Das humane Genom - genome.tugraz.at · DNA Fingerprint mittels VNTRPs-Vaterschaftstest • Abb. zeigt Vaterschaftstest. Die Pfleile zeigen an, wo sich das Profil des Kindes von jenem

Molekulare Diagnostik

1Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Andreas Prokesch

Das humane GenomDas humane Genom

protein coding &non-protein coding

satellites and single repeats

mob

ile (t

rans

posa

ble)

DNA

ele

men

ts

Alle Genome sind individuell, selbst jene eineiiger Zwillinge!



Variationen im humanen GenomVariationen im humanen Genom• Einzelpunktmutationen (SNPs or SNVs, single nucleotide polymorphisms/variants)

synonyme (neutrale) oder nicht-synonyme (funktionelle)

• Indelskurze Insertionen oder Deletionen

• Duplikationen oder Inversionen

• Strukturelle VariationenGrößere Insertionen (z.B. Retrovirus), Deletionen, Inversionen oder Duplikationen (>100-1000bp)

• Mobile DNA elemente (Transposone)„Springen“ im Genome, machen 45% des Genoms aus

• Kurze repetitive Elemente (Satelliten DNA oder variable number tandem repeat(VNTR))6-7% des humanen Genoms

Führen oft zu CNVs

(copy-numbervariations)



SNP-Genotypisierung

Single nucleotide polymorphisms (SNPs):

•99,5% der DNA Sequenzen aller Menschen sind ident•20% der verbleibenden 0,5% entsprechen SNPs •SNP nennt man den Austausch einer einzelnen Base:

Bsp.: GCCCCT wird zu GACCCT•SNP kommt etwa alle 1000 bp im Genom vor•Damit gibt es etwa 1-3 Millionen potentielle SNPs•The SNP consortium (TSC): Zusammenschluss von Pharma und Akademie um so viel wie möglich SNPs zu identifizieren•Öffentlich zugänglich in dbSNP•>12 Millionen sind bereits identifiziert



Vererbung von SNP• Meist nicht als einzelne SNPs sondern als Blöcke

(benachbarte SNPs) vererbt

• Blöcke bezeichnet man als Haplotyp

• Haplotyp Blöcke werden über Generationen ohne Rekombination weitervererbt (Stammbaumnachweis,Evolutionsnachweis, Populationsstudien)

• Sprich, auch wenn ein Block viele SNPs enthält, reicht die Identifizierung einiger SNPs um Haplotyp zu identifizieren



Verbreitete Krankheiten und dazugehörende SNPs

• Die meisten Krankheiten werden nicht von einzelnen SNPs hervorgerufen, sondern durch komplexe Interaktionen mehrerer Gene, Umweltfaktoren und Lebensstil.

• Zusammenhänge zwischen Krankheit und SNPs bzw. Haplotypen werden immer wichtiger für Diagnose.

• Umso mehr Krankheiten bestimmten SNPs/Haplotypen zugeordnet werden können, umso einfacher wird ihre Diagnose.

• Diagnose durch Analyse spezifischer SNP-Muster



SNP-abhängiger Response • Mensch und Tier:

-Medikamente führen zum gewünschten Erfolg: Heilung, Repression, Linderung (benefitial drug response)

-Medikamente führen zu keiner Besserung oder überhaupt zum Tod (adverse drug respsponse)

• Pflanzen: genet. Manipulation von/durch SNPs könnte Erntertrag erhöhen

Vorteil: Reduktion von Herbiziden, Insektiziden, Kunstdünger• Bakterien/Viren: SNPs verursachen Medikamentenresistenz

(Krankenhauskeime!!!)HIV ist schwer zu behandeln, weil Mutationsfrequenz des Virus in den SNPs sehr hoch



Diagnose von SNPs

• Allel-spezifische (Oligonukleotid) Hybridisierung

• Allel-spezifische Oligonukleotid Ligation

• Primer Verlängerung

• Sequenzierung bestimmter DNA-Fragmente



Allel Spezifische Hybridisierung(AS oder ASO)

Testprinzip: Unterscheidung zweier DNA Moleküle, die in einer Base variieren, mittels Hybridisierung.

Floureszenz markierte PCR Produkte werden zu immobilisierten Oligonukleotiden (=SNP Sequenzen) gegeben. Hybridisierung erfolgt extrem stringent (was nicht exakt bindet wird weggewaschen). Hinterher wird die Intensität der Floureszenz gemessen.



Allel Spezifische Hybridisierung(AS oder ASO)

Zugabe floureszenzmarkierter PCR Produkte zu immobilisiertenOligos (oder umgekehrt), Bindung sehr stringent.

Dot-blot:



SNP-chips zur parallelen Detektion tausender SNPs

Beinhaltet 1,8 Mill Marker für genetische Variationen (~900.000 SNPs)



Allel Spezifische Oligonukleotid Ligation

• Es werden Oligos designt, die komplementär zur Zielsequenz (zu untersuchende Sequenz, durch PCR hergestellt) sind.

• Am 5´oder 3´Ende dieses Oligos befindet sich die allelspezifische Base

• Liegt ein SNP vor:Oligonukleotid ligiert nicht an Zielsequenz

• Liegt kein SNP vor:Oligonukleotid ligiert an Zeilsequenz



Allel Spezifische Oligonukleotid Ligation



Primer extension

• Das zu untersuchende Gen wird wiederum mittels PCR amplifiziert• Daraufhin folgt eine Einzelbasen-Erweiterung via Terminatoren

(Didesoxynukleotide, verhindert weiteren Anbau von Basen)• Ob Erweiterung erfolgte, kann mittels Massenspektrometrie (MALDI-TOF)

gemessen werden

+ddNTPs

Sonde:



Sequenzierung gewisser DNA-Fragmente

• Das Sequenzieren ist meist die Untersuchungsmethode der Wahl bei SNPs

• Zwei Möglichkeiten der Primer Verlängerung:a) dye-Primers und unmarkierte Terminatoren b) Unmarkierte Primer und dye-Terminatoren

Die Produkte der Reaktion werden dann mittels Kapillarelektrophorese aufgetrennt.



Sequenzierung bestimmter DNA-Fragmente

• 1. Sequenz: WT homozygot

• 2. Sequenz: SNP homozygot

• 3. Sequenz: 1 Allel mit SNP, 1 Allel ohne Mutation

Sequenz zeigt typischen Haplotyp, gleich mehrere SNPs als Block nebeneinander!!



Copy-number variations (CNVs)

• Deletionen oder Duplikationen (1kbp – xMbp)• Verursacht durch Replikationsfehler und Transposone • 12% des humanen Genoms sind CNVs• Wirken meist evolutorisch positiv, aber:• Assoziiert mit Krankheiten

– Krebs (Bsp: Lungenkrebs (EGF Rezeptor))– Autismus– Schizophrenie– ...

• Detektionsmöglichkeiten:– FISH (Fluorescent in situ-hybridization)– Array-CGH (comparative genomic hybridisation)– Direktes Sequenzieren– MPLA-Analyse



MLPA Analyse(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)

• Multiplexmethode zur CNV-Detektion• Bis zu 50 Zielsequenzen können gleichzeitig

untersucht werden (Stuffer sequence Unterschiedlich lange Amplicons)

• Auftrennung mittels Kapillarelektrophorese (Fluoreszenzmarkierter Primer)

• Semi-quantitative Auswertung durch Vergleich zu Kontroll-DNA

• Auch zur Analyse von Aneuploidie (z.B.: Trisomie)



DNA-Fingerprint(DNA Profiling, DNA test)

Dient dazu Individuen genetisch zu unterscheidenDazu verwendet man genetischen Polymorphismus (Bsp. Blutgruppen-Polymorphismus/Landsteiner).

Verfahren erzeugt für das Genom eines Individuums spezifisches DNA-Fragmentmuster. Diese Muster bezeichnet man als:

genetischer Fingerabdruck



Verwendung der Fingerprints• Vaterschaftstest (allg. Abstammungsverhältnisse)

50-100ng DNA reichen aus 1-2 µl Blutaus Spuren von Samenflüssigkeitaus Haarwurzel(n)

• Forensische Analysen• Diagnostik von Gendefekten• Reinheitsüberwachung von Zelllinien• Identifizierung von Spender und Empfängerzellen bei

Knochenmarkstransplantationen• Eiigkeitsbestimmung von Zwillingen



DNA-FingerprintEs gibt drei Methoden genetischer Fingerprints:• RFLP (Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus)• VNTRPs (Variable number of tandem repeats polymorphismus)• STRPs (Short tandem repeats polymorphismus)

Verwendete Methoden zur Bandenvisualisierung:• PCR gefolgt von Gelelektrophorese• Southern Blot



Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP)

• spezielle Klasse von DNA-Sequenz Polymorphismen• lokal auftretende DNA-Sequenzveränderungen durch:

einzelne BasenaustauscheDNA UmlagerungenDNA InsertionenDNA Deletionen

• RFLP, wenn durch Basenaustausch die Erkennungsstelle für Restriktionsendonuklease betroffen ist



RFLP verursacht

• Auftreten oder Verschwinden von Schnittstellen• Schneiden der genomischen DNA führt also zu:

verkürzten DNA-Fragmentenverlängerten DNA-Fragmenten

• Veränderung des Fragmentmusters der geschnittenen genom. DNA nach Gelelektrophorese

• Verwendbar als genetische Marker (Vererbung nach Mendel), da sie co-dominant sind

• Heterozygote Individuen besitzen das mutierte (RFLP) und das normale Gen



RFLP Analyse mittels PCR & Restriktionsverdau

• Die Allele A und B unterscheiden sich in der Schnittstelle T. Mittels PCR wird DNA amplifiziert und dann mit einem Enzym geschnitten (bei T).

• Bei Individuen AA gibt es keine Restriktionsschnittstelle

• Bei Individuen AB trägt ein Allel die Schnittstelle T, das andere nicht.

• Bei Individuen BB tragen beide Allele die Schnittstelle T.

• Menge an DNA entsprechend!!!

B1



VNTRPs (Variable-number-of-tandem-repeats polymorphisms)

• Verschiedene Individuen einer Population besitzen an bestimmten Stellen im Genom unterschiedlich viel tandemartig wiederholte Sequnzen (10-100 Nukleotide, Minisatelliten); ca. 50 Wiederholungen

• z.B. kommt bestimmte Nukleotidfolge bei einem Individuum 15, beim anderen 22-mal vor

• Führt zu unterschiedlichen Sequenzlängen zwischen homologen Regionen



Entstehung von Satelliten DNA



VNTRPs Analyse mittels PCR

a.) DNA mit unterschiedlich vielen Tandemrepeats

b.) PCR mittels individuell gesetzter Primer

c.) Gelelektrophorese liefert unterschiedlich lange DNA Fragmente aufgrund der unterschiedlich vielen repetitiven Sequenzen

Vorteil: durch PCR wird DNA angereichert. Schneiden der DNA ist nicht nötig!!!



STRPs (Short tandem repeats Polymorphisms)

Verschiedene Individuen einer Population besitzen an bestimmten Stellen im Genom unterschiedlich viele tandemartig wiederholte Mikrosatelliten:

Wiederholungen 2-10 bp (gatagatagatagatagatagata)(vgl. VNTRPs 10-100 bp, Minisatelliten)

Bzgl. dieser STRPs sind so gut wie alle Individuen einer Population heterozygot und daher untereinander verschieden. Wird daher für kommerzielle Tests verwendet.



DNA Fingerprint mittels VNTRPs-Vaterschaftstest

• Abb. zeigt Vaterschaftstest. Die Pfleile zeigen an, wo sich das Profil des Kindes von jenem des V2 unterscheidet, damit kommt V2 nicht als Vater in Frage.

• Technik: DNA der Probanden wird mit Enzymen geschnitten, auf Agarosegel aufgetrennt, auf Trägerfolie geblottet und mittels spezifischer radioaktiv markierter Sonde(n) hybridisiert und sichtbar gemacht. Nicht radioaktiv nicht möglich, da viel zu viele Fragmente vorhanden sein würden (Überlappung).



Familienzugehörigkeit????• Wie sind die Eltern

und die Kinder verwandt?

• Wie können sie die Verwandtschaft erklären?

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