FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS, FÍSICAS, MATEMÁTICAS, FARMACIA E

INFORMATICA

C.P FARMACIA Y BIOQUÍMICA

CURSO: Laboratorio de Biotecnología

ALUMNOS:

- BARRIENTOS VALENZUELA JUAN BERNARDO- HUAMAN TITO JACKELINE ZUMIKO

UNIVERSIDADUNIVERSIDAD NACIONAL DE SANNACIONAL DE SAN

ANTONIO ABAD DELANTONIO ABAD DEL CUSCOCUSCO

OBTENCIÓN DE PROTEÍNA UNICELULAR

- LAUREL ARIAS JULIO CESAR- RIOS ZÚÑIGA ALMA ZURI

SEMESTRE: 2013-I

CUSCO – PERÚ

2013

OBTENCIÓN DE PROTEINA UNICELULAROBJETIVO:

Obtener biomasa microbiana para ser usado como fuente de proteína.

FUNDAMENTO:

Saccharomyces cerevisiae tiene un alto contenido de proteína y al ser cultivada bajo un sistema Batch multietapa en mosto de trigo, en condiciones aerobias, se obtiene un incremento de biomasa que es recuperada y secada para ser utilizada como fuente de proteína.

El término proteína unicelular (PUC) se emplea para referirse a microorganismos tales como bacterias, levaduras, algas y hongos filamentosos, que son empleados para alimentación humana o animal, principalmente por su alto contenido en proteínas. El hombre ha consumido microorganismos presentes en alimentos fermentados desde hace siglos y más recientemente empleo para consumo animal microorganismos derivados de la producción de cerveza y de bebidas alcohólicas.

Pero el alto costo de su producción sólo es competitivo en ciertas circunstancias con respecto de las proteínas de origen vegetal. Los microorganismos crecen rápidamente, lo cual es una de las razones más importantes para su interés en su producción industrial.

Bacterias de los géneros Methilomonas, Pseudomonas, Bacillus y Aerobacter tuvieron en los 60 gran interés debido a su alta velocidad de duplicación y alto contenido proteico pero el incremento del costo de los sustratos (metano, metanol, hidrocarburos...) han limitado su aplicación.

Sin embargo ciertas especies de levaduras, como Candida utilis, Saccharomyces cerevisiae y Kluyveromycees fragilis (k.marxianus) han sido aceptadas para

alimentación humana y producidas continuamente desde la Segunda Guerra Mundial.

Los hongos filamentosos y las algas tienen la desventaja de crecer más lentamente. En la actualidad se producen comercialmente los hongos Gliocladium deliquescens, Paecilomyces varioti y Fusarium graminearum y las algas SpirulinaChlorella. En el caso de las algas su producción es similar a la de la agricultura convencional.

VENTAJAS:

Rápido crecimiento. No hay competencia por el terreno de cultivo. No está sujeto al cultivo microbiano ni a condiciones ambientales, se puede

controlar la temperatura y oxígeno.

DESVENTAJAS: El consumo excesivo de proteínas produce la gota.

MATERIALES:

Agente Biológico: Cepa comercial de Saccharomyces cerevisiae Solución nutritiva: Mosto de Trigo. Incubadora: 26± 1°C Centrífuga 3000 rpm Balanza analítica Refractómetro manual Horno Pasteur Material de vidrio

PROCEDIMIENTO:

CULTIVO BATCH MULTIETAPA.

1) Inocular 0.1 g de Saccharomyces cerevisiae a 10 ml de mosto, luego trasvasar a 50 ml y finalmente trasvasar a 100 ml de mosto.

2) Vaciar a 6 tubos y luego centrifugar a 3000 rpm x 10 min.

72h

3) Se pesa la placa, y luego se pesa la placa más la biomasa húmeda.

4) Llevar al horno 50 °C x 24 h 5) Llevar al horno 60 °C x 48 h.6) Llevar al horno 70 °C x 72 h.

7) Pesar la placa con la biomasa seca.8) Con los pesos hallar el porcentaje de

biomasa húmeda y el rendimiento.

CÁLCULOS

Datos:

Inoculo: 0.1 gr

Base de la Placa: 42.1 grTapa de la Placa: 44.28 grBase + Biomasa húmeda: 43.09 grTapa + Biomasa húmeda: 44.54 gr

Base + Biomasa seca: 42.37 grTapa + Biomasa seca: 44.43Tubo de ensayo: 4.52 grTubo + Biomasa: 5.17 gr% Azúcar inicial: 25.5% Azúcar final: 20.5

Masa seca Celular:

43.09 - 42.1 = 0.99 42.37 - 42.1 = 0.27 X = 0.27*100/0.99 X = 27.27%

44.54 - 44.28 = 0.26 44.43 - 44.28 = 0.15 X = 0.15*100/0.26 X = 57.69%

m.s.c = 42.48 %

Biomasa Obtenida húmeda:

Tubo + Biomasa: 5.17*6 = 31.02 Tubo: 4.52*6 = 27.12 Diferencia: 3.9

X = 3.9 * 42.48/100 X = 1.65 gr de Biomasa húmeda

Rendimiento del Proceso

Y = (Biomasa Húmeda - Cantidad de inoculo) / (Azúcar inicial - Azúcar final)

Y = (1.65 - 0.1) / (25.5 - 20.5)

Y = 31 %

CUESTIONARIO

1) Metabolismo de Compuestos Nitrogenados

Procedencia:

- De proteínas de la dieta que se absorven y dan aminoácidos.- De proteínas funcionales de la célula que se recambian.

Muchos aminoácidos se reutilizan para sintetizar proteínas. También pueden degradarse para obtener energía en los siguientes casos:

- Cuando se ingieren muchas proteínas.- Cuando hay déficit de glucosa y hace falta energía.

Degradación. Hay 2 etapas:

- Desaminación, el grupo amino aparece en forma de NH4+y queda el esqueleto carbonado.- Eliminación del grupo amino.

El NH4+ es muy tóxico y los vertebrados terrestres lo eliminan transformándolo en urea que se excreta. El esqueleto carbonado se transforma en 7 productos dependiendo del aminoácido. Acetil-CoA, acetoacetatil-CoA, piruvato e intermediarios del C.A.C. (OAA, OG, succinil-CoA y fumarato). Si hace falta energía se degradan en el C.A.C..

Si se ingieren muchas proteínas los esqueletos se almacenan en forma de ácidos grasos (grasas) o en forma de glucosa (glucógeno). Depende del destino del destino del esqueleto:

- Aminoácido cetogénicos: acetil-CoA, acetoacetato. Como no poseemos el ciclo del glioxilato no pueden producir glucosa.- Aminoácido glucogénicos: piruvato e intermediarios del C.A.C.. dan lugar a glucosa.

Degradación de aminoácidos: Se pierde el grupo amino. Actúa enzima glutamato transaminasa que quita el grupo amino y lo transfiere a un oxoácido. Casi todos los aminoácidos tienen el mismo oxoácido, el OG que pasa a glutámico y el aminoácido forma un oxoácido. Tiene la ventaja de que todos los aminos están en el glutámico, se canalizan hacia la misma molécula. Algunos aminoácidos lo ceden a la alanina, que es el oxoácido del piruvato. Las transaminasas tienen como grupo prostético el fosfato de piridoxal (derivado de la vitamina B6) que sirve para transportar aminos. La Asp cede el amino al enzima que lo transporta en el piridoxal y luego lo cede al glutámico. Éste sufre una desaminación oxidativa. El NH4+ puede usarse para sintetizar aminoácidos haciendo la reacción al revés por el mismo enzima que ahora depende de NADPH. Enzima regulado alostéricamente. La reacción de desaminación ocurre en todas las células.

Eliminación del NH4+: Si se absorbe el amonio en la sangre el OG se convierte en glutámico y no habrán intermediarios del C.A.C. La transformación en algo inocuo ocurre en el hígado. Para transportar los NH4+ hasta allí se adhieren a la cadena lateral de la glutamina (es como el glutámico pero en lugar del grupo carboxilo tiene un amino) Al llegar al hígado se hidroliza y suelta el grupo amino. Otra posibilidad de transporte hasta el hígado del NH4+ es que se recoja en forma

de alanina, preferentemente en las células musculares: Músculo si el músculo trabaja hay glicolisis de la glucosa.

Ciclo de la urea: Descubierto por Krebs y Henseleit. Para eliminar el amonio se convierte en urea. Ocurre preferentemente en el hígado y se ven implicados enzimas mitocondriales y del citosol. Urea: C = OEl CO2 procede de la atmósfera. Los NH2 vienen uno del amonio y otro del aspártico. Esta ruta requiere mucho ATP. En el citosol la arginina se hidroliza liberando urea y ornitina (aminoácido no proteico) por medio del enzima arginasa. A partir de la ornitina se sintetiza arginina, La ornitina entra en la mitocondria y recibe el primer amino del glutámico por medio de la glutamato deshidrogenasa. En cuanto se forma el NH4+ reacciona con CO2 (en forma de HCO3-, del C.A.C). Necesita 2 ATP, uno para la energía y otro para el fosfato.

2) Cultivo Batch Multietapa

Otro modo de operar un biorreactor es empleando la técnica de batch alimentado (BA) o fed batch. Esta técnica se define como un cultivo en batch donde se alimenta continuamente medio nutritivo fresco o alguno de sus componentes. Si el nutriente que se alimenta es el limitante del crecimiento, esta técnica permite controlar la velocidad de crecimiento () del microorganismo. El BA es particularmente útil en procesos en los que el crecimiento celular y/o la formación de producto son sensibles a la concentración del sustrato limitante, es decir cuando el rendimiento celular o la poductividad de la biomasa o del metabolito buscado se ven afectados. Así, este método se emplea cuando se quieren evitar

fenómenos de inhibición por sustrato y se requiere alcanzar una alta concentración de biomasa.

ESQUEMA

Donde : F(t): caudal de alimentación

Sr(t):concentración de sustrato de la alimentaciónVf: volumen final de trabajoVo: volumen al inicio de la alimentaciónXo: concentración de biomasa al inicio de la alimentaciónSo: concentración de sustrato limitante al inicio de la alimentación

El cultivo BA se inicia a partir de un cultivo en Batch, por lo que Vo, Xo y So son las condiciones finales de dicho Batch. Es posible elegir distintas condiciones de alimentación, ya sea mediante el empleo de caudales variables (F = F(t)), o bien mediante la variación de la concentración de sustrato limitante (S r=Sr(t)). En el caso del Trabajo Práctico se utilizará el sistema más simple, es decir F=cte y Sr=cte.

Produccion de Biomasa: Ecuaciones y Diseño

El cultivo puede describirse matemáticamente. La resolución de las ecuaciones así obtenidas permitirá calcular la evolución de la biomasa durante el cultivo, la velocidad específica de crecimiento, y la productividad. Asimismo se podrán

determinar parámetros de diseño, tales como F y S r Para estudiar la evolución de X durante el cultivo se deben plantear las ecuaciones de balance de materia.

SUSTRATO

Acumulación = suministro - consumo

(1)

En este caso el volumen no es constante, como ocurre en cultivos en Batch o en continuo. Por lo tanto la expresión (1) quedará:

(2)

de aquí, y recordando que rx = µ . X

(3) F . SR =

r x VY x/s

esta ecuación indica que la velocidad de producción de biomasa se acomoda a la velocidad de suministro de sustrato, es decir que rx puede controlarse “externamente”, modificando F y/o Sr. La ecuación (3) es en realidad un límite superior ya que dados µ, X y V, cualquier par de valores F, S r que satisfagan la condición

(4) F . SR

harán que la velocidad de crecimiento esté limitada por la velocidad de alimentación. Esta ecuación (3) será muy útil en el momento de diseñar la alimentación.

BIOMASA: La velocidad de acumulación de biomasa será:

F . SR =

1Y x/s

d ( x V )d t

que indica que la velocidad de acumulación de biomasa depende de la velocidad de alimentación de sustrato. Integrando, se llega a

X V = xo Vo + Yx/s F SR t

Uno de los objetivos planteados es conocer cómo varía la concentración de biomasa con el tiempo. En cultivo en batch, al ser V = cte, X.V es proporcional a X. En BA V no es constante, sino que varía con el tiempo (F = dV/dt). Integrando se tiene

V = Vo + F t reemplazando en (8) y despejando X, se tendrá

X =

expresión que describe la variación de X con t a lo largo del cultivo alimentado. Puede darse el caso en que el aumento de V sea tal que haya un efecto de dilución que provoque la disminución de la concentración de biomasa. Así, puede ocurrir que la concentración final alcanzada sea menor que la inicial, pero no así la cantidad total X.V. Puede representarse un cultivo en Batch alimentado operando en las condiciones halladas.

Al obtener valores de Sr y F, se ha DISEÑADO una alimentación para el cultivo en batch alimentado. El caso descrito hasta aquí tiene en cuenta que tanto F como S r

sean constantes. Es claro que en caso de ser F = F(t) y/o S r = Sr(t), dicha

funcionalidad habrá de ser tenida en cuenta para resolver las ecuaciones planteadas.

3) Análisis Gravimétrico

En química analítica, el análisis gravimétrico o gravimetría consiste en determinar la cantidad proporcionada de un elemento, radical o compuesto presente en una muestra, eliminando todas las sustancias que interfieren y convirtiendo el constituyente o componente deseado en un compuesto de composición definida, que sea susceptible de pesarse. La gravimetría es un método analítico cuantitativo, es decir, que determina la cantidad de sustancia, midiendo el peso de la misma con una balanza analítica y por último sin llevar a cabo el análisis por volatización. Los cálculos se realizan con base en los pesos atómicos y moleculares, y se fundamentan en una constancia en la composición de sustancias puras y en las relaciones ponderales (estequiometría) de las reacciones químicas.

Método por precipitación: Técnica analítica clásica que se basa en la precipitación de un compuesto de composición química conocida tal que su peso permita calcular mediante relaciones, generalmente estequiométricas, la cantidad original de analito en una muestra.En este tipo de análisis suele prepararse una solución que contiene al analito ya que éste está en solución madre, a la que posteriormente se agrega un agente precipitante, que es un compuesto que reacciona con el analito en la solución para formar un compuesto de muy baja solubilidad. Posteriormente se realiza la separación del precipitado de la solución madre empleando técnicas En este método el analito es convertido en un precipitado poco soluble, luego se filtra, se purifica, es convertido en un producto de composición química conocida y se pesa. Para que este método pueda aplicarse se requiere que el analito cumpla ciertas propiedades:

Baja solubilidad Alta pureza al precipitar Alta filtrabilidad Composición química definida al precipitar

Método por volatilización: En este método se miden los componentes de la muestra que son o pueden ser volátiles. El método será directo si evaporamos el analito y lo hacemos pasar a través de una sustancia absorbente que ha sido

previamente pesada así la ganancia de peso corresponderá al analito buscado; el método será indirecto si volatilizamos el analito y pesamos el residuo posterior a la volatilización así pues la pérdida de peso sufrida corresponde al analito que ha sido volatilizado. El método por volatilización solamente puede utilizarse si el analito es la única sustancia volátil o si el absorbente es selectivo para el analito.

Método por electrodeposición: Este método se basa en la deposición sobre un electrodo de un compuesto de relación conocida con el analito que se requiere cuantificar. La cuantificación se realiza mediante la diferencia de peso que se produce en los electrodos antes y después de realizar una reacción redox en la solución problema, que se moldea ocasionando la precipitación del analito o de un compuesto formado por el mismo.

4) Tabla de Proteínas

Valores por cada 100 gr de alimento. Proteína Unicelular obtenida 390 /100 gr.

RESULTADOS:

Con la Saccharomyces cerevisiae se obtuvo un rendimiento del 31 %.Se obtuvo una biomasa húmeda de 1.65 g.

CONCLUSIONES:Los resultados generados en este trabajo muestran que con la Saccharomyces cerevisiae se obtiene un buen rendimiento del producto.

BIBLIOGRAFÍA:

1.  García G., Quintero R. y López M.: “Biotecnología Alimentaria”, Limusa Noriega Editores. Primera Edición, 1993. 

2.  Chinappi I. y Sánchez J.: “Producción de biomasa de Kluyveromyces fragilis en suero de leche desproteinizado”. Acta Científica Venezolana, Vol 51, (2000), 223-230. 

3.  Quintero H., Rodríguez M., Páez G., Mármol Z. y Rincón M.: “Producción de Proteína Unicelular”. Revista Científica, FCV- LUZ Vol. 9, Nº 2, (2001) 87-94. 

4.  Badui D.: “Química de los alimentos”. Longman de México Editores, S.A. de C. V, 1999.