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Tí tulo (breve, sintetizar l os principales objetivos y los principales resultados):an á lisis de “ funny current ”

Introducci ón (una ca ra. Debe incluir nalidad (un p á rrafo), justicaci ó n,antecedentes, buscarlo que s e s abe e n la b ibliograf í a q ue ya hay, los grupos queest é n trabajando en eso, de m anera g eneral decir c ó mo vam os a trabajar y decir queespecies vamos a utilizar y justicarlo):

http://www.cvphysiology.com/Arrhythmias/A004.htm

Las car diomiopat í as s on actualmente u na d e las pr incipales causas d e m uerte e n los p a í sesdesarrollados. Concretamente e n Espa ña murieron 387.911 personas de las cuales, el 9%fueron debidas a enfermedades isqu émicas d el coraz ón, seg ún e l INE.

Las células de tro del odo si oauricular !"A# co stituye el marcapasosprimario del cora$ó . %stas células se caracteri$a por te er i gú verdaderopote cial de reposo& pero e cam'io ge era pote ciales de acció espo t( eos.

Los pote ciales de acció del odo "A est( divididos e ) *ases. La *ase 4 es ladespolari$ació espo t( ea !pote cial del marcapasos# +ue dese cade a elpote cial de acció u a ve$ el pote cial de mem'ra a alca $a el um'ral e tre ,4y ,)0m-#. ase 0 es la *ase de despolari$ació del pote cial de acció . a ve$+ue la célula est( completame te repolari$ada a apro imadame te ,10 m-& elciclo se repite de *orma espo t( ea.

Los cam'ios e el pote cial de mem'ra a dura te las

di*ere tes *ases so provocados por los cam'ios e elmovimie to de io es !pri cipalme te 2a 33 y 3& y eme or medida 5a 3# a través de la mem'ra a a travésde los ca ales ió icos +ue se a're y cierra a di*ere testiempos dura te el pote cial de acció .

Al 6 al de la repolari$ació & cua do el pote cial demem'ra a es muy egativo !apro imadame te ,10 m-#&ca ales io icos a'iertos +ue co duce le to& i teriori$a !despolari$ació #corrie tes de io es de 5a3. %stas corrie tes so llamadas 7*u y curre ts8 ya'reviarse como 88. %stas corrie tes despolari$a tes causa +ue el pote cial de

mem'ra a empiece a despolari$arse espo t( eame te& i icia do de este modola ase 4.

http://physrev.physiology.org/co te t/99/)/ ;

A. f-Channels

Almost all spontaneously active cells coming from heart rhythmogenic centers express f-channels ( 21 ). DiFrancesco

and co-workers ( 20 , 120 , 121 ) have proposed that I f is the predominant ionic mechanism underlying cardiac

automaticity. A! pacemaker cells ro"ustly express I f (125 , 313 ). #n the ra""it, I f density is higher in the A!

periphery than in the center (355

). I f can "e recorded also in the myocardium, where it can "e activated "elow the physiological resting potential (535 ). #t has "een shown that disease states such as atrial fi"rillation and heart failure

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enhance I f expression and shift positively the current voltage dependence (see $ef. 79 for review). I f is a mixed cationic

current carried "y !a % and & % (2 ). 'ermea"ility to !a % is predominant, "ut & %activates I f conductance ( 115 , 122 , 125 ).

a % permea"ility of f-channels has "een reported in *+& cells expressing recom"inant * ! channels ( 538 ) and in

rat ventricular cells ( 537 ). #n the A! and A !, I f activates upon mem"rane hyperpolari ation with varia"le threshold

"etween /0 and 1/ m ( 21 ). 2he threshold of I f is su"stantially more negative in 'urkin3e fi"ers ( 118 ).

everal factors can influence the activation of f-channels. β -Adrenergic receptor activation stimulates ( 21 ) while

muscarinic agonists inhi"it I f (129 ). 2his regulation is mediated "y direct activation of f-channels "y cA4' ( 50 , 128 ),

which facilitates channel opening ( 126 ). DiFrancesco and 2ortora ( 128 ) failed to o"serve a direct regulation of A! f-

channels "y purified protein kinase A ('&A) ( 128 ). #n A! cells, direct regulation of voltage dependence "y cA4'

can 5uantitatively account for I f regulation "y autonomic agonists ( 126 ). 2he existence of a '&A-mediated regulation

of I f has "een suggested "y hang et al. ( 80 ) in canine 'urkin3e cells and in murine stem cells derived from

cardiomyocytes ( 1 ). #ntracellular a % have "een reported to positively regulate I f "y either increasing current

conductance ( 171 ) or "y positively shifting the current voltage dependence ( 416 ). 2he mechanisms "y which

a % regulate I f has not "een elucidated. #nside-out patch-clamp experiments seem to exclude a direct a % effect on f-

channels ( 540 ).

Four gene isoforms, named * !678, code for f-channels and have "een cloned from the mouse ( 295 , 435 ), ra""it

(217 ), and human ( 296 , 444 ). 2hese isoforms display different activation threshold, kinetics, and sensitivity to cA4'

(234 ). 'articularly, * !6 channels show the more positive threshold for activation, the fastest activation kinetics, and

the lowest sensitivity to cA4' ( 295 , 435 ), while * !8 channels are slowly gating and strongly sensitive to cA4'

(217 , 296 ,444 ). * ! -mediated channels have intermediate properties "etween * !6- and * !8-mediated channels

(234 ). #t has "een proposed that the transmem"rane protein & !+ stimulates the surface expression and accelerates

the kinetics of * ! channels in heterologous expression system ( 536 ) and in cardiomyocytes ( 404 ). #t has also "een

proposed that & !+ can switch * ! -mediated currents from time dependent to time independent ( 302 ).

* !8 is the predominant f-channel isoform expressed in the A! ( 317 , 342 , 450 ) and A ! ( 317 ). 2he * !6 and

* ! isoforms are also expressed in these rhythmogenic centers ( 317 , 342 , 344 ,450 ).

*owever, the molecular composition of native cardiac f-channels has not "een elucidated. 2he strong expression of

* !8 m$!A in the A! and A ! and the high sensitivity of native f-channels to cA4' ( 126 ) suggest that * !8 is

a ma3or determinant of native I f . $emarka"ly, native I f has faster activation kinetics than I f mediated "y * !6-* !8

heterotetramers. uch a difference cannot "e accounted for the presence of "asal cA4' or & !+ in intact A! cells

(7 ). $ecent studies have descri"ed a 9context-dependent: regulation of native f -channels. ;u et al. ( 403 )

overexpressed * ! channels in neonatal and adult ventricular myocytes and showed that I f voltage dependence was

dependent on the developmental state of the cells. Furthermore, transfection of * ! and * !8 channels in *+&

cells and neonatal ventricular myocytes yields I f currents that activated more positively in cardiomyocytes than in *+&

cells, irrespectively of the transfected isoform ( 402 ). 2hese o"servations indicate that cellular factors other than cA4'

and & !+ contri"ute to the native A! I f kinetics and voltage dependence. <ar"uti et al. ( 19 ) have reported that in

ra""it A! cells, * !8 channels interact with caveolin-= and are concentrated in caveolar mem"rane lipid rafts.

hemical disorgani ation of caveolar structures positively shifted the I f activation curve and slowed the current

deactivation kinetics (19

). #n a follow-up study, the same group showed that > -receptors colocali e with f-channels incavelolar structures and that > -dependent regulation of I f also re5uires caveolar mem"rane compartimentali ation

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(20 ). #t thus seems very likely that cA4'-dependent regulation of f-channels takes place locally, in a su"cellular space

delimited "y lipid rafts. 'ian et al. ( 392 ) have reported that phosphatidylinositol 8,/-"isphosphate ('#' ) prevents

rundown of "oth recom"inant * ! -mediated and native ra""it A! I f . #t is thus possi"le that a multiplicity of

factors other than cA4' can participate in the regulation of I f in the A!. $egulation of * ! channels "y stretch

has "een reported "y ?i et al. ( 287 ). 2hese authors have studied * ! -mediated I f expressed in Xenopus oocytes. #n

this preparation, stretch accelerated "oth activation and deactivation kinetics of I f (287 ).

Art ículo de "ergio:

% el 5" se e presa *u dame talme te <25 !90=#& au +ue se ha descritotam'ié pe+ueños grados de <25; y <25>. La e presió de estas dos últimasiso*ormas parece depe der de la especie. % co creto& e el 5" de co e?o& +uees la especie me?or estudiada& los ca ales * apare teme te esta co stituidospero heteromultudímeros de <254 y <25;& co predomi io del compo e te<254.%l 5" es u a estructura co u a elevada especiali$ació a atomo*u cio al +uee?erce de *orma e6cie te la *u ció de marcapasos del resto del cora$ó . "uscélulas se caracteri$a por poseer actividad autom(tica& +ue est( determi adpor la corrie te ió ica @*. %sta corrie te es modulada de *orma activa por elsistema ervioso autó omo& lo +ue permite ma te er u ritmo cardiacoco trolado y co sta te. %l co ocimie to de esta corrie te y sus determi a tesmoleculares es recie te y& e muchos aspectos& todavía limitado. %l estudio delas características de la corrie te @* os permitir( u me?or co ocimie to de la6siología del cora$ó y de su papel e múltiples situacio es patológicas.

Finalidad del proyecto:

odríamos e te der dos pu tos ese ciales e cua to a la 6 alidad de esteproyecto a largo pla$o. or u parte& la o'te ció de la proteí a puri6cada seríau paso previo y ese cial para poder someter dicha proteí a a u a i vestigacióco la +ue ampliar el a'a ico de susta cias +ue ya hoy día se co oce +uei teractúa otoriame te co esta proteí a. %sto puede co ducir a variasaplicacio es clí icas pote cialme te útiles y puede ser valioso e co dicio esterapéuticame te releva tes. !e?emplosBB#. %l segu do pu to clave a te er ecue ta es u estudio detallado +ue corro'ore la implicació & cua titativame teha'la do& de la proteí a sometida a estudio e procesos patológicos del cora$ó!arritmias&etcBBB#.

Antecedentes ci ent í cos:

ACD@2 LE" @F ECDA5D%" A AGAH@C

http://www. c'i. lm. ih.gov/pu'med/>I;4II;9

http://www. c'i. lm. ih.gov/pu'med/>I;4II;Jhttp://www. c'i. lm. ih.gov/pu'med/>I 91;41

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http://www. c'i. lm. ih.gov/pu'med/>I ;;101

http://www. c'i. lm. ih.gov/pu'med/>I ));>>

http://www. c'i. lm. ih.gov/pu'med/>49>IJ4>

Objetivos (media cara. Hipotesis de partida y objetivos concretos aalcanzar para contrastar la hipótesis).

artimos de la 'ase de +ue co ocemos el papel clave +ue desempeña la *amiliade ca ales,* e los miocitos cardiacos para +ue se produ$ca de ma era e*ectivala co tracció del cora$ó . He este modo& se ha o'te ido evide cias de +ue umal *u cio amie to& ause cia o 'lo+ueo de estos ca ales co lleva serias

cardiomiopatías. % 'ase a estas hipótesis de partida podríamos pla tear udo'le o'?etivo. %l o'?etivo pri cipal es co seguir u e tracto puro de uestraproteí a y por otra parte reali$ar u a cua ti6cació e orde de comparar laca tidad de esta misma proteí a e dos cora$o es disti tos& u o de u i dividuosa o y otro co algu a patología cardiaca.

Especie q ue se usa: (mejor usar conejo) Utilizaremos e l coraz ón de co nejo. Debido a su

f( cil manipulaci ón este animal es i d óneo para la extracci ón de las m uestras. Ademas , dadalos a ntecedentes c ient í cos, sabemos q ue el coraz ón y co ncretamente las p rote í nas d e lascé lulas del marcapasos ca rdiaco han sido ampliamente estudiadas e n esta especie, de lacual se ha descrito hasta 4 isoformas d e la prote í na a estudio (K?)

METODOLOGIA

Preparaci ón d e las m uestras

El proceso e st ( conforme a las r eglas d el uso y cu idado de animales d e l aboratorio de laComunidad Europea.

1. Eutanasia del animal . Seg ún el art í culo de 7La Eutanasia e n los A nimales d eLaboratorio del centro d e Investigaci ón del Hospital General Universitario de

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Valencia (1), para una muerte sin dolor y la extracci ón del coraz ón se a consejaCaptive bolt, Electrocuci ón o Exanguinaci ón del cerdo. En nuestro caso, noutilizaremos l a Electrocuci ón por los p osibles e fectos q ue puede tener en las c é lulasy co nservar las condiciones n ormales d el potencial de membrana d e las c é lulas.

2. Extracci ón del órgano: haciendo uso d e u n b istur í quir úrgico realizamos una incisi ónen la cavidad tor ( cica dejando al descubierto el coraz ón para extraerlo einmediatamente ponerlo en hielo. Conservar siempre a 4 MC.

). Extracci ón del N ódulo sinusal

4. http://www.oc.lm.ehu.es/fundamentos/doctorado/cursos/cirexp/019.pdf

I. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25862830

1.

FACN %O

% ri+uecer mem'ra a plasm(tica

usar disti tos deterge tes para ver co cual se puri6ca me?or. "e comprue'aco u i hi'idor marcado radictivame te.