maacutexima concentracioacuten de
AntiBrettreg a las muestras la cual fue de 40 gHl
Estas muestras se dejaron a temperatura ambiente simulando condiciones de
almacenamiento del vino en barricas temperatura aproximada de 20C evitando el
contacto con la luz solar y evitando movimientos fuertes Esto se mantuvo por 15
diacuteas que fue el tiempo de duracioacuten del experimento
Con el vino restante se mantuvo en las mismas condiciones de almacenamiento
de los demaacutes para hacer un paralelo de comparacioacuten
Previamente se analizaron las caracteriacutesticas del vino sin contaminar por medio
del analizador infrarrojo Bacchus II microdom antes de agregar los compuestos
46
SO2 y AntiBrettreg y despueacutes se volvioacute a realizar el anaacutelisis para determinar los
efectos de estos compuestos en el vino y asiacute mismo al de control
74 DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN
EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO
MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE
741 Materiales
Cromatografo de Gas HP5890 Serie II
Microextractor de fase solida (SPME)
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Quiacutemicos de laboratorio (p-cresolAcetaldehido Propanol diacetil etil-
acetato i-butanol acido aceacutetico i-amil-alcohol n-amil lactato de etilo
acetato amil metiacutelico 1-hexanol etil-hexanol linalol nerol citronelol
geraniol 2-feniletanol octanoato de etilo 4-etilfenol 2-feniletil acetato 4-
etilguaiacol)
Vino Tinto Babic
Agua destilada
742 Metodologiacutea
El meacutetodo fue desarrollado anteriormente en el Departamento de Tecnologiacutea y
Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos de
la Universidad de Zagreb Croacia Y despueacutes de modificaciones fue utilizado en el
desarrollo del trabajo El meacutetodo utilizado es descrito a continuacioacuten
47
Cromatografo de gas HP 5890 SERIES II
Programa HP-chem
a) Condiciones para analisis SPME-GC
Muestra diluida 5050 con adicion de estandar interno (p-cresol1mgl)
25ml de la muestra diluida con mezcla continua a temperatura ambiente
Tiempo de adsorcion 30 minutos
SPME es colocado en la muestra para la adsorcion durante el tiempo
previsto
b) Condiciones para el Cromatografo de gas (GC)
La columna usada en este experimento es RTXreg-5 (Restec USA sn 210627)
30m id=025mm 025μm
Gas portador Nitrogeno
Flujo del Nitrogeno 5 mlmin
Temperatura del inyector 240 C
Temperatura del detector 250 C
Temperaturas programadas 35 C5 min 150 C 34 Cmin 180 C
10Cmin 190 C 5 Cmin
Se conocen los resultados del cromatografiacutea de gases (ver tabla 10) y se hacen
necesarias varias correcciones del meacutetodo y algunas pruebas con unos
compuestos para determinar realmente su tiempo de retencioacuten en este tipo de
vino Se deben comprobar tiempos de retencioacuten
48
8 DISCUSIOacuteN Y RESULTADOS
81 RESULTADOS PARA EL DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO
Tabla 2 Medio Selectivo con Glucosa como fuente de carbono para
BrettanomycesDekkera en incubacioacuten por 5 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten
microscoacutepica
1 Negativo Negativo - No se realiza
2 Negativo Negativo - Presencia de levaduras
3 Negativo Negativo - Presencia de
Levaduras
4 Aparicioacuten de
algunas colonias
Negativo Transparente Presencia de levaduras
5 Colonias definidas Positivo-
Fenoles
Amarillo Presencia positiva de
BrettanomycesDekkera
49
Este medio tiene alto grado de selectividad para levaduras con un tiempo de
crecimiento de aproximadamente 5 diacuteas en 28C lo que lo hace raacutepido gracias al
antibioacutetico (ampicilina) que hace parte de la composicioacuten del medio no hay
presencia de bacterias Se hace confiable para resultados positivos de levaduras
BrettanomycesDekkera debido a que las levaduras Saccharomyces fueron
inhibidas con el compuesto cicloheximida su selectividad fue comprobada por
revisioacuten microscoacutepica macroscoacutepica y sensorial
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con glucosa como fuente de carboacuten son las
siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
50
Tabla 3 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono para Brettanomyces Dekkera en
incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica
1 Ninguno Negativo - -
2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras y
bacterias
9 Diminutas
colonias
transparentes
Negativo Transparentes Presencia de levaduras y
algunas bacterias
10 Positivo Positivo-
Fenoacutelicos
Amarillo Presencia de levaduras
BrettanomycesDekkera y
bacterias
El medio selectivo para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de
carbono tambieacuten es selectiva entre levaduras ya que solo se identifico la levadura
BrettanomycesDekkera en este sin embargo se evidencia una presencia de otro
microorganismo presuntamente bacteria ya que este medio no contiene agente
antibacteriano (ampicilina) Es necesaria la adicioacuten de ampicilina en una
concentracioacuten de 10mgl para inhibir la presencia de bacterias
Este medio presenta un tiempo maacutes prolongado para mostrar crecimiento de la
levadura BrettanomycesDekkera aproximadamente 10 diacuteas
51
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las
presentadas en el medio selectivo con glucosa como fuente de carbono y son las
siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
52
Tabla 4 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono y adicioacuten de ampicilina para
Brettanomyces Dekkera en incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica
1 Ninguno Negativo - -
2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
9 Diminutas
colonias
transparentes
Negativo Transparentes Presencia de levaduras
10 Positivo Positivo-
Fenoacutelicos
Amarillo Presencia de levaduras
BrettanomycesDekkera
El efecto de la ampicilina sobre el medio selectivo con etanol como fuente de
carbono fue el esperado inhibioacute completamente el crecimiento de colonias
bacterianas en el medio el tiempo de crecimiento de la levadura y presencia de
aromas fenoacutelicos fue el mismo de 10 diacuteas en incubacioacuten de 28C
53
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las
presentadas anteriormente y son las siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
82 RESULTADOS PRUEBAS MEDIO LIQUIDO
Tabla 5 Influencia de la concentracioacuten de levaduras BrettanomycesDekkera en el
tiempo necesario para detectar la produccioacuten de 4-etil-fenol en medio liquido
Nuacutemero de ceacutelulas ml
(concentracioacuten final)
Tiempo necesario para obtener resultados
positivos (diacuteas)
1 Experimento
32x106 le 3
3 X 104 3
33x102 7
40 No detectado
2 Experimento
43x106 le3
39x104 le3
37x102 8
62 No detectado
54
El nuacutemero de ceacutelulas de levadura de BrettanomycesDekkera fue contabilizado
usando contador de ceacutelulas Chamber
Los aromas fenoacutelicos son difiacuteciles de detectar debido al fuerte olor que tiene el
medio liquido caracteriacutestico de sus componentes esto dificulta la identificacioacuten del
ldquocaraacutecter Brettrdquo en especial cuando las concentraciones de
BrettanomycesDekkera no son elevadas Ademaacutes de los olores fenoacutelicos otros
compuestos volaacutetiles se detectan tales como acido aceacutetico y olores oxidativos
tambieacuten producido por la levadura BrettanomycesDekkera
En la inspeccioacuten visual se detecta alta turbidez en el medio Se compara con un
medio sin presencia de BrettanomycesDekkera
En las muestras con mayor concentracioacuten de la levadura es maacutes notoria la
turbidez Despueacutes de 3 diacuteas se presenta un precipitado blanco en todas las
muestras de altas concentraciones
La revisioacuten microbioloacutegica se realiza diariamente para determinar el nuacutemero de
ceacutelulas y la presencia positiva de la levadura a evaluar
Entre los dos experimentos realizados con el medio liquido el tiempo que se
demoro en detectar compuestos fenoacutelicos fue muy similar entre ellos
dependiendo del nuacutemero de ceacutelulas en el medio en mayores concentraciones el
tiempo de deteccioacuten fue menor
Hay que sentildealar que BrettanomycesDekkera debe alcanzar una concentracioacuten
miacutenima (denominada poblacioacuten criacutetica) de 103 UFCml para comenzar a liberar etil
fenoles Por debajo de esta concentracioacuten la levadura seriacutea metaboacutelicamente
activa pero no produciraacute compuestos alterantes a niveles detectables esto se ve
reflejado en los resultados en los que las concentraciones de ceacutelulas son muy
bajas
55
Estos resultados se comparan con los resultados dados en el medio solido Los
dos medios muestran altos grados de selectividad hacia la levadura
BrettanomycesDekkera y similar comportamiento para el crecimiento de dicha
levadura
En el medio liacutequido cuando hay altas concentraciones de BrettanomycesDekkera
el tiempo de deteccioacuten del microorganismo es menor que con el medio solido pues
en el liacutequido es aproximadamente 3 diacuteas y en el soacutelido son 5 diacuteas
83 RESULTADOS DE LA INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE
(SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO DE LA REGION DE
DALMACIA CROACIA
El vino fue analizado antes de la adicioacuten de los compuestos quiacutemicos a evaluar y
15 diacuteas despueacutes de adicioacuten para ver la reaccioacuten de este frente a SO2 y Antibrettreg
estas caracteriacutesticas se determinaron con el equipo de laboratorio Bacchus II
Microdom localizado en el laboratorio Vinolab doo Zagreb Croacia Los
resultados se muestran en la tabla
Tabla 6 Resultados de las muestras de vino inoculados con la levadura BrettanomycesDekkera
durante 15 diacuteas Comparativos con los diferentes compuestos
CFUml
Vino Day 1 Day 4 Day 10 Day 15
Control 130E+04 800E+03 700E+03 500E+03
Control 800E+03 640E+03 700E+03 280E+03
SO2 110E+04 400E+02 400E+02 67
SO2 900E+03 380E+03 270E+03 183
Antibrett 140E+05 920E+04 140E+04 400E+03
Antibrett 210E+05 181E+05 160E+04 900E+03
Antibrett 120E+05 990E+04 120E+04 100E+03
Antibrett 230E+05 204E+05 300E+03 200E+03
56
Tabla 7 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 antes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o
Antibrettreg Diacutea 0
Alcohol
()
Acidez Total
(gr Aci
Tartaacuterico L)
Acidez volaacutetil
(Aci
AceacuteticoL)
Densidad
(grml)
Azuacutecar residual
(grl)
Extracto
seco
(grl)
Acido
Laacutectico
(grl)
Glicerol
(grl)
Taninos
(grl)
Acetato
(grl)
1473
525
083
09928
473
332
164
799
305
117
1471
522
084
09927
479
329
162
786
299
116
Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
Tabla 8 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 despueacutes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o
Antibrettreg Diacutea 15
Alcohol
()
Acidez Total
(gr Aci
Tartaacuterico L)
Acidez volaacutetil
(Aci
AceacuteticoL)
Densidad
(grml)
Azuacutecar residual
(grl)
Extrac
to seco
(grl)
Acido
Laacutectico
(grl)
Glicerol
(grl)
Taninos
(grl)
Acetatos
(grl)
Control
1414
565
107
09935
436
364
177
827
259
136
Control
1415
556
108
09936
420
365
170
824
256
137
SO2
1456 543 108 09932 476 369 167 803 281 125
SO2
1457
542 108 09933 472 370 170 804 271 124
Antibrett 1454 533 106 09933 448 371 175 813 277 125
Antibrett 1455 534 105 09933 460 372 171 809 282 124
Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
57
Figura 4 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en el vino de control para
evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas
El comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en la prueba por
duplicado en el vino de control fue muy similar pues con el tiempo esta levadura
deja de reproducirse y va muriendo cuando las condiciones ya no son aptas para
su desarrollo debido a que la mayoriacutea de su fuente de carbono (Glucosa) esta
consumida sin embargo esta levadura no llega a su desaparicioacuten total lo que
representa uno de los mayores problemas en la elaboracioacuten del vino
Esta levadura tiene un metabolismo lento y el factor tiempo es un requisito
fundamental para su desarrollo este experimento se empezoacute con una alta
poblacioacuten de BrettanomycesDekkera (130 x 104 UFCml y 8 x 103 UFCml
respectivamente) y durante el transcurso del tiempo la poblacioacuten fue disminuyendo
debido a la perdida de las condiciones necesarias para la reproduccioacuten
58
Figura 5 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de SO2 en
concentracioacuten de 40 mgl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas
El SO2 tuvo un comportamiento efectivo y raacutepido contra las colonias de
BrettanomycesDekkera La poblacioacuten de esta levadura se redujo de forma
significativa entre el diacutea primero y el cuarto se encontroacute una diferencia porcentual
de 96 en la primera prueba y del 60 en la de duplicado al diacutea 15 ya la
poblacioacuten era casi nula pasando raacutepidamente de un numero por encima de la
poblacioacuten critica de la levadura BrettanomycesDekkera a un numero lt103 UFCml
siendo muy eficaz y raacutepido en el manejo de produccioacuten
Este compuesto ademaacutes de favorecer la extraccioacuten de los compuestos fenoacutelicos y
de su actividad antioxidante al inhibir la accioacuten de las polifenoloxidasas a dosis
adecuadas de un maacuteximo de 50gl inhibe la multiplicacioacuten bacteriana y de
levaduras
59
Figura 6 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de
Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo
de 15 diacuteas
Figura 7 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de
Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo
de 15 diacuteas
El compuesto Antibrettreg en la primera prueba tanto como en el duplicado tuvo su
mayor tiempo de reduccioacuten de UFCml entre los diacuteas 4-10 con una diferencia
porcentual de 91 en comparacioacuten con el diacutea cuarto al decimo a diferencia de
60
SO2 el cual presenta la gran disminucioacuten de colonias entre los primeros diacuteas de
agregarse el producto
El tiempo para que la poblacioacuten de la levadura llegara a la cantidad menor a la de
la poblacioacuten critica es mucho mayor que la del compuesto SO2 sabiendo que esta
poblacioacuten debe ser lt103 UFCml
El compuesto Antibrettreg puede tardarse 4-10 diacuteas en representar una reduccioacuten
de UFCml significativa en dicho tiempo puede representar grandes peacuterdidas
nutricionales y altos costos de produccioacuten para la fabricacioacuten
Figura 8 Comportamiento del contenido de alcohol en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin adicioacuten)
hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
BrettanomycesDekkera estaacute presente en vinos de alto contenido alcohoacutelico
aproximadamente entre 125 a 14 pues esta levadura toma a etanol como
fuente de carbono y este vino (Babic) procede de uvas muy maduras las cuales
presentan mayor cantidad de azuacutecares residuales (como glucosa y fructosa y
otras pentosas residuales)
138
14
142
144
146
148
Alcohol
Day 0 Day 15
61
Analizando el comportamiento del vino durante el experimento de 15 diacuteas sin
compuestos quiacutemicos y con SO2 y Antibrettreg a partir de las caracteriacutesticas
iniacuteciales que se determinaron seguacuten el equipo BACCHUS analizador infrarrojo se
presenta en general una reduccioacuten del contenido alcohoacutelico de este vino pero se
ve una mayor reduccioacuten en el vino de control el cual redujo en un 394 su
contenido alcohoacutelico desde el dia 0 hasta el diacutea 15 este vino no tiene ninguacuten
compuesto contra la levadura BrettanomycesDekkera y por su elevada presencia
en los 15 diacuteas de experimento consumioacute esta cantidad de etanol
Mientras en el vino que conteniacutea SO2 tras 15 diacuteas de tratamiento se vio una
reduccioacuten de alcohol de 1 ya que este compuesto redujo la cantidad de
BrettanomycesDekkera en los primeros diacuteas de tratamiento previniendo su
reproduccioacuten y protegiendo el contenido alcohoacutelico del vino Babic 2007
En los vinos de prueba con Antibrett reg la reduccioacuten alcohoacutelica se dio en un
porcentaje de 122 un poco maacutes alta que con SO2 y mucho maacutes baja en
comparacioacuten del vino de control este compuesto tambieacuten previno la gemacioacuten de
la levadura evitando la perdida de etanol en el vino sin embargo como este
compuesto duro mas en este proceso de eliminar BrettanomycesDekkera se
produjo una mayor peacuterdida alcohoacutelica
62
Figura 9 Comportamiento del contenido de acidez volatil en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin
adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
Debido a la presencia de oxigeno en los frascos la acidez volaacutetil aumento pero no
significativamente en las muestras No hubo grandes diferencias entre las
muestras con compuestos y las de control por lo que se deduce que estos
compuestos no ayudan a evitar esta acidez Esta acidez tan alta puede dantildear la
calidad del vino de forma casi irreparable Pero el factor oxigeno es de los maacutes
controlados en la produccioacuten de vinos
la alteracioacuten del aumento de la acidez volaacutetil no estaacute relacionada con la levadura
BrettanomycesDekkera sino a la presencia de oxigeno en el almacenamiento el
oxigeno fue usado en esta prueba para promover condiciones apropiadas para el
desarrollo de la levadura
002040608
112
Acidez Volatil
Day 0 Day 15
63
Figura 10 Comportamiento del contenido de Acido Acetico en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin
adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
Brettanomyces Dekkera son productores de aacutecido aceacutetico y elevan el contenido
de los vinos anormalmente en condiciones de anaerobiosis En condiciones de
aerobiosis producen concentraciones bajas o nulas de aacutecido aceacutetico
Este acido aceacutetico al igual que los fenoles afecta el sabor y el perfil olfativo del
vino tinto este efecto es tambieacuten producido por la levadura
BrettanomycesDekkera vemos en los resultados el gran crecimiento de este
compuesto en el vino control el cual no tenia compouestos en contra de
BrettanomycesDekkera lo que produjo este aumento significativo del acido aceacutetico
en comparacioacuten con estos que teniacutean SO2 y Antibrettreg entre ellos la diferencia en
este compuesto es muy reducida y no significativa pues estos compuestos no
permitieron la gemacioacuten de esta levadura y esta no produjo este acido en esa gran
cantidad
A este compuesto se le atribuye el olor y sabor a vinagre del vino tinto un defecto
muy comuacuten y poco agradable para el consumidor
105110115120125130135140
Acido Acetico
Day 0 Day 15
64
Figura 11 Comportamiento del contenido de Azucares reductores en vino Babic 2007
desde el diacutea 0 (sin adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en
comparacioacuten con el vino de control
BrettanomyesDekkera utiliza los azucares residuales como fuente de carbono
para su crecimiento en el vino este es el factor maacutes importante para su desarrollo
y este es el que determina en cierto caso la cantidad de levaduras de
BretanomycesDekkera presente en las graficas se determina claramente que en
el vino de control donde la cantidad de esta levadura es muy alta 15 diacuteas despueacutes
de empezar las pruebas la cantidad de azucares reductores es muy baja y ha
bajado en un porcentaje de 10 mientras que el vino que tiene SO2 bajo la
cantidad de azucares reductores en un 042 y el vino que tiene el compuesto
Antibrettreg redujo su nivel de azucares reductores en 462
38
4
42
44
46
48
5
Azucares Reductores
Day 0 Day 15
65
84 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE
CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON
EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID
PHASE
Tabla 10 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en
vino Babic 2007 con el meacutetodo propuesto
Compuesto Tiempos de
retencioacuten (min)
Acetaldehiacutedo 1437
Propanol 3759
Diacetil 4202
Etil-acetato 4523
i-butanol 6232
Acido Aceacutetico 7840
i-amil alcohol 11740
n-amil 13489
lactato de etiacutelico 15741
acetato amil metiacutelico 17796
1-hexanol 19101
etil-hexanol 24456
Linalol 30370
2-feniletanol 32768
p-cresol 33522
octanoato de etilo 34226
4-etilfenol 37100
2-feniletil acetato 32769
4-etilguayacol 39704
4 vinilfenol 40529
decanoato de etilo 42117
Refirieacutendose a estos resultados es necesaria la creacioacuten de soluciones estaacutendar
para determinar tiempos de retencioacuten con el meacutetodo y si es necesario ajustes a
este
66
Tabla 11 Soluciones estaacutendar para compuestos en vinos tintos Croatas
MODEL 0
(en volumen de 100 ml en 40 Etanol)
Compuesto Pureza Cantidad
(g)
Concentracioacuten (gl)
Acetaldehiacutedo 099 1623 160677
Propanol 0995 13849 137718
Diacetil 098 01071 104958
Etil-acetato 0995 30172 3002114
i-butanol 099 15016 1486584
Acido Acetico 0995 0 0
i-amil alcohol 099 20116 1991484
n-amil 098 15442 1513316
lactato de etilio 098 00507 049686
acetato amil metilico 098 01028 100744
1-hexanol 098 00367 035966
etil-hexanol 098 00308 029876
Linalol 097 00288 027936
Nerol 097 00311 030478
Citronelol 098 0031 03038
Geraniol 098 15803 1548694
2-feniletanol 098 00402 039396
4-etilfenol 098 00812 078764
octanoato de etilo 097 00597 059103
2-feniletil acetato 099 00315 031185
4-etilguayacol 098 00803 079674
Fuente Laboratorio de anaacutelisis e investigacioacuten de bebidas Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea
de Alimentos Universidad de Zagreb Zagreb Croacia 2009
Las soluciones estaacutendar se realizan teniendo como referencia las cantidades de
estos compuestos en los vinos tintos croatas datos suministrados por el Doctor
Leo Gracin en concentraciones de gl a partir de este dato y teniendo en cuenta
67
la pureza de los compuestos que se teniacutean en el laboratorio de anaacutelisis e
investigacioacuten de bebidas se crean las soluciones estaacutendar Ejemplo
Solucioacuten estaacutendar para 4 etil-fenol en un volumen de 100 ml
Con estas soluciones estaacutendar se realizo el tiempo de retencioacuten para corroborar el
meacutetodo Los resultados de esto fueron tiempos de retencioacuten diferentes a los del
meacutetodo primero con el que se realizaron los ensayos y a partir de esos resultados
se ajusto el meacutetodo con el que se trabajo
68
Tabla 12 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en
vino Babic 2007 con el meacutetodo modificado
Compuesto Tiempos de
retencioacuten (min)
Acetaldehiacutedo 1542
Propanol 4046
Diacetil 4733
Etil-acetato 4807
i-butanol 6659
Acido Acetico 8343
i-amil alcohol 12123
n-amil 13866
lactato de etilio 16072
acetato amil metilico 18336
1-hexanol 19447
etil-hexanol 24835
Linalol 31831
2-feniletanol 33305
p-cresol 33703
octanoato de etilo 34571
4-etilfenol 37724
Citronelol 38326
Nerol 38576
2-feniletil acetato 39012
Geraniol 39944
4-etilguayacol 40271
4 vilifenol 41168
decanoato de etilo 42657
69
DIA 0
Se coloca ISTD a todas las muestras respectivas para poder determinar
cantidades de los compuestos aromaacuteticos
Se realiza la cromatografiacutea de gas al vino Babic 2007 antes de ser inoculado con
BrettanomycesDekkera
Tabla 13 Resultados de la cromatografiacutea de gas del vino Babic 2007
Compuesto Tiempo de retencioacuten
min
Cantidad
mgl
Acetaldehiacutedo 1542 0
Propanol 4046 0
Diacetil 4733 37215204
Etil-acetato 4807 0
i-butanol 6659 0
Acido Aceacutetico 8343 2817465
i-amil alcohol 12123 16799019
n-amil 13866 26
lactato de etiacutelico 16072 10983961
acetato amil metiacutelico 18336 0185196
1-hexanol 19447 264655
etil-hexanol 24835 0158751
Linalol 31831 0
2-feniletanol 33305 4235560
p-cresol 33703 1
octanoato de etilo 34571 0152412
4-etilfenol 37724 00581345
Citronelol 38326 00439729
Nerol 38576 00344799
2-feniletil acetato 39012 00407983
Geraniol 39944 0
4-etilguayacol 40271 0
4 vilifenol 41168 0
Decanoato de etilo 42657 00190144
70
Basados en los compuestos aromaacuteticos que brinda el ldquoCaraacutecter Brettrdquo se van a
analizar detalladamente los siguientes aromas 4-Etilfenol 4-Etilguayacol 4-
Vinylfenol
Figura 12 Compuestos aromaticos en vino tinto Babic sin estar contaminado con la levadura
BrettanomycesDekkera
El vino a analizar esta por debajo de las concentraciones consideradas como
perjudiciales para el aroma del vino tinto (El umbral sensorial del 4-etilfenol es de
230 μgl y el del 4-etilguaiacol es de 47 μgl) pues posee una concentracion de
58microgL de 4etilfenol 0 microgL de 4 etilguayacol y 0 microgL de vinylfenol
841 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGUacuteN TEMPERATURAS
DE ALMACENAMIENTO
0
02
4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinylfenol
Vino 00581345 0 0
C (
mg
L)
Vino Babic 2007 Dia 0
71
Tabla 14 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el
ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 20C por 4 diacuteas Prueba por duplicado
MUESTRAS INCUBADA A 20C
Compuesto Day 1
Amount
(mgL)
Day 2
Amount
(mgL)
Day 3
Amount
(mgL)
Day 4
Amount
(mgL)
4-etilfenol 0260244 017294 0177547 020156
4-etilfenol 0260244 0245915 0204542 0262499
4-etilguayacol 0 0 0 0
4-etilguayacol 0 0 0 0
4 vinilifenol 1107096 781349 685317 460323
4 vinilifenol 1107096 1297465 621324 693225
72
Figura 13 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
BrettanomycesDekkera es la levadura responsable de la produccion de 4-etil-
fenol compuesto asociado con olores caracteristicos a ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 00581345 0260244 0172935 0177547 020156
C (
mg
L)
4 etilfenol
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 00581345 0260244 0245915 0204542 0262499
C (
mg
L)
4 etilfenol
73
caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo dantildeando la calidad sensorial del vino tinto Babic la
produccioacuten de este compuesto en esta muestra realizada por duplicado fue
ascendente y tuvo incremento muy grande en el primer dia de almacenamiento y
en el transcurso de los siguientes cuatro diacuteas se mantuvo relativamente estable lo
cual no concuerda con el comportamiento tiacutepico de esta levadura quien tiene un
crecimiento lento e incrementa la produccioacuten de fenoles con su gemacioacuten esto
genera muchas dudas sobre el buen funcionamiento del equipo GC o de la
estabilidad de las levaduras BrettanomycesDekkera en este almacenamiento
Figura 14 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar prueba por duplicado
002040608
1
Vino Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0 0 0
4 etilguayacol
002040608
1
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0 0 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
74
Presencia negativa de 4 etil guayacol durante todo el almacenamiento
probablemente las condiciones de almacenamiento y el medio no dieron lugar al
desarrollo de este compuesto el cual se considera menos conflictivo que el 4-etil-
fenol
Figura 15 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
Estos resultados tambieacuten dejan dudas del normal comportamiento de dicha
levadura pues indican que la levadura no convirtioacute este compuesto en etilfenol
0
2
4
6
8
10
12
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 110709781349685317460323
4 vinylfenol
0
2
4
6
8
10
12
14
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
Series1 0 11071 12974 62132 69322
C (
mg
l)
4 Vinylfenol
75
durante el almacenamiento caracteriacutestica que solo la levadura
BrettanomycesDekkera puede realizar se ve que las concentraciones de
vinylfenoles son mucho mas altas que las de fenoles lo que nos deja determinar
que la poblacioacuten de BrettanomycesDekkera es muy baja y existen otras levaduras
productoras de vinylfenoles en este tipo de vino en las condiciones de
almacenamiento dadas para estas pruebas
Tabla 16 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el
ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 28C por 4 diacuteas
MUESTRA 2 INCUBADA A 28C
Compuesto Day 1
Amount
(mgL)
Day 2
Amount
(mgL)
Day 3
Amount
(mgL)
Day 4
Amount
(mgL)
4-etilfenol 0260244 019612 0186614 019932
4-etilfenol 0260244 020576 0214917 0193554
4-etilguayacol 0 014304 0223836 0
4-etilguayacol 0 002287 00529832 0
4 vinilifenol 1107096 787068 665182 397847
4 vinilifenol 1107096 284389 00204392 0
76
Figura 16 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar
El desarrollo de este compuesto en el diacutea 1 fue significativo y luego relativamente
estable el comportamiento fue similar en las pruebas de diferentes temperaturas
de almacenamiento para este compuesto el cual es el maacutes problemaacutetico en la
industria viniacutecola
0
005
01
015
02
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 005813019932018661019611019932
4 etilfenol
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 005813 019355 021491 020576 026024
4 etilfenol
77
Figura 17 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar
Los resultados de la prueba son poco confiables y no entendibles por lo que
podemos verificar que el GC no estaacute trabajando de forma adecuada para la
deteccioacuten del compuesto
0001002003004005006
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 Etilguayacol 0 0 0022 0053 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
0005
01015
02025
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0223 0143 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
78
Figura 18 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
El comportamiento de este compuesto en la prueba es muy irregular y poco
confiable
0
2
4
6
8
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 397847665182787068397847
4 vinylfenol
0
2
4
6
8
10
12
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 11071 28438 00204 0
4 vinylfenol
79
Figura 19 Comportamiento del compuesto 4 etilfenol durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
La concentracioacuten de 4 etil fenol fue mayor al cuarto diacutea almacenado a
temperatura ambiente de 20C pero este compuesto no tuvo una actividad notoria
de ascenso durante su almacenamiento como se esperaba lo que deja muchas
dudas sobre los resultados de este ensayo
0
05
1
15
2
25
3
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etil fenol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 20C
80
Figura 20 Comportamiento del compuesto 4 etil guayacol durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
Comportamiento anormal del compuesto no se ve tendencias de aumento o
disminucioacuten de este en ninguna de las pruebas no tiene un comportamiento
regular pues se esperaba que la levadura BrettanomycesDekkera
descarboxinizara el compuesto 4-vinilguaiacol y aumentar las concentraciones de
4-etilguaiacol esta reaccioacuten no se hizo notoria en los compuestos aromaacuteticos
seguacuten lo determino el Cromatografo de Gas (GC)
0
005
01
015
02
025
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3
C (
mg
L)
4 etil guayacol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 20C
81
Figura 21 Comportamiento del compuesto 4 Vinyl fenoll durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
La no presencia de este compuesto en el vino original demuestra las baja o casi
nula presencia de la levadura BrettanomycesDekkera al diacutea primero este
compuesto incrementa de forma notoria en las muestras debido a la presencia de
acido cumaacuterico en el medio ya que sufre su carboxilacion convirtieacutendose en 4 vinyl
fenol sin embargo su comportamiento no fue regular y presento problemas de
lecturas
0
2
4
6
8
10
12
14
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
C (
mg
L)4 Vinyl fenol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 28C
82
9 CONCLUSIONES Y
RECOMENDACIONES
91 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO
Se desarrolloacute un medio selectivo soacutelido para BrettanomycesDekkera
accesible y faacutecil de elaborar
Se detectan colonias de la levadura BrettanomycesDekera en el agar
selectivo con glucosa como fuente de carbono en un lapso de 5 diacuteas en
incubacioacuten a 28C
El medio selectivo soacutelido con Glucosa como fuente de carbono fue maacutes
raacutepido y efectivo ya que toma 5 diacuteas para dar resultados positivos frente al
de Etanol como fuente de carbono el cual toma 10 diacuteas para mostrar
resultados positivos aunque ambos dieron resultados satisfactorios en la
selectividad de la levadura BrettanomycesDekkera
La levadura se adapto de forma satisfactoria a estos medios en
condiciones de almacenamiento propias para su desarrollo (28C)
Las colonias de la levadura BrettanomycesDekkera tiene un crecimiento
en estos medios soacutelidos de forma circular con topografiacutea convexa y borde
entero dimensiones 5-6 mm color Amarillo opacicidad oscuro
83
superficie lisa y suave siendo faacutecil de identificar y realizar los conteos
necesarios
El medio solido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten
de la levadura BrettanomycesDekkera en vino tinto es raacutepido econoacutemico
y uacutetil
El uso de azucares para fermentacioacuten de la levadura
BrettanomycesDekkera que Saccharomyces no puede fermentar para
mayor selectividad
Realizacioacuten de pruebas Bioquiacutemicas como meacutetodo raacutepido de selectividad
92 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DESARROLLO DEL MEDIO LIacuteQUIDO
Se desarrollo un medio selectivo liquido para BrettanomycesDekkera
accesible y faacutecil de elaborar
Este medio mostroacute resultados positivos de la presencia de
BrettanomycesDekkera en un lapso de tiempo menor (3 diacuteas) que con el
medio solido (5 diacuteas) en caso de que el nuacutemero de ceacutelulas de la levadura
BrettanomycesDekkera sea mayor a la poblacioacuten critica (103)
Cuando la poblacioacuten de ceacutelulas de la levadura BrettanomycesDekkera es
menor a la poblacioacuten critica el tiempo de identificacioacuten de esta levadura por
medio liquido es muy prolongado puede tomar maacutes de 10 diacuteas o incluso no
detectarlo
84
Los compuestos quiacutemicos usados para el desarrollo del medio liacutequido no
son los adecuados para este tipo de medios donde los resultados positivos
son olfativos pues estos compuestos emiten fuertes olores que confunden
los olores caracteriacutesticos del caraacutecter Brett
El medio liquido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten
de altas concentraciones de la levadura BrettanomycesDekkera en vino
tinto es raacutepido econoacutemico y uacutetil
93 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg
EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE DALMACIA
CROACIA
Este trabajo mostroacute que el dioacutexido de azufre (SO2) tiene buenos resultados
en contra de la levadura BrettanomycesDekkera en concentraciones
normales de 40mgl concentracioacuten en la que se trabaja este compuesto en
los vinos tintos
En Europa el dioacutexido de azufre es usado de forma tradicional en gran
nuacutemero de alimentos y especialmente en vinos sin embargo y a pesar de
su uso regulado se busca la sustitucioacuten de este o su maacutexima reduccioacuten
para hacer de este producto maacutes sano para las personas no tolerantes a
este tipo de compuestos sin embargo seguacuten el trabajo realizado en
comparacioacuten con el producto Antibrettreg el SO2 es maacutes eficaz en el control
85
de la levadura ayudando a evitarla y eliminarla de la cadena productiva del
vino tinto
Gracias a sus caracteriacutesticas el vino tinto Babic es muy vulnerable a la
levadura BrettanomycesDekkera pero a su vez se puede tratar faacutecilmente
con productos como SO2 y Antibrettreg aunque es maacutes efectivo contra
BrettanomycesDekkera el dioacutexido de azufre (SO2)
Antibrettreg es una buena opcioacuten para el control de BrettanomycesDekkera
para evitar el uso de productos alergenicos como SO2
94 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN
EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO
MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE
Al terminar la primera prueba con anaacutelisis en cromatografiacutea a gas y el SPME
queda como resultados
Es necesario repetir la prueba
No se determina el efecto de los estaacutendares internos sometidos a tiempos
de almacenamiento en temperaturas de 20C y 28C lo que puede dar falsos
resultados de cantidades de compuestos
86
Se debe crear un medio maacutes apto para el desarrollo de la levadura y un
control diario de crecimiento ( agregar maacutes Glucosa en caso de que se
haya consumido toda controlar presencia de Bacterias y otros
microorganismos que no se deseen en el medio)
Es necesario control de aromas con panel sensorial para determinar el
umbral de deteccioacuten en este vino
Control de crecimiento por medio solido Selectivo para
BrettanomycesDekekra conteo de colonias presentes en el vino inoculado
y su desarrollo durante almacenamiento a diferentes temperaturas
La segunda prueba no fue posible realizarla por dantildeos en el equipo de
cromatografiacutea de gas (GC)
87
ANEXOS
11
89
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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Investigacioacuten Enoloacutegica Zaragoza Espantildea
93
11
GRACIAS es una palabra corta para todo lo que quiero expresar a todos aquellos que
hicieron parte de este suentildeo hecho realidadhellip
A Dios y a la virgen Auxiliadora por llevarme de su mano cada diacutea de mi carrera en cada
momento alegre y en cada momento difiacutecil fueron mi fortaleza
A mis papitos por hacer de mi estudio una realidad por su sacrificio y apoyo desinteresado y
sincero
A mi Hermanito por ser mi fortaleza mi ejemplo y mi amigo incondicional
A mi familia Blanco y Urrea por su compantildeiacutea durante esta etapa
A mi facultad (Decano Dr Camilo Rozo Dra Patricia Jimeacutenez y mis profesores) por
ensenarme mi profesioacuten y aportar lo mejor de ustedes para mi formacioacuten personal
A mis asesores de Tesis (Ing Patricia Chaparro y Dr Sc Leo Gracin) por su guiacutea y
colaboracioacuten oportuna
A mis queridos amigos quienes siempre han estado a mi lado en las dificultades y en las
alegriacuteas (Ingrid Mafe Cami G Cami R Harold Pipe Karla Andreacutes T Diego G)
A IAESTE en alianza con el ORI por hacer posible mi intercambio y poder hacer mi tesis en el
maravilloso paiacutes de Croacia
A Croacia por ser mi segundo hogar por abrirme sus puertas y su corazoacuten por brindarme
tan maravillosas personas en mi camino
Croatia Thank you for being my second home for opening your doors and your heart to me
and give me the opportunity to meet so many wonderful people
To my boss my teacher my mentor and specially my friend Leo
To the faculty of food technology and Biotechnology and the department of technology
and analysis of beverages for give me the opportunity to give all my knowledge to the
project and learn a lot more
To all the amazing people I met during this experience (Igor Karin Natka Josip Ana Matija
Daniel Pz Szilvia Dini Daniela Lidija Sanja and everybody else who I had the pleasure to
meet in this great trip) for give me the best of your hearts
I only have one thing to say hellipTHANK YOU
Solo me queda una palabra por decirhellipGRACIAS
15
y otra que lo hace asexualmente (Brettanomyces) Tambieacuten se llaman
respectivamente forma perfecta y forma imperfecta En algunos casos la forma
perfecta y la imperfecta reciben nombres diferentes como ocurre con B anomalus
y D anomala En otros casos el nombre es similar como las pertenecientes a la
especie bruxellensis que pueden parecer como D bruxellensis como B
bruxellensis o como BrettanomycesDekkera A efectos praacutecticos en la bodega
estos dos estados son similares Cuando vemos referencias a Brettanomyces
como contaminante en la mayor parte de los casos se refieren a
DekkeraBrettanomyces ya que este es el responsable de las alteraciones en el
vino18 y 19
La morfologiacutea celular de BrettanomycesDekkera es ojival o ciliacutendrica con
gemacioacuten multipolar en reproduccioacuten vegetativa Una de las caracteriacutesticas de
este geacutenero es su tamantildeo celular variable y la formacioacuten de filamentos19
18 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 23
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
19
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
16
Figura 1 Microfotografiacutea de cultivo de BrettanomycesDekkera a) Variabilidad morfoloacutegica y de
tamantildeo celular b) forma filamentosa
Fuente Lopez-Cordon Eva BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia wwwacenologiacom
Los defectos sensoriales asociados directamente a Brett aparecen
mayoritariamente en vinos tintos de calidad y las causas radican en la propia
fisiologiacutea del microorganismo Ademaacutes al ser una levadura de crecimiento muy
lento la alteracioacuten se presenta principalmente durante el almacenamiento y sobre
todo la crianza del vino habitual en los vinos tintos de gama alta En las barricas
de madera el microorganismo tiene a su disposicioacuten todo el sustrato y tiempo
suficiente para realizar su actividad La naturaleza porosa de la madera y su difiacutecil
limpieza contribuye a que las poblaciones existentes se mantengan incluso
despueacutes del lavado de la barrica Ademaacutes BrettanomycesDekkera tiene la
capacidad de degradar uno de sus componentes la celobiosa 20
13 CARACTERISTICAS FISIOLOGICAS
S cerevisiae y BrettanomycesDekkera tienen metabolismos similares muy
adaptados a las condiciones de vinificacioacuten Tras la fermentacioacuten alcohoacutelica S
cerevisiae es la levadura mayoritaria debido a que las condiciones nutricionales
20
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
17
del vino son muy estrictas (altas concentraciones de etanol y bajas
concentraciones de nutrientes) En este momento BrettanomycesDekkera
continuacutea creciendo gracias a que utiliza nutrientes que S cerevisiae no ha podido
consumir sobre todo algunos azuacutecares y fuentes de nitroacutegeno21
Una de las caracteriacutesticas que diferencia a BrettanomycesDekkera es la gran
diversidad de azuacutecares que puede fermentar (ver tabla de Relacioacuten de los
principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) La mayoriacutea de
las cepas pueden crecer utilizando trealosa y celobiosa azucares presentes en el
vino y no consumibles por S cerevisiae Otra de las ventajas que presenta frente
a S cerevisiae (y frente a la mayoriacutea de las levaduras) es que puede utilizar los
nitratos como fuente de nitroacutegeno Debido a que S cerevisiae soacutelo utiliza el
nitroacutegeno amoniacal y los aminoaacutecidos libres estos se consumen con relativa
rapidez Al final de la fermentacioacuten el nitroacutegeno moniacal es escaso y se favorece
el crecimiento de las levaduras que pueden utilizar otras fuentes de nitroacutegeno
Ademaacutes Brettanomyces puede crecer con concentraciones de fosfato diamoacutenico
tan bajas como 05gl o a partir de diversos aminoaacutecidos En resumen
BrettanomycesDekkera crece maacutes despacio que S cerevisiae es resistente a
concentraciones altas de alcohol puede utilizar otros azucares como fuentes de
energiacutea y nitrato como fuente de nitroacutegeno Esto explica que pueda reproducirse
cuando la fermentacioacuten alcohoacutelica ha terminado a partir de nutrientes no
consumibles por S cerevisiae y cuando no tiene competidores22
21
Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
22 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
18
Tabla 1 Relacioacuten de los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto
Fuente Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista
VINOTEQ N 38 pag 21 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
131 BrettanomycesDekkera y siacutentesis de fenoles volaacutetiles
El origen de los fenoles volaacutetiles estaacute relacionado con la actividad secuencial de
dos enzimas que descarboxilan los aacutecidos en hidroxiestirenos (vinilfenoles) que
19
son posteriormente reducidos a etilderivados (etilfenoles)23 como puede
observarse en la figura 2
Figura 2 Siacutentesis de etilfenoles de BrettanomycesDekkera
Fuente ACE revista de Enologia wwwacenologiacom
El primer paso de descaboxilacion de los aacutecidos hidroxicinamicos es comuacuten
tambieacuten en otros microorganismos como bacterias hongos y otras levaduras Sin
embargo el segundo paso reduccioacuten de vinilfenoles es caracteriacutestico de algunos
tipos de levaduras como Dekkera bruxelliensis D anomala Pichia guillermondi
Candida versarilis C halophila y C mannitofaciens24
Los fenoles volaacutetiles que se asocian al problema Brett en vinos son el 4-etilfenol y
el 4- etilguaiacol asiacute como sus precursores intermedios 4-vinilfenol y 4-
vinilguaiacol aunque estos uacuteltimos son menos importantes por ser muy reactivos y
raacutepidamente convertidos en etilfenoles por BrettanomycesDekkera o en su caso
23
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
24 Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
20
condensan con otras moleacuteculas como antocianos25 Los etilfenoles y
especialmente elevadas concentraciones de 4-vinilfenol en vinos se asocian con
aromas desagradables asociados a descriptores como ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de
caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo26
El umbral sensorial del 4-etilfenol es de 230 μg l-1 y el del 4-etilguaiacol es de 47
μgl Pese a su menor umbral sensorial el 4-etilguaiacol responde a descriptores
como ldquobaconrdquo o ldquoahumadordquo que a bajas concentraciones aportan complejidad por
lo que se puede considerar sensorialmente menos conflitivo que el 4-etilfenol 27
Figura 3 Defectos sensoriales producidos en el vino por BrettanomycesDekkera
Fuente Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
25 Morata A Goacutemez-Cordoveacutes M Calderoacuten F Suaacuterez J 2006 Effects of pH temperature and SO2 on the
formation of pyranoanthocyanins during red wine fermentation with two species of Saccharomyces Journal Food Microbiology No106 pag 4 Madrid Espana
26 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea 27 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
21
132 Identificacioacuten de BrettanomycesDekkera
Los Bioacutelogos usan sistemas de identificacioacuten basados en similitudes taxonoacutemicas
entre organismos dichas similitudes pueden ser morfoloacutegicas tipos capacidad de
produccioacuten de sustratos como azuacutecar yo nitratos caracteriacutesticas fisioloacutegicas y
bioquiacutemicas secuencia del material geneacutetico y respuestas inmunoloacutegicas28
En la industria viniacutecola es importante recurrir a diferentes tipos de pruebas para la
identificacioacuten de microorganismos una de estas y la maacutes realizada es la revisioacuten
del microorganismo bajo el microscopio Esta prueba brinda informacioacuten sobre la
morfologiacutea del microorganismo (cocos bacilos formas puntudas ojival entre
otros) tamantildeo (dimensiones) agrupaciones celulares (solas parejas triacuteos
grupos o cadenas) Sin embargo el uso del microscopio es una prueba raacutepida
para examinar mostos o vino pero no determina cantidades que muchas veces es
requerido para tratamientos de accioacuten otro de los inconvenientes es que los
microorganismos pueden variar su morfologiacutea en forma o tamantildeo dependiendo de
la edad y las condiciones de crecimiento por lo que puede no ser clara la
identificacioacuten de este29
14 Medios soacutelidos selectivos
Si se requiere de la confirmacioacuten del microorganismo este debe ser aislado del
vino para una caracterizacioacuten para esto se requiere de medios soacutelidos Cuando se
examina un microorganismo en un medio solido es importante revisar las
caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias (ver figura 4 Morfologiacuteas de colonias
en medios soacutelidos) Entre estas caracteriacutesticas estaacuten forma (circular irregular o
2829 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
22
rizada) tamantildeo (dimensiones estas normalmente se expresan en miliacutemetros)
topografiacutea (plano elevado convexo coacutencavo o embonado) presencia de
pigmentos opacidad (transparente traslucido u opaco) superficie (suave rugosa
lisa o aacutespero) bordes (entero ondulado crespo dentado rizado) o cualquier
cambio en el agar (color opacidad cambios en los indicadores de pH o CaCO3
respectivamente)30
Figura 4 Varias morfologiacuteas de crecimiento de colonias en medio solido
Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007
Gran nuacutemero de medios selectivos se han creado para la aislacioacuten deteccioacuten yo
conteo de levaduras provenientes de jugos de uva mostos o vinos El medio maacutes
utilizado en estos fines es YPD (Yeast Peptone Dextrose) pero dicho medio no
es selectivo entre levaduras y se usa comuacutenmente para el conteo de
Saccharomyces31 Las colonias empiezan a parecer con un periodo de incubacioacuten
30
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
31 Essia Ngang J Wolniewicz E Villa P2005 Stimulation of lactobacilli during alcoholic fermentation action
of sucrose hydrolysis by yeast Biotechnology letters No 8 pag 743 Amiens France
23
de 2 a 4 diacuteas a 22C a 25C Igualmente el agar de jugo de uva es no selectivo y
presenta faacutecil crecimiento de levaduras bacterias y mohos
Para la levadura Brettanomyces Dekkera se han elaborado diferentes medios
selectivos entre ellos el maacutes conocido es WL por sus siglas en ingles del
laboratorio que lo creo ldquoWallerstein Laboratoriesrdquo este medio contiene
cicloheximida compuesto selectivo para Brettanomyces e inhibe Saccharomyces
El punto criacutetico es encontrar la cantidad exacta de este compuesto para la
inhibicioacuten de las levaduras sin que afecte a BrettanomycesDekkera32
Ademaacutes del medio WL BrettanomycesDekkera puede ser cultivado en otros
medios selectivos como Brettanomyces medio A creado por Vilas en 1993
Brettanomyces medio B el cual contiene cicloeximida como agente selectivo
mientras que Brettanomyces medio C tiene cicloheximida y ampicilina este medio
fue creado por B Watson en 1998 Brettanomyces medio D fue creado
recientemente por Rodrigues en 2001 este medio es conocido como DBDM
(DekkeraBrettanomyces differential medium ) es un medio selectivo para
Brettanomyces en contra de Saccharomyces y otras levaduras este medio es el
maacutes utilizado en la vineras para caracterizacioacuten de BrettanomycesDekkera
actualmente33
15 Dioacutexido de azufre (SO2) en vinos
32
33
Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers
GmbH United States of America and Canada
24
El dioacutexido de azufre tambieacuten llamado oxido de azufre es un eficaz agente
conservante antioxidante y antimicrobiano en la industria viniacutecola34
Durante la vinificacioacuten SO2 ha representado histoacutericamente una herramienta muy
importante usada por los vinicultores para el control de crecimiento microbioloacutegico
Debido a preocupaciones por la salud del consumidor el uso de este producto ha
disminuido dramaacuteticamente con el posible riesgo de aumentar el riesgo
microbioloacutegico35
El actual liacutemite legal de SO2 en vinos en los Estados Unidos es de 350mgL una
concentracioacuten mucho mayor a la usada en la industria viniacutecola No obstante vinos
que contienen maacutes de 10mgL deben declarar este compuesto en la etiqueta
porque SO2 es un metabolito que las levaduras usan durante la fermentacioacuten Los
vinos siempre contienen algo de sulfitos aunque la adicioacuten no se realice durante el
proceso36
151 Formas del Dioacutexido de Azufre (SO2)
Una vez disuelto en agua el dioacutexido de azufre existe en equilibrio entre SO2
molecular (SO2H2O) bisulfito (HSO3) y sulfito (SO32-) Este equilibrio depende del
pH Ademaacutes de estar en equilibrio con el molecular y especies sulfito el bisulfito
tambieacuten existe en forma ldquolibrerdquo y en forma ldquoatadardquo Aquiacute la moleacutecula reaccionara
34
Orwine Eureka 2008Investigadores europeos buscan alternativas al dioxido de azufre en vinos
httpawprowordpresscom20081107investigadores-europeos-buscan-alternativas-al-dioxido-de-
azufre-en-el-vino
3536 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
25
con compuestos carbonilos (ej Acetaldehiacutedo) formando productos adicionales
como Acido Hydroxysulfonico 37
Ademaacutes de Acetaldehiacutedo algunas moleacuteculas presentes en el jugo de uva que
reaccionan con bisulfito son acido piruvico α-keto-glutaric dihidroxyacetona
diacetyl Pigmentos de antocianinas entre otros38
152 Inhibidor Microbiano
El sulfuro molecular es la forma antimicrobiana del dioacutexido de azufre La cantidad
de SO2 molecular presente en cualquier vino no se mide directamente La
concentracioacuten es calculada conociendo la concentracioacuten de SO2 libre y el pH del
vino basaacutendose en la siguiente foacutermula
Alternativamente la figura 5 Se puede utilizar como guiacutea para aproximar la
cantidad de SO2 libre necesitada a determinado valor de pH de valores entre 05 o
08 mgl de SO2 molecular 39
El SO2 inhibe microorganismos de varias formas incluyendo rupturas de puentes
bisulfitos en proteiacutenas y reaccionando con coofactores como NAD+ y FAD tambieacuten
reacciona con ATP
3739
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
38 Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi
Springer New York United States
26
Figura 5 Cantidades de SO2 libre a un pH determinado para obtener 05 o 08 mgl de SO2
molecular
Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007
La concentracioacuten de SO2 molecular necesario para prevenir el crecimiento de
microorganismos variacutea seguacuten vinojugo pH temperatura poblacioacuten densidad y
diversidad estado de crecimiento grado de alcohol entre otros factores Beech
1979 sugirioacute una adicioacuten de 08 mgl de SO2 molecular como la cantidad
necesaria del compuesto en vinos blancos de mesa para dar una reduccioacuten de
cerca de 104 UFCml de la poblacioacuten de diferente tipo de microorganismos en 24
horas Las diferencias que existen entre las levaduras y bacterias en base a la
27
sensibilidad a este compuesto son dadas a conocer por diferentes autores (Warth
1977 1985 Du Toit 2005 Davis 1988 Hood 1983)40
16 Antibrettreg como alternativa de prevencioacuten y eliminacioacuten de
BrettanomycesDekkera
Antibrettreg es un producto nuevo creado por Spindal SARL-Gretz - Armainvilliers
Francia Es una preparacioacuten enzimaacutetica para inactivar Brettanomyces y para
reducir olores producidos por fenoles volaacutetiles41
Antibrettreg es preparado a base de paredes celulares de levadura activados
enzimaacuteticamente que presentan elevadas propiedades adsorbentes frente al 4-
etilfeno y 4- etilguayacol compuestos asociados con olores desagradables en el
vino tales como sudor de caballo farmacia o barniz42
Antibrettreg inhibe la produccioacuten de la vinilreductasa que participa en la
transformacioacuten de los aacutecidos cinaacutemicos naturalmente presentes en los vinos en
los correspondientes derivados etilados responsables de los olores atribuidos a
BrettanomycesDekkera 43
40
Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi
Springer New York United States
41 Manual de instrucciones de producto Antibrett reg producido por Spindal SARL-Gretz -
Armainvilliers France
424344 AEB Group 2008 ANTIBRETT Preparado a base de paredes celulares de levadura para la inactivacioacuten
de Brettanomyces y la eliminacioacuten de los olores de estos productos httpwwwaeb-
groupcomimgsSPAGNOLODepliantANTIBRETT-lett-ESPpdf
28
El uso de Antibrettreg es efectivo incluso contra otros olores anoacutemalos como los
que se generan en las barricas sucias principalmente huacutemedas dantildeando la
calidad olfativa del vino44
29
2 PROBLEMA
La levadura BrettanomycesDekkera es una levadura de contaminacioacuten presente
en la mayoriacutea de industrias viniacutecolas en el mundo Afecta directamente la
produccioacuten y calidad sensorial de los vinos con el desarrollo de los compuestos 4
etilfenol y 4 etilguayacol los cuales dantildean el perfil olfativo del vino dando aromas
caracteriacutesticas a ldquoestablordquo ldquocuerordquo ldquosudor de caballordquo o ldquobarnizrdquo conocido como
ldquocaraacutecter Brettrdquo
Esta contaminacioacuten se da especialmente en los vinos tintos debido a sus
caracteriacutesticas de produccioacuten (fermentacioacuten crianza antildeejamiento) y sus
propiedades fisicoquiacutemicas (Grado alcohoacutelico pH Acidez total Acidez volaacutetil
entre otros)
En Croacia existe una gran produccioacuten de vinos tintos entre los cuales se
encuentra el vino tinto Babic proveniente de la isla de Hvar el cual es famoso por
ser un vino duro carnoso estructurado y casi sobre-maduro con un grado
alcohoacutelico que ronda los 15 vv siendo la primera denominacioacuten de origen que
se aproboacute en Croacia en el antildeo 1961 este vino es de gran importancia en la
regioacuten la mayoriacutea de sitios de elaboracioacuten son pequentildeas industrias que han sido
afectadas por el bdquocaraacutecter Brett‟ Muchas investigaciones se han realizado al
respecto de la levadura BrettanomycesDekkera pero se conoce muy poco sobre
sus efectos en el vino Babic debido a sus caracteriacutesticas particulares (alcohol
30
15 pH 35 Acidez total 520 gr Acido TartaricoL Acidez volaacutetil 08 gr Acido
AceticoL Azucar residual 47 grLt)45
La dificultad de la pequentildea industria para acceder a productos que lleven a la
identificacioacuten de la levadura mencionada y de esta manera conllevar a planes de
accioacuten contra el ldquocaraacutecter Brettrdquo es una de las grandes dificultades de la industria
vinera en este paiacutes en donde los productos para la industria enoacuteloga son
complicados y de alto precio para acceder a ellos y en consecuencia no se
realizan muchas de estas pruebas de deteccioacuten de BrettanomycesDekkera
llevando al mercado productos contaminados de baja calidad que inicialmente
podriacutea haber sido un vino de alta calidad debido a sus caracteriacutesticas uacutenicas y de
gran popularidad
45
Datos obtenidos en el laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
31
3 JUSTIFICACION
Actualmente Croacia cuenta con maacutes de 300 zonas vineras en las que se producen 67
de vino blanco 32 vino tinto y el restante 1 vino rosado De acuerdo a recientes datos
estadiacutesticos hay 650 km2 de vintildeedos en Croacia de los cuales 375 km2 son uvas con
indicacioacuten geograacutefica de origen que producen maacutes de 300 vinos y maacutes de la mitad de este
nuacutemero son vinos elaborados en microempresas con un total de 50000000 de botellas
de vino el 8 es vino superior 70 de calidad y el 22 es vino de mesa de produccioacuten
nacional46
Croacia es un fuerte productor de vino a nivel regional con sus diferentes variedades
propias (Merlot Plavac Dingač Postup Malvazija Pošip Kujundžuša Babic) pero dicha
produccioacuten ha sido fuertemente afectada por la presencia de la levadura
BrettanomycesDekkera trayendo consecuencias como perdidas de produccioacuten peacuterdida
de calidad sensorial del vino grandes peacuterdidas econoacutemicas y desprestigio a sus vinos de
denominacioacuten de origen
Es por esto que en este proyecto de investigacioacuten se busca una faacutecil y raacutepida
identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera causante del ldquocaraacutecter Brettrdquo con el
desarrollo de medios selectivos liquido y solido ademaacutes de opciones para el tratamiento
yo prevencioacuten de esta levadura en la cadena productiva comparativamente entre dioacutexido
de azufre (SO2 ) y Antibrettreg y la identificacioacuten de los aromas caracteriacutesticos del ldquocaraacutecter
Brettrdquo en el vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia
46
Hrvatski zavod za vinogradarstvo i vinasrtvo 2003 Pravilnik o vinu httpwwwhrzvvhrpropisihtm
32
4 OBJETIVOS
41 General
Caracterizar y evaluar el comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera
en teacuterminos de crecimiento y produccioacuten de aromas no deseados en vino tinto
Babic
42 Especiacuteficos
Desarrollar el medio solido y medio liacutequido selectivo para
BrettanomycesDekkera
Evaluar el comportamiento de la levadura en estos medios selectivos
Determinar la influencia del Dioacutexido de azufre (SO2) y el compuesto
Antibrettreg en la levadura BrettanomycesDekkera presente en vino tinto
Babic 2007
Identificar los compuestos aromaacuteticos producidos por Brettanomyces
bruxellensis en vino tinto Babic usando el meacutetodo ldquomultiple headspace
solid-phase microextraction (SPME)rdquo
33
5 ALCANCES
En este proyecto se pretende desarrollar un medio selectivo faacutecil de producir en
donde sea raacutepida la identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera en la
produccioacuten de vinos tintos se realizaran pruebas para corroborar el crecimiento de
esta levadura en el medio determinando el tiempo que esta levadura toma en
adaptarse en el medio y su comportamiento en este una vez comprobada su
adaptacioacuten al medio liquido se trabajara con el meacutetodo de cromatografiacutea de gas
(GC) y el uso de micro extraccioacuten en fase solida (SPME) para el anaacutelisis
cuantitativo de los compuestos volaacutetiles (4-etil-fenol 4-etil-guayacol4-vinilfenol y
4-vinil-guayacol) y posteriormente con el vino tinto Babic Ademaacutes se desea
comprobar la efectividad de los productos con que las vineras de Croacia inhiben
o eliminan la presencia de la levadura en los vinos tintos como lo son el producto
AntiBrettreg y el Dioacutexido de azufre (SO2)
34
6 ESTADO DEL ARTE
Sobre el campo problemico causado por la levadura BrettanomycesDekkera en la
industria viniacutecola se han realizado bastante investigaciones a nivel de
caracterizacioacuten de la levadura los factores fisicoquiacutemicos que favorecen el
crecimiento de la levadura meacutetodos de prevencioacuten y control evaluacioacuten de
dantildeos sensoriales en diferentes tipos de vinos formacioacuten de compuestos fenoacutelicos
en los diferentes tipos de vino otros compuestos no fenoacutelicos asociados al
ldquocaraacutecter Brettrdquo teacutecnicas de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera
evaluacioacuten de la teacutecnicas de control e inhibicioacuten de dicha levadura desarrollo de
nuevos medios de deteccioacuten y aislamiento de la levadura relacioacuten entre la
levadura BrettanomycesDekkera con las otras levaduras presentes en el vino
entre otros
Seguacuten estas investigaciones se analizan aquellas que pueden aportar datos
importantes para el desarrollo del trabajo que se quiere realizar y se tiene en
cuenta sus metodologiacuteas conclusiones recomendaciones y comentarios
Entre las importantes para el planteamiento de este trabajo se menciona el trabajo
realizado por la Universidad Politeacutecnica de Madrid Espantildea el cual analiza
algunas de las caracteriacutesticas maacutes relevantes de este geacutenero de levaduras su
crecimiento en bodega factores fisicoquiacutemicos que favorecen su crecimiento y
desarrollo en el vino los defectos sensoriales que presenta en los vinos y estudia
algunas de los meacutetodos fiacutesicos para el control de BrettanomycesDekkera en vino
35
(clarificacioacuten filtracioacuten amicrobica proteiacutenas clarificantes anhiacutedrido sulfuros
dimetil dicarbonato Aditivos)47
Para conocer maacutes sobre la levadura en condiciones de barrica y almacenamiento
se revisa el articulo elaborado en el Departamento Teacutecnico Guserbiot La rioja
Espantildea en este artiacuteculo se describe brevemente su metabolismo y su ecologiacutea en
las bodegas Igualmente se comparan las teacutecnicas utilizadas en los laboratorios
para su deteccioacuten y cuaacuteles son las limitaciones de los diferentes meacutetodos
Finalmente se analizan las estrategias desarrolladas para su eliminacioacuten de las
bodegas y se dan una serie de recomendaciones para su control48
El instituto de fermentaciones Industriales Consejo superior de investigaciones
cientiacuteficas Juan de Cierva Madrid Espantildea en el cual se revisa la formacioacuten de
etilfenoles (4 etil-fenol 4 etil guayacol) en vinos tintos anejos Los factores
fisicoquiacutemicos que favorecen el crecimiento de la levadura no deseada
BrettanomycesDekkera las teacutecnicas usadas para la detectar la presencia de esta
levadura en vinos ( Revisioacuten microscoacutepica fluorescente remocioacuten de aacutecidos
grasos de su membrana teacutecnicas moleculares como PCR y electroforesis) y de
control (Proteiacutenas fining Fining con gelatina liquida filtracioacuten variables
fisicoquiacutemicas adicioacuten de aditivos procedimientos de altas presiones
manipulacioacuten geneacutetica) con esta investigacioacuten se concluye que la combinacioacuten y el
uso de las numerosas teacutecnicas pueden ayudar a la prevencioacuten y reduccioacuten de la
levadura BrettanomycesDekkera 49 Este trabajo muestra las muacuteltiples opciones
47
A Morata S Benito F Palomero F Calderoacuten y J A Suaacuterez-Lepe Ecologiacutea y prevencioacuten de
BrettanomycesDekkera durante la elaboracioacuten y crianza de vinos tintos Revista enoacutelogos (Editada por la
Federacioacuten Espantildeola de Asociaciones de Enoacutelogos y Periodistas Asociados) No 50 paacuteg 1-12 Madrid Espantildea
48 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 20-
24 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
49 R Suarez JA Suarez-Lepe A Morata F Calderon 2006 The production of ethyl phenols in wine by yeasts
of the genera Brettanomyces and Dekkera A review Journal Food Chemistry No 102 pag 10-21 Madrid
Espantildea
36
existentes en el control y prevencioacuten de la levadura mencionada sin embargo deja
claro que la mayoriacutea de estas opciones son costosas y no de faacutecil adquisicioacuten para
una pequentildea industria
El anaacutelisis sensorial ha sido de los aspectos maacutes estudiados al respecto de
BrettanomycesDekkera una de estas investigaciones fue realizada en Centre
Europeacuteen des Sciences du Goucirct en Talence Francia en el cual se evaluaron 50
vinos bordeaux sensorialmente para demostrar la complejidad del ldquoCaraacutecter Brett‟‟
al cual se unen otros compuestos aromaacuteticos ademaacutes de los fenoacutelicos como acido
isobutirico e isovalerico en este tipo de vino debido a sus caracteriacutesticas
fisicoquiacutemicas50
De los meacutetodos de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera los medios
selectivos son muy populares es por esto que el Laboratorio de Microbiologiacutea
Departamento de Botanica e Engenharia Biologica Instituto Superior de
Agronomia Lisboa Portugal realizo un trabajo en el cual se pretendia desarrollar
un medio selectivo o diferencial capaz de aislar la levadura
BrettanomycesDekkera del vino y de la cadena productiva del vino con el fin de
detreminar la relacioacuten entre esta levadura y los compuestos 4-etilfenol y 4 etil-
guayacol51 otro estudio realizado para la deteccioacuten de dicha levadura fue
realizado en la Escola Superior de Biotecnologiacutea Universidade Catoacutelica
Portuguesa el desarrollo de un simple procedimiento compatible con las rutinas
50 Andrea Romano a Marie Claire Perello a Aline Lonvaud-Funel Gilles Sicard Gilles de Revel2008 Sensory
and analytical re-evaluation of lsquolsquoBrett characterrdquo Journal Food Chemestry No 114 pag 15-19 Talence
France
51 N Rodrigues G Gonccedilalves S Pereira-da-Silva M Malfeito-Ferreira and V Loureiro2001 Development
and use of a new medium to detect yeasts of the genera DekkeraBrettanomyces Journal of applied microbiology No 90 pag 588-599Lisboa Portugal
37
usadas en las vineras para la deteccioacuten de BrettanomycesDekkera en vino y en
maquinarias52
En el laboratorio de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas Alcohoacutelicas de la
Universidad de Zagreb se ha trabajado anteriormente en el desarrollo de medio
solido selectivo con pruebas de diferentes concentraciones de los compuestos
como resultados se encuentra una buen relacioacuten entre las concentraciones de los
compuestos sin embargo como recomendaciones se encuentran la falta de
antibioacutetico para evitar contaminacioacuten por bacterias probar con diferentes fuentes
de carbono para comparacioacuten de tiempo de crecimiento positivo y un monitoreo
diario en el medio53
Los compuestos aromaacuteticos que libera la presencia de BrettanomycesDekkera
estaacute asociada a los compuestos 4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinilfenol y 4
viniguayacol a partir de esto los centros de investigacioacuten han hondado en la
identificacioacuten de dichos compuestos relacionados en la enologiacutea y especialmente
con BrettanomycesDekkera a partir de eso el Departamento de Quiacutemica
Universidad de La Rioja Espantildea este estudio presenta un meacutetodo basado en el
uso de Cromatografiacutea de Gas y micro extraccioacuten en fase solida para el anaacutelisis
cuantitativo de 4-etilfenol 4-etil guayacol 4-vinilfenol 4-vinilguayacol
Demostrando la existencia de un efecto matriz en el anaacutelisis de compuestos
responsables del ldquocaraacutecter Brettrdquo en vino Este nuevo meacutetodo fue
satisfactoriamente aplicado a cierto nuacutemero de vinos tintos comerciales vinos
52
JA Couto A Barbosa and T Hogg 2005 A simple cultural method for the presumptive detection of the yeasts BrettanomycesDekkera in wines Letters in Applied Microbiology No 41 pag 505-510 Porto
Portugal
53 Serkovic Dubravka Gracin Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac
Brettanomyces bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet pag 1-117 ZagrebCroatia
38
blancos y roseacute Este meacutetodo puede ser una alternativa para evitar el efecto matriz
en muestras de vino54
De acuerdo con este tema en la jornada cientiacutefica del 99 el grupo de investigacioacuten
enoloacutegica se estudio la formacioacuten de sustancias volaacutetiles por 13 cepas de S
cerevisiae con buenas aptitudes enoloacutegicas inoculadas individualmente en un
mosto homogeacuteneo de la variedad airen fermentado en las mismas condiciones
de aireacioacuten y a temperatura controlada55
54
C Pizarro N Perez-del-Notario JM Gonzalez-Saiz 2007 Determination of Brett character responsible
compounds in wines by using multiple headspace solid-phase micro extraction Journal of Chromatography
No 1143 pag 176-181 La Rioja Espantildea
55 E Pueyo P Hidalgo K Fernaacutendez y P Martiacuten-Aacutelvarez 1999 Anaacutelisis de compuestos volaacutetiles en vinos
obtenidos con distintas cepas de Saccharomyces cerevisiae Aplicacioacuten de la teacutecnica de microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientificas 99 Grupos de Investigacion Enologica Zaragoza Espana
39
7 MATERIALES Y METODOS
A continuacioacuten se presentan materiales y meacutetodos para la investigacioacuten
Este proyecto fue realizado en su gran mayoriacutea en las instalaciones de la
Universidad de Zagreb en la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos
(PBF) Laboratorios del Departamento de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas
Alcohoacutelicas ubicado en la ciudad de Zagreb Croacia
Los anaacutelisis fisicoquiacutemicos del vino tinto Babic fueron realizados en los
laboratorios de VINOLAB ubicado en Zagreb Croacia
71 MEDIO SOLIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera
711 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Autoclave de laboratorio
Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa Etanol peptona extracto de levadura
agar cicloheximida acido cumaacuterico ampicilina)
Balanza electroacutenica de precisioacuten
Microscopio oacuteptico
712 Metodologiacutea
Basados en estudios anteriores realizados en el laboratorio para el desarrollo de
medio solido selectivo para BrettanomycesDekkera (Serkovic Dubravka Gracin
40
Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac Brettanomyces
bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet Universidad de Zagreb pag 1-
117 Zagreb Croacia) se evaluaron las recomendaciones mencionadas en dicha
investigacioacuten para la mejoriacutea y desarrollo de otros medios soacutelidos selectivos
Se usoacute como base el medio YPD (Yeast Peptone Dextrose) el cual estaacute
compuesto de la siguiente forma 20gL peptona 10 gl extracto de levadura 20 gl
de agar56 este medio es selectivo para levaduras pero no es selectivo entre ellas
Es necesario el uso de una fuente de carbono para la levadura
BrettanomycesDekkera de acuerdo a la teoriacutea y revisando la tabla 1 (Relacioacuten de
los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) y seguacuten
facilidades de disponibilidad en el laboratorio se utiliza glucosa la cual es
utilizable por entre 75-100 de las cepas de BrettanomycesDekkera seguacuten la
tabla mencionada anteriormente
Esta fuente de carbono (Glucosa) fue probada en una concentracioacuten de 20 gL
Cicloheximida fue probada a 30 mgL para inhibir Saccharomyces en el medio y
darle mayor selectividad para Brettanomyces Dekkera Se antildeade acido p-
cumarico en una concentracioacuten de 100 mgL como precursor para la formacioacuten
del compuesto 4 etilfenol caracteriacutestico de la levadura BrettanomycesDekkera
Para inhibir bacterias en el medio se usa ampicilina a 10 mgL esta se agrega
despueacutes de realizada la esterilizacioacuten y cuando la temperatura del medio este
igual o menor a 40C El pH del medio se ajusto a 5
Paralelamente se crea el medio con Etanol como fuente de carbono en una
concentracioacuten de 6 o 60 mlL con la misma concentracioacuten de los otros
compuesto como cicloheximida 30mgL acido cumarico 100mgL 20 gL peptona
10 gL de extracto de levadura 16gL de agar Este medio se crea como
56
Concentraciones preestablecidas en el laboratorio de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas alcoholicas
41
comparativo para determinar cual fuente de carbono es la maacutes utilizada por la
levadura Brettanomyces bruxellensis para su reproduccioacuten Seguacuten la teoriacutea (ver
tabla 1) el etanol es utilizado por entre 25-75 de las cepas de
BrettanomycesDekkera pero es el azuacutecar que se encuentra en mayor
concentracioacuten presente en los vinos tintos aproximadamente 130 gl57
Estos medios fueron debidamente esterilizados para eliminar cualquier
microorganismo o espora presente en este Este procedimiento se realizo por el
meacutetodo de combinacioacuten de altas temperatura y presioacuten (Autoclave 121 C a 1034
kPa)
Se usaron colonias de BrettanomycesDekkera aisladas anteriormente de vinos
contaminados y guardas para investigaciones en el Departamento de Tecnologiacutea y
Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos
Universidad de Zagreb Croacia
Los medios fueron monitoreados visualmente todos los diacuteas y se toman
observaciones de macroscoacutepicas y microscoacutepicas Se comparan estos dos medios
en teacuterminos de rapidez de crecimiento de la levadura y selectividad Estas
muestras fueron incubadas a 28C por 10 diacuteas
La prueba fue realizada por duplicado en diferentes tiempos
57
Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
42
72 MEDIO LIacuteQUIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera
721 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Frascos de vidrio esteacuteriles
Autoclave de laboratorio
Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa peptona extracto de levadura
cicloheximida acido cumarico ampicilina etanol)
Microscopio oacuteptico
Balanza electroacutenica de precisioacuten
722 Metodologiacutea
En el mercado para enologiacutea existen medio liacutequidos selectivos para la deteccioacuten
de BrettanomycesDekkera en vinos sin embargo estos son de difiacutecil accesibilidad
por sus elevados precios es por esto que se desarrolla un medio liquido selectivo
para dicha levadura en el laboratorio del Departmaneto de Tecnologiacutea y Anaacutelisis
de Bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia
Para este medio se toma como base el medio selectivo con Glucosa como fuente
carbono desarrollado anteriormente sin usar agar para mantener el medio en su
estado liquido
43
La composicioacuten de este medio liacutequido es la siguiente
20 gL Glucosa
20 gL peptona
10gL extracto de levadura
30mgL de cicloheximida
100mgL acido p-cumarico
10 mgL ampicilina
Estos compuestos fueron medidos en una balanza electroacutenica de precisioacuten se
antildeade 250 ml de agua destilada y se mezcla constantemente se pasa a proceso
de esterilizacioacuten en autoclave a 120C y 1034 KPa por 45 minutos
De esta forma se asegura la usencia de microorganismos yo esporas en el
medio Despueacutes de bajar la Temperatura a 40C se agrega a la mezcla ampicilina
en una concentracioacuten de 10mgL
En frascos de vidrio esteacuteril se agrega 40 ml de medio liacutequido y diferentes
cantidades iniciales de levaduras BrettanomycesDekkera fueron inoculadas al
respectivo medio el primer frasco tiene una cantidad de 106 ceacutelulasml el segundo
tiene 104 ceacutelulasml el tercero tiene 102 celulasml y el cuarto con una cantidad
aproximada de 25 ceacutelulasml Estas cantidades estaacuten basadas en estudios
anteriores para medios liacutequidos selectivos en levaduras58
58 J Ungar A M James P W Muggleton H F Pegler y E G Tomich1950 The Cultivation of
Haemophilus pertussis in Partially Defined Liquid Media Journal of General Microbiology No 4
pag 345-359 Greenford
44
Este medio liacutequido inoculado fue inspeccionado diariamente visualmente revisioacuten
de turbidez microscoacutepicamente y olfativamente para deteccioacuten de olores del
ldquocaraacutecter Brettrdquo
Los diacuteas fueron contabilizados para determinar resultados positivos en estos
ensayos
73 INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN
VINO TINTO DE LA REGION DE DALMACIA CROACIA
731 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Medio selectivo solido para BretanomycesDekkera
Medio selectivo Liquido para BrettanomycesDekkera
Quiacutemicos de laboratorio (Dioxido de Azufre (SO2) Antibrettreg Glucosa)
Vino Babic 2007
Anallizador infrarojo Bacchius II microdom
732 Metodologiacutea
Con los medios desarrollados (solido y liquido) se quiere conocer el efecto del
dioacutexido de azufre (SO2) y el producto Antibrettreg en la levadura
BrettanomycesDekkera presente en el vino tinto de la regioacuten de Dalmacia
Con las herramientas que se tienen en el laboratorio del departamento de
tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia se quiere
determinar la influencia de estos productos en la levadura BrettanomycesDekkera
presente en vino tinto croata de la regioacuten de Dalmacia Babic
45
El primer paso es adaptar la levadura al vino tinto croata (Babic) para esto se
inoculan 20 colonias de BrettanomycesDekkera en 500 ml de vino se antildeadioacute
glucosa en una concentracioacuten de 2gL y se oxigena la mezcla Para este paso de
adaptacioacuten se dejan las muestras de 1 a 2 diacuteas a temperatura ambiente (20C)
Despueacutes de este periodo se revisa microscoacutepicamente la presencia positiva de
BrettanomycesDekkera en los 500 ml de vino en los que se estaba haciendo el
paso de adaptacioacuten en Babic al comprobar su presencia positiva se procede a
mezclar los 500 ml de vino contaminado con BrettanomycesDekkera con los 3
Litros de vino Babic que se disponen para esta prueba
Estos 3 litros de vino tinto Babic contaminado con la levadura
BrettanomycesDekkera se reparten en 8 frascos de vidrios esteacuteriles al siguiente
diacutea se toman dos frascos para agregar cada uno de los compuestos a evaluar
(SO2 y Antibrettreg)
Para SO2 se toman dos frascos uno de 600ml y uno de 100ml se agrega una
concentracioacuten de 40 mgl
Para el producto AntiBrettreg se toman cuatro frascos dos de 600 ml y dos de 100
ml seguacuten especificaciones del producto y la alta poblacioacuten de
BrettanomycesDekkera en las muestras se adiciono la maacutexima concentracioacuten de
AntiBrettreg a las muestras la cual fue de 40 gHl
Estas muestras se dejaron a temperatura ambiente simulando condiciones de
almacenamiento del vino en barricas temperatura aproximada de 20C evitando el
contacto con la luz solar y evitando movimientos fuertes Esto se mantuvo por 15
diacuteas que fue el tiempo de duracioacuten del experimento
Con el vino restante se mantuvo en las mismas condiciones de almacenamiento
de los demaacutes para hacer un paralelo de comparacioacuten
Previamente se analizaron las caracteriacutesticas del vino sin contaminar por medio
del analizador infrarrojo Bacchus II microdom antes de agregar los compuestos
46
SO2 y AntiBrettreg y despueacutes se volvioacute a realizar el anaacutelisis para determinar los
efectos de estos compuestos en el vino y asiacute mismo al de control
74 DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN
EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO
MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE
741 Materiales
Cromatografo de Gas HP5890 Serie II
Microextractor de fase solida (SPME)
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Quiacutemicos de laboratorio (p-cresolAcetaldehido Propanol diacetil etil-
acetato i-butanol acido aceacutetico i-amil-alcohol n-amil lactato de etilo
acetato amil metiacutelico 1-hexanol etil-hexanol linalol nerol citronelol
geraniol 2-feniletanol octanoato de etilo 4-etilfenol 2-feniletil acetato 4-
etilguaiacol)
Vino Tinto Babic
Agua destilada
742 Metodologiacutea
El meacutetodo fue desarrollado anteriormente en el Departamento de Tecnologiacutea y
Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos de
la Universidad de Zagreb Croacia Y despueacutes de modificaciones fue utilizado en el
desarrollo del trabajo El meacutetodo utilizado es descrito a continuacioacuten
47
Cromatografo de gas HP 5890 SERIES II
Programa HP-chem
a) Condiciones para analisis SPME-GC
Muestra diluida 5050 con adicion de estandar interno (p-cresol1mgl)
25ml de la muestra diluida con mezcla continua a temperatura ambiente
Tiempo de adsorcion 30 minutos
SPME es colocado en la muestra para la adsorcion durante el tiempo
previsto
b) Condiciones para el Cromatografo de gas (GC)
La columna usada en este experimento es RTXreg-5 (Restec USA sn 210627)
30m id=025mm 025μm
Gas portador Nitrogeno
Flujo del Nitrogeno 5 mlmin
Temperatura del inyector 240 C
Temperatura del detector 250 C
Temperaturas programadas 35 C5 min 150 C 34 Cmin 180 C
10Cmin 190 C 5 Cmin
Se conocen los resultados del cromatografiacutea de gases (ver tabla 10) y se hacen
necesarias varias correcciones del meacutetodo y algunas pruebas con unos
compuestos para determinar realmente su tiempo de retencioacuten en este tipo de
vino Se deben comprobar tiempos de retencioacuten
48
8 DISCUSIOacuteN Y RESULTADOS
81 RESULTADOS PARA EL DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO
Tabla 2 Medio Selectivo con Glucosa como fuente de carbono para
BrettanomycesDekkera en incubacioacuten por 5 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten
microscoacutepica
1 Negativo Negativo - No se realiza
2 Negativo Negativo - Presencia de levaduras
3 Negativo Negativo - Presencia de
Levaduras
4 Aparicioacuten de
algunas colonias
Negativo Transparente Presencia de levaduras
5 Colonias definidas Positivo-
Fenoles
Amarillo Presencia positiva de
BrettanomycesDekkera
49
Este medio tiene alto grado de selectividad para levaduras con un tiempo de
crecimiento de aproximadamente 5 diacuteas en 28C lo que lo hace raacutepido gracias al
antibioacutetico (ampicilina) que hace parte de la composicioacuten del medio no hay
presencia de bacterias Se hace confiable para resultados positivos de levaduras
BrettanomycesDekkera debido a que las levaduras Saccharomyces fueron
inhibidas con el compuesto cicloheximida su selectividad fue comprobada por
revisioacuten microscoacutepica macroscoacutepica y sensorial
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con glucosa como fuente de carboacuten son las
siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
50
Tabla 3 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono para Brettanomyces Dekkera en
incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica
1 Ninguno Negativo - -
2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras y
bacterias
9 Diminutas
colonias
transparentes
Negativo Transparentes Presencia de levaduras y
algunas bacterias
10 Positivo Positivo-
Fenoacutelicos
Amarillo Presencia de levaduras
BrettanomycesDekkera y
bacterias
El medio selectivo para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de
carbono tambieacuten es selectiva entre levaduras ya que solo se identifico la levadura
BrettanomycesDekkera en este sin embargo se evidencia una presencia de otro
microorganismo presuntamente bacteria ya que este medio no contiene agente
antibacteriano (ampicilina) Es necesaria la adicioacuten de ampicilina en una
concentracioacuten de 10mgl para inhibir la presencia de bacterias
Este medio presenta un tiempo maacutes prolongado para mostrar crecimiento de la
levadura BrettanomycesDekkera aproximadamente 10 diacuteas
51
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las
presentadas en el medio selectivo con glucosa como fuente de carbono y son las
siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
52
Tabla 4 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono y adicioacuten de ampicilina para
Brettanomyces Dekkera en incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica
1 Ninguno Negativo - -
2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
9 Diminutas
colonias
transparentes
Negativo Transparentes Presencia de levaduras
10 Positivo Positivo-
Fenoacutelicos
Amarillo Presencia de levaduras
BrettanomycesDekkera
El efecto de la ampicilina sobre el medio selectivo con etanol como fuente de
carbono fue el esperado inhibioacute completamente el crecimiento de colonias
bacterianas en el medio el tiempo de crecimiento de la levadura y presencia de
aromas fenoacutelicos fue el mismo de 10 diacuteas en incubacioacuten de 28C
53
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las
presentadas anteriormente y son las siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
82 RESULTADOS PRUEBAS MEDIO LIQUIDO
Tabla 5 Influencia de la concentracioacuten de levaduras BrettanomycesDekkera en el
tiempo necesario para detectar la produccioacuten de 4-etil-fenol en medio liquido
Nuacutemero de ceacutelulas ml
(concentracioacuten final)
Tiempo necesario para obtener resultados
positivos (diacuteas)
1 Experimento
32x106 le 3
3 X 104 3
33x102 7
40 No detectado
2 Experimento
43x106 le3
39x104 le3
37x102 8
62 No detectado
54
El nuacutemero de ceacutelulas de levadura de BrettanomycesDekkera fue contabilizado
usando contador de ceacutelulas Chamber
Los aromas fenoacutelicos son difiacuteciles de detectar debido al fuerte olor que tiene el
medio liquido caracteriacutestico de sus componentes esto dificulta la identificacioacuten del
ldquocaraacutecter Brettrdquo en especial cuando las concentraciones de
BrettanomycesDekkera no son elevadas Ademaacutes de los olores fenoacutelicos otros
compuestos volaacutetiles se detectan tales como acido aceacutetico y olores oxidativos
tambieacuten producido por la levadura BrettanomycesDekkera
En la inspeccioacuten visual se detecta alta turbidez en el medio Se compara con un
medio sin presencia de BrettanomycesDekkera
En las muestras con mayor concentracioacuten de la levadura es maacutes notoria la
turbidez Despueacutes de 3 diacuteas se presenta un precipitado blanco en todas las
muestras de altas concentraciones
La revisioacuten microbioloacutegica se realiza diariamente para determinar el nuacutemero de
ceacutelulas y la presencia positiva de la levadura a evaluar
Entre los dos experimentos realizados con el medio liquido el tiempo que se
demoro en detectar compuestos fenoacutelicos fue muy similar entre ellos
dependiendo del nuacutemero de ceacutelulas en el medio en mayores concentraciones el
tiempo de deteccioacuten fue menor
Hay que sentildealar que BrettanomycesDekkera debe alcanzar una concentracioacuten
miacutenima (denominada poblacioacuten criacutetica) de 103 UFCml para comenzar a liberar etil
fenoles Por debajo de esta concentracioacuten la levadura seriacutea metaboacutelicamente
activa pero no produciraacute compuestos alterantes a niveles detectables esto se ve
reflejado en los resultados en los que las concentraciones de ceacutelulas son muy
bajas
55
Estos resultados se comparan con los resultados dados en el medio solido Los
dos medios muestran altos grados de selectividad hacia la levadura
BrettanomycesDekkera y similar comportamiento para el crecimiento de dicha
levadura
En el medio liacutequido cuando hay altas concentraciones de BrettanomycesDekkera
el tiempo de deteccioacuten del microorganismo es menor que con el medio solido pues
en el liacutequido es aproximadamente 3 diacuteas y en el soacutelido son 5 diacuteas
83 RESULTADOS DE LA INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE
(SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO DE LA REGION DE
DALMACIA CROACIA
El vino fue analizado antes de la adicioacuten de los compuestos quiacutemicos a evaluar y
15 diacuteas despueacutes de adicioacuten para ver la reaccioacuten de este frente a SO2 y Antibrettreg
estas caracteriacutesticas se determinaron con el equipo de laboratorio Bacchus II
Microdom localizado en el laboratorio Vinolab doo Zagreb Croacia Los
resultados se muestran en la tabla
Tabla 6 Resultados de las muestras de vino inoculados con la levadura BrettanomycesDekkera
durante 15 diacuteas Comparativos con los diferentes compuestos
CFUml
Vino Day 1 Day 4 Day 10 Day 15
Control 130E+04 800E+03 700E+03 500E+03
Control 800E+03 640E+03 700E+03 280E+03
SO2 110E+04 400E+02 400E+02 67
SO2 900E+03 380E+03 270E+03 183
Antibrett 140E+05 920E+04 140E+04 400E+03
Antibrett 210E+05 181E+05 160E+04 900E+03
Antibrett 120E+05 990E+04 120E+04 100E+03
Antibrett 230E+05 204E+05 300E+03 200E+03
56
Tabla 7 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 antes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o
Antibrettreg Diacutea 0
Alcohol
()
Acidez Total
(gr Aci
Tartaacuterico L)
Acidez volaacutetil
(Aci
AceacuteticoL)
Densidad
(grml)
Azuacutecar residual
(grl)
Extracto
seco
(grl)
Acido
Laacutectico
(grl)
Glicerol
(grl)
Taninos
(grl)
Acetato
(grl)
1473
525
083
09928
473
332
164
799
305
117
1471
522
084
09927
479
329
162
786
299
116
Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
Tabla 8 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 despueacutes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o
Antibrettreg Diacutea 15
Alcohol
()
Acidez Total
(gr Aci
Tartaacuterico L)
Acidez volaacutetil
(Aci
AceacuteticoL)
Densidad
(grml)
Azuacutecar residual
(grl)
Extrac
to seco
(grl)
Acido
Laacutectico
(grl)
Glicerol
(grl)
Taninos
(grl)
Acetatos
(grl)
Control
1414
565
107
09935
436
364
177
827
259
136
Control
1415
556
108
09936
420
365
170
824
256
137
SO2
1456 543 108 09932 476 369 167 803 281 125
SO2
1457
542 108 09933 472 370 170 804 271 124
Antibrett 1454 533 106 09933 448 371 175 813 277 125
Antibrett 1455 534 105 09933 460 372 171 809 282 124
Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
57
Figura 4 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en el vino de control para
evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas
El comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en la prueba por
duplicado en el vino de control fue muy similar pues con el tiempo esta levadura
deja de reproducirse y va muriendo cuando las condiciones ya no son aptas para
su desarrollo debido a que la mayoriacutea de su fuente de carbono (Glucosa) esta
consumida sin embargo esta levadura no llega a su desaparicioacuten total lo que
representa uno de los mayores problemas en la elaboracioacuten del vino
Esta levadura tiene un metabolismo lento y el factor tiempo es un requisito
fundamental para su desarrollo este experimento se empezoacute con una alta
poblacioacuten de BrettanomycesDekkera (130 x 104 UFCml y 8 x 103 UFCml
respectivamente) y durante el transcurso del tiempo la poblacioacuten fue disminuyendo
debido a la perdida de las condiciones necesarias para la reproduccioacuten
58
Figura 5 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de SO2 en
concentracioacuten de 40 mgl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas
El SO2 tuvo un comportamiento efectivo y raacutepido contra las colonias de
BrettanomycesDekkera La poblacioacuten de esta levadura se redujo de forma
significativa entre el diacutea primero y el cuarto se encontroacute una diferencia porcentual
de 96 en la primera prueba y del 60 en la de duplicado al diacutea 15 ya la
poblacioacuten era casi nula pasando raacutepidamente de un numero por encima de la
poblacioacuten critica de la levadura BrettanomycesDekkera a un numero lt103 UFCml
siendo muy eficaz y raacutepido en el manejo de produccioacuten
Este compuesto ademaacutes de favorecer la extraccioacuten de los compuestos fenoacutelicos y
de su actividad antioxidante al inhibir la accioacuten de las polifenoloxidasas a dosis
adecuadas de un maacuteximo de 50gl inhibe la multiplicacioacuten bacteriana y de
levaduras
59
Figura 6 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de
Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo
de 15 diacuteas
Figura 7 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de
Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo
de 15 diacuteas
El compuesto Antibrettreg en la primera prueba tanto como en el duplicado tuvo su
mayor tiempo de reduccioacuten de UFCml entre los diacuteas 4-10 con una diferencia
porcentual de 91 en comparacioacuten con el diacutea cuarto al decimo a diferencia de
60
SO2 el cual presenta la gran disminucioacuten de colonias entre los primeros diacuteas de
agregarse el producto
El tiempo para que la poblacioacuten de la levadura llegara a la cantidad menor a la de
la poblacioacuten critica es mucho mayor que la del compuesto SO2 sabiendo que esta
poblacioacuten debe ser lt103 UFCml
El compuesto Antibrettreg puede tardarse 4-10 diacuteas en representar una reduccioacuten
de UFCml significativa en dicho tiempo puede representar grandes peacuterdidas
nutricionales y altos costos de produccioacuten para la fabricacioacuten
Figura 8 Comportamiento del contenido de alcohol en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin adicioacuten)
hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
BrettanomycesDekkera estaacute presente en vinos de alto contenido alcohoacutelico
aproximadamente entre 125 a 14 pues esta levadura toma a etanol como
fuente de carbono y este vino (Babic) procede de uvas muy maduras las cuales
presentan mayor cantidad de azuacutecares residuales (como glucosa y fructosa y
otras pentosas residuales)
138
14
142
144
146
148
Alcohol
Day 0 Day 15
61
Analizando el comportamiento del vino durante el experimento de 15 diacuteas sin
compuestos quiacutemicos y con SO2 y Antibrettreg a partir de las caracteriacutesticas
iniacuteciales que se determinaron seguacuten el equipo BACCHUS analizador infrarrojo se
presenta en general una reduccioacuten del contenido alcohoacutelico de este vino pero se
ve una mayor reduccioacuten en el vino de control el cual redujo en un 394 su
contenido alcohoacutelico desde el dia 0 hasta el diacutea 15 este vino no tiene ninguacuten
compuesto contra la levadura BrettanomycesDekkera y por su elevada presencia
en los 15 diacuteas de experimento consumioacute esta cantidad de etanol
Mientras en el vino que conteniacutea SO2 tras 15 diacuteas de tratamiento se vio una
reduccioacuten de alcohol de 1 ya que este compuesto redujo la cantidad de
BrettanomycesDekkera en los primeros diacuteas de tratamiento previniendo su
reproduccioacuten y protegiendo el contenido alcohoacutelico del vino Babic 2007
En los vinos de prueba con Antibrett reg la reduccioacuten alcohoacutelica se dio en un
porcentaje de 122 un poco maacutes alta que con SO2 y mucho maacutes baja en
comparacioacuten del vino de control este compuesto tambieacuten previno la gemacioacuten de
la levadura evitando la perdida de etanol en el vino sin embargo como este
compuesto duro mas en este proceso de eliminar BrettanomycesDekkera se
produjo una mayor peacuterdida alcohoacutelica
62
Figura 9 Comportamiento del contenido de acidez volatil en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin
adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
Debido a la presencia de oxigeno en los frascos la acidez volaacutetil aumento pero no
significativamente en las muestras No hubo grandes diferencias entre las
muestras con compuestos y las de control por lo que se deduce que estos
compuestos no ayudan a evitar esta acidez Esta acidez tan alta puede dantildear la
calidad del vino de forma casi irreparable Pero el factor oxigeno es de los maacutes
controlados en la produccioacuten de vinos
la alteracioacuten del aumento de la acidez volaacutetil no estaacute relacionada con la levadura
BrettanomycesDekkera sino a la presencia de oxigeno en el almacenamiento el
oxigeno fue usado en esta prueba para promover condiciones apropiadas para el
desarrollo de la levadura
002040608
112
Acidez Volatil
Day 0 Day 15
63
Figura 10 Comportamiento del contenido de Acido Acetico en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin
adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
Brettanomyces Dekkera son productores de aacutecido aceacutetico y elevan el contenido
de los vinos anormalmente en condiciones de anaerobiosis En condiciones de
aerobiosis producen concentraciones bajas o nulas de aacutecido aceacutetico
Este acido aceacutetico al igual que los fenoles afecta el sabor y el perfil olfativo del
vino tinto este efecto es tambieacuten producido por la levadura
BrettanomycesDekkera vemos en los resultados el gran crecimiento de este
compuesto en el vino control el cual no tenia compouestos en contra de
BrettanomycesDekkera lo que produjo este aumento significativo del acido aceacutetico
en comparacioacuten con estos que teniacutean SO2 y Antibrettreg entre ellos la diferencia en
este compuesto es muy reducida y no significativa pues estos compuestos no
permitieron la gemacioacuten de esta levadura y esta no produjo este acido en esa gran
cantidad
A este compuesto se le atribuye el olor y sabor a vinagre del vino tinto un defecto
muy comuacuten y poco agradable para el consumidor
105110115120125130135140
Acido Acetico
Day 0 Day 15
64
Figura 11 Comportamiento del contenido de Azucares reductores en vino Babic 2007
desde el diacutea 0 (sin adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en
comparacioacuten con el vino de control
BrettanomyesDekkera utiliza los azucares residuales como fuente de carbono
para su crecimiento en el vino este es el factor maacutes importante para su desarrollo
y este es el que determina en cierto caso la cantidad de levaduras de
BretanomycesDekkera presente en las graficas se determina claramente que en
el vino de control donde la cantidad de esta levadura es muy alta 15 diacuteas despueacutes
de empezar las pruebas la cantidad de azucares reductores es muy baja y ha
bajado en un porcentaje de 10 mientras que el vino que tiene SO2 bajo la
cantidad de azucares reductores en un 042 y el vino que tiene el compuesto
Antibrettreg redujo su nivel de azucares reductores en 462
38
4
42
44
46
48
5
Azucares Reductores
Day 0 Day 15
65
84 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE
CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON
EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID
PHASE
Tabla 10 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en
vino Babic 2007 con el meacutetodo propuesto
Compuesto Tiempos de
retencioacuten (min)
Acetaldehiacutedo 1437
Propanol 3759
Diacetil 4202
Etil-acetato 4523
i-butanol 6232
Acido Aceacutetico 7840
i-amil alcohol 11740
n-amil 13489
lactato de etiacutelico 15741
acetato amil metiacutelico 17796
1-hexanol 19101
etil-hexanol 24456
Linalol 30370
2-feniletanol 32768
p-cresol 33522
octanoato de etilo 34226
4-etilfenol 37100
2-feniletil acetato 32769
4-etilguayacol 39704
4 vinilfenol 40529
decanoato de etilo 42117
Refirieacutendose a estos resultados es necesaria la creacioacuten de soluciones estaacutendar
para determinar tiempos de retencioacuten con el meacutetodo y si es necesario ajustes a
este
66
Tabla 11 Soluciones estaacutendar para compuestos en vinos tintos Croatas
MODEL 0
(en volumen de 100 ml en 40 Etanol)
Compuesto Pureza Cantidad
(g)
Concentracioacuten (gl)
Acetaldehiacutedo 099 1623 160677
Propanol 0995 13849 137718
Diacetil 098 01071 104958
Etil-acetato 0995 30172 3002114
i-butanol 099 15016 1486584
Acido Acetico 0995 0 0
i-amil alcohol 099 20116 1991484
n-amil 098 15442 1513316
lactato de etilio 098 00507 049686
acetato amil metilico 098 01028 100744
1-hexanol 098 00367 035966
etil-hexanol 098 00308 029876
Linalol 097 00288 027936
Nerol 097 00311 030478
Citronelol 098 0031 03038
Geraniol 098 15803 1548694
2-feniletanol 098 00402 039396
4-etilfenol 098 00812 078764
octanoato de etilo 097 00597 059103
2-feniletil acetato 099 00315 031185
4-etilguayacol 098 00803 079674
Fuente Laboratorio de anaacutelisis e investigacioacuten de bebidas Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea
de Alimentos Universidad de Zagreb Zagreb Croacia 2009
Las soluciones estaacutendar se realizan teniendo como referencia las cantidades de
estos compuestos en los vinos tintos croatas datos suministrados por el Doctor
Leo Gracin en concentraciones de gl a partir de este dato y teniendo en cuenta
67
la pureza de los compuestos que se teniacutean en el laboratorio de anaacutelisis e
investigacioacuten de bebidas se crean las soluciones estaacutendar Ejemplo
Solucioacuten estaacutendar para 4 etil-fenol en un volumen de 100 ml
Con estas soluciones estaacutendar se realizo el tiempo de retencioacuten para corroborar el
meacutetodo Los resultados de esto fueron tiempos de retencioacuten diferentes a los del
meacutetodo primero con el que se realizaron los ensayos y a partir de esos resultados
se ajusto el meacutetodo con el que se trabajo
68
Tabla 12 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en
vino Babic 2007 con el meacutetodo modificado
Compuesto Tiempos de
retencioacuten (min)
Acetaldehiacutedo 1542
Propanol 4046
Diacetil 4733
Etil-acetato 4807
i-butanol 6659
Acido Acetico 8343
i-amil alcohol 12123
n-amil 13866
lactato de etilio 16072
acetato amil metilico 18336
1-hexanol 19447
etil-hexanol 24835
Linalol 31831
2-feniletanol 33305
p-cresol 33703
octanoato de etilo 34571
4-etilfenol 37724
Citronelol 38326
Nerol 38576
2-feniletil acetato 39012
Geraniol 39944
4-etilguayacol 40271
4 vilifenol 41168
decanoato de etilo 42657
69
DIA 0
Se coloca ISTD a todas las muestras respectivas para poder determinar
cantidades de los compuestos aromaacuteticos
Se realiza la cromatografiacutea de gas al vino Babic 2007 antes de ser inoculado con
BrettanomycesDekkera
Tabla 13 Resultados de la cromatografiacutea de gas del vino Babic 2007
Compuesto Tiempo de retencioacuten
min
Cantidad
mgl
Acetaldehiacutedo 1542 0
Propanol 4046 0
Diacetil 4733 37215204
Etil-acetato 4807 0
i-butanol 6659 0
Acido Aceacutetico 8343 2817465
i-amil alcohol 12123 16799019
n-amil 13866 26
lactato de etiacutelico 16072 10983961
acetato amil metiacutelico 18336 0185196
1-hexanol 19447 264655
etil-hexanol 24835 0158751
Linalol 31831 0
2-feniletanol 33305 4235560
p-cresol 33703 1
octanoato de etilo 34571 0152412
4-etilfenol 37724 00581345
Citronelol 38326 00439729
Nerol 38576 00344799
2-feniletil acetato 39012 00407983
Geraniol 39944 0
4-etilguayacol 40271 0
4 vilifenol 41168 0
Decanoato de etilo 42657 00190144
70
Basados en los compuestos aromaacuteticos que brinda el ldquoCaraacutecter Brettrdquo se van a
analizar detalladamente los siguientes aromas 4-Etilfenol 4-Etilguayacol 4-
Vinylfenol
Figura 12 Compuestos aromaticos en vino tinto Babic sin estar contaminado con la levadura
BrettanomycesDekkera
El vino a analizar esta por debajo de las concentraciones consideradas como
perjudiciales para el aroma del vino tinto (El umbral sensorial del 4-etilfenol es de
230 μgl y el del 4-etilguaiacol es de 47 μgl) pues posee una concentracion de
58microgL de 4etilfenol 0 microgL de 4 etilguayacol y 0 microgL de vinylfenol
841 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGUacuteN TEMPERATURAS
DE ALMACENAMIENTO
0
02
4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinylfenol
Vino 00581345 0 0
C (
mg
L)
Vino Babic 2007 Dia 0
71
Tabla 14 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el
ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 20C por 4 diacuteas Prueba por duplicado
MUESTRAS INCUBADA A 20C
Compuesto Day 1
Amount
(mgL)
Day 2
Amount
(mgL)
Day 3
Amount
(mgL)
Day 4
Amount
(mgL)
4-etilfenol 0260244 017294 0177547 020156
4-etilfenol 0260244 0245915 0204542 0262499
4-etilguayacol 0 0 0 0
4-etilguayacol 0 0 0 0
4 vinilifenol 1107096 781349 685317 460323
4 vinilifenol 1107096 1297465 621324 693225
72
Figura 13 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
BrettanomycesDekkera es la levadura responsable de la produccion de 4-etil-
fenol compuesto asociado con olores caracteristicos a ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 00581345 0260244 0172935 0177547 020156
C (
mg
L)
4 etilfenol
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 00581345 0260244 0245915 0204542 0262499
C (
mg
L)
4 etilfenol
73
caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo dantildeando la calidad sensorial del vino tinto Babic la
produccioacuten de este compuesto en esta muestra realizada por duplicado fue
ascendente y tuvo incremento muy grande en el primer dia de almacenamiento y
en el transcurso de los siguientes cuatro diacuteas se mantuvo relativamente estable lo
cual no concuerda con el comportamiento tiacutepico de esta levadura quien tiene un
crecimiento lento e incrementa la produccioacuten de fenoles con su gemacioacuten esto
genera muchas dudas sobre el buen funcionamiento del equipo GC o de la
estabilidad de las levaduras BrettanomycesDekkera en este almacenamiento
Figura 14 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar prueba por duplicado
002040608
1
Vino Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0 0 0
4 etilguayacol
002040608
1
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0 0 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
74
Presencia negativa de 4 etil guayacol durante todo el almacenamiento
probablemente las condiciones de almacenamiento y el medio no dieron lugar al
desarrollo de este compuesto el cual se considera menos conflictivo que el 4-etil-
fenol
Figura 15 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
Estos resultados tambieacuten dejan dudas del normal comportamiento de dicha
levadura pues indican que la levadura no convirtioacute este compuesto en etilfenol
0
2
4
6
8
10
12
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 110709781349685317460323
4 vinylfenol
0
2
4
6
8
10
12
14
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
Series1 0 11071 12974 62132 69322
C (
mg
l)
4 Vinylfenol
75
durante el almacenamiento caracteriacutestica que solo la levadura
BrettanomycesDekkera puede realizar se ve que las concentraciones de
vinylfenoles son mucho mas altas que las de fenoles lo que nos deja determinar
que la poblacioacuten de BrettanomycesDekkera es muy baja y existen otras levaduras
productoras de vinylfenoles en este tipo de vino en las condiciones de
almacenamiento dadas para estas pruebas
Tabla 16 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el
ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 28C por 4 diacuteas
MUESTRA 2 INCUBADA A 28C
Compuesto Day 1
Amount
(mgL)
Day 2
Amount
(mgL)
Day 3
Amount
(mgL)
Day 4
Amount
(mgL)
4-etilfenol 0260244 019612 0186614 019932
4-etilfenol 0260244 020576 0214917 0193554
4-etilguayacol 0 014304 0223836 0
4-etilguayacol 0 002287 00529832 0
4 vinilifenol 1107096 787068 665182 397847
4 vinilifenol 1107096 284389 00204392 0
76
Figura 16 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar
El desarrollo de este compuesto en el diacutea 1 fue significativo y luego relativamente
estable el comportamiento fue similar en las pruebas de diferentes temperaturas
de almacenamiento para este compuesto el cual es el maacutes problemaacutetico en la
industria viniacutecola
0
005
01
015
02
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 005813019932018661019611019932
4 etilfenol
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 005813 019355 021491 020576 026024
4 etilfenol
77
Figura 17 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar
Los resultados de la prueba son poco confiables y no entendibles por lo que
podemos verificar que el GC no estaacute trabajando de forma adecuada para la
deteccioacuten del compuesto
0001002003004005006
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 Etilguayacol 0 0 0022 0053 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
0005
01015
02025
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0223 0143 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
78
Figura 18 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
El comportamiento de este compuesto en la prueba es muy irregular y poco
confiable
0
2
4
6
8
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 397847665182787068397847
4 vinylfenol
0
2
4
6
8
10
12
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 11071 28438 00204 0
4 vinylfenol
79
Figura 19 Comportamiento del compuesto 4 etilfenol durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
La concentracioacuten de 4 etil fenol fue mayor al cuarto diacutea almacenado a
temperatura ambiente de 20C pero este compuesto no tuvo una actividad notoria
de ascenso durante su almacenamiento como se esperaba lo que deja muchas
dudas sobre los resultados de este ensayo
0
05
1
15
2
25
3
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etil fenol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 20C
80
Figura 20 Comportamiento del compuesto 4 etil guayacol durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
Comportamiento anormal del compuesto no se ve tendencias de aumento o
disminucioacuten de este en ninguna de las pruebas no tiene un comportamiento
regular pues se esperaba que la levadura BrettanomycesDekkera
descarboxinizara el compuesto 4-vinilguaiacol y aumentar las concentraciones de
4-etilguaiacol esta reaccioacuten no se hizo notoria en los compuestos aromaacuteticos
seguacuten lo determino el Cromatografo de Gas (GC)
0
005
01
015
02
025
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3
C (
mg
L)
4 etil guayacol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 20C
81
Figura 21 Comportamiento del compuesto 4 Vinyl fenoll durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
La no presencia de este compuesto en el vino original demuestra las baja o casi
nula presencia de la levadura BrettanomycesDekkera al diacutea primero este
compuesto incrementa de forma notoria en las muestras debido a la presencia de
acido cumaacuterico en el medio ya que sufre su carboxilacion convirtieacutendose en 4 vinyl
fenol sin embargo su comportamiento no fue regular y presento problemas de
lecturas
0
2
4
6
8
10
12
14
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
C (
mg
L)4 Vinyl fenol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 28C
82
9 CONCLUSIONES Y
RECOMENDACIONES
91 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO
Se desarrolloacute un medio selectivo soacutelido para BrettanomycesDekkera
accesible y faacutecil de elaborar
Se detectan colonias de la levadura BrettanomycesDekera en el agar
selectivo con glucosa como fuente de carbono en un lapso de 5 diacuteas en
incubacioacuten a 28C
El medio selectivo soacutelido con Glucosa como fuente de carbono fue maacutes
raacutepido y efectivo ya que toma 5 diacuteas para dar resultados positivos frente al
de Etanol como fuente de carbono el cual toma 10 diacuteas para mostrar
resultados positivos aunque ambos dieron resultados satisfactorios en la
selectividad de la levadura BrettanomycesDekkera
La levadura se adapto de forma satisfactoria a estos medios en
condiciones de almacenamiento propias para su desarrollo (28C)
Las colonias de la levadura BrettanomycesDekkera tiene un crecimiento
en estos medios soacutelidos de forma circular con topografiacutea convexa y borde
entero dimensiones 5-6 mm color Amarillo opacicidad oscuro
83
superficie lisa y suave siendo faacutecil de identificar y realizar los conteos
necesarios
El medio solido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten
de la levadura BrettanomycesDekkera en vino tinto es raacutepido econoacutemico
y uacutetil
El uso de azucares para fermentacioacuten de la levadura
BrettanomycesDekkera que Saccharomyces no puede fermentar para
mayor selectividad
Realizacioacuten de pruebas Bioquiacutemicas como meacutetodo raacutepido de selectividad
92 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DESARROLLO DEL MEDIO LIacuteQUIDO
Se desarrollo un medio selectivo liquido para BrettanomycesDekkera
accesible y faacutecil de elaborar
Este medio mostroacute resultados positivos de la presencia de
BrettanomycesDekkera en un lapso de tiempo menor (3 diacuteas) que con el
medio solido (5 diacuteas) en caso de que el nuacutemero de ceacutelulas de la levadura
BrettanomycesDekkera sea mayor a la poblacioacuten critica (103)
Cuando la poblacioacuten de ceacutelulas de la levadura BrettanomycesDekkera es
menor a la poblacioacuten critica el tiempo de identificacioacuten de esta levadura por
medio liquido es muy prolongado puede tomar maacutes de 10 diacuteas o incluso no
detectarlo
84
Los compuestos quiacutemicos usados para el desarrollo del medio liacutequido no
son los adecuados para este tipo de medios donde los resultados positivos
son olfativos pues estos compuestos emiten fuertes olores que confunden
los olores caracteriacutesticos del caraacutecter Brett
El medio liquido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten
de altas concentraciones de la levadura BrettanomycesDekkera en vino
tinto es raacutepido econoacutemico y uacutetil
93 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg
EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE DALMACIA
CROACIA
Este trabajo mostroacute que el dioacutexido de azufre (SO2) tiene buenos resultados
en contra de la levadura BrettanomycesDekkera en concentraciones
normales de 40mgl concentracioacuten en la que se trabaja este compuesto en
los vinos tintos
En Europa el dioacutexido de azufre es usado de forma tradicional en gran
nuacutemero de alimentos y especialmente en vinos sin embargo y a pesar de
su uso regulado se busca la sustitucioacuten de este o su maacutexima reduccioacuten
para hacer de este producto maacutes sano para las personas no tolerantes a
este tipo de compuestos sin embargo seguacuten el trabajo realizado en
comparacioacuten con el producto Antibrettreg el SO2 es maacutes eficaz en el control
85
de la levadura ayudando a evitarla y eliminarla de la cadena productiva del
vino tinto
Gracias a sus caracteriacutesticas el vino tinto Babic es muy vulnerable a la
levadura BrettanomycesDekkera pero a su vez se puede tratar faacutecilmente
con productos como SO2 y Antibrettreg aunque es maacutes efectivo contra
BrettanomycesDekkera el dioacutexido de azufre (SO2)
Antibrettreg es una buena opcioacuten para el control de BrettanomycesDekkera
para evitar el uso de productos alergenicos como SO2
94 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN
EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO
MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE
Al terminar la primera prueba con anaacutelisis en cromatografiacutea a gas y el SPME
queda como resultados
Es necesario repetir la prueba
No se determina el efecto de los estaacutendares internos sometidos a tiempos
de almacenamiento en temperaturas de 20C y 28C lo que puede dar falsos
resultados de cantidades de compuestos
86
Se debe crear un medio maacutes apto para el desarrollo de la levadura y un
control diario de crecimiento ( agregar maacutes Glucosa en caso de que se
haya consumido toda controlar presencia de Bacterias y otros
microorganismos que no se deseen en el medio)
Es necesario control de aromas con panel sensorial para determinar el
umbral de deteccioacuten en este vino
Control de crecimiento por medio solido Selectivo para
BrettanomycesDekekra conteo de colonias presentes en el vino inoculado
y su desarrollo durante almacenamiento a diferentes temperaturas
La segunda prueba no fue posible realizarla por dantildeos en el equipo de
cromatografiacutea de gas (GC)
87
ANEXOS
11
89
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fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientiacuteficas 99 Grupos de
Investigacioacuten Enoloacutegica Zaragoza Espantildea
93
11
GRACIAS es una palabra corta para todo lo que quiero expresar a todos aquellos que
hicieron parte de este suentildeo hecho realidadhellip
A Dios y a la virgen Auxiliadora por llevarme de su mano cada diacutea de mi carrera en cada
momento alegre y en cada momento difiacutecil fueron mi fortaleza
A mis papitos por hacer de mi estudio una realidad por su sacrificio y apoyo desinteresado y
sincero
A mi Hermanito por ser mi fortaleza mi ejemplo y mi amigo incondicional
A mi familia Blanco y Urrea por su compantildeiacutea durante esta etapa
A mi facultad (Decano Dr Camilo Rozo Dra Patricia Jimeacutenez y mis profesores) por
ensenarme mi profesioacuten y aportar lo mejor de ustedes para mi formacioacuten personal
A mis asesores de Tesis (Ing Patricia Chaparro y Dr Sc Leo Gracin) por su guiacutea y
colaboracioacuten oportuna
A mis queridos amigos quienes siempre han estado a mi lado en las dificultades y en las
alegriacuteas (Ingrid Mafe Cami G Cami R Harold Pipe Karla Andreacutes T Diego G)
A IAESTE en alianza con el ORI por hacer posible mi intercambio y poder hacer mi tesis en el
maravilloso paiacutes de Croacia
A Croacia por ser mi segundo hogar por abrirme sus puertas y su corazoacuten por brindarme
tan maravillosas personas en mi camino
Croatia Thank you for being my second home for opening your doors and your heart to me
and give me the opportunity to meet so many wonderful people
To my boss my teacher my mentor and specially my friend Leo
To the faculty of food technology and Biotechnology and the department of technology
and analysis of beverages for give me the opportunity to give all my knowledge to the
project and learn a lot more
To all the amazing people I met during this experience (Igor Karin Natka Josip Ana Matija
Daniel Pz Szilvia Dini Daniela Lidija Sanja and everybody else who I had the pleasure to
meet in this great trip) for give me the best of your hearts
I only have one thing to say hellipTHANK YOU
Solo me queda una palabra por decirhellipGRACIAS
16
Figura 1 Microfotografiacutea de cultivo de BrettanomycesDekkera a) Variabilidad morfoloacutegica y de
tamantildeo celular b) forma filamentosa
Fuente Lopez-Cordon Eva BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia wwwacenologiacom
Los defectos sensoriales asociados directamente a Brett aparecen
mayoritariamente en vinos tintos de calidad y las causas radican en la propia
fisiologiacutea del microorganismo Ademaacutes al ser una levadura de crecimiento muy
lento la alteracioacuten se presenta principalmente durante el almacenamiento y sobre
todo la crianza del vino habitual en los vinos tintos de gama alta En las barricas
de madera el microorganismo tiene a su disposicioacuten todo el sustrato y tiempo
suficiente para realizar su actividad La naturaleza porosa de la madera y su difiacutecil
limpieza contribuye a que las poblaciones existentes se mantengan incluso
despueacutes del lavado de la barrica Ademaacutes BrettanomycesDekkera tiene la
capacidad de degradar uno de sus componentes la celobiosa 20
13 CARACTERISTICAS FISIOLOGICAS
S cerevisiae y BrettanomycesDekkera tienen metabolismos similares muy
adaptados a las condiciones de vinificacioacuten Tras la fermentacioacuten alcohoacutelica S
cerevisiae es la levadura mayoritaria debido a que las condiciones nutricionales
20
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
17
del vino son muy estrictas (altas concentraciones de etanol y bajas
concentraciones de nutrientes) En este momento BrettanomycesDekkera
continuacutea creciendo gracias a que utiliza nutrientes que S cerevisiae no ha podido
consumir sobre todo algunos azuacutecares y fuentes de nitroacutegeno21
Una de las caracteriacutesticas que diferencia a BrettanomycesDekkera es la gran
diversidad de azuacutecares que puede fermentar (ver tabla de Relacioacuten de los
principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) La mayoriacutea de
las cepas pueden crecer utilizando trealosa y celobiosa azucares presentes en el
vino y no consumibles por S cerevisiae Otra de las ventajas que presenta frente
a S cerevisiae (y frente a la mayoriacutea de las levaduras) es que puede utilizar los
nitratos como fuente de nitroacutegeno Debido a que S cerevisiae soacutelo utiliza el
nitroacutegeno amoniacal y los aminoaacutecidos libres estos se consumen con relativa
rapidez Al final de la fermentacioacuten el nitroacutegeno moniacal es escaso y se favorece
el crecimiento de las levaduras que pueden utilizar otras fuentes de nitroacutegeno
Ademaacutes Brettanomyces puede crecer con concentraciones de fosfato diamoacutenico
tan bajas como 05gl o a partir de diversos aminoaacutecidos En resumen
BrettanomycesDekkera crece maacutes despacio que S cerevisiae es resistente a
concentraciones altas de alcohol puede utilizar otros azucares como fuentes de
energiacutea y nitrato como fuente de nitroacutegeno Esto explica que pueda reproducirse
cuando la fermentacioacuten alcohoacutelica ha terminado a partir de nutrientes no
consumibles por S cerevisiae y cuando no tiene competidores22
21
Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
22 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
18
Tabla 1 Relacioacuten de los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto
Fuente Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista
VINOTEQ N 38 pag 21 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
131 BrettanomycesDekkera y siacutentesis de fenoles volaacutetiles
El origen de los fenoles volaacutetiles estaacute relacionado con la actividad secuencial de
dos enzimas que descarboxilan los aacutecidos en hidroxiestirenos (vinilfenoles) que
19
son posteriormente reducidos a etilderivados (etilfenoles)23 como puede
observarse en la figura 2
Figura 2 Siacutentesis de etilfenoles de BrettanomycesDekkera
Fuente ACE revista de Enologia wwwacenologiacom
El primer paso de descaboxilacion de los aacutecidos hidroxicinamicos es comuacuten
tambieacuten en otros microorganismos como bacterias hongos y otras levaduras Sin
embargo el segundo paso reduccioacuten de vinilfenoles es caracteriacutestico de algunos
tipos de levaduras como Dekkera bruxelliensis D anomala Pichia guillermondi
Candida versarilis C halophila y C mannitofaciens24
Los fenoles volaacutetiles que se asocian al problema Brett en vinos son el 4-etilfenol y
el 4- etilguaiacol asiacute como sus precursores intermedios 4-vinilfenol y 4-
vinilguaiacol aunque estos uacuteltimos son menos importantes por ser muy reactivos y
raacutepidamente convertidos en etilfenoles por BrettanomycesDekkera o en su caso
23
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
24 Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
20
condensan con otras moleacuteculas como antocianos25 Los etilfenoles y
especialmente elevadas concentraciones de 4-vinilfenol en vinos se asocian con
aromas desagradables asociados a descriptores como ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de
caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo26
El umbral sensorial del 4-etilfenol es de 230 μg l-1 y el del 4-etilguaiacol es de 47
μgl Pese a su menor umbral sensorial el 4-etilguaiacol responde a descriptores
como ldquobaconrdquo o ldquoahumadordquo que a bajas concentraciones aportan complejidad por
lo que se puede considerar sensorialmente menos conflitivo que el 4-etilfenol 27
Figura 3 Defectos sensoriales producidos en el vino por BrettanomycesDekkera
Fuente Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
25 Morata A Goacutemez-Cordoveacutes M Calderoacuten F Suaacuterez J 2006 Effects of pH temperature and SO2 on the
formation of pyranoanthocyanins during red wine fermentation with two species of Saccharomyces Journal Food Microbiology No106 pag 4 Madrid Espana
26 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea 27 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
21
132 Identificacioacuten de BrettanomycesDekkera
Los Bioacutelogos usan sistemas de identificacioacuten basados en similitudes taxonoacutemicas
entre organismos dichas similitudes pueden ser morfoloacutegicas tipos capacidad de
produccioacuten de sustratos como azuacutecar yo nitratos caracteriacutesticas fisioloacutegicas y
bioquiacutemicas secuencia del material geneacutetico y respuestas inmunoloacutegicas28
En la industria viniacutecola es importante recurrir a diferentes tipos de pruebas para la
identificacioacuten de microorganismos una de estas y la maacutes realizada es la revisioacuten
del microorganismo bajo el microscopio Esta prueba brinda informacioacuten sobre la
morfologiacutea del microorganismo (cocos bacilos formas puntudas ojival entre
otros) tamantildeo (dimensiones) agrupaciones celulares (solas parejas triacuteos
grupos o cadenas) Sin embargo el uso del microscopio es una prueba raacutepida
para examinar mostos o vino pero no determina cantidades que muchas veces es
requerido para tratamientos de accioacuten otro de los inconvenientes es que los
microorganismos pueden variar su morfologiacutea en forma o tamantildeo dependiendo de
la edad y las condiciones de crecimiento por lo que puede no ser clara la
identificacioacuten de este29
14 Medios soacutelidos selectivos
Si se requiere de la confirmacioacuten del microorganismo este debe ser aislado del
vino para una caracterizacioacuten para esto se requiere de medios soacutelidos Cuando se
examina un microorganismo en un medio solido es importante revisar las
caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias (ver figura 4 Morfologiacuteas de colonias
en medios soacutelidos) Entre estas caracteriacutesticas estaacuten forma (circular irregular o
2829 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
22
rizada) tamantildeo (dimensiones estas normalmente se expresan en miliacutemetros)
topografiacutea (plano elevado convexo coacutencavo o embonado) presencia de
pigmentos opacidad (transparente traslucido u opaco) superficie (suave rugosa
lisa o aacutespero) bordes (entero ondulado crespo dentado rizado) o cualquier
cambio en el agar (color opacidad cambios en los indicadores de pH o CaCO3
respectivamente)30
Figura 4 Varias morfologiacuteas de crecimiento de colonias en medio solido
Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007
Gran nuacutemero de medios selectivos se han creado para la aislacioacuten deteccioacuten yo
conteo de levaduras provenientes de jugos de uva mostos o vinos El medio maacutes
utilizado en estos fines es YPD (Yeast Peptone Dextrose) pero dicho medio no
es selectivo entre levaduras y se usa comuacutenmente para el conteo de
Saccharomyces31 Las colonias empiezan a parecer con un periodo de incubacioacuten
30
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
31 Essia Ngang J Wolniewicz E Villa P2005 Stimulation of lactobacilli during alcoholic fermentation action
of sucrose hydrolysis by yeast Biotechnology letters No 8 pag 743 Amiens France
23
de 2 a 4 diacuteas a 22C a 25C Igualmente el agar de jugo de uva es no selectivo y
presenta faacutecil crecimiento de levaduras bacterias y mohos
Para la levadura Brettanomyces Dekkera se han elaborado diferentes medios
selectivos entre ellos el maacutes conocido es WL por sus siglas en ingles del
laboratorio que lo creo ldquoWallerstein Laboratoriesrdquo este medio contiene
cicloheximida compuesto selectivo para Brettanomyces e inhibe Saccharomyces
El punto criacutetico es encontrar la cantidad exacta de este compuesto para la
inhibicioacuten de las levaduras sin que afecte a BrettanomycesDekkera32
Ademaacutes del medio WL BrettanomycesDekkera puede ser cultivado en otros
medios selectivos como Brettanomyces medio A creado por Vilas en 1993
Brettanomyces medio B el cual contiene cicloeximida como agente selectivo
mientras que Brettanomyces medio C tiene cicloheximida y ampicilina este medio
fue creado por B Watson en 1998 Brettanomyces medio D fue creado
recientemente por Rodrigues en 2001 este medio es conocido como DBDM
(DekkeraBrettanomyces differential medium ) es un medio selectivo para
Brettanomyces en contra de Saccharomyces y otras levaduras este medio es el
maacutes utilizado en la vineras para caracterizacioacuten de BrettanomycesDekkera
actualmente33
15 Dioacutexido de azufre (SO2) en vinos
32
33
Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers
GmbH United States of America and Canada
24
El dioacutexido de azufre tambieacuten llamado oxido de azufre es un eficaz agente
conservante antioxidante y antimicrobiano en la industria viniacutecola34
Durante la vinificacioacuten SO2 ha representado histoacutericamente una herramienta muy
importante usada por los vinicultores para el control de crecimiento microbioloacutegico
Debido a preocupaciones por la salud del consumidor el uso de este producto ha
disminuido dramaacuteticamente con el posible riesgo de aumentar el riesgo
microbioloacutegico35
El actual liacutemite legal de SO2 en vinos en los Estados Unidos es de 350mgL una
concentracioacuten mucho mayor a la usada en la industria viniacutecola No obstante vinos
que contienen maacutes de 10mgL deben declarar este compuesto en la etiqueta
porque SO2 es un metabolito que las levaduras usan durante la fermentacioacuten Los
vinos siempre contienen algo de sulfitos aunque la adicioacuten no se realice durante el
proceso36
151 Formas del Dioacutexido de Azufre (SO2)
Una vez disuelto en agua el dioacutexido de azufre existe en equilibrio entre SO2
molecular (SO2H2O) bisulfito (HSO3) y sulfito (SO32-) Este equilibrio depende del
pH Ademaacutes de estar en equilibrio con el molecular y especies sulfito el bisulfito
tambieacuten existe en forma ldquolibrerdquo y en forma ldquoatadardquo Aquiacute la moleacutecula reaccionara
34
Orwine Eureka 2008Investigadores europeos buscan alternativas al dioxido de azufre en vinos
httpawprowordpresscom20081107investigadores-europeos-buscan-alternativas-al-dioxido-de-
azufre-en-el-vino
3536 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
25
con compuestos carbonilos (ej Acetaldehiacutedo) formando productos adicionales
como Acido Hydroxysulfonico 37
Ademaacutes de Acetaldehiacutedo algunas moleacuteculas presentes en el jugo de uva que
reaccionan con bisulfito son acido piruvico α-keto-glutaric dihidroxyacetona
diacetyl Pigmentos de antocianinas entre otros38
152 Inhibidor Microbiano
El sulfuro molecular es la forma antimicrobiana del dioacutexido de azufre La cantidad
de SO2 molecular presente en cualquier vino no se mide directamente La
concentracioacuten es calculada conociendo la concentracioacuten de SO2 libre y el pH del
vino basaacutendose en la siguiente foacutermula
Alternativamente la figura 5 Se puede utilizar como guiacutea para aproximar la
cantidad de SO2 libre necesitada a determinado valor de pH de valores entre 05 o
08 mgl de SO2 molecular 39
El SO2 inhibe microorganismos de varias formas incluyendo rupturas de puentes
bisulfitos en proteiacutenas y reaccionando con coofactores como NAD+ y FAD tambieacuten
reacciona con ATP
3739
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
38 Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi
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26
Figura 5 Cantidades de SO2 libre a un pH determinado para obtener 05 o 08 mgl de SO2
molecular
Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007
La concentracioacuten de SO2 molecular necesario para prevenir el crecimiento de
microorganismos variacutea seguacuten vinojugo pH temperatura poblacioacuten densidad y
diversidad estado de crecimiento grado de alcohol entre otros factores Beech
1979 sugirioacute una adicioacuten de 08 mgl de SO2 molecular como la cantidad
necesaria del compuesto en vinos blancos de mesa para dar una reduccioacuten de
cerca de 104 UFCml de la poblacioacuten de diferente tipo de microorganismos en 24
horas Las diferencias que existen entre las levaduras y bacterias en base a la
27
sensibilidad a este compuesto son dadas a conocer por diferentes autores (Warth
1977 1985 Du Toit 2005 Davis 1988 Hood 1983)40
16 Antibrettreg como alternativa de prevencioacuten y eliminacioacuten de
BrettanomycesDekkera
Antibrettreg es un producto nuevo creado por Spindal SARL-Gretz - Armainvilliers
Francia Es una preparacioacuten enzimaacutetica para inactivar Brettanomyces y para
reducir olores producidos por fenoles volaacutetiles41
Antibrettreg es preparado a base de paredes celulares de levadura activados
enzimaacuteticamente que presentan elevadas propiedades adsorbentes frente al 4-
etilfeno y 4- etilguayacol compuestos asociados con olores desagradables en el
vino tales como sudor de caballo farmacia o barniz42
Antibrettreg inhibe la produccioacuten de la vinilreductasa que participa en la
transformacioacuten de los aacutecidos cinaacutemicos naturalmente presentes en los vinos en
los correspondientes derivados etilados responsables de los olores atribuidos a
BrettanomycesDekkera 43
40
Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi
Springer New York United States
41 Manual de instrucciones de producto Antibrett reg producido por Spindal SARL-Gretz -
Armainvilliers France
424344 AEB Group 2008 ANTIBRETT Preparado a base de paredes celulares de levadura para la inactivacioacuten
de Brettanomyces y la eliminacioacuten de los olores de estos productos httpwwwaeb-
groupcomimgsSPAGNOLODepliantANTIBRETT-lett-ESPpdf
28
El uso de Antibrettreg es efectivo incluso contra otros olores anoacutemalos como los
que se generan en las barricas sucias principalmente huacutemedas dantildeando la
calidad olfativa del vino44
29
2 PROBLEMA
La levadura BrettanomycesDekkera es una levadura de contaminacioacuten presente
en la mayoriacutea de industrias viniacutecolas en el mundo Afecta directamente la
produccioacuten y calidad sensorial de los vinos con el desarrollo de los compuestos 4
etilfenol y 4 etilguayacol los cuales dantildean el perfil olfativo del vino dando aromas
caracteriacutesticas a ldquoestablordquo ldquocuerordquo ldquosudor de caballordquo o ldquobarnizrdquo conocido como
ldquocaraacutecter Brettrdquo
Esta contaminacioacuten se da especialmente en los vinos tintos debido a sus
caracteriacutesticas de produccioacuten (fermentacioacuten crianza antildeejamiento) y sus
propiedades fisicoquiacutemicas (Grado alcohoacutelico pH Acidez total Acidez volaacutetil
entre otros)
En Croacia existe una gran produccioacuten de vinos tintos entre los cuales se
encuentra el vino tinto Babic proveniente de la isla de Hvar el cual es famoso por
ser un vino duro carnoso estructurado y casi sobre-maduro con un grado
alcohoacutelico que ronda los 15 vv siendo la primera denominacioacuten de origen que
se aproboacute en Croacia en el antildeo 1961 este vino es de gran importancia en la
regioacuten la mayoriacutea de sitios de elaboracioacuten son pequentildeas industrias que han sido
afectadas por el bdquocaraacutecter Brett‟ Muchas investigaciones se han realizado al
respecto de la levadura BrettanomycesDekkera pero se conoce muy poco sobre
sus efectos en el vino Babic debido a sus caracteriacutesticas particulares (alcohol
30
15 pH 35 Acidez total 520 gr Acido TartaricoL Acidez volaacutetil 08 gr Acido
AceticoL Azucar residual 47 grLt)45
La dificultad de la pequentildea industria para acceder a productos que lleven a la
identificacioacuten de la levadura mencionada y de esta manera conllevar a planes de
accioacuten contra el ldquocaraacutecter Brettrdquo es una de las grandes dificultades de la industria
vinera en este paiacutes en donde los productos para la industria enoacuteloga son
complicados y de alto precio para acceder a ellos y en consecuencia no se
realizan muchas de estas pruebas de deteccioacuten de BrettanomycesDekkera
llevando al mercado productos contaminados de baja calidad que inicialmente
podriacutea haber sido un vino de alta calidad debido a sus caracteriacutesticas uacutenicas y de
gran popularidad
45
Datos obtenidos en el laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
31
3 JUSTIFICACION
Actualmente Croacia cuenta con maacutes de 300 zonas vineras en las que se producen 67
de vino blanco 32 vino tinto y el restante 1 vino rosado De acuerdo a recientes datos
estadiacutesticos hay 650 km2 de vintildeedos en Croacia de los cuales 375 km2 son uvas con
indicacioacuten geograacutefica de origen que producen maacutes de 300 vinos y maacutes de la mitad de este
nuacutemero son vinos elaborados en microempresas con un total de 50000000 de botellas
de vino el 8 es vino superior 70 de calidad y el 22 es vino de mesa de produccioacuten
nacional46
Croacia es un fuerte productor de vino a nivel regional con sus diferentes variedades
propias (Merlot Plavac Dingač Postup Malvazija Pošip Kujundžuša Babic) pero dicha
produccioacuten ha sido fuertemente afectada por la presencia de la levadura
BrettanomycesDekkera trayendo consecuencias como perdidas de produccioacuten peacuterdida
de calidad sensorial del vino grandes peacuterdidas econoacutemicas y desprestigio a sus vinos de
denominacioacuten de origen
Es por esto que en este proyecto de investigacioacuten se busca una faacutecil y raacutepida
identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera causante del ldquocaraacutecter Brettrdquo con el
desarrollo de medios selectivos liquido y solido ademaacutes de opciones para el tratamiento
yo prevencioacuten de esta levadura en la cadena productiva comparativamente entre dioacutexido
de azufre (SO2 ) y Antibrettreg y la identificacioacuten de los aromas caracteriacutesticos del ldquocaraacutecter
Brettrdquo en el vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia
46
Hrvatski zavod za vinogradarstvo i vinasrtvo 2003 Pravilnik o vinu httpwwwhrzvvhrpropisihtm
32
4 OBJETIVOS
41 General
Caracterizar y evaluar el comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera
en teacuterminos de crecimiento y produccioacuten de aromas no deseados en vino tinto
Babic
42 Especiacuteficos
Desarrollar el medio solido y medio liacutequido selectivo para
BrettanomycesDekkera
Evaluar el comportamiento de la levadura en estos medios selectivos
Determinar la influencia del Dioacutexido de azufre (SO2) y el compuesto
Antibrettreg en la levadura BrettanomycesDekkera presente en vino tinto
Babic 2007
Identificar los compuestos aromaacuteticos producidos por Brettanomyces
bruxellensis en vino tinto Babic usando el meacutetodo ldquomultiple headspace
solid-phase microextraction (SPME)rdquo
33
5 ALCANCES
En este proyecto se pretende desarrollar un medio selectivo faacutecil de producir en
donde sea raacutepida la identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera en la
produccioacuten de vinos tintos se realizaran pruebas para corroborar el crecimiento de
esta levadura en el medio determinando el tiempo que esta levadura toma en
adaptarse en el medio y su comportamiento en este una vez comprobada su
adaptacioacuten al medio liquido se trabajara con el meacutetodo de cromatografiacutea de gas
(GC) y el uso de micro extraccioacuten en fase solida (SPME) para el anaacutelisis
cuantitativo de los compuestos volaacutetiles (4-etil-fenol 4-etil-guayacol4-vinilfenol y
4-vinil-guayacol) y posteriormente con el vino tinto Babic Ademaacutes se desea
comprobar la efectividad de los productos con que las vineras de Croacia inhiben
o eliminan la presencia de la levadura en los vinos tintos como lo son el producto
AntiBrettreg y el Dioacutexido de azufre (SO2)
34
6 ESTADO DEL ARTE
Sobre el campo problemico causado por la levadura BrettanomycesDekkera en la
industria viniacutecola se han realizado bastante investigaciones a nivel de
caracterizacioacuten de la levadura los factores fisicoquiacutemicos que favorecen el
crecimiento de la levadura meacutetodos de prevencioacuten y control evaluacioacuten de
dantildeos sensoriales en diferentes tipos de vinos formacioacuten de compuestos fenoacutelicos
en los diferentes tipos de vino otros compuestos no fenoacutelicos asociados al
ldquocaraacutecter Brettrdquo teacutecnicas de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera
evaluacioacuten de la teacutecnicas de control e inhibicioacuten de dicha levadura desarrollo de
nuevos medios de deteccioacuten y aislamiento de la levadura relacioacuten entre la
levadura BrettanomycesDekkera con las otras levaduras presentes en el vino
entre otros
Seguacuten estas investigaciones se analizan aquellas que pueden aportar datos
importantes para el desarrollo del trabajo que se quiere realizar y se tiene en
cuenta sus metodologiacuteas conclusiones recomendaciones y comentarios
Entre las importantes para el planteamiento de este trabajo se menciona el trabajo
realizado por la Universidad Politeacutecnica de Madrid Espantildea el cual analiza
algunas de las caracteriacutesticas maacutes relevantes de este geacutenero de levaduras su
crecimiento en bodega factores fisicoquiacutemicos que favorecen su crecimiento y
desarrollo en el vino los defectos sensoriales que presenta en los vinos y estudia
algunas de los meacutetodos fiacutesicos para el control de BrettanomycesDekkera en vino
35
(clarificacioacuten filtracioacuten amicrobica proteiacutenas clarificantes anhiacutedrido sulfuros
dimetil dicarbonato Aditivos)47
Para conocer maacutes sobre la levadura en condiciones de barrica y almacenamiento
se revisa el articulo elaborado en el Departamento Teacutecnico Guserbiot La rioja
Espantildea en este artiacuteculo se describe brevemente su metabolismo y su ecologiacutea en
las bodegas Igualmente se comparan las teacutecnicas utilizadas en los laboratorios
para su deteccioacuten y cuaacuteles son las limitaciones de los diferentes meacutetodos
Finalmente se analizan las estrategias desarrolladas para su eliminacioacuten de las
bodegas y se dan una serie de recomendaciones para su control48
El instituto de fermentaciones Industriales Consejo superior de investigaciones
cientiacuteficas Juan de Cierva Madrid Espantildea en el cual se revisa la formacioacuten de
etilfenoles (4 etil-fenol 4 etil guayacol) en vinos tintos anejos Los factores
fisicoquiacutemicos que favorecen el crecimiento de la levadura no deseada
BrettanomycesDekkera las teacutecnicas usadas para la detectar la presencia de esta
levadura en vinos ( Revisioacuten microscoacutepica fluorescente remocioacuten de aacutecidos
grasos de su membrana teacutecnicas moleculares como PCR y electroforesis) y de
control (Proteiacutenas fining Fining con gelatina liquida filtracioacuten variables
fisicoquiacutemicas adicioacuten de aditivos procedimientos de altas presiones
manipulacioacuten geneacutetica) con esta investigacioacuten se concluye que la combinacioacuten y el
uso de las numerosas teacutecnicas pueden ayudar a la prevencioacuten y reduccioacuten de la
levadura BrettanomycesDekkera 49 Este trabajo muestra las muacuteltiples opciones
47
A Morata S Benito F Palomero F Calderoacuten y J A Suaacuterez-Lepe Ecologiacutea y prevencioacuten de
BrettanomycesDekkera durante la elaboracioacuten y crianza de vinos tintos Revista enoacutelogos (Editada por la
Federacioacuten Espantildeola de Asociaciones de Enoacutelogos y Periodistas Asociados) No 50 paacuteg 1-12 Madrid Espantildea
48 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 20-
24 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
49 R Suarez JA Suarez-Lepe A Morata F Calderon 2006 The production of ethyl phenols in wine by yeasts
of the genera Brettanomyces and Dekkera A review Journal Food Chemistry No 102 pag 10-21 Madrid
Espantildea
36
existentes en el control y prevencioacuten de la levadura mencionada sin embargo deja
claro que la mayoriacutea de estas opciones son costosas y no de faacutecil adquisicioacuten para
una pequentildea industria
El anaacutelisis sensorial ha sido de los aspectos maacutes estudiados al respecto de
BrettanomycesDekkera una de estas investigaciones fue realizada en Centre
Europeacuteen des Sciences du Goucirct en Talence Francia en el cual se evaluaron 50
vinos bordeaux sensorialmente para demostrar la complejidad del ldquoCaraacutecter Brett‟‟
al cual se unen otros compuestos aromaacuteticos ademaacutes de los fenoacutelicos como acido
isobutirico e isovalerico en este tipo de vino debido a sus caracteriacutesticas
fisicoquiacutemicas50
De los meacutetodos de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera los medios
selectivos son muy populares es por esto que el Laboratorio de Microbiologiacutea
Departamento de Botanica e Engenharia Biologica Instituto Superior de
Agronomia Lisboa Portugal realizo un trabajo en el cual se pretendia desarrollar
un medio selectivo o diferencial capaz de aislar la levadura
BrettanomycesDekkera del vino y de la cadena productiva del vino con el fin de
detreminar la relacioacuten entre esta levadura y los compuestos 4-etilfenol y 4 etil-
guayacol51 otro estudio realizado para la deteccioacuten de dicha levadura fue
realizado en la Escola Superior de Biotecnologiacutea Universidade Catoacutelica
Portuguesa el desarrollo de un simple procedimiento compatible con las rutinas
50 Andrea Romano a Marie Claire Perello a Aline Lonvaud-Funel Gilles Sicard Gilles de Revel2008 Sensory
and analytical re-evaluation of lsquolsquoBrett characterrdquo Journal Food Chemestry No 114 pag 15-19 Talence
France
51 N Rodrigues G Gonccedilalves S Pereira-da-Silva M Malfeito-Ferreira and V Loureiro2001 Development
and use of a new medium to detect yeasts of the genera DekkeraBrettanomyces Journal of applied microbiology No 90 pag 588-599Lisboa Portugal
37
usadas en las vineras para la deteccioacuten de BrettanomycesDekkera en vino y en
maquinarias52
En el laboratorio de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas Alcohoacutelicas de la
Universidad de Zagreb se ha trabajado anteriormente en el desarrollo de medio
solido selectivo con pruebas de diferentes concentraciones de los compuestos
como resultados se encuentra una buen relacioacuten entre las concentraciones de los
compuestos sin embargo como recomendaciones se encuentran la falta de
antibioacutetico para evitar contaminacioacuten por bacterias probar con diferentes fuentes
de carbono para comparacioacuten de tiempo de crecimiento positivo y un monitoreo
diario en el medio53
Los compuestos aromaacuteticos que libera la presencia de BrettanomycesDekkera
estaacute asociada a los compuestos 4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinilfenol y 4
viniguayacol a partir de esto los centros de investigacioacuten han hondado en la
identificacioacuten de dichos compuestos relacionados en la enologiacutea y especialmente
con BrettanomycesDekkera a partir de eso el Departamento de Quiacutemica
Universidad de La Rioja Espantildea este estudio presenta un meacutetodo basado en el
uso de Cromatografiacutea de Gas y micro extraccioacuten en fase solida para el anaacutelisis
cuantitativo de 4-etilfenol 4-etil guayacol 4-vinilfenol 4-vinilguayacol
Demostrando la existencia de un efecto matriz en el anaacutelisis de compuestos
responsables del ldquocaraacutecter Brettrdquo en vino Este nuevo meacutetodo fue
satisfactoriamente aplicado a cierto nuacutemero de vinos tintos comerciales vinos
52
JA Couto A Barbosa and T Hogg 2005 A simple cultural method for the presumptive detection of the yeasts BrettanomycesDekkera in wines Letters in Applied Microbiology No 41 pag 505-510 Porto
Portugal
53 Serkovic Dubravka Gracin Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac
Brettanomyces bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet pag 1-117 ZagrebCroatia
38
blancos y roseacute Este meacutetodo puede ser una alternativa para evitar el efecto matriz
en muestras de vino54
De acuerdo con este tema en la jornada cientiacutefica del 99 el grupo de investigacioacuten
enoloacutegica se estudio la formacioacuten de sustancias volaacutetiles por 13 cepas de S
cerevisiae con buenas aptitudes enoloacutegicas inoculadas individualmente en un
mosto homogeacuteneo de la variedad airen fermentado en las mismas condiciones
de aireacioacuten y a temperatura controlada55
54
C Pizarro N Perez-del-Notario JM Gonzalez-Saiz 2007 Determination of Brett character responsible
compounds in wines by using multiple headspace solid-phase micro extraction Journal of Chromatography
No 1143 pag 176-181 La Rioja Espantildea
55 E Pueyo P Hidalgo K Fernaacutendez y P Martiacuten-Aacutelvarez 1999 Anaacutelisis de compuestos volaacutetiles en vinos
obtenidos con distintas cepas de Saccharomyces cerevisiae Aplicacioacuten de la teacutecnica de microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientificas 99 Grupos de Investigacion Enologica Zaragoza Espana
39
7 MATERIALES Y METODOS
A continuacioacuten se presentan materiales y meacutetodos para la investigacioacuten
Este proyecto fue realizado en su gran mayoriacutea en las instalaciones de la
Universidad de Zagreb en la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos
(PBF) Laboratorios del Departamento de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas
Alcohoacutelicas ubicado en la ciudad de Zagreb Croacia
Los anaacutelisis fisicoquiacutemicos del vino tinto Babic fueron realizados en los
laboratorios de VINOLAB ubicado en Zagreb Croacia
71 MEDIO SOLIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera
711 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Autoclave de laboratorio
Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa Etanol peptona extracto de levadura
agar cicloheximida acido cumaacuterico ampicilina)
Balanza electroacutenica de precisioacuten
Microscopio oacuteptico
712 Metodologiacutea
Basados en estudios anteriores realizados en el laboratorio para el desarrollo de
medio solido selectivo para BrettanomycesDekkera (Serkovic Dubravka Gracin
40
Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac Brettanomyces
bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet Universidad de Zagreb pag 1-
117 Zagreb Croacia) se evaluaron las recomendaciones mencionadas en dicha
investigacioacuten para la mejoriacutea y desarrollo de otros medios soacutelidos selectivos
Se usoacute como base el medio YPD (Yeast Peptone Dextrose) el cual estaacute
compuesto de la siguiente forma 20gL peptona 10 gl extracto de levadura 20 gl
de agar56 este medio es selectivo para levaduras pero no es selectivo entre ellas
Es necesario el uso de una fuente de carbono para la levadura
BrettanomycesDekkera de acuerdo a la teoriacutea y revisando la tabla 1 (Relacioacuten de
los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) y seguacuten
facilidades de disponibilidad en el laboratorio se utiliza glucosa la cual es
utilizable por entre 75-100 de las cepas de BrettanomycesDekkera seguacuten la
tabla mencionada anteriormente
Esta fuente de carbono (Glucosa) fue probada en una concentracioacuten de 20 gL
Cicloheximida fue probada a 30 mgL para inhibir Saccharomyces en el medio y
darle mayor selectividad para Brettanomyces Dekkera Se antildeade acido p-
cumarico en una concentracioacuten de 100 mgL como precursor para la formacioacuten
del compuesto 4 etilfenol caracteriacutestico de la levadura BrettanomycesDekkera
Para inhibir bacterias en el medio se usa ampicilina a 10 mgL esta se agrega
despueacutes de realizada la esterilizacioacuten y cuando la temperatura del medio este
igual o menor a 40C El pH del medio se ajusto a 5
Paralelamente se crea el medio con Etanol como fuente de carbono en una
concentracioacuten de 6 o 60 mlL con la misma concentracioacuten de los otros
compuesto como cicloheximida 30mgL acido cumarico 100mgL 20 gL peptona
10 gL de extracto de levadura 16gL de agar Este medio se crea como
56
Concentraciones preestablecidas en el laboratorio de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas alcoholicas
41
comparativo para determinar cual fuente de carbono es la maacutes utilizada por la
levadura Brettanomyces bruxellensis para su reproduccioacuten Seguacuten la teoriacutea (ver
tabla 1) el etanol es utilizado por entre 25-75 de las cepas de
BrettanomycesDekkera pero es el azuacutecar que se encuentra en mayor
concentracioacuten presente en los vinos tintos aproximadamente 130 gl57
Estos medios fueron debidamente esterilizados para eliminar cualquier
microorganismo o espora presente en este Este procedimiento se realizo por el
meacutetodo de combinacioacuten de altas temperatura y presioacuten (Autoclave 121 C a 1034
kPa)
Se usaron colonias de BrettanomycesDekkera aisladas anteriormente de vinos
contaminados y guardas para investigaciones en el Departamento de Tecnologiacutea y
Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos
Universidad de Zagreb Croacia
Los medios fueron monitoreados visualmente todos los diacuteas y se toman
observaciones de macroscoacutepicas y microscoacutepicas Se comparan estos dos medios
en teacuterminos de rapidez de crecimiento de la levadura y selectividad Estas
muestras fueron incubadas a 28C por 10 diacuteas
La prueba fue realizada por duplicado en diferentes tiempos
57
Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
42
72 MEDIO LIacuteQUIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera
721 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Frascos de vidrio esteacuteriles
Autoclave de laboratorio
Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa peptona extracto de levadura
cicloheximida acido cumarico ampicilina etanol)
Microscopio oacuteptico
Balanza electroacutenica de precisioacuten
722 Metodologiacutea
En el mercado para enologiacutea existen medio liacutequidos selectivos para la deteccioacuten
de BrettanomycesDekkera en vinos sin embargo estos son de difiacutecil accesibilidad
por sus elevados precios es por esto que se desarrolla un medio liquido selectivo
para dicha levadura en el laboratorio del Departmaneto de Tecnologiacutea y Anaacutelisis
de Bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia
Para este medio se toma como base el medio selectivo con Glucosa como fuente
carbono desarrollado anteriormente sin usar agar para mantener el medio en su
estado liquido
43
La composicioacuten de este medio liacutequido es la siguiente
20 gL Glucosa
20 gL peptona
10gL extracto de levadura
30mgL de cicloheximida
100mgL acido p-cumarico
10 mgL ampicilina
Estos compuestos fueron medidos en una balanza electroacutenica de precisioacuten se
antildeade 250 ml de agua destilada y se mezcla constantemente se pasa a proceso
de esterilizacioacuten en autoclave a 120C y 1034 KPa por 45 minutos
De esta forma se asegura la usencia de microorganismos yo esporas en el
medio Despueacutes de bajar la Temperatura a 40C se agrega a la mezcla ampicilina
en una concentracioacuten de 10mgL
En frascos de vidrio esteacuteril se agrega 40 ml de medio liacutequido y diferentes
cantidades iniciales de levaduras BrettanomycesDekkera fueron inoculadas al
respectivo medio el primer frasco tiene una cantidad de 106 ceacutelulasml el segundo
tiene 104 ceacutelulasml el tercero tiene 102 celulasml y el cuarto con una cantidad
aproximada de 25 ceacutelulasml Estas cantidades estaacuten basadas en estudios
anteriores para medios liacutequidos selectivos en levaduras58
58 J Ungar A M James P W Muggleton H F Pegler y E G Tomich1950 The Cultivation of
Haemophilus pertussis in Partially Defined Liquid Media Journal of General Microbiology No 4
pag 345-359 Greenford
44
Este medio liacutequido inoculado fue inspeccionado diariamente visualmente revisioacuten
de turbidez microscoacutepicamente y olfativamente para deteccioacuten de olores del
ldquocaraacutecter Brettrdquo
Los diacuteas fueron contabilizados para determinar resultados positivos en estos
ensayos
73 INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN
VINO TINTO DE LA REGION DE DALMACIA CROACIA
731 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Medio selectivo solido para BretanomycesDekkera
Medio selectivo Liquido para BrettanomycesDekkera
Quiacutemicos de laboratorio (Dioxido de Azufre (SO2) Antibrettreg Glucosa)
Vino Babic 2007
Anallizador infrarojo Bacchius II microdom
732 Metodologiacutea
Con los medios desarrollados (solido y liquido) se quiere conocer el efecto del
dioacutexido de azufre (SO2) y el producto Antibrettreg en la levadura
BrettanomycesDekkera presente en el vino tinto de la regioacuten de Dalmacia
Con las herramientas que se tienen en el laboratorio del departamento de
tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia se quiere
determinar la influencia de estos productos en la levadura BrettanomycesDekkera
presente en vino tinto croata de la regioacuten de Dalmacia Babic
45
El primer paso es adaptar la levadura al vino tinto croata (Babic) para esto se
inoculan 20 colonias de BrettanomycesDekkera en 500 ml de vino se antildeadioacute
glucosa en una concentracioacuten de 2gL y se oxigena la mezcla Para este paso de
adaptacioacuten se dejan las muestras de 1 a 2 diacuteas a temperatura ambiente (20C)
Despueacutes de este periodo se revisa microscoacutepicamente la presencia positiva de
BrettanomycesDekkera en los 500 ml de vino en los que se estaba haciendo el
paso de adaptacioacuten en Babic al comprobar su presencia positiva se procede a
mezclar los 500 ml de vino contaminado con BrettanomycesDekkera con los 3
Litros de vino Babic que se disponen para esta prueba
Estos 3 litros de vino tinto Babic contaminado con la levadura
BrettanomycesDekkera se reparten en 8 frascos de vidrios esteacuteriles al siguiente
diacutea se toman dos frascos para agregar cada uno de los compuestos a evaluar
(SO2 y Antibrettreg)
Para SO2 se toman dos frascos uno de 600ml y uno de 100ml se agrega una
concentracioacuten de 40 mgl
Para el producto AntiBrettreg se toman cuatro frascos dos de 600 ml y dos de 100
ml seguacuten especificaciones del producto y la alta poblacioacuten de
BrettanomycesDekkera en las muestras se adiciono la maacutexima concentracioacuten de
AntiBrettreg a las muestras la cual fue de 40 gHl
Estas muestras se dejaron a temperatura ambiente simulando condiciones de
almacenamiento del vino en barricas temperatura aproximada de 20C evitando el
contacto con la luz solar y evitando movimientos fuertes Esto se mantuvo por 15
diacuteas que fue el tiempo de duracioacuten del experimento
Con el vino restante se mantuvo en las mismas condiciones de almacenamiento
de los demaacutes para hacer un paralelo de comparacioacuten
Previamente se analizaron las caracteriacutesticas del vino sin contaminar por medio
del analizador infrarrojo Bacchus II microdom antes de agregar los compuestos
46
SO2 y AntiBrettreg y despueacutes se volvioacute a realizar el anaacutelisis para determinar los
efectos de estos compuestos en el vino y asiacute mismo al de control
74 DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN
EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO
MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE
741 Materiales
Cromatografo de Gas HP5890 Serie II
Microextractor de fase solida (SPME)
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Quiacutemicos de laboratorio (p-cresolAcetaldehido Propanol diacetil etil-
acetato i-butanol acido aceacutetico i-amil-alcohol n-amil lactato de etilo
acetato amil metiacutelico 1-hexanol etil-hexanol linalol nerol citronelol
geraniol 2-feniletanol octanoato de etilo 4-etilfenol 2-feniletil acetato 4-
etilguaiacol)
Vino Tinto Babic
Agua destilada
742 Metodologiacutea
El meacutetodo fue desarrollado anteriormente en el Departamento de Tecnologiacutea y
Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos de
la Universidad de Zagreb Croacia Y despueacutes de modificaciones fue utilizado en el
desarrollo del trabajo El meacutetodo utilizado es descrito a continuacioacuten
47
Cromatografo de gas HP 5890 SERIES II
Programa HP-chem
a) Condiciones para analisis SPME-GC
Muestra diluida 5050 con adicion de estandar interno (p-cresol1mgl)
25ml de la muestra diluida con mezcla continua a temperatura ambiente
Tiempo de adsorcion 30 minutos
SPME es colocado en la muestra para la adsorcion durante el tiempo
previsto
b) Condiciones para el Cromatografo de gas (GC)
La columna usada en este experimento es RTXreg-5 (Restec USA sn 210627)
30m id=025mm 025μm
Gas portador Nitrogeno
Flujo del Nitrogeno 5 mlmin
Temperatura del inyector 240 C
Temperatura del detector 250 C
Temperaturas programadas 35 C5 min 150 C 34 Cmin 180 C
10Cmin 190 C 5 Cmin
Se conocen los resultados del cromatografiacutea de gases (ver tabla 10) y se hacen
necesarias varias correcciones del meacutetodo y algunas pruebas con unos
compuestos para determinar realmente su tiempo de retencioacuten en este tipo de
vino Se deben comprobar tiempos de retencioacuten
48
8 DISCUSIOacuteN Y RESULTADOS
81 RESULTADOS PARA EL DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO
Tabla 2 Medio Selectivo con Glucosa como fuente de carbono para
BrettanomycesDekkera en incubacioacuten por 5 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten
microscoacutepica
1 Negativo Negativo - No se realiza
2 Negativo Negativo - Presencia de levaduras
3 Negativo Negativo - Presencia de
Levaduras
4 Aparicioacuten de
algunas colonias
Negativo Transparente Presencia de levaduras
5 Colonias definidas Positivo-
Fenoles
Amarillo Presencia positiva de
BrettanomycesDekkera
49
Este medio tiene alto grado de selectividad para levaduras con un tiempo de
crecimiento de aproximadamente 5 diacuteas en 28C lo que lo hace raacutepido gracias al
antibioacutetico (ampicilina) que hace parte de la composicioacuten del medio no hay
presencia de bacterias Se hace confiable para resultados positivos de levaduras
BrettanomycesDekkera debido a que las levaduras Saccharomyces fueron
inhibidas con el compuesto cicloheximida su selectividad fue comprobada por
revisioacuten microscoacutepica macroscoacutepica y sensorial
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con glucosa como fuente de carboacuten son las
siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
50
Tabla 3 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono para Brettanomyces Dekkera en
incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica
1 Ninguno Negativo - -
2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras y
bacterias
9 Diminutas
colonias
transparentes
Negativo Transparentes Presencia de levaduras y
algunas bacterias
10 Positivo Positivo-
Fenoacutelicos
Amarillo Presencia de levaduras
BrettanomycesDekkera y
bacterias
El medio selectivo para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de
carbono tambieacuten es selectiva entre levaduras ya que solo se identifico la levadura
BrettanomycesDekkera en este sin embargo se evidencia una presencia de otro
microorganismo presuntamente bacteria ya que este medio no contiene agente
antibacteriano (ampicilina) Es necesaria la adicioacuten de ampicilina en una
concentracioacuten de 10mgl para inhibir la presencia de bacterias
Este medio presenta un tiempo maacutes prolongado para mostrar crecimiento de la
levadura BrettanomycesDekkera aproximadamente 10 diacuteas
51
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las
presentadas en el medio selectivo con glucosa como fuente de carbono y son las
siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
52
Tabla 4 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono y adicioacuten de ampicilina para
Brettanomyces Dekkera en incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica
1 Ninguno Negativo - -
2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
9 Diminutas
colonias
transparentes
Negativo Transparentes Presencia de levaduras
10 Positivo Positivo-
Fenoacutelicos
Amarillo Presencia de levaduras
BrettanomycesDekkera
El efecto de la ampicilina sobre el medio selectivo con etanol como fuente de
carbono fue el esperado inhibioacute completamente el crecimiento de colonias
bacterianas en el medio el tiempo de crecimiento de la levadura y presencia de
aromas fenoacutelicos fue el mismo de 10 diacuteas en incubacioacuten de 28C
53
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las
presentadas anteriormente y son las siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
82 RESULTADOS PRUEBAS MEDIO LIQUIDO
Tabla 5 Influencia de la concentracioacuten de levaduras BrettanomycesDekkera en el
tiempo necesario para detectar la produccioacuten de 4-etil-fenol en medio liquido
Nuacutemero de ceacutelulas ml
(concentracioacuten final)
Tiempo necesario para obtener resultados
positivos (diacuteas)
1 Experimento
32x106 le 3
3 X 104 3
33x102 7
40 No detectado
2 Experimento
43x106 le3
39x104 le3
37x102 8
62 No detectado
54
El nuacutemero de ceacutelulas de levadura de BrettanomycesDekkera fue contabilizado
usando contador de ceacutelulas Chamber
Los aromas fenoacutelicos son difiacuteciles de detectar debido al fuerte olor que tiene el
medio liquido caracteriacutestico de sus componentes esto dificulta la identificacioacuten del
ldquocaraacutecter Brettrdquo en especial cuando las concentraciones de
BrettanomycesDekkera no son elevadas Ademaacutes de los olores fenoacutelicos otros
compuestos volaacutetiles se detectan tales como acido aceacutetico y olores oxidativos
tambieacuten producido por la levadura BrettanomycesDekkera
En la inspeccioacuten visual se detecta alta turbidez en el medio Se compara con un
medio sin presencia de BrettanomycesDekkera
En las muestras con mayor concentracioacuten de la levadura es maacutes notoria la
turbidez Despueacutes de 3 diacuteas se presenta un precipitado blanco en todas las
muestras de altas concentraciones
La revisioacuten microbioloacutegica se realiza diariamente para determinar el nuacutemero de
ceacutelulas y la presencia positiva de la levadura a evaluar
Entre los dos experimentos realizados con el medio liquido el tiempo que se
demoro en detectar compuestos fenoacutelicos fue muy similar entre ellos
dependiendo del nuacutemero de ceacutelulas en el medio en mayores concentraciones el
tiempo de deteccioacuten fue menor
Hay que sentildealar que BrettanomycesDekkera debe alcanzar una concentracioacuten
miacutenima (denominada poblacioacuten criacutetica) de 103 UFCml para comenzar a liberar etil
fenoles Por debajo de esta concentracioacuten la levadura seriacutea metaboacutelicamente
activa pero no produciraacute compuestos alterantes a niveles detectables esto se ve
reflejado en los resultados en los que las concentraciones de ceacutelulas son muy
bajas
55
Estos resultados se comparan con los resultados dados en el medio solido Los
dos medios muestran altos grados de selectividad hacia la levadura
BrettanomycesDekkera y similar comportamiento para el crecimiento de dicha
levadura
En el medio liacutequido cuando hay altas concentraciones de BrettanomycesDekkera
el tiempo de deteccioacuten del microorganismo es menor que con el medio solido pues
en el liacutequido es aproximadamente 3 diacuteas y en el soacutelido son 5 diacuteas
83 RESULTADOS DE LA INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE
(SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO DE LA REGION DE
DALMACIA CROACIA
El vino fue analizado antes de la adicioacuten de los compuestos quiacutemicos a evaluar y
15 diacuteas despueacutes de adicioacuten para ver la reaccioacuten de este frente a SO2 y Antibrettreg
estas caracteriacutesticas se determinaron con el equipo de laboratorio Bacchus II
Microdom localizado en el laboratorio Vinolab doo Zagreb Croacia Los
resultados se muestran en la tabla
Tabla 6 Resultados de las muestras de vino inoculados con la levadura BrettanomycesDekkera
durante 15 diacuteas Comparativos con los diferentes compuestos
CFUml
Vino Day 1 Day 4 Day 10 Day 15
Control 130E+04 800E+03 700E+03 500E+03
Control 800E+03 640E+03 700E+03 280E+03
SO2 110E+04 400E+02 400E+02 67
SO2 900E+03 380E+03 270E+03 183
Antibrett 140E+05 920E+04 140E+04 400E+03
Antibrett 210E+05 181E+05 160E+04 900E+03
Antibrett 120E+05 990E+04 120E+04 100E+03
Antibrett 230E+05 204E+05 300E+03 200E+03
56
Tabla 7 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 antes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o
Antibrettreg Diacutea 0
Alcohol
()
Acidez Total
(gr Aci
Tartaacuterico L)
Acidez volaacutetil
(Aci
AceacuteticoL)
Densidad
(grml)
Azuacutecar residual
(grl)
Extracto
seco
(grl)
Acido
Laacutectico
(grl)
Glicerol
(grl)
Taninos
(grl)
Acetato
(grl)
1473
525
083
09928
473
332
164
799
305
117
1471
522
084
09927
479
329
162
786
299
116
Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
Tabla 8 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 despueacutes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o
Antibrettreg Diacutea 15
Alcohol
()
Acidez Total
(gr Aci
Tartaacuterico L)
Acidez volaacutetil
(Aci
AceacuteticoL)
Densidad
(grml)
Azuacutecar residual
(grl)
Extrac
to seco
(grl)
Acido
Laacutectico
(grl)
Glicerol
(grl)
Taninos
(grl)
Acetatos
(grl)
Control
1414
565
107
09935
436
364
177
827
259
136
Control
1415
556
108
09936
420
365
170
824
256
137
SO2
1456 543 108 09932 476 369 167 803 281 125
SO2
1457
542 108 09933 472 370 170 804 271 124
Antibrett 1454 533 106 09933 448 371 175 813 277 125
Antibrett 1455 534 105 09933 460 372 171 809 282 124
Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
57
Figura 4 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en el vino de control para
evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas
El comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en la prueba por
duplicado en el vino de control fue muy similar pues con el tiempo esta levadura
deja de reproducirse y va muriendo cuando las condiciones ya no son aptas para
su desarrollo debido a que la mayoriacutea de su fuente de carbono (Glucosa) esta
consumida sin embargo esta levadura no llega a su desaparicioacuten total lo que
representa uno de los mayores problemas en la elaboracioacuten del vino
Esta levadura tiene un metabolismo lento y el factor tiempo es un requisito
fundamental para su desarrollo este experimento se empezoacute con una alta
poblacioacuten de BrettanomycesDekkera (130 x 104 UFCml y 8 x 103 UFCml
respectivamente) y durante el transcurso del tiempo la poblacioacuten fue disminuyendo
debido a la perdida de las condiciones necesarias para la reproduccioacuten
58
Figura 5 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de SO2 en
concentracioacuten de 40 mgl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas
El SO2 tuvo un comportamiento efectivo y raacutepido contra las colonias de
BrettanomycesDekkera La poblacioacuten de esta levadura se redujo de forma
significativa entre el diacutea primero y el cuarto se encontroacute una diferencia porcentual
de 96 en la primera prueba y del 60 en la de duplicado al diacutea 15 ya la
poblacioacuten era casi nula pasando raacutepidamente de un numero por encima de la
poblacioacuten critica de la levadura BrettanomycesDekkera a un numero lt103 UFCml
siendo muy eficaz y raacutepido en el manejo de produccioacuten
Este compuesto ademaacutes de favorecer la extraccioacuten de los compuestos fenoacutelicos y
de su actividad antioxidante al inhibir la accioacuten de las polifenoloxidasas a dosis
adecuadas de un maacuteximo de 50gl inhibe la multiplicacioacuten bacteriana y de
levaduras
59
Figura 6 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de
Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo
de 15 diacuteas
Figura 7 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de
Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo
de 15 diacuteas
El compuesto Antibrettreg en la primera prueba tanto como en el duplicado tuvo su
mayor tiempo de reduccioacuten de UFCml entre los diacuteas 4-10 con una diferencia
porcentual de 91 en comparacioacuten con el diacutea cuarto al decimo a diferencia de
60
SO2 el cual presenta la gran disminucioacuten de colonias entre los primeros diacuteas de
agregarse el producto
El tiempo para que la poblacioacuten de la levadura llegara a la cantidad menor a la de
la poblacioacuten critica es mucho mayor que la del compuesto SO2 sabiendo que esta
poblacioacuten debe ser lt103 UFCml
El compuesto Antibrettreg puede tardarse 4-10 diacuteas en representar una reduccioacuten
de UFCml significativa en dicho tiempo puede representar grandes peacuterdidas
nutricionales y altos costos de produccioacuten para la fabricacioacuten
Figura 8 Comportamiento del contenido de alcohol en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin adicioacuten)
hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
BrettanomycesDekkera estaacute presente en vinos de alto contenido alcohoacutelico
aproximadamente entre 125 a 14 pues esta levadura toma a etanol como
fuente de carbono y este vino (Babic) procede de uvas muy maduras las cuales
presentan mayor cantidad de azuacutecares residuales (como glucosa y fructosa y
otras pentosas residuales)
138
14
142
144
146
148
Alcohol
Day 0 Day 15
61
Analizando el comportamiento del vino durante el experimento de 15 diacuteas sin
compuestos quiacutemicos y con SO2 y Antibrettreg a partir de las caracteriacutesticas
iniacuteciales que se determinaron seguacuten el equipo BACCHUS analizador infrarrojo se
presenta en general una reduccioacuten del contenido alcohoacutelico de este vino pero se
ve una mayor reduccioacuten en el vino de control el cual redujo en un 394 su
contenido alcohoacutelico desde el dia 0 hasta el diacutea 15 este vino no tiene ninguacuten
compuesto contra la levadura BrettanomycesDekkera y por su elevada presencia
en los 15 diacuteas de experimento consumioacute esta cantidad de etanol
Mientras en el vino que conteniacutea SO2 tras 15 diacuteas de tratamiento se vio una
reduccioacuten de alcohol de 1 ya que este compuesto redujo la cantidad de
BrettanomycesDekkera en los primeros diacuteas de tratamiento previniendo su
reproduccioacuten y protegiendo el contenido alcohoacutelico del vino Babic 2007
En los vinos de prueba con Antibrett reg la reduccioacuten alcohoacutelica se dio en un
porcentaje de 122 un poco maacutes alta que con SO2 y mucho maacutes baja en
comparacioacuten del vino de control este compuesto tambieacuten previno la gemacioacuten de
la levadura evitando la perdida de etanol en el vino sin embargo como este
compuesto duro mas en este proceso de eliminar BrettanomycesDekkera se
produjo una mayor peacuterdida alcohoacutelica
62
Figura 9 Comportamiento del contenido de acidez volatil en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin
adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
Debido a la presencia de oxigeno en los frascos la acidez volaacutetil aumento pero no
significativamente en las muestras No hubo grandes diferencias entre las
muestras con compuestos y las de control por lo que se deduce que estos
compuestos no ayudan a evitar esta acidez Esta acidez tan alta puede dantildear la
calidad del vino de forma casi irreparable Pero el factor oxigeno es de los maacutes
controlados en la produccioacuten de vinos
la alteracioacuten del aumento de la acidez volaacutetil no estaacute relacionada con la levadura
BrettanomycesDekkera sino a la presencia de oxigeno en el almacenamiento el
oxigeno fue usado en esta prueba para promover condiciones apropiadas para el
desarrollo de la levadura
002040608
112
Acidez Volatil
Day 0 Day 15
63
Figura 10 Comportamiento del contenido de Acido Acetico en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin
adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
Brettanomyces Dekkera son productores de aacutecido aceacutetico y elevan el contenido
de los vinos anormalmente en condiciones de anaerobiosis En condiciones de
aerobiosis producen concentraciones bajas o nulas de aacutecido aceacutetico
Este acido aceacutetico al igual que los fenoles afecta el sabor y el perfil olfativo del
vino tinto este efecto es tambieacuten producido por la levadura
BrettanomycesDekkera vemos en los resultados el gran crecimiento de este
compuesto en el vino control el cual no tenia compouestos en contra de
BrettanomycesDekkera lo que produjo este aumento significativo del acido aceacutetico
en comparacioacuten con estos que teniacutean SO2 y Antibrettreg entre ellos la diferencia en
este compuesto es muy reducida y no significativa pues estos compuestos no
permitieron la gemacioacuten de esta levadura y esta no produjo este acido en esa gran
cantidad
A este compuesto se le atribuye el olor y sabor a vinagre del vino tinto un defecto
muy comuacuten y poco agradable para el consumidor
105110115120125130135140
Acido Acetico
Day 0 Day 15
64
Figura 11 Comportamiento del contenido de Azucares reductores en vino Babic 2007
desde el diacutea 0 (sin adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en
comparacioacuten con el vino de control
BrettanomyesDekkera utiliza los azucares residuales como fuente de carbono
para su crecimiento en el vino este es el factor maacutes importante para su desarrollo
y este es el que determina en cierto caso la cantidad de levaduras de
BretanomycesDekkera presente en las graficas se determina claramente que en
el vino de control donde la cantidad de esta levadura es muy alta 15 diacuteas despueacutes
de empezar las pruebas la cantidad de azucares reductores es muy baja y ha
bajado en un porcentaje de 10 mientras que el vino que tiene SO2 bajo la
cantidad de azucares reductores en un 042 y el vino que tiene el compuesto
Antibrettreg redujo su nivel de azucares reductores en 462
38
4
42
44
46
48
5
Azucares Reductores
Day 0 Day 15
65
84 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE
CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON
EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID
PHASE
Tabla 10 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en
vino Babic 2007 con el meacutetodo propuesto
Compuesto Tiempos de
retencioacuten (min)
Acetaldehiacutedo 1437
Propanol 3759
Diacetil 4202
Etil-acetato 4523
i-butanol 6232
Acido Aceacutetico 7840
i-amil alcohol 11740
n-amil 13489
lactato de etiacutelico 15741
acetato amil metiacutelico 17796
1-hexanol 19101
etil-hexanol 24456
Linalol 30370
2-feniletanol 32768
p-cresol 33522
octanoato de etilo 34226
4-etilfenol 37100
2-feniletil acetato 32769
4-etilguayacol 39704
4 vinilfenol 40529
decanoato de etilo 42117
Refirieacutendose a estos resultados es necesaria la creacioacuten de soluciones estaacutendar
para determinar tiempos de retencioacuten con el meacutetodo y si es necesario ajustes a
este
66
Tabla 11 Soluciones estaacutendar para compuestos en vinos tintos Croatas
MODEL 0
(en volumen de 100 ml en 40 Etanol)
Compuesto Pureza Cantidad
(g)
Concentracioacuten (gl)
Acetaldehiacutedo 099 1623 160677
Propanol 0995 13849 137718
Diacetil 098 01071 104958
Etil-acetato 0995 30172 3002114
i-butanol 099 15016 1486584
Acido Acetico 0995 0 0
i-amil alcohol 099 20116 1991484
n-amil 098 15442 1513316
lactato de etilio 098 00507 049686
acetato amil metilico 098 01028 100744
1-hexanol 098 00367 035966
etil-hexanol 098 00308 029876
Linalol 097 00288 027936
Nerol 097 00311 030478
Citronelol 098 0031 03038
Geraniol 098 15803 1548694
2-feniletanol 098 00402 039396
4-etilfenol 098 00812 078764
octanoato de etilo 097 00597 059103
2-feniletil acetato 099 00315 031185
4-etilguayacol 098 00803 079674
Fuente Laboratorio de anaacutelisis e investigacioacuten de bebidas Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea
de Alimentos Universidad de Zagreb Zagreb Croacia 2009
Las soluciones estaacutendar se realizan teniendo como referencia las cantidades de
estos compuestos en los vinos tintos croatas datos suministrados por el Doctor
Leo Gracin en concentraciones de gl a partir de este dato y teniendo en cuenta
67
la pureza de los compuestos que se teniacutean en el laboratorio de anaacutelisis e
investigacioacuten de bebidas se crean las soluciones estaacutendar Ejemplo
Solucioacuten estaacutendar para 4 etil-fenol en un volumen de 100 ml
Con estas soluciones estaacutendar se realizo el tiempo de retencioacuten para corroborar el
meacutetodo Los resultados de esto fueron tiempos de retencioacuten diferentes a los del
meacutetodo primero con el que se realizaron los ensayos y a partir de esos resultados
se ajusto el meacutetodo con el que se trabajo
68
Tabla 12 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en
vino Babic 2007 con el meacutetodo modificado
Compuesto Tiempos de
retencioacuten (min)
Acetaldehiacutedo 1542
Propanol 4046
Diacetil 4733
Etil-acetato 4807
i-butanol 6659
Acido Acetico 8343
i-amil alcohol 12123
n-amil 13866
lactato de etilio 16072
acetato amil metilico 18336
1-hexanol 19447
etil-hexanol 24835
Linalol 31831
2-feniletanol 33305
p-cresol 33703
octanoato de etilo 34571
4-etilfenol 37724
Citronelol 38326
Nerol 38576
2-feniletil acetato 39012
Geraniol 39944
4-etilguayacol 40271
4 vilifenol 41168
decanoato de etilo 42657
69
DIA 0
Se coloca ISTD a todas las muestras respectivas para poder determinar
cantidades de los compuestos aromaacuteticos
Se realiza la cromatografiacutea de gas al vino Babic 2007 antes de ser inoculado con
BrettanomycesDekkera
Tabla 13 Resultados de la cromatografiacutea de gas del vino Babic 2007
Compuesto Tiempo de retencioacuten
min
Cantidad
mgl
Acetaldehiacutedo 1542 0
Propanol 4046 0
Diacetil 4733 37215204
Etil-acetato 4807 0
i-butanol 6659 0
Acido Aceacutetico 8343 2817465
i-amil alcohol 12123 16799019
n-amil 13866 26
lactato de etiacutelico 16072 10983961
acetato amil metiacutelico 18336 0185196
1-hexanol 19447 264655
etil-hexanol 24835 0158751
Linalol 31831 0
2-feniletanol 33305 4235560
p-cresol 33703 1
octanoato de etilo 34571 0152412
4-etilfenol 37724 00581345
Citronelol 38326 00439729
Nerol 38576 00344799
2-feniletil acetato 39012 00407983
Geraniol 39944 0
4-etilguayacol 40271 0
4 vilifenol 41168 0
Decanoato de etilo 42657 00190144
70
Basados en los compuestos aromaacuteticos que brinda el ldquoCaraacutecter Brettrdquo se van a
analizar detalladamente los siguientes aromas 4-Etilfenol 4-Etilguayacol 4-
Vinylfenol
Figura 12 Compuestos aromaticos en vino tinto Babic sin estar contaminado con la levadura
BrettanomycesDekkera
El vino a analizar esta por debajo de las concentraciones consideradas como
perjudiciales para el aroma del vino tinto (El umbral sensorial del 4-etilfenol es de
230 μgl y el del 4-etilguaiacol es de 47 μgl) pues posee una concentracion de
58microgL de 4etilfenol 0 microgL de 4 etilguayacol y 0 microgL de vinylfenol
841 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGUacuteN TEMPERATURAS
DE ALMACENAMIENTO
0
02
4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinylfenol
Vino 00581345 0 0
C (
mg
L)
Vino Babic 2007 Dia 0
71
Tabla 14 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el
ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 20C por 4 diacuteas Prueba por duplicado
MUESTRAS INCUBADA A 20C
Compuesto Day 1
Amount
(mgL)
Day 2
Amount
(mgL)
Day 3
Amount
(mgL)
Day 4
Amount
(mgL)
4-etilfenol 0260244 017294 0177547 020156
4-etilfenol 0260244 0245915 0204542 0262499
4-etilguayacol 0 0 0 0
4-etilguayacol 0 0 0 0
4 vinilifenol 1107096 781349 685317 460323
4 vinilifenol 1107096 1297465 621324 693225
72
Figura 13 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
BrettanomycesDekkera es la levadura responsable de la produccion de 4-etil-
fenol compuesto asociado con olores caracteristicos a ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 00581345 0260244 0172935 0177547 020156
C (
mg
L)
4 etilfenol
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 00581345 0260244 0245915 0204542 0262499
C (
mg
L)
4 etilfenol
73
caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo dantildeando la calidad sensorial del vino tinto Babic la
produccioacuten de este compuesto en esta muestra realizada por duplicado fue
ascendente y tuvo incremento muy grande en el primer dia de almacenamiento y
en el transcurso de los siguientes cuatro diacuteas se mantuvo relativamente estable lo
cual no concuerda con el comportamiento tiacutepico de esta levadura quien tiene un
crecimiento lento e incrementa la produccioacuten de fenoles con su gemacioacuten esto
genera muchas dudas sobre el buen funcionamiento del equipo GC o de la
estabilidad de las levaduras BrettanomycesDekkera en este almacenamiento
Figura 14 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar prueba por duplicado
002040608
1
Vino Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0 0 0
4 etilguayacol
002040608
1
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0 0 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
74
Presencia negativa de 4 etil guayacol durante todo el almacenamiento
probablemente las condiciones de almacenamiento y el medio no dieron lugar al
desarrollo de este compuesto el cual se considera menos conflictivo que el 4-etil-
fenol
Figura 15 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
Estos resultados tambieacuten dejan dudas del normal comportamiento de dicha
levadura pues indican que la levadura no convirtioacute este compuesto en etilfenol
0
2
4
6
8
10
12
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 110709781349685317460323
4 vinylfenol
0
2
4
6
8
10
12
14
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
Series1 0 11071 12974 62132 69322
C (
mg
l)
4 Vinylfenol
75
durante el almacenamiento caracteriacutestica que solo la levadura
BrettanomycesDekkera puede realizar se ve que las concentraciones de
vinylfenoles son mucho mas altas que las de fenoles lo que nos deja determinar
que la poblacioacuten de BrettanomycesDekkera es muy baja y existen otras levaduras
productoras de vinylfenoles en este tipo de vino en las condiciones de
almacenamiento dadas para estas pruebas
Tabla 16 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el
ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 28C por 4 diacuteas
MUESTRA 2 INCUBADA A 28C
Compuesto Day 1
Amount
(mgL)
Day 2
Amount
(mgL)
Day 3
Amount
(mgL)
Day 4
Amount
(mgL)
4-etilfenol 0260244 019612 0186614 019932
4-etilfenol 0260244 020576 0214917 0193554
4-etilguayacol 0 014304 0223836 0
4-etilguayacol 0 002287 00529832 0
4 vinilifenol 1107096 787068 665182 397847
4 vinilifenol 1107096 284389 00204392 0
76
Figura 16 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar
El desarrollo de este compuesto en el diacutea 1 fue significativo y luego relativamente
estable el comportamiento fue similar en las pruebas de diferentes temperaturas
de almacenamiento para este compuesto el cual es el maacutes problemaacutetico en la
industria viniacutecola
0
005
01
015
02
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 005813019932018661019611019932
4 etilfenol
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 005813 019355 021491 020576 026024
4 etilfenol
77
Figura 17 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar
Los resultados de la prueba son poco confiables y no entendibles por lo que
podemos verificar que el GC no estaacute trabajando de forma adecuada para la
deteccioacuten del compuesto
0001002003004005006
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 Etilguayacol 0 0 0022 0053 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
0005
01015
02025
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0223 0143 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
78
Figura 18 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
El comportamiento de este compuesto en la prueba es muy irregular y poco
confiable
0
2
4
6
8
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 397847665182787068397847
4 vinylfenol
0
2
4
6
8
10
12
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 11071 28438 00204 0
4 vinylfenol
79
Figura 19 Comportamiento del compuesto 4 etilfenol durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
La concentracioacuten de 4 etil fenol fue mayor al cuarto diacutea almacenado a
temperatura ambiente de 20C pero este compuesto no tuvo una actividad notoria
de ascenso durante su almacenamiento como se esperaba lo que deja muchas
dudas sobre los resultados de este ensayo
0
05
1
15
2
25
3
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etil fenol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 20C
80
Figura 20 Comportamiento del compuesto 4 etil guayacol durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
Comportamiento anormal del compuesto no se ve tendencias de aumento o
disminucioacuten de este en ninguna de las pruebas no tiene un comportamiento
regular pues se esperaba que la levadura BrettanomycesDekkera
descarboxinizara el compuesto 4-vinilguaiacol y aumentar las concentraciones de
4-etilguaiacol esta reaccioacuten no se hizo notoria en los compuestos aromaacuteticos
seguacuten lo determino el Cromatografo de Gas (GC)
0
005
01
015
02
025
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3
C (
mg
L)
4 etil guayacol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 20C
81
Figura 21 Comportamiento del compuesto 4 Vinyl fenoll durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
La no presencia de este compuesto en el vino original demuestra las baja o casi
nula presencia de la levadura BrettanomycesDekkera al diacutea primero este
compuesto incrementa de forma notoria en las muestras debido a la presencia de
acido cumaacuterico en el medio ya que sufre su carboxilacion convirtieacutendose en 4 vinyl
fenol sin embargo su comportamiento no fue regular y presento problemas de
lecturas
0
2
4
6
8
10
12
14
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
C (
mg
L)4 Vinyl fenol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 28C
82
9 CONCLUSIONES Y
RECOMENDACIONES
91 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO
Se desarrolloacute un medio selectivo soacutelido para BrettanomycesDekkera
accesible y faacutecil de elaborar
Se detectan colonias de la levadura BrettanomycesDekera en el agar
selectivo con glucosa como fuente de carbono en un lapso de 5 diacuteas en
incubacioacuten a 28C
El medio selectivo soacutelido con Glucosa como fuente de carbono fue maacutes
raacutepido y efectivo ya que toma 5 diacuteas para dar resultados positivos frente al
de Etanol como fuente de carbono el cual toma 10 diacuteas para mostrar
resultados positivos aunque ambos dieron resultados satisfactorios en la
selectividad de la levadura BrettanomycesDekkera
La levadura se adapto de forma satisfactoria a estos medios en
condiciones de almacenamiento propias para su desarrollo (28C)
Las colonias de la levadura BrettanomycesDekkera tiene un crecimiento
en estos medios soacutelidos de forma circular con topografiacutea convexa y borde
entero dimensiones 5-6 mm color Amarillo opacicidad oscuro
83
superficie lisa y suave siendo faacutecil de identificar y realizar los conteos
necesarios
El medio solido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten
de la levadura BrettanomycesDekkera en vino tinto es raacutepido econoacutemico
y uacutetil
El uso de azucares para fermentacioacuten de la levadura
BrettanomycesDekkera que Saccharomyces no puede fermentar para
mayor selectividad
Realizacioacuten de pruebas Bioquiacutemicas como meacutetodo raacutepido de selectividad
92 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DESARROLLO DEL MEDIO LIacuteQUIDO
Se desarrollo un medio selectivo liquido para BrettanomycesDekkera
accesible y faacutecil de elaborar
Este medio mostroacute resultados positivos de la presencia de
BrettanomycesDekkera en un lapso de tiempo menor (3 diacuteas) que con el
medio solido (5 diacuteas) en caso de que el nuacutemero de ceacutelulas de la levadura
BrettanomycesDekkera sea mayor a la poblacioacuten critica (103)
Cuando la poblacioacuten de ceacutelulas de la levadura BrettanomycesDekkera es
menor a la poblacioacuten critica el tiempo de identificacioacuten de esta levadura por
medio liquido es muy prolongado puede tomar maacutes de 10 diacuteas o incluso no
detectarlo
84
Los compuestos quiacutemicos usados para el desarrollo del medio liacutequido no
son los adecuados para este tipo de medios donde los resultados positivos
son olfativos pues estos compuestos emiten fuertes olores que confunden
los olores caracteriacutesticos del caraacutecter Brett
El medio liquido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten
de altas concentraciones de la levadura BrettanomycesDekkera en vino
tinto es raacutepido econoacutemico y uacutetil
93 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg
EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE DALMACIA
CROACIA
Este trabajo mostroacute que el dioacutexido de azufre (SO2) tiene buenos resultados
en contra de la levadura BrettanomycesDekkera en concentraciones
normales de 40mgl concentracioacuten en la que se trabaja este compuesto en
los vinos tintos
En Europa el dioacutexido de azufre es usado de forma tradicional en gran
nuacutemero de alimentos y especialmente en vinos sin embargo y a pesar de
su uso regulado se busca la sustitucioacuten de este o su maacutexima reduccioacuten
para hacer de este producto maacutes sano para las personas no tolerantes a
este tipo de compuestos sin embargo seguacuten el trabajo realizado en
comparacioacuten con el producto Antibrettreg el SO2 es maacutes eficaz en el control
85
de la levadura ayudando a evitarla y eliminarla de la cadena productiva del
vino tinto
Gracias a sus caracteriacutesticas el vino tinto Babic es muy vulnerable a la
levadura BrettanomycesDekkera pero a su vez se puede tratar faacutecilmente
con productos como SO2 y Antibrettreg aunque es maacutes efectivo contra
BrettanomycesDekkera el dioacutexido de azufre (SO2)
Antibrettreg es una buena opcioacuten para el control de BrettanomycesDekkera
para evitar el uso de productos alergenicos como SO2
94 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN
EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO
MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE
Al terminar la primera prueba con anaacutelisis en cromatografiacutea a gas y el SPME
queda como resultados
Es necesario repetir la prueba
No se determina el efecto de los estaacutendares internos sometidos a tiempos
de almacenamiento en temperaturas de 20C y 28C lo que puede dar falsos
resultados de cantidades de compuestos
86
Se debe crear un medio maacutes apto para el desarrollo de la levadura y un
control diario de crecimiento ( agregar maacutes Glucosa en caso de que se
haya consumido toda controlar presencia de Bacterias y otros
microorganismos que no se deseen en el medio)
Es necesario control de aromas con panel sensorial para determinar el
umbral de deteccioacuten en este vino
Control de crecimiento por medio solido Selectivo para
BrettanomycesDekekra conteo de colonias presentes en el vino inoculado
y su desarrollo durante almacenamiento a diferentes temperaturas
La segunda prueba no fue posible realizarla por dantildeos en el equipo de
cromatografiacutea de gas (GC)
87
ANEXOS
11
89
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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Investigacioacuten Enoloacutegica Zaragoza Espantildea
93
11
GRACIAS es una palabra corta para todo lo que quiero expresar a todos aquellos que
hicieron parte de este suentildeo hecho realidadhellip
A Dios y a la virgen Auxiliadora por llevarme de su mano cada diacutea de mi carrera en cada
momento alegre y en cada momento difiacutecil fueron mi fortaleza
A mis papitos por hacer de mi estudio una realidad por su sacrificio y apoyo desinteresado y
sincero
A mi Hermanito por ser mi fortaleza mi ejemplo y mi amigo incondicional
A mi familia Blanco y Urrea por su compantildeiacutea durante esta etapa
A mi facultad (Decano Dr Camilo Rozo Dra Patricia Jimeacutenez y mis profesores) por
ensenarme mi profesioacuten y aportar lo mejor de ustedes para mi formacioacuten personal
A mis asesores de Tesis (Ing Patricia Chaparro y Dr Sc Leo Gracin) por su guiacutea y
colaboracioacuten oportuna
A mis queridos amigos quienes siempre han estado a mi lado en las dificultades y en las
alegriacuteas (Ingrid Mafe Cami G Cami R Harold Pipe Karla Andreacutes T Diego G)
A IAESTE en alianza con el ORI por hacer posible mi intercambio y poder hacer mi tesis en el
maravilloso paiacutes de Croacia
A Croacia por ser mi segundo hogar por abrirme sus puertas y su corazoacuten por brindarme
tan maravillosas personas en mi camino
Croatia Thank you for being my second home for opening your doors and your heart to me
and give me the opportunity to meet so many wonderful people
To my boss my teacher my mentor and specially my friend Leo
To the faculty of food technology and Biotechnology and the department of technology
and analysis of beverages for give me the opportunity to give all my knowledge to the
project and learn a lot more
To all the amazing people I met during this experience (Igor Karin Natka Josip Ana Matija
Daniel Pz Szilvia Dini Daniela Lidija Sanja and everybody else who I had the pleasure to
meet in this great trip) for give me the best of your hearts
I only have one thing to say hellipTHANK YOU
Solo me queda una palabra por decirhellipGRACIAS
17
del vino son muy estrictas (altas concentraciones de etanol y bajas
concentraciones de nutrientes) En este momento BrettanomycesDekkera
continuacutea creciendo gracias a que utiliza nutrientes que S cerevisiae no ha podido
consumir sobre todo algunos azuacutecares y fuentes de nitroacutegeno21
Una de las caracteriacutesticas que diferencia a BrettanomycesDekkera es la gran
diversidad de azuacutecares que puede fermentar (ver tabla de Relacioacuten de los
principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) La mayoriacutea de
las cepas pueden crecer utilizando trealosa y celobiosa azucares presentes en el
vino y no consumibles por S cerevisiae Otra de las ventajas que presenta frente
a S cerevisiae (y frente a la mayoriacutea de las levaduras) es que puede utilizar los
nitratos como fuente de nitroacutegeno Debido a que S cerevisiae soacutelo utiliza el
nitroacutegeno amoniacal y los aminoaacutecidos libres estos se consumen con relativa
rapidez Al final de la fermentacioacuten el nitroacutegeno moniacal es escaso y se favorece
el crecimiento de las levaduras que pueden utilizar otras fuentes de nitroacutegeno
Ademaacutes Brettanomyces puede crecer con concentraciones de fosfato diamoacutenico
tan bajas como 05gl o a partir de diversos aminoaacutecidos En resumen
BrettanomycesDekkera crece maacutes despacio que S cerevisiae es resistente a
concentraciones altas de alcohol puede utilizar otros azucares como fuentes de
energiacutea y nitrato como fuente de nitroacutegeno Esto explica que pueda reproducirse
cuando la fermentacioacuten alcohoacutelica ha terminado a partir de nutrientes no
consumibles por S cerevisiae y cuando no tiene competidores22
21
Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
22 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
18
Tabla 1 Relacioacuten de los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto
Fuente Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista
VINOTEQ N 38 pag 21 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
131 BrettanomycesDekkera y siacutentesis de fenoles volaacutetiles
El origen de los fenoles volaacutetiles estaacute relacionado con la actividad secuencial de
dos enzimas que descarboxilan los aacutecidos en hidroxiestirenos (vinilfenoles) que
19
son posteriormente reducidos a etilderivados (etilfenoles)23 como puede
observarse en la figura 2
Figura 2 Siacutentesis de etilfenoles de BrettanomycesDekkera
Fuente ACE revista de Enologia wwwacenologiacom
El primer paso de descaboxilacion de los aacutecidos hidroxicinamicos es comuacuten
tambieacuten en otros microorganismos como bacterias hongos y otras levaduras Sin
embargo el segundo paso reduccioacuten de vinilfenoles es caracteriacutestico de algunos
tipos de levaduras como Dekkera bruxelliensis D anomala Pichia guillermondi
Candida versarilis C halophila y C mannitofaciens24
Los fenoles volaacutetiles que se asocian al problema Brett en vinos son el 4-etilfenol y
el 4- etilguaiacol asiacute como sus precursores intermedios 4-vinilfenol y 4-
vinilguaiacol aunque estos uacuteltimos son menos importantes por ser muy reactivos y
raacutepidamente convertidos en etilfenoles por BrettanomycesDekkera o en su caso
23
Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
24 Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de
Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
20
condensan con otras moleacuteculas como antocianos25 Los etilfenoles y
especialmente elevadas concentraciones de 4-vinilfenol en vinos se asocian con
aromas desagradables asociados a descriptores como ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de
caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo26
El umbral sensorial del 4-etilfenol es de 230 μg l-1 y el del 4-etilguaiacol es de 47
μgl Pese a su menor umbral sensorial el 4-etilguaiacol responde a descriptores
como ldquobaconrdquo o ldquoahumadordquo que a bajas concentraciones aportan complejidad por
lo que se puede considerar sensorialmente menos conflitivo que el 4-etilfenol 27
Figura 3 Defectos sensoriales producidos en el vino por BrettanomycesDekkera
Fuente Lopez-Cordon Eva 2007 BrettanomycesDekkera Control y deteccioacuten en bodegas ACE revista de Enologia No 78 pag 3 Cataluntildea Espantildea
25 Morata A Goacutemez-Cordoveacutes M Calderoacuten F Suaacuterez J 2006 Effects of pH temperature and SO2 on the
formation of pyranoanthocyanins during red wine fermentation with two species of Saccharomyces Journal Food Microbiology No106 pag 4 Madrid Espana
26 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea 27 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
21
132 Identificacioacuten de BrettanomycesDekkera
Los Bioacutelogos usan sistemas de identificacioacuten basados en similitudes taxonoacutemicas
entre organismos dichas similitudes pueden ser morfoloacutegicas tipos capacidad de
produccioacuten de sustratos como azuacutecar yo nitratos caracteriacutesticas fisioloacutegicas y
bioquiacutemicas secuencia del material geneacutetico y respuestas inmunoloacutegicas28
En la industria viniacutecola es importante recurrir a diferentes tipos de pruebas para la
identificacioacuten de microorganismos una de estas y la maacutes realizada es la revisioacuten
del microorganismo bajo el microscopio Esta prueba brinda informacioacuten sobre la
morfologiacutea del microorganismo (cocos bacilos formas puntudas ojival entre
otros) tamantildeo (dimensiones) agrupaciones celulares (solas parejas triacuteos
grupos o cadenas) Sin embargo el uso del microscopio es una prueba raacutepida
para examinar mostos o vino pero no determina cantidades que muchas veces es
requerido para tratamientos de accioacuten otro de los inconvenientes es que los
microorganismos pueden variar su morfologiacutea en forma o tamantildeo dependiendo de
la edad y las condiciones de crecimiento por lo que puede no ser clara la
identificacioacuten de este29
14 Medios soacutelidos selectivos
Si se requiere de la confirmacioacuten del microorganismo este debe ser aislado del
vino para una caracterizacioacuten para esto se requiere de medios soacutelidos Cuando se
examina un microorganismo en un medio solido es importante revisar las
caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias (ver figura 4 Morfologiacuteas de colonias
en medios soacutelidos) Entre estas caracteriacutesticas estaacuten forma (circular irregular o
2829 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
22
rizada) tamantildeo (dimensiones estas normalmente se expresan en miliacutemetros)
topografiacutea (plano elevado convexo coacutencavo o embonado) presencia de
pigmentos opacidad (transparente traslucido u opaco) superficie (suave rugosa
lisa o aacutespero) bordes (entero ondulado crespo dentado rizado) o cualquier
cambio en el agar (color opacidad cambios en los indicadores de pH o CaCO3
respectivamente)30
Figura 4 Varias morfologiacuteas de crecimiento de colonias en medio solido
Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007
Gran nuacutemero de medios selectivos se han creado para la aislacioacuten deteccioacuten yo
conteo de levaduras provenientes de jugos de uva mostos o vinos El medio maacutes
utilizado en estos fines es YPD (Yeast Peptone Dextrose) pero dicho medio no
es selectivo entre levaduras y se usa comuacutenmente para el conteo de
Saccharomyces31 Las colonias empiezan a parecer con un periodo de incubacioacuten
30
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
31 Essia Ngang J Wolniewicz E Villa P2005 Stimulation of lactobacilli during alcoholic fermentation action
of sucrose hydrolysis by yeast Biotechnology letters No 8 pag 743 Amiens France
23
de 2 a 4 diacuteas a 22C a 25C Igualmente el agar de jugo de uva es no selectivo y
presenta faacutecil crecimiento de levaduras bacterias y mohos
Para la levadura Brettanomyces Dekkera se han elaborado diferentes medios
selectivos entre ellos el maacutes conocido es WL por sus siglas en ingles del
laboratorio que lo creo ldquoWallerstein Laboratoriesrdquo este medio contiene
cicloheximida compuesto selectivo para Brettanomyces e inhibe Saccharomyces
El punto criacutetico es encontrar la cantidad exacta de este compuesto para la
inhibicioacuten de las levaduras sin que afecte a BrettanomycesDekkera32
Ademaacutes del medio WL BrettanomycesDekkera puede ser cultivado en otros
medios selectivos como Brettanomyces medio A creado por Vilas en 1993
Brettanomyces medio B el cual contiene cicloeximida como agente selectivo
mientras que Brettanomyces medio C tiene cicloheximida y ampicilina este medio
fue creado por B Watson en 1998 Brettanomyces medio D fue creado
recientemente por Rodrigues en 2001 este medio es conocido como DBDM
(DekkeraBrettanomyces differential medium ) es un medio selectivo para
Brettanomyces en contra de Saccharomyces y otras levaduras este medio es el
maacutes utilizado en la vineras para caracterizacioacuten de BrettanomycesDekkera
actualmente33
15 Dioacutexido de azufre (SO2) en vinos
32
33
Fleet Graham 1993 Wine Microbiology and Biotechnology Edi Hardwood Academic Publishers
GmbH United States of America and Canada
24
El dioacutexido de azufre tambieacuten llamado oxido de azufre es un eficaz agente
conservante antioxidante y antimicrobiano en la industria viniacutecola34
Durante la vinificacioacuten SO2 ha representado histoacutericamente una herramienta muy
importante usada por los vinicultores para el control de crecimiento microbioloacutegico
Debido a preocupaciones por la salud del consumidor el uso de este producto ha
disminuido dramaacuteticamente con el posible riesgo de aumentar el riesgo
microbioloacutegico35
El actual liacutemite legal de SO2 en vinos en los Estados Unidos es de 350mgL una
concentracioacuten mucho mayor a la usada en la industria viniacutecola No obstante vinos
que contienen maacutes de 10mgL deben declarar este compuesto en la etiqueta
porque SO2 es un metabolito que las levaduras usan durante la fermentacioacuten Los
vinos siempre contienen algo de sulfitos aunque la adicioacuten no se realice durante el
proceso36
151 Formas del Dioacutexido de Azufre (SO2)
Una vez disuelto en agua el dioacutexido de azufre existe en equilibrio entre SO2
molecular (SO2H2O) bisulfito (HSO3) y sulfito (SO32-) Este equilibrio depende del
pH Ademaacutes de estar en equilibrio con el molecular y especies sulfito el bisulfito
tambieacuten existe en forma ldquolibrerdquo y en forma ldquoatadardquo Aquiacute la moleacutecula reaccionara
34
Orwine Eureka 2008Investigadores europeos buscan alternativas al dioxido de azufre en vinos
httpawprowordpresscom20081107investigadores-europeos-buscan-alternativas-al-dioxido-de-
azufre-en-el-vino
3536 Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
25
con compuestos carbonilos (ej Acetaldehiacutedo) formando productos adicionales
como Acido Hydroxysulfonico 37
Ademaacutes de Acetaldehiacutedo algunas moleacuteculas presentes en el jugo de uva que
reaccionan con bisulfito son acido piruvico α-keto-glutaric dihidroxyacetona
diacetyl Pigmentos de antocianinas entre otros38
152 Inhibidor Microbiano
El sulfuro molecular es la forma antimicrobiana del dioacutexido de azufre La cantidad
de SO2 molecular presente en cualquier vino no se mide directamente La
concentracioacuten es calculada conociendo la concentracioacuten de SO2 libre y el pH del
vino basaacutendose en la siguiente foacutermula
Alternativamente la figura 5 Se puede utilizar como guiacutea para aproximar la
cantidad de SO2 libre necesitada a determinado valor de pH de valores entre 05 o
08 mgl de SO2 molecular 39
El SO2 inhibe microorganismos de varias formas incluyendo rupturas de puentes
bisulfitos en proteiacutenas y reaccionando con coofactores como NAD+ y FAD tambieacuten
reacciona con ATP
3739
Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007 Wine microbiology practical applications and
procedures edi Springer second edition Fresno California United States of America
38 Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi
Springer New York United States
26
Figura 5 Cantidades de SO2 libre a un pH determinado para obtener 05 o 08 mgl de SO2
molecular
Fuente Kenneth C Fugelsang Charles G Edwards2007
La concentracioacuten de SO2 molecular necesario para prevenir el crecimiento de
microorganismos variacutea seguacuten vinojugo pH temperatura poblacioacuten densidad y
diversidad estado de crecimiento grado de alcohol entre otros factores Beech
1979 sugirioacute una adicioacuten de 08 mgl de SO2 molecular como la cantidad
necesaria del compuesto en vinos blancos de mesa para dar una reduccioacuten de
cerca de 104 UFCml de la poblacioacuten de diferente tipo de microorganismos en 24
horas Las diferencias que existen entre las levaduras y bacterias en base a la
27
sensibilidad a este compuesto son dadas a conocer por diferentes autores (Warth
1977 1985 Du Toit 2005 Davis 1988 Hood 1983)40
16 Antibrettreg como alternativa de prevencioacuten y eliminacioacuten de
BrettanomycesDekkera
Antibrettreg es un producto nuevo creado por Spindal SARL-Gretz - Armainvilliers
Francia Es una preparacioacuten enzimaacutetica para inactivar Brettanomyces y para
reducir olores producidos por fenoles volaacutetiles41
Antibrettreg es preparado a base de paredes celulares de levadura activados
enzimaacuteticamente que presentan elevadas propiedades adsorbentes frente al 4-
etilfeno y 4- etilguayacol compuestos asociados con olores desagradables en el
vino tales como sudor de caballo farmacia o barniz42
Antibrettreg inhibe la produccioacuten de la vinilreductasa que participa en la
transformacioacuten de los aacutecidos cinaacutemicos naturalmente presentes en los vinos en
los correspondientes derivados etilados responsables de los olores atribuidos a
BrettanomycesDekkera 43
40
Zoecklein Bruce Fugelsang Kenneth C Gump Barry Nury Fred 1999 Wine Analysis and production Edi
Springer New York United States
41 Manual de instrucciones de producto Antibrett reg producido por Spindal SARL-Gretz -
Armainvilliers France
424344 AEB Group 2008 ANTIBRETT Preparado a base de paredes celulares de levadura para la inactivacioacuten
de Brettanomyces y la eliminacioacuten de los olores de estos productos httpwwwaeb-
groupcomimgsSPAGNOLODepliantANTIBRETT-lett-ESPpdf
28
El uso de Antibrettreg es efectivo incluso contra otros olores anoacutemalos como los
que se generan en las barricas sucias principalmente huacutemedas dantildeando la
calidad olfativa del vino44
29
2 PROBLEMA
La levadura BrettanomycesDekkera es una levadura de contaminacioacuten presente
en la mayoriacutea de industrias viniacutecolas en el mundo Afecta directamente la
produccioacuten y calidad sensorial de los vinos con el desarrollo de los compuestos 4
etilfenol y 4 etilguayacol los cuales dantildean el perfil olfativo del vino dando aromas
caracteriacutesticas a ldquoestablordquo ldquocuerordquo ldquosudor de caballordquo o ldquobarnizrdquo conocido como
ldquocaraacutecter Brettrdquo
Esta contaminacioacuten se da especialmente en los vinos tintos debido a sus
caracteriacutesticas de produccioacuten (fermentacioacuten crianza antildeejamiento) y sus
propiedades fisicoquiacutemicas (Grado alcohoacutelico pH Acidez total Acidez volaacutetil
entre otros)
En Croacia existe una gran produccioacuten de vinos tintos entre los cuales se
encuentra el vino tinto Babic proveniente de la isla de Hvar el cual es famoso por
ser un vino duro carnoso estructurado y casi sobre-maduro con un grado
alcohoacutelico que ronda los 15 vv siendo la primera denominacioacuten de origen que
se aproboacute en Croacia en el antildeo 1961 este vino es de gran importancia en la
regioacuten la mayoriacutea de sitios de elaboracioacuten son pequentildeas industrias que han sido
afectadas por el bdquocaraacutecter Brett‟ Muchas investigaciones se han realizado al
respecto de la levadura BrettanomycesDekkera pero se conoce muy poco sobre
sus efectos en el vino Babic debido a sus caracteriacutesticas particulares (alcohol
30
15 pH 35 Acidez total 520 gr Acido TartaricoL Acidez volaacutetil 08 gr Acido
AceticoL Azucar residual 47 grLt)45
La dificultad de la pequentildea industria para acceder a productos que lleven a la
identificacioacuten de la levadura mencionada y de esta manera conllevar a planes de
accioacuten contra el ldquocaraacutecter Brettrdquo es una de las grandes dificultades de la industria
vinera en este paiacutes en donde los productos para la industria enoacuteloga son
complicados y de alto precio para acceder a ellos y en consecuencia no se
realizan muchas de estas pruebas de deteccioacuten de BrettanomycesDekkera
llevando al mercado productos contaminados de baja calidad que inicialmente
podriacutea haber sido un vino de alta calidad debido a sus caracteriacutesticas uacutenicas y de
gran popularidad
45
Datos obtenidos en el laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
31
3 JUSTIFICACION
Actualmente Croacia cuenta con maacutes de 300 zonas vineras en las que se producen 67
de vino blanco 32 vino tinto y el restante 1 vino rosado De acuerdo a recientes datos
estadiacutesticos hay 650 km2 de vintildeedos en Croacia de los cuales 375 km2 son uvas con
indicacioacuten geograacutefica de origen que producen maacutes de 300 vinos y maacutes de la mitad de este
nuacutemero son vinos elaborados en microempresas con un total de 50000000 de botellas
de vino el 8 es vino superior 70 de calidad y el 22 es vino de mesa de produccioacuten
nacional46
Croacia es un fuerte productor de vino a nivel regional con sus diferentes variedades
propias (Merlot Plavac Dingač Postup Malvazija Pošip Kujundžuša Babic) pero dicha
produccioacuten ha sido fuertemente afectada por la presencia de la levadura
BrettanomycesDekkera trayendo consecuencias como perdidas de produccioacuten peacuterdida
de calidad sensorial del vino grandes peacuterdidas econoacutemicas y desprestigio a sus vinos de
denominacioacuten de origen
Es por esto que en este proyecto de investigacioacuten se busca una faacutecil y raacutepida
identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera causante del ldquocaraacutecter Brettrdquo con el
desarrollo de medios selectivos liquido y solido ademaacutes de opciones para el tratamiento
yo prevencioacuten de esta levadura en la cadena productiva comparativamente entre dioacutexido
de azufre (SO2 ) y Antibrettreg y la identificacioacuten de los aromas caracteriacutesticos del ldquocaraacutecter
Brettrdquo en el vino tinto Babic de la regioacuten de Dalmacia Croacia
46
Hrvatski zavod za vinogradarstvo i vinasrtvo 2003 Pravilnik o vinu httpwwwhrzvvhrpropisihtm
32
4 OBJETIVOS
41 General
Caracterizar y evaluar el comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera
en teacuterminos de crecimiento y produccioacuten de aromas no deseados en vino tinto
Babic
42 Especiacuteficos
Desarrollar el medio solido y medio liacutequido selectivo para
BrettanomycesDekkera
Evaluar el comportamiento de la levadura en estos medios selectivos
Determinar la influencia del Dioacutexido de azufre (SO2) y el compuesto
Antibrettreg en la levadura BrettanomycesDekkera presente en vino tinto
Babic 2007
Identificar los compuestos aromaacuteticos producidos por Brettanomyces
bruxellensis en vino tinto Babic usando el meacutetodo ldquomultiple headspace
solid-phase microextraction (SPME)rdquo
33
5 ALCANCES
En este proyecto se pretende desarrollar un medio selectivo faacutecil de producir en
donde sea raacutepida la identificacioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera en la
produccioacuten de vinos tintos se realizaran pruebas para corroborar el crecimiento de
esta levadura en el medio determinando el tiempo que esta levadura toma en
adaptarse en el medio y su comportamiento en este una vez comprobada su
adaptacioacuten al medio liquido se trabajara con el meacutetodo de cromatografiacutea de gas
(GC) y el uso de micro extraccioacuten en fase solida (SPME) para el anaacutelisis
cuantitativo de los compuestos volaacutetiles (4-etil-fenol 4-etil-guayacol4-vinilfenol y
4-vinil-guayacol) y posteriormente con el vino tinto Babic Ademaacutes se desea
comprobar la efectividad de los productos con que las vineras de Croacia inhiben
o eliminan la presencia de la levadura en los vinos tintos como lo son el producto
AntiBrettreg y el Dioacutexido de azufre (SO2)
34
6 ESTADO DEL ARTE
Sobre el campo problemico causado por la levadura BrettanomycesDekkera en la
industria viniacutecola se han realizado bastante investigaciones a nivel de
caracterizacioacuten de la levadura los factores fisicoquiacutemicos que favorecen el
crecimiento de la levadura meacutetodos de prevencioacuten y control evaluacioacuten de
dantildeos sensoriales en diferentes tipos de vinos formacioacuten de compuestos fenoacutelicos
en los diferentes tipos de vino otros compuestos no fenoacutelicos asociados al
ldquocaraacutecter Brettrdquo teacutecnicas de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera
evaluacioacuten de la teacutecnicas de control e inhibicioacuten de dicha levadura desarrollo de
nuevos medios de deteccioacuten y aislamiento de la levadura relacioacuten entre la
levadura BrettanomycesDekkera con las otras levaduras presentes en el vino
entre otros
Seguacuten estas investigaciones se analizan aquellas que pueden aportar datos
importantes para el desarrollo del trabajo que se quiere realizar y se tiene en
cuenta sus metodologiacuteas conclusiones recomendaciones y comentarios
Entre las importantes para el planteamiento de este trabajo se menciona el trabajo
realizado por la Universidad Politeacutecnica de Madrid Espantildea el cual analiza
algunas de las caracteriacutesticas maacutes relevantes de este geacutenero de levaduras su
crecimiento en bodega factores fisicoquiacutemicos que favorecen su crecimiento y
desarrollo en el vino los defectos sensoriales que presenta en los vinos y estudia
algunas de los meacutetodos fiacutesicos para el control de BrettanomycesDekkera en vino
35
(clarificacioacuten filtracioacuten amicrobica proteiacutenas clarificantes anhiacutedrido sulfuros
dimetil dicarbonato Aditivos)47
Para conocer maacutes sobre la levadura en condiciones de barrica y almacenamiento
se revisa el articulo elaborado en el Departamento Teacutecnico Guserbiot La rioja
Espantildea en este artiacuteculo se describe brevemente su metabolismo y su ecologiacutea en
las bodegas Igualmente se comparan las teacutecnicas utilizadas en los laboratorios
para su deteccioacuten y cuaacuteles son las limitaciones de los diferentes meacutetodos
Finalmente se analizan las estrategias desarrolladas para su eliminacioacuten de las
bodegas y se dan una serie de recomendaciones para su control48
El instituto de fermentaciones Industriales Consejo superior de investigaciones
cientiacuteficas Juan de Cierva Madrid Espantildea en el cual se revisa la formacioacuten de
etilfenoles (4 etil-fenol 4 etil guayacol) en vinos tintos anejos Los factores
fisicoquiacutemicos que favorecen el crecimiento de la levadura no deseada
BrettanomycesDekkera las teacutecnicas usadas para la detectar la presencia de esta
levadura en vinos ( Revisioacuten microscoacutepica fluorescente remocioacuten de aacutecidos
grasos de su membrana teacutecnicas moleculares como PCR y electroforesis) y de
control (Proteiacutenas fining Fining con gelatina liquida filtracioacuten variables
fisicoquiacutemicas adicioacuten de aditivos procedimientos de altas presiones
manipulacioacuten geneacutetica) con esta investigacioacuten se concluye que la combinacioacuten y el
uso de las numerosas teacutecnicas pueden ayudar a la prevencioacuten y reduccioacuten de la
levadura BrettanomycesDekkera 49 Este trabajo muestra las muacuteltiples opciones
47
A Morata S Benito F Palomero F Calderoacuten y J A Suaacuterez-Lepe Ecologiacutea y prevencioacuten de
BrettanomycesDekkera durante la elaboracioacuten y crianza de vinos tintos Revista enoacutelogos (Editada por la
Federacioacuten Espantildeola de Asociaciones de Enoacutelogos y Periodistas Asociados) No 50 paacuteg 1-12 Madrid Espantildea
48 Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 20-
24 Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
49 R Suarez JA Suarez-Lepe A Morata F Calderon 2006 The production of ethyl phenols in wine by yeasts
of the genera Brettanomyces and Dekkera A review Journal Food Chemistry No 102 pag 10-21 Madrid
Espantildea
36
existentes en el control y prevencioacuten de la levadura mencionada sin embargo deja
claro que la mayoriacutea de estas opciones son costosas y no de faacutecil adquisicioacuten para
una pequentildea industria
El anaacutelisis sensorial ha sido de los aspectos maacutes estudiados al respecto de
BrettanomycesDekkera una de estas investigaciones fue realizada en Centre
Europeacuteen des Sciences du Goucirct en Talence Francia en el cual se evaluaron 50
vinos bordeaux sensorialmente para demostrar la complejidad del ldquoCaraacutecter Brett‟‟
al cual se unen otros compuestos aromaacuteticos ademaacutes de los fenoacutelicos como acido
isobutirico e isovalerico en este tipo de vino debido a sus caracteriacutesticas
fisicoquiacutemicas50
De los meacutetodos de deteccioacuten de la levadura BrettanomycesDekkera los medios
selectivos son muy populares es por esto que el Laboratorio de Microbiologiacutea
Departamento de Botanica e Engenharia Biologica Instituto Superior de
Agronomia Lisboa Portugal realizo un trabajo en el cual se pretendia desarrollar
un medio selectivo o diferencial capaz de aislar la levadura
BrettanomycesDekkera del vino y de la cadena productiva del vino con el fin de
detreminar la relacioacuten entre esta levadura y los compuestos 4-etilfenol y 4 etil-
guayacol51 otro estudio realizado para la deteccioacuten de dicha levadura fue
realizado en la Escola Superior de Biotecnologiacutea Universidade Catoacutelica
Portuguesa el desarrollo de un simple procedimiento compatible con las rutinas
50 Andrea Romano a Marie Claire Perello a Aline Lonvaud-Funel Gilles Sicard Gilles de Revel2008 Sensory
and analytical re-evaluation of lsquolsquoBrett characterrdquo Journal Food Chemestry No 114 pag 15-19 Talence
France
51 N Rodrigues G Gonccedilalves S Pereira-da-Silva M Malfeito-Ferreira and V Loureiro2001 Development
and use of a new medium to detect yeasts of the genera DekkeraBrettanomyces Journal of applied microbiology No 90 pag 588-599Lisboa Portugal
37
usadas en las vineras para la deteccioacuten de BrettanomycesDekkera en vino y en
maquinarias52
En el laboratorio de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas Alcohoacutelicas de la
Universidad de Zagreb se ha trabajado anteriormente en el desarrollo de medio
solido selectivo con pruebas de diferentes concentraciones de los compuestos
como resultados se encuentra una buen relacioacuten entre las concentraciones de los
compuestos sin embargo como recomendaciones se encuentran la falta de
antibioacutetico para evitar contaminacioacuten por bacterias probar con diferentes fuentes
de carbono para comparacioacuten de tiempo de crecimiento positivo y un monitoreo
diario en el medio53
Los compuestos aromaacuteticos que libera la presencia de BrettanomycesDekkera
estaacute asociada a los compuestos 4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinilfenol y 4
viniguayacol a partir de esto los centros de investigacioacuten han hondado en la
identificacioacuten de dichos compuestos relacionados en la enologiacutea y especialmente
con BrettanomycesDekkera a partir de eso el Departamento de Quiacutemica
Universidad de La Rioja Espantildea este estudio presenta un meacutetodo basado en el
uso de Cromatografiacutea de Gas y micro extraccioacuten en fase solida para el anaacutelisis
cuantitativo de 4-etilfenol 4-etil guayacol 4-vinilfenol 4-vinilguayacol
Demostrando la existencia de un efecto matriz en el anaacutelisis de compuestos
responsables del ldquocaraacutecter Brettrdquo en vino Este nuevo meacutetodo fue
satisfactoriamente aplicado a cierto nuacutemero de vinos tintos comerciales vinos
52
JA Couto A Barbosa and T Hogg 2005 A simple cultural method for the presumptive detection of the yeasts BrettanomycesDekkera in wines Letters in Applied Microbiology No 41 pag 505-510 Porto
Portugal
53 Serkovic Dubravka Gracin Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac
Brettanomyces bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet pag 1-117 ZagrebCroatia
38
blancos y roseacute Este meacutetodo puede ser una alternativa para evitar el efecto matriz
en muestras de vino54
De acuerdo con este tema en la jornada cientiacutefica del 99 el grupo de investigacioacuten
enoloacutegica se estudio la formacioacuten de sustancias volaacutetiles por 13 cepas de S
cerevisiae con buenas aptitudes enoloacutegicas inoculadas individualmente en un
mosto homogeacuteneo de la variedad airen fermentado en las mismas condiciones
de aireacioacuten y a temperatura controlada55
54
C Pizarro N Perez-del-Notario JM Gonzalez-Saiz 2007 Determination of Brett character responsible
compounds in wines by using multiple headspace solid-phase micro extraction Journal of Chromatography
No 1143 pag 176-181 La Rioja Espantildea
55 E Pueyo P Hidalgo K Fernaacutendez y P Martiacuten-Aacutelvarez 1999 Anaacutelisis de compuestos volaacutetiles en vinos
obtenidos con distintas cepas de Saccharomyces cerevisiae Aplicacioacuten de la teacutecnica de microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientificas 99 Grupos de Investigacion Enologica Zaragoza Espana
39
7 MATERIALES Y METODOS
A continuacioacuten se presentan materiales y meacutetodos para la investigacioacuten
Este proyecto fue realizado en su gran mayoriacutea en las instalaciones de la
Universidad de Zagreb en la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos
(PBF) Laboratorios del Departamento de Tecnologiacutea y Anaacutelisis de Bebidas
Alcohoacutelicas ubicado en la ciudad de Zagreb Croacia
Los anaacutelisis fisicoquiacutemicos del vino tinto Babic fueron realizados en los
laboratorios de VINOLAB ubicado en Zagreb Croacia
71 MEDIO SOLIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera
711 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Autoclave de laboratorio
Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa Etanol peptona extracto de levadura
agar cicloheximida acido cumaacuterico ampicilina)
Balanza electroacutenica de precisioacuten
Microscopio oacuteptico
712 Metodologiacutea
Basados en estudios anteriores realizados en el laboratorio para el desarrollo de
medio solido selectivo para BrettanomycesDekkera (Serkovic Dubravka Gracin
40
Leo 2008 Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac Brettanomyces
bruxellensis Prehrambeno Biotehnološki Fakultet Universidad de Zagreb pag 1-
117 Zagreb Croacia) se evaluaron las recomendaciones mencionadas en dicha
investigacioacuten para la mejoriacutea y desarrollo de otros medios soacutelidos selectivos
Se usoacute como base el medio YPD (Yeast Peptone Dextrose) el cual estaacute
compuesto de la siguiente forma 20gL peptona 10 gl extracto de levadura 20 gl
de agar56 este medio es selectivo para levaduras pero no es selectivo entre ellas
Es necesario el uso de una fuente de carbono para la levadura
BrettanomycesDekkera de acuerdo a la teoriacutea y revisando la tabla 1 (Relacioacuten de
los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
BrettanomycesDekkera y su concentracioacuten media en vino tinto) y seguacuten
facilidades de disponibilidad en el laboratorio se utiliza glucosa la cual es
utilizable por entre 75-100 de las cepas de BrettanomycesDekkera seguacuten la
tabla mencionada anteriormente
Esta fuente de carbono (Glucosa) fue probada en una concentracioacuten de 20 gL
Cicloheximida fue probada a 30 mgL para inhibir Saccharomyces en el medio y
darle mayor selectividad para Brettanomyces Dekkera Se antildeade acido p-
cumarico en una concentracioacuten de 100 mgL como precursor para la formacioacuten
del compuesto 4 etilfenol caracteriacutestico de la levadura BrettanomycesDekkera
Para inhibir bacterias en el medio se usa ampicilina a 10 mgL esta se agrega
despueacutes de realizada la esterilizacioacuten y cuando la temperatura del medio este
igual o menor a 40C El pH del medio se ajusto a 5
Paralelamente se crea el medio con Etanol como fuente de carbono en una
concentracioacuten de 6 o 60 mlL con la misma concentracioacuten de los otros
compuesto como cicloheximida 30mgL acido cumarico 100mgL 20 gL peptona
10 gL de extracto de levadura 16gL de agar Este medio se crea como
56
Concentraciones preestablecidas en el laboratorio de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas alcoholicas
41
comparativo para determinar cual fuente de carbono es la maacutes utilizada por la
levadura Brettanomyces bruxellensis para su reproduccioacuten Seguacuten la teoriacutea (ver
tabla 1) el etanol es utilizado por entre 25-75 de las cepas de
BrettanomycesDekkera pero es el azuacutecar que se encuentra en mayor
concentracioacuten presente en los vinos tintos aproximadamente 130 gl57
Estos medios fueron debidamente esterilizados para eliminar cualquier
microorganismo o espora presente en este Este procedimiento se realizo por el
meacutetodo de combinacioacuten de altas temperatura y presioacuten (Autoclave 121 C a 1034
kPa)
Se usaron colonias de BrettanomycesDekkera aisladas anteriormente de vinos
contaminados y guardas para investigaciones en el Departamento de Tecnologiacutea y
Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos
Universidad de Zagreb Croacia
Los medios fueron monitoreados visualmente todos los diacuteas y se toman
observaciones de macroscoacutepicas y microscoacutepicas Se comparan estos dos medios
en teacuterminos de rapidez de crecimiento de la levadura y selectividad Estas
muestras fueron incubadas a 28C por 10 diacuteas
La prueba fue realizada por duplicado en diferentes tiempos
57
Hernandez I y Barbero F 2007Brettanomyces bruxellensis en la bodega Revista VINOTEQ N 38 pag 21
Edicioacuten Octubre-Noviembre 2007 La Rioja Espantildea
42
72 MEDIO LIacuteQUIDO SELECTIVO PARA BrettanomycesDekkera
721 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Frascos de vidrio esteacuteriles
Autoclave de laboratorio
Quiacutemicos de laboratorio (Glucosa peptona extracto de levadura
cicloheximida acido cumarico ampicilina etanol)
Microscopio oacuteptico
Balanza electroacutenica de precisioacuten
722 Metodologiacutea
En el mercado para enologiacutea existen medio liacutequidos selectivos para la deteccioacuten
de BrettanomycesDekkera en vinos sin embargo estos son de difiacutecil accesibilidad
por sus elevados precios es por esto que se desarrolla un medio liquido selectivo
para dicha levadura en el laboratorio del Departmaneto de Tecnologiacutea y Anaacutelisis
de Bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia
Para este medio se toma como base el medio selectivo con Glucosa como fuente
carbono desarrollado anteriormente sin usar agar para mantener el medio en su
estado liquido
43
La composicioacuten de este medio liacutequido es la siguiente
20 gL Glucosa
20 gL peptona
10gL extracto de levadura
30mgL de cicloheximida
100mgL acido p-cumarico
10 mgL ampicilina
Estos compuestos fueron medidos en una balanza electroacutenica de precisioacuten se
antildeade 250 ml de agua destilada y se mezcla constantemente se pasa a proceso
de esterilizacioacuten en autoclave a 120C y 1034 KPa por 45 minutos
De esta forma se asegura la usencia de microorganismos yo esporas en el
medio Despueacutes de bajar la Temperatura a 40C se agrega a la mezcla ampicilina
en una concentracioacuten de 10mgL
En frascos de vidrio esteacuteril se agrega 40 ml de medio liacutequido y diferentes
cantidades iniciales de levaduras BrettanomycesDekkera fueron inoculadas al
respectivo medio el primer frasco tiene una cantidad de 106 ceacutelulasml el segundo
tiene 104 ceacutelulasml el tercero tiene 102 celulasml y el cuarto con una cantidad
aproximada de 25 ceacutelulasml Estas cantidades estaacuten basadas en estudios
anteriores para medios liacutequidos selectivos en levaduras58
58 J Ungar A M James P W Muggleton H F Pegler y E G Tomich1950 The Cultivation of
Haemophilus pertussis in Partially Defined Liquid Media Journal of General Microbiology No 4
pag 345-359 Greenford
44
Este medio liacutequido inoculado fue inspeccionado diariamente visualmente revisioacuten
de turbidez microscoacutepicamente y olfativamente para deteccioacuten de olores del
ldquocaraacutecter Brettrdquo
Los diacuteas fueron contabilizados para determinar resultados positivos en estos
ensayos
73 INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg EN
VINO TINTO DE LA REGION DE DALMACIA CROACIA
731 Materiales
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Medio selectivo solido para BretanomycesDekkera
Medio selectivo Liquido para BrettanomycesDekkera
Quiacutemicos de laboratorio (Dioxido de Azufre (SO2) Antibrettreg Glucosa)
Vino Babic 2007
Anallizador infrarojo Bacchius II microdom
732 Metodologiacutea
Con los medios desarrollados (solido y liquido) se quiere conocer el efecto del
dioacutexido de azufre (SO2) y el producto Antibrettreg en la levadura
BrettanomycesDekkera presente en el vino tinto de la regioacuten de Dalmacia
Con las herramientas que se tienen en el laboratorio del departamento de
tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de Zagreb Croacia se quiere
determinar la influencia de estos productos en la levadura BrettanomycesDekkera
presente en vino tinto croata de la regioacuten de Dalmacia Babic
45
El primer paso es adaptar la levadura al vino tinto croata (Babic) para esto se
inoculan 20 colonias de BrettanomycesDekkera en 500 ml de vino se antildeadioacute
glucosa en una concentracioacuten de 2gL y se oxigena la mezcla Para este paso de
adaptacioacuten se dejan las muestras de 1 a 2 diacuteas a temperatura ambiente (20C)
Despueacutes de este periodo se revisa microscoacutepicamente la presencia positiva de
BrettanomycesDekkera en los 500 ml de vino en los que se estaba haciendo el
paso de adaptacioacuten en Babic al comprobar su presencia positiva se procede a
mezclar los 500 ml de vino contaminado con BrettanomycesDekkera con los 3
Litros de vino Babic que se disponen para esta prueba
Estos 3 litros de vino tinto Babic contaminado con la levadura
BrettanomycesDekkera se reparten en 8 frascos de vidrios esteacuteriles al siguiente
diacutea se toman dos frascos para agregar cada uno de los compuestos a evaluar
(SO2 y Antibrettreg)
Para SO2 se toman dos frascos uno de 600ml y uno de 100ml se agrega una
concentracioacuten de 40 mgl
Para el producto AntiBrettreg se toman cuatro frascos dos de 600 ml y dos de 100
ml seguacuten especificaciones del producto y la alta poblacioacuten de
BrettanomycesDekkera en las muestras se adiciono la maacutexima concentracioacuten de
AntiBrettreg a las muestras la cual fue de 40 gHl
Estas muestras se dejaron a temperatura ambiente simulando condiciones de
almacenamiento del vino en barricas temperatura aproximada de 20C evitando el
contacto con la luz solar y evitando movimientos fuertes Esto se mantuvo por 15
diacuteas que fue el tiempo de duracioacuten del experimento
Con el vino restante se mantuvo en las mismas condiciones de almacenamiento
de los demaacutes para hacer un paralelo de comparacioacuten
Previamente se analizaron las caracteriacutesticas del vino sin contaminar por medio
del analizador infrarrojo Bacchus II microdom antes de agregar los compuestos
46
SO2 y AntiBrettreg y despueacutes se volvioacute a realizar el anaacutelisis para determinar los
efectos de estos compuestos en el vino y asiacute mismo al de control
74 DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN
EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO
MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE
741 Materiales
Cromatografo de Gas HP5890 Serie II
Microextractor de fase solida (SPME)
Cultivo de levaduras BrettanomycesDekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnologiacutea y anaacutelisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb Croacia
Quiacutemicos de laboratorio (p-cresolAcetaldehido Propanol diacetil etil-
acetato i-butanol acido aceacutetico i-amil-alcohol n-amil lactato de etilo
acetato amil metiacutelico 1-hexanol etil-hexanol linalol nerol citronelol
geraniol 2-feniletanol octanoato de etilo 4-etilfenol 2-feniletil acetato 4-
etilguaiacol)
Vino Tinto Babic
Agua destilada
742 Metodologiacutea
El meacutetodo fue desarrollado anteriormente en el Departamento de Tecnologiacutea y
Anaacutelisis de Bebidas de la Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea de Alimentos de
la Universidad de Zagreb Croacia Y despueacutes de modificaciones fue utilizado en el
desarrollo del trabajo El meacutetodo utilizado es descrito a continuacioacuten
47
Cromatografo de gas HP 5890 SERIES II
Programa HP-chem
a) Condiciones para analisis SPME-GC
Muestra diluida 5050 con adicion de estandar interno (p-cresol1mgl)
25ml de la muestra diluida con mezcla continua a temperatura ambiente
Tiempo de adsorcion 30 minutos
SPME es colocado en la muestra para la adsorcion durante el tiempo
previsto
b) Condiciones para el Cromatografo de gas (GC)
La columna usada en este experimento es RTXreg-5 (Restec USA sn 210627)
30m id=025mm 025μm
Gas portador Nitrogeno
Flujo del Nitrogeno 5 mlmin
Temperatura del inyector 240 C
Temperatura del detector 250 C
Temperaturas programadas 35 C5 min 150 C 34 Cmin 180 C
10Cmin 190 C 5 Cmin
Se conocen los resultados del cromatografiacutea de gases (ver tabla 10) y se hacen
necesarias varias correcciones del meacutetodo y algunas pruebas con unos
compuestos para determinar realmente su tiempo de retencioacuten en este tipo de
vino Se deben comprobar tiempos de retencioacuten
48
8 DISCUSIOacuteN Y RESULTADOS
81 RESULTADOS PARA EL DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO
Tabla 2 Medio Selectivo con Glucosa como fuente de carbono para
BrettanomycesDekkera en incubacioacuten por 5 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten
microscoacutepica
1 Negativo Negativo - No se realiza
2 Negativo Negativo - Presencia de levaduras
3 Negativo Negativo - Presencia de
Levaduras
4 Aparicioacuten de
algunas colonias
Negativo Transparente Presencia de levaduras
5 Colonias definidas Positivo-
Fenoles
Amarillo Presencia positiva de
BrettanomycesDekkera
49
Este medio tiene alto grado de selectividad para levaduras con un tiempo de
crecimiento de aproximadamente 5 diacuteas en 28C lo que lo hace raacutepido gracias al
antibioacutetico (ampicilina) que hace parte de la composicioacuten del medio no hay
presencia de bacterias Se hace confiable para resultados positivos de levaduras
BrettanomycesDekkera debido a que las levaduras Saccharomyces fueron
inhibidas con el compuesto cicloheximida su selectividad fue comprobada por
revisioacuten microscoacutepica macroscoacutepica y sensorial
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con glucosa como fuente de carboacuten son las
siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
50
Tabla 3 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono para Brettanomyces Dekkera en
incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica
1 Ninguno Negativo - -
2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras y
bacterias
9 Diminutas
colonias
transparentes
Negativo Transparentes Presencia de levaduras y
algunas bacterias
10 Positivo Positivo-
Fenoacutelicos
Amarillo Presencia de levaduras
BrettanomycesDekkera y
bacterias
El medio selectivo para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de
carbono tambieacuten es selectiva entre levaduras ya que solo se identifico la levadura
BrettanomycesDekkera en este sin embargo se evidencia una presencia de otro
microorganismo presuntamente bacteria ya que este medio no contiene agente
antibacteriano (ampicilina) Es necesaria la adicioacuten de ampicilina en una
concentracioacuten de 10mgl para inhibir la presencia de bacterias
Este medio presenta un tiempo maacutes prolongado para mostrar crecimiento de la
levadura BrettanomycesDekkera aproximadamente 10 diacuteas
51
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las
presentadas en el medio selectivo con glucosa como fuente de carbono y son las
siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
52
Tabla 4 Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono y adicioacuten de ampicilina para
Brettanomyces Dekkera en incubacioacuten por 10 diacuteas a 28 C
Diacutea Crecimiento Olor Color Revisioacuten Microscoacutepica
1 Ninguno Negativo - -
2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
9 Diminutas
colonias
transparentes
Negativo Transparentes Presencia de levaduras
10 Positivo Positivo-
Fenoacutelicos
Amarillo Presencia de levaduras
BrettanomycesDekkera
El efecto de la ampicilina sobre el medio selectivo con etanol como fuente de
carbono fue el esperado inhibioacute completamente el crecimiento de colonias
bacterianas en el medio el tiempo de crecimiento de la levadura y presencia de
aromas fenoacutelicos fue el mismo de 10 diacuteas en incubacioacuten de 28C
53
Las caracteriacutesticas morfoloacutegicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para BrettanomycesDekkera con etanol como fuente de carboacuten son iguales a las
presentadas anteriormente y son las siguientes
Forma Circular
Dimensiones 5-6 mm
Topografiacutea convexa
Color Amarillo
Opacicidad oscuro
Superficie lisa y suave
Borde entero
El agar no presenta cambios de color ni turbidez
82 RESULTADOS PRUEBAS MEDIO LIQUIDO
Tabla 5 Influencia de la concentracioacuten de levaduras BrettanomycesDekkera en el
tiempo necesario para detectar la produccioacuten de 4-etil-fenol en medio liquido
Nuacutemero de ceacutelulas ml
(concentracioacuten final)
Tiempo necesario para obtener resultados
positivos (diacuteas)
1 Experimento
32x106 le 3
3 X 104 3
33x102 7
40 No detectado
2 Experimento
43x106 le3
39x104 le3
37x102 8
62 No detectado
54
El nuacutemero de ceacutelulas de levadura de BrettanomycesDekkera fue contabilizado
usando contador de ceacutelulas Chamber
Los aromas fenoacutelicos son difiacuteciles de detectar debido al fuerte olor que tiene el
medio liquido caracteriacutestico de sus componentes esto dificulta la identificacioacuten del
ldquocaraacutecter Brettrdquo en especial cuando las concentraciones de
BrettanomycesDekkera no son elevadas Ademaacutes de los olores fenoacutelicos otros
compuestos volaacutetiles se detectan tales como acido aceacutetico y olores oxidativos
tambieacuten producido por la levadura BrettanomycesDekkera
En la inspeccioacuten visual se detecta alta turbidez en el medio Se compara con un
medio sin presencia de BrettanomycesDekkera
En las muestras con mayor concentracioacuten de la levadura es maacutes notoria la
turbidez Despueacutes de 3 diacuteas se presenta un precipitado blanco en todas las
muestras de altas concentraciones
La revisioacuten microbioloacutegica se realiza diariamente para determinar el nuacutemero de
ceacutelulas y la presencia positiva de la levadura a evaluar
Entre los dos experimentos realizados con el medio liquido el tiempo que se
demoro en detectar compuestos fenoacutelicos fue muy similar entre ellos
dependiendo del nuacutemero de ceacutelulas en el medio en mayores concentraciones el
tiempo de deteccioacuten fue menor
Hay que sentildealar que BrettanomycesDekkera debe alcanzar una concentracioacuten
miacutenima (denominada poblacioacuten criacutetica) de 103 UFCml para comenzar a liberar etil
fenoles Por debajo de esta concentracioacuten la levadura seriacutea metaboacutelicamente
activa pero no produciraacute compuestos alterantes a niveles detectables esto se ve
reflejado en los resultados en los que las concentraciones de ceacutelulas son muy
bajas
55
Estos resultados se comparan con los resultados dados en el medio solido Los
dos medios muestran altos grados de selectividad hacia la levadura
BrettanomycesDekkera y similar comportamiento para el crecimiento de dicha
levadura
En el medio liacutequido cuando hay altas concentraciones de BrettanomycesDekkera
el tiempo de deteccioacuten del microorganismo es menor que con el medio solido pues
en el liacutequido es aproximadamente 3 diacuteas y en el soacutelido son 5 diacuteas
83 RESULTADOS DE LA INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE
(SO2) Y ANTIBRETTreg EN VINO TINTO DE LA REGION DE
DALMACIA CROACIA
El vino fue analizado antes de la adicioacuten de los compuestos quiacutemicos a evaluar y
15 diacuteas despueacutes de adicioacuten para ver la reaccioacuten de este frente a SO2 y Antibrettreg
estas caracteriacutesticas se determinaron con el equipo de laboratorio Bacchus II
Microdom localizado en el laboratorio Vinolab doo Zagreb Croacia Los
resultados se muestran en la tabla
Tabla 6 Resultados de las muestras de vino inoculados con la levadura BrettanomycesDekkera
durante 15 diacuteas Comparativos con los diferentes compuestos
CFUml
Vino Day 1 Day 4 Day 10 Day 15
Control 130E+04 800E+03 700E+03 500E+03
Control 800E+03 640E+03 700E+03 280E+03
SO2 110E+04 400E+02 400E+02 67
SO2 900E+03 380E+03 270E+03 183
Antibrett 140E+05 920E+04 140E+04 400E+03
Antibrett 210E+05 181E+05 160E+04 900E+03
Antibrett 120E+05 990E+04 120E+04 100E+03
Antibrett 230E+05 204E+05 300E+03 200E+03
56
Tabla 7 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 antes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o
Antibrettreg Diacutea 0
Alcohol
()
Acidez Total
(gr Aci
Tartaacuterico L)
Acidez volaacutetil
(Aci
AceacuteticoL)
Densidad
(grml)
Azuacutecar residual
(grl)
Extracto
seco
(grl)
Acido
Laacutectico
(grl)
Glicerol
(grl)
Taninos
(grl)
Acetato
(grl)
1473
525
083
09928
473
332
164
799
305
117
1471
522
084
09927
479
329
162
786
299
116
Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
Tabla 8 Caracteriacutesticas del vino Babic 2007 despueacutes de la adicioacuten de Dioacutexido de Azufre (SO2) o
Antibrettreg Diacutea 15
Alcohol
()
Acidez Total
(gr Aci
Tartaacuterico L)
Acidez volaacutetil
(Aci
AceacuteticoL)
Densidad
(grml)
Azuacutecar residual
(grl)
Extrac
to seco
(grl)
Acido
Laacutectico
(grl)
Glicerol
(grl)
Taninos
(grl)
Acetatos
(grl)
Control
1414
565
107
09935
436
364
177
827
259
136
Control
1415
556
108
09936
420
365
170
824
256
137
SO2
1456 543 108 09932 476 369 167 803 281 125
SO2
1457
542 108 09933 472 370 170 804 271 124
Antibrett 1454 533 106 09933 448 371 175 813 277 125
Antibrett 1455 534 105 09933 460 372 171 809 282 124
Anaacutelisis realizado con Bacchus II Microdom Laboratorio Vinolab Zagreb Croacia
57
Figura 4 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en el vino de control para
evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas
El comportamiento de la levadura BrettanomycesDekkera en la prueba por
duplicado en el vino de control fue muy similar pues con el tiempo esta levadura
deja de reproducirse y va muriendo cuando las condiciones ya no son aptas para
su desarrollo debido a que la mayoriacutea de su fuente de carbono (Glucosa) esta
consumida sin embargo esta levadura no llega a su desaparicioacuten total lo que
representa uno de los mayores problemas en la elaboracioacuten del vino
Esta levadura tiene un metabolismo lento y el factor tiempo es un requisito
fundamental para su desarrollo este experimento se empezoacute con una alta
poblacioacuten de BrettanomycesDekkera (130 x 104 UFCml y 8 x 103 UFCml
respectivamente) y durante el transcurso del tiempo la poblacioacuten fue disminuyendo
debido a la perdida de las condiciones necesarias para la reproduccioacuten
58
Figura 5 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de SO2 en
concentracioacuten de 40 mgl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo de 15 diacuteas
El SO2 tuvo un comportamiento efectivo y raacutepido contra las colonias de
BrettanomycesDekkera La poblacioacuten de esta levadura se redujo de forma
significativa entre el diacutea primero y el cuarto se encontroacute una diferencia porcentual
de 96 en la primera prueba y del 60 en la de duplicado al diacutea 15 ya la
poblacioacuten era casi nula pasando raacutepidamente de un numero por encima de la
poblacioacuten critica de la levadura BrettanomycesDekkera a un numero lt103 UFCml
siendo muy eficaz y raacutepido en el manejo de produccioacuten
Este compuesto ademaacutes de favorecer la extraccioacuten de los compuestos fenoacutelicos y
de su actividad antioxidante al inhibir la accioacuten de las polifenoloxidasas a dosis
adecuadas de un maacuteximo de 50gl inhibe la multiplicacioacuten bacteriana y de
levaduras
59
Figura 6 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de
Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo
de 15 diacuteas
Figura 7 Numero de UFCml de BrettanomycesDekkera en vino con adicioacuten de
Antibrettreg en concentracioacuten de 40gHl para evaluacioacuten y comparacioacuten durante un periodo
de 15 diacuteas
El compuesto Antibrettreg en la primera prueba tanto como en el duplicado tuvo su
mayor tiempo de reduccioacuten de UFCml entre los diacuteas 4-10 con una diferencia
porcentual de 91 en comparacioacuten con el diacutea cuarto al decimo a diferencia de
60
SO2 el cual presenta la gran disminucioacuten de colonias entre los primeros diacuteas de
agregarse el producto
El tiempo para que la poblacioacuten de la levadura llegara a la cantidad menor a la de
la poblacioacuten critica es mucho mayor que la del compuesto SO2 sabiendo que esta
poblacioacuten debe ser lt103 UFCml
El compuesto Antibrettreg puede tardarse 4-10 diacuteas en representar una reduccioacuten
de UFCml significativa en dicho tiempo puede representar grandes peacuterdidas
nutricionales y altos costos de produccioacuten para la fabricacioacuten
Figura 8 Comportamiento del contenido de alcohol en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin adicioacuten)
hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
BrettanomycesDekkera estaacute presente en vinos de alto contenido alcohoacutelico
aproximadamente entre 125 a 14 pues esta levadura toma a etanol como
fuente de carbono y este vino (Babic) procede de uvas muy maduras las cuales
presentan mayor cantidad de azuacutecares residuales (como glucosa y fructosa y
otras pentosas residuales)
138
14
142
144
146
148
Alcohol
Day 0 Day 15
61
Analizando el comportamiento del vino durante el experimento de 15 diacuteas sin
compuestos quiacutemicos y con SO2 y Antibrettreg a partir de las caracteriacutesticas
iniacuteciales que se determinaron seguacuten el equipo BACCHUS analizador infrarrojo se
presenta en general una reduccioacuten del contenido alcohoacutelico de este vino pero se
ve una mayor reduccioacuten en el vino de control el cual redujo en un 394 su
contenido alcohoacutelico desde el dia 0 hasta el diacutea 15 este vino no tiene ninguacuten
compuesto contra la levadura BrettanomycesDekkera y por su elevada presencia
en los 15 diacuteas de experimento consumioacute esta cantidad de etanol
Mientras en el vino que conteniacutea SO2 tras 15 diacuteas de tratamiento se vio una
reduccioacuten de alcohol de 1 ya que este compuesto redujo la cantidad de
BrettanomycesDekkera en los primeros diacuteas de tratamiento previniendo su
reproduccioacuten y protegiendo el contenido alcohoacutelico del vino Babic 2007
En los vinos de prueba con Antibrett reg la reduccioacuten alcohoacutelica se dio en un
porcentaje de 122 un poco maacutes alta que con SO2 y mucho maacutes baja en
comparacioacuten del vino de control este compuesto tambieacuten previno la gemacioacuten de
la levadura evitando la perdida de etanol en el vino sin embargo como este
compuesto duro mas en este proceso de eliminar BrettanomycesDekkera se
produjo una mayor peacuterdida alcohoacutelica
62
Figura 9 Comportamiento del contenido de acidez volatil en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin
adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
Debido a la presencia de oxigeno en los frascos la acidez volaacutetil aumento pero no
significativamente en las muestras No hubo grandes diferencias entre las
muestras con compuestos y las de control por lo que se deduce que estos
compuestos no ayudan a evitar esta acidez Esta acidez tan alta puede dantildear la
calidad del vino de forma casi irreparable Pero el factor oxigeno es de los maacutes
controlados en la produccioacuten de vinos
la alteracioacuten del aumento de la acidez volaacutetil no estaacute relacionada con la levadura
BrettanomycesDekkera sino a la presencia de oxigeno en el almacenamiento el
oxigeno fue usado en esta prueba para promover condiciones apropiadas para el
desarrollo de la levadura
002040608
112
Acidez Volatil
Day 0 Day 15
63
Figura 10 Comportamiento del contenido de Acido Acetico en vino Babic 2007 desde el diacutea 0 (sin
adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en comparacioacuten con el vino de control
Brettanomyces Dekkera son productores de aacutecido aceacutetico y elevan el contenido
de los vinos anormalmente en condiciones de anaerobiosis En condiciones de
aerobiosis producen concentraciones bajas o nulas de aacutecido aceacutetico
Este acido aceacutetico al igual que los fenoles afecta el sabor y el perfil olfativo del
vino tinto este efecto es tambieacuten producido por la levadura
BrettanomycesDekkera vemos en los resultados el gran crecimiento de este
compuesto en el vino control el cual no tenia compouestos en contra de
BrettanomycesDekkera lo que produjo este aumento significativo del acido aceacutetico
en comparacioacuten con estos que teniacutean SO2 y Antibrettreg entre ellos la diferencia en
este compuesto es muy reducida y no significativa pues estos compuestos no
permitieron la gemacioacuten de esta levadura y esta no produjo este acido en esa gran
cantidad
A este compuesto se le atribuye el olor y sabor a vinagre del vino tinto un defecto
muy comuacuten y poco agradable para el consumidor
105110115120125130135140
Acido Acetico
Day 0 Day 15
64
Figura 11 Comportamiento del contenido de Azucares reductores en vino Babic 2007
desde el diacutea 0 (sin adicioacuten) hasta el diacutea 15 con tratamiento de SO2 y Antibrettreg en
comparacioacuten con el vino de control
BrettanomyesDekkera utiliza los azucares residuales como fuente de carbono
para su crecimiento en el vino este es el factor maacutes importante para su desarrollo
y este es el que determina en cierto caso la cantidad de levaduras de
BretanomycesDekkera presente en las graficas se determina claramente que en
el vino de control donde la cantidad de esta levadura es muy alta 15 diacuteas despueacutes
de empezar las pruebas la cantidad de azucares reductores es muy baja y ha
bajado en un porcentaje de 10 mientras que el vino que tiene SO2 bajo la
cantidad de azucares reductores en un 042 y el vino que tiene el compuesto
Antibrettreg redujo su nivel de azucares reductores en 462
38
4
42
44
46
48
5
Azucares Reductores
Day 0 Day 15
65
84 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE
CARAacuteCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON
EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID
PHASE
Tabla 10 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en
vino Babic 2007 con el meacutetodo propuesto
Compuesto Tiempos de
retencioacuten (min)
Acetaldehiacutedo 1437
Propanol 3759
Diacetil 4202
Etil-acetato 4523
i-butanol 6232
Acido Aceacutetico 7840
i-amil alcohol 11740
n-amil 13489
lactato de etiacutelico 15741
acetato amil metiacutelico 17796
1-hexanol 19101
etil-hexanol 24456
Linalol 30370
2-feniletanol 32768
p-cresol 33522
octanoato de etilo 34226
4-etilfenol 37100
2-feniletil acetato 32769
4-etilguayacol 39704
4 vinilfenol 40529
decanoato de etilo 42117
Refirieacutendose a estos resultados es necesaria la creacioacuten de soluciones estaacutendar
para determinar tiempos de retencioacuten con el meacutetodo y si es necesario ajustes a
este
66
Tabla 11 Soluciones estaacutendar para compuestos en vinos tintos Croatas
MODEL 0
(en volumen de 100 ml en 40 Etanol)
Compuesto Pureza Cantidad
(g)
Concentracioacuten (gl)
Acetaldehiacutedo 099 1623 160677
Propanol 0995 13849 137718
Diacetil 098 01071 104958
Etil-acetato 0995 30172 3002114
i-butanol 099 15016 1486584
Acido Acetico 0995 0 0
i-amil alcohol 099 20116 1991484
n-amil 098 15442 1513316
lactato de etilio 098 00507 049686
acetato amil metilico 098 01028 100744
1-hexanol 098 00367 035966
etil-hexanol 098 00308 029876
Linalol 097 00288 027936
Nerol 097 00311 030478
Citronelol 098 0031 03038
Geraniol 098 15803 1548694
2-feniletanol 098 00402 039396
4-etilfenol 098 00812 078764
octanoato de etilo 097 00597 059103
2-feniletil acetato 099 00315 031185
4-etilguayacol 098 00803 079674
Fuente Laboratorio de anaacutelisis e investigacioacuten de bebidas Facultad de Tecnologiacutea y Biotecnologiacutea
de Alimentos Universidad de Zagreb Zagreb Croacia 2009
Las soluciones estaacutendar se realizan teniendo como referencia las cantidades de
estos compuestos en los vinos tintos croatas datos suministrados por el Doctor
Leo Gracin en concentraciones de gl a partir de este dato y teniendo en cuenta
67
la pureza de los compuestos que se teniacutean en el laboratorio de anaacutelisis e
investigacioacuten de bebidas se crean las soluciones estaacutendar Ejemplo
Solucioacuten estaacutendar para 4 etil-fenol en un volumen de 100 ml
Con estas soluciones estaacutendar se realizo el tiempo de retencioacuten para corroborar el
meacutetodo Los resultados de esto fueron tiempos de retencioacuten diferentes a los del
meacutetodo primero con el que se realizaron los ensayos y a partir de esos resultados
se ajusto el meacutetodo con el que se trabajo
68
Tabla 12 Tiempos de retencioacuten para los compuestos volaacutetiles y no volaacutetiles del caraacutecter Brett en
vino Babic 2007 con el meacutetodo modificado
Compuesto Tiempos de
retencioacuten (min)
Acetaldehiacutedo 1542
Propanol 4046
Diacetil 4733
Etil-acetato 4807
i-butanol 6659
Acido Acetico 8343
i-amil alcohol 12123
n-amil 13866
lactato de etilio 16072
acetato amil metilico 18336
1-hexanol 19447
etil-hexanol 24835
Linalol 31831
2-feniletanol 33305
p-cresol 33703
octanoato de etilo 34571
4-etilfenol 37724
Citronelol 38326
Nerol 38576
2-feniletil acetato 39012
Geraniol 39944
4-etilguayacol 40271
4 vilifenol 41168
decanoato de etilo 42657
69
DIA 0
Se coloca ISTD a todas las muestras respectivas para poder determinar
cantidades de los compuestos aromaacuteticos
Se realiza la cromatografiacutea de gas al vino Babic 2007 antes de ser inoculado con
BrettanomycesDekkera
Tabla 13 Resultados de la cromatografiacutea de gas del vino Babic 2007
Compuesto Tiempo de retencioacuten
min
Cantidad
mgl
Acetaldehiacutedo 1542 0
Propanol 4046 0
Diacetil 4733 37215204
Etil-acetato 4807 0
i-butanol 6659 0
Acido Aceacutetico 8343 2817465
i-amil alcohol 12123 16799019
n-amil 13866 26
lactato de etiacutelico 16072 10983961
acetato amil metiacutelico 18336 0185196
1-hexanol 19447 264655
etil-hexanol 24835 0158751
Linalol 31831 0
2-feniletanol 33305 4235560
p-cresol 33703 1
octanoato de etilo 34571 0152412
4-etilfenol 37724 00581345
Citronelol 38326 00439729
Nerol 38576 00344799
2-feniletil acetato 39012 00407983
Geraniol 39944 0
4-etilguayacol 40271 0
4 vilifenol 41168 0
Decanoato de etilo 42657 00190144
70
Basados en los compuestos aromaacuteticos que brinda el ldquoCaraacutecter Brettrdquo se van a
analizar detalladamente los siguientes aromas 4-Etilfenol 4-Etilguayacol 4-
Vinylfenol
Figura 12 Compuestos aromaticos en vino tinto Babic sin estar contaminado con la levadura
BrettanomycesDekkera
El vino a analizar esta por debajo de las concentraciones consideradas como
perjudiciales para el aroma del vino tinto (El umbral sensorial del 4-etilfenol es de
230 μgl y el del 4-etilguaiacol es de 47 μgl) pues posee una concentracion de
58microgL de 4etilfenol 0 microgL de 4 etilguayacol y 0 microgL de vinylfenol
841 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGUacuteN TEMPERATURAS
DE ALMACENAMIENTO
0
02
4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinylfenol
Vino 00581345 0 0
C (
mg
L)
Vino Babic 2007 Dia 0
71
Tabla 14 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el
ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 20C por 4 diacuteas Prueba por duplicado
MUESTRAS INCUBADA A 20C
Compuesto Day 1
Amount
(mgL)
Day 2
Amount
(mgL)
Day 3
Amount
(mgL)
Day 4
Amount
(mgL)
4-etilfenol 0260244 017294 0177547 020156
4-etilfenol 0260244 0245915 0204542 0262499
4-etilguayacol 0 0 0 0
4-etilguayacol 0 0 0 0
4 vinilifenol 1107096 781349 685317 460323
4 vinilifenol 1107096 1297465 621324 693225
72
Figura 13 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
BrettanomycesDekkera es la levadura responsable de la produccion de 4-etil-
fenol compuesto asociado con olores caracteristicos a ldquofenolrdquo ldquocuerordquo ldquosudor de
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 00581345 0260244 0172935 0177547 020156
C (
mg
L)
4 etilfenol
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 00581345 0260244 0245915 0204542 0262499
C (
mg
L)
4 etilfenol
73
caballordquo ldquoestablordquo o ldquobarnizrdquo dantildeando la calidad sensorial del vino tinto Babic la
produccioacuten de este compuesto en esta muestra realizada por duplicado fue
ascendente y tuvo incremento muy grande en el primer dia de almacenamiento y
en el transcurso de los siguientes cuatro diacuteas se mantuvo relativamente estable lo
cual no concuerda con el comportamiento tiacutepico de esta levadura quien tiene un
crecimiento lento e incrementa la produccioacuten de fenoles con su gemacioacuten esto
genera muchas dudas sobre el buen funcionamiento del equipo GC o de la
estabilidad de las levaduras BrettanomycesDekkera en este almacenamiento
Figura 14 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar prueba por duplicado
002040608
1
Vino Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0 0 0
4 etilguayacol
002040608
1
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0 0 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
74
Presencia negativa de 4 etil guayacol durante todo el almacenamiento
probablemente las condiciones de almacenamiento y el medio no dieron lugar al
desarrollo de este compuesto el cual se considera menos conflictivo que el 4-etil-
fenol
Figura 15 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 20C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
Estos resultados tambieacuten dejan dudas del normal comportamiento de dicha
levadura pues indican que la levadura no convirtioacute este compuesto en etilfenol
0
2
4
6
8
10
12
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 110709781349685317460323
4 vinylfenol
0
2
4
6
8
10
12
14
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
Series1 0 11071 12974 62132 69322
C (
mg
l)
4 Vinylfenol
75
durante el almacenamiento caracteriacutestica que solo la levadura
BrettanomycesDekkera puede realizar se ve que las concentraciones de
vinylfenoles son mucho mas altas que las de fenoles lo que nos deja determinar
que la poblacioacuten de BrettanomycesDekkera es muy baja y existen otras levaduras
productoras de vinylfenoles en este tipo de vino en las condiciones de
almacenamiento dadas para estas pruebas
Tabla 16 Resultados de las cantidades en mgL de los compuestos aromaacuteticos que otorgan el
ldquocaraacutecter Brettrdquo al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 28C por 4 diacuteas
MUESTRA 2 INCUBADA A 28C
Compuesto Day 1
Amount
(mgL)
Day 2
Amount
(mgL)
Day 3
Amount
(mgL)
Day 4
Amount
(mgL)
4-etilfenol 0260244 019612 0186614 019932
4-etilfenol 0260244 020576 0214917 0193554
4-etilguayacol 0 014304 0223836 0
4-etilguayacol 0 002287 00529832 0
4 vinilifenol 1107096 787068 665182 397847
4 vinilifenol 1107096 284389 00204392 0
76
Figura 16 Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces Dekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar
El desarrollo de este compuesto en el diacutea 1 fue significativo y luego relativamente
estable el comportamiento fue similar en las pruebas de diferentes temperaturas
de almacenamiento para este compuesto el cual es el maacutes problemaacutetico en la
industria viniacutecola
0
005
01
015
02
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 005813019932018661019611019932
4 etilfenol
0
005
01
015
02
025
03
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 005813 019355 021491 020576 026024
4 etilfenol
77
Figura 17 Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar
Los resultados de la prueba son poco confiables y no entendibles por lo que
podemos verificar que el GC no estaacute trabajando de forma adecuada para la
deteccioacuten del compuesto
0001002003004005006
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 Etilguayacol 0 0 0022 0053 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
0005
01015
02025
Vino
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
4 etilguayacol 0 0 0223 0143 0
C (
mg
l)
4 etilguayacol
78
Figura 18 Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura BrettanomycesDekkera almacenado a 28C por 4 diacuteas en comparacioacuten con el vino sin
contaminar Prueba por duplicado
El comportamiento de este compuesto en la prueba es muy irregular y poco
confiable
0
2
4
6
8
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 397847665182787068397847
4 vinylfenol
0
2
4
6
8
10
12
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 11071 28438 00204 0
4 vinylfenol
79
Figura 19 Comportamiento del compuesto 4 etilfenol durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
La concentracioacuten de 4 etil fenol fue mayor al cuarto diacutea almacenado a
temperatura ambiente de 20C pero este compuesto no tuvo una actividad notoria
de ascenso durante su almacenamiento como se esperaba lo que deja muchas
dudas sobre los resultados de este ensayo
0
05
1
15
2
25
3
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etil fenol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 20C
80
Figura 20 Comportamiento del compuesto 4 etil guayacol durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
Comportamiento anormal del compuesto no se ve tendencias de aumento o
disminucioacuten de este en ninguna de las pruebas no tiene un comportamiento
regular pues se esperaba que la levadura BrettanomycesDekkera
descarboxinizara el compuesto 4-vinilguaiacol y aumentar las concentraciones de
4-etilguaiacol esta reaccioacuten no se hizo notoria en los compuestos aromaacuteticos
seguacuten lo determino el Cromatografo de Gas (GC)
0
005
01
015
02
025
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3
C (
mg
L)
4 etil guayacol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 20C
81
Figura 21 Comportamiento del compuesto 4 Vinyl fenoll durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparacioacuten con el inicial del vino son contaminar
La no presencia de este compuesto en el vino original demuestra las baja o casi
nula presencia de la levadura BrettanomycesDekkera al diacutea primero este
compuesto incrementa de forma notoria en las muestras debido a la presencia de
acido cumaacuterico en el medio ya que sufre su carboxilacion convirtieacutendose en 4 vinyl
fenol sin embargo su comportamiento no fue regular y presento problemas de
lecturas
0
2
4
6
8
10
12
14
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
C (
mg
L)4 Vinyl fenol
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 28C
82
9 CONCLUSIONES Y
RECOMENDACIONES
91 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO
Se desarrolloacute un medio selectivo soacutelido para BrettanomycesDekkera
accesible y faacutecil de elaborar
Se detectan colonias de la levadura BrettanomycesDekera en el agar
selectivo con glucosa como fuente de carbono en un lapso de 5 diacuteas en
incubacioacuten a 28C
El medio selectivo soacutelido con Glucosa como fuente de carbono fue maacutes
raacutepido y efectivo ya que toma 5 diacuteas para dar resultados positivos frente al
de Etanol como fuente de carbono el cual toma 10 diacuteas para mostrar
resultados positivos aunque ambos dieron resultados satisfactorios en la
selectividad de la levadura BrettanomycesDekkera
La levadura se adapto de forma satisfactoria a estos medios en
condiciones de almacenamiento propias para su desarrollo (28C)
Las colonias de la levadura BrettanomycesDekkera tiene un crecimiento
en estos medios soacutelidos de forma circular con topografiacutea convexa y borde
entero dimensiones 5-6 mm color Amarillo opacicidad oscuro
83
superficie lisa y suave siendo faacutecil de identificar y realizar los conteos
necesarios
El medio solido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten
de la levadura BrettanomycesDekkera en vino tinto es raacutepido econoacutemico
y uacutetil
El uso de azucares para fermentacioacuten de la levadura
BrettanomycesDekkera que Saccharomyces no puede fermentar para
mayor selectividad
Realizacioacuten de pruebas Bioquiacutemicas como meacutetodo raacutepido de selectividad
92 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DESARROLLO DEL MEDIO LIacuteQUIDO
Se desarrollo un medio selectivo liquido para BrettanomycesDekkera
accesible y faacutecil de elaborar
Este medio mostroacute resultados positivos de la presencia de
BrettanomycesDekkera en un lapso de tiempo menor (3 diacuteas) que con el
medio solido (5 diacuteas) en caso de que el nuacutemero de ceacutelulas de la levadura
BrettanomycesDekkera sea mayor a la poblacioacuten critica (103)
Cuando la poblacioacuten de ceacutelulas de la levadura BrettanomycesDekkera es
menor a la poblacioacuten critica el tiempo de identificacioacuten de esta levadura por
medio liquido es muy prolongado puede tomar maacutes de 10 diacuteas o incluso no
detectarlo
84
Los compuestos quiacutemicos usados para el desarrollo del medio liacutequido no
son los adecuados para este tipo de medios donde los resultados positivos
son olfativos pues estos compuestos emiten fuertes olores que confunden
los olores caracteriacutesticos del caraacutecter Brett
El medio liquido es un buen complemento en los meacutetodos de identificacioacuten
de altas concentraciones de la levadura BrettanomycesDekkera en vino
tinto es raacutepido econoacutemico y uacutetil
93 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETTreg
EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE DALMACIA
CROACIA
Este trabajo mostroacute que el dioacutexido de azufre (SO2) tiene buenos resultados
en contra de la levadura BrettanomycesDekkera en concentraciones
normales de 40mgl concentracioacuten en la que se trabaja este compuesto en
los vinos tintos
En Europa el dioacutexido de azufre es usado de forma tradicional en gran
nuacutemero de alimentos y especialmente en vinos sin embargo y a pesar de
su uso regulado se busca la sustitucioacuten de este o su maacutexima reduccioacuten
para hacer de este producto maacutes sano para las personas no tolerantes a
este tipo de compuestos sin embargo seguacuten el trabajo realizado en
comparacioacuten con el producto Antibrettreg el SO2 es maacutes eficaz en el control
85
de la levadura ayudando a evitarla y eliminarla de la cadena productiva del
vino tinto
Gracias a sus caracteriacutesticas el vino tinto Babic es muy vulnerable a la
levadura BrettanomycesDekkera pero a su vez se puede tratar faacutecilmente
con productos como SO2 y Antibrettreg aunque es maacutes efectivo contra
BrettanomycesDekkera el dioacutexido de azufre (SO2)
Antibrettreg es una buena opcioacuten para el control de BrettanomycesDekkera
para evitar el uso de productos alergenicos como SO2
94 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DETERMINACION DE AROMAS DE CARAacuteCTER BRETT EN
EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO
MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE
Al terminar la primera prueba con anaacutelisis en cromatografiacutea a gas y el SPME
queda como resultados
Es necesario repetir la prueba
No se determina el efecto de los estaacutendares internos sometidos a tiempos
de almacenamiento en temperaturas de 20C y 28C lo que puede dar falsos
resultados de cantidades de compuestos
86
Se debe crear un medio maacutes apto para el desarrollo de la levadura y un
control diario de crecimiento ( agregar maacutes Glucosa en caso de que se
haya consumido toda controlar presencia de Bacterias y otros
microorganismos que no se deseen en el medio)
Es necesario control de aromas con panel sensorial para determinar el
umbral de deteccioacuten en este vino
Control de crecimiento por medio solido Selectivo para
BrettanomycesDekekra conteo de colonias presentes en el vino inoculado
y su desarrollo durante almacenamiento a diferentes temperaturas
La segunda prueba no fue posible realizarla por dantildeos en el equipo de
cromatografiacutea de gas (GC)
87
ANEXOS
11
89
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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fase soacutelida (SPME) Revista Jornadas Cientiacuteficas 99 Grupos de
Investigacioacuten Enoloacutegica Zaragoza Espantildea
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GRACIAS es una palabra corta para todo lo que quiero expresar a todos aquellos que
hicieron parte de este suentildeo hecho realidadhellip
A Dios y a la virgen Auxiliadora por llevarme de su mano cada diacutea de mi carrera en cada
momento alegre y en cada momento difiacutecil fueron mi fortaleza
A mis papitos por hacer de mi estudio una realidad por su sacrificio y apoyo desinteresado y
sincero
A mi Hermanito por ser mi fortaleza mi ejemplo y mi amigo incondicional
A mi familia Blanco y Urrea por su compantildeiacutea durante esta etapa
A mi facultad (Decano Dr Camilo Rozo Dra Patricia Jimeacutenez y mis profesores) por
ensenarme mi profesioacuten y aportar lo mejor de ustedes para mi formacioacuten personal
A mis asesores de Tesis (Ing Patricia Chaparro y Dr Sc Leo Gracin) por su guiacutea y
colaboracioacuten oportuna
A mis queridos amigos quienes siempre han estado a mi lado en las dificultades y en las
alegriacuteas (Ingrid Mafe Cami G Cami R Harold Pipe Karla Andreacutes T Diego G)
A IAESTE en alianza con el ORI por hacer posible mi intercambio y poder hacer mi tesis en el
maravilloso paiacutes de Croacia
A Croacia por ser mi segundo hogar por abrirme sus puertas y su corazoacuten por brindarme
tan maravillosas personas en mi camino
Croatia Thank you for being my second home for opening your doors and your heart to me
and give me the opportunity to meet so many wonderful people
To my boss my teacher my mentor and specially my friend Leo
To the faculty of food technology and Biotechnology and the department of technology
and analysis of beverages for give me the opportunity to give all my knowledge to the
project and learn a lot more
To all the amazing people I met during this experience (Igor Karin Natka Josip Ana Matija
Daniel Pz Szilvia Dini Daniela Lidija Sanja and everybody else who I had the pleasure to
meet in this great trip) for give me the best of your hearts
I only have one thing to say hellipTHANK YOU
Solo me queda una palabra por decirhellipGRACIAS
