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Se realizó la cuantificación simultánea de catequinas y metilxantinas por HPLC.El contenido de bioactivos cacao difería notablemente entre las plantaciones de cacao de la muestra.El análisis multivariado mostró dos grupos principales en función de las zonas de cultivo del cacao.
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Food Research InternationalDisponible en línea 25 de junio 2013
En prensa, corregido Prueba - Nota para los usuarios
Comparación de los polifenoles, metilxantinas y la actividad antioxidante en Theobroma cacao frijol de diferentes zonas de cultivo del cacao en Colombia
Luis C. Carrillo ,
Julián Londoño Londoño ,
Andrés Gil ,
Grupo de Investigación en Sustancias bioactivas, Sede de Investigación Universitaria de la Universidad
de Antioquia, Carrera 53 # 61-30 Lab 229, AA 1226 Medellín, Colombia
http://dx.doi.org/10.1016/j.foodres.2013.06.019 , Cómo citar o enlazar Usando DOI
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Reflejos
•
Se realizó la cuantificación simultánea de catequinas y metilxantinas por HPLC.
•
El contenido de bioactivos cacao difería notablemente entre las plantaciones de
cacao de la muestra.
•
El análisis multivariado mostró dos grupos principales en función de las zonas
de cultivo del cacao.
Abstracto
Los objetivos del presente trabajo fueron estudiar la influencia de las áreas
geográficas en los contenidos de polifenoles y metilxantinas y la actividad
antioxidante en los granos de cacao de diferentes zonas productoras de cacao de
Colombia, y evaluar la posibilidad de establecer una clasificación basada en las
áreas geográficas de las regiones de cultivo del cacao. Se analizaron dieciocho
plantaciones de cacao ubicadas en once zonas de cultivo del cacao. El análisis
estadístico mostró diferencias significativas (p <0,05) en el contenido de
polifenoles totales (TPC), flavan-3-ol, epicatequina, catequina, el contenido de
cafeína y teobromina, así como la relación teobromina / cafeína y la capacidad
antioxidante entre algunos de los diferentes granjas muestreadas, que muestran
un efecto significativo de la región productora de cacao en estos parámetros. En
general, una relación proporcional se ha propuesto que existe entre el contenido
de polifenoles con los cambios en la altitud de los cultivos de plantas, a pesar de
esto, nuestros resultados sugieren que cuanto menor sea la altitud, los más
polifenoles, flavan-3-oles y epicatequina se producen por el cacao planta. Los
resultados del análisis de componentes principales (PCA) indican que el contenido
de cafeína y la relación teobromina / cafeína podría servir como parámetros para
establecer una clasificación de granos de cacao de acuerdo a la zona geográfica
de las regiones de cultivo del cacao.
Palabras clave
Análisis de componentes principales ;
Las zonas de cría ;
Los polifenoles ;
Las metilxantinas ;
La actividad antioxidante
1. Introducción
Nuevas tendencias en el mercado de alimentos muestran un aumento constante
en el consumo de productos de cacao, ya que tienen una gran aceptación por los
consumidores, y también presentan múltiples beneficios para la salud debido a la
presencia de polifenoles, que poseen una alta capacidad antioxidante (Belscak,
Komes, Horzic, Ganic, y Karlovic, 2009 ).
Tres grupos principales polifenoles se pueden distinguir en el cacao: catequinas,
antocianinas y procianidinas, cuya característica común es una estructura de tipo
flavonoide ( Wollgast y Anklam, 2000 ).Estos compuestos generalmente han
recibido una especial atención debido a sus funciones fisiológicas, que incluyen la
modulación de la síntesis de eicosanoides, aumento en la síntesis de óxido nítrico,
la inhibición de la oxidación de las lipoproteínas de baja densidad (LDL), la
inhibición de la activación de las plaquetas, estimulación de la producción de
citoquina anti-inflamatoria, y la inhibición de la producción de citoquinas pro-
inflamatorias ( Niemenak et al., 2006 y Othman et al., 2007 ). Además, algunos
estudios epidemiológicos han establecido una correlación inversa entre la ingesta
de flavonoides y la aparición de enfermedades crónicas, tales como
enfermedades cardiovasculares y cerebrovasculares, cáncer y otros trastornos,
tales como la diabetes y la artritis reumatoide ( Othman et al., 2007 y Wollgast y
Anklam, 2000 ).Aunque la mayoría de los estudios indican que los beneficios para
la salud de cacao o cacao en subproductos son atribuibles a los polifenoles, debe
tenerse en cuenta que estos no son sólo es rico en polifenoles, pero son también
ricos en metilxantinas, que representan aproximadamente el 3,2% de desgrasada
composición de chocolate sin azúcar ( Belscak et al., 2009 ). Los principales
metilxantinas de cacao son teobromina (3,7% sobre una base libre de grasa) y
cafeína (aproximadamente 0,2%) y se han asociado con algunos efectos
fisiológicos en diversos sistemas del cuerpo, incluyendo el sistema nervioso
central, gastrointestinal, respiratorio, renal y sistemas ( Li et al., 2012 ). Sin
embargo, las posibles interacciones sinérgicas entre los flavonoides y
metilxantinas en los productos de cacao sobre los beneficios de salud siguen
siendo poco claras y la demanda de nuevos estudios. Sin embargo, es evidente
que los compuestos de polifenol y metilxantina son responsables para el sabor
astringente y amargo y afectan a la estabilidad y digestibilidad de cacao
( Brunetto et al., 2007 y Li et al., 2012 ).
El cacao es uno de los cultivos de alto interés económico en varios países, como
Costa de Marfil, Ghana, Camerún, Indonesia, Colombia, Venezuela y Ecuador. Es
nativa del Nuevo Mundo, con probable origen situada en la cuenca alta del río
Amazonas ( Cuatrecasas, 1964 y Motamayor et al., 2002 ). En los últimos años,
se ha creado confusión en la clasificación taxonómica de cacao comercial, debido
a su variabilidad genética relacionada con las características fenotípicas tales
como el color, la forma y dimensión de las diversas partes de la flor, fruto y
semilla. Sin embargo, se acepta que la mayor parte del cacao comercial
pertenece a una sola especie ( Theobroma cacao L.), que incluye tres complejos
genéticos: Criollo, Forastero / Amazónico, y Trinitario ( Cuatrecasas,
1964 , Motamayor et al, 2002. , y N 'Goran et al., 1994 ).
En la actualidad, el cultivo de cacao en Colombia tiene una alta variabilidad
genética debido a la siembra de los ecotipos procedentes de cruces entre
Forastero / Amazónico y Trinitario clones. Por otra parte, las condiciones
ecológicas varían mucho en Colombia y en las regiones de cultivo del cacao están
muy dispersos a través de su territorio. Además, la gran variedad de microclimas
en todo el país, conduce a la producción de cacao con alta variabilidad en su
composición química. Estos fenómenos se han observado en otros productos
alimenticios tales como aceite de oliva, la miel, y los aceites esenciales de pino
(Baltrusaityte et al., 2007 , Semiz et al., 2007 y Temime et al., 2006 ), en el que
la composición química es influenciada por los cambios en las condiciones de
cultivo ambientales (climáticas y edafológicas). Esto significa que tanto el área de
producción y las variaciones genotípicas son en gran parte responsables de las
características de calidad de los productos alimenticios finales, entregados al
consumidor ( Criado, Morello, Motilva, y Romero, 2004 ), incluyendo el cacao
subproductos. Las últimas características proporcionan Colombia con la capacidad
de producir diferentes ecotipos de cacao con diferente bioactivo y perfiles de
sabor. Sin embargo, hasta la fecha, las condiciones edafoclimáticas ideales para
la producción de granos de cacao de alta calidad, en términos de composición
química y propiedades organolépticas son desconocidos.El establecimiento de
estas condiciones podría contribuir a fortalecer el concepto de "Denominación de
Origen" en los subproductos del cacao.
Por lo tanto, los objetivos de la corriente de trabajo fueron estudiar la influencia
de las zonas geográficas sobre el comportamiento de los contenido de polifenoles
y metilxantina, así como la actividad antioxidante en los granos de cacao de
diferentes áreas de cultivo de cacao, y para evaluar la posibilidad de establecer
una clasificación de acuerdo a la zona geográfica de las regiones de cultivo del
cacao, tratando así de contribuir a una trazabilidad del cacao colombiano.
2. Materiales y métodos
2.1. Productos químicos y reactivos
Todos los disolventes fueron de grado analítico o HPLC y suministrados por Merck
KGaA (Darmstadt, Alemania). El agua desionizada se obtuvo con un sistema de
purificación de agua Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.). Compuestos
estándar, tales como (+)-catequina, (-)-epicatequina, y teobromina fueron
adquiridos de ChromaDex (Irvine, California, EE.UU.); cafeína, ácido gálico y
Trolox (6-hidroxi-2, 5,7,8-tetramethylchromane ácido-2-carboxílico) se obtuvieron
de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.), así como otros reactivos, tales como
fluoresceína, DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidracilo), AAPH (2,2 ' -azobis (2-
metilpropionamidina) dihidrocloruro) y el reactivo de Folin-Ciocalteu. La vainillina
y ácido sulfúrico también se compraron de Merck KGaA (Darmstadt, Alemania).
2.2. Muestras
Para este estudio, se utilizaron granos de cacao secados al sol disponibles
comercialmente. El muestreo aleatorio en dieciocho explotaciones (muestras) con
las prácticas agrícolas similares se llevó a cabo. Las fincas están situadas en once
áreas de cacao crecen dispersos en tres de las principales regiones productoras
de cacao en toda Colombia ( Tabla 1 y . Fig. 1 ). Se eligieron estas zonas
geográficas ("Andina" (a), "Orinoco" (b) y "Pacífico" (c) región) porque presentan
claras diferencias en sus condiciones edafológicas y climáticas, de acuerdo con el
Sistema de Zonas de Vida de Holdridge (un mundial sistema bioclimático para la
clasificación de las áreas de tierra) estas zonas se pueden clasificar como bosque
húmedo tropical, bosque húmedo tropical y bosque húmedo tropical,
respectivamente ( Lugo, Brown, Dodson, Smith y Shugart, 1999 ). Sólo los granos
sanos de la misma etapa de procesamiento de secado al sol, sin ningún tipo de
infección o daño físico, fueron procesados. Durante el muestreo, se lavaron las
habas, se molió en un molino de cuchilla giratoria y el polvo obtenido finalmente
fue almacenado a - 20 ° C hasta la preparación de muestras. En este estudio,
cada muestra se llevó a cabo por triplicado utilizando los procedimientos
mencionados a continuación, y cada valor se presenta en los Resultados y
discusiónsección es la media de seis a nueve de datos ± desviación estándar
(SD).
Tabla 1. productor de cacao, la ubicación geográfica y las condiciones climáticas regionales de
diferentes regiones de cultivo del cacao.
Código de Cultivares Zona
Latitud Longitud Altitud (msnm) una Temperatura media (° C)
aL_1 un 6 ° 13 '26 "N 073 ° 48 '46 "W 968 20
aL_2 un 6 ° 13 '26 "N 073 ° 48 '46 "W 968 20
aL_3 un 6 ° 13 '26 "N 073 ° 48 '46 "W 968 20
ceniza un 6 ° 20 '0 "N 73 ° 36 '0 "W 1426 20
AVC un 05 ° 19 '0 "N 74 ° 54 '0 "W 750 26
ACA un 5 ° 21 '0 "N 74 ° 30 '0 "W 1271 23
AGT un 4 ° 18 '0 "N 74 ° 48 '0 "W 289 33
bS_1 b 6 ° 53 '0 "N 71 ° 54 '0 "W 800 25.6
bS_2 b 6 ° 53 '0 "N 71 ° 54 '0 "W 800 25.6
bAR b 7 ° 1 '0 "N 71 ° 25 '0 "W 165 29
bTA_1 b 6 ° 27 '0 "N 71 ° 44 '0 "W 340 28
bTA_2 b 6 ° 27 '0 "N 71 ° 44 '0 "W 340 28
BVM b 4 ° 9 '0 "N 73 ° 38 '0 "W 410 27
bGM_1 b 3 ° 33 '0 "N 73 ° 42 '0 "W 410 25
bGM_2 b 3 ° 33 '0 "N 73 ° 42 '0 "W 410 25
cCT_1 c 1 ° 48 '0 "N 78 ° 45 '0 "W 2 29
cCT_2 c 1 ° 48 '0 "N 78 ° 45 '0 "W 2 29
cCT_3 c 1 ° 48 '0 "N 78 ° 45 '0 "W 2 29
un
Metros sobre el nivel del mar.
Opciones de tabla
. Figura 1. mapa de las zonas de muestreo "a", "b" y "c" para los granos de cacao.
Opciones Figura
2.3. Preparación de la muestra
Las muestras de cacao en polvo se extrajeron como sigue. La muestra seca y
molida se pesó (100 mg), se desgrasa mediante la adición de 2 ml de hexano y se
centrifugó a 1565 g durante 10 min, se decantó y otro 2 ml de hexano se añadió
repitiendo el procedimiento tres veces. El polvo de cacao sin grasa reducida se
extrajo a temperatura ambiente con 1,5 ml de 2-propanol acuoso (60%, pH 9,0)
durante 60 min en un baño de ultrasonidos. Después de la extracción, la mezcla
se centrifugó durante 10 min a 391 g a 4 ° C. El sobrenadante se decanta y se
filtra a través de una membrana de nylon (0,45 micras). Por último, el
sobrenadante se colocó en un matraz y se llena hasta obtener 2 ml de extracto, y
se almacena en la oscuridad a - 20 ° C hasta su uso.
2.4. Determinación del contenido total de polifenoles
El contenido de polifenoles totales (TPC) de extractos de cacao se determinó
espectrofotométricamente de acuerdo con un método modificado propuesto
por Londoño, Montoya, Guerrero, Aristizabal y Arango (2006) .Brevemente, 30 l
de extracto previamente preparado, 15 reactivo de Folin-Ciocalteu l, 225 l de
agua destilada y 30 l de 20% de Na 2 CO 3 se mezclaron. Después de 1 h se midió
la absorbancia del color azul a 760 nm frente a un blanco de muestra. Se produjo
una curva de calibración con ácido gálico como estándar.El TPC se expresa como
miligramos equivalentes de ácido gálico (GAE mg) por gramo de material de
muestra seca (mg GAE / g de muestra seca). Todas las mediciones se realizaron
por triplicado.
2.5. Contenido Flavan-3-ol por vainillina ensayo
Cacao extractos se analizaron para determinar su contenido de flavan-3-ol
usando un método descrito porBelscak et al. (2009) , con algunas
modificaciones. Extractos previamente preparadas (200 l) se llenaron hasta 1 mL
con metanol. El volumen total del medio de reacción se fijó en 1 ml, que
comprende 166,7 l de muestra (extracto de cacao) o estándar, 416,7 l de solución
de trabajo vainillina 1% (preparado a diario en metanol) y 416,7 l de H 2 SO 4 9,0 N
en metanol. La mezcla se dejó reaccionar durante 5 min, en un baño de hielo,
después de lo cual se tomaron lecturas de absorbancia a 500 nm. Se prepararon
dos espacios en blanco: 1) sustitución de la muestra por más 1% de vainillina, y
2) la sustitución de la solución de vainillina mediante metanol. Absorbancia de los
espacios en blanco se sustrajo de la absorbancia del extracto correspondiente y la
muestra que contiene vainillina. Una curva de calibración con catequina como se
produjo estándar. El contenido de flavan-3-oles se expresa como equivalentes de
catequina miligramos por gramo de muestra seca (mg EC / g de muestra
seca). Todas las mediciones se realizaron por triplicado.
2.6. El análisis por HPLC de catequinas y metilxantinas
Los análisis de HPLC se llevaron a cabo usando un sistema Agilent Serie 1200 de
resolución rápida Cromatografía Líquida (Agilent Technologies, Palo Alto, CA,
EE.UU.), equipada con un desgasificador de vacío, un muestreador automático,
una bomba cuaternaria y un detector de red de diodos (DAD). Las muestras se
centrifugaron durante 15 min a 10581 g y 4 ° C y luego se filtró a través de un
filtro de 0,45 micras (membranas de nylon, Supelco, Bellefonte, EE.UU.) antes del
análisis por HPLC.
Para separar los compuestos, la velocidad de flujo usado varió entre 0,75 y 1,0 ml
/ min y el análisis se llevó a cabo a 30 ° C. Una columna Supelco Ascentis ® C18
(25 cm x 4,6 mm, con un tamaño de partícula 5 micras) se utilizó para la
separación cromatográfica. La fase móvil utilizada fue agua con ácido acético al
0,1% como eluyente A y metanol como eluyente B. El método óptimo
cromatográfico consistió en el siguiente gradiente lineal: 0 min, 6% de A; 7 min,
25% de A; después isocráticamente hasta 30 min , y finalmente un ciclo de
acondicionamiento de 3 min con las condiciones iniciales para el siguiente
análisis. El volumen de inyección en el sistema de HPLC fue de 10 mL. Los
compuestos separados se monitorizaron con DAD ajustado a 280 nm y los
espectros de pico se registraron entre 200 y 400 nm. Las catequinas (catequina y
epicatequina) y metilxantinas (teobromina y la cafeína) se identificaron
comparando los tiempos de retención y los datos espectrales a las de los
estándares. Todos los análisis se repitieron tres veces.
2.7. Determinación de la capacidad antioxidante por ORAC
El ensayo de Capacidad de Absorción de Radicales de Oxígeno (ORAC) se llevó a
cabo de acuerdo con un procedimiento descrito por Ou, Hampsch-Woodill, y Prior
(2001) , ligeramente modificado. Para la evaluación de ORAC, se prepararon
todos los reactivos en 10 mM de tampón de fosfato (pH 7,4), así como los
extractos de cacao originales que fueron diluidas según sea apropiado. De
muestra (25 l) y fluoresceína (150 l; 1 mM, concentración final) soluciones se
colocaron en el pocillo de la microplaca. La mezcla se preincubó durante 30 min a
37 ° C. Solución AAPH (25 l, 250 mM, concentración final) se añadió rápidamente
usando una pipeta multicanal. La microplaca se colocó inmediatamente en el
lector y la fluorescencia registró cada 2 min durante 120 min a longitudes de
onda de excitación y emisión de 485 y 520 nm, respectivamente. La microplaca
se agitó automáticamente antes de cada lectura. Un espacio en blanco
(fluoresceína + AAPH) usando tampón de fosfato en lugar de la solución de
muestra y cinco soluciones de calibración utilizando Trolox (0-200 mM,
concentración final) como antioxidante también se llevaron a cabo en cada
ensayo. Las ecuaciones de regresión entre el área bajo la curva de decaimiento
de la fluorescencia (AUC) y la concentración de antioxidante se calcularon para
todas las soluciones estándar de Trolox. Todas las mezclas de reacción se
prepararon por duplicado, y se realizaron al menos tres ensayos independientes
para cada muestra. Los valores finales de ORAC se expresan como equivalentes
de Trolox utilizando la curva de Trolox estándar calculada para cada ensayo
(mmol Trolox de equivalent/100 g de muestra seca de cacao).
2.8. El análisis estadístico y la aplicación quimiométrico
Todas las pruebas se realizaron por triplicado. Los datos se presentan como
medios ± SD. La significación estadística de las diferencias entre grupos se
evaluó mediante ANOVA de una vía utilizando el GraphPad Prism versión 5.0 para
Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, EE.UU.). Se evaluaron las
diferencias entre las medias utilizando el Newman-Keuls comparación post-test
múltiple y el significado se identificó a nivel de 5%.
Las variables que se tienen en cuenta durante el desarrollo de este estudio se
sometieron a análisis multivariante (análisis de componentes principales (PCA))
realiza utilizando Statgraphics Centurion XVI Software (versión 16.0.07 para
Windows, StatPoint Technologies, Inc). PCA se aplicó para separar las muestras (n
= 18) de acuerdo con sus valores de contenido de polifenoles totales (TPC),
flavan-3-oles (FLV), epicatequina (EPI), catequina (CAT), la cafeína (CAF) y la
teobromina ( TEO) contenidos, valores ORAC, así como la relación teobromina /
cafeína (TE / CA) y las condiciones agroclimáticas de temperatura (TEMP) y la
altitud (ALT) de los cultivos. En el PCA, el conjunto de datos consistió en una
matriz de 18 × 10, donde los resultados obtenidos para cada parámetro se
adoptaron como columnas y las granjas de cacao (muestras) fueron utilizados
como las filas. Los análisis se basan en correlaciones y las variaciones se calculan
como SS / (n - 1). Los valores propios mayores que 1,0 se adoptaron para explicar
la proyección de los ensayos en el factor de plano. Todos los datos se
autoescalados antes del análisis, lo que significa que cada matriz de datos de la
columna fue de media-centrado y a escala en la unidad de varianza y evitar el
efecto de diferentes escalas de las variables ( Cruz et al., 2013 ).
3. Resultados y discusión
3.1. Contenido de polifenoles totales (TPC) y flavan-3-ol contenido de
extractos de cacao
La preparación de la muestra fue diseñado para obtener una fracción enriquecida
en compuestos de polifenol y metilxantinas, de acuerdo con Niemenak et
al. (2006) . Estos autores establecen que el uso de acetona-agua al 60:40 v / v
como disolvente hace que sea posible para obtener la máxima recuperación de
los polifenoles y xantinas presentes en los granos de cacao. A continuación,
Nuestra etapa de extracción fue optimizado con el fin de ser exhaustiva y
recuperar simultáneamente las dos clases de metabolitos. Algunos cambios tales
como el tipo de disolvente, el pH del medio, la cantidad de muestra, así como la
duración del procedimiento de extracción y el uso de la extracción asistida por
ultrasonidos, nos permitieron alcanzar las más altas concentraciones de
polifenoles y xantinas presentes en extractos de granos de cacao y cacao en
productos secundarios (datos no presentados).
La Tabla 2 presenta el contenido de polvo de cacao desgrasado determinado en
los extractos de 2-propanol acuosas de dieciocho plantaciones de cacao
analizadas TPC y flavan-3-ol. El TPC de extractos varió de 44,940 ± 1,174 a
70,090 ± 1,988 mg GAE / g, mientras que el contenido flavan-3-ol de los mismos
extractos de cacao varió de 2,496 ± 0,388 a 11,240 ± 0,825 mg EC / g. El
contenido de TPC y flavan-3-ol en las diferentes fincas de cacao disminuyó en el
orden: aL_1> Bar> cCT_1> cCT_2> AVC> bS_2> cCT_3> bGM_2> AGT> aL_3>
Ceniza> aL_2> bTA_2> bS_1> BVM> bGM_1 > Aca> bTA_1 y barra> aL_1>
cCT_2> cCT_1> bTA_2> bS_1> bS_2> AGT> cCT_3> bGM_2> AVC> aL_3>
Ceniza> BVM> aL_2> bGM_1> bTA_1> ACA para el contenido de TPC y flavan-3-
ol, respectivamente ( Tabla 2 ), que muestra que ambas variables están
altamente correlacionados (r de Pearson = 0,897). Además, los análisis
estadísticos mostraron una diferencia significativa (p <0,05) en el TPC y flavan-3-
ol contenido entre algunas de las granjas muestreadas. Estos resultados son
consistentes con los reportados por Othman et al. (2007) , quien encontró un
efecto significativo de la región productoras de cacao en el contenido de los
compuestos de polifenol que fue altamente correlacionado con su actividad
antioxidante. Otro estudio examinó los diferentes contenidos de polifenoles en el
cacao de Costa de Marfil, Guinea Ecuatorial, Venezuela, Perú, República
Dominicana, Ecuador y Colombia ( Tomás-Barberán et al., 2007 ). Estos autores
encontraron que el cacao colombiano fue el tercero más rico de TPC (81,4 mg
GAE / g) entre los países estudiados. Este valor es superior a los obtenidos en
nuestro estudio, pero se sabe que el TPC varía en función de la variedad de los
granos de cacao, el grado de madurez (época de cosecha) y, más importante aún,
las condiciones de su origen geográfico y post-cosecha, como fermentación,
secado, tostado, procesamiento y almacenamiento ( Wollgast y Anklam, 2000 ),
que contribuyen a las principales discrepancias entre los resultados.
Tabla 2. Capacidad antioxidante y el contenido de compuestos de metilxantina y polifenoles
en los granos de cacao de diferentes cultivares.
Código de Cultivares
TPC (mg GAE / g)
Flavan-3-oles (CE mg / g)
La epicatequina (mg / g)
Catequina (mg / g)
ORAC valores deun
Cafeína (mg / g)
Teobromina (mg / g)
aL_1 70.090 ± 1.988 a
11,240 ± 0,825a
3,562 ± 0,016a 1,297 ± 0,031 a
61812 ± 5042 ab
1,330 ± 0,028 gh
8.863 ± 0.119 cd
aL_2 52.880 ± 2.062 def
3.842 ± 0.739 cd
2.284 ± 0.112cde
0.377 ± 0.033 cd
40390 ± 3784 b
1.230 ± 0.021 hij
8.581 ± 0.138 de
aL_3 53.410 ± 3.679 de
5,245 ± 0,520bcd
2.019 ± 0.064de 0,245 ± 0,008 d
42020 ± 6553 b
1.096 ± 0.038 jkl
8.777 ± 0.142 cd
ceniza 53.170 ± 0.165 de
4,405 ± 0,714 cd
1.970 ± 0.071de 0,346 ± 0,013 d
51940 ± 7472 ab
1.184 ± 0.040 ij
8,306 ± 0,119 def
AVC 56.540 ± 1.507 cde
5.456 ± 0.346bcd
2.516 ± 0.156bcd
0,286 ± 0,016 d
54027 ± 5753 ab
1.073 ± 0.009 jkl
8,242 ± 0,057 def
ACA 45.320 ± 1.152 efg
2.496 ± 0.388 cd
1,405 ± 0,080 f 0,323 ± 0,012 d
50029 ± 6453 ab
1,879 ± 0,028 a
9.076 ± 0.049 bcd
AGT 53.780 ± 1.434 de
6.781 ± 0.506aC
2.395 ± 0.057cd 0.370 ± 0.010 cd
50002 ± 6868 ab
1,435 ± 0,021 ef
8.639 ± 0.094 cde
bS_1 52.690 ± 3.325 def
7.407 ± 0.945aC
2.342 ± 0.126cde
0.431 ± 0.023 cd
52718 ± 3508 ab
1.014 ± 0.075 kl
7,062 ± 0,123 g
bS_2 56.340 ± 3.399 cde
6.856 ± 0.833aC
2.414 ± 0.130cd 0.487 ± 0.044 bcd
54020 ± 6116 ab
0,724 ± 0,025 m
8,024 ± 0,177 ef
bAR 65.050 ± 1.314 abc
11.290 ± 0.451a
3,787 ± 0,070a 0.493 ± 0.031 aC
63951 ± 7384 ab
1.148 ± 0.016 IJK
9,679 ± 0,273 ab
bTA_1 44.940 ± 1.174 fg
3.763 ± 0.411 cd
1,497 ± 0,015 f 0.226 ± 0.006 de
39130 ± 3562 b
1.311 ± 0.023 ghi
9.109 ± 0.149 aC
bTA_2 52.860 ± 1.194 def
7.439 ± 0.692aC
2.516 ± 0.112bcd
0.615 ± 0.022 aC
49786 ± 8320 ab
1.590 ± 0.019 cde
8,274 ± 0,209 def
BVM 47.590 ± 1.947 efg
4.121 ± 0.886 cd
2.150 ± 0.141cde
0.569 ± 0.027 aC
57189 ± 3555 ab
1.126 ± 0.042 jk
8,245 ± 0,076 def
bGM_1 47.000 ± 2.319 efg
3.765 ± 0.553 cd
2.388 ± 0.205cd 0.391 ± 0.021 cd
38729 ± 1084 b
1,517 ± 0,024 def
8.824 ± 0.155 cd
bGM_2 53.820 ± 0.470 de
6.058 ± 0.439aC
2.570 ± 0.114aC 0,350 ± 0,023 d
54339 ± 4357 ab
1,435 ± 0,023 ef
8.734 ± 0.127 cd
cCT_1 61.930 ± 3.558 bcd
7.775 ± 1.399aC
2.862 ± 0.190aC 0.355 ± 0.033 cd
61511 ± 7547 ab
1.630 ± 0.022 cd
8,354 ± 0,217 def
cCT_2 61.650 ± 0.778 bcd
7.841 ± 0.322aC
2.831 ± 0.044aC 0,342 ± 0,024 d
50837 ± 4677 ab
1.730 ± 0.040 b
9,510 ± 0,237 abc
cCT_3 53.960 ± 5.778 de
6.168 ± 3.019aC
2.105 ± 0.289de 0.468 ± 0.158 cd
43879 ± 4305 b
1.592 ± 0.009 cde
8,217 ± 0,048 def
Los datos se presentan como media ± SD ( n = 3). Los valores dentro de una columna
seguidas por las mismas letras de superíndice no son significativamente diferentes en el nivel
0,05 de acuerdo con ANOVA ( p <0,05). un Expresado como (mol TroloxEq / 100 g).
Opciones de tabla
Algunos autores han propuesto que existe una relación proporcional entre el
contenido y la actividad de los compuestos que forman parte del sistema de
defensa antioxidante de la planta (polifenoles) con los cambios en función de la
altura del crecimiento de los cultivos ( Criado et al., 2004 ), las variaciones que
tienen también ha demostrado que aumenta la síntesis de la fenilalanina amonio
liasa (PAL) en las plantas, lo que lleva a un aumento de la producción de
compuestos fenólicos, incluyendo flavonoides ( Kishore, Ranjan, Pandey, y Gupta,
2010 ). En lo que a nosotros respecta, estos argumentos no parecen aplicarse a
los granos de cacao, ya que nuestros resultados ( Tabla 2 ) indican que a menor
altitud, más polifenoles y flavan-3-oles son producidos por la planta. Este tema se
discute a continuación.
3.2. Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) de los extractos
de cacao
HPLC con detección UV a 280 nm ha sido el principal método analítico para la
cuantificación de las catequinas y procianidinas en muestras de cacao ( Wollgast
y Anklam, 2000 ). De acuerdo con los datos de la literatura ( Liu et al.,
2006 y Markham y Bloor, 1998 ), la adición de ácidos a la fase móvil de HPLC
mejora la separación de los polifenoles ya que reduce la ionización de los dos
grupos hidroxilo y carboxilo fenólicos.En este estudio, el uso de metanol y ácido
acético diluido como disolvente, dos compuestos flavan-3-ol y dos metilxantinas
se identificaron por sus tiempos de retención, espectros de HPLC-UV (280 nm), y
las comparaciones cromatográficas con patrones primarios ( Fig. 2 ) . Los
resultados no mostraron diferencias cualitativas en los perfiles cromatográficos
entre extractos de cacao de diferentes áreas geográficas de crecimiento. Sin
embargo, no se observaron diferencias cuantitativas significativas en catequinas
y metilxantinas.
. Figura 2. cromatograma HPLC de los extractos de grano de cacao, rico en polifenoles y
metilxantinas. Los tiempos de retención de 13,13, 17,40, 23,59 y 31,05 min, corresponden a
la teobromina, (+)-catequina, la cafeína y el (-)-epicatequina, respectivamente. Para las
condiciones cromatográficas, ver sección 2.6 .
Opciones Figura
En su conjunto, las metilxantinas (teobromina y la cafeína) se encontraron en
mayor concentración que el catequinas, teobromina siendo el compuesto
predominante en los extractos ( Tabla 2 ). El mayor contenido de teobromina fue
9.679 ± 0.273, y la más baja fue de 7.062 ± 0.123 cacao en polvo sin grasa mg /
g de. El contenido de teobromina en las diferentes granjas de cacao en
crecimiento disminuyó en el orden de la barra> cCT_2> bTA_1> Aca> aL_1>
bGM_1> aL_3> bGM_2> AGT> aL_2> cCT_1> Ceniza> bTA_2> BVM> AVC>
cCT_3> bS_2> bS_1 . En comparación con la teobromina, el contenido de cafeína
era más bajo, que van desde 1.879 ± desde 0,028 hasta 0,724 ± 0,025 mg / g de
polvos de cacao desgrasados, en el siguiente orden decreciente ACA> cCT_2>
cCT_1> cCT_3> bTA_2> bGM_1> AGT = bGM_2> aL_1> bTA_1> aL_2> Ceniza>
Bar> BVM> aL_3> AVC> bS_1> bS_2. Se ha propuesto que la zona de producción
y las variaciones genotípicas, son en gran medida responsables de las
características de calidad de la de cacao final subproductos, en términos de
compuestos bioactivos ( Belscak et al., 2009 ). Con respecto a esta posibilidad, la
alta variabilidad genética del cacao colombiano, debido a la siembra de los
ecotipos procedentes de cruces entre Forastero / Amazónico y clones Trinitario se
convirtió en un tema importante relativo a la clasificación de los granos de cacao
utilizados durante este estudio. Sin embargo, es importante destacar que
anteriormente, los estudios llevados a cabo por Brunetto et al. (2007) , demostró
la existencia de una relación entre el contenido en metilxantinas y el genotipo del
cacao. Estos estudios se han centrado en la relación teobromina / cafeína, lo que
permite su clasificación en "Forastero", "Trinitario" y el cacao "criollo". En el
presente estudio, la correlación entre el cacao extractos analizó y se examinó la
relación teobromina / cafeína. Los resultados obtenidos se presentan en la
figura. 3 . La mayoría de las granjas muestreadas producir cacao en grano
"Trinitario", excepto bS_2 que es claramente una "Forastero" cosecha de cacao,
que se caracteriza por un alto contenido de teobromina y la baja concentración de
cafeína, mientras que las otras muestras (Trinitario) contienen niveles de
teobromina / cafeína intermedios. A pesar de que la ACA es una muestra
clasificada como cacao "Trinitario", con base en los resultados actuales, también
es claro que esta muestra es cerca de "Criollo" del cacao debido principalmente a
su baja relación teobromina / cafeína ( Fig. 3 ).
. Figura 3. Relación entre metilxantina contenido y el genotipo de cacao. Los ejes X e Y
representan el coeficiente de concentración de teobromina / cafeína y el% de cafeína en los
granos de cacao, respectivamente.
Opciones Figura
El flavan-3-oles, (-)-epicatequina y (+)-catequina (también conocidos como
catequinas) fueron identificados y cuantificados en extractos de cacao de varias
áreas de cultivo de cacao, y los resultados se muestran enla Tabla 2 . Se
observaron variaciones considerables en las concentraciones de estos
compuestos en los extractos de cacao, dependiendo del origen geográfico de las
muestras. (-)-Epicatequina dominó entre flavan-3-oles, con las más altas
concentraciones de 3,787 ± 0,070 a 1,405 ± 0,080 mg / g de cacao en polvo sin
grasa, y la disminución en la siguiente barra orden> aL_1> cCT_1> cCT_2>
bGM_2> bTA_2 AVC> bS_2> AGT> bGM_1> bS_1> aL_2> BVM> cCT_3> aL_3>
Ceniza> bTA_1> ACA. Por otra parte, las concentraciones de (+)-catequina eran
bajos, oscilando entre 1,297 ± 0,031 y 0,226 ± 0,006 cacao en polvo sin grasa
mg / g de, y disminuyeron en el orden de aL_1> bTA_2> BVM> Bar> bS_2>
cCT_3> bS_1 > bGM_1> aL_2> AGT> cCT_1> bGM_2> Ceniza> cCT_2> Aca>
AVC> aL_3> bTA_1. La comparación del contenido de flavan-3-ol en los granos de
cacao analizadas con los obtenidos por otros autores muestra algunas
diferencias. A saber, Niemenak et al. (2006) , determinado el contenido de
catequinas mediante cromatografía de fase inversa líquida de alto rendimiento
(RP-HPLC), utilizando acetona acuosa al 60% como disolvente en semillas recién
cosechadas de diferentes vainas de cacao de diferentes clones de extracción, y
se encontró un mayor contenido de catequina (1,25 a 14,42 mg / g) y
epicatequina (14,43 a 43,90 mg / g) a los obtenidos en el presente estudio. Gotti,
Furlanetto, Pinzauti, y Cavrini (2006) , que se utiliza etanol acuoso al 71% como
disolvente de extracción y modificado ciclodextrina para cuantificar catequinas en
los granos de cacao por cromatografía electrocinética micelar, y determina 0,06 ±
0,008 mg / g de catequina y 4,10 ± 0,20 mg / g de epicatequina en los granos de
cacao venezolanos, que están de acuerdo con nuestros resultados. Ortega et
al. (2008) , preparado dos tipos de extractos fenólicos de cacao en grano, el
extracto de cacao fenol (CE), por extracción sólido / líquido, y el extracto
purificado (PCE), mediante extracción en fase sólida (SPE). Aunque no
mencionaron el disolvente de extracción utilizado, los resultados son muy
similares a los obtenidos aquí, sino que informaron 0,335 ± 0,083 y 0,434 ±
0,055 mg / g de catequina para CE y el PCE, respectivamente, mientras que para
epicatequina los contenidos fueron 3,011 ± 0,053 y 4,314 ± 0,371 mg / g para el
CE y el PCE, respectivamente.
Se sabe que cuanto mayor es la altitud, la menos densa es la atmósfera a través
de la cual la radiación UV debe pasar para llegar al suelo. (280-315 nm), la
radiación UV-B es un componente menor del espectro solar, sin embargo, tiene el
potencial de afectar desproporcionadamente a los procesos metabólicos en los
seres humanos, animales, microorganismos y plantas ( Jansen et al.,
2001 ). Investigaciones anteriores sobre las plantas silvestres y cultivadas,
mostraron correlaciones positivas significativas entre la altitud del lugar de
crecimiento y las cantidades de ciertos antioxidantes fenólicos ( Alonso-Amelot,
Oliveros-Bastidas, y Calcagnopisarelli, 2007 ). Tales variaciones con la altitud se
supone que se asocia con las enzimas implicadas en la síntesis de compuestos
fenólicos que se producen en mayores cantidades o muestran una mayor
actividad a baja temperatura ( Chalker-Scott & Scott, 2004 ). En condiciones
tropicales, la temperatura disminuye con el aumento de la altitud, pero la
radiación UV solar también cambia, lo que aumenta con el aumento de la altitud y
la proximidad al mar. Cuantitativamente, se sabe que la radiación UV-B aumenta
14-18% por 1,000 m de altura en aumento. Por lo tanto, con una mayor radiación
UV en las zonas altas, se espera que las plantas de mostrar un mayor contenido
de polifenoles y mejores propiedades antioxidantes ( Kishore et al.,
2010 ). Nuestros resultados en cuanto a TPC, flavan-3-ol, catequina y
epicatequina contenidos sugieren que las plantas de cacao pueden experimentar
el efecto contrario, ya que las muestras como cCT_1, cCT_2, bar y AGT, que se
encuentran en el rango más bajo de altitud se encuentran entre las muestras
cuyo contenido de estos compuestos bioactivos es la más alta ( Tabla 2 ).Estos
resultados concuerdan con los obtenidos por Mateus, Marques Gonçalves,
Machado y De Freitas (2001) , que investigó la influencia de la altitud de los
viñedos en los cambios en el desarrollo de las catequinas en las semillas y la piel
de dos variedades de uva. Los resultados mostraron que la altitud del viñedo y su
clima son factores importantes para la madurez de la uva y la composición
varietal flavan-3-ol.Al final de la madurez, baja altitud (mayor temperatura y
humedad) parece ser ventajosa para producir mayores concentraciones de
catequinas, bajo peso molecular flavan-3-ol, y oligómeros de procianidinas totales
extraíbles. Independientemente de la matriz vegetal, esto también podría estar
sucediendo en los granos de cacao se utilizan aquí, ya que los principales
compuestos de polifenol producidos por la planta son oligómeros flavan-3-ol y sus
polímeros (procianidinas). Sin embargo, se necesitan más investigaciones para
concluir sobre este tema.
Finalmente, un estudio reciente ha propuesto la influencia del medio ambiente y
el genotipo de la patata nativo Andino, sobre el contenido de polifenoles y la
actividad antioxidante ( Andre et al., 2009 ). De acuerdo con los resultados
obtenidos, las plantas de patata pueden ajustar su contenido de polifenoles en
respuesta a las condiciones ambientales cambiantes, pero más importante fue el
genotipo predominante en los efectos generados por el medio ambiente, en
relación con las variaciones en el contenido de polifenol. Variación en el genotipo
no fue tomada en cuenta en el estudio actual, en consecuencia, las diferencias
observadas en los resultados también pueden ser influenciados por esta
variable. Por lo tanto, se necesita más investigación con ecotipos de cacao
específicos para llegar a conclusiones absolutas.
3.3. La capacidad antioxidante de los extractos de cacao
El reconocimiento de muchos beneficios para la salud proporcionados por
compuestos de polifenol ha fomentado un aumento del interés científico en la
determinación de la capacidad antioxidante de diversos productos derivados de
las plantas. Sin embargo, un método normalizado para la determinación de las
propiedades antioxidantes de ciertos alimentos y bebidas todavía no se ha
establecido. El ensayo ORAC se ha convertido en un método muy utilizado para
evaluar la capacidad antioxidante de las muestras biológicas y los alimentos
( Prior et al., 2003 ) y se ha aplicado ampliamente como un método de elección
por parte de académicos y la industria de alimentos y suplementos. Se realizó la
evaluación de la capacidad antioxidante por el ensayo ORAC para extractos de
cacao de dieciocho plantaciones de cacao probadas y los resultados obtenidos se
muestran en la Tabla 2 . El orden decreciente de grano de cacao extractos basa
en la capacidad antioxidante evaluado con el ensayo ORAC, sigue de cerca la
TPC, flavan-3-ol y el contenido de epicatequina: bar> aL_1> cCT_1> BVM>
bGM_2> AVC> bS_2> bS_1> Ceniza> cCT_2> Aca> AGT> bTA_2> cCT_3> aL_3>
aL_2> bTA_1> bGM_1. Estos resultados se confirman también por los moderados
coeficientes de correlación de Pearson obtenidos entre ORAC y estas tres
variables (r = 0,678, r = 0,685 y r = 0,677 para el TPC, flavan-3-ol y el contenido
de epicatequina, respectivamente). A pesar de ello, los resultados son muy
similares a los reportados por la base de datos ORAC del Departamento de
Agricultura de los Estados Unidos para los granos de cacao y cacao en polvo seco
( Laboratorio de Datos de Nutrientes, 2010 ).
3.4. Análisis de componentes principales (PCA)
El análisis multivariado tradicionalmente se ha empleado para evaluar la calidad
de los alimentos, así como los vinos y otros productos. PCA es un método de
análisis estadístico empleado con frecuencia y se ha aplicado con éxito a los
resultados analíticos, tanto para los compuestos individuales y las combinaciones
de componentes ( Kallithraka et al., 2001 ). PCA puede comprimir los datos en
función de similitudes y diferencias, al reducir el número de dimensiones sin
mucha pérdida de información, y definir el número de "componentes principales",
ofreciendo una "descripción visual" de las diferencias de grupo o agrupación y
valores atípicos ( Ieri et al ., 2011 y Rodríguez-Campos et al., 2011 ). Para
evaluar la posibilidad de diferenciar las muestras teniendo en cuenta su origen,
hemos aplicado esta herramienta estadística. TPC, flavan-3-ol, epicatequina,
catequina, contenidos de cafeína y teobromina, así como la relación teobromina /
cafeína, los valores ORAC, la temperatura y la altitud, se consideraron como
atributos para identificar los componentes principales. En general, los dos
primeros componentes principales (PCs) son suficientes para explicar la variación
máxima en todos los datos originales. En nuestro caso, los tres primeros
componentes principales representados 79,60% de la variabilidad total, el total de
polifenoles, flavan-3-ol y el contenido de epicatequina son las características
dominantes en el PC1 (39,65% de la variabilidad total), mientras que la altitud,
teobromina / relación de contenido de cafeína y la cafeína son las características
con mayor peso en el PC2 (25,68% de la variabilidad total). Temperatura
constituye el elemento más importante en la tercera PC (14,28% de la
variabilidad total). figura. 4 muestra una representación clásica de las
puntuaciones de PC1 y PC2 (65,32% de la varianza total). Los granos de cacao de
aL_1 y BAR contienen grandes cantidades de polifenoles, flavan-3ols y
epicatequina y es por eso PC1 los separa claramente de las otras muestras,
mientras que lo contrario ocurre para el ACA y bTA_1 frijoles. Examen de una
gráfica de las puntuaciones de dos dimensiones en el espacio definido por la PC1
y PC2 muestra que la distribución de muestras sigue un patrón que depende de
PC2 ( . Fig. 4 ). Así, el primer grupo que comprende 7 áreas de cultivo del cacao,
es un poco dominado por las características de la PC1, pero muy relacionada con
la altitud y la relación teobromina / cafeína (PC2). El segundo grupo está formado
por otras 7 áreas de cultivo del cacao, y también es un poco dominado por las
características de la primera componente principal, pero muy vinculado al
contenido de cafeína (PC2). Es importante destacar que las muestras dentro de
los grupos se diferencian claramente por orígenes regionales, como se muestra
en la figura. 1 . AVC, ACA, bS_1, bS_2, aL_1, aL_2, aL_3 y Ash fueron cultivados y
cosechados en las montañas andinas colombianas, mientras que las otras
muestras eran de llanuras.
. Figura . 4 Análisis de componentes principales: Biplot (partitura y carga parcelas se
superponen) de los dos primeros componentes principales asociados con la diferenciación de
las muestras de acuerdo a las zonas de crecimiento (TPC: contenido total de polifenoles, FLV:
flavan-3-oles, EPI: epicatequina, CAT : catequina, CAF: cafeína, TEO: teobromina, TE / CA:
relación teobromina / cafeína, TEMP: temperatura, ALT: altitud, los valores ORAC). Las
abreviaturas de cacao en las zonas de cultivo se describen en la Tabla 1 .
Opciones Figura
Técnicas quimiométricas se han utilizado comúnmente para asegurar la
autenticidad de los alimentos y de la calidad ( Cruz et al., 2013 y Souza et al.,
2011 ), así como para clasificar su origen geográfico basado en la composición
química ( Cheng et al., 2013 y Luykx y van -Ruth, SM, 2008 ). Es muy frecuente
encontrar investigaciones que aplican métodos univariados para determinar las
relaciones entre los fenoles totales o individuales con las propiedades
antioxidantes de los granos de cacao y cacao en productos derivados. Sin
embargo, este enfoque unidimensional no garantiza la determinación de
correlaciones simultáneas entre todos los resultados. Para superar este problema,
el interés por los métodos quimiométricos, que son de naturaleza multifactorial,
ha sido reconocida como una herramienta valiosa en la ciencia de los alimentos
(Granato, Katayama, y Castro, 2010 ). Específicamente en el campo de cacao y
chocolates, mediante el uso de PCA y análisis cluster jerárquico Niemenak et
al. (2006) , de anuncios diferentes clones de cacao de acuerdo con su contenido
de polifenoles y antocianinas; Miller et al. (2009) , establecido que la mayoría de
las medidas de la química flavanoles, incluyendo epicatequina y la flavan-3-oles
oligomérico y polimérico (procianidinas), tienen una relación predecible con el
grado de procesamiento de subproductos de cacao (cacao en polvo, bicarbonato
de chocolate, chocolate negro, chocolates de leche, entre otros), y más
recientemente, Rodríguez-Campos et al. (2012) , que se utiliza PCA para
determinar el efecto de los tiempos de fermentación y la temperatura de secado
de la composición de compuestos volátiles en los granos de cacao. En lo que a
nosotros respecta, el trabajo actual es una de las primeras evaluar las posibles
relaciones entre los componentes principales de cacao (catequinas y
metilxantinas) y su origen geográfico.
Hay varios factores internos y externos que afectan a la calidad y / o cantidad de
compuestos bioactivos en plantas de cacao. Estos incluyen la diversidad genética
(varietal y regionales), así como muchas variables ambientales, es decir, las
condiciones de crecimiento tales como intensidad de la luz, la humedad, la
temperatura, el uso de fertilizantes, hiriendo, infecciones u otros factores de
estrés ( Niemenak et al., 2006 ).Ya sea o no el contenido de polifenol, flavan-3-ol
y la epicatequina en muestras de cacao son importantes para beneficios para la
salud, nuestros resultados indican que el contenido de cafeína y la relación
teobromina / cafeína podrían ser utilizados como parámetros para establecer una
clasificación de granos de cacao de acuerdo con la geográfica área de las
regiones de cultivo de cacao, dependiendo principalmente de la altitud de los
cultivos.
Reconocimiento
Los autores agradecen a la Universidad de Antioquia para el apoyo logístico y
financiero del proyectoEstrategia de Sostenibilidad 2011/2012, y en especial a
Anne-Lise Haenni (Instituto Jacques Monod, CNRS - Université Paris-Diderot) por
sus importantes contribuciones en el desarrollo de este trabajo .
Química de los Alimentos
Volume 100, Issue 4 , 2007, páginas 1523-1530
Capacidad antioxidante y contenido fenólico de los granos de cacao
Azizah Othman una ,
Amin Ismail una , , ,
Nawalyah Abdul Ghani una ,
Ilham Adenan b
el Departamento de Ciencias de la Nutrición y la Salud, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud,
Universidad Putra Malaysia, 43400 UPM, Serdang, Selangor, Malaysia
b Instituto de Investigación Forestal de Malasia (FRIM) Kepong, 52109 Kuala Lumpur, Malasia
http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2005.12.021 , Cómo citar o enlazar Usando DOI
Permisos y reimpresiones
Abstracto
Este estudio investigó la capacidad antioxidante y el contenido de fenoles totales de
los granos de cacao de diferentes países, a saber, Malasia, Ghana, Costa de Marfil y
Sulawesi. La capacidad antioxidante de agua y extractos etanólicos preparados a partir
de granos de cacao se midió por tres ensayos diferentes. Para estimar el contenido
fenólico total, se utilizó el ensayo usando el reactivo de Folin-Ciocalteu. El extracto
acuoso mostró el valor más alto de actividad antioxidante basado en ensayo de
blanqueo de β-caroteno, mientras que el extracto etanólico mostró la mayor reducción
de las actividades de barrido y férricos. Granos de cacao de Ghana pueden observar las
actividades de barrido, seguido por Costa de Marfil, Malasia y Sulawesian mayor
antioxidante y. Sin embargo, los granos de Malasia y Sulawesian exhibieron la
reducción de la actividad más alta férrico, en comparación con los otros granos. El alto
contenido fenólico se encuentra en los granos de Malasia, seguido por Sulawesian,
Ghana y Costa de Marfil. Existía una correlación positiva tanto para etanol ( r = 0,76) y
los extractos de agua ( r = 0.78) entre el contenido de compuestos fenólicos y
actividad reductora férrica. Nuestros resultados mostraron que la capacidad
antioxidante y el contenido fenólico de los granos de cacao de Malasia eran
comparables a los de Ghana, Costa de Marfil, y los frijoles Sulawesian.
Palabras clave
Los granos de cacao ;
La actividad antioxidante ;
Actividad de barrido ;
Actividad reductora férrico ;
El contenido fenólico
1. Introducción
Componentes antioxidantes son los microelementos presentes en la dieta que puede
retrasar o inhibir la oxidación de lípidos, mediante la inhibición de la intiation o la
propagación de reacciones de oxidación de la cadena, y también están involucrados en
los radicales libres. Alimentos, tales como frutas, verduras y granos se dice que
contiene una amplia variedad de componentes antioxidantes, incluyendo compuestos
fenólicos. Estos compuestos se encuentran para estar bien correlacionado con
potencial antioxidante (Katalinic, Milos, Modun, Música, y Boban, 2004 ). Algunos
estudios epidemiológicos indican una correlación negativa entre la ingesta de
flavonoides de la dieta y la enfermedad coronaria del corazón ( Hertog et al.,
1993 y Knekt et al., 1996 ), cáncer ( Sun et al., 2002 ) y el accidente cerebrovascular
( Keli, Hertog, Feskens , y Kromhout, 1996 ).
Los fenólicos o polifenoles han recibido una considerable atención debido a sus
funciones fisiológicas, incluyendo antioxidantes, actividades antimutagénicas y
antitumoral ( Kono et al., 1995 y saliva et al., 1991). Cacao en grano y sus productos
(licor de cacao, polvo de cacao y de chocolate negro) son fuentes de alimentos ricos en
compuestos fenólicos. Los granos de cacao tienen un alto contenido fenólico de
alrededor de 12-18% (peso seco) en granos no fermentados ( Kim y Keeney,
1984 ). Dreosti (2000) informó que el 60% de los fenoles totales en los granos de cacao
crudos son monómeros de flavanoles (epicatequina y catequina) y oligómeros de
procianidina (dímero a decámero). Estos compuestos se informó a ser un candidato
potencial para combatir los radicales libres, que son perjudiciales para los sistemas de
nuestro cuerpo y de alimentos ( Adamson et al., 1999 y Sanbogi et al., 1998 ). En
estudios in vitro demostraron que estos compuestos tienen varias actividades
biológicas, tales como la capacidad de eliminar los radicales superóxido y radicales
hidroxilo, reducir los radicales peroxilo lipídicos y de inhibir la peroxidación lipídica
( Kanner et al., 1994 , Salah et al., 1995 y Vinson y Hontz , 1995 ).
Cacao ( Theobroma cacao L.) es un cultivo importante en la economía de varios países,
como Ghana, Costa de Marfil, Nigeria, Indonesia y Malasia. Malasia es el quinto mayor
productor de cacao del mundo. Es uno de los principales fabricantes de productos a
base de cacao del mundo y el más grande de Asia. Sin embargo, los granos de Malasia
se venden a un precio más bajo en comparación con los granos de África occidental,
debido a algunas deficiencias en su calidad (bajo aroma de cacao, sabor astringente y
amargo). Uno de los factores que podrían causar que esto podría ser una alta cantidad
de sustancias fenólicas. Un estudio realizado por Natsume et al. (2000) informaron de
que el contenido fenólico en licor de cacao variado con el país de origen. Sin embargo,
no se ha publicado en la capacidad antioxidante del cacao en grano de diferentes
países.
Los estudios han demostrado que el consumo de cacao o chocolate reduce el riesgo de
enfermedad cardiovascular ( Keen, 2001 y Osakabe et al., 1998 ). Por otra parte, los
extractos preparados a partir de polvo de cacao y granos de cacao, se mostró a exhibir
efectos antidiabéticos en ratas diabéticas inducidas con estreptozotocina ( Amin et al.,
2004b y Ruzaidi et al., 2005 ). Amin, Koh, y Asmah (2004a) demostró que un extracto
etanólico preparado a partir de licor de cacao de Malasia exhibió un potencial en la
disminución de la gravedad de la hepatocarcinogénesis en ratas. Una revisión realizada
por Duke (2000)supone que dos cucharas de cacao en una taza de agua o leche
podrían ser utilizados como un tratamiento paliativo de la enfermedad de Parkinson, la
mastitis, enfermedades del hígado, la disfunción sexual, la fiebre, la cistitis, el frío,
quemaduras, el asma y la bronquitis , la diabetes y la obesidad.
Por lo tanto, este estudio se llevó a cabo para evaluar la capacidad antioxidante del
cacao en grano de diferentes países de origen, por ejemplo, Malasia, Ghana, Costa de
Marfil y Sulawesi. Además, también se determinó la correlación entre la capacidad
antioxidante y el contenido fenólico. Además de la calidad del sabor, datos sobre la
capacidad antioxidante de los granos de cacao puede ser una información adicional a
considerar cuando se promueve el consumo de granos de cacao.
2. Materiales y métodos
2.1. Granos de cacao
2.1.1. General
Cacao en grano en bruto (secado y fermentado) de Malasia, Ghana, Costa de Marfil y
Sulawesi fueron adquiridos de KL Kepong (Productos del Cacao) Sdn. Bhd, Selangor,
Malasia.
2.1.2. Productos Químicos
β-caroteno, ácido linoleico, Tween 20, hidroxitolueno butilado (BHT), 2,2-difenil-2-
picrilhidrazil (DPPH), ácido ascórbico, Tris-HCl, 2,4,6-tripiridil-s-triazina (TPTZ) y ácido
ferúlico se adquirieron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EE.UU.); reactivo de Folin-
Ciocalteu, bicarbonato de sodio, acetato de sodio, ácido acético glacial, cloruro férrico
(FeCl 3 · 6H 2 O), sulfato ferroso (FeSO 4 · 7H 2 O) y etanol fueron de Merck (Darmstadt,
Alemania), cloroformo era de Fisher Scientific (Loughborough, Reino Unido).
2.1.3. Preparación de extractos
Cacao en grano sin procesar se desconchados manualmente antes de la molienda. El
extracto se preparó de acuerdo con el método de Velioglu, Mazza, Gao, y Oomah
(1998) . Cotiledones cacao molido se extrajeron con agua destilada o etanol acuoso al
70% durante 2 horas a 50 ° C utilizando un agitador orbital (Unimax 1010, Heidolph,
Alemania). La relación entre la muestra al medio de extracción fue de 1:25. La mezcla
se filtró a través de un papel de filtro (Whatman n º 1) utilizando un embudo
Buchner. El filtrado se considera como extracto de cacao y se utiliza para los ensayos
de antioxidantes.
2.2. ensayo de blanqueo β-caroteno-linoleato
La actividad antioxidante del extracto de cacao se ensayó basado en el método de
blanqueo β-caroteno desarrollado por Velioglu et al. (1998) . BHT se utilizó como el
estándar. β-caroteno (0,2 mg en 1 ml de cloroformo), ácido linoleico (0,02 ml) y Tween
20 (0,2 ml) se transfirieron a un matraz de fondo redondo. A continuación, la mezcla se
añadió a 0,2 ml de extracto de cacao o estándar o etanol (como control). El cloroformo
se eliminó a temperatura ambiente bajo vacío a presión reducida utilizando un
evaporador rotatorio (Unimax 1010, Heidolph, Alemania). Después de la evaporación,
se añadieron 50 ml de agua destilada a la mezcla, a continuación, se agita
vigorosamente para formar una emulsión. Dos alícuotas de un mililitro de la emulsión
se pipetearon en tubos de ensayo y se colocan inmediatamente en un baño de agua
(Techne, Cambridge Duxford, Reino Unido) a 50 ° C. La absorbancia se leyó a
intervalos de 20 minutos durante 2 horas a 470 nm, usando un SECOMAM Anthelie
avanzada 5 espectrofotómetro. Tasa de degradación (DR) se calculó de acuerdo a la
cinética de primer orden, utilizando la siguiente ecuación basada en Al-Saikhan,
Howard, y Miller (1995) :
Gire MathJax en
donde ln es logaritmo natural, una es la absorbancia inicial (470 nm) en el tiempo
0, b es la absorbancia (470 nm) a 20, 40, 60, 80, 100 o 120 min y t es la absorbancia
inicial (470 nm) en el tiempo 0.
La actividad antioxidante (AA) se expresó como porcentaje de inhibición con respecto
al control, utilizando la siguiente fórmula:
Gire MathJax en
2.3. Ensayo de depuración de radicales 2,2-difenil-2-picrilhidrazil
La actividad de eliminación se estimó de acuerdo con el método de Lai, Chous, y Chao
(2001) . Una alícuota de extracto de cacao (200 l, 0,62 a 496 mg / ml en etanol) o ácido
ascórbico (estándar) (0,16 a 1,28 mg / ml) se mezcló con 100 mM de tampón Tris-HCl
(800 l, pH 7,4). A continuación, se añadió 1 ml de 500 mM de DPPH preparados
previamente en etanol. La mezcla se agitó vigorosamente y se dejó reposar durante 20
min a temperatura ambiente en una habitación oscura. Se leyó la absorbancia
utilizando un espectrofotómetro a 517 nm. El efecto de la basura en el radical de DPPH
fue calculado usando la siguiente ecuación:
Gire MathJax en
CE 50 valor se determinó a partir del gráfico trazado de barrido de actividad frente a la
concentración de extractos de cacao, que se define como el antioxidante total
necesario para disminuir la concentración de radicales DPPH inicial en un 50%. Las
mediciones se llevaron a cabo por triplicado, y su efecto de barrido se calculó
basándose en el porcentaje de DPPH depurado.
2.4. Ensayo de alimentación / antioxidante férrico reductor (FRAP)
Ensayo FRAP se determinó sobre la base de la reducción de Fe 3 + -TPTZ a un color azul
Fe 2 + TPTZ (Benzie y Strain, 1996 ). El reactivo FRAP se preparó mediante la mezcla de
300 mM de tampón de acetato (pH 3,6), 10 mM y 20 mM TPTZ FeCl 3 · 6H 2 O en una
proporción de 10:01:01, en a 37 ° C. Reactivo FRAP (3 ml) se pipeteó en tubos de
ensayo. A continuación se añadió un total de 100 l de muestra y 300 l de agua
destilada a los mismos tubos de ensayo, y se incubó a 37 ° C durante 4 min. Cada
muestra se realizó por triplicado. Se midió la absorbancia a 593 nm. El valor FRAP se
calculó utilizando la ecuación descrita porBenzie y Strain (1996) . En el ensayo FRAP, el
potencial antioxidante de la muestra se determinó a partir de una curva patrón trazada
utilizando, FeSO 4 · 7H 2 O en un rango de concentración entre 200 y 1000 mM.
2.5. Contenido de fenoles totales
Contenido fenólico total se determinó según el método de Singleton y Rossi
(1965) . Una muestra (200 mg) se extrajo con 2 ml de agua destilada o etanol acuoso
al 70% a temperatura ambiente durante 2 h utilizando un agitador orbital a 200
rpm. La mezcla se centrifugó (Protech, Malasia) a 1000 g durante 15 min. El
sobrenadante (200 l) se mezcló con 1,5 ml de reactivo de Folin-Ciocalteu, y se dejó
reposar a temperatura ambiente durante 5 min, a continuación se añadió 1,5 ml de
solución de bicarbonato de sodio (0,566 M) a la mezcla. Después de 90 min, la
absorbancia se leyó a 725 nm. Los resultados se expresaron como equivalentes de
ácido ferúlico. La concentración utilizada era en un rango entre 0,02 y 0,1 mg / ml.
2.6. El análisis estadístico
Todos los datos se expresaron como media ± desviación estándar. Los datos fueron
analizados mediante ANOVA de una vía con el programa SPSS 11.5. Nueva prueba de
rango múltiple de Duncan se utilizó para evaluar las diferencias entre las
medias. Prueba de correlación de Pearson se utilizó para evaluar las correlaciones
entre las medias. Una diferencia significativa fue considerado en el nivel de p <0,05.
3. Resultados y discusión
3.1. blanqueo β-caroteno-linoleato
En el ensayo de blanqueo β-caroteno, ácido linoleico produce hidroperóxidos como los
radicales libres durante la incubación a 50 ° C. La presencia de antioxidantes en el
extracto reducirá al mínimo la oxidación de β-caroteno por
hidroperóxidos. Hidroperóxidos formados en este sistema serán neutralizados por los
antioxidantes de los extractos. Por lo tanto, la tasa de degradación de β-caroteno
depende de la actividad antioxidante de los extractos. Hubo una correlación entre la
tasa de degradación y la decoloración de β-caroteno; donde el extracto con la tasa de
degradación de β-caroteno más bajo exhibió la actividad antioxidante más alta. Todos
los extractos tenían una actividad antioxidante más bajo que el BHT ( . Fig. 1 y . Fig.
2 ).
. Figura 1. tasa de degradación de la materia prima del grano de cacao (extracto etanólico) se
ensayó por el método de blanqueo β-caroteno ( n = 3). La concentración de la muestra fue de
0,04 g / ml (40 000 ppm). BHT a 200 ppm se usó como el estándar. Los coeficientes de
variación (CV) están a menos de 11%.
Opciones Figura
. Figura 2. tasa de degradación de la materia prima del grano de cacao (extracto de agua) se
ensayó por el método de blanqueo β-caroteno ( n = 3). Concentración de la muestra fue de
0,04 g / ml (40 000 ppm). BHT a 200 ppm se usó como el estándar. Los coeficientes de
variación (CV) están a menos de 18%.
Opciones Figura
En este estudio, se utilizaron dos medios de extracción para la preparación de los
extractos de cacao. Un estudio previo había informado que la actividad antioxidante y
el rendimiento del contenido fenólico fue influenciado por diferentes solventes de
extracción ( Sun & Ho, 2005 ). Por ejemplo, un extracto de agua deTerminalia
chebuta mostró una buena actividad antioxidante, en comparación con los extractos
metanólicos de Lycopersicon esculentum ( Cai, Qiong, Mei, y Harold, 2004 ). Por otra
parte, desde un punto de vista toxicológico, el etanol y el agua son más seguras que
acetona, metanol y otros disolventes orgánicos (Oktay, Gulcin, y Kufrevioglu, 2003 ). La
actividad antioxidante de los extractos etanólicos de cacao siguió el orden de Ghana,
Costa de Marfil ≈ ≈ Malasia> Sulawesi ( Tabla 1 ). Hubo una diferencia significativa
( p <0,05) entre la actividad antioxidante de los granos de Sulawesian y otros
granos. No se encontró diferencia significativa entre Costa de Marfil y Ghana
frijoles. Extracto de cacao de Malasia mostró una diferencia significativa ( p <0,05) en
la actividad antioxidante en comparación con todos los otros extractos excepción de
Costa de Marfil.
Tabla 1. Actividad antioxidante (%) de los granos de cacao primas ensayó por el blanqueo β-
caroteno-linoleatoPaíses de origen
La actividad antioxidante (%)
Etanol Agua
Malasia 67,6 ± 1,8 d 72,7 ± 1.5bc
Ghana 74,1 ± 2.5bc 74.9 ± 2.4b
Costa de Marfil 71,02 ± 1.53cd 83.69 ± 1.07a
Sulawesi 26,1 ± 1,8 E 51,4 ± 3.0f
Concentración de la muestra fue de 0,04 g / ml. Los valores se expresan como media ±
desviación estándar ( n = 3).Medias con letras diferentes son significativamente diferentes al
nivel de p <0,05.
Opciones de tabla
Extractos de agua de Costa de Marfil, el cacao fue significativamente mayor ( p <0,05)
en la actividad antioxidante, seguido de Ghana, Malasia y Sulawesi. Sin embargo, el
análisis de varianza no mostró ninguna diferencia significativa entre los granos de
Ghana y Malasia. Todos los extractos de agua de los granos de cacao mostraron
actividad antioxidante más alta en comparación a los extractos etanólicos.Compuestos
antioxidantes solubles en agua de los granos de cacao parecen inhibir la oxidación de
β-caroteno en un sistema de β-caroteno-linoleato mejor que los compuestos solubles
en etanol. Esta conclusión fue apoyada por un estudio sobre hongos ( L. edodes y V.
volvacea ), que mostró extractos de agua que tienen actividad antioxidante más alta
que los extractos metanólicos ( Cheung, Peter, y Vincent, 2003 ). Amin y Tan
(2002) reportaron que el agua extractos de algas marinas ( Laminaria sp.) tenían
mayor actividad antioxidante, en comparación con extractos etanólicos. Componentes
antioxidantes presentes en los extractos de agua, tales como aminoácidos, ácidos
fenólicos y flavonoides en el propóleo ( Nagai, Reiji, Hachiro, y Nobutaka, 2003 ),
pirocatecol en la ortiga ( Gulcin, Irfan, Oktay, y Mehmet, 2004 ), catequina en el té,
vino, uva, manzana, pera y melocotón ( Dreosti, 2000 , Nicolas et al., 1994 , Spanos y
Wrolstad, 1990 y Cheng y Crisoto, 1995 ) tienen alta actividad antioxidante. En los
granos de cacao, compuestos antioxidantes solubles en agua pueden ser (-)-
epicatequina, (+)-catequina, quercetina y ( Sanbogi, Suzuki, y Sakane, 1997 ). Otros
factores que también influyen en la actividad de los antioxidantes son la concentración
de antioxidantes, medio de extracción, temperatura, pH del medio ( Gazzani, Papetti,
Massolini, y Daglia, 1998 ), estructuras químicas y la posición en la molécula ( Antes,
Wu, y Schaich, 2005 ) .
El contenido fenólico total de los granos de cacao se muestra en la figura. 3 . Granos
de Malasia presentó el mayor contenido de polifenoles, seguido de Sulawesi, Ghana y
Costa de Marfil para el agua y extractos de etanol. Varios estudios han demostrado una
correlación entre la actividad antioxidante y el contenido fenólico ( Nagai et al.,
2003 , Velioglu et al., 1998 y Yang et al., 2002 ). Sin embargo, sobre la base de
ensayo de blanqueo β-caroteno, el estudio no mostró una correlación entre la actividad
antioxidante y el contenido fenólico para ambos extractos. Nuestro hallazgo está de
acuerdo con Amarowicz, Wanasundara, Wanasundara, y Shahidi (1993) , que
informaron de que la linaza con el contenido fenólico más bajo, exhibió la actividad
antioxidante más alta. Además, la actividad antioxidante de la nuez, anacardo ( Tsuda,
Makino, Kato, Osawa, y Kawakishi, 1993 ) y el trigo sarraceno ( Sun & Ho, 2005 ) fue
inversamente correlacionada con el contenido fenólico. Basado en el ensayo de
blanqueo β-caroteno, compuestos fenólicos de cacao en grano inhibieron débilmente la
oxidación de β-caroteno por hidroperóxidos. Una alta actividad antioxidante también
podría ser debido a otros compuestos fenólicos además de que son solubles en agua y
etanol.
. Figura 3. contenido de fenoles totales de cacao en grano extraer. Concentración de la
muestra fue de 0,01 g / ml. Los resultados se expresan como equivalentes de ácido
ferúlico. Los valores se expresan como media ± desviación estándar ( n = 3). Las medias con
letras diferentes son significativamente diferentes al nivel de p <0,05.
Opciones Figura
3.2. Actividad de barrido de 2,2-difenil-2-picrilhidrazil radical
La acción de barrido del radical de protones es conocido por ser uno de los diversos
mecanismos de la actividad antioxidante de medición. DPPH es uno de los compuestos
que poseen un protón radical y muestra un máximo de absorción a 517 nm
libre. Cuando se encuentra con eliminadores de radicales DPPH de protones, sus
púrpura color se desvanece rápidamente. Este ensayo determina la compactación de
especies de radicales estables de DPPH por los antioxidantes.
Para los extractos etanólicos, granos de Ghana mostraron el efecto de barrido más
alta, mientras que los granos Sulawesian mostraron la actividad más baja entre los
granos ( . Fig. 4 ). Granos de Costa de Marfil mostraron un efecto de barrido
ligeramente mayor que los granos de Malasia. Sin embargo, no hubo diferencia
significativa entre estos granos.
. Figura 4. Scavenging efecto del extracto etanólico sobre los radicales DPPH. Los valores se
expresan como media ± desviación estándar ( n = 3). El ácido ascórbico se usa como el
estándar. Los coeficientes de variación (CV) están a menos de 12%.
Opciones Figura
La actividad de eliminación de los extractos acuosos se encontraba en el orden de
Ghana> Malasia> Costa de Marfil> Sulawesi. Hubo diferencias significativas ( p <0,05)
entre los granos. Granos de Malasia mostraron una significativa mayor ( p <0,05) en
comparación con el efecto de barrido de granos de Costa de Marfil ( . Fig. 5 ).
. Figura 5. Scavenging efecto del extracto de agua sobre los radicales DPPH. Los valores se
expresan como media ± desviación estándar ( n = 3). El ácido ascórbico se usa como el
estándar. Los coeficientes de variación (CV) están a menos de 20%.
Opciones Figura
La actividad de eliminación de ambos extractos de cacao en radicales DPPH aumentó
rápidamente desde 0,62 hasta 2,5 mg / ml. Los resultados mostraron que la actividad
de barrido se aumentó a medida que la concentración de extracto aumentó hasta que
se alcanzó una meseta después de 2,5 mg / ml. A una concentración de 4,96 mg / ml,
extractos etanólicos mostraron actividad de barrido más alta que los extractos acuosos
( . Fig. 4 y fig. 5 ). Un estudio realizado por Cheung et al. (2003) en seta ( V. volvaco )
encontró que la actividad de eliminación de los extractos metanólicos fue
significativamente mayor que los extractos acuosos.
CE 50 valor se determinó a partir del gráfico trazado de barrido de actividad frente a la
concentración de extractos de cacao, que se define como la cantidad de antioxidante
necesario para disminuir la concentración de radicales DPPH inicial en un 50% ( Tabla
2 ). La CE bajo 50 indica la capacidad más fuerte de los extractos de actuar como
captadores DPPH. Para los extractos etanólicos, frijoles Malasia y Ghana tenían la
misma EC 50 , que fue ligeramente menor que el frijol de Costa de Marfil. Sin embargo,
no hubo diferencia significativa entre estos granos. La CE 50 no se obtuvo el valor de los
granos Sulawesian para ambos extractos etanólicos y agua.
Tabla 2. actividad captadora (CE 50 ) de los granos de cacao sobre los radicales DPPHPaíses de origen
CE 50 (DPPH) mg / ml
Extractos etanólicos Extractos de agua
Malasia 1,3 ± 0.01B 2,4 ± 0,1 d
Ghana 1,3 ± 0.01B 1,7 ± 0.01c
Países de origen
CE 50 (DPPH) mg / ml
Extractos etanólicos Extractos de agua
Costa de Marfil 1,5 ± 0.1bc 2,9 ± 0.0E
Sulawesi ND ND
Los valores se expresan como media ± desviación estándar ( n = 3). El ácido ascórbico se
usa como un estándar. CE50 valor se define como el antioxidante necesario para disminuir la
concentración de radicales DPPH inicial en un 50% la cantidad. Las medias con letras
diferentes son significativamente diferentes ( p <0,05, ANOVA). ND = no detectado.
Opciones de tabla
De los extractos de agua, granos de Ghana mostraron la CE más bajo 50 , en
comparación con los otros granos. Granos de Malasia tenían una significativamente
mayor ( p <0,05) CE 50 en comparación con granos de Ghana. El análisis de varianza
reveló una diferencia significativa ( p <0,05) entre la CE 50 valores de extractos
etanólicos y agua. Sun y Ho (2005) reportaron una correlación significativa entre los
fenoles totales y la capacidad de eliminación de los extractos de trigo sarraceno en
radicales DPPH. Sin embargo, nuestro estudio no mostró una correlación entre la
capacidad de recolección de residuos y fenoles totales.Este hallazgo fue similar a los
resultados obtenidos a partir del ensayo de blanqueo β-caroteno. Un estudio realizado
por Yu et al. (2002) no encontró ninguna correlación entre la actividad de barrido y el
contenido de fenoles totales. Nuestros resultados indican que la capacidad de barrido
de alta en radicales DPPH no podía ser debido a los compuestos fenólicos en los
extractos de granos de cacao.
3.3. Actividad reductora férrico sobre la base de ensayo FRAP
El extracto etanólico de los granos de Sulawesian exhibió el potencial antioxidante más
alta entre los extractos ( . Fig. 6 ), basado en el ensayo FRAP. Granos de Malasia y
Sulawesian tuvieron mayor potencial antioxidante en comparación con el ghanés y el
frijol de Costa de Marfil. Para los extractos de agua, frijoles Sulawesian también
mostraron el mayor potencial antioxidante, seguido de Ghana, Costa de Marfil y
Malasia. Todos los extractos de agua mostraron diferencia significativa ( p <0,05) en el
potencial antioxidante, excepto para los granos de Ghana y Malasia.
. Figura 6. potencial antioxidante de extractos de cacao ensayadas por el ensayo
FRAP. Concentración de la muestra fue de 0,04 g / ml. Los valores se expresan como media ±
desviación estándar ( n = 3). Las medias con letras diferentes son significativamente
diferentes al nivel de p <0,05.
Opciones Figura
Ensayo FRAP mide el potencial reductor de un antioxidante reaccionar con un
tripyridyltriazine férrico (Fe 3 +-TPTZ) y la producción de un complejo ferroso
tripyridyltriazine color (Fe 2 + -TPTZ) ( Benzie y Strain, 1996 y Benzie y Strain,
1999 ). En general, las propiedades reductoras se asocian con la presencia de
compuestos, que ejercen su acción mediante la ruptura de la cadena de los radicales
libres a través de la donación de un átomo de hidrógeno ( Gordon, 1990 y Duh et al.,
1999 ). De acuerdo con Benzie y Strain (1996) , la reducción de Fe 3 + complejo-TPTZ de
color azul de Fe 2 + -TPTZ se produce a un pH bajo.
Frijoles Sulawesian y Malasia son bien conocidos por tener un pH bajo cotiledones,
mientras que Ghana tiene un pH medio, y Costa de Marfil tiene un pH alto ( Misnawi,
Jinap, Nazamid, y Jamilah, 2002 ). El potencial antioxidante más alta de los granos de
Malasia podría ser debido a la naturaleza altamente ácida (pH bajo) de los cotiledones
de frijol, que muchos influencia del pH del medio de ensayo.
Además, hubo una correlación positiva entre el ensayo FRAP y el contenido fenólico
tanto para el etanólico (r = 0,764) y los extractos acuosos ( r = 0,782). Este resultado
está de acuerdo con Benzie y Stezo (1999) , que encontró una fuerte correlación entre
el contenido de fenoles totales y el ensayo FRAP. Gardner, Blanco, McPhail y Duthie
(2000) han evaluado la nitrosodisulfonato potasio radicales libres sintético (mediante el
uso de spin electrónico resonancia) y Fe 3 + (mediante el uso de FRAP) y encontraron
una fuerte correlación con el contenido fenólico. En este estudio, los compuestos
fenólicos de cacao en grano exhiben alta potencia en la reducción de Fe 3 + -TPTZ. Rice-
Evans, Miller, y Paganga (1997) informó que los compuestos fenólicos tienen
propiedades redox, que les permiten actuar como agentes reductores, donadores de
hidrógeno y extintores de oxígeno singlete. El potencial redox de compuestos fenólicos
juega un papel importante en la determinación de la capacidad antioxidante ( Rice-
Evans et al., 1997 ). El análisis de varianza mostró que los extractos etanólicos de
granos de cacao tuvieron significativo más fuerte ( p alimentación <0,05) la reducción
de los extractos de agua. Esto podría ser debido a la alta cantidad de fenoles totales
presentes en los extractos etanólicos, en comparación con los extractos
acuosos. Cheung et al. (2003) informaron de que la cantidad de compuestos fenólicos
en los extractos orgánicos fue mayor que en los extractos de agua.
Nuestros resultados revelaron que la capacidad antioxidante y el contenido fenólico de
los granos de cacao de Malasia fue comparable a Costa de Marfil, Ghana y granos de
Sulawesian, lo que indica que los granos de Malasia tienen una capacidad antioxidante
similar a otros granos. El disolvente de extracción afectó significativamente el
contenido de fenoles totales y capacidad antioxidante del cacao en grano. Extractos
etanólicos mostraron la capacidad antioxidante más alta cuando se determina
mediante los ensayos de DPPH y FRAP, mientras que los extractos acuosos mostraron
la actividad antioxidante más alta cuando se evaluó por el ensayo de blanqueo β-
caroteno. Por otra parte, se encontró que la cantidad fenólico total más alto en los
extractos etanólicos. Basado en los ensayos de antioxidantes, por lo tanto se sugiere
que los compuestos fenólicos presentes en los extractos de cacao tienen una fuerte
capacidad secuestradora y poder reductor férrico en lugar de β-caroteno-blanqueo
actividad. Esto podría ser debido a los mecanismos antioxidantes de los compuestos
fenólicos hacia los radicales libres. Además de los compuestos fenólicos, la presencia
de metil xantina (teobromina y la cafeína) y antocianinas en los granos de cacao puede
influir en la capacidad antioxidante. Además, estos compuestos son miscibles en agua
o agua-etanol.
Sin embargo, hay varias limitaciones metodológicas para las determinaciones de
antioxidantes ( Kaur y Kapoor, 2001 ). Los métodos más ampliamente utilizados para la
actividad antioxidante de medición son aquellos que implican la generación de
especies de radicales, donde la presencia de antioxidantes determina la desaparición
de los radicales ( Cao, Alessio, y Cutler, 1993 ). Es pertinente utilizar diferentes
ensayos en un medio de extracción eficiente, en lugar de confiar en un solo ensayo
para evaluar y comparar la capacidad antioxidante.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer la ayuda financiera proporcionada por el Ministerio de
Ciencia, Tecnología e Innovación de Malasia (IRPA Proyecto N º 01-02-04-0013-
EA001). También hacen extensivo su agradecimiento a la Universidad Putra Malaysia
para el uso de instalaciones de laboratorio.
Food Research InternationalVolume 33, Issue 6 , julio de 2000, Pages 423-447
Revisión de polifenoles en Theobroma cacao: cambios en la composición durante la fabricación del chocolate y de la metodología para la identificación y cuantificación
Ene Wollgast ,
Elke Anklam ,
Comisión Europea, Centro Común de Investigación, Instituto de Salud y Protección del Consumidor,
Productos Alimenticios y la Unidad de Bienes de Consumo, I-21020 Ispra (Va), Italia
http://dx.doi.org/10.1016/S0963-9969 (00) 00068-5 , Cómo citar o enlazar Usando DOI
Permisos y reimpresiones
Abstracto
Los polifenoles se han convertido en un foco intenso de interés en la investigación
debido a su percepción de los efectos beneficiosos para la salud, tales como anti-
cancerígenos anti-aterogénicas antiinflamatorios antimicrobianos etc polifenoles,,,, en
el té verde y negro, semillas de uva, uvas y (rojo) de vino han aumentado mucho la
atención, pero el chocolate no se ha investigado intensamente hasta ahora. Esta
opinión se refiere a los polifenoles en Theobroma cacao , el cambio en la composición y
la cantidad durante la fermentación, el secado, y la fabricación de chocolate, así como
con métodos analíticos para el aislamiento, caracterización y cuantificación. Los granos
de cacao son ricos en polifenoles en catequinas y proantocianidinas particulares. Sin
embargo, una fuerte disminución de la cantidad se produce durante la fermentación y
secado del cacao en grano y mayor retención se ha informado durante el
tostado.Caracterización y, en particular, la cuantificación de los polifenoles en el
chocolate sólo se ha desarrollado relativamente recientemente. Este trabajo revisa
además la literatura sobre la metodología para el análisis, cuantificación, aislamiento,
purificación y elucidación estructural de los polifenoles en los componentes de cacao y
otros productos básicos. En cuanto a los métodos de análisis se pone mayor énfasis en
HPLC, ya que suele ser el método de elección debido a su alta resolución, alta
eficiencia, alta reproducibilidad y tiempo de análisis relativamente corto y sin
restricciones en la volatilidad de la muestra. Por otra parte, la HPLC puede ser acoplado
a una variedad de detectores tales como UV-Vis, matriz de fotodiodos (PDA),
fluorescencia, electroquímica (ECD), y espectrometría de masas (MS). Sin embargo, la
TLC como un método de cribado y la electroforesis capilar (CE) como una herramienta
prometedora se toma en la consideración también. La caracterización y cuantificación
de la composición de polifenoles es uno de los primeros pasos a realizar para evaluar
una supuesta contribución del chocolate para la salud humana.
1. Introducción
La importancia de los antioxidantes en la medicina preventiva se reconoce desde hace
varios años. Las enfermedades que se cree que es causada o al menos mejorarse por
el estrés oxidativo incluyen las enfermedades cardiovasculares y cerebrovasculares,
algunas formas de cáncer y varios otros trastornos, tales como la diabetes y la
enfermedad reumatoide, muchos de los cuales puede ser relacionada con la
edad. Aunque la etiología de estas enfermedades es compleja, se reconoce que la
dieta, o la ingesta de ciertos componentes de la dieta está jugando un papel esencial
en la prevención o el tratamiento de estas enfermedades. La mayoría de estas
enfermedades son vistos como resultado de un estilo de vida occidental excesiva en
torno a una dieta altamente refinados ricos en grasas saturadas y azúcares extrínsecos
no lácteos y baja en hidratos de carbono complejos de plantas y algunas veces en
minerales y vitaminas (Zumbe, 1998 ).
Sin embargo, el aumento de interés se ha dedicado a compuestos de origen natural,
durante mucho tiempo se consideró no nutritivo. Se producen en el metabolismo
secundario de muchas plantas y juegan un papel, por ejemplo, en la defensa contra los
microorganismos, como los compuestos de señalización, etc Por lo tanto, se les llama
"productos secundarios de las plantas" ( Watzl y Leitzmann, 1995 ), "fitoquímicos
"( 1 , 58 y 95 ), o "quimio-preventores" ( Zumbe, 1998 ). Tal quimio-preventores se
cree que tienen el potencial para retrasar, prevenir o incluso revertir muchas
condiciones desde el cáncer a la caries dental. Ellos tienen el potencial para la inclusión
en los alimentos fabricados como un ingrediente añadido, o existen como un
ingrediente intrínseco de la comida en preguntas ( Zumbe ).
Los polifenoles son un tal clase de compuestos. Se presentan en una variedad de
frutas, verduras, nueces, semillas, flores, corteza, bebidas, e incluso algunos alimentos
manufacturados, como un componente de los ingredientes naturales utilizados. Los
polifenoles se han convertido en un foco intenso de interés en la investigación debido a
su percepción de los efectos beneficiosos para la salud. Ellos han sido reportados para
exhibir anti-cancerígenos ( 1 , 19 , 26 , 42 , 58 , 87 , 93 , 94 , 95 y 96 ), anti-
aterogénico ( 40 , 41 , 44 , 47, 63 y 66 ), anti- úlcera ( Saito, Hosoyama, Ariga,
Kataoka y Yamaji, 1998 ), anti-trombótico ( Samman, Lyons Wall & Cook, 1998 ), anti-
inflamatorio ( 7 , 54 y 74 ), anti-alergénico ( 7 y 54 ), inmune (modulación
de 74 y 79 ), (anti-microbianas 7 y 98 ), vasodilatadores ( Fitzpatrick, Bing y
Rohdewald, 1998 ), y analgésicos ( Benavente-García, et al., 1997 ) efectos. Los
polifenoles ejercen estos efectos como antioxidantes
( 11 , 24 , 35 , 77 , 83 , 91 y 93 ), los quelantes de cationes divalentes ( Cook &
Samman, 1996 ), inhibidores de la actividad de enzimas, incluyendo ADN
topoisomerasa II ( Romanczyk et al., 1997 ), la proteína quinasa C ( Huang y Ferraro,
1992 ) y las proteínas tirosina quinasas ( agua subterránea, Solomons, Drewe y
Munawar, 1996 ), inductores de hepática electrófilo de procesamiento (Fase II),
enzimas ( Prochaska y Talalay, 1992 ), y como moduladores de la actividad de enzimas
tales como citocromo P-450 isoenzima ( Huang y Ferraro, 1992 ), la sintasa de óxido
nítrico ( Romanczyk et al., 1997 ), ciclo-oxigenasa y lipoxigenasa ( 13 y 75 ).
El cacao es inusualmente rico en polifenoles, pero caracterización precisa, por no
hablar de cuantificación del contenido de polifenoles sólo se ha desarrollado
relativamente recientemente ( Zumbe, 1998 ). Por otra parte, el chocolate como la
principal fuente de cacao consumida por los seres humanos ha sido el menos objeto de
investigación.
Por lo tanto, esta revisión se centra en: (1) la química y la biosíntesis de polifenoles, (2)
su incidencia en el cacao y el estado de conocimiento de los cambios en la composición
y la cantidad de polifenoles durante la fabricación del chocolate, y (3) un resumen de
los recursos disponibles metodología para el aislamiento y la caracterización de los
polifenoles en los componentes de cacao y otras fuentes de alimentos con la
composición de polifenoles similares.
La evaluación del potencial de protección de la salud-polifenoles presentes en el
chocolate es un problema complejo y necesita un enfoque integrado. Además de
análisis cualitativo y cuantitativo, esto incluye una investigación de la biodisponibilidad
de los polifenoles a partir de la matriz de chocolate de alimentos, el metabolismo de los
polifenoles absorbidos principalmente en los enterocitos y hepatocitos, la degradación
de los polifenoles por la microflora (colon), dianas moleculares, la dosificación eficaz en
vivo, y la interacción con otros nutrientes como proteínas, polisacáridos, grasas y
algunos micronutrientes. Productos de cacao o polifenoles de cacao no se han
investigado intensamente en este contexto, hasta ahora, mientras que el té verde y
negro, así como el vino tinto que tiene una composición de polifenoles bastante
similares han había planteado la atención para la investigación.
2. Química y la biosíntesis de polifenoles
Los compuestos fenólicos o polifenoles constituyen uno de los más numerosos y
ampliamente distribuida grupos de sustancias en el reino vegetal, con más de 8.000
estructuras fenólicas actualmente conocidos (Bravo, 1998 ).
Los polifenoles son productos del metabolismo secundario de las plantas. Surgen
biogenéticamente a partir de dos principales rutas sintéticas principales: la vía de
shikimato y la vía de etilo ( Bravo, 1998 ). Tanto el ácido acético y el ácido shikímico se
derivan del metabolismo de la glucosa ( 18 y 82 ). El ácido acético en su forma activa
acetil-CoA reductasa o más adelante en la vía como malonil-CoA es el punto de partida
de la síntesis de ácidos grasos en una vía primaria, pero es también el punto de partida
en un camino secundario de la síntesis del anillo A de los flavonoides . Productos de la
vía de shikimato primaria son los aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina), pero
su degradación conduce también en la vía fenilpropanoide considerada como una vía
secundaria. Sin embargo, la vía fenilpropanoide es presente de forma ubicua en las
plantas superiores que forman el núcleo de una serie de vías relacionadas que
conducen a diversos productos incluyendo flavonoides y stilbens. La vía de
fenilpropanoides parece esencial para la supervivencia de las plantas terrestres que
proporcionan componentes de las plantas tales como la lignina con su función
mecánica y estructural importante. Además, los compuestos derivados de
fenilpropanoides tienen distintas funciones en la fisiología de las plantas (por ejemplo,
como compuestos de señalización dentro de la planta y, como factores que controlan la
esterilidad masculina y la regulación de la actividad hormonal) y sus interrelaciones
con otros organismos (por ejemplo, como compuestos de defensa contra
microorganismos y compuestos entre plantas y otros organismos de señalización)
( Rhodes, 1998 ). La acumulación de compuestos derivados de la ruta de los
fenilpropanoides se controla de una manera sensible al entorno de la planta que
implica una jerarquía de los controles en el nivel y la regulación de un conjunto muy
específico de proteínas enzimáticas genómico. Por otra parte, un compartition espacial
permite una serie de vías paralelas que conducen a productos específicos y para
diferentes sistemas de regulación para operar. Por lo tanto, la distinción que se dibuja
entre un metabolismo primario y secundario es algo arbitrario y Rodas (1998) sugirió
que pensar en términos de un metabolismo integrado que es único y característico en
las plantas.
Los polifenoles se pueden dividir en al menos 10 clases diferentes en función de su
estructura básica. Tabla 1 ilustra la estructura química básica de los principales
compuestos polifenólicos.
Tabla 1. Principales tipos de compuestos polifenólicos ( Bravo, 1998 )
Clase Esqueleto básico
Estructura básica
Fenoles simples
C 6
Clase Esqueleto básico
Estructura básica
Benzoquinonas
C 6
Los ácidos fenólicos
C 6 -C 1
Acetofenonas
C 6 -C 2
Los ácidos fenilacético
C 6 -C 2
Clase Esqueleto básico
Estructura básica
Ácidos Hydoxycinnamic
C 6 -C 3
Phenylpropenes
C 6 -C 3
Cumarinas, isocoumarines
C 6 -C 3
Cromonas C 6 -C 3
Clase Esqueleto básico
Estructura básica
Naftoquinonas
C 6 -C 4
Xantonas C 6 -C 1 -C6
Clase Esqueleto básico
Estructura básica
Estilbenos C 6 -C 2 -C6
Antraquinonas
C 6 -C 2 -C6
Los flavonoides
C 6 -C 3 -C6
Clase Esqueleto básico
Estructura básica
Lignanos, neolignanos
(C 6 -C 3 )2
Las ligninas
(C 6 -C 3 )n
Opciones de tabla
Los flavonoides, que constituyen el grupo más importante, pueden ser divididos en 13
clases, con más de 5.000 compuestos descritos en 1990 ( Tabla 2 ).
Tabla 2. Clasificación de los flavonoides alimenticios ( Bravo, 1998 )
Flavonoides Estructura básica
Chalconas
Dihidrocalconas
Aurones
Flavonoides Estructura básica
Flavonas
Flavonoides Estructura básica
Los flavonoles
Flavonoides Estructura básica
Dihidroflavonoles
Flavonoides Estructura básica
Flavanones
Los flavanoles
Flavonoides Estructura básica
Flavandiol orleucoanthocyanidin
Flavonoides Estructura básica
Antocianidina
Isoflavonoides
Biflavonoides
Proantocianidinas taninos orcondensed
Opciones de tabla
Su estructura común es el de diphenylpropanes (C 6 -C 3 -C 6 ) y consta de dos anillos
aromáticos unidos a través de tres carbonos que suelen formar un heterociclo
oxigenado ( . Fig. 1 ).
. Figura 1. Estructura básica y el sistema de numeración de los flavonoides.
Opciones Figura
Como se mencionó anteriormente, el anillo A es biosintetizado por la condensación de
tres moles de malonil-CoA derivados del metabolismo de la glucosa. Los anillos C y B
también se derivan de mecanismo de glucosa por medio de la vía de shikimato y la vía
fenilpropanoide, respectivamente, para producir C-9 ácidos (por ejemplo, ácido
cinámico, ácido hidroxicinámico, y ácido cumárico). Como CoA derivados de estos
ácidos C-9 se condensan con el producto C-6 a partir de malonato para formar una C-
15 chalcona. Cierre del anillo subsiguiente hidratación y da lugar a los diversos
flavonoides ( Formica y Regelson, 1995 ).
En resumen, la figura. 2 muestra una representación de la biosíntesis de flavonoides de
acuerdo con 18 , 71 ,70 y 82 .
. Figura 2. Esquema de la estructura de la biosíntesis de los flavonoides y las interconexiones.
Opciones Figura
Junto con fenilpropanoides o derivados de ácidos hidroxicinámicos, flavonoles y en
menor grado flavonas se encuentran en casi todas las plantas. Mientras flavanonas y
flavonas se encuentran a menudo juntos (por ejemplo, en las frutas cítricas) y están
conectados por enzimas específicas, hay una cierta exclusión mutua entre flavonas y
flavonoles en muchas familias de plantas y antocianinas son casi ausente en las
plantas flavanona-ricos ( Rice-Evans et al., 1996 ).
Los flavonoides se presentan ocasionalmente en plantas como agliconas, aunque se
encuentra más comúnmente como derivados glucósidos ( 10 y 85 ). El sitio de
glicosilación preferida es la posición 3 y con menos frecuencia la posición 7. La glucosa
es el residuo más habitual de azúcar, pero otros incluyen galactosa, ramnosa, y xilosa
( Rice-Evans et al., 1996 ).
Además, las diferencias individuales dentro de cada grupo de flavonoides resultado de
la variación en el número y la disposición de los grupos hidroxilo con el que ocurre más
comúnmente siendo aquellos con dihidroxilación en las posiciones 3 'y 4' ( Rice-Evans
et al., 1996 ).
Los flavonoides, en especial la flavan-3-oles catequina, epicatequina, galocatequina,
epigalocatequina, y son los constituyentes monoméricos de los taninos condensados,
aunque también son muy comunes como monómeros libres ( 10 , 32 y 38 ).
Las antocianinas son el grupo más importante de pigmentos vegetales solubles en
agua y son responsables para el color de las flores y los frutos de las plantas
superiores. El término antocianina se refiere a los glucósidos de antocianidinas (por
ejemplo malvidina, cianidina). Las antocianinas y pigmentos poliméricos formados a
partir de antocianinas por condensación con otros flavonoides son responsables para el
color de vino tinto ( Bravo, 1998 ).
A diferencia de los grupos descritos anteriormente de compuestos fenólicos vegetales,
taninos son compuestos de intermedio a alto peso molecular. Taninos con una masa
molecular de hasta 30.000 Da se han encontrado en las vainas de algarrobo. Los
taninos son moléculas altamente hidroxilados y pueden formar complejos insolubles
con los hidratos de carbono y proteínas. Esta función de los taninos de plantas es
responsable de la astringencia de los alimentos ricos en taninos, debido a la
precipitación de las proteínas salivales. El término "tanino" se deriva de la capacidad
de bronceado de estos compuestos en la transformación de las pieles de animales en
el cuero mediante la formación de complejos estables tanino-proteína con colágeno de
la piel ( 10 , 31 , 50 y 49 ).
Taninos vegetales se pueden subdividir en dos grandes grupos: taninos hidrolizables y
condensados.Taninos hidrolizables consisten de ácido gálico y su producto de
condensación dimérica, ácido hexahydroxydiphenic, esterificados con un poliol, que es
principalmente glucosa. Como su nombre lo indica, estos taninos son fácilmente
hidrolizados con ácido, álcali, y el agua caliente y por la acción enzimática ceder a
alcohol polivalente y ácido phenylcarboxic ( 10 y 31 ).
Taninos condensados o proantocianidinas son polímeros de alto peso molecular. La
unidad monomérica es un flavan-3-ol (por ejemplo, catequina, epicatequina y), con una
molécula de flavan-3 ,4-diol o leucoanthocyanidin como su precursor. Condensación
oxidativa se produce entre el carbono C-4 del heterociclo y átomos de carbono C-6 o C-
8 de las unidades adyacentes. La mayor parte de la literatura sobre el contenido de
tanino condensado se refiere sólo a las proantocianidinas oligoméricas (dímeros,
trímeros, y tetrámeros), debido a la dificultad en el análisis de moléculas altamente
polimerizados. Las proantocianidinas, sin embargo, pueden ocurrir como polímeros con
un grado de polimerización de 50 años y más. Auto-polimerización oxidativa o
enzimática de unidades flavan-3-ol y flavan-3 ,4-diol se han sugerido como el proceso
que conduce a la formación de taninos condensados ( 10 , 31 , 38 y 75 ).
Vínculos Interflavanoid son lábiles ácidos y ceden a antocianidinas durante la hidrólisis
ácida en soluciones alcohólicas (por ejemplo, ácido clorhídrico-butanol). Esta reacción
se utiliza para la determinación de las moléculas de proantocianidina. Si las sub-
unidades constan sólo de catequina y epicatequina, cianidina es el producto resultante
de la hidrólisis. Esos proantocianidinas son entonces llamados procianidinas
específicamente, sin embargo, esta diferenciación no es seguida constantemente en la
literatura.Sustancias flobafeno-como también se forman cuando catequinas
condensados se calientan en soluciones de ácido minerales de la polimerización
adicional de estos compuestos ( 10 , 15 , 61 , 68 , 73 y 75 ).
Proantocianidinas oligoméricas son solubles en diferentes disolventes acuosos y
orgánicos, tales como acetona y metanol. Sin embargo, taninos condensados de alto
peso molecular son insolubles. Además, cuando taninos forman complejos con
proteínas o polisacáridos de la pared celular, que permanecen insolubles. Esta
insolubilidad es responsable de errores significativos en la cuantificación del contenido
de polifenoles de las plantas, porque por lo general polifenoles se analizaron en los
extractos, a menudo omitiendo la cuantificación de taninos insolubles o no extraíble
( Bravo, 1998 ).
3. Los polifenoles del cacao: alteraciones en la composición y la
cantidad de grano de cacao al chocolate - estado del conocimiento
3.1. El grano de cacao
Los granos de cacao se obtienen de los árboles de cacao, que se encuentran en climas
cálidos y húmedos en las zonas alrededor de 20 ° de latitud norte y al sur del
ecuador. En general, las semillas del Theobroma cacao (del orden Sterculiacae ) son
conocidos principalmente en dos variedades: Criollo y Forastero, con Forastero dividen
en varias subvariedades. Un tercer grupo se llama Trinitario, es esencialmente una
mezcla entre Criollo y Forastero y no se encuentra en la naturaleza. El grano de cacao
se compone de una porción de punta interior cubierto por una capa exterior
( 43 y 55 ).
Los polifenoles en granos de cacao se almacenan en las células de pigmento de los
cotiledones.Dependiendo de la cantidad de antocianinas las células de pigmento,
también llamadas células polifenoles de almacenamiento, son de color blanco a purpur
profundo. Tres grupos de polifenoles se pueden distinguir: catequinas, o flavan-3-oles
(ca. 37%), antocianinas (aprox. 4%) y proantocianidinas (ca. 58%). La catequina
principal es (-)-epicatequina con un máximo de 35% de contenido de polifenoles. En un
estudio ( Kim y Keeney, 1984 ) los (-)-epicatequina contenido oscilaron desde 34,65
hasta 43,27 mg por g de muestra desengrasada en recién cosechado Catongo y granos
de cacao Forastero. En cantidades más pequeñas, (+)-catequina, así como trazas de
(+)-galocatequina y (-)-epigalocatequina se han encontrado. La fracción de antocianina
se compone principalmente de cianidina-3-α- L -arabinosid y cianidina-3-β- D -
galactosid. Las procianidinas son en su mayoría flavan-3 ,4-dioles, que son 4 → 8 o 4 →
6 unido a dímeros, trímeros condensados u oligómeros de epicatequina como la
extensión principal sub-unidad ( 6 y 75 ).
La cantidad total de polifenoles solubles en la masa seca libre de grasa de los granos
de cacao frescos es de 15 a 20% (equivale a aprox. 6% en los granos de cacao secados
al aire, que contiene 54% de grasa y 6% de agua), en los granos fermentados
aprox. 5% (10% y más que se considera un signo de una mala fermentación). Estos
valores son válidos para los granos Forastero, criollo granos de cacao tienen aprox.2/3
de la cantidad de polifenoles, no se ha encontrado que las antocianinas ( Lange &
Fincke, 1970 ).
En resumen, los diferentes polifenoles que han sido identificados en los granos de
cacao o cacao-productos se enumeran a continuación
( 32 , 38 , 39 , 60 , 67 , 73 , 75 y 80 ):
3.1.1. Las catequinas
•
(-)-Epicatequina
•
(+)-Catequina
•
(+)-Galocatequina
•
(-)-Epigalocatequina
3.1.2. Las procianidinas
•
procianidina B1 = epicatequina-(4β → 8)-catequina
•
procianidina B2 = epicatequina-(4β → 8)-epicatequina
•
procianidina B3 = catequina-(4α → 8)-catequina
•
procianidina B4 = catequina-(4α → 8)-epicatequina
•
B5 procianidina = epicatequina-(4β → 6)-epicatequina
•
procianidina C1 = epicatequina-(4β → 8)-epicatequina-(4β → 8)-epicatequina
•
procyanidin D = epicatequina-(4β → 8) - epicatequina-(4β → 8)-epicatequina-(4β
→ 8)-epicatequina
•
mayor oligo-y polímeros, en su mayoría homólogos de epicatequina con 2 a 18
unidades monoméricas
3.1.3. Las antocianinas
•
cianidina-3-α- L -arabinosid
•
cianidina-3-β- D -galactosid
3.1.4. Glucósidos de flavonol
•
quercetina-3- O -α- D -arabinosid
•
quercetina-3- O -β- D -glucopuranosid
3.1.5. Otros
•
clovamide
•
dideoxyclovamide
3.2. Proceso de cacao en los países de origen: el efecto de la fermentación y el
secado sobre el contenido y la composición de polifenoles
La correcta fermentación y secado de los granos de cacao es esencial para el
desarrollo de sabores adecuados y / o precursores del sabor. Después de que las
vainas se cortan de los árboles, los frijoles con la pulpa adherida se retiran y se
transfirieron a montones, cajas o cestas para la fermentación tenga lugar. La
fermentación dura entre 5 y 6 días con granos Forastero teniendo lugar más de
Criollo. Durante el primer día de la pulpa adherida convierte en líquido y se escurre,
con el aumento de la temperatura constante. Bajo condiciones anaeróbicas, los
microorganismos producen ácido acético y etanol. Estos procesos inhiben la
germinación de las semillas y contribuyen a los cambios estructurales en los granos
fermentados, tales como la eliminación de la compartimentación de las enzimas y
sustratos. Líquidos celulares se mueven por las paredes celulares y se distribuyen por
todo el cacao en grano. Esto ocurre generalmente después de 24-48 h de grano de
fermentación. Al tercer día de la masa de granos se han calentado de manera bastante
uniforme a 45 ° C y se mantendrá entre esta temperatura y 50 ° C hasta que la
fermentación se ha completado. Es necesario mezclar los granos de vez en cuando
para la aireación y para asegurar que los que están siendo inicialmente en el exterior
de la pila están expuestos a la temperatura en el interior ( 38 , 39 y 43 ).
Después de la fermentación, los granos se colocan en bandejas poco profundas que se
seque. En algunas zonas de cultivo, donde la cosecha principal coincide con la estación
seca, secado al sol es la adecuada. En las zonas donde la lluvia y la humedad no
permiten el secado al sol, secado artificial sea necesario ( 39 y 55).
Después de la fermentación y el secado, los granos de cacao deben tener un contenido
de humedad de aprox. 5-7%. Esto es de gran importancia para un almacenamiento y
transporte como por encima de un contenido de humedad crítico de 8% correcta,
moldes son propensos a desarrollar ( 38 y 39 ).
Durante la fermentación de los granos de cacao, los polifenoles se difunden con
líquidos celulares de sus celdas de almacenamiento y se someten a la oxidación de
taninos condensados moleculares altos mayormente insolubles. Estas reacciones son
tanto no enzimática y catalizada por la enzima polifenol oxidasa, a pesar de que esta
enzima está fuertemente inactiva durante los primeros días de fermentación,
permaneciendo sólo el 50 y el 6% de la actividad enzimática después de 1 y 2 días,
respectivamente (Hansen, del Olmo y Burri, 1998 ). La aparición de reacciones de
condensación se confirmó por la fuerte disminución del contenido de epicatequina
entre el segundo y tercer día de la fermentación. Epicatequina y contenido de
polifenoles solubles, respectivamente, se reduce a aprox. 10 a 20% durante la
fermentación.Esto no es sólo debido al proceso de oxidación, pero también causada
por la difusión de los polifenoles en exudaciones de fermentación
( 8 , 9 , 27 , 32 y 39 ).
La polifenol oxidasa también es sensible al secado de manera que la actividad
enzimática restante después de la fermentación y el secado de los granos es sólo
alrededor de 2%. Se cree también que la oxidación no enzimática de los polifenoles
puede ser importante durante el proceso de secado ( Hansen et al., 1998 ).
Se ha demostrado que los 2 días de sol-secado de los granos de cacao frescos no
fermentados por sí solos (sin fermentación) provoca una disminución del 50% en el
contenido de epicatequina (ca. 22 en lugar de aprox. 40 mg / g de muestra
desgrasada). Por lo tanto, para investigar el contenido de epicatequina de granos de
cacao frescos, éstos tenían que ser liofilizado inmediatamente después de la
eliminación de las vainas. La mayoría de los granos para la producción de chocolate se
fermentan, sin embargo, está lejos de ser un proceso estandarizado en todo el mundo,
o incluso dentro de una misma región. Esto se evidencia por una variación de 6 veces
en la concentración de epicatequina 10 muestras de granos de cacao fermentados de
diferentes regiones (véase la Tabla 3 ) ( Kim y Keeney, 1984 ).
Tabla 3. Concentración de (-)-epicatequina en los granos de cacao fermentados de envíos que
representan varios países de producción de un (mg / g) ( Kim y Keeney, 1984 )
Fuente de frijol (-)-Epicatequina en la muestra desgrasada
Costa de Marfil 6.22
Maracaibo (Venezuela)
3.62
Samoa 10.64
Trinidad 4.68
Bahía (Brasil) 8.23
Ghana 4.52
Lagos (Nigeria) 4.68
Costa Rica 16.52
Arriba (Ecuador) 8.08
Jamaica 2.66
un
Los resultados son valores medios de inyecciones duplicadas de un solo extracto.
Opciones de tabla
Durante el proceso de fermentación, las antocianinas son hidrolizados a
antocianidinas. Los últimos compuestos se polimerizan junto con catequinas simples
para formar taninos complejos. Las antocianinas suelen desaparecer rápidamente
durante el proceso de fermentación (93% de pérdida después de 4 días).Por lo tanto, el
contenido de antocianina se ha considerado como un buen índice para la
determinación del grado de fermentación de granos de cacao ( 43 , 64 y 85 ).
En una solicitud de patente reciente, se ha demostrado que los niveles de
procianidinas para disminuir 3 - a 5 veces durante la fermentación (ver Tabla 4 )).. Hay
una correlación negativa del contenido de procianidina con el grado de fermentación y
el cambio de color de púrpura a pizarroso más de granos de café ( Kealey et al., 1998 ).
Tabla 4. niveles Procianidina ppm (mg / g) en muestras de granos de cacao desgrasados ( T.
cacao , SIAL 659) con diversos grados de fermentación ( Kealey et al., 1998 )
Las horas de fermentación
Monómero
Dimer
Trimer
Tetramer
Pentámera
Hexamer
Heptámero
Octamer
Nonamer
Decámero
Undecamer
Total
0 21929 10072
10196
7788 5311 3242 1311 626 422 146 Tr. un 60753
24 21088 9762
9119
7064 4744 2906 1364 608 361 176 Tr. 57252
48 20887 9892
9474
7337 4906 2929 1334 692 412 302 Tr. 58165
96 9552 5780
5062
3360 2140 1160 464 254 138 Tr. ND b 27910
120 8581 4665
4070
2527 1628 888 326 166 123 Tr. ND 22974
un
Tr., Huellas.
b
ND, no detectado.
Opciones de tabla
3.3. Proceso de cacao para la fabricación de chocolate en los países usuarios:
Efecto del tostado, semilla-en grano, alcalinizantes y conchado
El primer proceso en los países usuarios que deben preceder a la fabricación de
chocolate o cacao es el de limpieza prima-frijol. El mecanismo consiste en una serie de
operaciones, que elimina de la fibra (a partir de los sacos de yute), agrupaciones de
frijol piedras y arena, de metal, y los inmaduros ( Minifie, 1989 ).
Tostado de todo el grano o semilla es un paso esencial en la fabricación de licor de
chocolate o sólidos de cacao desgrasada parcialmente. Los granos de cacao se tuestan
para desarrollar aún más el sabor del chocolate, ya que debe existir en la forma de
precursores derivados de la fermentación correcta y el secado de los granos
originales. Todo el grano tostado también afloja la carcasa de modo que se puede
retirar fácilmente durante el proceso de eliminación. El grado de tostación de cacao es
una relación dependiente del tiempo / temperatura, donde el tiempo puede variar de 5
a 120 minutos y la temperatura de grano entero típicamente puede variar desde 120
hasta 150 º C. Asados de menor temperatura son habituales para la leche-chocolate y
para algunos chocolates oscuros. En el pre-tostado de los granos enteros, un paso
inicial de calentamiento se puede realizar a justo por debajo de 100 ° C, seguido de
calcinación de las puntas a temperaturas elevadas de hasta aproximadamente 130 °
C. Otras calor tratamientos previos para aflojar la cáscara puede ser un choque térmico
de los granos dadas por aire caliente, vapor o calor infrarrojo ( 38 , 43 y 55 ).
El siguiente paso en el procesamiento de cacao convencional implica punta de
rectificado. Semilla de molienda se lleva a cabo típicamente en dos etapas, una etapa
de trituración inicial para convertir las puntas de sólidos en una pasta fluida y una
etapa final de rectificado para lograr el tamaño de partícula deseado.Durante la
molienda, la punta es de tierra, por ejemplo mediante molienda, en un fluido, de color
marrón oscuro "licor". La fluidez se debe a la ruptura de las paredes celulares y la
liberación de la manteca de cacao durante el procesamiento ( 38 , 43 y 55 ).
Otros de tratamiento de cacao convencional incluye la separación de la manteca de
cacao del licor por cualquiera de prensas hidráulicas o prensas de tornillo. Para la
fabricación de chocolate esto tiene importancia para la manteca de cacao que se
añade al mezclar todos los ingredientes de chocolate y / o en el final del proceso de
conchado (descrito más adelante) ( 38 , 43 y 55 ).
Otro paso puede implicar alcalinizante de los granos, licor, puntas, o polvo con
soluciones o suspensiones de álcali, principalmente para cambiar el color. La
alcalinización también afecta sabor, pero es dudoso si hay alguna mejora. Sin
embargo, no alcalinizante es un paso indispensable en la fabricación de chocolate,
pero más común para otros productos de cacao tales como cacao en polvo, bebidas de
cacao oscuros o como un ingrediente en un revestimiento o una galleta ( 43 y 55 ).
Los ingredientes básicos requeridos para la producción de chocolate son semillas de
cacao, licor de cacao, azúcar, otros edulcorantes, manteca de cacao, grasa de
mantequilla (aceite), leche en polvo, leche miga, y emulsionantes. Estos ingredientes
tienen que ser primero mezclado de forma continua o en las mezcladoras por lote. Esto
debería producir una pasta de chocolate de textura algo rugosa y consistencia plástica
(Minifie, 1989 ).
El refinado de pasta de chocolate como el próximo paso es una operación importante y
produce la suave textura de deseable en chocolate pastelería moderna. Hoy en día, la
refinación se lleva a cabo en los sistemas de refinado de varios pasos usando
refinadores rollo. En las refinerías modernas, la presión entre los rodillos se controla y
cada rollo se enfría internamente de modo que la temperatura deseada se puede
lograr. Las temperaturas en los rollos por lo general varían de 25 a 50 ° C
( 38 , 43 y 55 ).
La pasta de chocolate refinado se almacena durante 24 horas a 45-50 ° C
("maduración"), para conseguir una textura pastosa. Se puede usar como chocolate del
panadero, pero para conchado chocolate fino se requiere ( Minifie, 1989 ).
Conching puede ser considerado como el último proceso en la fabricación del chocolate
a granel, si el chocolate negro o con leche. Sin duda, es un proceso esencial para el
desarrollo de la textura final y el sabor.Por lo general es un proceso de dos pasos con
la primera para reducir la humedad, expulsar las sustancias volátiles, y distribuir la
grasa igualmente de manera que todas las partículas se dispersan en una fase grasa
continua. En el segundo paso, se añade manteca de cacao y, finalmente, la lecitina
para obtener una pasta homogeneizada líquido. Las condiciones de tiempo /
temperatura durante el conchado pueden variar en cierta medida para el tipo de
chocolate para ser procesado. Con miga de chocolate con leche 10 a 16 horas a 49-52
° C con frecuencia se puede utilizar, 16-24 horas a 60 ° C es más probable con
chocolates de leche en polvo y el chocolate oscuro es conched generalmente a
temperaturas más altas, 70 ° C, a veces hasta 82 ° C ( 38 , 43 y 55 ).
Conchado condiciones pueden ser modificados (abreviado) mediante el tratamiento
previo del licor de chocolate, por ejemplo, tratamiento térmico (temperaturas por
encima de 100 ° C) como una película delgada ( Minifie, 1989 ).
Antes del vertido en las formas, la pasta de chocolate tiene que ser enfriado a 10 ° C y
recalentados varias veces a 29-31 ° C para una buena cristalización ( 43 y 55 ).
La alteración en el contenido y la composición de compuestos polifenólicos en el
proceso de fabricación de chocolate, preferibles durante la tostación, molienda,
refinado, conchado y donde más bien altas temperaturas se logran y el aire (oxígeno)
está presente debe ser anticipado debido a la alta actividad redox de polifenoles . Sin
embargo, el conocimiento de estos cambios es limitada.
Sólo en una solicitud de patente ( Kealey et al., 1998 ) tiene tales cambios han
divulgado en relación con los parámetros del proceso. Generalmente, las temperaturas
de tratamiento más altas y / o más largos tiempos de procesamiento reducen la
cantidad de polifenoles disponibles en los componentes de cacao. Si un paso
alcalinizante está presente en el proceso, esto también conduce a una disminución
notable en el contenido de polifenol.
Para estudiar los cambios en la composición y la cantidad de polifenoles, en virtud de
los granos de cacao fermentado-habían sido asados a tres temperaturas diferentes
para asar (127, 159, y 181 ° C) y posteriormente molida en dos pasos en licor de
chocolate. Los cambios que se encuentran en el contenido total de polifenoles y de un
pentámero de procianidina en relación con las temperaturas de calcinación o la
temperatura interna del grano (IBT), respectivamente, y la molienda se enumeran en la
Tabla 5 .
Tabla 5. Sub-fermentado resultados del proceso de frijol ( Kealey et al., 1998 )
Temperatura del producto
Contenido pentámera de peso total (g / g)
Procyanidin total de peso total (g / g)
127 ° C puntas asadas
119 ° C, IBT un 1953 24618
Licor Finalizado 82-95 ° C 1943 23710
159 ° C puntas asadas
142 ° C, IBT 810 21234
Licor Finalizado 59-92 ° C 727 16826
181 ° C puntas asadas
162 ° C, IBT 425 12786
Licor Finalizado 59-83 ° C 408 11656
un
IBT, la temperatura interna del grano.
Opciones de tabla
A medida que la temperatura de calcinación se aumenta desde 127 hasta 181 ° C, el
nivel de polifenoles totales disminuye desde 24.618 a 12.786 g / g, y la del pentámero
procianidina 1953 a 425 mg / g.Disminuciones similares en polifenoles y pentámero
contenido se logran mediante un aparato de calentamiento de infrarrojos con el fin de
calentar los granos enteros y aflojar la cáscara de la semilla. En consecuencia, la
temperatura es un factor importante en la retención de los polifenoles del cacao,
especialmente los oligómeros superiores ( Kealey et al. 1998 ).
Puesto que es un objetivo de la invención es proporcionar métodos de selección y / o el
procesamiento de los granos de cacao para la producción de componentes de cacao o
chocolate, respectivamente, que tienen mayores niveles de polifenoles de cacao,
existe muy poca información sobre el contenido de polifenoles de fabricación de
chocolate convencional. Una realización de la invención se refiere a un "estándar de
identidad" chocolate negro que comprende al menos 3600 g (hasta más de 8000 g)
polifenoles de cacao por gramo de chocolate. Otra realización se refiere a un "estándar
de identidad" chocolate con leche que comprende al menos 1000 g (hasta más de
5000 g) por gramo de chocolate con leche. Por lo tanto, se puede sugerir como se ha
determinado anteriormente que la "norma de identidad" convencional oscuro y
chocolate con leche tiene niveles por debajo de 3.600 y 1.000 mu g,
respectivamente. Niveles similares de chocolate negro han sido encontrados
por Waterhouse, Sirley y Donovan (1996) , donde la cantidad de polifenoles totales,
medidos por el método Folin (descrito más adelante) da como equivalentes de ácido
gálico (GAE), fue de 5 mg / g es igual a 205 mg polifenoles en una g (1,5 oz) trozo de
chocolate 41. Estos valores ligeramente más altos podrían ser debido a los diferentes
métodos utilizados para analizar el contenido de polifenoles totales. En la solicitud de
patente ( Kealey et al., 1998 ) sólo monomérica y oligomérica flavan-3-oles se
describen, el resultado dado por peso, mientras que el método de Folin-mide todos los
polifenoles dan como equivalentes de una curva patrón obtenida con ácido gálico.
Principalmente el camino por el cual se conserva un alto contenido de polifenoles de
cacao en los componentes de cacao o chocolate es por la elección de los granos de
cacao ricos en polifenoles, el uso de menores de los granos fermentados, y reducir el
tiempo y / o la temperatura de tratamiento térmico, por ejemplo, en el tostado o el
calor tratamiento de licor de cacao. Sin embargo, el contenido de polifenoles más alta
se asocia típicamente con un amargo, sabor astringente. Varios métodos se presentan
para reducir la, nota amargo y astringente, tales como aditivos de sabor, sólidos de
leche en una cantidad mayor que 12% en peso de chocolates de leche, y diversas
variaciones en el procesamiento del chocolate. Por ejemplo, se han utilizado al menos
dos licores de chocolate con distintos niveles de polifenoles del cacao. Los que tienen
un contenido de polifenoles inferior se someten a una temperatura más alta, mientras
que los que tienen un mayor contenido de polifenoles a una temperatura más baja
para conservar el contenido de polifenoles elevada. Posteriormente los dos licores se
combinan para su transformación en el producto de chocolate final ( Kealey et al.
1998 ).
4. Metodología disponible para el análisis, aislamiento, purificación, e
identificación
La metodología aplicada para el estudio de los flavonoides depende en cierta medida
de la finalidad de la investigación. Esto puede ser (1) para cribar una cierta grupo de
plantas para la presencia de flavonoides; (2) para aislar los flavonoides de una planta
que se sabe que contiene este tipo de sustancia; (3) para determinar la concentración
de un determinado flavonoide en un en particular planta, o (4) para identificar un
flavonoide aislado y purificado ( Markham y Bloor, 1998 ).
Para la cuantificación aproximada de polifenoles métodos colorimétricos son
ampliamente utilizados principalmente debido a su simplicidad y alta
sensibilidad. Estos incluyen el método de Folin-Ciocalteu y métodos de Prusia-azules
para polifenoles totales, el ensayo de la vainillina-HCl de catequinas y el ensayo de
butanol-HCl para proantocianidinas ( 45 , 49 , 51 y 53 ).
Las capacidades de precipitación de proteína de taninos tienen relevancia para los
aspectos sensoriales, la fisiología nutricional (por ejemplo, la biodisponibilidad de los
macronutrientes tales como proteínas y polisacáridos y micronutrientes tales como el
hierro y otros elementos traza), y procesamiento de alimentos.Por lo tanto, se han
desarrollado métodos para determinar el porcentaje de taninos y no taninos,
respectivamente, por los llamados métodos de precipitación de
proteínas. Principalmente, se añadió albúmina de suero bovino (BSA) o gelatina a un
extracto de polifenoles de crudo para producir una precipitación tanino-
proteína. Entonces, o la proteína restante en el supernatate o la proteína de la
precipitación después de resolubilización se determina por el método de la ninhidrina
( 50 y 49 ).
En ambos casos, se requiere un procedimiento de extracción de polifenoles, y por lo
tanto, los resultados dependen mucho del disolvente de extracción y
procedimiento. Por otra parte, una curva estándar con ácido gálico o catequina es
común para los métodos colorimétricos. Por lo tanto, los resultados sólo se pueden dar
como equivalentes de las normas y los resultados son bastante inespecífica para los
tipos de flavonoides presentes ( Makkar, 1989 ).
Resultados más específicos y hoy en día se utilizan más comúnmente son las técnicas
cromatográficas, como la cromatografía de capa fina (TLC) y la cromatografía líquida
de alta resolución (HPLC), y más recientemente la electroforesis capilar (CE). Estas
técnicas se pueden aplicar para el análisis cualitativo y cuantitativo, así como para los
procedimientos de aislamiento y purificación.
La cromatografía en columna (CC) sobre Sephadex LH-20 se utiliza con frecuencia para
la purificación final, ya que da soluciones libres de residuos para el análisis estructural
por la degradación o técnicas instrumentales, tales como la espectrometría de masas
(MS) y resonancia magnética nuclear (RMN).
En general, los pasos que tienen que ser trabajado a través se indican a continuación
( Fig. 3. ) ( 22 , 45 , 49 ,51 y 53 ):
. Figura 3. Esquema del procedimiento general para ser trabajado a través de análisis,
cuantificación, aislamiento y elucidación estructural de los polifenoles en los alimentos.
Opciones Figura
4.1. Preparación de la muestra
Dado que algunos flavonoides son inestables, como en el caso de polifenoles de cacao
antocianinas y procianidinas, se requiere un cuidado durante el almacenamiento y
preparación de la muestra. Si cuantificación es el objetivo del análisis subsiguiente, la
congelación, la congelación a presión más preferible en nitrógeno líquido es
aconsejable ( 22 y 51 ).
El primer paso en el análisis es para aplastar, moler o molino de alimentos crudos (por
ejemplo, granos de cacao), o para mezclar u homogeneizar alimentos procesados (por
ejemplo, chocolate) con el fin de permitir un mejor contacto del disolvente de
extracción con la muestra y para asegurar que el porción extraída es representativa de
toda la muestra. Dado que muchos polifenoles se producen en forma ligada como
glicósidos o ésteres, la preparación de la muestra puede incluir la hidrólisis alcalina o
ácida de compuestos fenólicos enlazados libres antes o después de la etapa de
extracción con disolvente. Sin embargo, se omite la etapa de hidrólisis, si se desea la
medición de compuestos fenólicos en las formas unidas. Por otra parte, las
procianidinas pueden someterse a hidrólisis parcial ( 22 , 45 , 51 y 53 ).
4.2. Procedimiento de extracción
Para los polifenoles del cacao, metanol acuoso al 70-80% o acetona acuosa al 70% o
combinaciones de los mismos son los más utilizados para la extracción. El agua y el
etanol también se han utilizado, sin embargo, procianidinas oligoméricas se extraen
sólo parcialmente, polímeros de alto peso molecular no se extraen en absoluto
( 22 y 45 ).
Después de una extracción exhaustiva para un componente menor, los componentes
pueden estar presentes en un nivel muy diluida. La concentración se realiza casi
siempre a bajas temperaturas (por debajo de 40 ° C) y bajo presión reducida para
reducir al mínimo la degradación de los componentes. En esta etapa los analitos
arriesgan a ser oxidado ( Lee & Widmer, 1996 ).
Ejemplos de procedimientos de limpieza generalmente se utilizan a los extractos de
limpiar-up antes de continuar con el análisis por HPLC (o CE). La etapa de limpieza es
una parte crítica de un método, la eliminación de componentes interferentes
potenciales (por ejemplo, teobromina y la cafeína en el caso de cacao) y
necesariamente varía según el tipo de matriz de los alimentos a analizar. Estos
incluyen partición líquido-líquido con un disolvente y cromatografía de columna no
miscible en Sephadex LH-20, poliamida, Amberlite XAD-2, HPLC preparativa, y
extracción en fase sólida (SPE), usando cartuchos desechables disponibles
comercialmente ( 22 y 51 ).
La eliminación de la teobromina y la cafeína por lo general puede ser llevada a cabo
por extracción con cloroformo o diclorometano, ya que la mayoría de los flavonoides
tienen una solubilidad muy limitada en estos disolventes. Los factores más importantes
a considerar en la selección del adsorbente de limpieza son la eficiencia, la
recuperación y la contaminación ( Lee & Widmer, 1996 ).
Sephadex LH-20 se utilizó con éxito para la purificación adicional de los flavonoides y
de HPLC semi-preparativa en fase ligada C18 antes de la HPLC analítica se puede
aplicar también. Desde la introducción de la extracción desechable fase sólida (SPE)
(cartuchos de pequeñas columnas de cromatografía empaquetadas) con envases HPLC,
SPE se ha convertido en el método preferido para la limpieza de los extractos crudos
antes del análisis. Toda la gama de polares y no polares fases estacionarias a base de
sílice en cartuchos pequeños está disponible comercialmente y SPE en fase ligada C18
se utiliza principalmente para el aislamiento de compuestos fenólicos, reemplazando el
uso de Sephadex para las etapas de purificación. Por preacondicionamiento el cartucho
C18 secuencialmente con neutro o ácido disolventes fraccionamiento de compuestos
fenólicos en ácido y grupos neutros pueden ser alcanzados así como la separación de
compuestos fenólicos por modificación adicional por eluyendo secuencialmente usando
diferentes efluentes ( 22 , 45 y 51 ).
4.3. Los métodos de análisis
Aunque otros métodos como métodos colorimétricos (véase más arriba), cromatografía
de papel (PC), la cromatografía en contracorriente (CCC) o la cromatografía de gases
(GC) se pueden utilizar principalmente el método más común es el HPLC debido a su
alta resolución, alta eficiencia, alta reproducibilidad, y el tiempo de análisis
relativamente corto y sin derivatización y sin restricciones en la volatilidad de la
muestra. HPLC también se acopla fácilmente a una variedad de detectores ( 45 y 51 ).
Por lo tanto en los métodos de HPLC se pondrá el énfasis principal. Sin embargo, el TLC
como un método de cribado y la electroforesis capilar se tomará una herramienta
prometedora en la consideración también.
4.3.1. Cromatografía en capa fina (TLC)
TLC se utiliza principalmente como una técnica analítica. Sus principales ventajas sobre
PC para este propósito son su velocidad y su versatilidad, resultante de la serie de
fases estacionarias disponibles. Estos incluyen alúmina, sílice, celulosa, poliamida,
sílice de fase inversa, etc Literalmente, hay una combinación adsorbente y disolvente
para adaptarse a todos los tipos imaginables de flavonoide. TLC se utiliza
especialmente para la detección de los extractos que contienen flavonoides o
fracciones de otras separaciones cromatográficas, por ejemplo, PC y CC, sino también
para el análisis cualitativo. Tabla 6muestra un rango seleccionado de combinaciones de
disolvente-adsorbentes que se han utilizado para procianidinas y / o de antocianinas
cacao en grano u otros productos con una composición de polifenoles similar
( 22 y 51 ).
Tabla 6. TLC combinaciones de polifenoles de cacao en grano y otras fuentes con una
composición de polifenoles similares
Fuente Fase estacionaria
Opciones de disolvente a Referencia
Granos de cacao Sílice / celulosa
TLC sobre gel de sílice usando: TAF (tolueno-acetona-ácido fórmico 03:06:01); 2-D TLC en celulosa: A: TBA ( t ácido-agua-butanol-acético 03:01:01) y B: 6 ácido acético%
Porter et al., 1991
Los granos de cacao (cotiledones)
Celulosa 2-D TLC: A: 5% de ácido acético; B: n ácido-agua-butanol-acético 04:01:05
Jalal y Collin, 1977
Fuente Fase estacionaria
Opciones de disolvente a Referencia
Las cerezas de café
Sílice Ácido tolueno-acetona-fórmico 06:06:01 Colmenarez et al., 1998
Corteza deGuazuma ulmifolia
Sílice / celulosa
1-D TLC sobre gel de sílice: ácido-agua-acetato de etilo fórmico 18:01:01, 2-D TLC de celulosa: A: 6% de ácido acético y B: ácido agua 2-butanol-ácido acético 14:01:05
Hoer, Rimpler y Heinrich, 1995
Bebidas, semillas de uva, almendras
Sílice / celulosa
El gel de sílice: ácido tolueno-acetona-acético 06:03:01; sobre la celulosa: ácido fórmico al 10%
Pascual-Teresa, Treutter, Rivas-Gonzalo y Santos-Buelga, 1998b
Uva y el vino Sílice 03:03:01 ácido tolueno-acetona-acético Sun, Leandro, Ricardo da Silva y Spranger, 1998
Flavan-3-oles (en general)
Celulosa 1-D TLC: 14:05:01 ácido acético-iso-butanol-agua o n -ácido acético-butanol-agua 04:05:01; 2-D TLC: A: 5% de ácido acético; B: n -butanol -acético-agua 04:01:05 ácido
Grayer, 1989
un
1-D TLC, la TLC unidimensional; 2-D TLC, la TLC de dos dimensiones.
Opciones de tabla
Al igual que con PC, manchas pueden ser visualizados utilizando una lámpara de
UV. Este es un método muy sensible, especialmente cuando se utiliza sílice
fluorescente UV. Uso de diversos reactivos de pulverización, tales como vainillina-HCl y
cloruro ferroso alcohólicas puede aumentar la sensibilidad de otros medios de
comunicación ( 22 y 51 ).
4.3.2. Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC)
HPLC se puede utilizar para la separación, la determinación cuantitativa, y la
identificación de los flavonoides. En la mayoría de los casos, los sistemas reportados
para la separación de compuestos fenólicos y sus glucósidos presentes en los
alimentos se llevaron a cabo por fase inversa (RP) cromatografía en columnas de fase
C18-unidas a base de sílice. El diámetro de partícula medio de HPLC envases es
típicamente 3-10 micras. Columnas de tamaño de partícula más pequeño por lo
general proporcionan un mayor número de placas por unidad de tiempo que las
columnas ver con el tamaño de partícula más grande. Sin embargo, columnas 3-m son
algo más difícil de trabajar y se tapan con más facilidad ( 22 , 45 , 51 y 53 ).
La mayoría de los sistemas de disolventes usados en HPLC analítica incluyen eluciones
binarios gradiente y, ocasionalmente, de elución isocrática. Gradiente o elución
isocrática utilizando disolventes de ácidos acético, fórmico acuoso, o fosfórico con
metanol (MeOH) o acetonitrilo (ACN) como modificador orgánico es común. La gama de
fuerza de disolvente utilizado en eluciones gradiente y el tiempo requerido para la
separación analítica depende del número y tipo de compuestos fenólicos en la
mezcla. A menudo las gradientes de varios pasos se emplean con mezclas
complejas. Isocrática métodos se pueden utilizar para los extractos o extractos crudos
que contengan sólo unos pocos componentes de polaridad similar (parcialmente
purificada 22 , 45 y 51 ).
La naturaleza del disolvente, tales como la resistencia a disolvente y la viscosidad del
modificador orgánico tiene una influencia importante en la separación cromática. ACN
se ha encontrado para dar una mejor resolución y dar picos mejores y más cortante
que resulta en mayor número de placa que hicieron MeOH.Sin embargo, MeOH puede
ser preferible a ACN debido a su naturaleza menos tóxica. Además, un mayor
porcentaje de disolvente orgánico se puede utilizar en la fase móvil para evitar el
deterioro de la columna de fase inversa. En algunos casos, la sustitución de MeOH con
tetrahidrofurano (THF), que tiene incluso mayor valor de intensidad de disolvente de
elución (fuerza elutropic) que tanto ACN y MeOH, resolución mejorada (Lee & Widmer,
1996 ).
El pH y la fuerza iónica de la fase móvil se sabe que influyen en la retención de los
compuestos fenólicos en la columna en función de la aparición de protonación,
disociación, o una disociación parcial. Un cambio en el pH que aumenta la ionización de
una muestra podría reducir la retención en una separación en fase inversa.Por lo tanto,
pequeñas cantidades de ácido acético (2-5%), fosfórico o ácido trifluoroacético (TFA)
(0,1%) se incluyen en el sistema de disolvente para suprimir la ionización de
compuestos fenólicos y grupos carboxílicos y por lo tanto mejorar la resolución y la
reproducibilidad de carreras. La elución de compuestos fenólicos de RP-HPLC es el fin
de la polaridad decreciente, por lo que los glucósidos son eluidos antes agliconas y
agliconas con grupos hidroxilo más antes de los que tienen menos ( 45 y 51 ).
Postcolumna técnicas de derivatización no se han utilizado mucho para la detección de
compuestos fenólicos, pero no es claramente un gran potencial en ella. Una aplicación
fue la detección de catequinas y proantocianidinas oligoméricas con 4-
dimetilaminocinamaldehido ( 53 , 62 y 89 ).
Rigaud et al. (1993) desarrolló un método HPLC usando una fase normal (NP) columna
de sílice y un gradiente de metanol en diclorometano con constante de 4% de la
mezcla de ácido fórmico-agua (01:01) como eluyente para separar las procianidinas
sobre una base de masa molecular, sin derivación. Se aplicó varias veces para el
análisis de extractos de procianidinas de cacao, así como para el semi-preparativa y
HPLC preparativa para el aislamiento, purificación, y análisis de la estructura posterior
( 25 , 38 y 75 ).
Fenoles absorben bien en la región UV y el detector más comúnmente utilizado para la
HPLC UV es una longitud de onda variable o detector de UV-Vis. No hay una sola
longitud de onda es ideal para monitorear todas las clases de compuestos fenólicos ya
que presentan máximos de absorción a diferentes longitudes de onda. Para obtener la
máxima sensibilidad, por lo general una longitud de onda cerca de la máxima se desea,
sin embargo, en la práctica, las longitudes de onda se establecen para la mejor
detección global de todos los componentes, que es en el caso de los flavonoides sobre
todo alrededor de 280 nm ( 45 y 53 ).
En los instrumentos modernos, multicanal, escaneo rápido, o detectores de matriz de
fotodiodos (PDA) se han convertido en la norma. PDA puede producir datos tanto en el
dominio del tiempo y espectrales. Se demostró la utilidad de la información cualitativa
de compuestos fenólicos analizados en base al espectro de absorción. PDA tiene tres
ventajas principales para el análisis de HPLC: detección de múltiples longitudes de
onda, la identificación de picos y determinación máxima pureza. Desde PDA puede
registrar la característica espectros UV de los diferentes compuestos fenólicos, ya que
eluyen de la columna, la caracterización y la disponibilidad de la información sobre la
pureza de un pico se puede facilitar mediante la comparación de los espectros en la
parte delantera, el ápice, y la cola de cada pico. Por otra parte, el rápido cálculo de la
relación de absorbencia entre diferentes longitudes de onda es posible. Comúnmente,
la identificación de compuestos fenólicos en el análisis por HPLC se llevó a cabo a
menudo mediante la comparación de los tiempos de retención y las características
espectrales de los picos con los de los estándares. Muestras patrón de agliconas y
algunos de los glicósidos más comunes están disponibles comercialmente, sin
embargo, procianidinas especialmente oligómeros con tres o más unidades
monoméricas no lo son. El orden de elución es en gran medida independiente de las
variaciones menores en el sistema de disolvente de una RP-HPLC, y por lo que también
es posible hacer identificaciones tentativas comparando los tiempos de retención
relativos con las listas publicadas de estos datos ( 45 y 51 ).
Para la comprobación de pureza del pico, los espectros de la pendiente ascendente,
cuesta abajo, y del máximo de pico se utiliza para comparar. Sin embargo, para los
isómeros, información espectral UV-Vis sí sola no puede ser utilizado para la
identificación positiva porque isómeros co-elución pueden dar lugar a espectros que
representa una mezcla de isómeros. En este caso y para los compuestos, de los cuales
las normas no están disponibles, medios adicionales de identificación se deben utilizar
en la interpretación de separación por HPLC, tales como la espectrometría de masas
(MS), resonancia magnética nuclear (RMN), y la transformada de Fourier de infrarrojos
(FT-IR) (ver más abajo) ( 22 , 45 y 51 ).
Detectores de fluorescencia también son utilizados para compuestos fenólicos, pero no
se han aplicado ampliamente para la detección de flavonoides. Detección de
fluorescencia puede ofrecer ventajas sobre detección UV en términos de una mayor
selectividad y mayor sensibilidad. Por otra parte, junto con detección de fluorescencia
detección UV puede ser útil en la identificación de los picos y la determinación pico
pureza ( Lee & Widmer, 1996 ).
Más recientemente, el uso de la detección electroquímica (ED) ha recibido mucha
atención. ED es muy sensible para compuestos que pueden ser oxidados o reducidos
en los potenciales de bajo voltaje, como los flavonoides. Se muestra una mayor
sensibilidad y selectividad sobre detección UV, y por lo tanto, es muy útil en el análisis
de muestras reales, ya que reduce los efectos de matriz y por lo tanto mejora la
cuantificación e identificación de los picos de analitos. Tiempo necesario para la
preparación de la muestra, que además son las posibles fuentes de error, se puede
reducir. Por otra parte, la disfunción eréctil es casi insensible a los cambios en
condiciones de fase móvil asociados con elución en gradiente. Líneas de base
estacionario se puede lograr con ajustes de alta sensibilidad del detector. En un caso
(Madigan, McMurrough y Smyth, 1994) en lugar complejos gradientes de metanol y
ácido fosfórico podrían haber sido reemplazados por un ácido acético (2,5 a 10%) en
gradiente lineal de agua consecución de una línea de base más suave, obviamente
junto con una mayor resolución de los flavanoles ( 29 , 30 , 45 , 46 , 48 y 53 ).
El uso de la doble-canal de detección electroquímica con HPLC para el análisis de
compuestos fenólicos ha generado un interés particular. Esto es porque el uso de
electrodos de trabajo en serie o en paralelo a diferentes potenciales de funcionamiento
se puede utilizar para ofrecer una identificación inequívoca de los componentes de la
muestra ( Madigan et al., 1994 ).
El acoplamiento de un método de NP-HPLC modificado con el análisis de
espectrometría de masas en línea (MS) usando una cámara de ionización por
electropulverización presión atmosférica ha demostrado ser una herramienta poderosa
para el análisis cualitativo y la identificación de las procianidinas de cacao y chocolate
componentes ( 25 y 75 ). La combinación de los datos de tiempo de la masa y la
retención es suficiente para pre-identificar o confirmar la identidad de las sustancias
sin aislamiento previo. La confirmación de este método como una herramienta fiable
para la determinación cuantitativa de los niveles de procianidinas de cacao, chocolate,
y otros productos alimenticios está siendo investigado actualmente. Dado que este
método no requiere el aislamiento de las sustancias con el fin de caracterizar su
tamaño, es más rápida y puede proporcionar además una verificación de la fiabilidad
de las técnicas basadas en la hidrólisis para la estimación del grado medio de
polimerización (DG) en proantocianidinas (que se describe más adelante) ( 25 y 62 ).
4.3.3. La electroforesis capilar (CE)
CE es un refinamiento de la electroforesis tradicional en la que el poder de separación
ha aumentado en un grado (hasta 120 000 platos teóricos). Es capaz de superar HPLC
hasta en 65 veces. La sensibilidad también es 10-12 veces mayor que en la HPLC, para
la detección de la muestra, aunque también es comúnmente por absorción UV, el
tamaño de la muestra inyectada es sólo aprox. 1 ng. Por otra parte, tiempos de análisis
son mucho más cortos en CE que en HPLC. HPLC, sin embargo, a menudo sigue siendo
el método de elección para el análisis de flavonoides. Esto es debido al hecho de que
en el CE conseguidas espectros UV son a menudo ruidosa debido a la pequeña
cantidad inyectada y los límites de detección para los componentes en la muestra
original son más altos. CE ofrece un método para la separación de los flavonoides que
utiliza bastante diferentes propiedades moleculares. Como tal CE a veces se producen
separaciones en HPLC no ( 45 y 51 ).
El principio de la CE se basa en un tubo capilar lleno de tampón de cuyos extremos se
encuentran en depósitos llenos de tampón que contienen electrodos. La muestra se
aplica por diversos medios a un extremo del tubo y una tensión de la tensión aplicada
entre los electrodos. Cualquiera de las especies cargadas positiva o negativamente
pueden ser seleccionados mediante el cambio de la polaridad del
electrodo. Componentes Neutral viajan juntos a través del capilar con el flujo electro-
osmótico de la memoria intermedia inducida por la diferencia de potencial entre los
electrodos. Moléculas de la muestra cargados se separan a medida que migran a
través del capilar (en contra del flujo) ( Lee & Widmer, 1996 ).
La movilidad de flavonoides en el CE se determina esencialmente por la relación de
carga a masa de la molécula. Por lo tanto, los flavonoides no llevan una carga deben
estar ionizados por el uso de un tampón adecuado. Tampones de borato con un pH de
8-11 y una concentración de 25-200 mM se utilizan comúnmente, aunque tampones de
borato de sodio pueden formar complejos con orto grupos-dihidroxilados en el núcleo
flavonoide y con vecinales cis grupos-dihidroxilados en azúcares ( 45 y 51 ).
Los flavonoides que no se ionizan fácilmente o son hidrofóbicos pueden ser tratados
eficazmente mediante cromatografía capilar electrocinética micelar (MECC), en el que
un agente tensioactivo, a menudo dodecil-sulfato de sodio (SDS), se introduce para
producir micelas cargadas en la que el flavonoide neutro migra.Alternativamente, la
adición a la memoria intermedia de alrededor de 20% de un disolvente orgánico tal
como metanol o acetonitrilo puede ser suficiente ( Markham y Bloor, 1998 ).
En la mayoría de las separaciones, el flujo de endo-osmótica de agua hace que el
flavonoide para ser conducido hacia el cátodo, y el grado de este efecto se determina
por el tamaño molecular. Esta es la gran influencia y fundamentales en la
movilidad. Sin embargo, los aniones de flavonoides, que son producidos por el pH
alcalino de la memoria intermedia, también son atraídos hacia el ánodo, con la fuerza
de esta atracción está determinado por el grado de ionización. Por lo tanto, el equilibrio
de estos dos efectos determina la tasa neta a la que los flavonoides migran a lo largo
de la columna capilar para el cátodo.Mientras que el tamaño molecular es
generalmente evidente por sí mismo, es decir, desde el peso molecular, el grado de
ionización depende de la p K una del grupo (más ácido) hidroxilo ( 45 y 51 ).
MECC se ha utilizado como un método rápido para separar oligómeros de procianidina
de cacao (Romanczyk et al., 1997 ). Se ha demostrado que este método sólo requiere
12 min para lograr la misma separación que la obtenida por un min análisis de HPLC de
fase normal 70. El tampón de MECC consistió en ácido bórico 200 mM, 50 mM de SDS e
hidróxido de sodio para ajustar el pH a 8,5. El capilar FUE UN 50 cm x 75 m
Identificación sin recubrimiento de sílice fundida y los analitos detectados por PDA.
4.4. Cuantificar flavonoides
Una cuantificación crudo de componentes puros o mezclas individuales es posible
usando técnicas colorimétricas (descrito anteriormente) y / o espectrofotometría UV /
visible. En los casos en que los componentes de una mezcla son de un tipo similar, por
ejemplo, todas las antocianinas o todos los flavanoles estos métodos pueden dar
resultados razonables utilizando las curvas de calibración con flavonoides disponibles
comercialmente. En el caso de componentes de cacao esto requiere, al menos, el
fraccionamiento de las antocianinas y flavonoles (véase más arriba) o por
procedimientos de aislamiento aún más tediosas cuantificación más precisa utilizando
PC, CC, cromatografía de permeación en gel (GPC), y HPLC o combinaciones de los
mismos tal como se describe más adelante ( Markham y Bloor, 1998 ).
HPLC con un detector de UV / visible se puede utilizar como tal para la
cuantificación. El chromatogramme muestra todos los componentes que se adsorben
en la longitud de onda de interés y el área del pico de cada componente. El área del
pico depende del coeficiente de absorción de ese componente en esa longitud de
onda. Para la cuantificación de estas áreas de los picos se comparan luego con los de
compuestos estándar, que, o bien se incluyen en la muestra antes de la inyección
(patrón interno) o por separado cromatografió (patrón externo). Las funciones
principales de un patrón interno son en la determinación de la fiabilidad de los
procedimientos de extracción, preparación de muestras, y cromatográficos. Cuando se
conoce la clase de compuestos de cada compuesto de la mezcla bajo estudio (por
ejemplo, a partir de los espectros de absorción), sus niveles pueden calcularse a partir
de su relatividad para el pico del patrón interno. Estos familiares, a una longitud de
onda específica, se establecen por cromatografía separado del patrón interno con
representantes estándar adecuados de cada clase ( Markham y Bloor, 1998 ).
En el caso de los polifenoles de cacao, es bastante bien conocido que los flavonoides
son el grupo predominante sobre glucósidos y antocianinas (por ejemplo, flavonoles
(quercetina) 6 y 32 ). Sin embargo, tiene que ser establecido si oligómeros de
procianidina tienen respuestas similares de radiación UV como sus unidades
monoméricas epicatequina y catequina para los que están disponibles los
estándares. Una opción es la degradación hidrolítica de las procianidinas en la
presencia de floroglucinol o phenylmethanethiol para producir las catequinas
monoméricas y por lo tanto el grado medio de polimerización (DG) (véase la
descripción más precisa a continuación). Esto daría una cuantificación de procianidinas
como un grupo como equivalentes de la norma monomérica. Si las fracciones de
procianidinas oligoméricas se han aislado previamente, la cantidad de dímeros,
trímeros, tetrámeros, etc, podría lograrse (15 , 62 , 68 y 75 ).
4.5. Procedimientos de aislamiento de flavonoides
El aislamiento y purificación de los flavonoides individuales se requiere a menudo
porque las estructuras son desconocidos o, como en el caso de las normas de
procianidinas de cacao no están disponibles comercialmente. Material puro también
puede ser necesaria para mediciones de la actividad, por ejemplo, antioxidantes o
actividad anti-cancerígena, o para estudios de biodisponibilidad en animales, seres
humanos o el uso de cultivos celulares (por ejemplo, la línea celular de epitelio
intestinal humano Caco-2).
Un esquema generalizado para el aislamiento flavonoide que a menudo ha demostrado
ser útil se presenta a continuación ( Markham y Bloor, 1998 ):
1.
Inicial de limpieza del extracto
2.
Fraccionamiento en gran escala utilizando cromatografía en columna
3.
La purificación final (por lo general de pequeña escala)
La mayor parte del metanol acuoso o acetona peso del extracto es debido a los
hidratos de carbono. Una separación crudo primaria de estos hidratos de carbono del
resto del extracto se puede lograr por CC utilizando materiales de relleno tales como
las resinas Amberlite XAD, gel de sílice derivatizado (por ejemplo, RP-18) o de los
productos Diaion HP. Para este fin, el extracto se disolvió en agua (o el disolvente
orgánico se eliminó por evaporación rotativa) y se pasó a través de la columna. Los
azúcares no se adsorben y se lavaron totalmente de la columna con agua
adicional. Los compuestos menos polares retenidas, incluyendo los flavonoides, se
lavan a continuación de la columna con alcohol acuoso o puro. Si se desea, algo de
separación se puede lograr en esta etapa por un aumento intensificado en el contenido
de metanol ( Markham y Bloor, 1998 ).
La separación adicional de la fracción flavonoide que contiene (s) puede ahora
proceder con otra forma de CC. Poliamida (por ejemplo, MN SC-6) y Sephadex LH-20
son útiles los medios de comunicación de piel este propósito. El uso de agua ácida,
metanol acuoso al 10-60%, y 60-100% de metanol en una columna de poliamida
previamente acidulada, antocianinas, glucósidos de flavonol y agliconas de flavanoles
(y proantocianidinas), respectivamente, puede ser fraccionada. Separación por GPC
puede ser utilizado para más fracciones de las separaciones de columnas más
grandes. Sephadex LH-20 se emplea más comúnmente y produce separaciones
basadas no solamente en tamaño molecular, sino también en la interacción de enlace
de hidrógeno. La mayoría de los flavonoides eventualmente se pueden aislar en forma
pura por GPC, aunque en algunos casos será necesario repetir la cromatografía para
obtener fracciones de pureza suficiente para la purificación final o determinación de la
estructura. Estas columnas se suelen funcionar con un único sistema de
disolvente. Para antocianinas, metanol-ácido acético-agua (10:01:09) es útil, mientras
que para otros flavonoides metanol-agua (o etanol) o alcohol solo resultado en buenas
separaciones. La acetona se puede añadir para ayudar a la elución de algunos taninos
( Markham y Bloor, 1998 ).
Para separaciones más difíciles, o cuando sólo se requiere una pequeña cantidad de
compuesto puro, una forma preparativa de una de las técnicas analíticas se puede
utilizar. Se utiliza a menudo por HPLC semi-preparativa. Se requiere una columna más
grande (10 mm de diámetro) y se utiliza una velocidad de flujo mayor que el utilizado
en el trabajo analítico. Dado que sólo pequeñas cantidades se pueden recoger de cada
ejecución, los compuestos puros se acumulan a partir de varias inyecciones por la
recolección de los picos apropiados tal como se detecta por absorción UV / visible o la
otra de detección. Para garantizar la reproducibilidad durante muchos carreras, se
prefiere un sistema de disolvente isocrático y la temperatura de la columna debe ser
controlada con precisión a través del uso de un calentador de la columna. GPC en
Sephadex LH-20 y ambos RP-HPLC semipreparativa y NP-HPLC se han usado para el
aislamiento y purificación de los polifenoles de cacao ( Romanczyk et al.,
1997 ). Alternativamente, se puede utilizar PC unidimensional. Las cantidades de mg
se pueden obtener mediante la ejecución de varias chromatogrammes de papel de una
sola dimensión. Las bandas apropiadas se extirparon, se eluyeron, y los eluatos
combinados. La contaminación de material polisacárido puede ser retirado
posteriormente utilizando CC como se describe anteriormente ( 15 , 51 y 67 ).
4.6. Análisis de la estructura por la degradación
La técnica más importante para el análisis de flavonoides por la degradación es la de
hidrólisis. Para los componentes de cacao, la composición de polifenoles es bastante
bien conocido y las normas para los monómeros que se producen están disponibles
comercialmente. Dado que este no es el caso para las proantocianidinas oligoméricas y
superior-polímero, la degradación hidrolítica puede proporcionar información útil sobre
el tipo de proantocianidina presente en el extracto, en la estructura de
proantocianidina (de los componentes aislados y purificados), y en el grado medio de
polimerización (DG ).
Hidrólisis ácida total en presencia de butanol-HCl se puede utilizar para establecer el
tipo de proantocianidina. En el caso de las proantocianidinas de cacao esto ha sido
demostrado para ser el tipo de procianidina, no galatadas y con epicatequina sobre
catequina siendo la unidad de extensión dominante ( 15 y 62 ).
Hidrólisis ácida parcial se lleva a cabo para identificar los iniciación (o terminal) sub-
unidades "inferiores".Sólo una parte de la unión entre flavan se rompe, liberando
subunidades inferiores libres, por lo que, por ejemplo, a partir de una procianidina el
trímero no hidrolizada trímero, se obtienen el dímero y monómero inferior (como puede
ser identificado por TLC y / o HPLC) ( 15 y 62 ).
La hidrólisis ácida en presencia de floroglucinol y phenylmethanethiol, con
desulfuración posterior de los tioéteres (utilizando níquel Raney en metanol), se llevan
a cabo para la identificación de las unidades de extensión "superiores". En esta
reacción, los menores subunidades son liberados como catequinas libres, mientras que
el sub-unidades superior en forma de aductos floroglucinol o benzylthioethers,
respectivamente. La relación entre las cantidades de productos de adición o tioéteres y
de catequinas libres liberados por lo tanto puede estar relacionado con el grado de
polimerización de los compuestos presentes en el extracto. El uso de
phenylmethanethiol es de desventaja debido a su olor fuerte y persistente y, por otra
parte, el análisis cromatográfico de los aductos de floroglucinol se han notificado a ser
más fácil ( 15 , 62, 68 , 73 y 75 ).
4.7. Análisis de la estructura usando técnicas instrumentales
4.7.1. Espectroscopia de absorción
Espectroscopia de absorción se utiliza, en particular, para la cuantificación de los
flavonoides y para los estudios preliminares de las estructuras de flavonoides aislados
por cromatografía o detectado por HPLC.Una ventaja principal de esta técnica es que
requiere sólo cantidades muy pequeñas de flavonoides, por ejemplo, la cantidad
comúnmente disponibles a partir de un punto PC de dos dimensiones es normalmente
suficiente.
Los espectros de absorción de una amplia selección de flavonoides está ahora
disponible en la literatura, y estos espectros puede proporcionar un medio útil para
determinar el tipo de flavonoide, el patrón de oxigenación, e incluso en ocasiones el
patrón glycosalation. Sin embargo, los polifenoles del cacao son principalmente los
flavonoides (catequinas, procianidinas) y sólo pequeñas cantidades de glucósidos de
flavonoles y antocianidinas. Así, la espectroscopia de absorción sólo pudo confirmar la
presencia de un flavanol, pero no pudo dar más información para identificar si
epicatequina o catequina o un procianidina oligomérica. Para ello y de identificación
positiva en general, las técnicas tales como MS y RMN son indispensables ( 22 y 51 ).
4.7.2. La espectrometría de masas (MS)
Hasta la fecha, MS se utiliza principalmente en el análisis de flavonoides para la
confirmación de peso molecular ( Markham y Bloor, 1998 ). Por lo tanto, esta técnica
podría proporcionar información muy útil sobre el número de sub-unidades de
catequina en procianidinas de cacao.
Uso de impacto de electrones espectrometría de masas (EI-MS) en cantidades sub-
miligramo, distintos de los pesos moleculares, las fórmulas químicas de los flavonoides
se puede determinar, y se obtiene información valiosa en cuanto a los patrones de
sustitución de A-y B-anillos. Durante el procedimiento de impacto de electrones, los
flavonoides se escinden en un número de fragmentos de acuerdo con ciertas vías. Por
ejemplo, la fragmentación de las flavanonas y dihidroflavonoles a menudo implica
procesos de retro-Diels-Alder. Durante la escisión, se forman muchos intacta
fragmentos A-y-B anillo, la combinación de los cuales tiende a ser característica de la
clase de los flavonoides a los que pertenece el compuesto en estudio. Con el fin de dar
un buen espectro de masas EI y el ion molecular, el compuesto en estudio debe ser
volátil a las temperaturas de la sonda utilizados en alto vacío en el espectrómetro de
masas (100-230 ° C).Agliconas flavonoides cumplen con este requisito, pero sus
glucósidos (y probablemente procianidinas oligoméricas) no lo hacen. Sin embargo,
otras técnicas espectrales de masas están disponibles, por ejemplo, de iones negativos
de bombardeo de átomos rápidos MS (FAB-MS) y de desorción de campo EM (FD-MS)
( 22 , 45 y 51 , pp 15, 30, 35).
Como se mencionó anteriormente, el acoplamiento de la HPLC o CE con el análisis de
espectrometría de masas en línea (MS) puede ser una herramienta poderosa en el
análisis cualitativo y la identificación, así como la determinación cuantitativa de
flavonoides, en particular, de procianidinas de cacao y componentes del chocolate, sin
aislamiento anterior ( 15 , 25 , 38 y 75 ).
4.7.3. Resonancia magnética nuclear (RMN)
Espectroscopía de RMN es una herramienta poderosa en la determinación de la
estructura flavonoide.Además de proporcionar información sobre el entorno químico de
cada protón o núcleo de carbono en la molécula, la técnica también se puede emplear
para determinar los vínculos entre núcleos cercanos, a menudo permitiendo una
estructura completa para ser ensamblado ( 22 , 45 y 51 ).
Protones básica y 13 C espectros se obtienen normalmente en experimentos
separados. Debido a la relativamente baja abundancia natural de la 13 C isótopo, 13 C
experimentos toman mucho más tiempo para adquirir datos suficientes para producir
un espectro presentable (horas), mientras que los espectros de protones se puede
obtener en cuestión de minutos. Un espectro de protón descifrable se puede obtener
con tan poco como 0,3 mg de muestra, mientras que 13 C espectros generalmente
requieren muestras más grandes, típicamente más de 1 mg ( Markham y Bloor, 1998 ),
un autor sugiere incluso más de 15 mg (Grayer, 1989 ).
La mayoría de los disolventes producen su propia / o protones y 13 señales C, y esto
puede influir en la elección del disolvente. Los disolventes también ejercen algún
efecto sobre los espectros. Por lo tanto, el mismo disolvente se debe utilizar cuando se
comparan datos. DMSO- d 6 (sulfóxido de dimetilo) es el disolvente de elección para
muchos flavonoides, sin embargo, para flavanos y proantocianidinas, metanol- d4 ha
sido reportado para dar los mejores resultados ( Markham y Bloor, 1998 ).
En muchos casos de clases de compuestos bien estudiados como los flavonoides,
protón unidimensional básica y 13 C espectros son todo lo que se requiere para
confirmar la sospecha de un tipo estructural.Interpretación de los datos del espectro de
frecuencia se puede lograr a través de la comparación con los datos publicados para
los compuestos conocidos. Por lo tanto, la espectroscopia de RMN de protón se puede
utilizar: (1) para determinar el patrón de oxigenación de la molécula; (2) para
determinar el número y la estructura de los grupos funcionales distintos de los
hidroxilos; (3) para establecer el número de azúcares presentes en glucósidos; y (4)
para distinguir entre diferentes clases de flavonoides. 13 C espectroscopía de RMN
proporciona información valiosa sobre el esqueleto de carbono de un compuesto, por
ejemplo, el número de átomos de carbono y que de estos átomos de carbono se
oxigena. También se puede utilizar para distinguir entre las diversas clases de
flavonoides. Sin embargo, la contribución más valiosa de esta técnica ha sido que se ha
proporcionado un medio relativamente fáciles de identificar el resto de azúcar de
flavonoide C -glicósidos (y de O -glucósidos), de establecer la presencia y la identidad
de los grupos acilo, y de determinar las posiciones de los vínculos entre los diversos
restos ( 22 , 45 , 51 y 75 ).
Si un análisis de compuestos conocidos no ofrece datos adecuados para la
determinación de la estructura en comparación, a continuación, una serie de técnicas
de RMN sofisticados están disponibles para ayudar a determinar los vínculos dentro de
la molécula. En la mayoría de estos experimentos el instrumento combina
automáticamente los resultados de muchos experimentos y los datos se presentan
como un gráfico de contorno de dos dimensiones ( 22 , 51 y 75 ). Sin embargo, está
más allá del alcance de esta descripción general para discutir estas técnicas en detalle.
4.7.4. Rayos infrarrojos de Fourier (FT-IR)
Espectroscopia de IR se ha usado con menos frecuencia para la identificación de
sustancias fenólicas. Sin embargo, después de GC o HPLC, la combinación de las dos
técnicas de detección de IR y MS pueden ser una herramienta poderosa para la
identificación de compuestos fenólicos individuales, especialmente para los isómeros
de posición. Para este tipo de compuestos, los espectros de masas son por lo general
prácticamente idéntica pero espectros de IR puede ser muy diferente ( Lee & Widmer,
1996 ).
4.8. Visión de conjunto
Tabla 7 da una visión general de los procedimientos utilizados para el análisis,
aislamiento, purificación, identificación y cuantificación de los polifenoles en los
productos de cacao y en otras fuentes, con la composición de polifenoles similares, es
decir, rica en procianidinas.
Tabla 7. Información general sobre los métodos de análisis, aislamiento, purificación,
identificación y cuantificación de los polifenoles de granos de cacao y productos y fuentes de
polifenol con composición similar (procianidinas) un
Fuente Extracción por solventes
La purificación y / o fraccionamiento
Método de análisis
Detección Esclarecimiento Estructura
Ref..
Los granos de cacao o licor de cacao
Ácido acetona-agua-ácido acético 70:29.5:0.5
NP-HPLC; gradiente de diclorometano-metanol con const. 4% de ácido acético-agua (01:01)
DAD 280 nm; fluorescencia λ ex 276 nm, λ em 316 nm
Kealey et al., 1998
Los granos de cacao (cotiledones)
Cold metanol acuoso al 70%
Acetato de etilo Acidificados extracto purificado de varias carreras de PC
2-D TLC en celulosa: A: 5% de ácido acético; B: nácido-agua-butanol-acético 04:01:05
La luz ultravioleta, la vainillina-HCl, oxalato de titanio
Jalal y Collin, 1977
Los granos de cacao, chocolate negro
Acetona acuosa al 70% de metanol acuoso al 70% (judías); ácido acetona-
SPE sobre C18; eluida con agua para eliminar los azúcares a continuación, agua acetona, ácido acético 70:29.5:0.5
NP-HPLC; gradiente de diclorometano-metanol con const. 4% de ácido acético-agua (01:01)
DAD y MS con cámara de ionización API-ES utilizando tanto el modo de exploración y control de
Debido a la masa molecular en combinación con DAD espectros
Hammer-stone et al., 1999
Fuente Extracción por solventes
La purificación y / o fraccionamiento
Método de análisis
Detección Esclarecimiento Estructura
Ref..
agua-acético 70:29.5:0.5
para procianidinas
iones específicos (SIM)
Los granos de cacao, chocolate, productos de chocolate primas
70% de acetona acuosa; 70% de metanol acuoso
Extracto de acetato de etilo en Sephadex LH20 eluyó con gradiente de paso racional del agua en metanol
NP-HPLC: gradiente diclorometano-metanol con const. 4% ácido acético-agua (01:01); RP-HPLC gradientes de agua-metanol (Const 0,5% de ácido acético); MECC: 200 mM de ácido bórico, 50 mM de SDS a pH 8,5
DAD 280 nm; fluorescencia λ ex 276 nm, λ em 316 nm
FAB-MS usando una técnica de espectrometría de masas de iones secundarios líquido (LSIMS) en los modos de iones o MALDI-TOF/MS positivos y negativos; 13 C RMN y 1 H RMN; HOHAHA, HMQC, COSY, APT, espectros de XHCORR; tiolisis y desulfuración
Romanczyk et al., 1997
Los granos de cacao y las semillas de uva
70% de metanol
Evaporada y se volvió a disolver en 60% de acetona; salado a cabo con NaCl; se lavó con cloroformo, se extrajo con acetato de etilo;
Ácido agua NP-HPLC diclorometano-metanol-fórmico con relaciones A: 4:43:1:1 y B: 41:7:1:1
UV-VIS a 280 nm
Microthiolysis para identificar procianidinas
Rigaud et al., 1993
Granos de cacao
60% de acetona-agua
Se extrajo con acetato de etilo; 1. fase aqueousueous: A: en Sephadex LH-20 (fracción de polímero) B: en TSK-HW-40 (F) se eluyó con metanol (procianidinas con el aumento de M r -peso); 2. fase de acetato de etilo sobre Sephadex LH-20 se eluyó con agua en gradiente escalonado de metanol
TLC sobre gel de sílice usando: TAF (tolueno-acetona-ácido fórmico 03:06:01); 2-D TLC en celulosa: A: TBA ( t ácido-agua-butanol-acético 03:01:01) y B: 6 ácido acético%; RP-HPLC: metanol-ácido acético (1%) 01:04 isocrático
Vainillina-HCl para TLC; UV-Vis a 280 nm para HPLC
FAB-MS y 13 C RMN, la degradación tiolítica
Porter y Chan, 1991.
Fuente Extracción por solventes
La purificación y / o fraccionamiento
Método de análisis
Detección Esclarecimiento Estructura
Ref..
Los granos de cacao fermentado y no fermentado ()
80% de acetona acuosa
RP-C18 cartucho Sep-Pak eluyó con metanol acuoso al 40%
RP-HPLC: ácido agua-metanol-ácido acético (87:8:5) isocrática
UV-VIS a 280 nm
Kim y Keeney, 1984
El licor de cacao
Hervir el agua
Sephadex LH-20 se eluyó con agua-acetona paso gradiente de sabia
RP-HPLC: 25% de metanol que contenía ácido trifluoroacético 0,03% (TFA) isocrático
UV-VIS a 280 nm
MS y 1 H y 13 C RMN
Osakabe et al., 1998
El licor de cacao
Etanol acuoso al 80%
Columna Diaion HP2MG eluyó con acetona-agua (que contiene 0,05% de TFA) gradiente de paso a paso
Preparación de RP-HPLC: 40% de metanol que contiene 0,1% de TFA isocrática
UV-VIS a 280 nm
MS y 1 H y 13 C RMN
Sanbongi y col., 1998
Los granos de cacao, cacao en polvo bajo en grasa no alcalizado, y cacao en polvo instantánea
70% de metanol acuoso (de polifenoles totales y taninos); 75% de acetona acuosa (por HPLC)
La precipitación de taninos en el extracto de metanol a pH 4 usando 1% de NaCl en la solución de gelatina al 10%, extracto de acetona (por HPLC): filtración y la saturación con NaCl (separación en dos fases), el uso de la fase de acetona, se evaporó a sequedad; disuelto de nuevo en agua-metanol
Total de fenoles y taninos con reactivo de Folin-Ciocalteu (RFC), RP-HPLC (sólo epicatequina): agua a pH 2,6 gradientes (ácido fosfórico)-metanol
RFC: absorbancia a 760 nm (en equivalentes de ácido gálico); HPLC: DAD a 278-282 nm
Serra Bonvehi y Ventura Coll, 1997
El licor de cacao
Etanol acuoso al 80%
RP-cromatografía sobre Diaion HP-2MG eluyó con 20% de etanol (impurezas tales como azúcares y proteínas) y
Reactivo de Folin-Ciocalteu
La absorbancia a 760 nm
Sanbongi y col., 1997
Fuente Extracción por solventes
La purificación y / o fraccionamiento
Método de análisis
Detección Esclarecimiento Estructura
Ref..
80% de etanol (polifenoles), se secó al aire y se disolvió en DMSO
Chocolate y cacao en polvo
95% de metanol
Reactivo de Folin-Ciocalteu
La absorbancia a 760 nm
Waterhouse et al., 1996
Manzana, uva negra, frijoles enlatados
Metanol acuoso al 90% (manzanas / uvas), el 70% de metanol acuoso (frijoles)
RP-HPLC: 5 a 25% de acetonitrilo en tampón de fosfato (pH 2,4)
UV-Vis a 280 nm y la fluorescencia en serie
Artes y Hollmann, 1998
Vino y uva semillas
C18 cartucho Sep-Pak eluyó con agua (ácidos orgánicos y azúcares), solución de amoníaco a pH 9,5 (ácidos fenólicos), y metanol (para los flavonoides)
RP-HPLC: gradientes de agua-acetonitrilo en tampón de fosfato de amonio 0,05 M (pH 2,5)
De doble electrodo LC-ECD
Lunte et al., 1998
Soluciones puras de semillas de uva procianidinas o aislados
RP-HPLC: 2,5% ácido acético gradientes-acetonitrilo
UV-VIS a 280 nm
La degradación tiolítica con phenylmethanethiol en ácido sulfuroso (+ RP-HPLC); desulfuración con níquel Raney (+ HPLC)
Rigaud et al., 1991
Uva y el vino Metanol (de uva)
Cartuchos C18 Sep-Pak eluidos con agua (ácidos fenólicos), acetato de etilo (catequinas y procianidinas oligoméricas), metanol (procianidinas poliméricas y antocianinas); fracción de acetato de etilo de nuevo en Sep-Pak, eluyeron con
TLC sobre placas de sílice: ácido tolueno-acetona-acético 03:03:01, RP-HPLC: agua 10% gradientes de ácido acético
Vainillina-HCl para TLC; UV-Vis a 280 nm para HPLC
La degradación tiolítica con tolueno-α-tiol (+ HPLC) para la media de DP
Sun et al., 1998
Fuente Extracción por solventes
La purificación y / o fraccionamiento
Método de análisis
Detección Esclarecimiento Estructura
Ref..
dietil-éter (catequinas monoméricas) y metanol (procianidinas oligoméricas)
Vino tinto Extracción líquido-líquido: 1. acetato de etilo a pH 2,0; 2. fase de acetato de etilo se evaporó y se volvió a disolver en agua se extrajo con acetato de etilo a pH 7,0
RP-HPLC: 5% ácido acético gradientes-acetonitrilo
DAD a 535 330 310 280 nm
MS (PE-API/Sciex interfaz de aerosol de iones y un triplequadrupole MS Sciex Taga 6000E) con el modo de iones positivos de antocianinas, modo de iones negativos de catequinas y ácidos fenólicos y flavonoides
Ghiselli, Nardini, Baldi y Scaccini, 1998
Bebidas, semillas de uva, almendras
Metanol (para las semillas de uva, almendras)
Sephadex LH-20
TLC sobre gel de sílice: ácido tolueno-acetona-acético 06:03:01; TLC de celulosa: ácido fórmico al 10%; RP-HPLC: agua-metanol-4.5% gradientes de ácido fórmico
DAD detección de línea doble: a 280 nm y después de derivatización con DMACA a 640 nm
Pascual Teresa et al., 1998b
Semillas de uva, piel de manzana, lentejas, carne de almendras
Metanol frío que contiene ácido ascórbico 0,05% (-20 ° C)
Extracto de acetato de etilo sobre Sephadex LH 20 se eluyó con etanol al 96%
RP-HPLC: gradiente de 2% de ácido acético-metanol
UV-Vis a 280 nm; pureza de los compuestos controladas por HPLC-DAD y LC-MS
LC-ESI-MS (procianidinas puros); hidrólisis ácida en presencia de floroglucinol y phenylmethanethiol con la subsiguiente desulfuración de thiolethers; MS y 2-D RMN (para catequinas glicosiladas)
Plumb, Pascual-Teresa, Santos-Buelga, Cheynier y Williamson, 1998
Semillas de uva
Acetona acuosa al 75%
Diaion HP-20 resina
Prep-RP-HPLC: 15% de metanol
La hidrólisis con tanasa (procianidinas galloylated); degradación
Takahashi, Kamiya y Yakoo, 1998
Fuente Extracción por solventes
La purificación y / o fraccionamiento
Método de análisis
Detección Esclarecimiento Estructura
Ref..
tiolítica con tolueno-α-tiol en ácido acético (+ HPLC)
Semillas de uva
Metanol Sephadex LH 20 se eluyó con etanol al 96%
RP-HPLC: 4,5% ácido fórmico gradiente de acetonitrilo-
DAD a 280 nm
TLC en sílice (ácido tolueno-acetona-acético 3:7.5:1); hidrólisis completa con butanol-ácido HCl; hidrólisis parcial con HCl 0,1 N (+ HPLC); tiolisis y desulfuración (+ HPLC); hidrólisis enzimática (sólo para galoilo ésteres) (+ HPLC)
Escribano-Bailon et al., 1992
Las cerezas de café
70% de acetona acuosa
Extracto de acetato de etilo se lavó con diclorometano (para eliminar la cafeína); en una columna Sephadex LH-20 se eluyó con acetona acuosa al 80%
TLC: ácido tolueno-acetona-fórmico 06:06:01; RP-HPLC 0,5% de ácido fosfórico gradientes-metanol
DAD 280 nm
FT-IR usando discos de KBr; 13 C RMN; reacción de autooxidación con n-butanol-HCl-Fe (III) para evaluar la homogeneidad de las fracciones de procianidina-ricos
Colmenarez et al., 1997
Té negro descafeinado
Metanol acuoso al 50%
Columna de celulosa Solka floc eluyó con metanol y acetona; más fraccionamiento en Sephadex LH-20 se eluyó con 20, 40, y 80% de acetona
Prep-RP-HPLC: acetonitrilo-agua-ácido acético-10:0.5:89.5
DAD 280 nm
Negativo electropulverización de iones-MS; 1 H, 13C RMN
Davis et al., 1997
El té negro Agua caliente
La extracción de la cafeína y la clorofila con cloroformo
RP-HPLC 0,5% de ácido acético gradientes-acetonitrilo
DAD dos carreras entre 190 a 390 y 390 a 590 nm
Opie, Robertson y Clifford, 1990
El té negro Agua RP-HPLC: acetonitrilo-ácido o 1% de ácido acético al 2% cítrico (pH 2,8 con NaOH)-acetonitrilo o
DAD a 280, 380, 460 nm
Bailey, Nursten y McDowell, 1991
Fuente Extracción por solventes
La purificación y / o fraccionamiento
Método de análisis
Detección Esclarecimiento Estructura
Ref..
ácido acético al 2% en 2% de EDTA sal de sodio-acetonitrilo
Cerveza y cebada
Extraído acetona acuosa al 75% (cebada)
RP-HPLC: 2,5 a 10% de ácido acético
Coulochem II ECD (electrodo colorimétrico en serie con el electrodo amperométrico
Madigan et al., 1994
Cerveza RP-HPLC: 3,5% gradientes de ácido acético-metanol
UV a 254 nm; ECD; voltametría cíclica
29 y 30
Frutas almendras inmaduros
Metanol frío que contiene ácido ascórbico 0,05% (-20 ° C)
Sephadex LH-20 se eluyó con 96% de etanol y acetona
RP-HPLC: 4,5% ácido fórmico gradientes-acetonitrilo o 10 mM NH 4OAc 0,1% de ácido fórmico gradientes metanol
DAD a 280 nm, HPLC-MS (ESI-MS)
Tiempos de retención de HPLC-; de valores de Rf de TLC 1-D y 2-D TLC; hidrólisis total (butanol-HCl); hidrólisis parcial (HCl 1 N); hidrólisis ácida en presencia de floroglucinol y phenylmethanethiol con la subsiguiente desulfuración; MS
Pascual Teresa et al., 1998a
Hojas de las plantas deAmeyena scandens
Metanol acuoso al 70%
Extracto de acetato de etilo; CC sobre gel de sílice
RP-HPLC en acetonitrilo-agua (que contiene ácido fórmico al 0,03%) gradiente
DAD a 280 nm, ESI-MS
Gariboldi, Mascetti, Galli, Caballion y Bosiso, 1998
Corteza deGuazuma ulmifolia
Frío 70% de etanol acuoso; 96% de etanol y 70% de etanol (reflujo)
Se lavó con diclorometano; extracto de acetato de etilo en una columna Sephadex LH-20 se eluyó con A: 50% de etanol y B: etanol-agua-acetona 09:09:02
1-D TLC en gel de sílice: ácido-agua-acetato de etilo fórmico 18:01:01, 2-D TLC de celulosa: A: 6% de ácido acético y B: ácido agua 2-butanol-ácido acético 14:01:05
Vainillina ácido sulfúrico o vainillina-etanol-agua-HCl 0.5:5:95:25)
n -butanol-HCl-Fe (III) para evaluar la homogeneidad de las fracciones de procianidina-ricos
Hoer et al., 1995
23 vehículos 50% de Análisis Vinson,
Fuente Extracción por solventes
La purificación y / o fraccionamiento
Método de análisis
Detección Esclarecimiento Estructura
Ref..
metanol acuoso a 90 ° C (compuestos fenólicos no conjugados); HCl 1,2 M en 50% de metanol a 90 ° C (fenoles totales)
colorimétrico con el reactivo de Folin-Ciocalteu usando catequina como un estándar
Hao, Su y Zubick, 1998
Soluciones estándar y hojas de roble
Precipitación de la proteína con BSA; hidrólisis alcalina de los complejos de tanino-BSA
Método de la ninhidrina de ácidos BSA-amino de complejo hidrolizado
Fotométrica (absorbancia a 570 nm)
Makkar et al., 1987
Los compuestos de referencia (disponibles comercialmente o aislado de castaño de Indias)
RP-HPLC: 5% ácido fórmico gradientes-metanol
DAD a 280 nm ya 640 nm después de la derivatización con DMACA
Treutter et al., 1994
Los taninos en general
Agua o metanol
Precipitación con BSA; lavó el sedimento y se disolvió en SDS (1%), trietanolamina (5%) en solución o sólo 1% de SDS
Una: la determinación de proteínas con ninhidrina; B: determinación de taninos con 0,01 M de FeCl 3 en HCl 0,01 M
Fotométrica (a 570 nm para la determinación de proteínas, a 510 nm de taninos)
Makkar, 1989
Los flavonoides en general
Acetona acuosa al 75%; acuosa de etanol o metanol, acetato de etilo; C18-SPE o precipitación con PVPP (líquidos)
Aq extrae acetona saturada con NaCl (dos fases): la fase acuosa contiene taninos; la fase de acetona (glucósidos de flavonoles, flavanoles más bajos oligómeros) se puede aplicar en: C18-SPE, cartuchos Sep-Pak o
Citrato de amonio férrico en solución alcalina o de Folin-Ciocalteu reactivo (fenoles totales); HCl vainillina (flavan-3-oles); RP-HPLC: A: gradiente empinada de metanol 0-95 o 0-50% en ácido acético 2,5%, B:
UV-Vis a 280 nm (flavan-3-oles) o 270-280 y 475-555 nm (antocianinas) o 350-365 nm (glucósidos de flavonoles) oa 640 nm (después de derivación de flavan-3-oles con DMACA) ; DAD y ECD (sola
McMurrough y Byrne, 1992
Fuente Extracción por solventes
La purificación y / o fraccionamiento
Método de análisis
Detección Esclarecimiento Estructura
Ref..
Sephadex LH-20
gradiente de ácido acético al 0-10%
explotación o doble electrodos detectores amperic); fluorescencia
un
Abreviaturas utilizadas aquí que no se explican en el texto o son diferentes: la extracción SPE en fase sólida; DAD,
la detección por red de diodos, API-ES, electrospray ionización a presión atmosférica, MALDI-TOF, matriz asistida
por láser de ionización disorption tiempo de vuelo; HOHAHA , homonuclear Hartmann-Hahn; HMQC, heteronuclear
múltiple coherencia cuántica;, espectroscopia de correlación COSY homonuclear; APT, prueba de protones adjunta;
DMACA, p -dimetilaminocinamaldehido; ECD, la detección electroquímica; PVPP, polivinilpolipirrolidona.
Opciones de tabla
5. Conclusión
La importancia y la actualidad de los fitoquímicos en general y de los polifenoles, en
particular, tan prometedor quimio-preventores en la nutrición humana y la medicina
han sido tocados en la introducción.Este será manejado con más detalle en otro
estudio de revisión.
Los polifenoles existen como un ingrediente intrínseca en el cacao, y por lo tanto, los
productos de cacao tales como el chocolate podrían convertirse en un alimento
funcional para conferir efectos beneficiosos para la salud para el consumidor como se
sugiere para el vino tinto y el té verde o negro ( Zumbe, 1998 ). Sin embargo, durante
el procesamiento de los granos de cacao y de la fabricación de chocolate aún hay una
disminución notable en el contenido de polifenoles. Tal disminución se ha descrito
bastante bien para la fermentación y el secado de los granos de cacao en los países de
origen (por ejemplo, 8 , 9 , 38 , 39 y 43 ).Por otra parte, la elaboración del cacao en
los países usuarios y, en particular, la fabricación de chocolate en relación con los
cambios en la composición y el contenido de polifenoles hasta ahora no ha sido mucho
objeto de investigación con una excepción de una solicitud de patente ( Kealey et al.,
1998 ). Por otra parte, incluso hay muy poco conocimiento sobre el contenido de
polifenoles en el chocolate, especialmente chocolate con leche, a pesar de estos
productos de cacao se consumen ampliamente en los países occidentales. Las
variaciones en los parámetros del proceso (por ejemplo, la condición de tiempo /
temperatura de calcinación) pueden proporcionar productos de cacao con niveles
mejorados de polifenoles.
Sin embargo, para obtener una respuesta a la pregunta, si el chocolate podría
contribuir a la salud de las personas como un alimento funcional de acuerdo a su
contenido en polifenoles, uno tiene que obtener respuestas a preguntas más concretas
tales como:
•
Qué polifenoles del cacao están presentes y en qué cantidad se les puede
todavía se encuentran en el chocolate, ya sea negro o con leche, y cuáles son
los factores clave del proceso responsable de su mantenimiento?
•
¿Esas polifenoles ya ejercen bioactividad en el tracto digestivo?
•
¿Son absorbidos en el intestino y en caso afirmativo en qué medida
(biodisponibilidad) y por cuánto tiempo es lo que permanecen en el cuerpo
antes de su excreción (biocinética)? ¿Qué influencia sobre la biodisponibilidad
tiene el chocolate matriz alimentaria, por ejemplo, las proteínas de la leche en
el chocolate con leche?
•
¿Qué sucede con los polifenoles no absorbidos en el colon expuestos a los
microorganismos?
•
Absorción pre-supone son los polifenoles metabolizados, y si es así lo
bioactividad no ejercer esos metabolitos?
•
¿Qué interacciones con otros nutrientes o no nutrientes no existen?
•
¿Cuáles son las dianas moleculares de los polifenoles del cacao y sus
metabolitos?
•
¿Qué dosis se puede considerar como efectivo para cualquiera de los efectos a
corto plazo oa largo plazo?
El contenido fenólico y la capacidad antioxidante del cacao en grano de variedades híbridas
WA Jonfia-Essien ,
G. West ,
PG Alderson ,
G. Tucker ,
Facultad de Biociencias de la Universidad de Nottingham, Sutton Bonington Campus, Loughborough,
Leicestershire LE12 5RD, Reino Unido
http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2007.12.001 , Cómo citar o enlazar Usando DOI
Permisos y reimpresiones
Abstracto
Cacao ( Theobroma cacao L.) es un importante económicamente, cultivo importante,
internacional y se ha asociado con varios beneficios nutricionales que incluyen alta
capacidad antioxidante. Nuevos híbridos de cacao se han desarrollado en Ghana que
muestran resistencia a los daños de plagas durante el almacenamiento. El objetivo de
este trabajo fue evaluar el contenido fenólico y la capacidad antioxidante de estos
nuevos híbridos en comparación con las variedades de cacao más
tradicionales. Compuestos fenólicos totales extraíbles fueron similares en todos los
cuatro híbridos ensayados que van desde 69,9 hasta 81,6 g FAE -1 . Estos niveles eran
muy similar a la que se extrae a partir de granos tradicionales (73,8 ± 2,5 g FAE -1 ). El
"perfil fenólico" se determinó por HPLC. Se observó un total de 25 picos pero sólo había
pequeñas diferencias en este perfil entre los extractos de soja tradicionales e
híbridos. La capacidad antioxidante se determinó utilizando el ensayo FRAP y se han
encontrado granos tradicionales de poseer 12,4 mmol TE g -1 . En comparación con los
granos híbridos tuvieron capacidades antioxidantes que van desde 21,6 hasta 45,5
mmol TE g -1 , y éstas fueron significativamente mayores que en los granos
tradicionales para tres de los cuatro híbridos. Dado que el fenólica y los niveles de
antioxidantes y en estas variedades híbridas eran ya sea similar a, o mayor que, la que
se obtiene a partir de granos tradicionales, la introducción de estas nuevas variedades
sería poco probable que una incidencia perjudicial sobre estos componentes
nutricionales de los granos.
Palabras clave
Los granos de cacao ;
Las variedades híbridas ;
Los antioxidantes ;
Phenolics
1. Introducción
Los polifenoles se han convertido en un foco intenso de interés de la investigación
debido a sus efectos beneficiosos para la salud percibidos ( Wollgast y Anklam, 2000 ),
incluyendo anti-cancerígena, anti-aterogénico, anti-úlcera, anti-trombóticos, anti-
inflamatoria, modulación inmune, anti -microbiana, efectos vasodilatadores y
analgésico.
Los estudios sugieren que las enfermedades cardiovasculares pueden prevenirse
mediante modificaciones del estilo de vida, como el ejercicio y la nutrición ( Hu y
Willett, 2002 , Stampfer et al., 2000 , Tanasescu et al., 2002 y Weisburger,
2000 ). Una dieta que contenga las principales fuentes de antioxidantes y polifenoles
se recomienda para fines de prevención.
Muchos estudios han considerado frutas, verduras y tés como una de las principales
fuentes de compuestos fenólicos antioxidantes dietéticos, pero Lee, Kim, Lee, y Lee
(2003) demostraron la importancia de cacao. Vinos y bebidas, como el cacao, el vino
tinto, el té negro y el té verde se consume ampliamente y se sabe que son ricos en
fitoquímicos fenólicos. En particular, teaflavina, galato de epigalocatequina, el
resveratrol y procianidina en el té negro, el té verde, el vino tinto y el cacao,
respectivamente, han sido considerados como agentes quimio-preventivas principales,
principalmente debido a sus actividades antioxidantes fuertes ( Lee et al.,
2003 ). Cacao ( Theobroma cacao L.) es particularmente rico en polifenoles ( Wollgast y
Anklam, 2000 ). También es una de las más ricas fuentes naturales de
antioxidantes. En efecto los productos de cacao contienen una mayor capacidad
antioxidante y una mayor cantidad de flavonoides por la porción que ya sea té o vino
tinto ( Lee et al., 2003 y Steinberg et al., 2003 ). Chocolate, un producto de cacao,
también puede ser una fuente importante de antioxidantes en la dieta, y estos pueden
tener efectos protectores contra la enfermedad cardiovascular ( Keen et al.,
2005 , Kris-Etherton y Keen, 2002 y Steinberg et al., 2003 ). El chocolate también se
ha informado de que una buena fuente de catequinas dietéticos, sólo superada por el
té negro ( Artes, Hollman, y Kromhout, 1999 ).
La composición polifenólica de cacao se ha caracterizado y cuantificado ( Sánchez-
Rabaneda et al., 2003 ,Wollgast y Anklam, 2000 y Zumbe, 1998 ). Los compuestos
identificados incluyen las catequinas: catequina - epicatequina, galocatequina y galato;
procianinas; antocianinas, y flavona y glucósidos de flavonoles tales como luteolina-
7- O -glucósido y quercetina-3- O -arabinósido.
Ghana es uno de los mayores productores de cacao de alta calidad. Sin embargo,
mientras que el consumo de cacao se ha incrementado en la última década, el
rendimiento de los cultivos en el país ha estado en declive. Para mejorar el
rendimiento, los híbridos se han desarrollado a partir de cruces entre Amazon,
Trinitario y genotipos Amelonado para aumentar la II híbridos Series ( Adu-Ampomah y
Sersah, 1987/1988 ) ya cultivadas por los agricultores ( Adu-Ampomah, 1996 ). Algunos
de estos híbridos han sido seleccionados sobre la base de sus rendimientos, que son
comparables a los materiales tradicionales de siembra de amelonado y genotipos
locales Trinitario de cacao, o en su resistencia a enfermedades y plagas. Si bien estos
no están actualmente en uso comercial son probable que se introduzcan en el futuro
próximo. Sin embargo, muy poco se sabe sobre el nivel de nutrientes clave como
antioxidantes y compuestos fenólicos en estos híbridos. El objetivo de este estudio fue
determinar el contenido fenólico y la capacidad antioxidante de estos híbridos con el
fin de determinar cualquier impacto potencial sobre el contenido de estos importantes
nutrientes.
2. Materiales y métodos
2.1. Materiales
Una serie de nuevas variedades híbridas de cacao ha sido desarrollado por el Instituto
de Investigación del Cacao de Ghana. Cuatro de estos híbridos (HV1-HV4) ( Tabla 1 )
han sido seleccionados para el estudio adicional en base a sus altos rendimientos y se
cultivaron en condiciones tropicales en la finca experimental del Instituto de
Investigación del Cacao de Ghana en Tafo, una ciudad en la región oriental de
Ghana. Beans fueron cosechadas en noviembre de 2002. Granos tradicionales (TV) se
cultivaron en las mismas condiciones pero en diferentes granjas, y se cosecharon en
exactamente el mismo tiempo que los híbridos.Las vainas cosechadas se rompen para
extraer los granos, que después se fermenta durante un período de seis días. Después
de la fermentación de los granos se secan al sol sobre esteras levantadas del
suelo.Habas planas o rotos se retiraron después de secado y los granos fueron
embolsados en sacos de yute. Los granos fueron enviados al Departamento de
Investigaciones de la División de Control de Calidad para el control de calidad,
embalaje y almacenamiento de tránsito de corta duración antes de ser aire levantado
al Reino Unido en marzo de 2003 para iniciar el experimento.
Tabla 1. linaje genético del cacao utilizado en este estudio
Tipo de Cacao Variedad
Amazon / Trinitario híbridos HV1
Inter híbridos Amazon (Amazon / Amazon)
HV2 y HV3
Amazon / Amelonado Híbridos HV4
Tipo de cacao tradicional TV
Opciones de tabla
Los granos de cacao secos se tamizaron para eliminar la suciedad. Frijoles se
combinaron juntos y se dividieron en cuatro partes iguales en diagonal. Una parte fue
seleccionado al azar para la primera muestra y un lote de 500 g pesó. Los granos
restantes se combinaron juntos y se repitió el proceso dos veces más para dar
muestras por triplicado de cada variedad. Cada muestra se almacena en un prototipo
sacos de yute.Sacos de yute se utilizan con el fin de ajustarse a la norma de los granos
de cacao almacenamiento aprobado. Los granos de cacao se almacenaron a
continuación en un armario de ambiente controlado a 30 ± 2 ° C y una humedad
relativa de 70 ± 2%, sobre la base de las condiciones imperantes en los almacenes de
cacao en Ghana. Las muestras para el análisis se tomaron en la tienda después de 31
días.
2.2. Extracción metanólica
Un g de muestra de cacao puntas de frijol 10 se molió con un café licuadora y 2 g de
cacao en polvo resultante se homogeneizó en 50 ml de metanol al 80% durante 1 min
en un matraz de fondo plano usando un homogeneizador Polytron a 25.000 rpm. La
suspensión de cacao se sometió a reflujo durante 30 min y después se filtró.
Este extracto se utiliza para la determinación tanto de la capacidad antioxidante y el
contenido de fenoles totales.
2.3. Ensayo antioxidante
La capacidad antioxidante se midió utilizando el potencial antioxidante de reducción
férrico (FRAP) ensayo como se describe por Benzie y Strain (1996) , utilizando Trolox
(0-20 nmol) como un estándar. Placas de micro-ensayo se prepararon poniendo 10 l de
etanol (en blanco), estándar de Trolox o solución de la muestra en los pocillos de una
placa de microtitulación seguido de la adición de 100 l de reactivo de ensayo FRAP a
todos los pocillos. La absorbancia a 630 nm se registró usando un lector de placas (Bio-
Rad 550) y la capacidad antioxidante de la muestra se calcula como equivalentes de
Trolox.
2.4. Ensayo fenólica
Contenido fenólico total se midió usando el método de Folin Ciocalteu y ensayo de
( Forrest y Bendall, 1969). Un ml de la muestra se sometió a reflujo filtrada se diluyó
con 49,0 ml de agua destilada. Reactivo de fenol de Folin-Ciocalteu se diluyó a 50%, a
continuación se añadió 0,25 ml del reactivo de 50% a 0,25 ml de la muestra y se
incubó en un baño de agua durante 3 min a 25 ° C. Esto fue seguido por la adición de
0,5 ml de solución acuosa saturada de Na 2 CO 3 y la solución de incubación adicional
en el baño de agua durante 60 min. A continuación, se registró la absorbancia a 750
nm. Los resultados se expresan como equivalentes de ácido ferúlico (FAE) utilizando
una curva estándar de ácido ferúlico (0-20 g).
2.5. Perfil fenólico
Perfiles fenólicos se determinaron mediante cromatografía líquida de alto rendimiento
(Perkin-Elmer LC 200).La HPLC se equipó con una columna Supelco C18
Descubrimiento, 4,6 mm x 15 cm, y un detector de matriz de diodos con absorbancia
ajustado a 280 nm.
Una muestra (5 g) de las puntas de granos de cacao molidas se colocó en un vaso de
precipitados de 200 ml y de 70% de metanol se añadió. Hesperitina (1 mg) se añadió
como un estándar interno para supervisar la recuperación de compuestos fenólicos. La
mezcla se agitó con un agitador magnético durante 2 h, después se filtró bajo vacío a
través de filtros Whatman GF / A de papel. El filtrado se transfirió cuantitativamente a
un matraz de fondo redondo y el metanol se evaporó usando un evaporador rotatorio,
R-3000, a ~ 170 rpm y 30 ° C para dejar una solución acuosa de aproximadamente 60
ml. El hidróxido de sodio se añadió y se dejó hidrolizar durante la noche a temperatura
ambiente (50 ml x 2 N). A continuación, la mezcla se transfirió cuantitativamente a 3 ×
50 ml tubos de centrífuga, y se centrifugó a 2000 g durante 15 min. El sobrenadante se
decantó del sedimento y se filtró a través de papel Whatman N º 4 en un embudo de
separación. Se añadieron 80 ml de éter, se agita y la solución se dejó a la partición. Se
mantuvo la fase acuosa. Este paso de particionado se repitió dos veces más. Después,
el extracto acuosa final se acidificó a pH 1,5 con ácido clorhídrico y se filtró a través de
papel Whatman N º 1 en un embudo de separación. Se añadieron 80 ml de éter
dietílico, se agita y se deja partición. Se recogió la fase de éter. Esta partición se repitió
dos veces más y los tres extractos de éter resultantes se agruparon. El extracto de éter
combinada se secó con MgSO 4(anhidro), se filtró a través de papel Whatman N º 1 en
un matraz de fondo redondo y se evapora de manera rotatoria hasta que sólo unos
pocos ml de éter se mantuvo. Este se transfirió cuantitativamente a un pequeño tubo
de muestra y el éter se evaporó a sequedad en una corriente de nitrógeno.
La muestra se recogió en 2 ml de una mezcla de metanol de grado HPLC (25%) y 0,02
M tampón fosfato pH 2,4 (75%), se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras y
10 mu l se inyecta en la HPLC. A continuación, se eluyó con un gradiente lineal de
metanol de grado HPLC y 0,02 M tampón fosfato pH 2,4 durante 25 min a partir de 20%
de metanol y tampón de 80% y terminando con 80% de metanol y 20% de tampón.
2.6. Estadística
Todas las mediciones se realizaron por triplicado y los resultados analizados por ANOVA
usando el programa estadístico Genstat 3.1.
3. Resultados y discusión
Granos de cacao tradicionales e híbridos fueron muestreados y compuestos fenólicos
extraídos en 70% de metanol. Los compuestos fenólicos extraídos totales se
cuantificaron entonces ( . Fig. 1 ). Todas las variedades de frijol analizados contenían
relativamente alto - alrededor de 70 a 80 mg g -1 - niveles de compuestos fenólicos. El
contenido fenólico total de los granos de cacao se ha informado que oscilar entre 67 y
149 y 101 a 144 mg g -1 de cacao en grano recién cosechadas y 2 días fermentado,
respectivamente (Niemenak, Rohsius, Elwers, Ndoumoua, y Lieberei, 2006 ) . Los
valores ligeramente más bajos en este caso podrían atribuirse o bien al hecho de que
los granos se habían almacenado antes del análisis o las diferencias de
variedades. Había, sin embargo, no hay diferencias significativas observadas entre los
niveles en las cuatro nuevas variedades híbridas y la de la mezcla tradicional. Por lo
tanto es probable que sea el caso de que estos cuatro híbridos no son diferentes a los
granos tradicionales en términos de fenoles totales.
. Figura 1. Total de compuestos fenólicos extraíbles a partir de granos de cacao tradicionales
o híbrido. Puntas de fresado de cualquiera de los granos de cacao tradicionales (TV) o híbridos
(HV1-HV4) se extrajeron en 70% de metanol y fenoles totales medidos con el ensayo de Folin-
Ciocalteu. Los resultados se expresan como equivalentes de ácido ferúlico y presentan como
la media y SE ( n = 3). No hubo diferencias estadísticamente significativas entre ninguno de
los granos analizados.
Opciones Figura
Mientras fenoles totales pueden ser un indicador útil de potencial beneficio nutricional,
el perfil real de compuestos fenólicos dentro del frijol es probable que sea más
importante. Así, el perfil de los compuestos fenólicos extraíbles, después de la hidrólisis
alcalina, de cualquiera de los granos de híbridos o tradicional se determinó por
HPLC. Un perfil típico de HPLC se muestra en la figura. 2 A. Se observó un total de 25
picos dentro de las variedades probadas. No fue posible asignar identidades de estos
picos. Un procedimiento de extracción similar, pero sin la hidrólisis alcalina ( Niemenak
et al., 2006 ), logró resolver los 8 picos, tres de los cuales fueron identificados como
theobromide, epicatequina y la cafeína. Un análisis comparativo se llevó a cabo
mediante la comparación de las áreas de los picos relativos entre los cinco tipos
diferentes de frijoles. Por lo tanto cada una de las 25 áreas de los picos, después de la
corrección para el patrón interno, se expresó como un porcentaje de la totalidad. Sólo
hubo pequeñas diferencias evidentes entre el tipo tradicional y las variedades híbridas
( Fig. 2 B). Los valores para los picos 1 y 3 fueron más altos en todas las variedades
híbridas que en el tipo tradicional. Pico 11 estaba ausente en los granos de las
variedades híbridas, pero también fue muy baja en el tipo tradicional. Los picos 17, 18,
19 y 20, mientras que bajo en todas las variedades híbridas, fueron indetectables en el
tipo tradicional. No se observaron cambios consistentes en los híbridos en comparación
con los granos de tipo tradicional y, como tal, es poco probable que los niveles de
cualquiera de los compuestos fenólicos individuales se alteran significativamente entre
los granos de híbridos y tradicionales.
. Figura 2. perfil fenólico de extractos metanólicos de cacao en grano seco. Milled puntas de
granos de cacao se extrajeron en 70% de metanol y el agente de extracción resultante se
secaron y se sometieron a hidrólisis alcalina antes de la separación por HPLC y detección a
280 nm. (A) traza típica de HPLC para una variedad híbrida que muestra la numeración de los
picos principales observados. IC = Control Interno (hesperitina). (B) la contribución relativa de
cada pico de contenido total de compuestos fenólicos. Los valores se presentan como% del
total del área integrada de los picos de correlación después de para el control interno.
Opciones Figura
La capacidad antioxidante de los granos, se determinó utilizando el ensayo FRAP ( . Fig.
3 ). Este se encontró que era 12,4 ± 7,3 mmol TE g -1 para la variedad tradicional,
mientras que los valores para los híbridos varió de 21,6 + 2,7 a 45,5 + 2,86 mol TE g -
1 . Los valores para HV1 ( p = 0,001), HV2 ( p = 0,004) y HV3 ( p = 0,002) fueron
significativamente más alto que el de los granos tradicionales. El valor para HV4,
mientras numéricamente mayor que para los granos tradicionales, no fue
estadísticamente significativa ( p = 0,055). Es difícil comparar estos valores de
capacidad antioxidante con los citados por los trabajadores anteriores, debido a las
diferencias en ambas metodologías de ensayo y extracción. Sin embargo, Gu, Casa,
Wu, Ou y Prior (2006) utilizando una extracción etanólica y un ensayo ORAC reportaron
valores de 826 + 103 mmol TE g -1 para el polvo de cacao natural. Estos valores son
notablemente superiores a los encontrados en este estudio. Desde fenólicos
representan un componente importante de los granos de cacao se postula que
representan la principal fuente de la capacidad antioxidante en granos de cacao y sus
productos. AsíOthman Ismail, Ghani y Adenan (2007) monitoreados fenólicos y
capacidad antioxidante en los granos de una variedad de orígenes geográficos, entre
ellos Ghana, y han demostrado que hubo un efecto significativo de la "zona de
producción" en ambos parámetros y que hubo una buena correlación entre fenoles
totales y capacidad antioxidante. Del mismo modo, Gu et al. (2006) han demostrado
una buena correlación entre los fenoles totales y capacidad antioxidante en los granos
de cacao y sus productos. Es interesante observar que en este estudio, mientras que el
contenido fenólico total no se vio afectada en los híbridos, la capacidad antioxidante
aparentemente ha aumentado. Esto podría sugerir la presencia de otros antioxidantes
importante en el grano de cacao.
. Figura 3. Capacidad total antioxidante extraíble de granos de cacao tradicionales o
híbridas. Puntas de fresado de cualquiera de los granos de cacao tradicionales (TV) o híbrido
(HV1-HV4) se extrajeron en 70% de metanol y la capacidad antioxidante total medido
utilizando el ensayo FRAP. Los resultados se expresan como equivalentes de Trolox y
presentan como la media y SE ( n = 3). Los valores marcados con (*) representan muestras
cuya capacidad antioxidante es significativamente ( p <0,005) diferente a la TV.
Opciones Figura
En conclusión, parece que hay poca o ninguna diferencia entre las variedades híbridas
y los granos de cacao de tipo tradicional en términos de cualquiera de sus contenidos o
composición fenólica. La capacidad antioxidante de los híbridos es equivalente a, o
incluso puede ser mayor que, los granos tradicionales. Sobre la base de este estudio,
por lo tanto, es poco probable que la introducción de estas variedades híbridas en el
comercio tendría un impacto en la prestación de estos nutrientes esenciales para el
consumidor.
Diario de Composición y Análisis de AlimentosVolume 19, Issues 6-7 , septiembre-noviembre de 2006, Pages 612-619
La biodiversidad y la nutrición: un camino común
La biodiversidad y la nutrición: un camino común
Artículo Original
Estudio comparativo de diferentes cacao ( Theobroma cacao L.) clones en términos de sus compuestos fenólicos y antocianinas contenidos
Nicolas Niemenak una , , , ,
Christina Rohsius b ,
Silke Elwers b ,
Denis Omokolo Ndoumou una,
Reinhard Lieberei b
un Laboratorio de Fisiología Vegetal, Departamento de Ciencias Biológicas, Escuela de Formación
Normal Superior de la Universidad de Yaundé I PO Box 47 Yaounde, Camerún
b Instituto de Botánica Aplicada de la Universidad de Hamburgo, Ohnhorststrasse 18, 22609 Hamburgo,
Alemania
http://dx.doi.org/10.1016/j.jfca.2005.02.006 , Cómo citar o enlazar Usando DOI
Permisos y reimpresiones
Abstracto
Los polifenoles se analizaron a 280 nm por el dispositivo de HPLC utilizando un detector
de matriz de fotodiodos (PDA). Las antocianinas se separaron con la columna de la SEP-
PAK Vac 6 cc 1000 mg (Waters) y se midió a 520 nm con un PDA. Diecinueve clones de
cacao de Camerún banco de genes fueron analizados. Se utilizaron semillas frescas y
fermentados-como. Dos polifenoles principales estaban presentes en las muestras:
catequina y epicatequina. Epicatequina representa el 2-4% de MS de polvo de semillas
de cacao desgrasado. Sustancias no definidas llamados A, B y C también se encuentran
en las semillas de cacao. La sustancia A se discute como un derivado de ácido cafeico
y un compuesto éster enlazado. Sustancias B y C son oligómeros de
proantocianidinas. No se detectaron ácido Protocatechiuc y quercetina. Dos
antocianinas se encuentran en las semillas del cacao: cianidina-3-galactosidasa y
cianidina-3-arabinósido. Representan 0,02 a 0,4% de MS de polvo de semillas de cacao
desgrasado.Fenoles totales, catequina, epicatequina y antocianina en granos frescos y
fermentados-como eran genotipo-dependiente. Los polifenoles de las semillas de dos
vainas diferentes de un mismo clon mostró una diferencia cuantitativa importante. Test
de correlación de Spearman mostró que no existe una correlación entre el número de
semillas por vaina, peso de la vaina y el contenido de compuestos polifenólicos. Sin
embargo, se encontró una correlación negativa entre el número de semillas por vaina y
el contenido de catequinas ( r = - 0 , 4 6 3 , P < 0 , 0 1 ). No se observaron
agrupaciones de muestras utilizando PCA y análisis de agrupamiento jerárquico. La
separación entre los grupos está relacionada con su contenido de polifenoles y
antocianinas.
Palabras clave
Las antocianinas ;
HPLC ;
Análisis de componentes principales ;
Los compuestos polifenólicos ;
Semillas;
Theobroma cacao
1. Introducción
En las plantas superiores, muchos fenómenos y funciones son atribuibles a los
metabolitos secundarios. La naturaleza de los compuestos de polifenol en las plantas
es complejo. Los fenoles se han asociado con procesos de la planta y el tejido de
maduración, mecanismos de defensa ( Kubo y Matsumoto, 1984 ), y la caracterización
sensorial de los productos alimenticios derivados de las plantas ( Cimato et al., 1990 ).
Los granos de cacao son ricos en polifenoles, contribuyendo algunos 12-18% del peso
en seco de todo el grano ( Bravo, 1998 ). Polifenoles de cacao de frijol se han asociado
con el sabor y color del chocolate. En la fermentación aeróbica, pigmentos marrones se
forman a partir de polifenoles ( Forsyth, 1952 ). La epicatequina y catequina polifenoles
son oxidados a quinonas, y la condensación de las proteínas y polifenoles resultados en
una reducción de la astringencia y sabor amargo. Las quinonas pueden también
complejo con aminoácidos, péptidos y proteínas y polimerizar con otros
flavonoides. Taninos de alto peso molecular complejos con proteínas a través de
enlaces de hidrógeno, y el resultado de estas reacciones es un agua, pigmento
insoluble marrón. Granos de cacao frescos contienen pigmentos antocianidina púrpura,
3 - β -Galactosil-y 3 - α - L -arabinosil-cyanidins. Durante la fermentación, estos
pigmentos se hidrolizan por glicosidasas, lo que resulta en un blanqueo de los
cotiledones ( Forsyth y Quesnel, 1957 ).
Flavonoides de cacao se ha informado que tienen una amplia gama de propiedades
biológicas, incluyendo la síntesis de eicosanoides de modulación, el aumento de la
síntesis de óxido nítrico, la reducción de la tasa de lipoproteínas de baja densidad
(LDL), la oxidación, la inhibición de la activación de plaquetas, estimulación de la
producción de citocinas antiinflamatorias, y la inhibición de la producción de ciertas
citoquinas proinflamatorias ( Waterhouse et al, 1996. ; Kondo et al, 1996. ; Mao et al,
1999. ; Karim et al, 2000. ; Mao et al, 2000. ; . Rein et al, 2000 ; Schramm et al,
2001. ; Wan et al, 2001. ). Estas actividades biológicas diversas se cree que son
atribuibles a un grupo de compuestos polifenólicos presentes en el cacao, incluyendo
los monómeros flavan-3-ol (-)-epicatequina y (+)-catequina y varios oligómeros de
procianidina construidas sobre estas unidades monoméricas.
Recientemente, Lee et al. (2003) mostraron que el cacao tiene más sustancias
fitoquímicas fenólica y una mayor capacidad antioxidante que el té y el vino
tinto. En T. cacao L., estudios de compuestos fenólicos se han centrado en los granos
de asar y licor de cacao debido a su importancia en la industria del chocolate.Poca
atención se ha prestado a cacao crudo y muy rara vez el espectro de polifenoles en
granos frescos se ha investigado al mismo tiempo como la base de fitoquímicos
fenólicos presentes en el chocolate. Los granos de cacao se utilizan en la industria de
confitería provenir de una amplia gama de áreas geográficas, y pueden tener
diferentes propiedades químicas y organolépticas. Por consiguiente, el productor de
chocolate debe seleccionar y combinar estos granos en diversas proporciones con el fin
de cumplir con ciertas normas de calidad y especificación económica. Los fabricantes
tienen que producir chocolates de sabor constante utilizando materia prima que es
variable. Por esta razón, es importante para ellos tener criterios analíticos para la
rápida estimación de la calidad de la materia prima.
Los polifenoles se analizaron en planta, planta de semillero y el tejido culturas maduras
de cacao ( Jalal y Collin, 1977 ). Leucocianidina se fraccionó en las semillas de cacao
por Quesnel (1968) . La medida en que el genotipo, la procedencia geográfica y el
método de fermentación y el tamaño de las vainas de cacao afecta polifenoles no se ha
demostrado de manera inequívoca y estudios que abordan estas cuestiones son más
bien escasos.
El objetivo de este estudio fue utilizar HPLC para determinar el contenido de polifenoles
en los granos de cacao crudos y fermentados-como las semillas de Camerún y luego de
evaluar las posibles relaciones entre compuestos fenólicos y su origen geográfico. La
correlación entre el tamaño de la vaina, se analizan el número de granos por vaina y el
contenido polifenólico.
2. Materiales y métodos
2.1. Muestras
Las semillas de cacao eran de las vainas maduras, genéticamente indefinidos
cosechados en el "Institut de Recherche pour le Développement Agricole (IRAD)"
Nkoemvone, Ebolowa (Camerún). Las semillas fueron analizadas en el Instituto de
Botánica Aplicada de la Universidad de Hamburgo, Alemania. A su llegada, se midieron
los parámetros morfológicos (peso de la vaina, el número y peso de las semillas por
vaina) para cada clon. Semillas no fermentadas se tomaron de las vainas (7 días
después de la cosecha), choque-congelaron en nitrógeno líquido después de la
eliminación de testas y se liofiliza. Para los estudios de fermentación-como, semillas
con testa se colocaron en placas de Petri (≈ 10 semillas / placa) y se incubaron a 25 ° C
durante 1 y 2 días antes de la elaboración.
2.2. Reactivos y normas
La epicatequina y quercetina se obtuvieron de Sigma. Ácido Protocatechiuc y catequina
eran de Aldrich y Fluka, respectivamente. 3 - α - L -arabinosil cyanidinin y 3 - β - D -
galactosil cianidina fueron adquiridos de polifenoles. Todos los disolventes utilizados
eran de grado analítico comprado a Merck (Darmstadt, Alemania). El agua se purificó
en un sistema de purificación de agua Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.).
2.3. La extracción de polifenoles
Antes de la extracción, los ensayos preliminares ( Waterman y Mole, 1994 ) mostraron
que las 60:40 de acetona / agua disolvente (v / v) y los diferentes procedimientos
descritos en este documento para el fraccionamiento de los diferentes grupos fenol
maximizadas el porcentaje de recuperación.
Dos gramos de cotiledón liofilizado se molieron hasta un polvo fino en un Kroll Retsch o
Resch MM 200 (Alemania) molino de laboratorio con 10 ml de n -hexano para la
eliminación de grasa. La mayor parte de la grasa de semilla residual se extrajo lavando
el polvo con 25 ml de n -hexano en un embudo Buchner.
Los compuestos fenólicos se extrajeron mediante agitación de 0,5 g de la muestra libre
de grasa en el hielo tres veces con 50 ml de acetona acuosa al 60% con agitación
constante. Después de la centrifugación a temperatura ambiente a 5000 rpm durante
15 min, los tres sobrenadantes se combinaron en un matraz que contenía 2 ml de
ácido acético glacial. La acetona se eliminó mediante evaporación rotatoria bajo vacío
parcial a 40 ° C. La fase acuosa obtenida se ajustó a 100 ml con agua Milli-Q Plus en un
matraz aforado.Total de contenidos de compuestos polifenólicos se analizaron a partir
de esta fase acuosa.
Para limpiar la muestra, 30 ml de la fase acuosa anterior se mezclaron cinco veces con
30 ml de acetato de etilo. Después de 1 min agitando, las fases acuosas se desecharon
y las fases orgánicas se combinaron, se secaron mediante la adición de 20 g de
anhidro Na 2 SO 4 y se filtraron después de 5 minutos en la oscuridad con papel
Whatman. El residuo de sal se desechó y la fase orgánica clara se secó a 40 ° C bajo
vacío. El extracto seco de compuestos polifenólicos se disolvió en 5 ml de metanol puro
(LiChrosolv, Merck) y se filtró con papel de Millipore (0,45 micras). Los extractos de
polifenoles puros fueron almacenadas a -20 ° C hasta que la HPLC analizó.
2.4. La purificación de antocianinas
La purificación de antocianinas se llevó a cabo a partir de la fase acuosa de 100 ml
usando un Sep-Pak ®Vac columna de 6 cc C18 (Waters). La columna se eluyó primero
con una mezcla de metanol puro (10 ml): ácido acético al 2% (10 ml). Un ml de alícuota
de la muestra de la fase acuosa 20 se cargó en la columna y se lavó con 2 x 5 ml de
ácido acético al 2%. Las antocianinas se eluyen a continuación dos veces de la
columna con 5 puro metanol de grado analítico ml (LiChrosolv, Merck). Las fracciones
que eluyen se combinaron y se secaron por evaporación rotatoria. Los residuos se
volvieron a suspender en 2 ml de una mezcla de metanol puro y ácido acético al 2%.
2.5. Análisis de compuestos polifenólicos por HPLC de fase inversa
Total de contenidos de compuestos polifenólicos en los extractos de granos de cacao
se determinaron de acuerdo con el procedimiento de Folin-Ciocalteu ( Singleton y
Rossi, 1965 ).
Los análisis cromatográficos se llevaron a cabo en el sistema de HPLC de Waters
equipado con un 200-A2 inyector automático, bomba de HPLC Knauer 64, Knauer
HPLC-programa 50 controlador de disolvente, Waters 996 detector de matriz de
fotodiodos (PDA) y se analizaron con el software de MilleniumTM 3,2 (Millipore
Corporation, Milford , MA, EE.UU.). Separación de los polifenoles se realizó en un
LicroCart 250-4 octadecilsililo (SAO) C18, 5 micras de partículas [RP-18 (5 micras)]
columna (Merck) a 26 ° C. La columna de protección consistió en una LicroCart 4-4
Lichrospher 100 RP-18 (5 micras) (Merck). La fase móvil binaria ( Tabla 1 ) consistía en
ácido acético al 2% en agua (A) y mezcla de ácido acético concentrado-acetonitrilo-
agua (04:09:01 v / v / v) (B). Veinte microlitros de muestra se inyectó en la columna. La
separación de los polifenoles se controló usando un detector PDA a 280 nm y
antocianinas fueron registrados a 520 nm. La identificación de cada pico se confirmó
por comparación del tiempo de retención y la coelución con patrones auténticos de
ácido protocatechiuc, catechinhydrate, epicatequina, quercetina, cianidina-3-
galactósido y cyanindin-3-arabinósido.
Tabla 1. gradiente binario utilizado para la separación de compuestos de polifenol y
antocianinas presentes en los granos de cacao
Tiempo (min) El flujo de combustible (ml min -1 ) Disolvente A (%) Disolvente B (%)
0 1.2 90 10
8 1.2 90 10
38 1.1 77 23
50 1.0 60 40
70 1.0 10 90
73 1.0 10 90
78 1.2 90 10
93 1.2 90 10
Opciones de tabla
2.6. El análisis estadístico
Los datos se sometieron a análisis de varianza y las correlaciones entre el tamaño de la
fruta, número de semillas por vaina y el contenido de compuestos polifenólicos
utilizando el software SPSS 10.0 para Windows. Los valores medios se compararon
mediante la diferencia menos significativa (DMS) de prueba.Análisis de componentes
principales (PCA) se realizó para describir la variabilidad de los datos químicos.Este
análisis se realizó con el SPAD 4.01 (Système d'portátil analizar des données) software.
3. Resultados y discusión
Los contenidos totales de compuestos polifenólicos de cacao en grano se determinaron
y se expresaron como equivalentes de epicatequina. El contenido total promedio varió
desde 67 hasta 149,2 mg g -1 MS en grano recién cosechado, 102,3-139,6 mg g -1 MS en
1 día de edad fermentados-como frijol y 101,3-143,6 mg g -1 MS en 2 - frijoles días de
edad fermentadas ( Tabla 2 ). Diferentes tendencias y la gama de concentraciones se
encontraron en estudios que informaron los niveles de polifenoles en los granos de
cacao de una población autofecundada y heterocigotos ecuatoriana del clon EET 95
( Luna et al., 2002 ).
Tabla 2. polifenoles totales, catequina, epicatequina y antocianos contenidos en las semillas
recién cosechadas de diferentes vainas de cacao de diferentes clones
Clones Peso de las vainas (g)
Número de semillas / vaina
Polifenoles totales (mg g-1 ) l
Catequina (mg kg -1)
Epicatequina (mg kg -1 )
Cianidina-3-galactosidasa (mg kg -1 )
Cianidina-3-arabinósido (mg kg -1 )
SNK10 (A)
304.97 32 119,7 836 28 186 853 978
SNK10 (B)
271.73 42 122,9 725 29 028 820 880
SNK413 376.03 31 103,5 1036 29 839 1031 1453
SNK64 (A)
412.00 52 96.8 895 29 046 650 2375
SNK64 (B)
299.79 30 105,7 1389 27 787 1483 2485
SNK60 389.20 26 114,6 890 30 924 997 1692
Clones Peso de las vainas (g)
Número de semillas / vaina
Polifenoles totales (mg g-1 ) l
Catequina (mg kg -1)
Epicatequina (mg kg -1 )
Cianidina-3-galactosidasa (mg kg -1 )
Cianidina-3-arabinósido (mg kg -1 )
SNK478 362.06 45 122.2 497 34 750 601 1040
SNK480 (A)
324.14 46 86.6 694 24 499 494 821
SNK480 (B)
354.52 46 117,6 899 33 230 1833 2186
SNK476 352.52 25 149,2 863 41 519 1544 2732
SNK16 322.47 35 134,4 1234 43 903 396 941
SNK505 (A)
357.86 30 136,2 833 42 926 308 2273
SNK505 (B)
277.89 37 109,6 328 31 697 nd 673
SNK417 (A)
326.68 44 67.0 125 14 435 94 404
SNK417 (B)
226.37 43 75.8 179 16 989 79 502
ICS84 (A)
405.06 44 129,0 503 36 282 1486 3212
ICS84 (B)
566.15 40 147,8 672 39 098 1288 1693
ICS84 (C)
517.26 40 121,4 968 32 618 1099 1114
ICS84 (D)
464.08 22 94.1 609 29 452 438 659
ICS1 (A)
321.16 34 126,6 332 35 623 455 1508
ICS1 (B) 324.61 46 134,6 525 38 692 321 894
ICS95 (A)
337.70 34 100.7 1192 30 894 294 466
ICS95 (B)
640.52 38 139.4 867 43 154 1781 4552
ICS95 (C)
351.24 40 122,7 545 37 319 561 1581
ICS95 (D)
359.93 39 147,9 431 34 606 1006 1388
UPA134 (A)
148.80 29 118,5 737 29 788 1807 2452
UPA134 (B)
283.64 34 104,0 781 20 833 590 639
UPA143 (A)
417.21 28 88.9 555 18 639 369 491
UPA143 (B)
352.59 36 118,2 974 33 225 699 1327
UPA143 (C)
277.33 28 116,9 1295 29 910 1402 1776
UPA143 (D)
375.73 22 114,4 1059 35 545 792 1096
UPA143 (E)
896.08 44 103,5 782 35 639 379 940
IMC60 (A)
571.04 35 131,2 1239 27 196 1829 2027
IMC60 (B)
383.00 26 139.4 1442 34 363 2817 4443
Clones Peso de las vainas (g)
Número de semillas / vaina
Polifenoles totales (mg g-1 ) l
Catequina (mg kg -1)
Epicatequina (mg kg -1 )
Cianidina-3-galactosidasa (mg kg -1 )
Cianidina-3-arabinósido (mg kg -1 )
T79/467 (A)
695,5 57 84.4 170 16 880 448 1661
T79/467 (B)
548.05 34 94.1 688 20 193 1313 2389
T79/501 (A)
368.90 45 101,0 nd 26 852 477 1012
T79/501 (B)
380.64 31 112,9 507 28 563 1362 1795
Dependiendo de la disponibilidad de material vegetal, cuatro y cincuenta y nueve vainas se
analizaron por clon. Los resultados se expresaron como unidad / g o kg de polvo de grano de
cacao seco desgrasado. Los resultados son la media de análisis duplicados.
Opciones de tabla
El contenido total de compuestos polifenólicos en granos recién cosechadas en
comparación con granos fermentados-como ( Tabla 3 ) mostró que a partir de la misma
vaina no hay evolución regular de este determinante durante la fermentación-como
proceso. En algunos clones, compuestos fenólicos totales aumentaron un 25% después
de 2 días (SNK10, T79/467, UPA143), disminuyó en otros, entre un 14% and25%
(ICS84, ICS1), mientras que se mantiene constante en los clones SNK413, IMC60, ICS95
y UPA134 . De acuerdo con Forsyth (1952) , las pérdidas de fenol total son debido a la
difusión de los cotiledones y se pueden calcular como 24% después de 60 h de
fermentación, llegando a 58% después de 8 días. Los compuestos fenólicos también
complejos con las proteínas de cacao y polisacáridos ( Forsyth et al, 1958. ; Zak y
Keeney, 1976 ). Por otra parte, aumentar de los polifenoles durante el proceso de
fermentación-como puede reflejar una formación de proantocianinas poliméricos.
Tabla 3. Cambios en polifenoles totales, catequina, epicatequina y el contenido de antocianina
durante la incubación de fermentación similar a 25 ° C de los diferentes granos de cacao de
diferentes clones (de lo contrario, como en la Tabla 2)
Clones Polifenoles totales (mg g -1)
Catequina (mg kg -1 )
Epicatequina (mg kg -1 )
Cianidina-3-galactosidasa (mg kg -1 )
Cianidina-3-arabinósido (mg kg-1 )
SNK413 Sin fermentar 103,5 1036 29 839 1031 1453
Fermentados-como (d 1 )
112,8 1121 30 723 1080 1481
Fermentados-como (d 2 )
105,3 917 28 037 1036 1563
SNK480 Sin fermentar 86.6 694 24 499 494 821
Fermentados-como (d 1 )
119,8 1298 33 098 2127 4552
Fermentados-como (d 2 )
116,2 1319 32 980 1024 3821
T79/467 Sin fermentar 94.1 688 20 193 1313 2389
Fermentados-como (d 1 )
112,1 950 26 632 1925 3507
Fermentados-como (d 2 )
126,6 1278 31 358 2554 5031
Clones Polifenoles totales (mg g -1)
Catequina (mg kg -1 )
Epicatequina (mg kg -1 )
Cianidina-3-galactosidasa (mg kg -1 )
Cianidina-3-arabinósido (mg kg-1 )
IMC60 Sin fermentar 139.4 1442 34 363 2817 4443
Fermentados-como (d 1 )
139,6 1618 34 936 2590 3915
Fermentados-como (d 2 )
141,6 1735 37 652 2359 3473
ICS95 Sin fermentar 139.4 867 43 154 1781 4552
Fermentados-como (d 1 )
135,7 742 42 419 1497 3543
Fermentados-como (d 2 )
143,6 739 44 644 1045 3198
UPA134 Sin fermentar 118,5 737 29 788 1807 2452
Fermentados-como (d 1 )
113,2 735 28 626 1596 2120
Fermentados-como (d 2 )
107,9 814 26 761 1228 2184
ICS1 Sin fermentar 126,6 332 35 623 455 1508
Fermentados-como (d 1 )
116,0 370 30 584 354 2455
Fermentados-como (d 2 )
103,0 272 2401 149 1639
ICS84 Sin fermentar 129 503 36285 1486 3212
Fermentados-como (d 1 )
1023 337 27691 1220 2752
Fermentados-como (d 2 )
1143 330 32795 1172 2617
UPA143 Sin fermentar 118,2 974 33225 699 1327
Fermentados-como (d 1 )
138,6 1274 40089 1283 2422
Fermentados-como (d 2 )
130,2 1085 35884 1008 1672
Opciones de tabla
Los compuestos polifenólicos se identificaron por su comportamiento cromatográfico y
espectros UV (280 nm), HPLC y comparaciones cromatográficas con patrones
auténticos. El patrón cromatograma ( . Fig. 1a ) que se encuentra en granos de cacao
fue similar a la descrita por Elwers (2002) a partir de cacao de otros países. Los
polifenoles predominantes identificados en liofilizado de cacao desgrasada frijol fueron
catequina y epicatequina. No se detectaron ácido Protocatechiuc y quercetina. La
epicatequina representado 2-4% ( Tabla 2 ) de la masa seca del polvo desgrasada,
mientras que la catequina era aproximadamente 0,05-0,1% de frijol desgrasada.
. Figura 1. cromatogramas de HPLC de (a) polifenoles y (b) las antocianinas en las semillas de
cacao. Condiciones cromatográficas se describen en el texto. Identificación de los picos: 1-
sustancia A, 2-Catechinhydrate, 3-sustancia B, 4-epicatequina, 5-Sustancia C, 1'-cianidina-3-
galactósido (tiempo de retención, 19,123 min), 2'-cianidina-3-arabinósido (tiempo de
retención, 24,463 min). Los otros picos en (a) son aquellos de los alcaloides de purina y sus
derivados. Así picos a 4,5 y 11,5 min son teobromina y cafeína, respectivamente.
Opciones Figura
Está bien establecido que la (-)-epicatequina es el polifenol principal que se encuentra
en los granos de cacao ( Kim y Keeny, 1984 ; Nelson y Sharpless, 2003 ; Zhu et al,
2003. ). Ácido Protocatechiuc se discute que se sintetizan en los granos de cacao
después de la infección, por lo que pod involucrados en mecanismos de defensa
patógenos vis-à-vis y parásitos. Tres compuestos no identificados fueron revelados con
tiempo de retención a ≈ 6,9 min (sustancia A); ≈ 12,6 min (sustancia B) y ≈ 20,4 min
(sustancia C). La sustancia A, debido a los resultados de PDA es un derivado de ácido
cafeico y un compuesto éster enlazado. La sustancia B y C son oligómeros de
proantocianidinas. Porter et al. (1991)establecieron la presencia de oligómeros de
procianidina a través heptamers en el cacao utilizando la columna y cromatografía en
capa fina y bombardeo de átomos rápidos espectrometría de masa negativa.Evidencia
de oligómeros de procianidinas de cacao a través octamers fue reportado
por Clapperton et al.(1992) que utiliza una combinación de cromatografía en columna,
HPLC de fase inversa, y espectrometría de masas de iones secundarios líquida
positiva. Procianidinas monoméricos y oligoméricos presentes en el cacao y el
chocolate se separaron e identificaron por Hammerstone et al. (1999) utilizando un
método de cromatografía líquida de alta en fase normal modificado junto con el análisis
de espectrometría de masas en línea usando una cámara de ionización por
electrospray y la presión atmosférica.
Durante la fermentación similar a la incubación, cambio en compuestos de polifenol
dependía de los clones y los metabolitos analizados ( Tabla 3 ). La fermentación de los
granos de cacao es crítico para el desarrollo de los precursores de sabor a
chocolate. Las interacciones complejas entre los polifenoles para formar taninos de alto
peso molecular y su asociación con las proteínas juegan un papel importante en la
calidad general de los granos de cacao fermentados para la producción de chocolate
( Forsyth, 1952 ).
. Figura 1b muestra un cromatograma típico del extracto de antocianina. Los
principales compuestos de antocianina en grano recién cosechado incluyen cianidina-3-
arabinósido que van desde 466 hasta 4552 mg kg -1 de los granos secos y desgrasada,
y cyanindin-3-galactósido que van desde 294 hasta 2817 mg kg -1 (Tabla 2 ). Contenido
del cyanindin-3-arabinósido en todos los clones fueron consistentemente más altas en
granos no fermentados y fermentados-como en comparación con cianidina-3-
galactosidasa. Durante la fermentación similar a la incubación, la variación en
antocianina era clon y de la vaina dependiente ( Tabla 3). El valor medio de
antocianinas totales en recién cosechadas, fermentados-como (d1) y fermentados-
como (d2) de frijoles de nueve genotipos de cacao fue de 6587.5, 8239 y 6720 por mg
kg -1 MS, respectivamente.
Test de correlación de Spearman mostró que no existe una correlación entre el número
de semillas por vaina, peso de la vaina y el contenido de compuestos polifenólicos. La
ausencia de correlación significativa entre el contenido de polifenoles y los parámetros
morfológicos puede derivar de diferencias evolutivas de acuerdo con factor ambiental
que los vínculos de genes. Sin embargo, se encontró una correlación negativa entre el
número de semillas por vaina y el contenido de catequinas ( r = -0 , 4 6 3 , P < 0 , 0 1 ). Existe una correlación significativa positiva alta ( r = 0 , 8 4 2 , P < 0 , 0 1 ) Se encontró entre el contenido total de compuestos polifenólicos
y la acumulación epicatequina en los granos de cacao. De la misma manera el
contenido total de compuestos polifenólicos y cyanindin-3-galactósido mostró una
correlación positiva con un coeficiente de r = 0 , 8 4 2 a P < 0 . 0 1 .
Un PCA se llevó a cabo en los datos de todos los clones estudiados. Los tres primeros
componentes principales representan el 93,76% de la variabilidad total, los fenoles
totales, catequina, epicatequina y el contenido de antocianina son las características
dominantes en el primer componente principal (58,60% de la variabilidad total) y el
contenido epicatequina la característica con mayor peso en el segundo componente
principal (21,60% de la variabilidad total). Contenido en catequinas mostró el mayor
peso en el tercer componente principal (14,06% de la variabilidad total). Fig. 2 muestra
una representación clásica de las puntuaciones de PC1 y PC2 (79,70% de la varianza
total). Haba del clon IMC60 B contiene una gran cantidad de catequina, cianidina-3-
galactósido y cianidina-3-arabinósido, y esta es la razón PC1 separa claramente de las
otras muestras. Examen de un gráfico de las puntuaciones de dos dimensiones en el
espacio definido por la PC1 y PC2 muestra que la distribución de las muestras sigue un
patrón. La separación entre los grupos se relaciona con el contenido de polifenoles de
los granos. Esto se aclaró mediante la prueba de LSD. No se encontraron medios
Promedio de compuestos polifenólicos dentro del grupo a ser estadísticamente
diferentes ( P < 0 , 0 5 ). El primer grupo comprende 8 clones de cacao contiene altas
cantidades de fenoles totales, catequina, epicatequina y antocianina (dominando
características en el primer componente principal). El segundo grupo (6 clones)
contiene cantidades promedio de fenoles totales y la epicatequina en comparación con
el total de las cantidades medias. El tercer grupo (12 clones) contiene cantidades
promedio de catequina y cianidina-3-galactósido en comparación con el total de
cantidades medias. Grupo 4 (clones SNK417A y B, T79/467A) difiere de los otros por su
bajo contenido en todos los compuestos analizados. El análisis de agrupamiento
también clasifica las muestras en cuatro grupos de acuerdo con la distancia de 0,5
(dendrogam no se muestra).
. Figura 2. Cargando parcela de los dos primeros componentes principales de polifenoles
totales, epicatequina, catequina, cianidina-3-arabinósido y cianidina-3-galactósido de cacao de
diferentes genotipos.
Opciones Figura
Hay varios factores internos y externos que afectan a la calidad y / o cantidad de
compuestos polifenólicos en las plantas. Estos incluyen la diversidad genética (varietal
y regional), así como muchas variables ambientales, por ejemplo, las condiciones de
cultivo, tales como la intensidad de la luz, la humedad, la temperatura, el uso de
fertilizantes, heridas, infecciones u otros factores de estrés ( Macheix et al,
1990. ;Chalker -Scott, 1999 ; Cabrita et al, 2000. ; Vallejo et al, 2003. ; Stintzing y
Carle, 2004 ). La calidad de los compuestos polifenólicos presentes en el cacao crudo
de Camerún está de acuerdo con los de Ghana y Malasia, a pesar de sus diferencias
genéticas ( Elwers, 2002 ). Las diferencias cuantitativas registrados dentro de los
clones se podrían explicar, al menos en parte, por la interacción de varios genéticos,
fisiológicos, agronómicos (es decir, la posición de las vainas en el árbol), y los factores
ambientales (microclima) la modificación de la concentración final en cada vaina. Por
ejemplo, se ha demostrado que muchos factores ambientales controlan la acumulación
de antocianinas en las plantas ( Roubelakis-Angelakis y Kliewer, 1986 ). Además de la
luz y la temperatura ( Kliewer, 1977 , Cobbina y Miller, 1987 ;Wang y Zheng, 2001 ), la
disponibilidad de nutrientes para las plantas también tiene una gran influencia en la
acumulación de polifenoles ( Francis y Atwood, 1961 ; Doak y Miller, 1968 ; Piccaglia et
al., 2002 ).
4. Conclusión
Nuestros resultados sugieren que no hubo diferencia cualitativa en polifenoles en los
granos de cacao, a pesar de su origen genético y el proceso de fermentación
similar. Como dominar los componentes fenólicos epicatequina, catequina, cianidina-3-
galactosidasa y cianidina-3-arabinósido así como tres sustancias indefinidas A, B, C se
encontraron. Diferencia cuantitativa encontrado podría atribuirse a las condiciones de
cultivo (microclima, la posición de los frutos en el árbol). Se encontraron correlaciones
negativas entre el número de semillas por vaina y contenido en catequinas. Análisis de
agrupamiento jerárquico PCA y clasifica la muestra en función de su contenido de
polifenoles y antocianinas.
Agradecimientos
El estudio fue apoyado financieramente por el Deutscher Akademischer
Austauschdienst (DAAD) a través de subvención a Niemenak Nicolas (Grant N º 413;
A/02/04357). Los autores expresan agradecimiento al Sr. Thomas Tumforde y el Sr.
Detlef Boehm por su ayuda en los experimentos
Diario de Composición y Análisis de AlimentosVolume 23, Issue 8 , diciembre de 2010, Pages 790-793
Artículo Original
Detección fluorescente de (-)-epicatequina en micromuestras de semillas de cacao y productos de cacao: Comparación con el método de Folin-Ciocalteu
Israel Ramírez Sánchez- un , b ,
Lisandro Maya una ,
Guillermo Ceballos un , b ,
Francisco Villarreal una , ,
el Departamento de Medicina de la Universidad de California, San Diego, San Diego, CA, Estados Unidos
b Seccion de Posgrado, Escuela Superior de Medicina del Instituto Politécnico Nacional, Ciudad de
México, México
http://dx.doi.org/10.1016/j.jfca.2010.03.014 , Cómo citar o enlazar Usando DOI
Permisos y reimpresiones
Abstracto
Los compuestos polifenólicos de la familia de flavonoides están muy presentes en las
semillas de cacao y sus productos de cacao. Los resultados de los estudios que utilizan
los productos de cacao indican efectos beneficiosos de los flavonoides en los puntos
finales cardiovasculares. La evidencia indica que el (-)-epicatequina es el principal
flavanol del cacao asociado con efectos cardiovasculares, por lo que la cuantificación
precisa de su contenido en las semillas de cacao o productos de cacao es
importante. Los métodos comunes para la cuantificación del contenido fenólico en los
productos de cacao se basan en la reacción de fenoles con reactivos colorimétricos
tales como el método de Folin-Ciocalteu (FC). En este estudio, se comparó el método
de FC de determinaciones fenólicos con 2 normas diferentes (ácido gálico y (-)-
epicatequina) para la construcción de curvas de calibración. Se comparan estos
resultados con los obtenidos a partir de un método fluorométrico sencilla (ex 280 /
Em 320 nm) se utiliza para determinar catequina / (-)-epicatequina contenido en las
muestras de las semillas de cacao y productos de cacao. Los valores obtenidos a partir
del método de determinación de polifenoles FC producen una sobreestimación del
contenido de fenoles (flavonoides), cuando se utiliza ácido gálico como estándar. Por
otra parte, la epicatequina es un estándar más fiable debido a su abundancia en las
semillas de cacao y productos de cacao. El uso de espectros fluorométrica produce un
medio sencillo y altamente cuantitativo para una cuantificación más precisa y rápida
de cacao catequinas. Valores fluorométricos son esencialmente de acuerdo con lo
reportado el uso de métodos más complicados. En conclusión, el uso de espectros de
emisión de fluorescencia es un medio rápido, práctico y adecuado a la cuantificación
de catequinas en las semillas de cacao y productos de cacao.
Palabras clave
Semilla de cacao ;
Productos de cacao ;
Theobroma cacao ;
Fenoles ;
Rapid método de análisis ;
Folin-Ciocalteu ;
Fluorescencia ;
Los flavonoides ;
Los flavanoles ;
(-)-Epicatequina ;
Catequina ;
Análisis de productos alimenticios ;
Composición de los alimentos
1. Introducción
Los compuestos polifenólicos de la familia de los flavonoides están presentes
abundantemente en los productos naturales ( Natsume et al., 2000 ). Las plantas
tales Theobroma cacao producir una diversidad de compuestos fenólicos en donde los
flavonoides, taninos y antocianinas son los principales fenoles presentes ( Sanbongi y
col., 1998 y Tomás-Barberán et al., 2007 ). Semillas de cacao contienen, en peso,
muy grandes cantidades de flavonoides (en particular, la flavanoles catequina y (-)-
epicatequina) (Cienfuegos-Jovellanos et al, 2009. ). Catequina y (-)-epicatequina están
presentes en el cacao en una proporción de ≈ 40/60. Estudios de productos de cacao
indican efectos beneficiosos de (-)-epicatequina sobre los parámetros cardiovasculares,
tales como la presión arterial (hipertensión) ( Corti et al, 2009. ). Los flavonoides
también ejercen otros efectos beneficiosos relacionados con la salud. Estos
compuestos actúan como informes, eliminadores de radicales libres y los inhibidores
de la biosíntesis de eicosainoid; en sistemas modelo, sino que también reducen la
oxidación de lipoproteínas de baja densidad, evitar la agregación de plaquetas y
protegen el corazón de la lesión por isquemia-reperfusión ( Ainsworth y Gillespie,
2007 , Xu et al. de 2007 y Yamazaki et al., 2008 ). El contenido de flavonoles de los
productos de cacao varía con el origen de las semillas de cacao y su procesamiento
posterior. Los trabajadores en este campo necesitan un método rápido y fiable de
cuantificar y comparar el contenido de catequina de diversas muestras de modo que
los datos de concentración-dependencia precisos pueden ser obtenidos.
El método más común para la cuantificación del contenido de compuestos fenólicos en
los productos de la planta se basa en la reacción de fenoles con un reactivo
colorimétrico tales como azul de Prusia ( budinos et al., 1980 ) o de Folin-Ciocalteu (FC)
( Ainsworth y Gillespie, 2007 ) . Este método se basa en la reacción de fosfomolibdato y
fosfotungstato con compuestos fenólicos y polifenólicos ( Ainsworth y Gillespie,
2007 y Cicco et al., 2009 ). Una limitación importante del método FC es su falta de
especificidad, ya que otros productos de oxidación pueden interferir con las
mediciones, provocando de este modo overestimatation del verdadero contenido de
polifenoles ( Ainsworth y Gillespie, 2007 ). Aunque este método colorimétrico,
produciendo un contenido de polifenoles "aparente", no es muy fiable, que se utiliza de
forma rutinaria en diversos laboratorios para las determinaciones de fenólicos. En una
comparación de los diferentes productos de cacao, puede ser útil para que nos
hagamos una idea aproximada de (-)-epicatequina nivel (EPI) y catequina (CAT), ya que
sus monómeros y polímeros son abundantes en las muestras de cacao. Por el contrario,
un método fluorométrico simple y rápida facilita la cuantificación del contenido de PAI /
CAT de cacao en los productos que contienen y en muestras biológicas tales como
sangre humana.
En un esfuerzo por mejorar la cuantificación de la (s) contenido en catequinas sin el
uso de metodologías complejas tales HPLC y espectrofotometría de masas, se midió el
contenido de polifenoles presentes en las semillas de cacao y productos de cacao con
el método FC utilizando ácido gálico o PAI como estándares y comparó la los valores
obtenidos con los derivados de los espectros de fluorescencia de catequinas (ex 280 /
Em 320 nm) ( Cho et al., 1989 ).
2. Materiales y métodos
2.1. Desengrasante de muestras
Las muestras utilizadas en este estudio se indican en la Tabla 1 . Para la pérdida de
grasa 1 g de muestra se añadió a 3,5 ml de hexano, se agitó vorticialmente, se
centrifugó (1.350 × g durante 15 min) y se desechó el sobrenadante. El sedimento
resultante se re-extrajo 2 veces más por el mismo procedimiento y el hexano final en
gránulos se evaporó a sequedad bajo una corriente de N 2 . Para el ensayo, las
muestras se reconstituyeron en agua.
Tabla 1. Listado de productos de cacao usados en el estudio.
Muestra original (1 g) Desgrasada de peso seco de la muestra (g), media ± DE
Semillas de cacao crudo pulverizado
0,51 ± 0,07
Polvo de cacao natural 0,82 ± 0,06
Oscuro 85% 0,56 ± 0,05
Oscuro 72% 0,59 ± 0,06
Oscuro 70% 0,56 ± 0,07
De Hershey 60% 0,63 ± 0,09
Oscuro 60% 0,56 ± 0,07
Leche 40% 0,51 ± 0,08
Opciones de tabla
2.2. Extracción de polifenoles de las semillas de cacao y productos de cacao
Cincuenta miligramos de la muestra desgrasada se añadió a 0,5 ml de disolvente de
extracción (acetona: agua: ácido acético, 70:29.5:0.5) y agitaron con vórtex hasta que
la muestra se distribuyó homogéneamente. A continuación, la muestra se incubó (37 °
C, 30 min) con agitación continua. Las muestras se centrifugaron (3.600 × g , 15
min). La extracción se repitió una vez más y todos los sobrenadantes de mezclado. Los
disolventes se evaporaron hasta que el volumen fue de ~ 50 l. El extracto obtenido se
utilizó para medir el contenido total de polifenoles siguiendo el método de Singleton-
Rossi modificado FC o el enfoque fluorométrico ( Roura et al., 2006 ).
2.3. Ensayo de Folin-Ciocalteu
Los ensayos se realizaron usando el reactivo FC de Sigma-Aldrich, tampón de
carbonato de sodio y ácido gálico, PAI o CAT como estándares. Se disolvieron en agua
destilada Normas H 2 O a temperatura ambiente y el color desarrollado evaluado a 765
nm. El ensayo se realizó en un volumen final total de 1.000 l. Se añadieron muestras o
estándares acuosas (100 l) a tubos de ensayo que contienen 700 l de agua destilada y
50 l de reactivo de FC. Las mezclas se agitaron y se dejaron equilibrar (20 ° C, 10 min)
después de lo cual, el color se estabilizó mediante la adición de carbonato de sodio
(150 l de una solución 0,7 mM) y, a continuación, la mezcla se agitó en vórtex y se
incubó a 40 ° C durante 20 min. Los tubos se enfriaron rápidamente en hielo y 200 l de
cada muestra se colocaron en una microplaca de 96 pocillos. El color desarrollado se
leyó a 765 nm utilizando un lector de microplacas (uQuant, Biotek, Instruments
Inc.). Todas las muestras se analizaron al menos por triplicado y el contenido fenólico
se expresaron como mu M (media ± SD).
2.4. Ensayo de fluorescencia
Aquí, 1 l de espacios en blanco, los estándares o muestras desgrasadas se diluyó a 600
l con agua destilada y la fluorescencia evaluado a Ex 280 / Em 320 nm usando un
espectrofluorímetro (Perkin-Elmer LS55). Las muestras se analizaron al menos por
triplicado.
2.5. El análisis estadístico
Todas las curvas estándar se analizaron mediante una regresión lineal de los datos de
cálculo del coeficiente de correlación ( r ) en un nivel de confianza del 95%. La
significación estadística = P ≤ 0.05.
3. Resultados
3.1. Curvas estándar FC
El ácido gálico, el EPI y el estándar CAT curvas obtenidas utilizando la metodología FC
fue lineal en el rango de 10 a 140 M de la polifenol ( . Fig. 1 ). La curva estándar de
ácido gálico tiene relativamente poca pendiente, la pendiente usando EPI era más
favorable para un ensayo sensible. No hubo diferencias entre EPI y curvas CAT (datos
no presentados), por lo que hacemos más referencia únicamente a las curvas de
calibración del PAI. Las pendientes de las dos curvas en la figura. 1 son
estadísticamente diferentes ( P <0,001) y, confirmando datos de la literatura, por lo
tanto, el contenido de compuestos fenólicos en las muestras de cacao puede ser mal
interpretado cuando se utiliza ácido gálico como el estándar en el ensayo de
FC. Básicamente, el uso de galato como un estándar en la evaluación de PAI y CAT
dará lugar a una sobreestimación del contenido de PAI / CAT por la relación de las
pendientes, o en aproximadamente un 57% (diferencia entre pistas). Las
concentraciones inferiores a 20 mM con galato como un estándar y 10 mM con EPI de
serie dio lugar a las medidas indetectables ( . Fig. 2 insert B).
. Figura 1. Comparación de ácido gálico y las curvas de calibración con el método del PAI
FC. Las curvas de calibración de concentración-DO utilizando ácido gálico (pendiente = 7,753
× 10 -3 , r 2 = 0,99754) (círculos negros) o (-)-epicatequina (pendiente = 1,2226 × 10 -2 , r 2 =
0,99717) ( n = 3 ) (círculos blancos). Las pendientes son estadísticamente diferentes
( p <0,001).
Opciones Figura
. Figura 2. (A) Representante espectros de fluorescencia (ex 280 / Em 320 nm) de
concentraciones crecientes de (-)-epicatequina. (B) la curva de concentración-DO de (-)-
epicatequina ( n = 3) (pendiente = 19,5249, r 2 = 0,999). No se detectaron-epicatequina
(gráfico inserto) medidos con el método de FC - Las bajas concentraciones de ().
Opciones Figura
3.2. Las curvas de calibración de fluorescencia
El espectro de emisión de fluorescencia de EPI (Ex 280 / Em 320 nm) se muestra en la
figura. 2 A. La intensidad de emisión aumenta como una función lineal de la
concentración, con una sensibilidad de ~ 0,5 mM ( . Fig. 2 B). Dada la falta de
diferencia entre EPI vs laderas CAT, sólo hacemos referencia adicional a las curvas del
PAI.
3.3. Fenoles totales de método FC utilizando ácido gálico o (-)-epicatequina
curvas estándar
La comparación de los valores se presenta en la figura. 3 . Como se demostró
anteriormente ( . Fig. 1 ), el uso del ensayo de FC con galato como un estándar da
consistentemente valores más altos para todas las muestras, falsamente elevadas. El
contenido de polifenoles totales medidos por FC con ácido gálico como estándar fue de
151 m para la muestra con 85% de contenido de cacao. Leche y 40% tenían el menor
contenido de polifenoles (46 M). Polvo de cacao natural tiene 194 m. La semilla de
cacao seco sin tratar tuvo la concentración más alta (206 m). Cuando se utiliza PAI
para generar una curva estándar de las densidades ópticas grabadas resultaron en ~
36% de disminución en la concentración de polifenol vs estándar de ácido gálico. Con
este enfoque, se encontró que la muestra de chocolate con un 85% de contenido de
cacao tenía 97 mM de polifenoles, Milk-40% = 30 m, cacao natural = 124 micras y
semillas de cacao = 132 m.
. Figura 3. comparación relativa de la concentración de flavonoides en las muestras
analizadas. Metodología FC utilizando ácido gálico como (barras negras) estándar, la
metodología FC utilizando (-)-epicatequina como estándar (barras grises) y, de fluorescencia
(Ex 280 / Em 320 nm) metodología (barras punteadas).
Opciones Figura
3.4. FC vs método de fluorescencia
Utilizando el método fluorométrico, semillas de cacao y polvo de cacao natural fueron
los productos con mayor contenido (47 y 44 m, respectivamente). En promedio ( Tabla
2 ), el contenido relativo de PAI / CAT-detectado por fluorescencia fue de
aproximadamente 35% de polifenoles totales FC detecta utilizando PAI como el
estándar. figura. 3 informes el valor promedio de 3 extracciones de polifenoles y el
contraste del ácido gálico FC, FC EPI y métodos fluorométricos. Como se puede
observar, la relación entre los valores obtenidos a partir de polifenoles totales FC vs
catequinas fluorescencia detectados se mantiene en ninguna de las muestras
ensayadas, independientemente de la curva estándar que se utiliza. Estos resultados
sugieren que el método fluorométrico es una técnica fiable y simple para detectar PAI y
CAT en las muestras.
Tabla 2. Comparación de la concentración de polifenoles de Folin-Ciocalteu (ácido gálico o
normas epicatequina) y metodologías de fluorescencia en muestras de cacao.
Muestra GA std curva FC mM (media ± DE)
EPI std curva FC mM (media ± DE)
EPI vs . GA FC std curvas de detección%
EPI std curva de fluorescencia Ex 280 / Em 320 nm ± SD
Fluorometric vs .FC EPI% de detección
Semillas de cacao pulverizado
206 ± 8 132 ± 5 64.2 47 ± 3 35.5
Polvo de cacao natural
194 ± 6,5 124 ± 3,5 64 44 ± 2,5 35.5
Oscuro 85% 151 ± 6,5 97 ± 3,7 64.2 33.5 ± 3 34.6
Oscuro 72% 109 ± 5,5 70 ± 3 64.5 26,5 ± 2,5 36
Oscuro 70% 108 ± 5,5 70 ± 3,5 65 21,5 ± 2,5 31
De Hershey 60%
111 ± 5 71 ± 3 64 25 ± 2 35
Oscuro 60% 78 ± 5 50 ± 3,7 64.5 17.2 ± 2 34
Leche 40% 46 ± 5,5 30 ± 3,5 65 11,8 ± 1,5 39
GA = ácido gálico, EPI = epicatequina.
Opciones de tabla
4. Discusión
Los resultados del estudio indican lo siguiente que, primero, catequina espectros de
fluorescencia puede utilizarse de manera fiable para obtener mediciones precisas de
contenido de flavonoles de cacao. Esta metodología es precisa y rápida y no utiliza
reactivos o incubaciones especiales, por lo que es adecuado para mejorar las
mediciones en los productos de cacao. En segundo lugar, nuestros resultados también
sugieren que otros flavonoides presentes en el cacao (por ejemplo, quercetina)
también pueden ser cuantificados adecuadamente mediante sus espectros de emisión
de fluorescencia específica.
HPLC y métodos de espectrofotometría de masas son el estándar de oro para el
análisis cuantitativo de los flavonoides en las muestras. Estos métodos requieren
instrumentación compleja no está fácilmente disponible en muchos
laboratorios. Además, se basan en el uso disolventes no respetuosas del medio
ambiente. Por estas razones, las metodologías colorimétricas más tradicionales pueden
ser preferidos. El ensayo colorimétrico FC es una técnica útil para determinar fenoles
totales. Sin embargo, en una comparación de los diferentes productos de cacao, puede
ser útil para que nos hagamos una idea aproximada de (-) Nivel -EPI/CAT, ya que sus
monómeros y polímeros son abundantes en las muestras de cacao. Por lo general, el
contenido de polifenoles en muestras de plantas se calcula a partir de ácido gálico
como un estándar, expresada como equivalente de ácido gálico. Sin embargo, si el
objetivo principal es estimar la concentración de catequinas, ácido gálico no es el
estándar ideal, ya que tiene una estructura monofenólicos y catequinas tener más de 2
grupos fenólicos. Con este tema en mente, hemos implementado una curva estándar
alternativo usando EPI y se compararon los resultados observados con los obtenidos
utilizando ácido gálico. Los resultados demuestran que el ácido gálico y PAI FC FC
estándar curvas pendientes son estadísticamente diferentes. Utilizando los resultados
de ácido gálico en un 36% ~ sobreestimación de contenido en polifenoles (flavonoides)
en las muestras analizadas.
El método de FC también no es específico; sustancias tales como azúcares, aminas
aromáticas, dióxido de azufre, ácido ascórbico, y ácidos orgánicos y bases (incluyendo
algunos tampones comúnmente utilizados como Tris) pueden reaccionar con el
reactivo de FC ( Roura et al, 2006. ) . La presencia de estas sustancias puede por lo
tanto contribuir también a la sobreestimación del contenido de flavonoides. En un
intento de desarrollar un enfoque rápido, económico y simplificado para cuantificar las
catequinas del cacao, hemos implementado un método fluorométrico. Para ello, nos
aprovechamos de las propiedades fluorescentes de EPI / CAT. El ensayo resultante es
un orden de magnitud más sensible que el ensayo de absorbancia basada. Los datos
del ensayo de fluorescencia también concuerdan bien con la determinación hecha por
técnicas avanzadas.
La cantidad de catequinas determinadas por fluorescencia, ~ 35% por peso de la
muestra, está de acuerdo con el contenido reportó el uso de la espectrometría de
masas (~ 40%) en muestras similares ( Joseph, 2008). El 5% de diferencia puede estar
relacionada con la presencia de procianidinas (polímeros de 4, 6, 8 PAI / CAT), ya que la
cuantificación de fluorescencia de estos productos no es bastante lineal y, de hecho, su
presencia parece interferir con (es decir, disminución) de fluorescencia emisión
( Joseph, 2008 y Tomás-Barberán et al., 2007 ). También es posible que la
contaminación de las muestras con proteínas, que también emiten a Ex 280 /
Em 320 espectros, puede explicar la discrepancia. Sin embargo, esto no es probable que
el caso ya que la fluorescencia en cualquier muestra dada es ~ 35% de los valores de
FC, incluyendo la muestra con un alto contenido de la leche (que tiene caseína).
5. Conclusión
Dada la gran cantidad de catequinas del cacao y la relación entre fenoles totales y
catequinas, podemos concluir que el método de FC para la medición del contenido de
flavonoides en las muestras de cacao se puede implementar mediante el uso de EPI
como un estándar, ya que permite una mejor aproximación cuantitativa. El uso de
espectros de emisión de fluorescencia es un método rápido, práctico y altamente
cuantitativa para medir EPI / CAT de cacao y cacao muestras.
Agradecimientos
Los autores agradecen el interés estimulante y atinados comentarios del Prof. L.
Laurence Brunton, Departamento de Farmacología de la Facultad de Medicina de
UCSD. Este trabajo fue apoyado por un NIH HL-43617 y EN-004 277 a F.
Villarreal. Israel Ramírez Sánchez por el CONACYT beca postdoctoral de México y G.
Ceballos por un profesor visitante de becas CONACYT de México.
