2

ปญหาพเศษปรญญาตร สาขาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร

เรอง

การวเคราะหล าดบนวคลโอไทดของ Coat protein gene (CP gene) และ 3’ Untranslated

regions (3’UTR) ของเชอ Chilli veinal mottle virus (ChiVMV) ทแยกไดจากจงหวดเชยงใหมและหนองคาย

Sequence analysis of Coat protein gene (CP gene) and 3’ Untranslated regions (3’UTR)

of Chilli veinal mottle virus (ChiVMV) isolated from Chiang Mai and Nong Khai

โดย

นางสาวธญญาพร เหลาคงถาวร

ควบคมและอนมตโดย

………………………………… (ดร.สจนต ภทรภวดล) วนท ……… เดอน ...................... พ.ศ. .......... อาจารยทปรกษาปญหาพเศษ

3

การวเคราะหล าดบนวคลโอไทดของ Coat protein gene (CP gene) และ 3’ Untranslated regions (3’UTR) ของเชอ Chilli veinal mottle virus (ChiVMV) ทแยกไดจากจงหวดเชยงใหมและ

หนองคาย

นางสาวธญญาพร เหลาคงถาวร

บทคดยอ

โรคเสนใบดางประของพรกเกดจากเชอ Chilli veinal mottle virus (ChiVMV) มความหลากหลายทางพนธกรรมของเชอ เพอใหทราบถงความแตกตางของสายพนธเชอในแหลงปลกพรกทส าคญในเขตภาคเหนอและอสานของประเทศไทย งานวจยนจงมวตถประสงคเพอจดจ าแนกเชอและวเคราะหความสมพนธโดยการศกษาล าดบนวคลโอไทดของ CP gene และบรเวณ 3’UTR ของเชอ ChiVMV ทแยกไดจากจงหวดเชยงใหมและจงหวดหนองคายเปรยบเทยบกบเชอ ChiVMV ทมการรายงานในฐานขอมล NCBI โดยการสกดอารเอนเอจากใบพชทมเชอ ChiVMV น ามาสงเคราะห cDNA ดวยวธ Reverse Transcription (RT) และเพมปรมาณดเอนเอดวยเทคนค PCR ไดดเอนเอขนาดประมาณ 1,200 คเบส สงวเคราะหล าดบนวคลโอไทด พบวาเชอ ChiVMV ทแยกไดจากจงหวดเชยงใหม (Ca1010) มล าดบนวคลโอไทดทความคลายคลงกบเชอ ChiVMV สายพนธ K37 (กาญจนบร), SKh5 (สงขลา), CM1 (เชยงใหม), SRt8 (สราษฎรธาน), BP (ราชบร) และ KPS9 (นครปฐม) จากประเทศไทย โดยมเปอรเซนตความเหมอนของล าดบนวคลโอไทดทระดบ 99.0 เปอรเซนต สวนเชอ ChiVMV ทแยกไดจากจงหวดหนองคาย (Ca1053) มล าดบ นวคลโอไทดทความคลายคลงกบเชอ ChiVMV สายพนธ T97 (ตาก) และ PJ (ประจวบครขนธ) โดยมเปอรเซนตความเหมอนของล าดบนวคลโอไทด ทระดบ 97.0 เปอรเซนต ค าส าคญ : Chilli veinal mottle virus, ChiVMV, ยนโปรตนหอหมอนภาค, 3’UTR ปญหาพเศษ : ปรญญาตร สาขาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร อาจารยทปรกษา : ดร.สจนต ภทรภวดล ปทพมพ : 2555 จ านวนหนา : 33

4

Sequence analysis of Coat Protein Gene (CP gene) and 3’ Untranslated regions

(3’UTR) of Chilli veinal mottle virus (ChiVMV) isolated from Chiang Mai and Nong Kai

Miss Tanyaporn Lhaokongthawon Abstact

Chilli veinal mottle virus (ChiVMV) is causing agent of Chili veinal mottle disease. The objectives of this study were to identify and study the phylogenic relationship of ChiVMV infected chilli in the North and North-east of Thailand. RNA was extracted from ChiVMV infected leaf, cDNA was amplified by Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) and the PCR was performed to obtain 1200 base pairs (bp) of Coat Protein (Cp) gene. PCR products were cloned and sequenced. The sequences of Cp gene and 3’untranslated region (3’UTR) were compared with these gene sequences of ChiVMV isolates reported in the NCBI database. According to the phylogenetic tree, ChiVMV “Chiang Mai” isolate (Ca1010) was placed into the same cluster as same as K37 (Kanchanaburi), SKh5 (Songkhla), CM1 (Chiang Mai), SRt8 (Surat Thani), BP (Ratchaburi) and KPS9 (Nakhon Pathom) with the similarity of nucleotide identities at 99%. Whereas “Nong Khai” isolate (Ca1053). was placed into the same group as same as T97 (Tak) and PJ (Prachuap Khiri Khan) with the similarity of nucleotide identities at 97%. Key words : Chilli veinal mottle virus, ChiVMV, CP gene, 3’UTR Degree : Bachelor of Science, Program in Agricultural Biotechnology, Faculty of Agriculture at Kamphaeng Saen, Kasetsart University Advisor : Dr. Sujin Patarapuwadol Year : 2012 Page : 33

5

ค านยม

ขอขอบพระคณ ดร.สจนต ภทรภวดล อาจารยทปรกษาปญหาพเศษ ทกรณาใหโอกาส ใหวชาความร ค าปรกษา ค าแนะน า ความชวยเหลอ และการเอาใจใส พรอมทงใหการสนบสนนในทกๆ ดานดวยดตลอดมา จนท าใหขาพเจาประสบความส าเรจในการศกษาและการท าวจยครงน ขอขอบพระคณ คณวารรตน สมประทม , คณแพรวรจ ชเชด และพๆ หองปฏบตการ A309 อาคารปฏบตการวจยศนยเทคโนโลยชวภาพเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน ทคอยใหความชวยเหลอ แนะน าและดแลเอาใจใสเปนอยางด จนการท าวจยครงน ประสบผลส าเรจดวยด ขอขอบพระคณสาขาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร คณะเกษตร ก าแพงแสนมหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน ทใหทนสนบสนนการท าปญหาพเศษในครงน และขอขอบคณ ภาควชาโรคพช ในการอนเคราะหโรงเรอนส าหรบปลกพชทดลอง ขอขอบพระคณ บดา มารดา และทกคนในครอบครวทใหโอกาสทางการศกษา ก าลงใจ ค าแนะน า ความรกและความหวงใย ท าใหขาพเจามความวรยะอตสาหะจนงานวจยเสรจลลวงไปไดดวยด ขอขอบคณเพอนๆ ทกคนทคอยชวยเหลอทงใหค าปรกษา ค าแนะน า และก าลงใจ ท าใหการวจยในครงนประสบความส าเรจ สดทายประโยชนและคณคาอนพงมจากปญหาพเศษครงน ขอมอบแด บดา มารดา ทใหการอบรมเลยงด ใหการศกษา รวมทงอาจารยทกทานทประสทธประสาทความรตางๆ ตลอดจนพๆ ทใหความรกบขาพเจาทกคน จนสามารถท าใหการท าปญหาพเศษครงนส าเรจได

ธญญาพร เหลาคงถาวร พฤศจกายน 2554

6

สารบญ

หนา สารบญ (1) สารบญภาพ (2) สารบญตาราง (3) ค าน า 1 ตรวจเอกสาร 3 อปกรณและวธการ 7 ผลและวจารณการทดลอง 15 สรปผลการทดลอง 22 เอกสารอางอง 23 ภาคผนวก 26

1

สารบญภาพ ภาพท หนา 1 ลกษณะอาการของเชอ ChiVMV ในพชอาศย 16 2 ลกษณะอาการดางทเกดจากเชอ ChiVMV 16 3 ผลการวเคราะหขนาดดเอนเอของยน CP และบรเวณ 3’UTR ของเชอ ChiVMV 18 ทแยกไดดวยเทคนค Agarose gel electrophoresis 1.0 เปอรเซนต ภายหลงการเพม ปรมาณดวยเทคนค RT-PCR จากไพรเมอร ChiVMV 1037 pol. และ Oligo-dT 4 การเปรยบเทยบล าดบนวคลโอไทดของยน CP และสวน 3’UTR ของเชอ ChiVMV 19 ทแยกไดจากจงหวดเชยงใหมและหนองคายกบเชอ ChiVMV สายพนธอนๆ ทม รายงานในทวปเอเชยทง 19 สายพนธ ทมรายงานในฐานขอมลของ NCBI ดวยโปรแกรม MEGA 5 5 เปรยบเทยบความสมพนธทางพนธกรรมของเชอ ChiVMV ทแยกจากจงหวด 21 เชยงใหม (Ca1010) และหนองคาย (C1053) ดวยล าดบนวคลโอไทดของยน CP และบรเวณ 3’UTR กบเชอ ChiVMV จากเอเชยทมรายงานใน GeneBank โดยใชโปรแกรม MEGA 5.0 ดวยวธ Neighbor Joining ตวเลขเหนอเสนแสดง คา Bootstrap จากการค านวณ 100 ครง

1

สารบญตาราง

ตารางท หนา 1 แหลงทมาของเชอไวรสทกอโรคในพรกทท าการศกษา 7 2 แหลงทมาของล าดบนวคลโอไทดของเชอ ChiVMV บนฐานขอมล 13 GenBank ทใชในการศกษาความสมพนธทางพนธกรรม 3 การแสดงคาการดดกลนคลนแสงท 405 นาโนเมตรของตวอยางพช 15 ทน ามาตรวจสอบเชอไวรสดวยเทคนค indirect ELISA

1

ค าน า

พรกจดเปนพชทส าคญในชวตประจ าวนและมความส าคญทางเศรษฐกจของประเทศไทย จากสถตการสงออกและการน าเขาในป พ.ศ. 2554 (ระหวางเดอนมกราคม - มถนายน) ไทยน าเขาพรกแหงปรมาณ 17 ลานกโลกรม คดเปนมลคารวม 347ลานบาท เพมขนจากปทผานมาถงรอยละ 39.95 จากปรมาณการสงออกและน าเขาพรกแหงแสดงใหเหนวาความตองการใชพรกแหงมมากขน แตปรมาณ คณภาพและราคาของพรกทผลตไดภายในประเทศไมสอดคลองหรอสม าเสมอกบความตองการ เนองมาจากการเขาท าลายของโรคและแมลงทมกสรางความเสยหายใหกบผลผลตพรก โรคทพบในพรกทส าคญทท าใหผลผลตของพรกลดลง ไดแก โรคเสนใบดางประของพรก ซงมสาเหตมาจากเชอ Chilli veinal mottle virus (ChiVMV) ซงโรคทเกดจากเชอไวรสนน ในปจจบนยงไมมสารเคมใดทสามารถจะก าจดเชอไวรสไดโดยตรง วธการทดทสดคอ การปรบปรงพนธพรกใหตานทานตอเชอไวรส ทงนการปรบปรงพนธพชใหตานทานตอเชอไวรสเพยงไอโซเลทเดยวอาจไมเพยงพอเพราะพนธพชทตานทานดงกลาวอาจออนแอตอเชอไวรสชนดเดยวกนแตตางไอโซเลท ดงนนการจดจ าแนกเชอ ChiVMV จากแหลงปลกพรกในพนทตางๆ เปนปจจยหนงทมความส าคญส าหรบการปรบปรงพนธพรก เพอใชในการคดเลอกพนธตานทาน โดยสายพนธพรกทไดจะมความตานทานตอโรคเสนใบดางประในพนทตางๆ ซงจะเปนประโยชนกบเกษตรกรตอไป

การทดลองครงนมวตถประสงคเพอจ าแนกและวเคราะหความสมพนธทางพนธกรรมของ

เชอ ChiVMV ทแยกไดจากจงหวดเชยงใหมและจงหวดหนองคาย เปรยบเทยบกบเชอ ChiVMV ทมการรายงานในฐานขอมล NCBI โดยใชขอมลในสวนของล าดบนวคลโอไทดของยนโปรตนทหอหมอนภาคและบรเวณ 3’UTR

2

วตถประสงค

เพอวเคราะหความสมพนธทางพนธกรรมของเชอ ChiVMV ทแยกไดจากจงหวดเชยงใหมและจงหวดหนองคาย เปรยบเทยบกบเชอ ChiVMV ทมการรายงานในฐานขอมล NCBI โดยใชขอมลในสวนของล าดบนวคลโอไทดของยนโปรตนทหอหมอนภาคและบรเวณ 3’UTR

สถานทท าการทดลอง

1.หองปฏบตการ A309 อาคารปฏบตการวจยศนยเทคโนโลยชวภาพเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน จงหวดนครปฐม

2. โรงเรอนปลกพชทดลอง ภาควชาโรคพช คณะเกษตร ก าแพงแสน

มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน จงหวดนครปฐม

ระยะเวลาในการศกษา

เดอนมกราคม พ.ศ. 2554 ถง เดอนสงหาคม พ.ศ. 2554

3

การตรวจเอกสาร

1.พรก 1.1 ขอมลทวไปของพรก พรกเปนพชในตระกล Solanaceae มชอทางวทยาศาสตรวา Capsicum sp. ชอ

ภาษาองกฤษวา Chilli, peppers, chili หรอ chile ซงอยในตระกลเดยวกบมะเขอ มนฝรง และยาสบ พชในตระกลนมอยประมาณ 90 สกล (Genus) หรอ 2,000 ชนด (Species) พรกเปนเครองเทศทส าคญชนดหนง และยงมคณสมบตเปนสมนไพรดวยเชนกน พรกมหลายชนด เชน พรกขหน พรกไทย พรกหยวก พรกเหลอง พรกชฟา พรกหนม พรกกะเหรยง ประเทศไทยนนมกนยมปลกพรกอย 2 ชนด ซงไดแก 1.พรกหวาน พรกหยวก พรกชฟา (ในกลม C. annuum) 2.พรกเผดไดแก พรกขหนสวน พรกขหนใหญ (ในกลม C. furtescens) (นรนาม, 2554)

1.2 ลกษณะทางพฤกษศาสตร โดยทวไปพรกเปนไดทงพชลมลก ไมพม และไมยนตนขนาดเลก ซงกระจายอยทวไปของโลก ระบบรากของพรกมรากแกว ล าตนพรกตงตรง สงประมาณ 1-2.5 ฟต ใบมลกษณะแบนราบเปนมน มขนบางเลกนอย ใบมรปรางตงแตรปไขไปจนกระทงเรยวยาว ดอกพรกเปนดอกสมบรณเพศ คอมเกสรตวผและเกสรตวเมยอยภายในดอกเดยวกน มทงผลเดยวและผลกลม (สชลา, 2549)

1.3 ความส าคญทางเศรษฐกจของพรก พรกเปนพชทมความส าคญทางเศรษฐกจของประเทศไทย โดยเฉพาะอยางยงพรกขหนผล-

ใหญ ซ ง ม พ น ทปลกคดเ ปน 61% ของพน ทปลกทงหมด แหลงปลกทส าคญอย ในภาคตะวนออกเฉยงเหนอ พนธพรกทใชมทงพนธผสมเปดและพนธลกผสม จากสถตการสงออกพรกแหง พรกปนหรอบดและอนๆ ในป พ.ศ. 2551 ปรมาณ 2,595.91 ตน มลคารวม 187.35 ลานบาท ลดลงจากปทผานมารอยละ 63.48 เนองจากปรมาณการผลตลดลงและมการน าเขาพรกแหงราคาถกจากตางประเทศเขามามากขน ปรมาณการสงออกและน าเขาพรกแหงแสดงใหเหนวาความตองการใชพรกแหงมมากขน แตปรมาณ คณภาพและราคาของพรกทผลตไดไมสอดคลองหรอสม าเสมอกบความตองการใชของผ แปรรป จงท าใหตองมการน าเขาพรกแหง เพอมาใชในอตสาหกรรมอาหารภายในประเทศ (นรนาม, 2551)

4

จากการศกษาพบวาปญหาทส าคญของการผลตพรก คอเรองของโรคและแมลง เมอเกด

การระบาดของโรคหรอแมลงขนกจะท าใหเกดความเสยหายในการผลตเปนอยางมาก ซงโรคทพบ ไดแก โรคตนเนา โรคผลเนา โรคกลาเนา โรคยอดและดอกเนา โรคใบจด โรคก งแหง โรคราแปง โรคเหยว โรคใบหงกหรอใบดางและโรคเสนใบดางประของพรก ทท าใหผลผลตและคณภาพของพรกลดลงมากถง 50% (มณฉตร, 2541 และ Shah et al., 2008) แนวทางทส าคญในการควบคมโรคและแมลงทมประสทธภาพคอการปรบปรงพนธพชตานทาน (สพฒน, 2552)

2. เชอ ChiVMV สาเหตโรคใบดางประของพรก

เชอ ChiVMV ( Chilli veinal mottle virus ) เปนสาเหตของโรคเสนใบดางประของพรก ลกษณะอาการของโรค ไดแก ตนแคระแกรน ใบแกแสดงอาการดางสเขยวเขมตามแนวเสนใบสลบกบสเขยวออน บางครงถาพรกออนแอตอโรคใบพรกจะแสดงอาการบดเบยวผดรปหรอใบมขนาดเลกบดเบยวเรยวยาวและลดรป ตนทเปนโรคตดฝกนอย ฝกพรกเลกกวาปกต บางครงท าใหผลแสดงอาการดางหรอบดเบยว (นรนาม, 2553) พบการแพรระบาดทวไปทงประเทศแถบเอเชยใตและตะวนออกเฉยงใต ซงพบวาเชอ ChiVMV มความสมพนธทางพนธกรรมกบเชอ Pepper veinal mottle virus (PVMV) (Tsai et al., 2007) เชอ ChiVMV เปนไวรสในจนส Potyvirus โปรตนหอหมอนภาคมน าหนกโมเลกลประมาณ 33 กโลดาลตน ประกอบดวย กรดนวคลอกชนดอารเอนเอสายเดยว (single stranded RNA) มขนาดความยาวของสารพนธกรรม 9.7 กโลเบส มอนภาคเปนทอนยาวคด (flexuous rod) มความยาวของอนภาคประมาณ 750 นาโนเมตร และมความกวางประมาณ 13 นาโนเมตร (สจนต และคณะ, 2551)

3.การจดจ าแนกเชอ ChiVMV

ลกษณะและคณสมบตตางๆ ของไวรสทสามารถน ามาใชประกอบในการจ าแนกชนดของไวรส อาจแบงออกไดเปน 2 ประเภท (ธระ, 2522) คอ

3.1ลกษณะทคงท (stable characters) นยมใชเปนหลกในการก าหนดกลมของไวรส ซงประกอบดวย สวนทเปนลกษณะเฉพาะของอนภาคไวรส เชน ขนาดและรปราง ชนดและปรมาณของ nucleic acid จ านวน protein subunit ขนาด การเรยงตว องคประกอบหลกและคณสมบต

5

ทางเซรมวทยาของ protein subunit ความคงทนของอนภาคในสภาพแวดลอม และสวนทเกยวของกบไวรส พชอาศยและพาหะ เชน พาหะโดยธรรมชาต อาการของโรคทเกดเฉพาะพชและไวรสนนๆ (ธระ, 2522)

3.2 ลกษณะทผนแปร (Unstable or changeable characters) นยมใชในการจ าแนก

ชนดของไวรสในกลมเดยวกนออกจากกน เชน ความจ าเพาะทางเซรมวทยา องคประกอบของ protein subunit และสวนทเกยวของกบไวรส พชอาศยและพาหะ เชน ขอบเขตของพชอาศย ความรนแรงของโรคลกษณะการถายทอดโดยพาหะ (ธระ, 2522) ซงในปจจบนมการประยกตเทคนคทางอณชววทยาเขามาชวยในการจดจ าแนกชนดเชอไวรส เชน เทคนค Reverse transcription-Polymerase chain reaction (RT-PCR) ในการเพมปรมาณยนตางๆ ของไวรสและน าขอมลมาใชส าหรบการจดจ าแนก โดยจะเลอกใชสวนของล าดบนวคลโอไทดทเปนบรเวณอนรกษ (conserve region) ของเชอ เชน ยน CP ซงไดรบความนยมอยางมากในการจดจ าแนกเชอไวรสในจนสโพทไวรส โดยการจดจ าแนกเชอโพทไวรสดวยยนดงกลาว ถามคาความเหมอนกนของล าดบนวคลโอ-ไทดตงแต 76.0-77.0 เปอรเซนต ขนไปแสดงวาไวรสชนดนนเปนไวรสชนดเดยวกน (Adams et al., 2005) ตวอยางรายงานการวจยทมการน าเทคนคทางอณชววทยามาชวยในการจดจ าแนกชนดของเชอไวรสมดงน

พสสวรรณ และคณะ (2540) จ าแนกชนดของโพทไวรสทแยกไดจากพรกทแสดงอาการเสน

ใบดางประทพบในเขตอ าเภอก าแพงแสน จงหวดนครปฐม โดยโคลนยน CP และสวนปลายสายดาน 3’ ขนาด 1,309 นวคลโอไทด เมอวเคราะหเปรยบเทยบเปอรเซนตความเหมอนกนของการเรยงล าดบเบสและล าดบกรดอะมโนของยนนกบขอมลยนของโพทไวรสชนดอนอก 23 ชนด พบวาล าดบกรดอะมโนของโปรตนหอหมอนภาคไวรสเสนใบดางประของพรกมแบบแผนเชนเดยวกบโปรตนหอหมอนภาคของโพทไวรสชนดอน แตมเปอรเซนตเหมอนกนของล าดบกรดอะมโนโปรตนหอหมอนภาคสงสดเพยง 75.0 เปอรเซนต ส าหรบล าดบ นวคลโอไทดบรเวณทไมแปลรหสมเปอรเซนตความเหมอนเพยง 29.7 เปอรเซนต

Tsai et al. (2007) จดกลมของเชอ ChiVMV จ านวน 24 ไอโซเลท ทแยกจาก ประเทศจน

ไตหวน ไทย อนเดย และอนโดนเซย และจดกลมรวมกบเชอ Pepper veinal banding virus (PVBV), Chilli vein-banding mottle virus (CVbMV) และ CVbMV Chiang Mai isolate

6

(CVbMV-CM) โดยเลอกใชสวนของล าดบนวคลโอไทดบรเวณยน CP และ 3’UTR เพอศกษาความสมพนธของเชอไวรสดงกลาวพบวามคาความเหมอนกนของล าดบนวคลโอไทดของยน CP ของเชอ ChiVMV กบเชอ PVMV ทระดบ 89.5 เปอรเซนต

จากการจดจ าแนกเชอดวยวธการศกษาเปรยบเทยบล าดบนวคลโอไทดของยน CP แสดง

ใหเหนวาเชอ ChiVMV มความสมพนธของล าดบนวคลโอไทดใกลเคยงกบเชอ PVMV ซงเปนเชอไวรสในจนส (genus) เดยวกน นอกจากนเมอท าการตรวจสอบเชอไวรสทง 2 ชนด ดวยเทคนคทางเซรมวทยาพบวาแอนตบอดทใชตรวจสอบเกดปฏกรยาขามระหวางเชอไวรสทง 2 ชนด ดงรายงานของ Moury et al. (2005) ทตรวจเชอ ChiVMV และ PVMV ในแอฟรกาและเอเชยตะวนออกดวยเทคนค DAS-ELISA โดยใชโพลโคลนอลแอนตบอด สงเกตเหนวาการตรวจสอบเชอ ChiVMV และ PVMV เกดปฏกรยาขาม

นอกจากการจดจ าแนกเชอ ChiVMV ดวยการเปรยบเทยบความสมพนธของล าดบ

นวคลโอไทดสวนของยน CP ยงพบวามการเลอกใชล าดบนวคลโอไทดในสวนปลาย 3’ เพอจดจ าแนกเชอไวรสในจนสโพทไวรสได Ha et al. (2008) ไดจดจ าแนกเชอ ChiVMV ดวยล าดบ นวคลโอไทดในสวนปลาย 3’ พบวาล าดบนวคลโอไทดในบรเวณดงกลาวสามารถใชในการจดจ าแนกเชอ ChiVMV ไดจ านวน 7 ไอโซเลท ดงน 1. ChiVMV-VN/C1, 2. ChiVMV-VN/C2, 3. ChiVMV-VN/C3, 4. ChiVMV-VN/C4,5. ChiVMV-VN/C1, 6. ChiVMV-VN/C1 และ 7. ChiVMV-VN/C1 จากเชอโพทไวรสทงหมด 52 ไอโซเลท นอกจากนน าขอมลของล าดบนวคลโอไทดสวนปลาย 3’ ของเชอจากประเทศตางๆ เปรยบเทยบกบเชอ ChiVMV จากประเทศไทยพบวามคาความเหมอนกนของล าดบนวคลโอไทด 99.0 เปอรเซนต (วารรตน, 2554)

7

อปกรณและวธการ

1. การแยกเชอ ChiVMV ใหบรสทธ 1.1 การเกบตวอยางใบพรกทแสดงอาการดางจากพนทตางๆ และการปลกเชอในพชอาศย

เกบตวอยางใบพรกทแสดงอาการดางจากจงหวดเชยงใหมและหนองคาย จ านวน 98 ตวอยาง เลอกเกบตวอยางจากแหลงปลกพรก โดยท าการสมเกบใบพรกทแสดงอาการดางทวแปลงของเกษตรกร เลอกตวอยางใบพชทแสดงอาการดาง จากพนทตางๆ ดงตารางท 3 ปลกเชอลงในพชอาศย ดงตอไปน ล าโพง (Datura metel) ยาสบใบกลาง (Nicotiana glutinosa) ยาสบใบใหญ (Nicotiana tabacum) สายพนธ White Burley สายพนธ Xanthi nc. และคโนโปเดยมสมวง (Chenopodium amaranticoulor) โดยบดตวอยางใบพรกทแสดงอาการดางใน 0.1M Phosphate buffer, pH 7.0 อตราสวน 1:5 (w/v) โรยผงคาบอรมดรมบนใบพช จากนนทาน าคนใบพชลงบนใบพชอาศยดวยมอ (mechanical transmission) ลางใบพชดวยน าสะอาดภายหลงการปลกเชอประมาณ 15 นาท

ตารางท 1 แหลงทมาของเชอไวรสทกอโรคในพรกทท าการศกษา

ไอโซเลท แหลงทมา ลกษณะอาการ Ca1007 จงหวดเชยงใหม ใบดางเหลองไปตามเสนใบ Ca1008 จงหวดเชยงใหม ใบดางลาย เสนใบลดรป Ca1010 จงหวดเชยงใหม ใบดางบรเวณเนอใบ บรเวณยอดหงก ใบลด

รป Ca1018 จงหวดเชยงใหม ใบจดวงซอนๆ กน พบมากทใบแก ใบออน

ดางเหลอง Ca1053 จงหวดหนองคาย ใบดางประ เสนใบใส และเสนใบลดรป

8

1.2 ตรวจสอบเชอไวรสในตวอยางใบพรกทแสดงอาการดางดวยเทคนค indirect ELISA ตรวจเชอ ChiVMV จากใบพชดวยเทคนค indirect ELISA ตามวธการทปรบปรงจาก

วธการของ Clark and Adams (1977) โดยเกบใบยอด ใบท 3 และใบท 5 ทอยถดจากใบยอด รวมเปน 1 ตวอยางตอ 1 ตน บดใบพชในสารละลาย carbonate coating buffer pH 9.6 ทผสม sodium diethyldithiocarbamate trihydrate (sodium DIECA) 0.02 เปอรเซนต กอนใชในอตราสวนใบพชตอบฟเฟอรเทากบ 1 กรมตอ 10 มลลลตร (w/v) ใสน าคนพชปรมาตร 50 ไมโครลตร ในหลมของ ELISA microtitre plate (Costar 3590, Cambridge, USA) ตวอยางละ 2 หลม (โดยมตวอยางพชทเปนโรคเสนใบดางประของพรก (positive control) และตนพชปกต (negative control) เปนตวอยางควบคม) บมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 ชวโมง เตม blocking solution (powder non fat milk ความเขมขน 3 เปอรเซนต ใน PBS, pH 7.4) หลมละ 50 ไมโครลตร บมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 ชวโมง เตม antiserum ตอเชอ ChiVMV ทเจอจางใน PBS pH 7.4 อตราสวน 1:2,000 หลมละ 50 ไมโครลตร บมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 ชวโมง เตม goat anti-rabbit IgG alkaline phosphatase conjugated (Sigma, St.Louis, USA) ทเจอจางใน PBS pH 7.4 อตราสวน 1:10,000 หลมละ 50 ไมโครลตร บมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 ชวโมง เตรยม substrate solution ( p - nitrophenyl phosphate) 1 มลลกรมตอมลลลตร ใน ELISA substrate buffer (Diethanolamine 9.7 เปอรเซนต, Sodium azide 0.002 เปอรเซนต และ MgCl2.6H2O 10 เปอรเซนต) เตมในหลม ELISA microtitre plate หลมละ 100 ไมโครลตร บมทอณหภมหองในทมดเปนเวลา 45 และ 60 นาท เมอครบเวลาดงกลาววดคาการดดกลนคลนแสง ( Optical density; O.D.) ทความยาวคลนแสง 405 นาโนเมตร ดวยเครอง ELISA reader (Multiscan EX, Labsystem, Finland) ทงนทกขนตอนกอนการเตมสารชนดใหมลงในหลมของ ELISA microtitre plate ตองเทสารเดมออกและลางดวย PBST (phosphate buffer saline ความเขมขน 0.1 โมลาร, pH 7.4 ทผสม Tween 20 ความเขมขน 0.05 เปอรเซนต) จ านวน 3 ครง ลางครงแรก 400 ไมโครลตรตอหลม สวนครงท 2 และ 3 ลางครงละ 200 ไมโครลตรตอหลม ทอณหภมหองครงละ 5 นาท

สวนการตรวจสอบเชอ Cucumber mosaic virus (CMV) และ Tobaco mosaic virus

(TMV) ใชวธการตรวจสอบ เชน การตรวจสอบเชอ ChiVMV แตแตกตางทอตราสวนการใชแอนตบอดดงน การตรวจเชอ CMV และ TMV ใช 1°Ab (primary antibody; Anti-CMV และ Anti-TMV) อตราสวน 1:1,000 ทเจอจางใน PBS, pH 7.4

9

1.3 แยกเชอ ChiVMV ใหบรสทธดวยพชอาศย โรยผงคารโบรนดมลงบนยาสบใบใหญ (Nicotiana tabacum) สายพนธ White Burley และสายพนธ Xanthi nc น าตนพชทแสดงอาการแผลจดเฉพาะท (local lesion) ตดเฉพาะบรเวณแผลจดโดยใชใบมดตด 1 จด น ามาบดบนสไลดแกวทม 0.1M phosphate buffer, pH 7.0 บดตวอยางโดยใชดามเขมเขยบด น าน าคนทบดแลว ทาลงบนยาสบใบใหญสายพนธดงกลาว ทงไวสกคร ประมาณ 15 นาท จงลางใบพชใหสะอาดดวยน า สงเกตอาการแผลจดเฉพาะท (local lesion) บนใบพชหลงจากปลกเชอ 2-3 วน จากนนปลกเชอไวรสจากอาการแผลจดเฉพาะทซ าอก 2 ครงดวยวธการขางตน

1.4 การเพมปรมาณเชอ ChiVMV โรยผงคารโบรนดมลงบนใบล าโพง บดใบพชทแสดงอาการดางจากเชอ ChiVMV โดยบดใบพชใน 0.1M Phosphate buffer, pH 7.0 อตราสวน 1:10 (w/v) ในโกรง เตม sodium sulfite (Na2SO3) เลกนอย น าน าคนทาลงใบล าโพง ทงไวประมาณ 15 นาท จากนนลางใบพชดวยน าสะอาด น าตนพชเกบไวในกรงทมตาขายกนแมลงขนาด 64 mesh สงเกตอาการของโรคเสนใบดาง-ประของพรกในพชอาศยภายหลงการปลกเชอ ตอมายนยนอาการทปรากฏวามสาเหตจากเชอ ChiVMV โดยการน าตวอยางใบพชทเพมปรมาณเชอมาตรวจสอบเชอไวรสดวยเทคนค Indirect ELISA

2. การโคลนยนโปรตนหอหมอนภาคและบรเวณ 3’UTR ของเชอ ChiVMV

2.1 การสกด RNA จากตนล าโพงทมเชอ ChiVMV การสกด RNA จากใบล าโพงไดดดแปลงวธการสกด RNA จากวธการของ Monthatip et al

(2009) บดใบล าโพงในโกรงทเตมไนโตรเจนเหลวจนละเอยด ใสในหลอดทดลองขนาด 1.5 มลลลตร ทเตม TLES buffer (100 mM Tris-HCl, 100 mM LiCl, 100 mM EDTA และ 1% SDS) ทผสม Na2SO3 ทความเขมขน 2 % 650 ไมโครลตรและ PCI (phenol: chloroform: isoamyl อตราสวน 25:24:1) 650 ไมโครลตร ผสมใหเขากนดวยเครอง vortex เปนเวลา 2 นาท ปนตกตะกอนทความเรว 12,000 รอบตอนาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 10 นาท ดดสวนใสชนบนปรมาตร 450 ไมโครลตร ใสหลอดทดลองขนาด 1.5 มลลลตรหลอดใหม ตกตะกอน อารเอนเอโดยเตม 4M LiCl ปรมาตร 450 ไมโครลตร ผสมใหเขากนแลวน าไปบมทอณหภม 4

10

องศาเซลเซยส เปนเวลา 16 ชวโมง ปนตกตะกอนทความเรว 12,000 รอบตอนาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 10 นาท เทสวนใสทง ลางตะกอนดวย RNase free water ปรมาตร 100 ไมโครลตร ผสมใหเขากน บมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท เตม Absolute ethanol ปรมาตร 250 ไมโครลตรและ 2.5 M CH3COONa, pH 6.0 ปรมาตร 10 ไมโครลตร ผสมใหเขากนน าไปบมทอณหภม -20 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท ปนตกตะกอนทความเรว 12,000 รอบตอนาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 10 นาท เทสวนใสทง ลางตะกอน อารเอนเอดวย 70 % ethanol ปนตกตะกอนทความเรว 12,000 รอบตอนาท ทอณหภม 4 องศา-เซลเซยส เปนเวลา 10 นาท เทสวนใสทง ตากตะกอนใหแหง จากนนละลายตะกอนดวย RNase free water ปรมาตร 30 ไมโครลตร เกบท -20 องศาเซลเซยส จากนนตรวจสอบอารเอนเอทสกดไดดวยเทคนค Agarose gel electrophoresis โดยใช agarose gel ความเขมขน 1 เปอรเซนต ใน 0.5x TBE buffer

2.2 การสงเคราะห RNA ของเชอ ChiVMV ดวยเทคนค RT-PCR (Reverse

Transcription-Polymerase Chain Reaction) ดวยชดส าเรจรป Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit # K1622

น าอารเอนเอทสกดได (ขอ 2.1) 2.5 ไมโครลตร เตมไพรเมอร Oligo (dT)18 1 ไมโครลตร เตม DEPC–treated water 8 ไมโครลตร ผสมสารลงในหลอด PCR และปนตกตะกอนเปนเวลา 3-5 วนาท บมท 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 5นาท เตม 5x reaction buffer 4 ไมโครลตร เตม Libo3 LockTM Ribonuclease inhibitor ความเขมขน 20 ยนตตอไมโครลตร 1 ไมโครลตร เตม dNTPs 10 มลลโมลาร 2 ไมโครลตร บ มท 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 5 นาท ใน water bath วางหลอด PCR บนน าแขงเปนเวลา 5 นาท เตม Revert AidTM MMuLV Reverse Transcriptase ความเขมขน 20 ยนตตอไมโครลตร 1 ไมโครลตร น าหลอด PCR ใส water bath ทอณหภม 42

องศาเซลเซยส เปนเวลา 60 นาท และหยดปฏกรยาทอณหภม 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 10 นาท ในเครอง thermal cycler (วารรตน, 2554)

2.3 การตรวจสอบ PCR product ดวยวธ Agarose gel electrophoresis น า DNA sample ทอยในหลอด PCR ปรมาตร 20 ไมโครลตร เตม 5x gel star ปรมาตร 4

ไมโครลตร น าไปแยกขนาดของ DNA ดวย Agarose gel ความเขมขน 1 เปอรเซนต ใน 0.5x TBE และม Middle range DNA marker ในการเปรยบเทยบขนาดของ DNA ใชความตางศกยท 100

11

โวลต เปนเวลา 30 นาท น าไปตรวจสอบแถบ DNA ดวยเครอง UV transiluminator จากนนตดแถบ DNA ทมขนาด 1200 คเบส ออกจากเจลเพอน า DNA ออกจากเจลตอไป (ชตมา, 2554)

2.4 การโคลนสวน 3’UTR ของเชอ ChiVMV ชงน าหนกหลอดทดลองขนาด 1.5 มลลลตร และ label น าหนกทไดไวขางหลอดทดลอง

ตดแถบ DNA ใน gel ตามขนาดทตองการใสลงในหลอดทดลอง (ขอ 2.3) โดยตดใหใกลเคยงกบแถบ DNA มากทสด ชงน าหนกหลอดทดลองทม gel อย เตม QE buffer 3 เทาของน าหนก gel บมท 50 องศาเซลเซยส เปนเวลา 10 นาท และน ามา vortex ทก ๆ 2-3 นาท เตม isoprpanol ลงในตวอยาง 1 เทาของน าหนก gel ยาย solution จากในหลอดทดลอง ลงใน QIA Quick column น าไปปนตกตะกอน 13,000 รอบตอนาท เปนเวลา 1 นาท ปนตกตะกอนครงละ 800 ไมโครลตร ทงสวนใสดานลางแลวน า column ประกอบเขากบ collection tube ดงเดม เตม QG buffer 500 ไมโครลตร ลงใน column ปนเหวยงท 3,000 รอบตอนาท เปนเวลา 1 นาท ทงสวนใส เตม PE buffer 750 ไมโครลตร เตมลงใน column ปนตกตะกอนท 13,000 รอบตอนาท เปนเวลา 1 นาท ทงสวนใสและปนตกตะกอนท 13,000 รอบตอนาท เปนเวลา 1 นาท ซ าอกครง ยาย column วางบน microcentrifuge tube หลอดใหม เตม EB buffer 30 ไมโครลตร วางหลอดทดลองไวทอณหภมหอง 1 นาท ปนตกตะกอนท 13,000 รอบตอนาท เปนเวลา 1 นาท และน า DNA ไปเกบท -20 องศาเซลเซยส

น าดเอนเอทเกบท -20 องศาเซลเซยส ปรมาตร 3 ไมโครลตร เตมน ากลนทผานการฆาเชอ

แลว 0.5 ไมโครลตร เตม 2x ligation buffer 5 ไมโครลตร เตม pGEM-T easy vector 0.5 ไมโครลตร และเตม T4 ligase 1 ไมโครลตร ผสมสารตางๆ เบาๆ น าหลอดทดลองไปบมทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 48 ชวโมง

ยายพลาสมดสายผสม (recombinant plasmid) เขาสเซลลแบคทเรยเจาบาน ดวยวธ

Heat shock โดยยายพลาสมดสายผสม 10 ไมโครลตร เขาสเซลลแบคทเรย E. coli สายพนธ DH5α (competent cell) 100 ไมโครลตร แชในน าแขงทนทเปนเวลา 30 นาท บมใน water bath อณหภม 42 องศาเซลเซยส เปนเวลา 90 วนาท แชในน าแขงเปนเวลา 5 นาท จากนนเตมอาหาร LB 800 ไมโครลตร น าเขาเครองเขยาทความเรว 200 รอบตอนาท อณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 ชวโมง น ามาปนเหวยงดวยแรง 5,000 g ดดอาหารสวนบนออกปรมาตร 600 ไมโครลตร

12

จากนนเตมอาหาร LB 400 ไมโครลตร ผสมใหเขากน น าเซลลทไดมา spread ลงบนอาหารแขง LB ทเตมแอมพซลนความเขมขน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร เตม 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-6-D-galactoside (X-gal) ความเขมขน 20 ไมโครกรมตอมลลลตร 40 ไมโครลตร และเตม isopropyl-6-D-thiogalactopyranoside (IPTG) ความเขมขน 20 ไมโครกรมตอมลลลตร 15 ไมโครลตร น าไปบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลานานขามคน เลอกโคโลนสขาวจากการตรวจสอบโคลนดวยวธ Blue-white screening (วารรตน, 2554)

ตรวจสอบชน insert ใน DNA plasmid ดวยเทคนค Bio-PCR โดยมองคประกอบตาง ๆ

ดงน dH2O 7 ไมโครลตร เตม 2x mastermix PCR reaction 10 ไมโครลตร เตม Primer CVMV 1037 pol. ความเขมขน 2 ไมโครโมลาร 1 ไมโครลตร เตม Primer oligo (dT)18 1 ไมโครลตร เตม cDNA 1 ไมโครลตร ท าปฏกรยาในเครอง thermal cycler โดยก าหนดอณหภมและระยะเวลาการท าปฏกรยาดงน ขนตอนท 1 อณหภม 94 องศาเซลเซยส เปนเวลา 5 นาท ขนตอนท 2 อณหภม 94 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 นาท ขนตอนท 3 อณหภม 58 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 นาท ขนตอนท 4 อณหภม 72 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2 นาท และขนตอนท 5 อณหภม 72 องศาเซลเซยส เปนเวลา 5 นาท เปนจ านวน 35 รอบ และตรวจสอบ PCR product ดวยเทคนค Agarose gel electroghoresis โดยใช agarose gel ความเขมขน 1 เปอรเซนต ใน 0.5x TBE buffer

เลอกสกดพลาสมดดเอนเอเฉพาะเซลลแบคทเรยทมพลาสมดดเอนเอสายผสม โดยใช

QIAprep Spin Miniprep Kit Protocal (QIAGEN, CA, USA) ละลายตะกอนเซลลแบคทเรยดวยบฟเฟอร P1 250 ไมโครลตร เตมบฟเฟอร P2 250 ไมโครลตร กลบหลอดไปมา 4-6 ครง เตมบฟเฟอร N3 350 ไมโครลตร กลบหลอดไปมาเบาๆ 4-6 ครง น ามาปนเหวยง 10,000 รอบตอนาท เปนเวลา10 นาท น าสวนใสใสใน QIA prep column น ามาปนเหวยง 10,000 รอบตอนาท เปนเวลา 1 นาท ทงสวนใสใน QIA prep column ลาง filter ของ QIA prep column ดวยบฟเฟอร PE 750 ไมโครลตร น ามาปนเหวยง 10,000 รอบตอนาท เปนเวลา 1 นาท เทสวนใสออกและน า QIA prep column มาปนเหวยง 10,000 รอบตอนาท เปนเวลา1 นาท น า QIA prep column วางบน microcentrifuge หลอดใหม เตมบฟเฟอร EB 30 ไมโครลตร น ามาปนเหวยง 10,000 รอบตอนาท เปนเวลา 1 นาท จากนนลางพลาสมดดเอนเอซ าอกครงดวยบฟเฟอร EB 20 ไมโครลตร ปนเหวยง 10,000 รอบตอนาท เปนเวลา 1 นาท เกบพลาสมดดเอนเอทไดใส microcentrifuge หลอดใหมท 4 องศาเซลเซยส (วารรตน, 2554)

13

3. การวเคราะหล าดบนวคลโอไทดของยน CP และบรเวณ 3’UTR ของเชอ ChiVMV และ ศกษาความสมพนธทางพนธกรรมกบเชอ ChiVMV ทมรายงานในฐานขอมล NCBI

น าพลาสมดทสกดไดจากเซลลแบคทเรย สงวเคราะหล าดบนวคลโอไทด โดยใชไพรเมอร T7 และไพรเมอร SP6 เปน sequencing primer น าล าดบนวคลโอไทลทวเคราะหไดมาตดสวนล าดบนวคลโอไทดของไพรเมอรออก จดเรยงและแกไขล าดบนวคลโอไทดดวยโปรแกรม VecScreen ผานทางเครอขายของอนเตอรเนต (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ VecScreen/ VecScreen.html) จากนนศกษาความสมพนธทางพนธกรรมของเชอ ChiVMV ไอโซเลท Ca1010 และ Ca1053 เทยบกบเชอ ChiVMV ในภมภาคเอเชยจ านวน 21 สายพนธ ทพบวามรายงานบนฐานขอมลของ NCBI ดวยโปรแกรม ClustalW2 โดยผานทางเครอขายของอนเตอรเนต (http://www.ebi.ac.uk/Tools/-clustalw2/index.html) และจดท า Phylogenetic tree ดวยโปรแกรม MEGA 5.0 ตารางท 2 แหลงทมาของล าดบนวคลโอไทดของเชอ ChiVMV บนฐานขอมล GenBank ทใชใน

การศกษาความสมพนธทางพนธกรรม

สายพนธเชอ ประเทศ GenBank

(stain) Accession number

CM1 ไทย DQ854953.1

PJ ไทย DQ854955.1 SRt8 ไทย DQ854958.1 BP ไทย DQ854954.1 K37 ไทย DQ854956.1

SKh5 ไทย DQ854959.1 CVbMV ไทย U72193.1 KPS9 ไทย EU636198.1 T97 ไทย DQ854952.1

DCV3 อนเดย DQ854965.1 BCV1 อนเดย DQ854962.1

China2 จน DQ854951.1

14

ตารางท 2 (ตอ)

สายพนธเชอ ประเทศ GenBank

(stain) Accession number

P3215 P3380 P3389 P3488 P3525 Tom1 Pep1

Ca1010 Ca1053

ไตหวน ไตหวน ไตหวน ไตหวน ไตหวน ไตหวน ไตหวน ไทย ไทย

DQ854945.1 DQ854943.1 DQ854944.1 DQ854947.1 DQ854948.1 EU719647.1 EU719646.1 DQ854953.1 DQ854952.1

15

ผลและวจารณการทดลอง

1.การแยกเชอ ChiVMV ใหบรสทธ

1.1 การตรวจสอบเชอ ChiVMV โดยเทคนค indirect ELISA ผลการตรวจสอบเชอ ChiVMV ในตวอยางพชทง 98 ตวอยาง ทมอาการดางประจากแหลงปลกพรกในเขตจงหวดเชยงใหมและจงหวดหนองคาย ดวยเทคนค indirect-ELISA ตรวจพบเชอ ChiVMV จ านวน 5 ตวอยาง และตรวจไมพบเชอ CMV และ TMV จากนนจงก าหนดชอไอโซเลท ของเชอดงตารางท 3 โดยเชอ ChiVMV ทแยกไดจากจงหวดเชยงใหมทง 4 ไอโซเลท ก าหนดชอดงน Ca1007, Ca1008, Ca1010 และ Ca1018 เลอกตวอยางท Ca1010 มาศกษาล าดบนวคลโอไทดของเชอตอไป สวนเชอ ChiVMV ทแยกจากจงหวดหนองคาย ตงชอไอโซเลทวา Ca1053 (ตารางท 3) ตารางท 3 คาการดดกลนคลนแสงท 405 นาโนเมตรของตวอยางพชทน ามาตรวจสอบเชอไวรส ดวยเทคนค indirect ELISA

ชอไอโซเลท คาการดดกลนคลนแสงท 405 นาโนเมตร CMV ChiVMV TMV

Ca1007 Ca1008 Ca1010 Ca1018 Ca1053

0.117 0.116 0.126 0.120 0.089

0.625 0.533 0.753 0.713 0.624

0.162 0.189 0.209 0.186 0.169

พชปกต 0.110 0.248 0.208 1.2 การแยกเชอ ChiVMV ใหบรสทธดวยพชอาศย จากนนจงแยกเชอ ChiVMV ดวยยาสบใบใหญ ( N. tabacum) สายพนธ White Burley

เกดแผลจดเฉพาะแหงคอนขางกลมขนาด 0.3-0.5 เซนตเมตร ภายหลงการปลกเชอ 5 วน (ภาพท 1 a) น าแผลจดแตละจดปลกเชอบนใบล าโพง (Datura metel) พบวาล าโพงแสดงอาการดางระหวางเสนใบ ใบลบเลกเสยรปหลงการปลกเชอได 3 สปดาห (ภาพท 1b) ซงลกษณะอาการทปรากฎ

16

สอดคลองกบรายงานของเครอพนธและคณะ (2536) และ Siriwong et al. (1995) จากนนจงน าเชอ ChiVMV ทแยกใหบรสทธมาเพมปรมาณเชอ ChiVMV ในล าโพง (ภาพท 2) และตรวจสอบเชอดงกลาวดวยเทคนค indirect ELISA ซ าอกครง ซงพบวาตรวจพบเชอ ChiVMV ในตวอยางพชทใชเพมปรมาณ

ภาพท 1 ลกษณะอาการของเชอ ChiVMV ในพชอาศย a) ยาสบใบใหญสายพนธ White Burley ทแสดงอาการใบจดภายหลงการปลกเชอ 1 สปดาห และ b) ล าโพง ทแสดงอาการใบดาง บดเบยวผดรปภายหลงการปลกเชอ 3 สปดาห ภาพท 2 ลกษณะอาการดางทเกดจากเชอ ChiVMV a) ทแยกจากจงหวดเชยงใหม (Ca1010)

และ b) ทแยกไดจากจงหวดหนองคาย (Ca1053) ในล าโพง

a b

a b

17

2.ศกษาล าดบนวคลโอไทดส วนยน CP และบรเวณ 3’UTR ของเชอ ChiVMV และวเคราะหความสมพนธทางพนธกรรม

จ าแนกเชอ ChiVMV โดยใชขอมลสวนของล าดบนวคลโอไทดของยน CP และบรเวณ

3’UTR เนองจากยนดงกลาวเปนยนทมความจ าเพาะเจาะจงตอเชอในจนสโพทไวรสแตละชนดหรอเรยกวาเปนบรเวณอนรกษ (conservsed region) จงมความเหมาะสมทจะน ามาใชในการจดกลมของโพทไวรส (Moury et al., 2005) ซงยน CP และบรเวณ 3’UTR ของเชอ ChiVMV ทแยกไดจากจงหวดเชยงใหมและหนองคาย มความยาว 1,200 นวคลโอไทด (ภาพท 3) เมอเปรยบเทยบขอมลล าดบนวคลโอไทดในบรเวณดงกลาวกบเชอ ChiVMV สายพนธ อนทมรายงานในทวปเอเชย (ตารางท 2) รวม 19 สายพนธ พบวา ChiVMV ทแยกไดจากจงหวดเชยงใหม (Ca1010) มล าดบ นวคลโอไทดคลายคลงกบเชอ ChiVMV สายพนธ K37, KPS9, SKh5, CM1, CVbMV, SRt8, BP และ KPS9 จากประเทศไทย ทระดบ 99.0 เปอรเซนต สวนเชอ ChiVMV ทแยกไดจากจงหวดหนองคาย (Ca1053) มล าดบนวคลโอไทดคลายคลงกบเชอ ChiVMV สายพนธ P3380, P3389, China2, P3215, P3488, P3525, T97 และ PJ ทระดบ 97.0 เปอรเซนต ซงจากการวเคราะหความสมพนธทางพนธกรรมและน ามาสรางแผนภาพเดนโดแกรมพบวาเช อ ChiVMV ไอโซเลท Ca1010 และไอโซเลท Ca1053 ทกลาวมาขางตนจดอยคนละกลมคอกลมท 2 และ 1 ตามล าดบ (ภาพท 4)

18

ภาพท 3 ผลการวเคราะหขนาดดเอนเอของยน CP และบรเวณ 3’UTR ของเชอ ChiVMV ทแยกได ดวยเทคนค Agarose gel electrophoresis 1.0 เปอรเซนต ภายหลงการเพมปรมาณ

ดวยเทคนค RT-PCR จากไพรเมอร ChiVMV 1037 pol. และ Oligo-dT M คอ Middle range DNA marker (Fermentas, Ontario, Canada) 1 คอ ดเอนเอของยนโปรตนหอหมอนภาคเชอ ChiVMV ไอโซเลท Ca1010

2 คอ ดเอนเอของยนโปรตนหอหมอนภาคเชอ ChiVMV ไอโซเลท Ca1053 3 คอ ตวอยางควบคมทปราศจากดเอนเอตนแบบ

5000 bp

2000 bp

850 bp

100 bp

400 bp

1,200 bp

M 1 2 3

19

ภาพท 4 การเปรยบเทยบล าดบนวคลโอไทดของยน CP และสวน 3’UTR ของเชอ

ChiVMV ทแยกไดจากจงหวดเชยงใหมและหนองคายกบเชอ ChiVMV สายพนธ อนๆ ทมรายงานในทวปเอเชยทง 19 สายพนธ ทมรายงานในฐานขอมลของ NCBI ดวยโปรแกรม MEGA 5

20

ภาพท 4 (ต อ) การเปรยบเทยบล าดบนวคลโอไทดของยน CP และสวน 3’UTR ของเชอ

ChiVMV ทแยกไดจากจงหวดเชยงใหมและหนองคายกบเชอ ChiVMV สายพนธ อนๆ ทมรายงานในทวปเอเชยทง 19 สายพนธ ทมรายงานใน ฐานขอมลของ NCBI ดวยโปรแกรม MEGA 5

21

Group 1

Group 3

Group 2

ภาพท 5 เปรยบเทยบความสมพนธทางพนธกรรมของเชอ ChiVMV ทแยกจากจงหวดเชยงใหม (Ca1010) และหนองคาย (C1053) ดวยล าดบนวคลโอไทดของยน CP และบรเวณ 3’UTR กบเชอ ChiVMV จากเอเชยทมรายงานใน GeneBank โดยใชโปรแกรม MEGA 5.0 ดวยวธ Neighbor Joining ตวเลขเหนอเสนแสดงคา Bootstrap จากการค านวณ 1,000 ครง

ChiVMV P3380

ChiVMV P3389

ChiVMV China2

ChiVMV P3215

ChiVMV P3488

ChiVMV P3525

Ca1053

ChiVMV T97

ChiVMV PJ

ChiVMV DCV3

ChiVMV BCV1

ChiVMV SRt8

ChiVMV KPS9

Ca1010

ChiVMV BP

ChiVMV CVbMV

ChiVMV CM1

ChiVMV K37

ChiVMV SKh5

PVMV Tom1

PVMV Pep1

(กาญจนบร) (สงขลา)

(เชยงใหม)

(สราษฎรธาน)

(ราชบร)

(นครปฐม)

(ประจวบครขนธ) (ตาก)

(หนองคาย)

(เชยงใหม)

22

สรปผลการทดลอง

จากการวเคราะหล าดบนวคลโอไทดของยน CP และบรเวณสวนของ 3’UTR เพอศกษาความสมพนธทางพนธกรรมของเชอ ChiVMV ไอโซเลท Ca1010 และ Ca1053 กบเชอ ChiVMV สายพนธอนทมรายงานในประเทศไทยจากฐานขอมล NCBI ทงหมด 19 สายพนธ ซงเชอ ChiVMV ทแยกไดจากจงหวดเชยงใหม (Ca1010) มล าดบนวคลโอไทดทความคลายคลงกบเชอ ChiVMV สายพนธ K37 (กาญจนบร), SKh5 (สงขลา), CM1 (เชยงใหม), CVbMV, SRt8 (สราษฎรธาน), BP (ราชบร) และ KPS9 (นครปฐม) จากประเทศไทย โดยมเปอรเซนตความเหมอนของล าดบนวคลโอ-ไทดทระดบ 99.0 เปอรเซนต สวนเชอ ChiVMV ทแยกไดจากจงหวดหนองคาย (Ca1053) มล าดบ นวคลโอไทดทความคลายคลงกบเชอ ChiVMV สายพนธ P3380, P3389, China2, P3215, P3488, P3525, T97 (ตาก) และ PJ (ประจวบครขนธ) โดยมเปอรเซนตความเหมอนของล าดบ นวคลโอไทด ทระดบ 97.0 เปอรเซนต และสามารถจดจ าแนกเชอ ChiVMV ไอโซเลท Ca1010 และไอโซเลท Ca1053 อยในกลมท 2 และในกลมท 1 ตามล าดบ

23

เอกสารอางอง

เครอพนธ กตตปกรณ, ไชยา โนดา, นวลจนทร ดมา และ สวรรณา กลดพนธ. 2536. การศกษา เกยวกบไวรสของพรกและการคดเลอกพนธพรกใหตานทานตอเชอไวรสบางชนด, น. 331- 340. ใน การประชมวชาการของมหาวทยาลยเกษตรศาสตร ครงท 31 มหาวทยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพฯ.

ชตมา อาลย. 2554. การวเคราะหล าดบนวคลโอไทด 3’Untranslated Regions (3’UTR)

ของเชอ Chili veinal mottle virus isolate KPS9. ปญหาพเศษปรญญาตร, มหาวทยาลยเกษตรศาสตร. ธระ สตะบตร. 2522. วสาวทยาของพช. ภาควชาโรคพช คณะเกษตร มหาวทยาลยเกษตร-

ศาสตร, นครปฐม. นรนาม. 2554. พรก. แหลงทมา : http://th.wikipedia.org/wiki/, 19 สงหาคม 2554. นรนาม. 2553. พรกและพรก. แหลงทมา: http://www.oknation.net/blog/print.php?id=546399, มกราคม 2553. นรนาม. 2553. โรคเสนใบด างประของพรก(Chili veinal mottle). แหลงทมา: http://www.thaiblogonline.com/global.blog?TopicOnDate=13/9/2553, 14 กนยายน 2553. นรนาม. 2551. อตสาหกรรมไทย อตสาหกรรมเครองเทศเครองปรงรส. ศนยอจฉรยะเพออตสาหกรรมอาหาร. แหลงทมา : http://fic.nfi.or.th/th/thaifood/product52-condiment.asp, 11 มกราคม 2551.

24

พสสวรรณ เจยมสมบต, นชนาถ แซอง, สพฒน อรรถธรรม, สจนต ภทรภวดล และ เพรชรตน ศร- วงศ. 2540. การจ าแนกชนดของโพทไวรสทแยกไดจากโรคเสนใบดางประของพรกโดยใช ขอมลทางอณชวโมเลกล. น. 237-245. ใน การประชมทางวชาการของ มหาวทยาลยเกษตรศาสตร ครงท 35. มหาวทยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพฯ. มณฉตร นกรพนธ. 2541. พรก. โอเดยนสโตร, กรงเทพฯ. วารรตน สมประทม. 2554. การพฒนาเทคนค Surface Plasmon Resonance (SPR)

Biosensor ส าหรบตรวจสอบเชอ Chilli veinal mottle virus (ChiVMV). วทยานพนธ ปรญญาโท, มหาวทยาลยเกษตรศาสตร. สจนต ภทรภวดล, วารรตน สมประทม, รชดาภรณ เขยวหวาน, กรง สตะธน และสรกล วะส. 2551. การคดเลอกพนธพรกตานทานตอโรคใบดางแตงและใบดางประของพรก. ว. วทย. กษ. 39: 376-379. สชลา เตชะวงศเสถยร. 2549. พรก: การผลต การจดการ และการปรบปรงพนธ. บรษท เพรสมเดย จ ากด, กรงเทพฯ. สพฒน อรรถธรรม. 2552. โรคพชทเกดจากเชอไวรส (Virus Diseases of Plants). บรษท เพชรรง การพมพ จ ากด, นนทบร. Adams, M.J., J.F. Antoniw and C.M. Fauquet. 2005. Molecular criteria for genus and species discrimination within the family Potyviridae. Arch. Virol. 150: 459-479. Clark, M.F. and A.N. Adams. 1997. Characteristics of microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay of the detection of plant viruses. J. Gen.

Virol. 34 : 475-483.

25

Ha, C., P. Revill, R.M. Harding, M. Vu and J.L. Dale. 2008. Identification and sequence analysis of potyviruses infecting crops in Vietnam. Arch. Virol. 153: 45-60. Monthatip, T., A. Bhunchoth, N. Warin, O. Chatchawankanghanich and P. Burns. 2009. Cloning and expression of Ethylene Response Sensor 1 (Den-ERS1) gene of Dendrobium ‘Pompadour’ flower during development and senescence. Agricultural Sci. J. 42 : 227-236. Moury, B., A. Palloix, C. Caranta, P. Gognalons, S. Souche, K.G. Selassie and G. Marchoux. 2005. Serological, molecular and pathotype diversity of Pepper veinal mottle virus and Chili veinal mottle virus. Phytopathol. 95: 227-232. Shah, H., T. Yasmin, M. Fahim, S. Hameed and M.I. Haque. 2008. Transmission and host range studies of Pakistani isolate of Chilli veinal mottle virus. Pak. J. Bot. 40: 2669-2681. Siriwong, P., K. Kittipakorn and M. Ikegami. 1995. Characterization of Chilli vein- banding mottle virus isolated from pepper in Thailand. Plant Pathol. 44: 718-727. Tsai, W.S., Y.C. Huang, D. Zhang, K. Reddy, S.H. Hidayat, W. Green, S.K. Srithongchai

and F.J. Jan, 2007. Plant Pathol. 57, 408-416.

26

ภาคผนวก

27

1. การเตรยมสารละลายบฟเฟอรส าหรบการปลกเชอ ChiVMV 1.1 สารละลาย A 0.2 M NaH2PO4 6.85 กรม ละลายในน าปรมาตร 500 มลลลตร 1.2 สารละลาย B 0.2 M Na2HPO4.12H2O 17.95 กรม ละลายในน าปรมาตร 500 มลลลตร เตรยม 0.1 M phosphate buffer pH 7.0 โดยน าสารละลาย 0.2 M monobasic sodium phosphate ปรมาตร 39.0 มลลลตร ผสมกบ 0.2 M dibasic sodium phosphate ปรมาตร 61.0 มลลลตร จากนนปรบปรมาตรดวยน าใหครบ 200 มลลลตร 2. การเตรยมสารละลายบฟเฟอรส าหรบสกด RNA 2.1 TLES ปรมาตร 30 มลลลตร 100 mMTris-HCI pH 8.0 3 มลลลตร 100 mM LiCl 0.75 มลลลตร 10 mM EDTA 3 มลลลตร 1% SDS 3 มลลลตร ปรบปรมาตรดวยน าใหครบ 30 มลลลตร 2.2 PCI ( phenol : chloroform : isoamyl ; 25 : 24 : 1 ) ปรมาตร 10 มลลลตร Phenol 5 มลลลตร Chloroform 4.8 มลลลตร Isoamyl 0.2 มลลลตร เตรยมสารละลายภายในตดดควน และเกบสารละลายในภาชนะทบแสงทอณหภม 4 องศาเซลเซยส 2.3 TLES ทเตม 2% Na2SO3 ปรมาตร 10 มลลลตร TLES 10 มลลลตร Na2SO3 0.2 กรม

28

ผสมใหสารละลายเปนเนอเดยวกน 2.4 70% Ethanol Absolute ethanol 70 มลลลตร ปรบปรมาตรดวยน าปราศจาก nuclease (nuclease free water) จนครบ 100 มลลลตร 2.5 2.5 M CH3COONa CH3COONa 20.5075 กรม ปรบปรมาตรดวยน าปราศจาก nuclease (nuclease free water) จนครบ 100 มลลลตร 3. การเตรยมสารละลายส าหรบตวรจสอบเชอ ChiVMV ดวยวธ indirect ELISA 3.1 Carbonate coating buffer pH 9.6 NaHCO3 2.93 กรม Na2CO3 1.59 กรม ละลายในน ากลน 800 มลลตร ปรบ pH ใหได 9.6 แลวปรบปรมาตรดวยน ากลนจนครบ 1,000 มลลลตร 3.2 Phosphate buffer saline ( PBS ) pH 7.4 NaCl 8.0 กรม Na2HPO4.12H2O 2.9 กรม KH2PO4 0.2 กรม KCl 0.2 กรม ปรบ pH ใหได 7.4 แลวปรบปรมาตรดวยน ากลนจนครบ 1,000 มลลลตร 3.3 Washing buffer ( PBST ) 1,000 มลลลตร PBS 1,000 มลลลตร Tween-20 0.5 มลลลตร

29

3.4 Substrate buffer pH 9.8 Diethanolamine 97 มลลลตร Sodium azide 0.2 กรม MgCl2.6H2O 0.1 กรม น ากลน 800 มลลลตร ปรบ pH ใหได 9.8 แลวปรบปรมาตรดวยน าจนครบ 1,000 มลลลตร เกบในภาชนะทบแสง ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส 4. การเตรยมอาหารเลยงเซลลแบคทเรย 4.1 อาหาร LB Tryptone 10 กรม Yeast extract 10 กรม NaCl 5 กรม ปรบปรมาตรดวยน าจนครบ 1,000 มลลลตร น าไปนงฆาเชอ เกบทอณหภม 4 องศาเซลเซยส 4.2 อาหาร SOB ( Rich medium ) Tryptone 20 กรม Yeast extract 5 กรม NaCl 0.5 กรม ปรบปรมาตรดวยน าจนครบ 1,000 มลลลตร น าไปนงฆาเชอ เกบทอณหภม 4 องศาเซลเซยส

30

5. ตวอย างใบพรกทแสดงอาการด างจากแหล งพนทต างๆ จ านวน 98 ตวอย าง

ล าดบ ไอโซเลท แหลงทเกบตวอยาง 1 Ca1001 จ.เชยงใหม 2 Ca1002 จ.เชยงใหม 3 Ca1003 จ.เชยงใหม 4 Ca1004 จ.เชยงใหม 5 Ca1005 จ.เชยงใหม 6 Ca1006 จ.เชยงใหม 7 Ca1007 จ.เชยงใหม 8 Ca1008 จ.เชยงใหม 9 Ca1009 จ.เชยงใหม 10 Ca1010 จ.เชยงใหม 11 Ca1011 จ.เชยงใหม 12 Ca1012 จ.เชยงใหม 13 Ca1013 จ.เชยงใหม 14 Ca1014 จ.เชยงใหม 15 Ca1015 จ.เชยงใหม 16 Ca1016 จ.เชยงใหม 17 Ca1017 จ.เชยงใหม 18 Ca1018 จ.เชยงใหม 19 Ca1019 จ.เชยงใหม 20 Ca1020 อ.ก าแพงแสน จ.นครปฐม 21 Ca1021 อ.ก าแพงแสน จ.นครปฐม 22 Ca1022 อ.ก าแพงแสน จ.นครปฐม 23 Ca1023 อ.ก าแพงแสน จ.นครปฐม 24 Ca1024 อ.ก าแพงแสน จ.นครปฐม 25 Ca1025 อ.ก าแพงแสน จ.นครปฐม 26 Ca1026 อ.ก าแพงแสน จ.นครปฐม 27 Ca1027 อ.ก าแพงแสน จ.นครปฐม

31

ล าดบ ไอโซเลท แหลงทเกบตวอยาง 28 Ca1028 อ.ก าแพงแสน จ.นครปฐม 29 Ca1029 อ.ก าแพงแสน จ.นครปฐม 30 Ca1030 อ.ก าแพงแสน จ.นครปฐม 31 Ca1031 อ.ก าแพงแสน จ.นครปฐม 32 Ca1032 อ.ก าแพงแสน จ.นครปฐม 33 Ca1033 อ.ก าแพงแสน จ.นครปฐม 34 Ca1034 อ.ก าแพงแสน จ.นครปฐม 35 Ca1035 อ.ก าแพงแสน จ.นครปฐม 36 Ca1036 อ.ก าแพงแสน จ.นครปฐม 37 Ca1037 อ.ก าแพงแสน จ.นครปฐม 38 Ca1038 อ.ก าแพงแสน จ.นครปฐม 39 Ca1039 อ.ก าแพงแสน จ.นครปฐม 40 Ca1040 อ.ก าแพงแสน จ.นครปฐม 41 Ca1041 อ.ก าแพงแสน จ.นครปฐม 42 Ca1042 อ.ก าแพงแสน จ.นครปฐม 43 Ca1043 อ.ก าแพงแสน จ.นครปฐม 44 Ca1044 จ.หนองคาย 45 Ca1045 จ.หนองคาย 46 Ca1046 จ.หนองคาย 47 Ca1047 จ.หนองคาย 48 Ca1048 จ.หนองคาย 49 Ca1049 จ.หนองคาย 50 Ca1050 จ.หนองคาย 51 Ca1051 จ.หนองคาย 52 Ca1052 จ.หนองคาย 53 Ca1053 จ.หนองคาย 54 Ca1054 จ.หนองคาย

32

ล าดบ ไอโซเลท แหลงทเกบตวอยาง 55 56

Ca1055 Ca1056

จ.หนองคาย จ.หนองคาย

57 Ca1057 จ.หนองคาย 58 Ca1058 จ.หนองคาย 59 Ca1059 จ.หนองคาย 60 Ca1060 จ.หนองคาย 61 Ca1061 จ.หนองคาย 62 Ca1062 จ.หนองคาย 63 Ca1063 จ.หนองคาย 64 Ca1064 จ.ขอนแกน 65 Ca1065 จ.ขอนแกน 66 Ca1066 จ.ขอนแกน 67 Ca1067 จ.ขอนแกน 68 Ca1068 จ.ขอนแกน 69 Ca1069 จ.ขอนแกน 70 Ca1070 จ.ขอนแกน 71 Ca1071 จ.ขอนแกน 72 Ca1072 จ.ขอนแกน 73 Ca1073 จ.ขอนแกน 74 Ca1074 จ.ขอนแกน 75 Ca1075 จ.ขอนแกน 76 Ca1076 จ.ขอนแกน 77 Ca1077 จ.ขอนแกน 78 Ca1078 จ.ขอนแกน 79 Ca1079 จ.ขอนแกน 80 Ca1080 จ.ขอนแกน 81 Ca1081 จ.ขอนแกน

33

ล าดบ ไอโซเลท แหลงทเกบตวอยาง 82 83 84

Ca1082 Ca1083 Ca1084

จ.ขอนแกน จ.ขอนแกน จ.ขอนแกน

85 Ca1085 จ.ขอนแกน 86 Ca1086 จ.ขอนแกน 87 Ca1087 จ.ขอนแกน 88 Ca1088 จ.ขอนแกน 89 Ca1089 จ.ขอนแกน 90 Ca1090 จ.ขอนแกน 91 Ca1091 จ.ขอนแกน 92 Ca1092 จ.ขอนแกน 93 Ca1093 จ.ขอนแกน 94 Ca1094 จ.ขอนแกน 95 Ca1095 จ.ขอนแกน 96 Ca1096 จ.ขอนแกน 97 Ca1097 จ.ขอนแกน 98 Ca1098 จ.ขอนแกน