cinetique.pdf

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Licence SV Biochimie 2 : Cintique enzymatique

Introduction la cintique enzymatique

1. INTRODUCTION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1

2. BREFS RAPPELS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1

2.1. LA RACTION CHIMIQUE ..........................................................................................................12.1.1. Degr d'avancement...........................................................................................................1

2.1.2. Vitesse de la raction .........................................................................................................1

2.1.3. Ordre d'une raction..........................................................................................................2

2.1.4. Cas particulier des ractions lmentaires .............................................................................2

2.2. LA CATALYSE .........................................................................................................................5

3. CINTIQUE ENZYMATIQUE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5

3.1. LA CATALYSE ENZYMATIQUE...................................................................................................63.2. LE MODLE DE BASE DE LA CINTIQUE ENZYMATIQUE...............................................................8

3.2.1. Modle de Michalis-Menten...............................................................................................9

3.2.2. Modle de Briggs-Haldane................................................................................................ 10

4. LES CONSTANTES CINTIQUES. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

4.1. LA SIGNIFICATION DES CONSTANTES CINTIQUES .................................................................... 114.1.1. Vitesse maximale............................................................................................................. 11

4.1.2. Constante catalytique....................................................................................................... 12

4.1.3. Constante de Michalis, constante de dissociation ................................................................. 12

4.1.4. Constante de spcificit .................................................................................................... 134.1.5. Quelques valeurs de constantes catalytique, de Michalis, de spcificit .................................... 13

4.2. LA DTERMINATION DES CONSTANTES CINTIQUES ................................................................. 144.2.1. Mesure de la vitesse initiale............................................................................................... 14

4.2.2. Reprsentation hyperbolique (Michalis-Menten) .................................................................. 154.2.3. Reprsentation de Lineweaver-Burk.................................................................................... 15

4.2.4. Reprsentation Eadie-Hofstee............................................................................................ 164.2.5. Reprsentation de Hanes-Woolf ......................................................................................... 164.2.6. Reprsentation de Eisenthal et Cornish-Bowden (graphe linaire direct) ................................... 174.2.7. Quelques commentaires sur ces reprsentations .................................................................... 18

5. DOSAGE ENZYMATIQUE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

5.1. ACTIVIT ENZYMATIQUE ....................................................................................................... 195.1.1. Activit enzymatique (ou catalytique) .................................................................................. 195.1.2. Activit enzymatique (ou catalytique) spcifique .................................................................... 20

6. CE QUI N'A PAS T DIT. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

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Licence SV Biochimie 2 : Cintique enzymatique - 1 -

Introduction la cintique enzymatique

111... IIInnntttrrroooddduuuccctttiiiooonnnPresque toutes les ractions chimiques qui ont lieu dans les systmes biologiques sontcatalyses par des enzymes qui constituent la classe de protines la fois la plus vaste et laplus spcialise. Ils reprsentent l'instrument primaire direct de l'expression de l'action dugne puisqu'ils catalysent les milliers de ractions chimiques qui constituent le mtabolismeintermdiaire des cellules. Dans ce chapitre introductif, nous aborderons uniquement lesparamtres cintiques des mcanismes enzymatiques les plus simples.

222... BBBrrreeefffsss rrraaappppppeeelllsssVoici un bref rappel de notions, dfinitions que vous avez vues dans les cours de chimie.

2.1. La raction chimiqueSoit la raction chimique suivante en phase homogne :

1 2 3 1 2 3C + C + C + ... C + C + C + ...1 2 3 1 2 3

o C et reprsentent respectivement le compos et le coefficient stchiomtrique. Lescomposs C et C i i sont respectivement appels les ractifs (ou ractants) et les produits.

2.1.1. Degr d'avancementAu cours de cette transformation, le nombre de moles des diffrents constituants ne peuventvarier indpendamment. Ncessairement, nous avons :

dn =

dn = ... = -

dn = -

dn = ... = d1

12

21

12

2

(I)

o est le degr d'avancement de la raction et o les dn reprsentent les variations dunombre de moles du constituant considr.

2.1.2. Vitesse de la ractionLa vitesse de la raction est dfinie par la vitesse d'accroissement de l'avancement rapporte l'unit de volume : v = 1

V

ddt

. La vitesse peut tre aussi exprime par rapport aux

variations de concentrations des composs en utilisant l'quation (I) :

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1

1

12

21

12

2dnVdt

= 1 dn

Vdt = ... = -

1 dnVdt

= -1 dn

Vdt = ... =

1V

ddt

(II)

Le rapport 1V

dndt

reprsente la variation de la concentration en fonction du temps. L'quation

(II) peut s'crire aussi :

1

1

12

21

12

2d[Cdt

= 1 d[C

dt = ... = -

1 d[Cdt

= -1 d[C

dt = ... =

1V

ddt

] ] ] ] (III)

o les [C] reprsentent les concentrations des diffrents composs.Notons que la vitesse d'une raction a la dimension d'une concentration par unit detemps (mole/litre) temps-1[ ] (M s-1).

2.1.3. Ordre d'une ractionDans le cas le plus gnral, la loi de vitesse caractristique d'une raction chimique ne peutpas tre tablie priori, mais seulement partir de l'exprience. Phnomnologiquement, lavitesse peut s'crire : v = k[A] [B] [C] ... o les A,B, C .. sont les ractifs et les produitsintervenant dans la raction chimique.- k est appele constante de vitesse (c'est une constante pour les paramtresthermodynamiques : temprature, pression, concentrations initiales dtermines). Sadimension est dpendante de la loi de vitesse. , , sont appels les ordres partiels de raction par rapport l'espce chimique pourlaquelle ils sont exposants. Dans le cas le plus gnral, ils ne sont pas gaux aux coefficientsstchiomtriques des ractifs et des produits.- n = + + + .. n est appel l'ordre (global) de la ractionL'tude exprimentale des diffrentes courbes v= f([A]), .. permet de dterminer les ordrespartiels de la raction.

2.1.4. Cas particulier des ractions lmentairesLes ractions lmentaires sont des ractions ou processus qui- ne peuvent tre dcompose en tapes plus simples- refltent un vnement molculaire, une collision ractive telle que celle modlise dans lecadre de la thorie des collisions (M. Trautz, W.C.McC Lewis et Jean Perrin dans les annes1910-1920), complte par Lindemann, puis par Henry Eyring.

Toute raction lmentaire est caractrise par les proprits suivantes:1 - son ordre global est aussi sa molcularit. Il indique le nombre de molcules actuellementimpliques dans le processus molculaire dont la raction en est la manifestation

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2 - l'ordre d'une raction lmentaire est toujours entier3 - la vitesse d'une raction lmentaire ne dpend jamais de la concentration d'un produit,mais uniquement des ractifs4 - l'ordre partiel par rapport un ractif A est gal au coefficient stchiomtrique (entier) deA5 - une raction lmentaire n'a pas d'intermdiaire stable6- sa constante de vitesse satisfait la loi d'Arrhnius (voir cours de Chimie)

Nous supposerons dans la suite que pour toutes les tudes cintiques, ce sont des ractionslmentaires qui interviennent dans les diffrents schmas ractionnels.

Raction d'ordre zro (ou nul)

Soit une raction lmentaire : A P Si la raction est d'ordre zro, la vitesse de raction ne dpend pas des concentrations des

produits intervenant dans la raction : v = k = - d[A]dt

, d'o en intgrant :

[A] = [A] - kt0 , o [A]0 est la concentration de A l'instant t0= 0

La concentration des ractifs diminue linairement en fonction du temps, et videmment celledes produits augmente linairement en fonction du temps.

Une reprsentation de [A] = f(t) est une droite de pente k.Pour une raction d'ordre zro, la constante de vitesse k a les dimensions de(mole/litre) temps-1[ ] (M s-1).

Raction du premier ordre (ou d'ordre 1)

Soit une raction lmentaire : A P Si la raction est d'ordre 1 par rapport A, la vitesse de raction s'crit :

v = -d[A]

dt= k[A] , d'o d[A][A] = - kdt et en intgrant :

Ln [A][A] = - kt0

ou encore [A] = [A] e0

-kt , ou encore Ln [A] = - kt + Ln [A]0( ) ( )

o [A]0 est la concentration de A l'instant t0= 0.La concentration des ractifs diminue exponentiellement en fonction du temps, etvidemment celle des produits augmente exponentiellement en fonction du temps.

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On a l'habitude de dfinir pour une raction d'ordre 1 le temps de demi-vie (appel aussitemps de demi-raction) : temps ncessaire pour consommer la moiti de la concentration duractif.

t = Ln(2)

k =

0,693k1/2

Une reprsentation de Ln([A]) = f(t) est une droite de pente -kPour une raction d'ordre un, la constante de vitesse k a les dimensions de temps-1[ ] (s-1)Raction du second ordre (ou d'ordre 2)

Soit une raction lmentaire : A + A P Si la raction est d'ordre 2 par rapport A, la vitesse de raction s'crit :

v = -d[A]

dt= k[A]2 , d'o d[A]

[A]= - kdt2 et en intgrant :

1[A] = kt +

1[A]0

, o [A]0 est la concentration de A l'instant t0= 0.

La concentration des ractifs diminue hyperboliquement en fonction du temps, etvidemment celle des produits augmente hyperboliquement en fonction du temps.

Une reprsentation de 1/[A] = f(t) est une droite de pente kPour une raction d'ordre deux, la constante de vitesse k a les dimensions de(litre/mole) temps-1[ ] (M-1 s-1).

Dtermination de l'ordre d'une raction (mthode diffrentielle)

Dans les paragraphes prcdents, pour chaque ordre de raction, nous avons dtermin unereprsentation particulire f[A]=g(t) qui est linaire et permet de dterminer la constante devitesse. Si nous avons non pas des mesures exprimentales ([A], t) mais des mesures (v, [A])o v est la vitesse de la raction, la relation tudier est v = - d[A]

dt= k[A]n o n est l'ordre

de la raction :v = k[A] Ln(v) = Ln(k) + nLn([A])n ,

Une reprsentation de Ln(v) en fonction de Ln([A]) est une droite de pente n (ordre de laraction) et d'ordonne l'origine Ln(k).

Remarque : si la place des logarithmes npriens, nous avions utilis les logarithmesdcimaux (Log), la relation aurait t identique.

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2.2. La catalyseDs 1835, Jns Jacob Berzelius appela catalyse l'augmentation de la vitesse d'une ractiondue la prsence de substances particulires qui sont inchanges la fin de la raction.En 1895 Wilhelm Ostwald dfinit un catalyseur comme :

- une substance qui modifie la vitesse d'une raction sans modifier le bilan nergtiqueglobal

- et ajouta en 1902 : une substance que l'on retrouve inchange la fin de la raction.

On dit que la catalyse est homogne si le catalyseur fait partie de la mme phase que lesystme ractionnel, et dans le cas contraire on parle de catalyse htrogne.Un catalyseur est une substance :1) que l'on retrouve inchange la fin de la raction2) qui modifie la vitesse des ractions thermodynamiquement possibles (voir cours de

thermodynamique chimique : nergie libre de Gibbs ou enthalpie libre) puisqu'il nemodifie pas l'nergie du systme ractionnel

3) qui modifie de la mme manire la vitesse de deux ractions opposes selon la rgle derversibilit, et permet d'atteindre plus rapidement un quilibre chimique.

333... CCCiiinnntttiiiqqquuueee eeennnzzzyyymmmaaatttiiiqqquuueeeEn 1752, Ren-Antoine Ferchault de Raumur observe que des aliments solides taientconvertis en une matire fluide par l'effet d'un "ferment" scrt par l'estomac, observationconfirme par Lazzaro Spallanzani. En 1833, Anselme Payen et Jean-Franois Persozmontrent qu'aprs un traitement l'thanol du malt, l'extrait aqueux a la capacit d'hydrolyserl'amidon : cet extrait qui catalysait le passage d'un tat insoluble un tat soluble futdnomm diastase (du grec = sparation). En 1836 Theodor Schawnn dmontraitla prsence dans un extrait d'estomac d'un ferment protolytique, qu'il appela pepsine.De nombreuses tudes sur la fermentation par des levures furent menes par Louis Pasteur,Justus von Liebig, Georg Ernst Stahl, Marcelin Berthelot. En 1878 Wilhelm Kunhe proposale nom d'enzyme pour qualifier ces ferments et en 1898 Duclaux proposa le suffixe "ase".En 1897, Gabriel Bertrand observa que certains enzymes requirent des facteurs dialysablespour leur activit : il les nomma "coenzymes".Le dbut du XXme sicle voit une dbauche de travaux de purification des enzymes quipermettent l'lucidation de nombreuses voies mtaboliques et confirment que les enzymessont des protines : expriences de cristallisation de l'urase par James Summer en 1926, dela pepsine et de la chymotrypsine par John Northrop en 1933, de la ribonuclase A par MosesKunitz en 1940. Enfin en 1965, David Phillips et son quipe publient la premire structuretridimensionnelle d'un enzyme, le lysozyme (purifi partir du blanc d'uf).

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3.1. La catalyse enzymatiqueEn 1893, Wilhelm Ostwald montra que les enzymes sont des catalyseurs et en 1894 EmilFisher posa l'acte fondateur de la notion de strospcificit dans le phnomne de catalyseenzymatique sous l'image d'une cl qui ouvre une serrure et une seule.

Les mcanismes molculaires de la catalyse enzymatique ne posent pas de problmesdiffrents de ceux de la ractivit chimique. Soit la raction lmentaire catalyse :

E + S E + P

o E est l'enzyme (catalyseur protique que l'on retrouve dans le bilan des produits), S est lesubstrat et P le produit. Les proprits importantes de l'enzyme sont :1) il est retrouv inchang la fin de la raction2) il modifie la vitesse des ractions thermodynamiquement possibles (il ne modifie pas

l'nergie du systme ractionnel)3) il est strospcifique du substrat ( la diffrence de nombreux catalyseurs chimiques)4) notons que certains enzymes n'ont d'activit catalytique qu'en prsence de leur cofacteur,

compos non protique

Le facteur d'accroissement de la vitesse de la raction par un enzyme peut aller jusqu' lavaleur de 1017fois (cas de la phosphatase alcaline). Vous avez vu en chimie ou vous verrezdans la suite (3me anne de licence) le modle de l'tat de transition de Henry Eyring qui rendcompte de l'accroissement de la vitesse d'une raction par un catalyseur..

Enzyme Facteur d'accroissementChymotrypsine 107

Lysozyme 2 108

Urase 1014

Phosphatase alcaline 1017

La strospcificit des enzymes vis vis de leurs substrats ainsi que le nombre de cesderniers dans les mtabolismes des cellules, impliquent une grande diversit des catalyseursenzymatiques. Les enzymes ont des noms courants qui tmoignent plus des circonstances deleurs dcouvertes que d'une classification logique.Pour remdier cela, la Commission des Enzymes de l'Union Internationale de Biochimie apropos une nomenclature, ajoute au nom courant, qui tient compte des types de ractionque l'enzyme catalyse : elle s'crit sous la forme E.C.X.X.X.X (E.C. abrviation de "EnzymeCommission").

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Le premier X indique le type de raction catalyse, c'est la classe de l'enzyme :

N Classe de l'enzymeX=1 Oxydorductases (transfert d'lectrons : oxydorduction)X=2 Transfrases (transfert d'un groupe fonctionnel d'une molcule une autre)X=3 Hydrolases (coupure de liaisons par hydrolyse)X=4 Lyases (coupure de liaison par limination)X=5 Isomrases (changement dans la configuration de la molcule de substrat)X=6 Ligases (condensation de deux molcules)

Le deuxime X indique la nature du substrat, prenons la classe des hydrolases (3) :3.1 Acting on ester bonds3.2 Glycosylases...

...

3.11 Acting on Carbon-Phosphorus Bonds3.12 Acting on Sulfur-Sulfur Bonds3.12 Acting on Carbon-Sulfur Bonds

Dans les hydrolases agisssant sur des liaisons ester (3.1) :3.1.1 Carboxylic Ester Hydrolases3.1.2 Thiolester Hydrolases3.1.3 Phosphoric Monoester Hydrolases...

...

3.1.30 Endoribonucleases Active with either Ribo- or Deoxyribonucleic Acids andProducing 5'-Phosphomonoesters3.1.31 Endoribonucleases Active with either Ribo- or Deoxyribonucleic Acids andProducing 3'-Phosphomonoesters

Dans les carboxyl ester hydrolases (3.1.1) :3.1.1.1 carboxylesterase3.1.1.2 arylesterase3.1.1.3 triacylglycerol lipase

3.1.1.78 polyneuridine-aldehyde esterase3.1.1.79 hormone-sensitive lipase

Exemple : la lipase pancratique qui hydrolyse les triglycrides a comme nomenclature :E.C.3.1.1.3

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3.2. Le modle de base de la cintique enzymatiqueEn 1902, Victor Henri et Adrian Brown suggrrent indpendamment que dans la ractionenzymatique, l'hypothse de la formation d'un complexe enzyme-substrat tait ncessairepour interprter la forme hyperbolique des courbes vitesse initiale de la raction en fonctionde la concentration initiale de substrat, les autres paramtres tant constants (concentrationenzyme, temprature, pH, pression ..). La raction tait d'ordre zro par rapport au substratau-dessus d'une certaine concentration.

[S] 0

V0Vmax

Relation entre la vitesse initiale et la concentration initiale du substrat

Le modle de base de la cintique enzymatique s'crit ainsi :

E + S ES E + P k 1

k-1

k 2

k-2

o E est l'enzyme, S le substrat, P le produit de raction et les ki sont les constantes devitesse des ractions lmentaires :

k-1

k 1ESE + S

E + S ESk 1

E + S ESk

-1correspond aux deuxractions lmentaires

Ce cas correspond aux ractions rversibles ou quilibres.Nous allons maintenant voir le traitement de ce systme ractionnel en le simplifiant par deshypothses exprimentales ou ad hoc.

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3.2.1. Modle de Michalis-MentenEn 1913, suite aux travaux de Victor Henri, Maud Menten et Leonor Michalis rsolvrent lesystme ractionnel en posant les hypothses simplificatrices suivantes, suggres par lestudes exprimentales :1) les mesures de cintique seront toujours faites pour des concentrations de produit trs

faible : c'est la mesure de la vitesse initiale (vi) pour [P] 0 et [S] [S]0 o [S]0est laconcentration du substrat l'instant initial. Cette hypothse permet de ngliger la ractionlmentaire E + P ESk-2 .

2) la concentration totale du substrat [S]0est grande (>>) devant celle de l'enzyme [E]0.3) ds l'addition de l'enzyme dans la solution de substrat, il s'tablit un quilibre rapide entre

les formes libres de l'enzyme, du substrat et du complexe (appel complexe deMichalis), on parle d'hypothse du quasi-quilibre ou pr-quilibre.

Le schma ractionnel s'crit ainsi :

k 2

k-1

k 1E + P ESE + S

et pour calculer la vitesse d'apparition du produit, le systme d'quations rsoudre est :

(a) v = k [ES] (b) K = [E] [S][ES] , avec K =

kk

constante de dissociation du complexe ES

(c) [S] = [S] + [ES] + [P] (d) [E] = [E] + [ES]

2

-11

0

0

en remplaant [E] tir de l'quation (d) dans l'quation (b),en simplifiant l'quation (c) en tenant compte des hypothses (1) et (2) (c) [S] [S]0 et enremplaant [S] toujours dans l'quation (b),nous obtenons une quation simplifie : [ES] = [E] [S]

K + [S]0 0

0

d'o, en remplaant [ES] dans l'quation (a), le systme approxim (v est dans ce cas vi,vitesse initiale, hypothse (1)), se rduit :

v = k [E] [S]K + [S]2 0 0

0 , soit V = k [E] et K = K = k

kMax 2 0 S-11

, la vitesse s'crit sous la forme :

v = V [S]K + [S]

Max 0S 0

appele l'quation de Michalis-Menten.

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VMax est not en abrg VM . Le rapport V[E] , ici gal k

M

02 est not kcat , constante

catalytique de l'enzyme. K, constante de dissociation du complexe enzyme-substrat esttraditionnellement not KS.

Note : ce modle est aussi appel modle de Henri-Michalis-Menten.Attention : l'usage a consacr l'lision de l'indice i pour la vitesse (initiale) qui rappelait lacondition d'approximation et aussi de l'indice 0 pour la concentration initiale de substrat [S]0 .Nous garderons l'indice 0 pour la concentration de substrat pour ne pas oublier ces deuxconditions.

3.2.2. Modle de Briggs-HaldaneEn 1925, George Briggs et John Haldane ont montr que l'on obtenait une quation similaire celle de Michalis-Menten avec des hypothses moins restrictives : il n'est pas ncessaire deposer la condition (3) : tablissement d'un quilibre rapide entre les formes libres del'enzyme, du substrat et du complexe pour rsoudre le systme simplement. Il suffit desupposer que le systme ractionnel est dans un tat stationnaire (ou quasi-stationnaire).Ceci signifie que la vitesse de disparition du complexe Michalien (ES) est nulle d[ES]

dt= 0,

donc sa concentration constante [ES] =Ct.C'est le cas de la plupart des expriences de cintique, o on peut considrer qu'aprs un tatpr-stationnaire trs court, l'tat stationnaire est atteint.

Toujours, pour le mme schma ractionnel avec les conditions (1), (2) et de l'tatstationnaire :

k 2

k-1

k 1E + P ESE + S

le systme d'quations rsoudre est :

(a ) v = k [ES] (b ) 0 = d[ES]

dt = k [E][S] - (k +k )[ES]

(c ) [S] = [S] + [ES] + [P] (d ) [E] = [E] + [ES]

2

1 -1 2

0

0

en utilisant l'quation (d') pour remplacer [E] dans l'quation (b'),en simplifiant l'quation (c') en tenant compte des hypothses (1) et (2) (c) [S] [S]0 k [E] - [ES] [S] - (k + k ) [ES] = 01 0 0 -1 2( ) (b'')

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en calculant [ES] l'aide de (b") et en le remplaant dans (a'), on obtient pour le systmeapproxim (v est dans ce cas vi, vitesse initiale) :

v =k [E] [S]

(k +kk

+ [S]2 0 0

-1 21

0) , soit V = k [E] et K =

(k +kkM 2 0 M

-1 21

) la vitesse s'crit sous la

forme : v = V [S]

K + [S] M 0

M 0 quation de Briggs-Haldane

Cette quation de Briggs-Haldane est traditionnellement aussi appele quation deMichalis-Menten, en hommage. La constante K = (k +k

kM-1 2

1

) est appele constante de

Michalis.Remarquons que si k est petit devant k2 -1, l'quation de Briggs-Haldane est identique cellede Michalis-Menten (K = KM S).Pour la plupart de tous les enzymes, k2 est effectivement petit devant k-1.

Le rapport V[E] , ici gal kM

02 est not kcat , constante catalytique de l'enzyme (idem

prcdemment).

Attention : l'usage a consacr l'lision de l'indice i pour la vitesse (initiale) qui rappelait lacondition d'approximation et aussi de l'indice 0 pour la concentration initiale de substrat [S]0 .Ces deux conditions ne doivent jamais tre oublies lors de l'utilisation de l'quation ci-dessus.

444... LLLeeesss cccooonnnssstttaaannnttteeesss ccciiinnntttiiiqqquuueeesssLes quations de Michalis-Menten ou de Briggs-Haldane ont t obtenues par la rsolutiond'un systme d'quations simplifi par l'introduction d'hypothses :1) la vitesse mesure doit tre la vitesse initiale de la raction2) la concentration du substrat doit tre grande devant celle de l'enzyme3) hypothse du pr-quilibre ou hypothse de l'tat stationnaire

4.1. La signification des constantes cintiques

4.1.1. Vitesse maximale

V = k [E] = k [E]M 2 0 cat 0 est la vitesse maximale initiale v atteinte pour la concentration[E]0 et pour une concentration trs grande de [S]0 devant KM :

v = V [S]

K + [S] si [S] v VM 0

M 00 M

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La vitesse maximale est l'asymptote de la branche hyperbolique reprsentant l'quation deMichalis-Menten dans le modle de Michalis-Menten ou de Briggs-Haldane.

Exprimentalement, ceci est ralis si [S] >> K v = V [S]K + [S] V0 M

M 0M 0

M

Cette branche hyperbolique v = v = f [S]i 0( ) est appele courbe de saturation de l'enzymepar le substrat.

Note : dans la suite, lorsque nous parlerons de la vitesse de la raction enzymatique, vdsignera toujours la vitesse initiale, sauf spcification contraire.

4.1.2. Constante catalytiquekcat (ou k2) est une constante de vitesse du premier ordre (unit s-1, c'est une frquence).kcat reprsente la frquence laquelle l'enzyme accomplit l'acte catalytique (en anglais "turnover") lorsque l'enzyme est satur en substrat ( k = V[E]cat

M

0).

1kcat

est la dure d'un cycle catalytique lorsque l'enzyme est satur en substrat.

La valeur de kcat donne la mesure de l'efficacit de la catalyse par l'enzyme sur le substrat.

4.1.3. Constante de Michalis, constante de dissociation

Dans la relation de Briggs-Haldane, la constante de Michalis K = (k +kkM

-1 21

) est gale

kk-11

dans le cas o k >> k-1 2 . Si k-1 est grand devant k = k2 cat , cela signifie que le

complexe ES se dissocie en relarguant le substrat libre une vitesse nettement plusgrande qu'il ne subit l'acte catalytique. En ce cas, la valeur de la constante de Michalis estgale la valeur de la constante de dissociation du complexe ES en S et E, elle traduitl'affinit du substrat pour l'enzyme : les expressions de la vitesse pour le modle deMichalis-Menten et de Briggs-Haldane sont identiques. Nous remarquons que dans lemodle de Michalis-Menten l'hypothse d'quilibre rapide entre les formes libres del'enzyme, du substrat et du complexe est plus restrictive, elle est un cas particulier du modlede Briggs-Haldane. L'affinit du substrat pour l'enzyme est d'autant plus grande que lavaleur de la constante de Michalis est petite.

Lorsque la valeur de [S]0 est gale la valeur de KM, la valeur de la vitesse initiale est gale

: v = V [S][S] + [S] =VM 0

0 0M2

[S] = K v = V2

0 MM

et ce dans le modle de Michalis-Menten ou de Briggs-Haldane.

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4.1.4. Constante de spcificitLa constante catalytique kcat mesure l'efficacit de la catalyse par l'enzyme sur le substrat etla constante de Michalis mesure l'affinit de l'enzyme pour le substrat dans les cas ok >> k

-1 cat . Un enzyme peut avoir une trs grande affinit mais avec une constantecatalytique faible et inversement. L'un des deux paramtres ne suffit pas caractriser le

couple enzyme/substrat. C'est le rapport r = kKsp

cat

M qui reflte la spcificit globale d'un

enzyme vis vis d'un substrat, appel constante de spcificit.

r =kK

= k kk +k

= k kk +k

ksp catM

cat1

-1 cat1

cat

-1 cat1

La limite suprieure de r = kKsp

cat

M est la constante de vitesse d'association de l'enzyme E et

du substrat S : k1. Cette constante a pour limite la vitesse de diffusion des macromolculesdans le milieu ractionnel qui est de l'ordre de 10 -10 s M8 9 -1 -1( ) .

4.1.5. Quelques valeurs de constantes catalytique, de Michalis, de spcificit

Enzyme Substrat k (s )cat -1 K (M)M k /K (s M )cat M -1 -1Actylcholineestrase

Actylcholine 1,4 104 9 10-5 1,6 108

AnhydraseCarbonique II

CO

HCO2

3-

1 106

4 1051,2 10-2

2,6 10-28,3 107

1,5 107

-lactamase benzylpnicilline 2 103 5 10-5 4 107Catalase H O2 2 4 107 1,01 4 107

Fumarase FumarateMalate

8 102

9 1025 10-6

2,5 10-51,6 108

3,6 107

Penicillinase Benzylpenicilline 2 103 5 10-5 4 107

Chymotrypsine Ester thyliqueN-actylglycineEster thyliqueN-actyltyrosine

5,1 10-2

1,9 102

4,4 10-1

6,6 10-4

1,2 10-1

2,9 105

Ces quelques valeurs tmoignent- d'une part, de la diversit des valeurs selon les enzymes- d'autre part de la spcificit d'un enzyme vis vis d'un de ses substrats

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4.2. La dtermination des constantes cintiquesNombreuses sont les techniques physiques ou chimiques qui permettent de suivre lesparamtres d'une cintique, pour en citer quelques-unes :

- spectrophotomtrie- fluorescence- titrimtrie- radioactivit- dosages immunologiques

Gnralement, les expriences sont tablies pour mesurer la variation de concentration dusubstrat ou du produit en fonction du temps et cela pour une concentration donne d'enzymeet diffrentes valeurs de la concentration en substrat. La connaissance des valeurs de cesdiffrents paramtres nous permet de dterminer les constantes cintiques.De manire classique, il faut calculer tout d'abord la vitesse initiale ( [P] = 0) et ensuiteutiliser une reprsentation drive de l'quation de Briggs-Haldane.Nous supposerons que les paramtres (temprature, pH, force ionique, etc..) sont identiquespour un ensemble de mesures concernant un enzyme et un substrat particuliers.Il faudra toujours avoir en mmoire que l'quation de Michalis-Menten ou de Briggs-Haldane ont t calcules dans des conditions particulires :(1) [P] = 0, (2) [S]0>> [E]0 et (3) soit pr-quilibre soit tat stationnaire.

4.2.1. Mesure de la vitesse initiale

Pour une concentration d'enzyme donne, on calcule la vitesse initiale pour une concentrationde substrat totale donne en traant la courbe [P] = f(t) ou encore ([S]0 - [S]) = f(t).

[P]

temps

tangente la courbe [P]=f(t)au point t=0 : d[P]

Evolution de la concentration du produit en fonction du temps

dtvitesse initiale

La vitesse initiale est la tangente d[P]dt

la courbe [P] = f(t) au point t=0.

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La dimension de la vitesse est une concentration par unit de temps, l'unit est (M s-1),toutefois les biochimistes ont l'habitude de prendre comme unit des mole/litre parminute (M min-1).

4.2.2. Reprsentation hyperbolique (Michalis-Menten)A partir des rsulats exprimentaux, mesure des vitesses initiales pour chaque concentrationtotale de substrat [S]0 , pour une concentration donne d'enzyme, nous pouvons tracerv=f([S]0 ) qui est une hyperbole.

VM

v

[S]0

VM2

KM

L'asymptote horizontale de l'hyperbole pour les grandes valeurs de [S]0 permet d'avoir lavaleur de VM et la valeur de KMqui est la valeur de [S]0 pour v=

V2M

4.2.3. Reprsentation de Lineweaver-BurkC'est la reprsentation la plus utilise qui ft publie en 1935 par Hans Lineweaver et Dean

Burk : 1v

= f 1[S]0

.

1 / [S]0

1 / v

1 / VM

-1 / KM

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v = V [S]

K + [S] 1v

=K + [S]

V [S] 1v

=KV

1[S] +

1V

M 0M 0

M 0M 0

M

M 0 M

Cette reprsentation est une droite qui coupe l'axe des 1v

au point 1VM

et l'axe des 1[S]0 au

point -1KM

.

4.2.4. Reprsentation Eadie-HofsteeCette reprsentation ft publie par George Eadie en 1942 et Baren Hofstee en 1959 :

v = f v[S]0

v

v / [S] 0

VMpente -KM

v = V [S]

K + [S] v K +[S] = V [S] v = -Kv

[S] +VM 0

M 0M 0 M 0 M

0M ( )

Cette reprsentation est une droite de pente -KM et qui coupe l'axe des v au point VM .

4.2.5. Reprsentation de Hanes-Woolf

Cette reprsentation ft publie par Charles Hanes et Barnet Woolf en 1932 : [S]v

= f [S]0 0( )

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[S] / v0

[S]0

pente : 1 / VM

M- K

v = V [S]

K + [S] v K +[S] = V [S] K +[S] = V [S]

v

[S]v

= 1

V[S] + K

V

M 0M 0

M 0 M 0 M 0 M0

0M

0M

M

( )

( )

Cette reprsentation est une droite de pente 1VM

et qui coupe l'axe des [S]0 au point -KM( ).

4.2.6. Reprsentation de Eisenthal et Cornish-Bowden (graphe linaire direct)Cette reprsentation ft publie par Robert Eisenthal et Athelstan Cornish-Bowden en 1974.Pour chaque couple de vitesse initiale et concentration initiale de substrat v , [S] , jj 0( ) , ladroite, dfinie par le couple (j) de points [(-[S] , j0 , 0) : (0, v j)], est trace dans le reprecartsien (v, [S]).

L'quation gnrique est :

v = a [S] + b , avec pour chaque droite : b = v et a = v[S]

v = v

[S] [S] + v

j j jj0, j

j0, j

j

pour chacune de ces droites, calculons la valeur de v pour la valeur de [S] gale KM, enutilisant la relation de Briggs-Haldane : v =

V [S]K + [S] j

M 0,jM 0,j

v = v

[S] K + v = v 1+K

[S] , en utilisant la relation de Briggs - Haldane :j0, j

M j j M0,j

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v = V [S]

K + [S][S] + K

[S] = VM 0,j

M 0,j0, j M

0,jM

En thorie En pratique

v v

[S] [S]

VMVM

K MK M

o

o

v1

[S]0,1

Thoriquement, nous avons un faisceau de droites concourantes en un mme point decoordonnes : K , VM M( ). Pratiquement les droites concourent dans un petit rectangle et onprend le milieu des cts pour dterminer K , VM M( ).

4.2.7. Quelques commentaires sur ces reprsentationsLes calculs et programmes informatiques permettent d'utiliser directement les pointsexprimentaux et de calculer une vitesse initiale pour chaque concentration de substrat etensuite de tracer l'hyperbole de saturation, de calculer son asymptote et d'en dduire lesvaleurs de VM et KM ainsi que la valeur de la constante catalytique si on connat laconcentration de l'enzyme et par suite la constante de spcificit.

Dans le cas o nous procdons avec une calculette et une feuille de papier millimtr, nousallons calculer la vitesse initiale (pente de la tangente la courbe [P]=f(t)) et ensuite utiliserune des reprsentations linaires pour calculer les valeurs de VM et KM.Les reprsentations de Lineweaver-Burk et Eadie-Hofstee ont une coordonne en 1/ [S]0 ,cela signifie que les mesures les plus prcises seront concentres dans la mme rgion(voisines de l'axe vertical) et peu de mesures avec une erreur relativement grande existerontpour des faibles valeurs de concentration de substrat : le trac la rgle de la "meilleure"droite sera entach d'erreur.La reprsentation de Hanes-Woolf amliorera la dtermination des valeurs exprimentalespar une distribution plus quilibre des points exprimentaux. Celle de Eisenthal et Cornish-Bowden donnera les meilleures estimations des valeurs de VM et KM. Toutefois, malgr ses

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imprcisions sur les estimations des valeurs des constantes cintiques, la reprsentation deLineweaver-Burk est la plus utilise.

555... DDDooosssaaagggeee eeennnzzzyyymmmaaatttiiiqqquuueeeNous avons vu prcdemment la relation entre la vitesse maximum, la constante catalytiqueet la concentration totale de l'enzyme : V = k [E]M cat 0.Si nous nous plaons dans des conditions exprimentales o [S] >> [E] et [S] >> K0 0 0 Mla vitesse mesure est la vitesse maximum et elle est proportionnelle la concentrationtotale d'enzyme. C'est donc une mthode qui peut tre utilise pour doser la concentration etpar suite la quantit d'enzyme prsente dans la solution.

[E]0

pente de la droite k cat

v

5.1. Activit enzymatique

5.1.1. Activit enzymatique (ou catalytique)Cette unit a t dfinie pour estimer la quantit de l'activit catalytique d'une prparation oud'un chantillon d'enzyme lorsque l'enzyme ne peut tre dfini que par rapport son activitcatalytique.Une unit d'activit enzymatique (abrviation U.I. ou U.E.) est dfinie comme la quantitd'enzyme qui produit la transformation d'une micromole de substrat par minute 25C(mole min- 1) . La mesure de l 'act ivit dans des condit ions o[S] >> [E] et [S] >> K0 0 0 M permet de doser les quantits d'enzyme prsentes dans deschantillons.

Remarque : dans le systme international (S.I.), l'unit officielle est le katal (kat) : quantitd'enzyme qui catalyse la transformation de 1 mole de substrat par seconde. Les biochimistesprfrent utiliser les units internationales (U.I. ou U.E.)1 U.I = 1 U.E. = 0,0166 kat = 16,6 nkat

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5.1.2. Activit enzymatique (ou catalytique) spcifiqueC'est l'activit d'un prparation d'enzyme, normalise par unit de masse exprimeclassiquement en mg : micromole de substrat par minute par milligramme de l'chantillon(mole min-1 mg-1).Dans le cas d'un chantillon pur, et si la quantit d'enzyme est exprime en mole, onretrouve la constante catalytique, exprime dans ce cas en (min-1 ) (voir 4.1.2).

666... CCCeee qqquuuiii nnn'''aaa pppaaasss ttt dddiiitttC'est la fin de cette introduction la cintique enzymatique, les points suivants n'ont pas tabords, certains ont t vus en chimie, d'autres seront traits dans les annes suivantes :

1) le modle des collisions et du complexe activ pour l'interprtation des phnomnes decatalyse. Le modle des collisions cintiques a t dvelopp par M. Trautz, W.C.McCLewis et Jean Perrin dans les annes 1910-1920), complte par Lindemann, et le modledu complexe activ publi en 1935 par Henry Eyring

2) des schmas ractionnels non Michaeliens : les enzymes n'obissent pas tous au modlede base dcrit ici

3) les diagrammes d'tat des enzymes, c'est dire l'tude de l'influence de la temprature, dupH, de la force ionique, etc.. sur les constantes cintiques des enzymes

4) la dpendance vis vis de la prsence de coenzymes ou cofacteurs pour certains enzymes5) la rgulation de l'activit enzymatique par des phnomnes de cooprativit positive ou

ngative (le plus connu tant le modle allostrique cooprativit positive), la rgulationpar des effecteurs

6 ) des modles de schma ractionnel pour des catalyses enzymatiques en prsenced'inhibiteurs, ou des catalyses plusieurs substrats

7) les mcanismes molculaires qui interviennent dans la catalyse enzymatique.

Documents

cinetique.pdf