Chemical compounds in differentiation and death of stem cells Celia Conesa Montanel

Chemical compounds in differentiation and death of stem cells

Celia Conesa Montanel

Introducción

Firestone y Chen

ACS Chemical Biology, 2010, 5:15-34

Developmental Potential

Totipotent

Pluripotent

Multipotent

Unipotent

Introducción

Compuestos químicos que modifican la actividad proteica

directa (cambios fenotípicos)

reversa (cambios en proteína, y luego efecto fenotípico)

Genética Química

Firestone y Chen


Introducción

Firestone y Chen


Genética Química

•DIFERECIACIÓN CELULAR:Tipos celulares

específicos

•DESDIFERENCIACIÓN CELULAR:iPS

•TOXICIDAD SELECTIVA:Control de carcinomasSelección SC

Introducción

Tejidos: proliferación celular muerte celular

Tipos:

Muerte celular

APOPTOSIS

NECROSIS

http://www.anatomiahumana.ucv.cl/biologia

Desarrollo y MorfogénesisProcesos fisiológicosEliminación selectiva

Extrínseca

Intrínseca

Hipótesis

En colecciones complejas de compuestos químicos hay compuestos capaces de activar o inhibir:

diversas proteínas que participan en la proliferación y diferenciación de células madre

rutas apoptóticas de forma selectiva en células madre o células diferenciadas

Objetivos

Identificar compuestos químicos que induzcan diferenciación celular a cardiomiocitos a partir de células madre embrionarias de ratón

Identificar compuestos químicos que induzcan muerte celular programada durante la proliferación y diferenciación de estas células.

Línea celular: mES CGR8-AMPIGX-7 AMPIGX-7: GFP bajo el control de la cadena pesada de la miosina alfa (-MHC).

Dr. Agapios Sachinidis (Universidad de Colonia, Alemania)

Requerimientos de cultivo: Células indiferenciadas

Sin células “feeder” Medio de cultivo con LIF

Diferenciación cardiomiocitos

Medio de cultivo sin LIF Cuerpos embrioides

Gota colgante (“Hanging drop”) Suspensión

Línea celular: mES CGR8-AMPIGX-7

Diferenciación: EB Nuevo método: placas de 96 pocillos, fondo V

Células

Medio cultivo

500 células/EB

Línea celular: mES CGR8-AMPIGX-7

Diferenciación: EB Nuevo método: placas de 96 pocillos, fondo V

• Cantidad de GFP insuficiente para ser detectada en lector de placas

• Un solo ensayo de actividad por experimento

PROBLEMA

Dos nuevas líneas celulares

A partir de la línea original mES CGR8

Nuevo gen reportador: LUCIFERASA (-MHC) Metridia Gaussia

SobrenadanteActividadLuciferasa secretada

Dos nuevas líneas celulares

Amplificación DNA

purificación

Linerización del DNA

Extracción DNA Fenol-CloroformomES CGR84x107 células/ml de PBS

ELECTROPORACIÓN

medio de propagaciónplacas de 10 cm

Medio de selección: Geneticina (G-418) a 0,5 mg/ml

Selección de clones

Clones aislados: Cilindros de clonación

Lavado con PBS

Colocación del cilindro (presión)

Tripsina (20-50 l)

Placa de 96 pocillos

Placa de 24 pocillos

Placa de 6 pocillos

Frascos de 25 cm2: Placa de 6 pocillos, pellet

-80ºC

30 clones de cada

7 clones Metridia

Selección de clones

Clones que contienen: promotor de cardiomiocitos + luciferasa

PCR

Southern blot

Selección funcional (expresión de luciferasa)

Selección de clones - Expresión luciferasa

Siembra en placas 96 fondo V, en medio de diferenciación: 500 células/EB 2000 células/EB

Incubación: 8-10 días (Diferenciación)

Ensayo de luciferasa 25 l medio de cultivo + 2,5 l sustrato luciferasa

Medida de luminiscencia

DIFERENCIACIÓN CLONES METRIDIA LUCIFERASA

0

5000

10000

15000

20000

25000

M1 M2 M3 M4 M5 M6 M14 CGR8 Medio

Clones

RLU2000 células/EB500 células/EB


RLU


•Respuesta a compuestos químicos (10 M):Diferenciadores: VerapamilInhibidores: Forskolin

•500 células/EB•Compuestos tras 2 días de formación del EB

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

CGR8 M1 M5 M6 M14

RLU

Control negativo

Verapamil

Forskolin

Selección de clones - Southern blot

Sonda: Digestión cDNA de MetLuc con SmaI: Luciferasa 333 pb

Digestión DNA genómico: HindIII + NotI: promotor+luciferasa Al menos 6197 pb

MWM CGR8 M1 M5 M6 M14

Objetivos

Identificar compuestos químicos que induzcan diferenciación celular a cardiomiocitos a partir de células madre embrionarias de ratón

Identificar compuestos químicos que induzcan muerte celular programada durante la proliferación y diferenciación de estas células.

CRIBADO QUIMIOTECA-Viabilidad celular

Compuestos a 5 mM

Placa intermedia4 ó 3 compuestos/pocillo (500 M)C-: DMSOC+: Camptothecin (CPT) (500 M)

2 l/100 l medio

mES CGR8

(10,000 células/pocillo)

48h incubación4 ó 3 compuestos/pocillo (10 M)C-: DMSOC+: CPT (10 M)

Ensayo colorimétrico de viabilidad

XTT proliferation kit

Medida de la absorbancia a 450 nm

XTT (2,3-bis[2-Methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-2H-tetrazolium-5-carboxanilide)

Formazan

Quimioteca


Grupos de compuestos donde disminuyó la viabilidad, se seleccionaron para probarlos individualmente:

• mouse embryonic stem cells CGR8 (mES CGR8) (10,000 cells/well)• mouse embryonic fibroblasts (MEFs) (2,500 cells/well)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

CPT

Group 1Group 2Group 3Group 4Group 5Group 6Group 7Group 8Group 9Group 10Group 11Group 12Group 13Group 14Group 15Group 16Group 17Group 18Group 19Group 20Group 21Group 22Group 23Group 24Group 25Group 26Group 27Group 28Group 29Group 30Group 31Group 32Group 33Group 34Group 35Group 36Group 37Group 38Group 39Group 40

Grupos de 4 compuestos/pocillo

% Viabilidad

% Viabilidad


0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

CPT



% Viabilidad

0

20

40

60

80

100

120

140

CPT 26A 26B 26C 26D

Compuestos químicos

% Viabilidad

ESCsMEFs

% Viabilidad

% Viabilidad


0

20

40

60

80

100

120

140

CPT 26D 199A 223A

Compuestos Químicos

% Viabilidad

ESCsMEFs

COMPUESTOS CON ACTIVIDAD DIFERENCIAL A 10 M% Viabilidad


TINCIÓN VITAL CON AZUL TRYPAN

0

20

40

60

80

100

120

Control CPT 26D 199A 223A 23B 45B 92B 219C

Compuestos Quimicos

% ViabilidadESCs

MEFs

% Viabilidad

Estudio de la muerte celular

Bax/Bak Double Knockout MEFs (DKO-MEFs) Inhibidor de caspasas: z-VAD-fmk

DKO-MEFs,mES CGR8

o MEFs

z-VAD-fmk 100 M 30 min antes que los compuestos

Compuestos a 10 M 48 h

Ensayo de XTT

Estudio de la muerte celular

26D

0

20

40

60

80

100

120

MEFs DKO-MEFs

% Viabilidad

Sin z-VAD-fmkcon z-VAD-fmk

Estudio de muerte celular

Actividad de Caspasa-3 MEFs + 26D ESCs + 119A y 223A

Compuestos a 10 M durante 12 h

Lisis celular y ensayo colorimétrico para detectar la hidrólisis de acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilide (Ac-DEVD-pNA)

(200 M) por la Caspasa-3

mES CGR8o MEFs

Absorbancia a 405 nm a 0, 30 min, 1h, 2h y 4 h

Vía extrínsecaCaspasa-8

Vía intrínsecaCaspasa-9

Caspasa-3


Actividad de Caspasa-3 MEFs + 26D ESCs + 119A y 223A

0

0,04

0,08

0,12

0,16

0 1 2 3 4Tiempo de incubación (horas)

O.D. (405 nm)

DMSO (ESCs)CPT (ESCs)199A (ESCs)223A (ESCs)26D (MEFs)

Abs 405 nm


Inhibición de caspasas en el tiempo Incubación con los compuestos: 3, 6, 12, 24 y 48h

CPT

0

20

40

60

80

100

120

140

3 6 12 24 48

Tiempo de incubación (horas)

% Viabilidad

223A

0

20

40

60

80

100

120

140

3 6 12 24 48


% Viabilidad

CPT

0

20

40

60

80

100

120

140

160

3 6 12 24 48


% Viabilidad

26D

0

20

40

60

80

100

120

3 6 12 24 48


% Viabilidad

Sin z-VAD-fmk

Con z-VAD-fmk

ESCs MEFs

% Viabilidad

% Viabilidad

% Viabilidad

% Viabilidad


MICROSCOPÍA- Núcleos apoptóticos

mES CGR8 (150.000 células/pocillo)MEFs (25.000 células/pocillo)

Compuestos a 10 M durante 24 h

Hoechst 33342 (1 g/ml) durante15 min

Microscopio de fluorescencia

ESCs MEFs

DMSO

26D

223A

Ensayos de dosis-respueta

Concentraciones: 0,1-100 M (Ensayo XTT)

ESCs

020406080

100120140160180

0,1 1 10 100

Concentration ( )M

% Viability

CPT

26D199A223A

MEFs

0

20

40

60

80

100

120

140

0,1 1 10 100

Concentration (mM)

% Viability

CPT26D199A223A

LD50 ~ 7 M

LD50 ~ 40 M

LD50 ~ 8 MLD50 ~ 20 MLD50 ~ 25 M

% Viabilidad

% Viabilidad

Ensayos de dosis-respuetaA Benzethonium chloride

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Concentration ( ) M

% Viability

iPS cellsMXDJ

-1HFF

B

0

20

40

60

80

100

120

140

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Concentration ( ) M

% Viability

iPS cellsMXDJ

-1HFF

223A

26D

Doss M.X., Antzelevitch C., (Nueva York, USA)

iPS cells and human fibroblasts

% Viability

% Viability

CONCLUSIONES

CRIBADO QUIMIOTECA

Se han identificado compuestos que inducen apoptosis selectivamente en SCs Uso: Eliminar células indiferenciadas y prevenir la

formación de teratomas

Se ha identificado un compuesto que induce apoptosis selectivamente en MEFs Uso: Aislamiento de células madre en tejidos

Estos compuestos pueden usarse como herramienta para estudiar diferencias en las rutas apoptóticas entre SCs y somáticas

Ensayos en ratones

Grupos experimentales:

1: Control (sin tratar)

2: Tratamiento pre-inducción

3: Tratamiento post-inducción

Ratones (Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu/un (Harlan))CGR8: 500.000 células

Compuesto 223A

Proliferación celular

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

CPT



% Viabilidad% Viabilidad

Proliferación celular

BrdU ELISA

XTT

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control DMSO

CPTP4F2P4A3P4E3P4D5P4D6P4H8P5B2P5C2P5B3P5B5P5C5P5A6P5B6P5C6P5E7P5F8P5FG8


% Viabilidad

ESCsMEFs

BrdU ELISA

0

50

100

150

200

250

Control DMSO

CPTP4F2P4A3P4E3P4D5P4D6P4H8P5B2P5C2P5B3P5B5P5C5P5A6P5B6P5C6P5E7P5F8P5FG8

Background

Blank


% Viabilidad

ESCs

MEFs

% Viabilidad

% Viabilidad

XTT

Planes para el futuro

Cribado de otras quimiotecas Proliferación celular (muerte y metabolismo)

Diferenciación celular

Mecanismos de acción

Células madre humanas: hESC (ES4) hiPS ([K]iPS4F-1)

Agradecimientos

José Alberto Carrodeguas

Javier Sancho

Verónica Tomey

Michael Xavier DossCharles Antzelevitch

Agapios Sachinidis

Stem Cell Center, Masonic Medical Research LaboratoryUtica, New York, USA

Colaboradores externos:

University of Cologne, Center of Physiology and Pathophysiology, Institute of NeurophysiologyCologne. Alemania

¡Muchas gracias!

Documents

Chemical compounds in differentiation and death of stem cells Celia Conesa Montanel