UNIVERSIDAD TECNICA PARTICULAR DE LOJA

INGENIERIA EN INDUSTRIAS AGROPECUARIAS

ANLISIS INSTRUMENTAL

ARTCULOMTODO ANALTICO POR CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN PARA EL ESTUDIO DE ESTABILIDAD DEL JARABE DE LORATADINA 0,1 %

NOMBRE: GABRIELA A. ARCINIEGA A.

PROFESOR:

ING. GEOVANNY FIGUEROA LOJA ECUADOR

2007

Rev Cubana Farm 2007; 41(1)

Centro de Investigacin y Desarrollo de Medicamentos

Mtodo analtico por cromatografa lquida de alta resolucin para el estudio de estabilidad del jarabe de loratadina 0,1 %

Leonid Torres Amaro, 1 Caridad M. Garca Pea2 y Zenia Pardo Ruiz2 Resumen

Se valid un mtodo de cromatografa lquida de alta resolucin para el estudio de estabilidad del jarabe de loratadina 0,1 %. La curva de calibracin en el rango de 13,6 a 3,36 g/mL fue lineal, con un coeficiente de correlacin igual a 0,99975; la prueba estadstica para el intercepto y la pendiente, no significativa. El recobrado obtenido result de 100,2 % en el rango de concentracin estudiado, y las pruebas de Cochran y Student (t), no significativas. El coeficiente de variacin en el estudio de repetibilidad fue igual a 0,41 % para 10 rplicas ensayadas, mientras que en la reproducibilidad las pruebas de Fischer y Student, no significativas. El mtodo result especfico, lineal, preciso y exacto.

Palabras clave: Loratadina, cromatografa lquida de alta resolucin, validacin.

Loratadina es un derivado piperidnico de la azatadina, de accin antihistamnica con actividad central sedativa o antimuscarina. Es indicado para aliviar los sntomas de las reacciones de hipersensibilidad, incluyendo la rinitis alrgica y la urticaria crnica.1,2

Existen reportes de mtodos analticos por espectrofotometra ultravioleta para formulaciones de loratadina tabletas debido a que es un producto que absorbe intensamente en la regin del ultravioleta.3 Para el jarabe de loratadina aparecen reportes de mtodos analticos por cromatografa lquida de alta resolucin.4

La cromatografa lquida de alta resolucin (CLAR) ha dado la posibilidad al analista de usar esta herramienta para solucionar los inconvenientes de los mtodos espectrofotomtricos en los estudios de estabilidad, pues adems de presentar una alta sensibilidad y exactitud, es en esencia un mtodo separativo; lo que permite medir con gran selectividad el compuesto deseado, siempre y cuando se encuentre un sistema cromatogrfico que asegure una adecuada separacin.4

La validacin es el proceso establecido para la obtencin de pruebas documentadas de que el mtodo es lo suficientemente fiable para producir el resultado.5-8

En el presente trabajo se describe y valida un mtodo analtico por CLAR a fin de cuantificar el principio activo para los estudios de estabilidad del jarabe de loratadina 0,1 %.

Mtodos

La sustancia de referencia qumica de loratadina fue suministrada por el grupo de sustancias de referencia del Centro de Investigacin y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM). El producto terminado en forma de jarabe al 0,1 %, fue elaborado en la Grupo de Formas terminadas, perteneciente al CIDEM. Todos los reactivos utilizados fueron de grado HPLC.

En el ensayo se emple un cromatgrafo (KNAUER) con detector UV/VIS (KNAUER) ajustado a 254 nm, un dosificador (loo) de 20 L e integrador (SHIMADZU CR6A), con una sensibilidad de 0,08 AUFS. La separacin se realiz isocrticamente sobre una columna Licrospher RP 18, 250 mm x 4 mm, 10 m. La fase mvil utilizada consisti en una mezcla filtrada y desgasificada de metanol: dihidrogenofosfato de potasio 0,013 mol/L, ajustada a pH 7,6-8,0 con hidrxido de potasio 0,1 mol/L en proporcin 8/2 (v/v), con una velocidad de flujo de 2,0 L/min. Todos los reactivos utilizados fueron de calidad analtica (MERCK, Alemania).

Con el objetivo de evaluar la especificidad del mtodo cromatogrfico, se someti el producto terminado de la formulacin seleccionada a oxidacin con unas gotas de perxido de hidrgeno al 33 %, a hidrlisis con hidrxido de sodio 1 mol/L y cido clorhdrico 1 mol/L (1:1), colocndose las muestras durante 30 min. en un bao de agua destilada a 100 C. Previamente se analiz la sustancia de referencia y el placebo sin degradar y posteriormente fueron evaluadas por cromatografa lquida de alta resolucin.9 Las muestras fueron diluidas con la fase mvil de manera que se obtuviera una concentracin similar a 20 g/mL.

Se comprob la linealidad del sistema, preparando muestras a diferentes niveles de loratadina que representan el 68,100,128,148, 168 % de la concentracin terica del principio activo en el jarabe, evalundose el coeficiente de correlacin, la ecuacin de la recta, la prueba de linealidad y la prueba de proporcionalidad.10

La repetibilidad se realiz con una muestra homognea y comn del lote 46 que representa el 100 % de la cantidad terica declarada. La precisin intermedia se realiz con la misma muestra homognea de concentracin nica, efectundose las valoraciones en 2 equipos diferentes, 2 das diferentes; para su evaluacin se realiz un anlisis de varianza, a travs de la determinacin del coeficiente de variacin, prueba de Fischer y de la t de Student.11

El estudio de exactitud se desarroll por el mtodo de recuperacin, mediante la preparacin de muestras con diferentes niveles de loratadina que representan el 80, 90, 110 y 120 % respectivamente de la concentracin terica del principio activo en el producto terminado, evalundose los parmetros de la prueba de la t de Student, de Cochran, ecuacin de la recta y coeficiente de correlacin.10

Todos los resultados obtenidos fueron evaluados estadsticamente con la ayuda del programa Microcal Origin 5.0 para Windows.

Resultados

La figura muestra los resultados obtenidos en el estudio de especificidad del mtodo. Como se observa en el cromatograma correspondiente a la muestra placebo no se obtuvo ninguna seal en la zona de inters, al ser comparado con la seal obtenida para la solucin estndar de referencia y de la muestra, lo cual indica que los excipientes o sustancias auxiliares de la solucin no interfieren en la determinacin del principio activo. En cuanto a las muestras sometidas a condiciones drsticas de: hidrlisis bsica, hidrlisis cida y H2O2.

Fig. Estudio de especificidad. Cromatogramas: A) sustancia de referencia qumica; B) placebo; C) muestra; D) muestra en medio cido; E) muestra en medio bsico.

Simultneamente se realiz un scanning al pico correspondiente al principio activo en un rango de 200 a 500 nm, obtenindose una pureza del 99,6 %.

La ecuacin de la recta de la curva de calibracin en el rango de concentraciones entre 13,6 a 33,6 g/mL, se expresa segn y = 0,9815 X + 0,0136, con un coeficiente de correlacin lineal de 0,99854. Al aplicar la prueba de significacin del intercepto se obtuvo una tcal = 3,91 para una ttab = 4,30. Cuando se aplic la prueba de linealidad mediante los coeficientes de variacin de los factores de respuesta CVf se obtuvo como resultado un coeficiente de variacin CV= 2,1 %.

Los resultados del estudio de la precisin, realizado 2 das diferentes por 2 analistas diferentes, aparecen en la tabla 1.

Tabla 1. Resultados del estudio de la precisin

RepetibilidadReproducibilidad

Muestras % Analista 1Analista 2

1 98,0 Da 1 Da 2 Da 1 Da 2

2 98,1 100,4 % 100,2 % 97,8 % 97,4 %

3 98,5 97,8 % 97,6 % 98,3 % 98,5 %

4 97,9 98,5 % 98,8 % 99,1 % 99,8 %

5 98,3 97,6 % 97,1 % 98,5 % 99,3 %

6 98,2 98,6 % 98,4 % 98,5 % 98,3 %

7 98,5 98,3 % 98,5 % 98,6 % 98,7 %

8 99,0 98,2 % 98,8 % 98,4% 98,5 %

9 98,3 Xm1 =98,5 % Xm2 =98,5 % Xm1 =98,5 % Xm2 = 98,6 %

10 99,1 CV=0,9 % CV= 0,9 % CV= 0,4 % CV =0,74 %

X media = 98,4 % DSR= 0,4 % CV= 0,41 % Fcal =1,6 tcal = 0,253

Ftab (6/6; 0,05) = 4,28 ttab (12; 0,05) = 2,18

Intervalo de confianza: 98,5 0,04 %

En la tabla 2 se muestran los resultados obtenidos en el estudio de la exactitud del mtodo. En la curva de recuperacin, se reportan los mg tericos contra los mg prcticos, obtenindose la ecuacin de la recta: y= 1,04885 X - 1,1107, con un coeficiente de correlacin de 0,99624. Al aplicar la prueba de significacin para conocer la influencia de la concentracin (G de Cochran), se obtuvo una Gcal= 0,6923 para una Gtab= 0,8709. Al realizar la prueba de significacin entre la recuperacin media y el 100 % de recuperacin, se obtuvo una tcal= 0,71 para una ttab= 2,45.

Tabla 2. Resultados del estudio de exactitud

mg adicionadosmg recuperadosRecobrado (%)CV (%)

0,01592 0,01591 0,01579 0,01579 98,6 0,50

0,01871 0,01825 0,01828 0,01822 101,8 1,25

0,02206 0,02218 0,02222 0,0222 100,52 0,023

0,02403 0,02411 0,02419 0,02418 100,32 0,023

Discusin

Los resultados obtenidos del anlisis de la muestra placebo, la solucin de referencia, la muestra del producto terminado y la muestra degradada por hidrlisis cida, hidrlisis bsica, oxidacin H2O2, que se muestran en la figura, demuestran la especificidad del mtodo al no presentarse interferencias de picos adicionales en la zona de elucin del producto principal.6El scanning realizado con el objetivo de determinar la pureza del pico de loratadina, en el rango de 200 a 500 nm demostr que no exista solapamiento de otros productos de degradacin.

La curva de calibracin result ser lineal en un rango de concentraciones entre 13,6 a 33,6 g/mL.

Al aplicar la prueba del intercepto, este result ser no significativo ya que la tcal fue menor que la ttab para 4 g.l. y una probabilidad de 0,05. En la prueba de linealidad mediante los coeficientes de variacin de los factores de respuesta CVf se obtuvo un coeficiente de variacin menor del 5 %, lo que demuestra la adecuada linealidad de acuerdo con el lmite establecido, por lo que se demuestra el cumplimiento de la linealidad en el intervalo de concentracin estudiado.7 En el estudio de la repetibilidad se alcanz un coeficiente de variacin de 0,41 %, adecuado lo que nos demuestra la buena precisin del mtodo, segn el lmite para los mtodos cromatogrficos CV 2 %.8 Los valores obtenidos para el estudio de la precisin intermedia demuestran que no existen diferencias significativas entre las precisiones alcanzadas por los analistas en diferentes das para una probabilidad de 0,05 % ya que el valor de Fcal es menor que la Ftab. Al realizar la prueba de la t de Student el valor calculado result ser menor que el tabulado para una probabilidad de 0,05 y 8 g.l., lo cual demuestra que no existen diferencias significativas entre las medias alcanzadas con un nivel de significacin del 5 %.8

En el rango seleccionado en el estudio de exactitud, los valores de porcentaje de recobro estuvieron dentro de los lmites establecidos para los mtodos cromatogrficos (98-102 %) y los valores del coeficiente de variacin para cada uno de los niveles de concentracin estudiados resultaron ser menor que el 2 %.11

En la influencia del factor concentracin sobre la variabilidad de los resultados de la exactitud al aplicar la prueba de Cochran se obtuvo que Gexp fue menor que la Gtab para una probabilidad de 005, k= 3 y n= 3; por tanto, las varianzas de las concentraciones empleadas son equivalentes y nos indican que la concentracin no influye en la variabilidad de estos.

No existen diferencias significativas entre la recuperacin media (100,2 %) y el 100 % de recuperacin al aplicar la prueba de la t de Student, ya que la tcal fue menor que la ttab para 6 g.l. y una probabilidad de 0,05, por lo que el mtodo es exacto.

La curva de recuperacin reportada de mg tericos contra los mg prcticos demostr un comportamiento lineal, ya que la ecuacin de la recta y el coeficiente de correlacin se encontraron dentro de los lmites establecidos para este ensayo. La prueba de significacin del intercepto result no significativa y el valor de la pendiente no difiere significativamente de la unidad. Los valores alcanzados de la pendiente, el intercepto y el coeficiente de correlacin demostraron la exactitud y linealidad del mtodo.9

En conclusin, el mtodo analtico desarrollado por CLAR para el estudio de estabilidad del jarabe de loratadina result ser especfico, lineal, preciso y exacto en el intervalo de concentraciones de 13,6 y 33,6 g/mL

Summary

Analytical method by high resolution liquid chromatography for the stability study of loratidine syrup 0.1 %

A high resolution liquid chromatography method was validated to study the stability of loratidine syrup 0.1 %. The calibration curve in the range from 13.6 to 3.36 g/mL was lineal, with a coefficient of correlation equal to 0.99975. The intercept and slope statistical test was not significant. The recovery obtained was 100.2 % in the concentration range studied, and the Cochran and Student (t) tests results were not important. The variation coefficient in the repeatability study was equal to 0.41 % for 10 replications assayed, whereas in the reproducibility Fischer and Student tests were not remarkable. The method proved to be specific, lineal, accurate, and exact.

Key words: Loratidine, high resolution liquid chromatography, validation.

Referencias bibliogrficas

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6. United States Pharmacopoeial Convention. USP 29. Validation of compendial methods. 23 ed. Rockville : Mack Printing; 2006. p. 1982-4.

7. International Conference on Harmonization (ICH) of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use, Validation of analytical procedures, ICH-Q2A, Geneva, 1995.

8. International Conference on Harmonization (ICH) of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use, Validation of analytical procedures: Methodology, ICH-Q2B, Geneva, 1996. ICH harmonized tripartite guideline. Methodology of validation of analytical method. Recomendado en Nov. 1996.

9. Sarrio RV, Silvestre LJ. Validation of Analytical Assays and Test Methods for the Pharmaceutical Laboratory. The Regulatory Forum. Bioserch. 1996.

10. Guidance for Industry. Analytical Procedures and Methods Validation Chemistry, Manufacturing, and Controls Documentation. FDA/Center for Drug Evaluation and Research. 2001.

11. Guidance for Industry. Analytical Procedure and Methods Validation. Draft Guidance. August, 2000.

Recibido: 11 de octubre de 2006. Aprobado: 17 de noviembre de 2006. Lic. Leonid Torres Amaro Centro de Investigacin y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM). Ave. 26 No. 1605 entre Boyeros y Puentes Grandes, municipio Plaza de La Revolucin. La Habana, CP 10 600, Cuba. Correo electrnico:E-mail: mailto:leonid@cidem.quimefa.cu1 Licenciado en Ciencias Farmacuticas. Investigador Agregado. 2 Master en Ciencias. Investigadora Agregada. BIBLIOGRAFA Cromatografa (on line). Disponible en Internet http://bvs.sld.cu/revistas/far/vol41_1_07/far03107.htm. Acceso el 02 de junio de 2007