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PRÁCTICAS DE ECOLOGÍA MICROBIANA - 2010 Alberto Fonte Polo

COLUMNA DE WINOGRADSKY  

La columna de Winogradsky es un sistema acuático en el que se ayuda a los

microorganismos a establecerse en regiones diferenciadas según su metabolismo, y

constituye un modelo de ecosistema, similar a los tapetes microbianos que se hallan

en aguas dulces o saladas, donde proliferan microorganismos del medio acuático y de

los sedimentos.

Esta técnica fue desarrollada inicialmente por el microbiólogo ruso Sergei Winogradsky

(1856-1953), quien usó la columna para estudiar los microorganismos del suelo. La

columna de Winogradsky es un sistema que permite observar en el laboratorio el

proceso evolutivo de los microorganismos, es decir, el proceso de adaptación a los

diferentes ambientes empleando diferentes estrategias para la obtención de energía.

Una vez que se prepare la columna y se exponga a la luz solar, se desarrollará una

sucesión de comunidades bacterianas interrelacionadas metabólicamente, de un

modo similar a lo que ocurre en la naturaleza, que se podrán observar fácilmente por

su distinta coloración. Además, la columna es un sistema anóxico en miniatura que

puede usarse como suministro a largo plazo de bacterias para cultivos de

enriquecimiento.

Para la realización de esta práctica se usará agua estancada procedente de un lago, de

un estanque, de una acequia o de un río, aunque también podría usase agua de mar si

se quisiera prepara una columna marina. Y se estudiará el ciclo del azufre, no obstante

podría enfocarse la práctica para otros ciclos biogeoquímicos equivalentes (nitrógeno,

carbono u otros elementos).

Materiales y procedimiento para la construcción de la columna de Winogradsky

1.  Se usa una columna grande de cristal (una probeta de 100 ml) o de plástico

transparente (una botella).

2.  Se añade una fuente de carbono y energía para la cadena trófica microbiana,en este caso es celulosa, que puede administrarse en forma de tiras de papel

de filtro o de periódico, hierba, serrín, etc. Es importante que la celulosa

permanezca en el fondo o en la zona intermedia, pero no en la zona superficial,

ya que las bacterias que degradan la celulosa son anaeróbicas. Deben evitarse

los sustratos fácilmente fermentables, que pueden producir una formación

excesiva de gas.

3.  Se llena la columna con lodo, de una charca o del fondo de un río, ricos en

materia orgánica, hasta 1/3 de su volumen.

4.  Se añade a la mezcla una fuente de sulfato (sulfato de calcio, CaSO4, o yeso) y

un agente tamponador del pH (carbonato cálcico, CaCO3). El lodo tambiénpuede mezclarse con el contenido de un huevo, como fuente de azufre. Se

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añade también bicarbonato sódico (NaHCO3), cloruro de amonio (NH4Cl) y

tampón fosfato pH 7,3.

5.  La mezcla se compacta para forzar la salida de las burbujas de aire, hasta

obtener una capa de unos 10 cm.

6.  Se añade agua, de la propia charca o río donde se haya recogido el fango, hasta

rellenar casi completamente la columna (hay que dejar con aire unos 5 cm de lamisma). Si no se dispone de suficiente agua de río, se puede terminar de

rellenar la columna con agua corriente.

7.  Se tapa la columna, con parafina o con papel de aluminio, para evitar la

evaporación. Se coloca cerca de una ventana donde reciba luz solar atenuada, y

se deja durante varias semanas.

8.  Se examinará la columna periódicamente, anotando los cambios de color y

grosor de las diferentes capas (Fig. 1). Y se tomarán muestras de las capas para

estudiar los diferentes tipos de microorganismos.

Figura 1. Columna de Winogradsky después de un mes (izquierda), dos meses (centro) y tres

meses (derecha). La estratificación se hace cada vez más evidente.

Microorganismos de la columna de Winogradsky

Una vez establecida la columna, se pueden diferenciar tres zonas características en

base a su concentración relativa de oxígeno: 1) zona aeróbica, es la más superficial,

dispone de una alta concentración de oxígeno; 2) zona microaerófila, inmediatamente

debajo de la anterior, con una menor concentración de oxígeno; 3) zona anaeróbica,

que constituye el lecho de lodo (Fig. 2).

Las algas y cianobacterias forman una capa superficial de color verde brillante, y al

producir oxígeno ayudan a mantener la aerobiosis en la zona superior de la columna.

Mientras que, en el fondo de la columna, las bacterias reductoras del sulfato producen

sulfuro, que provoca el crecimiento de bacterias rojas y verdes del azufre (fotótrofos

anoxigénicos). De modo que se establecen dos gradientes en la columna, uno de

oxígeno y otro de sulfuro de hidrógeno (H2S).

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Las bacterias quimiorganotrofas crecen a lo largo de toda la columna, los

microorganismos aerobios y microaerófilos en la parte superior, los anaerobios en las

zonas donde hay sulfuro de hidrógeno.

Figura 2. Esquema de una columna de Winogradsky típica.

Al cabo de cuatro o seis semanas comenzarán a observarán una serie de comunidades

microbianas en la columna, que de arriba abajo son (Figs. 2 y 3):

  Zona aeróbica: esta es la parte de la columna más rica en oxígeno y más pobre

en azufre. El agua de la parte superior de la columna contiene abundantes

poblaciones de microorganismos aerobios, que aparecen normalmente en

hábitats acuáticos ricos en materia orgánica (estanques poco profundos,

arroyos, etc.). Suelen ser microorganismos flagelados, lo que les permite

moverse y establecerse en nuevas áreas, así como microorganismos

fotosintéticos: algas (diatomeas) y cianobacterias filamentosas. El oxígeno que

producen estos productores primarios difunde desde la superficie, creando

condiciones similares a las que existen en un lago con sedimentos ricos en

nutrientes.

   L   o   d   o

   C   o    l

   u   m   n   a   d   e   a   g   u   a

 

Algas y cianobacterias

Bacterias oxidadoras del azufre aerobias

Beggiatoa, Thiobacillus, Thiothrix  

Bacterias rojas no del azufreRhodospirillum, Rhodopseudomonas 

Bacterias rojas del azufre

Chromatium

Bacterias verdes del azufre

Chlorobium

Bacterias reductoras del sulfato

DesulfovibrioBacterias fermentadoras de celulosa

Clostridium

Bacterias metanogénicas y

quimiolitotrofos del azufre.

Zona aerobia

Zona

microaerófila

Zona anaerobia 

 

O2 

H2S

   C   o   n   c   e   n   t   r   a   c   i    ó   n   r   e    l   a   t   i   v   a   d   e   g   a

   s   e   s

Luz solar

H2S

SO42 – 

O2 

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  Zona microaerófila: es la zona en la que solapan ambos gradientes, el de

oxígeno y el de sulfuro de hidrógeno. Aparecen bacterias oxidadoras del azufre

como Beggiatoa, Thiothrix o Thiobacillus, que usan como fuente de carbono la

materia orgánica, y oxidan el H2S que llega por difusión desde las capas

inferiores a azufre elemental. La reacción química que se lleva a cabo es la

siguiente (reacción de Bunsen): O2 + H2S → H20 + S0. Son, por lo tanto,

microorganismos mixótrofos. Estos géneros acumulan gránulos de azufre en

sus citoplasmas por oxidación del H2S. Si se deja evolucionar el sistema, cuando

la concentración de H2S es muy baja, los gránulos de azufre elemental

intracitoplasmático presentes en estas bacterias empiezan a desaparecer por

oxidación total a sulfato (H2S → S0 → SO4

2 –).

  Zona anaeróbica: esta zona contiene H2S (procedente del fondo), en la zona

anaeróbica superior predominan las bacterias fotosintéticas anaerobias, y en la

columna se observan una serie de bandas de colores rojo y verde:

o  Bacterias rojas no del azufre: Rhodospirillum, Rhodomicrobium oRhodopseudomonas, son bacterias anaerobias fotoorganótrofas, que

sólo pueden realizar la fotosíntesis en presencia de una fuente de

carbono orgánico. Forman una capa de color rojo-anaranjado. Las

bacterias verdes no del azufre son termófilas y, por lo tanto, no crecen

en la columna a temperatura ambiente.

o  Bacterias rojas del azufre (Chromatium, Thiospirillum, Thiocapsa,

forman una capa de color rojo-púrpura) y bacterias verdes del azufre

(Chlorobium, Pelodyctium). Estas bacterias son fotolitótrofas y realizan

una fotosíntesis anoxigénica, no producen oxígeno ya que no utilizan

H2O como elemento reductor sino H2S, generando en este procesosulfatos (SO4

2 –). La reacción que tiene lugar es la siguiente: 2 H2S + CO2 

→ [CH2O] + H2O + 2 S0. Estos microorganismos aparecen como zonas de

crecimiento en el lodo de la columna, pero también pueden

desarrollarse en el agua si los fotótrofos oxigénicos son escasos.

En la zona anaerobia más profunda, de color negro intenso, aparecen

microorganismos capaces de realizar respiración anaeróbica y fermentación.

o  Bacterias reductoras del sulfato (BRS): Desulfovibrio, Desulfobacter ,

Desulfotomaculum o Desulfomonas. Usan el sulfato, u otras formas

parcialmente oxidadas de azufre como el tiosulfato, y generan grandescantidades de H2S en el proceso. La reacción de reducción bacteriana

del sulfato es la siguiente: SO42 –

+ 8 H+  → H2S + 2 H2O + 2 OH

 –. Este

H2S reaccionará con el hierro presente en el sedimento, produciendo

sulfuro de hierro (II), que precipita y da el color negro. Es por esto que,

en la naturaleza, los sedimentos acuáticos son frecuentemente negros.

La reacción sería la siguiente:

SO42 –

H2S (sulfuro de hidrógeno)

(ión sulfato) Fe2+

 

SFe (Sulfuro de hierro) → Precipitado negro

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Sin embargo, no todo el H2S reacciona con el hierro (II), parte de éste

difunde hacia arriba a lo largo de la columna de sedimentos y es

utilizado por las bacterias verdes y rojas del azufre que crecen en las

zonas superiores.

o  Bacterias fermentadoras: utilizan la celulosa del papel aportado como

fuente primaria para su metabolismo, aparecen las bacterias del géneroClostridium. Son anaerobias estrictas, y no empiezan a crecer hasta que

el oxígeno desaparece del sedimento. Estas bacterias degradan la

celulosa hasta residuos de glucosa y, a continuación, fermentan la

glucosa para obtener la energía que necesitan, produciendo una serie

de compuestos orgánicos simples (etanol, ácido acético, ácido láctico,

ácido succínico, etc.) como productos finales de esa fermentación. Estos

compuestos orgánicos serán, a su vez, respirados por las bacterias

reductoras del sulfato. Cuando la celulosa se agote, usarán la materia

orgánica producida por el resto de bacterias.

o  También pueden aparecer bacterias metanogénicas que generan CH4,que se observa como burbujas de gas en el fondo de la columna.

Figura 3. Esquema de los algunos microorganismos característicos de la columna de

Winogradsky.

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Para el estudio de las bacterias de la columna de Winogradsky, se puede introducir una

pipeta larga para recoger una pequeña muestra de lodo o agua, que puede ser usada

en microscopía y para inocular medios de cultivo de enriquecimiento para aislamiento

y caracterización.

Bibliografía:

Brock Biología de los microorganismos. 10ª edición (2003). J. Parker, J.M. Martinko,

M.T. Madigan. Pearson Education.

Manual Práctico de Microbiología. 3ª edición (2005). R. Díaz, C. Gamazo, I. López-Goñi. 

Elsevier-Masson.

http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/winogradsky.html  (Figura 3).