Chromatographie II HPLC - · Chromatographie II 2 HPLC Praktikum I.1I.1 Einleitung Einleitung (siehe Skript Praktikum) HPLC Praktikum I3 Die stationäre Phase I.2I.2 Ziele des Praktikums

1

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ldm

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rap

mat

ogra

p01

1/12

R.

011/

12 R

.

HPLCHPLCHPLCHPLCChromatographie IIChromatographie II

Chr

omC

hrom

WS

20W

S 20 HPLC HPLC SeminarSeminarHPLC HPLC SeminarSeminar

2Chromatographie II Chromatographie II HPLC PraktikumHPLC PraktikumI.1I.1 Einleitung Einleitung (siehe Skript Praktikum)(siehe Skript Praktikum)

HPLC PraktikumHPLC Praktikum

I 3I 3 Die stationäre PhaseDie stationäre PhaseI.2I.2 Ziele des PraktikumsZiele des PraktikumsI.3I.3 Die stationäre PhaseDie stationäre PhaseI.4I.4 Die mobile PhaseDie mobile PhaseI 5I 5 Di P ( )Di P ( )I.5I.5 Die Pumpe(n)Die Pumpe(n)I.6I.6 Die InjektionseinheitDie Injektionseinheit

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ld I.7I.7 Die DetektoreinheitDie DetektoreinheitI.8I.8 Die SoftwareDie Software

mat

ogra

pm

atog

rap

011/

12 R

.01

1/12

R. I.8I.8 Die SoftwareDie SoftwareI.9I.9 Die Methode des ISTDDie Methode des ISTDI 10I 10 Aufgaben zum theoretischen TeilAufgaben zum theoretischen Teil

Chr

omC

hrom

WS

20W

S 20 I.10I.10 Aufgaben zum theoretischen Teil Aufgaben zum theoretischen Teil

3

I 2 Ziele des PraktikumsI 2 Ziele des PraktikumsChromatographie II Chromatographie II

Nach diesem Nach diesem PraktikumPraktikum soll man u.a.:soll man u.a.:

I.2 Ziele des PraktikumsI.2 Ziele des Praktikums

Über den Aufbau einer Über den Aufbau einer HPLCHPLC--AnlageAnlage, sowie , sowie überüber stationärestationäre undund mobilemobile PhasePhase BescheidBescheid

Ziel 1Ziel 1über über stationärestationäre und und mobilemobile PhasePhase Bescheid Bescheid wissen. wissen.

Ziel 2Ziel 2 Über dieÜber die EinzelbestandteileEinzelbestandteile (wie z B(wie z B PumpenPumpenZiel 2Ziel 2 Über die Über die EinzelbestandteileEinzelbestandteile (wie z.B. (wie z.B. PumpenPumpen, , InjektoreinheitInjektoreinheit und und DetektorenDetektoren) Bescheid) Bescheidwissen. wissen.

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ld Wichtige Wichtige chromatographische Kenngrößenchromatographische Kenngrößen(z.B. (z.B. ttmm, , ttRR(X)(X), , VVmm, , VVRR(X)(X), , uumm, , uu(X)(X),, k etc.)k etc.)

Ziel 3Ziel 3

mat

ogra

pm

atog

rap

011/

12 R

.01

1/12

R. bestimmen können. bestimmen können.

Eine Eine quantitative Bestimmungquantitative Bestimmung mit der mit der Methode desMethode des Internen StandardsInternen Standards durchführendurchführen

Ziel 4Ziel 4

Chr

omC

hrom

WS

20W

S 20 Methode des Methode des Internen StandardsInternen Standards durchführen durchführen

können. können.

4

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ldm

atog

rap

mat

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p01

1/12

R.

011/

12 R

.

Kapitel IKapitel I Theoretischer TeilTheoretischer TeilKapitel IKapitel I Theoretischer TeilTheoretischer Teil

Chr

omC

hrom

WS

20W

S 20

5

I 2 1I 2 1 KomponentenKomponenten derder HPLC AnlageHPLC AnlageI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.2.1 I.2.1 KomponentenKomponenten der der HPLC AnlageHPLC Anlage

11 33114444

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ld 22 55

mat

ogra

pm

atog

rap

011/

12 R

.01

1/12

R.

Chr

omC

hrom

WS

20W

S 20

6

I 2 1I 2 1 KomponentenKomponenten derder HPLC AnlageHPLC AnlageI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.2.1 I.2.1 KomponentenKomponenten der der HPLC AnlageHPLC Anlage

331144

1144

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ld 22 55

mat

ogra

pm

atog

rap

011/

12 R

.01

1/12

R.

2 1 C2 1 C SS

Chr

omC

hrom

WS

20W

S 20 Abb. I.2.1: Komponenten eines HPLCAbb. I.2.1: Komponenten eines HPLC--Systems Systems

7

Chromatographiearten (Auswahl)Chromatographiearten (Auswahl)I Theoretischer TeilI Theoretischer TeilChromatographiearten (Auswahl)Chromatographiearten (Auswahl)

Trennung durch AdsorptionTrennung durch Adsorption Stationäre Stationäre

Adsorptions-Chromatographie

Trennung durch AdsorptionTrennung durch AdsorptionPhasePhase

Adsorptions-Chromatographieflüssig / fest

(NP/RP-HPLC) Mobile Mobile PhasePhasePhasePhase

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ld Trennung durch LöslichkeitTrennung durch Löslichkeit

StationäreStationäre

mat

ogra

pm

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rap

011/

12 R

.01

1/12

R.

Verteilungs-Chromatographieflüssig / flüssig

Stationäre Stationäre PhasePhase

Chr

omC

hrom

WS

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S 20

8

I 3 Die Stationäre PhaseI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.3 Die Stationäre Phase

Ad tiAd ti Ch t hiCh t hi t ilt i h f it ilt i h f i

NormalNormal PhasePhase Chomatographie:Chomatographie: NPNP

AdsorptionsAdsorptions--ChromatographieChromatographie teilt sich auf in:teilt sich auf in:

NormalNormal--PhasePhase--Chomatographie:Chomatographie: NPNP

St ti ä PhSt ti ä Ph M bil PhM bil PhStationäre Phase Stationäre Phase polarpolar

Mobile Phase Mobile Phase unpolarunpolar

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ld

ReversedReversed--PhasePhase--Chomatographie:Chomatographie: RPRP

mat

ogra

pm

atog

rap

011/

12 R

.01

1/12

R.

Stationäre Phase Stationäre Phase unpolarunpolar

Mobile Phase Mobile Phase polarpolar

Chr

omC

hrom

WS

20W

S 20 unpolarunpolar polarpolar

9

I 3 DieI 3 Die Stationäre PhaseStationäre PhaseI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.3 Die I.3 Die Stationäre PhaseStationäre Phaseph

ie II

ph

ie II

. . V

asol

dVa

sold

mat

ogra

pm

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rap

011/

12 R

.01

1/12

R.

Abb I 3 1 K t i HPLCAbb I 3 1 K t i HPLC S t (Sä l )S t (Sä l )

Chr

omC

hrom

WS

20W

S 20 Abb. I.3.1: Komponenten eines HPLCAbb. I.3.1: Komponenten eines HPLC--Systems (Säule)Systems (Säule)

10

I 3 DieI 3 Die Stationäre PhaseStationäre PhaseI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.3 Die I.3 Die Stationäre PhaseStationäre Phase

Stationäre Phase

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ld

End-Kartusche

mat

ogra

pm

atog

rap

011/

12 R

.01

1/12

R.

Abb I 3 2 D t ll i HPLC Sä l

End Kartusche

Chr

omC

hrom

WS

20W

S 20 Abb. I.3.2: Darstellung einer HPLC-Säule

11

I 3 Die Stationäre PhaseI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.3 Die Stationäre Phase

Partikel (z.B.sphärisch)

3µm 10µm

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ld 3µm -10µm

mat

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pm

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rap

011/

12 R

.01

1/12

R.

Abb I 3 3 D t ll d Ei l tik l

Chr

omC

hrom

WS

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S 20 Abb. I.3.3: Darstellung der Einzelpartikel

12

I 3 1 Beispiele stationärer PhasenI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.3.1 Beispiele stationärer Phasen

sesePh

asPh

asm

alm

al--

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ld

Nor

mN

orm

mat

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pm

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011/

12 R

.01

1/12

R.

Chr

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hrom

WS

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S 20 Abb. I.3.1.a: Material mit polaren Silanol- (SiOH)- Endguppen

13I Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI 3 1 Beispiele stationärer PhasenI.3.1 Beispiele stationärer Phasen

eeha

seha

seR

PR

P--PhPh

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ld RR

mat

ogra

pm

atog

rap

011/

12 R

.01

1/12

R.

Abb I 3 1 b M t i l it l CH E d

Chr

omC

hrom

WS

20W

S 20 Abb. I.3.1.b: Material mit unpolaren CH3-Endgruppen


eeha

seha

seR

PR

P--PhPh

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ld RR

mat

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pm

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rap

011/

12 R

.01

1/12

R.

Abb I 3 1 M t i l it l C4 E d

Chr

omC

hrom

WS

20W

S 20 Abb. I.3.1c: Material mit unpolaren C4-Endgruppen


eeha

seha

seR

PR

P--PhPh

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ld RR

mat

ogra

pm

atog

rap

011/

12 R

.01

1/12

R.

Abb I 3 1 d M t i l it l C8 E d

Chr

omC

hrom

WS

20W

S 20 Abb. I.3.1.d: Material mit unpolaren C8-Endgruppen


eeha

seha

seR

PR

P--PhPh

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ld RR

mat

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pm

atog

rap

011/

12 R

.01

1/12

R.

Chr

omC

hrom

WS

20W

S 20 Abb. I.3.1e: Material mit C18-Endgruppen


Im Praktikumsversuch wird folgende Säule Im Praktikumsversuch wird folgende Säule i t ti t teingesetzt:eingesetzt:

Hersteller:Hersteller: Fa. PhenomenexFa. Phenomenex

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ld Dimensionen:Dimensionen: 150 mm x 4.6 mm (ID)150 mm x 4.6 mm (ID)Material:Material: 3 µm3 µm

mat

ogra

pm

atog

rap

011/

12 R

.01

1/12

R. stationäre Phase: stationäre Phase: C18C18

Chr

omC

hrom

WS

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S 20

18

I 4 Die mobile PhaseI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.4 Die mobile Phase

Ad tiAd ti Ch t hiCh t hi t ilt i h f it ilt i h f i

NormalNormal PhasePhase Chomatographie:Chomatographie: NPNP

AdsorptionsAdsorptions--ChromatographieChromatographie teilt sich auf in:teilt sich auf in:

NormalNormal--PhasePhase--Chomatographie:Chomatographie: NPNP

St ti ä PhSt ti ä Ph M bil PhM bil PhStationäre Phase Stationäre Phase polarpolar

Mobile Phase Mobile Phase unpolarunpolar

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ld

ReversedReversed--PhasePhase--Chomatographie:Chomatographie: RPRP

mat

ogra

pm

atog

rap

011/

12 R

.01

1/12

R.

Stationäre Phase Stationäre Phase unpolarunpolar

Mobile Phase Mobile Phase polarpolar

Chr

omC

hrom

WS

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S 20 unpolarunpolar polarpolar

19

I 4 Die mobile PhaseI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.4 Die mobile Phaseph

ie II

ph

ie II

. . V

asol

dVa

sold

mat

ogra

pm

atog

rap

011/

12 R

.01

1/12

R.

4 1 C4 1 C S ( )S ( )

Chr

omC

hrom

WS

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S 20 Abb. I.4.1: Komponenten eines HPLCAbb. I.4.1: Komponenten eines HPLC--Systems (Eluenten)Systems (Eluenten)

20

I 4 1 Die Eluotrope ReiheI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.4.1 Die Eluotrope Reihe

== AnordnungAnordnung der Laufmittel nach der Laufmittel nach steigender Elutionskraft Esteigender Elutionskraft E00

(( P l ität)P l ität) b fb f NPNP Ph ( i i h b ti t)Ph ( i i h b ti t)(( Polarität) Polarität) bezogen aufbezogen auf NPNP--Phase (empirisch bestimmt)Phase (empirisch bestimmt)

UVUV--Grenze Grenze [nm][nm]

PolaritätPolarität[E[E0 0 (Al(Al22OO33)])]

EluentEluent

2452450 400 40ChloroformChloroform

2852850,290,29ToluolToluol

1901900,000,00nn--HexanHexan

togr

aphi

eto

grap

hie

[ ][ ][[ (( 22 33)])]

2602600 580 58EssigsäureethylesterEssigsäureethylester

3303300,560,56AcetonAceton

2302300,420,42DichlormethanDichlormethan

2452450,400,40ChloroformChloroformN

PN

P--C

hrom

atC

hrom

at

chlic

he

chlic

he

ndun

gnd

ung

nn

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ld

1901900 650 65AcetonitrilAcetonitril

2752750,630,63DiethylaminDiethylamin

2702700,620,62DimethylsulfoxidDimethylsulfoxid

togr

aphi

eto

grap

hie

2602600,580,58EssigsäureethylesterEssigsäureethylester

haup

tsäc

haup

tsäc

Verw

enVe

rwen inin

mat

ogra

pm

atog

rap

011/

12 R

.01

1/12

R.

<190<190>1 11>1 11WasserWasser

2052050,950,95MethanolMethanol

2102100,820,8222--PropanolPropanol

1901900,650,65AcetonitrilAcetonitril

RP

RP--

Chr

omat

Chr

omathh

Chr

omC

hrom

WS

20W

S 20

<190<190>1,11>1,11WasserWasserRR

Abb. I.4.1.a:Abb. I.4.1.a: Die Eluotrope Reihe (Auszug)Die Eluotrope Reihe (Auszug)

21


nn--HexanHexan CHClCHCl33 CHCH22ClCl22 22--PropanolPropanolnn HexanHexan CHClCHCl33 CHCH22ClCl22 pp

EE0 0 == 0,000,00 EE00 = 0, 40= 0, 40 EE00 = 0,42= 0,42 EE00 =0,82=0,82

Für die Für die NormalphasenNormalphasen--(NP)(NP)--Chomatographie gilt:Chomatographie gilt:

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ldm

atog

rap

mat

ogra

p01

1/12

R.

011/

12 R

.

Elutionskraft = Fähigkeit desElutionskraft = Fähigkeit des

Chr

omC

hrom

WS

20W

S 20

Elutionskraft Fähigkeit des Elutionskraft Fähigkeit des Fließmittels Substanzen inFließmittels Substanzen inder Säule weiter zu befördernder Säule weiter zu befördern

22


Beispiel für die Beispiel für die NormalphasenNormalphasen--(NP):(NP):

50% Hexan + 50% 250% Hexan + 50% 2--PrPrEE0 0 == 0,000,00 EE0 0 == 0,820,82

kt

Rete

60% Hexan + 40% 260% Hexan + 40% 2--PrPr

raft

sink

entionsz

70% Hexan + 30% 270% Hexan + 30% 2--PrPr

lutio

nskr

zeiten stph

ie II

ph

ie II

. . V

asol

dVa

sold

80% Hexan + 20% 280% Hexan + 20% 2--PrPr

El teigen

mat

ogra

pm

atog

rap

011/

12 R

.01

1/12

R.

90% Hexan + 10% 290% Hexan + 10% 2--PrPr

Chr

omC

hrom

WS

20W

S 20

Abb. I.4.1.b:Abb. I.4.1.b: Entwicklung einer NPEntwicklung einer NP--Trennung (isokratisch) Trennung (isokratisch)

23I Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI 4 1 Die Eluotrope ReiheI.4.1 Die Eluotrope Reihe

THFTHF CHCH33CNCN MethanolMethanol HH22OOTHFTHF 33 MethanolMethanol HH22OO

EE0 0 == 0,450,45 EE00 = 0, 65= 0, 65 EE00 = 0,95= 0,95 EE00 > 1 > 1

Für die Für die ReversedReversed--PhasePhase--(RP)(RP)--ChomatographieChomatographie gilt:gilt:

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ldm

atog

rap

mat

ogra

p01

1/12

R.

011/

12 R

.

Elutionskraft = Fähigkeit desElutionskraft = Fähigkeit des

Chr

omC

hrom

WS

20W

S 20

Elutionskraft Fähigkeit des Elutionskraft Fähigkeit des Fließmittels Substanzen inFließmittels Substanzen inder Säule weiter zu befördernder Säule weiter zu befördern

24

I 4 1 Die Eluotrope ReiheI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.4.1 Die Eluotrope ReiheBeispiel für die Beispiel für die ReversedReversed--PhasePhase--(RP)(RP)--ChomatographieChomatographie::

70% CH70% CH33CN + 30% HCN + 30% H22OO

NebenproduktNebenprodukt

EE00 = 0,65= 0,65 EE00 > 1> 1kt

Rete

60% CH60% CH33CN + 40% HCN + 40% H22OO

pp

raft

sink

entionsz

33 22

lutio

nskr

zeiten stph

ie II

ph

ie II

. . V

asol

dVa

sold 50% CH50% CH33CN + 50% HCN + 50% H22OOE

l teigen m

atog

rap

mat

ogra

p01

1/12

R.

011/

12 R

.

40% CH40% CH33CN + 60% HCN + 60% H22OO

Chr

omC

hrom

WS

20W

S 20

Abb. I.4.1.c:Abb. I.4.1.c: Entwicklung einer RPEntwicklung einer RP--Trennung (isokratisch) Trennung (isokratisch)

25

I 4 2 Die isokratische-ElutionI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.4.2 Die isokratische-Elution

Die Die ZusammensetzungZusammensetzung der der mobilen Phasemobilen Phase ändert sichändert sichggwährend der während der chromatographischenchromatographischen Trennung Trennung nichtnicht::

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ldm

atog

rap

mat

ogra

p01

1/12

R.

011/

12 R

.

Abb. I.4.2.: Abb. I.4.2.: EluentenverlaufEluentenverlauf bei bei isokratischerisokratischer ElutionElution

Chr

omC

hrom

WS

20W

S 20

26

I 4 3 Die Gradienten-ElutionI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.4.3 Die Gradienten-Elution

Die Die ZusammensetzungZusammensetzung der der mobilen Phasemobilen Phase ändertändert sichsichggwährend der chromatographischen Trennung:während der chromatographischen Trennung:

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ldm

atog

rap

mat

ogra

p01

1/12

R.

011/

12 R

.

Abb. I.4.3: Abb. I.4.3: EluentenverlaufEluentenverlauf bei Gradienten bei Gradienten ElutionElution

Chr

omC

hrom

WS

20W

S 20

27

I 5 Die Pumpe / Injektor / DetektorI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.5 Die Pumpe / Injektor / Detektorph

ie II

ph

ie II

. . V

asol

dVa

sold

mat

ogra

pm

atog

rap

011/

12 R

.01

1/12

R.

Chr

omC

hrom

WS

20W

S 20 Abb. I.5.a: Komponenten eines HPLCAbb. I.5.a: Komponenten eines HPLC--Systems (Pumpe,Systems (Pumpe,

Detektor, Injektionseinheit)Detektor, Injektionseinheit)

28

I 5 Die PumpeI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.5 Die Pumpe

Auslaßventil

K lbKolben

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ld

Einlaßventil

mat

ogra

pm

atog

rap

011/

12 R

.01

1/12

R.

Chr

omC

hrom

WS

20W

S 20

Abb. I.5.b:Abb. I.5.b: KolbenpumpeKolbenpumpe

29

I 5 DieI 5 Die PumpePumpeI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.5 Die I.5 Die PumpePumpe

Auslaßventil

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ld Kolben

EinlaßventilKolbenantrieb

mat

ogra

pm

atog

rap

011/

12 R

.01

1/12

R.

Abb I 5 Ei k lbAbb I 5 Ei k lb PP

Einlaßventil

Chr

omC

hrom

WS

20W

S 20 Abb. I.5.c: EinkolbenAbb. I.5.c: Einkolben--PumpePumpe

30

I 5 DieI 5 Die PumpePumpeI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.5 Die I.5 Die PumpePumpe

KolbenMembran

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ld

Hydraulik-Flüssigkeit

mat

ogra

pm

atog

rap

011/

12 R

.01

1/12

R.

Abb I 5 Di hAbb I 5 Di h PP

Chr

omC

hrom

WS

20W

S 20 Abb. I.5.e: DiaphragmaAbb. I.5.e: Diaphragma--PumpePumpe

31

I 6 DieI 6 Die InjektionseinheitInjektionseinheitI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.6 Die I.6 Die InjektionseinheitInjektionseinheit

Injektionsnadel

Ventil

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ld

Probengläschen

Proben-Schleife

mat

ogra

pm

atog

rap

011/

12 R

.01

1/12

R. g

Abb. I.6.a:Abb. I.6.a:

Chr

omC

hrom

WS

20W

S 20 Funktionsweise AutosamplerFunktionsweise Autosampler

Pumpe Säule

32

I 7 DieI 7 Die DetektoreinheitDetektoreinheitI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.7 Die I.7 Die DetektoreinheitDetektoreinheitI.7.1 Der I.7.1 Der UV/VISUV/VIS--DetektorDetektor

GitterSpalt

Gitter

Flußzelle

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ld DeuteriumlampeFlußzelle

Photozelle

mat

ogra

pm

atog

rap

011/

12 R

.01

1/12

R.

Abb. I.7:Abb. I.7: UV/VIS UV/VIS -- Detektor (VWD oder MWD) Detektor (VWD oder MWD) jeweils nur eine Wellenlänge einstellbarjeweils nur eine Wellenlänge einstellbar

Chr

omC

hrom

WS

20W

S 20

33I Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI 7 DieI 7 Die DetektoreinheitDetektoreinheitI.7.2 Der I.7.2 Der DiodenarrayDiodenarray--Detektor (UV/VIS)Detektor (UV/VIS)I.7 Die I.7 Die DetektoreinheitDetektoreinheit

Gitter

Spalt PhotodiodenSpalt otod ode

Flußzelle

Deuteriumlampe

Flußzelle

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ldm

atog

rap

mat

ogra

p01

1/12

R.

011/

12 R

.C

hrom

Chr

omW

S 20

WS

20

Abb. I.7.2: Der Photodiodenarray-Detektor

34

I 7 2 1 DerI 7 2 1 Der ISOISO--Plot (DADPlot (DAD--Detektor)Detektor)I Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.7.2.1 Der I.7.2.1 Der ISOISO--Plot (DADPlot (DAD--Detektor)Detektor)

AbsorptionAbsorption0 mAU0 mAU 100 mAU100 mAUe

[nm

]e

[nm

]en

läng

een

läng

eW

ell

Wel

l

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ldm

atog

rap

mat

ogra

p01

1/12

R.

011/

12 R

.C

hrom

Chr

omW

S 20

WS

20

Abb. I.7.2.1: Isoplot einer chromatographischen TrennungAbb. I.7.2.1: Isoplot einer chromatographischen TrennungZeit [min]Zeit [min]

35I Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI 7 2 2 DerI 7 2 2 Der 3D3D--Plot (DAD Detektor)Plot (DAD Detektor)I.7.2.2 Der I.7.2.2 Der 3D3D--Plot (DAD Detektor)Plot (DAD Detektor)

]]on

[mA

U]

on [m

AU

]

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ld

bsor

ptio

bsor

ptio

mat

ogra

pm

atog

rap

011/

12 R

.01

1/12

R.

Ab

Ab

Chr

omC

hrom

WS

20W

S 20

Abb. I.7.2.2: 3-D-Plot einer chromatographischen Trennung

36

I 7 3 DerI 7 3 Der MSMS DetektorDetektorI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.7.3 Der I.7.3 Der MSMS--DetektorDetektor

Quadrupol IonenfalleIonenquelle

HPLC

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ldm

atog

rap

mat

ogra

p01

1/12

R.

011/

12 R

.

Abb. I.7.3: Vereinfachte Darstellung eines HPLC-MS-Detektors

Chr

omC

hrom

WS

20W

S 20

37

I 7 4 weitereI 7 4 weitere HPLCHPLC--DetektorenDetektorenI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.7.4 weitere I.7.4 weitere HPLCHPLC--DetektorenDetektoren

HPLC-Detektoren Anwendung Nachweisgrenze Linearität

UV-VIS(VWD. MWD)

selektivnur für einzelne UV-aktive

Komponenten

ca. 0,3 ng/ml 104

DAD(Diodenarray-Detektor)

190-950 nm

selektivfür fast alle UV-aktiven

Komponenten

0,3 ng/ml 104

RI universell ca. 0,7 g/ml 3 x 103

(Brechungsindex-Detektor)

(stark temperaturabhängig, keine Gradientenelution möglich, relativ

unempfindlich)

FLD selektiv 0,8 pg/ml 103 - 104

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ld (Fluoreszenz-Detektor) nur für fluoreszierende Komponenten

ECD(Elektrochemischer

D t kt )

selektiv,nur für oxidierbare oder d i b K t

ca. 1,0 pg/ml --

mat

ogra

pm

atog

rap

011/

12 R

.01

1/12

R. Detektor) reduzierbare Komponenten

CDLeitfähigkeitsdetektor

ionenselektiv bis zu ca 0,2% untersch.

Leitfähigkeit

ca. 105

Chr

omC

hrom

WS

20W

S 20 Abb. I.7.4: weitere häufig eingesetzte HPLC-Detektoren

38

I 8 SoftwareI 8 SoftwareI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.8. SoftwareI.8. Softwareph

ie II

ph

ie II

. . V

asol

dVa

sold

mat

ogra

pm

atog

rap

011/

12 R

.01

1/12

R.

Chr

omC

hrom

WS

20W

S 20

Abb. I.8: Software ChemStation B.03.02

39

KenngrößenKenngrößen des Chromatogrammsdes ChromatogrammsI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilKenngrößenKenngrößen des Chromatogrammsdes Chromatogramms

tt tt ttRR (X)(X) SS(X)(X)

ttRR(X(X11))

ttRR(X(X22))tt tt ttRR (X)(X) SS(X)(X) mm

ttRR(X(X11))

ttmm

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ldm

atog

rap

mat

ogra

p01

1/12

R.

011/

12 R

.

Zeit [s]Zeit [s]ttSS(X(X11))ttSS(X(X22))

Chr

omC

hrom

WS

20W

S 20 Kenngrößen eines ChromatogrammsKenngrößen eines Chromatogramms

40

I 9 Die Methode desI 9 Die Methode des Internen StandardsInternen StandardsI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.9 Die Methode des I.9 Die Methode des Internen StandardsInternen Standards

Ch t hi h Lä f i d iCh t hi h Lä f i d iChromatographische Läufe sind nieChromatographische Läufe sind nie100%100% identisch denn:identisch denn:

Es kann zu „ganz normalen“ Es kann zu „ganz normalen“ SchwankungenSchwankungenzwischen den Läufen kommen, wie: zwischen den Läufen kommen, wie:

Geringe Unterschiede im Geringe Unterschiede im InjektionsvolumenInjektionsvolumen(Luftblasen, manuelle Injektion). (Luftblasen, manuelle Injektion).

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ld

( , j )( , j )

Veränderungen des Veränderungen des SäulenmaterialsSäulenmaterials im im Laufe des MeßbetriebesLaufe des Meßbetriebes

mat

ogra

pm

atog

rap

011/

12 R

.01

1/12

R. Laufe des Meßbetriebes.Laufe des Meßbetriebes.

Veränderungen der Veränderungen der UmgebungstemperaturUmgebungstemperaturtt

Chr

omC

hrom

WS

20W

S 20 etc. etc.

41I Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI 9 Die Methode desI 9 Die Methode des Internen StandardsInternen Standards

tt tt ttRR (X)(X) SS(X)(X)

I.9 Die Methode des I.9 Die Methode des Internen StandardsInternen Standards

ttRR(X(X11))

ttRR(X(X22))tt tt ttRR (X)(X) SS(X)(X) mm

Interner StandardInterner StandardttRR(X(X11))

ttmm

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ldm

atog

rap

mat

ogra

p01

1/12

R.

011/

12 R

.

Zeit [s]ttSS(X(X11))ttSS(X(X22))

Chr

omC

hrom

WS

20W

S 20 Abb. I.9:Abb. I.9: Zugabe eines internen Standards (Tracer)Zugabe eines internen Standards (Tracer)

42

I 9 Die Methode desI 9 Die Methode des Internen StandardsInternen StandardsI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.9 Die Methode des I.9 Die Methode des Internen StandardsInternen Standards

DieDie FlächeFläche eineseines PeaksPeaks ist mit derist mit derDie Die FlächeFläche eines eines PeaksPeaks ist mit der ist mit der eingespritzten Stoffmengeeingespritzten Stoffmenge bzw. der bzw. der Masse Masse mmii desdes StoffesStoffes proportional:proportional:

ff

ii

iimmff iiiiaa = = •• (1)(1)

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ld

FlächeFläche derder

mat

ogra

pm

atog

rap

011/

12 R

.01

1/12

R.

MasseMasseder Komponente ider Komponente iResponsefaktorResponsefaktor

Komponente iKomponente i

Chr

omC

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WS

20W

S 20

ppResponsefaktorResponsefaktorder Komponente ider Komponente i

43

I 9 Die Methode des Internen StandardsI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.9 Die Methode des Internen Standards

BeliebigeBeliebige SubstanzSubstanz Tracer Tracer SubstanzSubstanz

ffii == iiaa(2)(2) ffTT == TrTraa

(3)(3)ffii = = iimm (2)(2) ffTrTr = =

TrTrmmTT = Tracer= Tracer

(3)(3)

TrTr = Tracer= Tracer

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ld

KKKK

KKKK

iiKFKF = = TrTrff== TrTrii aamm

(4)(4)

mat

ogra

pm

atog

rap

011/

12 R

.01

1/12

R. KKKKii

iiff iiTrTr aamm

Chr

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WS

20W

S 20

KK = Kalibrierlösung= KalibrierlösungKalibrierfaktorKalibrierfaktor der Komponente ider Komponente i

44

I 9 Die Methode des Internen StandardsI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.9 Die Methode des Internen Standards

TrTr

ffff

== xxxx

xxTrTr

xxii aamm

(5)(5)

x = Probenlösung

iiff xxii

xxTrTr aamm

( )( )

Auflösen nach Auflösen nach Masse Masse der Komponente der Komponente ii

g

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ld

xx TrTrff iiaa xx

mat

ogra

pm

atog

rap

011/

12 R

.01

1/12

R. mmxx

ii = = mmTrTr (6)(6)ii

TrTr

ffff ii

xxTrTraa

aaKFKFii

Chr

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20W

S 20

45

I.10 Fragen zumI.10 Fragen zum Theoretischen TeilTheoretischen TeilI Theoretischer TeilI Theoretischer TeilI.10 Fragen zum I.10 Fragen zum Theoretischen TeilTheoretischen Teil1.) In welche zwei grundlegenden Typen von Phasensystemen kann die

Adsorptionschromatographie unterschieden werden?2 ) E klä i d B iff d i “2.) Erklären sie den Begriff „endcapping“.3.) Welche Effekte hinsichtlich der Peakform können auftreten, wenn z.B. basische

Substanzen (Amine, Phenole) auf schlecht endgecappten RP-Phasen chromatographiert werden (2 Beispiele)?

4 ) N Si i d t d i V t il di RP Ph i V l i h NP Ph4.) Nennen Sie mindestens drei Vorteile, die RP-Phasen im Vergleich zu NP-Phasen aufweisen.

5.) Was versteht man unter der Eluotropen Reihe, wie wurde sie bestimmt, und welchem Ordnungsprinzip folgt sie?

6 ) W l h Z h b t ht i h E (Al O ) d E (SiO ) ?6.) Welcher Zusammenhang besteht zwischen Eo (Al2O3) und Eo (SiO2) ?7.) Zwischen welchen beiden grundlegenden Arbeitsweisen wird beim Einsatz der

mobilen Phase während einer chromatographischen Trennung unterschieden und wie nennt man diese Formen der Elution?

8 ) E lä t i i di Z h di B iff bi ä “ t ä “ d

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ld 8.) Erläutern sie in diesem Zusammenhang die Begriffe „binärer“, „ternärer“ und „quaternärer“ Gradient.

9.) Nennen sie zwei Gründe, warum Eluenten entgast werden sollten.10.) Nennen sie vier mögliche Verfahren der Eluentenentgasung11 ) Wi i t d K lib i f kt KFi i K t i d fi i t ?

mat

ogra

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rap

011/

12 R

.01

1/12

R. 11.) Wie ist der Kalibrierfaktor KFi einer Komponente i definiert ?

12.) Nennen sie mindestens vier Eigenschaften, die ein geeigneter Tracer aufweisen muß.

13.) Nennen sie einen wesentlichen Unterschied zwischen dem Bauprinzip eines VWD D t kt d i DAD D t kt

Chr

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hrom

WS

20W

S 20 VWD-Detektors und eines DAD-Detektors.

14.) Erläutern sie in diesem Zusammenhang der Ausdruck: „Inverse Optik“.Nennen sie neben UV/VIS vier weitere Arten von HPLC-Detektoren.

46

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ldm

atog

rap

mat

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p01

1/12

R.

011/

12 R

.

Kapitel II Experimenteller TeilKapitel II Experimenteller TeilKapitel II Experimenteller TeilKapitel II Experimenteller Teil

Chr

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WS

20W

S 20

47

Kapitel II: Experimenteller Teil

II.1II.1 Einleitung Einleitung (siehe Skript Praktikum)(siehe Skript Praktikum)gg

II 2 1II 2 1 Vorbereitung der LösungenVorbereitung der Lösungen ( i h Sk i t)( i h Sk i t)

II.2II.2 VersuchsdurchführungVersuchsdurchführungII.2.1II.2.1 Vorbereitung der Lösungen Vorbereitung der Lösungen (siehe Skript) (siehe Skript)

II.2.1.1 Vorbereitung der Stammlösungen(siehe Skript Praktik m)(siehe Skript Praktikum)

II.2.1.2 Vorbereitung der Eich-(Kalibrierlösung)(siehe Skript Praktikum)

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ld

(siehe Skript Praktikum)

II.2.1.3 Vorbereitung der Probenlösungen(siehe Skript Praktikum)

mat

ogra

pm

atog

rap

011/

12 R

.01

1/12

R. ( p )

II.2.2II.2.2 Durchführung der HPLCDurchführung der HPLC--AnalysenAnalysenII 3II 3 Aufgaben zum experimentellen TeilAufgaben zum experimentellen Teil

Chr

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WS

20W

S 20 II.3II.3 Aufgaben zum experimentellen TeilAufgaben zum experimentellen Teil

48II Experimenteller TeilII Experimenteller Teil

O CH3

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ld

N

NNCH3

mat

ogra

pm

atog

rap

011/

12 R

.01

1/12

R.

Coffein

NNO

CH3

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20W

S 20 Coffein

49

II 2 2 Durchführung derII 2 2 Durchführung der HPLCHPLC--AnalysenAnalysenII Experimenteller TeilII Experimenteller TeilII.2.2 Durchführung der II.2.2 Durchführung der HPLCHPLC--AnalysenAnalysenph

ie II

ph

ie II

. . V

asol

dVa

sold

mat

ogra

pm

atog

rap

011/

12 R

.01

1/12

R.

Abb II 2 2 1 Di P P i

Chr

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WS

20W

S 20 Abb. II.2.2.1: Die Pumpen-Programmierung

50

II 2 2 Durchführung derII 2 2 Durchführung der HPLCHPLC--AnalysenAnalysenII Experimenteller TeilII Experimenteller TeilII.2.2 Durchführung der II.2.2 Durchführung der HPLCHPLC--AnalysenAnalysenph

ie II

ph

ie II

. . V

asol

dVa

sold

mat

ogra

pm

atog

rap

011/

12 R

.01

1/12

R.

Abb. II.2.2.2: Die Programmierung des Injektionsvolumens

Chr

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WS

20W

S 20

51

II.2.2 Durchführung derII.2.2 Durchführung der HPLCHPLC--AnalysenAnalysenII Experimenteller TeilII Experimenteller TeilII.2.2 Durchführung der II.2.2 Durchführung der HPLCHPLC AnalysenAnalysenph

ie II

ph

ie II

. . V

asol

dVa

sold

mat

ogra

pm

atog

rap

011/

12 R

.01

1/12

R.

Chr

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WS

20W

S 20 Abb. II.2.2.3: Die Detektorprogrammierung (DAD)

52


ie II

ph

ie II

. . V

asol

dVa

sold

mat

ogra

pm

atog

rap

011/

12 R

.01

1/12

R.

Abb II 2 2 4 Di P i d Sä l th t t

Chr

omC

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WS

20W

S 20 Abb. II.2.2.4: Die Programmierung des Säulenthermostaten

53


ie II

ph

ie II

. . V

asol

dVa

sold

mat

ogra

pm

atog

rap

011/

12 R

.01

1/12

R.

Abb II 2 2 5 Di Ei t ll d I t ti t

Chr

omC

hrom

WS

20W

S 20 Abb. II.2.2.5: Die Einstellung der Integrationsparameter

54

I.2.2 Durchführung derI.2.2 Durchführung der HPLCHPLC--AnalysenAnalysenII Experimenteller TeilII Experimenteller TeilI.2.2 Durchführung der I.2.2 Durchführung der HPLCHPLC AnalysenAnalysenph

ie II

ph

ie II

. . V

asol

dVa

sold

mat

ogra

pm

atog

rap

011/

12 R

.01

1/12

R.

Abb. II.2.2.6: Die Programmierung des Autosamplers

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S 20

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ie II

ph

ie II

. . V

asol

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011/

12 R

.01

1/12

R.

Abb II 2 2 7 D St t d P b

Chr

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S 20 Abb. II.2.2.7: Das Starten der Probensequence

56


ie II

ph

ie II

. . V

asol

dVa

sold

mat

ogra

pm

atog

rap

011/

12 R

.01

1/12

R.

Abb II 2 2 8 D M ü kt D t A l i

Chr

omC

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WS

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S 20 Abb. II.2.2.8: Der Menüpunkt: Data-Analysis

57


ie II

ph

ie II

. . V

asol

dVa

sold

mat

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pm

atog

rap

011/

12 R

.01

1/12

R.

Abb. II.2.2.9: Das Erstellen der Kalibriertabelle

Chr

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S 20

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ie II

ph

ie II

. . V

asol

dVa

sold

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.01

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R.

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S 20

Abb. II.2.2.10: Das Erstellen des Quantitativen Reports

59

II.3.1 Durchführung derII.3.1 Durchführung der HPLCHPLC--AnalyseAnalyseII Experimenteller TeilII Experimenteller TeilII.3.1 Durchführung der II.3.1 Durchführung der HPLCHPLC AnalyseAnalyse

1.) Was versteht man unter der chromatographische Durchbruchszeit tm.2.) Welche apparativen Einflüsse können zu einer deutlichen Beeinflussung der ) pp g

Durchbruchszeit führen (nennen sie 2 Beispiele)?3.) Ermitteln sie aus dem Tracer-Chromatogramm die Retentionszeit tR(X)

von Benzophenon, sowie die Durchbruchszeit tm des chromatographi-schen Systems.y

4.) Berechnen sie daraus die Wanderungsgeschwindigkeit der mobilen Phase um in [cm/min] (Länge der Säule = 150 mm).

5.) Berechnen sie das Durchbruchsvolumen Vm der mobilen Phase sowie das Retentionsvolumen VR von Benzophenon.R p

6.) Berechnen sie den Kapazitätsfaktor k für Benzophenon.7.) Berechnen sie ausgehend von den erhaltenen chromatographischen

Ergebnissen der Kalibriermessung den KF-Wert für Coffein.8.) Berechnen sie mit Hilfe des ermittelten KF-Wertes die Konzentration an

phie

II

phie

II

. . Vas

old

Vaso

ld

)Coffein [mg/ml] in den jeweils untersuchten Originallösungen (Caffee-Lösung / Red Bull / Coca-Cola).

9.) Der „Energy-Drink“ Red-Bull enthält neben Coffein auch die Substanz Taurin. Chemisch gesehen handelt es sich hierbei um 2-Amino-ethan-

mat

ogra

pm

atog

rap

011/

12 R

.01

1/12

R. g

sulfonsäure. Zeichnen sie die Strukturformel von Taurin.10.) In welchem Teil des Chromatogramms würden sie Taurin relativ zum

Coffeinpeak tendentiell erwarten (niedrigere oder höhere Retentionszeit). Begründen sie ihre Aussage.

Chr

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hrom

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20W

S 20

g g11.) Wie würden sie die Detektionsfähigkeit von Taurin im UV-Detektor einschätzen

(Begründung)? Nennen sie eine alternative Detektionsmethode für Taurin.12.) Welche Auftragung stellt ein Isoplot dar?

60

phie

II

phie

II

. . Vas

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R.

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61

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II

phie

II

. . Vas

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R.

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phie

II

phie

II

. . Vas

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R.

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Documents

Chromatographie II HPLC - · Chromatographie II 2 HPLC Praktikum I.1I.1 Einleitung Einleitung (siehe Skript Praktikum) HPLC Praktikum I3 Die stationäre Phase I.2I.2 Ziele des Praktikums