AZÚCAR. Métodos de análisis microbiológico en el azúcar refinada

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NORMA TÉCNICA NTP 207.028-2PERUANA 2005

Comisión de Reglamentos Técnicos y Comerciales-INDECOPICalle de La Prosa 138, San Borja (Lima 41) Apartado 145 Lima, Perú

AZÚCAR. Métodos de análisis microbiológico en elazúcar refinada

SUGAR: Methods of assay microbiologycal in refined sugar

2005-08-045ª Edición

R.0065-2005/INDECOPI-CRT.Publicada el 2005-09-03 Precio basado en 17 páginasI.C.S.: 67.180.10 ESTA NORMA ES RECOMENDABLEDescriptores: Azúcar, método microbiológico, azúcar refinada

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ÍNDICE

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ÍNDICE i

PREFACIO ii

1. OBJETO 1

2. REFERENCIAS NORMATIVAS 1

3. CAMPO DE APLICACIÓN 2

4. DEFINICIONES 2

5. REQUISITOS 4

6. HIGIENE 5

7. PRINCIPIOS 5

8. DILUYENTES, MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS 6

9. APARATOS 11

10. MUESTRAS 12

11. PROCEDIMIENTO 13

12. EXPRESIÓN DE RESULTADOS 14

13. ANTECEDENTES 15

ANEXO A 17

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PREFACIO

A. RESEÑA HISTÓRICA

A.1 La presente Norma Técnica Peruana ha sido elaborada por el ComitéTécnico de Normalización de Azúcar y sus derivados, mediante el sistema 2 u ordinario,durante los meses de julio del 2001 a febrero del 2005, utilizando como antecedentes alos que se mencionan en el capítulo correspondiente.

A.2 El Comité Técnico de Normalización de Azúcar y sus derivados,presentó a la Comisión de Reglamentos Técnicos y Comerciales – CRT, con fecha2005-04-08, el PNTP 207.028-2:2005 para su revisión y aprobación, siendo sometido ala etapa de Discusión Pública el 2005-06-03. No habiéndose presentado observacionesfue oficializada como Norma Técnica Peruana NTP 207.028-2:2005 AZÚCAR.Métodos de análisis microbiológicos en el azúcar refinada, 5ª Edición, el 03 desetiembre del 2005.

A.3 Esta Norma Técnica Peruana reemplaza a la NTP 207.028:1987. Lapresente Norma Técnica Peruana ha sido estructurada de acuerdo a las Guías PeruanasGP 001:1995 y GP 002:1995.

B. INSTITUCIONES QUE PARTICIPARON EN LA ELABORACIÓNDE LA NORMA TÉCNICA PERUANA

Secretaría Colegio de Ingenieros del Perú - FilialLa Libertad

Presidente Roberto Acosta Jarama - EmpresaAgroindustrial Laredo S.A.A.

Secretario Noé Costilla Sánchez- Colegio deIngenieros del Perú - Filial La Libertad

ENTIDAD REPRESENTANTE

Colegio de Ingenieros del Perú - Adela Rodríguez ParedesFilial La Libertad

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Agroindustrial Paramonga S.A. Marino Rodríguez Valverde

Empresa Agroindustrial Casa Grande S.A. Juan Pichén Saavedra

Complejo Agroindustrial Cartavio S.A Jaime Cabellos Vargas

Cía. Peruana del Azúcar San Jacinto Virgilio Rosell Dioses

Empresa Agroindustrial Tumán S.A. Oscar Samamé Nevado

Empresa Agroindustrial Pucalá S.A. Lorenzo Melgarejo Casimiro

Empresa Azucarera Andahuasi S.A Dante Barzola Cámara

Ministerio de Agricultura Dacio Muñoz Alva

INDECOPI José Alvarez Castañeda

Embotelladora Latinoamericana S.A. Víctor Quispe Carranza

Industrial Cartavio S.A. Fredy Chávez Cruzado

Universidad Nacional del Santa Gilbert Rodríguez Páucar

CERPER S.A. José Valdivia Ilizarbe

SAT - SAC Diana Quispe Ramírez

Universidad Nacional de Trujillo Carlos Vásquez Blas

Instituto del Azúcar del Perú Ketty Vásquez Santiago

Ministerio de Agricultura SENASA Ulises García Armas

Facultad de Ciencias Agrarias Luis Marquez VillacortaUniversidad Particular Antenor Orrego

SGS del Perú Ricardo Saavedra Zapata

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NORMA TECNICA NTP 207.028-2PERUANA 1 de 17

AZÚCAR. Métodos de análisis microbiológico en el azúcarrefinada

1. OBJETO

Esta Norma Técnica Peruana establece los métodos de análisis microbiológico, por elmétodo de vertido en placas (oficial), para determinar los siguientes microorganismos en elazúcar refinada:

- Microorganismos aerobios mesófilos viables

- Mohos y levaduras

- Enterobacteriáceas:

- Coliformes totales

- E. Coli

- Salmonella sp.

- Esporas termófilas

- Totales

- Flat Sour

- Anaeróbicas no productoras de H2S

- Anaeróbicas productoras de H2S

2. REFERENCIAS NORMATIVAS

No hay normas especificas, ni disposiciones, que sean citadas como referencia en el presentetexto que constituyan requisitos de esta Norma Técnica Peruana.

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3. CAMPO DE APLICACIÓN

Esta Norma Técnica Peruana se aplica a la determinación de bacterias aerobias mesófilasviables, levaduras, mohos, enterobacteriáceas (coliformes totales, E. Coli y Salmonella) yesporas termófilas en azúcar refinada.

4. DEFINICIONES

Para los propósitos de esta Norma Técnica Peruana se aplican las siguientes definiciones.

4.1 azúcar: Es el producto sólido cristalizado obtenido de los jugos de la cañade azúcar (Saccharum sp.) o de remolacha (Beta vulgaris L. variedad rapa), mediantecentrifugación de la masa cruda.

Al estado puro el azúcar es un hidrato de carbono denominado sacarosa cuya fórmulageneral es C12H22011 .

4.2 azúcar refinada: Es el azúcar obtenida mediante procedimientosindustriales de refinación del azúcar crudo por carbonatación, fosfatación o intercambioiónico.

Hay varias clases o grados de azúcar refinada y éstas son:

− Azúcar refinada farmacopea− Azúcar refinada industrial− Azúcar refinada doméstica

4.2.1 azúcar refinada farmacopea: Es un azúcar refinada de alta purezainodora, estable al aire y en solución neutra.

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4.2.2 azúcar refinada industrial: Es aquel azúcar refinada usada en el ámbitoindustrial y que reúne condiciones de pureza suficientes para tal empleo y que se definenen sus características.4.2.3 azúcar refinada doméstica: Es aquel azúcar refinada de menor grado depureza, definida por su estándar y que es apta para el consumo humano.

4.3 bacterias mesófilas: Son las que tienen su crecimiento óptimo entre 20 ºCy 45 ºC. La temperatura de incubación seleccionada es un promedio para un crecimientoóptimo. Las condiciones favorables para el crecimiento de amplio espectro de bacterias sonestablecidas por el uso de medios de cultivo general.

4.4 levaduras y mohos: Son microorganismos, que forman colonias a 30 ºC enun medio selectivo a pH bajo (<5) o en presencia de un antibiótico. El mismo mediosoporta el crecimiento de levaduras y mohos e inhibe el crecimiento de bacterias.

4.5 enterobacteriáceas: Familia de bacterias lactosa + y lactosa – utilizadascomo indicadores de contaminación.

4.6 recuento de colonias: Es la enumeración de unidades formadoras decolonia (U.F.C.). Los resultados son reportados en U.F.C./10 g.

4.7 vertido en placas: Estas son placas de agar las cuales han sido inoculadaspor mezclar cantidades conocidas de muestra diluida con medio de agar líquido (47 ºC ± 1ºC).

4.8 bacterias termofílicas formadoras de esporas: Las bacterias termofílicasformadoras de esporas pueden ser seleccionadas porque sus endosporas son resistentes alcalor. Las células de bacterias formadores de esporas morirían después de un periodo deebullición de 5 minutos a 100 ºC y el crecimiento de las endosporas sería estimulado.

4.9 bacterias formadoras de mucílago: Estas son bacterias que crecen ensubstratos conteniendo sacarosa y forman cápsulas brillantes, especialmente las cepas deBacillus, Streptococcus y Leuconostoc.

4.10 esterilización: Acción y efecto de esterilizar.

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4.11 esterilizar: Destrucción total de las formas viables y esporuladas demicroorganismos. La elección del método depende de la naturaleza física del Material queva a ser esterilizado.

5. REQUISITOS

5.1 Los azúcares refinados deberán cumplir los siguientes requisitos:

TABLA 1 - Requisitos microbiológicos del azúcar refinada doméstica expresados enU.F.C./10 g (unidades formadoras de colonias)

n m M C- Numeración de bacterias aerobias mesófilas viables 5 0 < 200 2- Numeración de levaduras 5 0 < 50 2- Numeración de mohos 5 0 < 10 2- Detección de Enterobacteriáceas 5 Ausencia en 10 g 0

TABLA 2 - Requisitos microbiológicos del azúcar refinada industrial expresados enU.F.C./10 g (unidades formadoras de colonias)

Tipo 1Azúcar refinada industrial n m M C- Numeración de bacterias aerobias mesófilas viables 5 0 < 200 2- Numeración de levaduras 5 0 < 10 2- Numeración de mohos 5 0 < 10 2- Detección de Enterobacteriáceas 5 Ausencia en 10 g 0- Numeración de esporas termófilas totales 5 50 150 3- Numeración de esporas termófilas “Flat Sours” 5 10 75 3- Detección de esporas anaeróbias termófilas noproductoras de H2S 5 0/6* 4/6* 3- Numeración de esporas anaeróbicas termófilasproductoras H2S 5 1 5 2* tubos

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Donde:

n = Es el número de unidades de muestra que deben ser examinadas de un lote dealimentos, para satisfacer los requerimientos de un plan de muestreo particular.

m = Límite menor de microorganismos.

M = Es un criterio microbiológico que en un plan de muestreo separa calidadmarginalmente aceptable de calidad defectuosa. Valores mayores a “M” soninaceptables.

c = Es el número máximo permitido de unidades de muestra defectuosa. Cuando seencuentran cantidades mayores de este número el lote es rechazado.

6. HIGIENE

Se recomienda que el producto regulado por las disposiciones de esta NTP se prepare deconformidad con las secciones I al X del Código Internacional recomendado de prácticas:Principios Generales de Higiene de los Alimentos del Codex Alimentarius.

7. PRINCIPIO

7.1 Para bacterias aerobias mesófilas viables, levaduras y mohos

Alícuotas diluidas de las muestras son mezcladas con volúmenes pequeños de un agarfundido y tibio (47 ºC) en placas de Petri. Estas placas luego son incubadas y las coloniasque desarrollan son contadas.

El medio de cultivo es selectivo y específico para cada microorganismo.

7.2 Para enterobacteriáceas

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Muestras pesadas de azúcar son adicionadas a un medio líquido de enriquecimiento paraenterobacterias. Son incubadas a 37 ºC por 20 h a 24 h. La presencia de turbidez esconsecuencia del crecimiento bacteriano, esta muestra se siembra por estría en placas deagar específico y se incuba a 37 ºC por otras 20 h a 24 h. Las colonias de color rojo conhalo de precipitación rojiza se consideran tentativamente como pertenecientes a la familiade enterobacteriáceas. Con pruebas bioquímicas se determinan la presencia o ausencia deenterobacterias.

7.3 Para bacterias termófilas formadoras de esporas

Alícuotas de la muestra diluida son mezcladas con volúmenes pequeños de agar fundidoenfriado en placas de Petri. Se usa un medio de cultivo selectivo para bacterias termófilas.Se incuban las placas y se cuentan las colonias que desarrollan.

7.4 Para bacterias formadoras de mucílago

Alícuotas diluidas de la muestra son mezcladas con el medio de cultivo selectivo líquido enplacas de Petri e incubadas cuando el medio de agar ha solidificado.

Material de vidrio estéril y una técnica aséptica se emplea en el desarrollo de estosmétodos.

8. DILUYENTES, MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

8.1 Agua destilada estéril autoclavada a 121 ºC por 15 minutos.

8.2 Medios de cultivo

8.2.1 Para bacterias aerobias mesófilas viables

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- Agar Nutriente (1 L)

Ingredientes: g/lExtracto de carne 1Extracto de levadura 2Peptona 5Cloruro de sodio 5Agar 15pH 7,5

- Medio para recuento en placa (PCA) (1L)

Ingredientes: g/lPeptona 5Extracto de levadura 2,5Glucosa 1Agar 12pH 7

8.2.2 Para levaduras y mohos

Utilizar uno de los tres medios siguientes:

- Agar Mosto ( 1L)

Ingredientes : g/lExtracto de malta 15Peptona 0,78Maltosa 12,75Dextrina 2,75Glicerol 2,35Sulfato de Potasio hidrogenado 1,00Cloruro de amonio 1,00Agar 15,00pH 4,8

- Agar Extracto de levadura –glucosa- cloranfenicol (1 L)

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Ingredientes: g/lExtracto de levadura 5Glucosa 20Cloranfenicol 0,1Agar 15pH 6,6

NOTA: La oxitetraciclina puede ser usada en lugar del cloranfenicol. La oxitetraciclina es sensible alcalor, por lo que deberá ser adicionada al medio justo antes de su uso, en forma de soluciónesterilizada por filtración.

- Agar micofílico (1 L)

Ingredientes: g/lPeptona fitona 10Glucosa 10Agar 16pH 4,0

NOTA: Ajustar el pH a 4,0 por adición al 15 ml, de ácido láctico estéril al 10 % (v/v) por cada litro demedio estéril diluído antes de plaquear.

8.2.3 Para enterobacteriáceas

- Caldo de Enriquecimiento para enterobacteriáceas (según Mossel)

Ingredientes: g/lPeptona 10Glucosa 5Fosfato monohidrógenodisódico 8Fosfato monopotásico dihidrógeno 2Bilis de Buey desecada 20Verde brillante (solución acuosaal 0,5 %, m/v) 3 cm3 ó 0,015 mgpH 7,3

NOTA: Este medio se utiliza a doble concentración. Para lo cual se duplica las cantidades deingredientes.

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- Agar bilis lactosa – glucosa rojo neutro cristal violeta

Ingredientes: g/lExtracto de levadura 3Peptona de carne 7Cloruro sódico 5Sales biliares # 3 1,5Lactosa 10Glucosa 10Agar 15Rojo neutro 0,03Cristal violeta 0,002pH 7,4

- Agar Mac Conkey

Ingredientes: g/lPeptona de caseina 17Peptona de carne 3Cloruro de sodio 5Lactosa 10Mezcla de sales biliares 1,5Rojo neutro 0,03Cristal violeta 0,001Agar 13,5

8.2.4 Para bacterias termófilas formadoras de esporas

- Agar dextrosa triptona (1 L)

Ingredientes: g/lTriptona (tripticasa) 10Dextrosa 5Púrpura de bromocresol 0,04Agar 12pH 7

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- Agar sulfito (1 L)

Ingredientes: g/lTriptona 10Sulfito sódico (anhidro) 1Agar 20

NOTA: Adicionar 10 ml de una solución de citrato férrico al 5 % para 1 litro y distribuir en tubos arazón de 15 ml por tubo.

- Caldo infusión de hígado (1 L)

Ingredientes: g/lInfusión de hígado de ternera 500Triptona o peptona 10Almidón soluble 1Fosfato dipotásico 1pH 7,6

- Shapton Agar (1 l)

Ingredientes: g/lExtracto de carne 3Peptona 5Extracto de levadura 1Púrpura de Bromocresol 0,25Agar 15pH 7,5

8.3 Para bacterias formadoras de mucílago

- Medio de Weman (1 L)

Ingredientes: g/l

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Azúcar crudo 40Cloruro de sodio 0,5Sulfato de Magnesio 0,1Sulfato ferroso 0,01Tiza precipitada 10Fosfato ácido disódico 2Agar 20pH 5,0

- Medio de McClesky-Faville (1 L)

Ingredientes: g/lTriptona 10Extracto de levadura 5Azúcar crudo 100Agar 20pH 6,5

8.4 Oxitetraciclina.

8.5 Desinfectante para el área de trabajo.

9. APARATOS

9.1 Ambiente de trabajo estéril.

9.2 Autoclave: Para la esterilización de medios de cultivo, aguas y material dedesecho a 121 ºC ± 1 ºC.

9.3 Incubadora: Para la incubación de placas inoculadas a 30 ºC ± 1 ºC, 37ºC ± 1 ºC y (44 ºC a 55 ºC) ± 1 ºC, según el análisis.

9.4 Horno: Para la esterilización de material de vidrio a 200 ºC.

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9.5 Balanza de laboratorio: Para pesar medios de cultivo, reactivos y muestrasde azúcar, de 0 g a 220 g.

9.6 Potenciómetro: Para ajustar a ± 0,1 unidades de pH a 25 ºC (medios decultivo y soluciones).

9.7 Estufas eléctricas: Para la preparación de medios de cultivo.

9.8 Equipo contador de colonias: Para la obtención de resultados.

9.9 Mechero de Bunsen: Para mantener la esterilidad del área durante larealización de los análisis.

9.10 Placas de Petri: De 90 mm a 100 mm de diámetro, estériles de vidrio oplástico.

9.11 Frascos: Estériles para la toma de muestras.

9.12 Pipetas graduadas: 1 ml, 5 ml para la distribución de muestras y 10 mlpara las diluciones.

9.13 Matraces Erlenmeyer: Graduados, de 200 ml para la preparación demuestras.

9.14 Tubos de prueba: Para la preparación de diluciones.

9.15 Equipo de baño-maría: Para mantener los medios de cultivo a temperaturade 47 °C, para uso inmediato.

9.16 Cápsulas metálicas y espátulas: Para pesar muestras, medios de cultivo yreactivos.

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10. MUESTRAS

Tomar muestras representativas de 200 g (peso mínimo) en frascos estériles. Retener lasmuestras testigo por un período de por lo menos un mes después de realizado el análisis.

11. PROCEDIMIENTO

11.1 Preparación del ambiente

Limpiar y desinfectar el área de trabajo antes de comenzar el análisis.

Marcar las placas de Petri estériles con fecha, muestra y tipo de medio.

11.2 Preparación del medio

Medio de agar: Siguiendo las instrucciones del productor cuidadosamente, rehidrate elmedio con agua destilada o desionizada. Coloque el medio en frascos de vidrio y esterilicea 121 ºC por 15 minutos.

Los medios para uso inmediato después de esterilizados deben enfriarse a 47 ºC en bañomaría y ser depositados en placas de Petri. Alternativamente debe permitírseles solidificary ser almacenadas en oscuridad entre 0 ºC a 5 ºC por un periodo máximo de 1 mes. Losmedios pueden ser refrigerados para su utilización posterior.

11.3 Preparación de material de vidrio

Esterilizar frascos, matraces, placas y pipetas en el equipo de esterilización en seco (170 ºCa 180 ºC) durante 1 hora.

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11.4 Preparación de la muestra

En forma aséptica pesar 10 g de azúcar en cristales y colocar en un matraz de 200 ml decapacidad, agregar agua estéril hasta la marca de 100 ml. Agitar vigorosamente hastadisolver.

11.5 Inoculación e incubación

Tomar dos placas estériles y pipetear 1 ml de la solución en cada placa. Si es necesarioprepare una de la suspensión inicial (10-1) adicionando 1 ml a 9 ml de agua estéril en eltubo de prueba quedando series de 10-2, 10-3, etc y poner la muestra en placas y el medio.

Adicionar aproximadamente 15 ml de medio de cultivo diluido y enfriado a cada placa ymezclar con la muestra con movimientos rotatorios, permitir que la mezcla solidifique.Preparar una placa control conteniendo el medio de cultivo para chequear la esterilidad.Invertir las placas e incubar a 30 ºC por 48 h a 72 h.

12. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

- Para bacterias aerobias mesófilas viables

Contar las colonias en cada placa usando el equipo cuenta colonias. Para placas quemuestren más de 200 colonias examine las diluciones. Esta técnica no es útil cuando lasplacas tienen menos de 10 colonias y se tendría que usar el método de Membranasfiltrantes inmediatamente.

- Para levaduras y mohos

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Contar las colonias de levadura de cada placa conteniendo no más de 150 colonias usandoel equipo cuenta colonias. Las levaduras son opacas, blancas, amarillas o rosadas, mientrasque los mohos forman un micelio el cual frecuentemente es blanco, con esporas negras,marrones o verdes. Para placas con recuentos altos, examine la dilución.

12.1 Recuento en placa

Σc = U.F.C./g de azúcar

(n1 + 0,1 n2 ) d

Σc = Suma de colonias contadas sobre todas las placas.

n1 = Nº de placas contadas en la primera dilución.

n2 = Nº de placas contadas en la segunda dilución.

d = Dilución de la cual fue obtenido el primer recuento

Ejemplo: Fueron incubadas dos placas de Petri por dilución

Dilución 10-1 1ra Placa 97 U.F.C.2da Placa 110 U.F.C.

Dilución 10-2 1ra Placa 35 U.F.C.2da. Placa 46 U.F.C.

97 + 110 + 35 + 46 = 288 = 1309 g UFC(2 + 0,1 x 2) x 10- 1 0,22

Por 10 g de azúcar el resultado es: 1,3 x 104 U.F.C./10 g

13. ANTECEDENTES

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13.1 ICUMSA GS 2/3 – 43 (1998) Determinación de Bacterias MesófilasTotales. Recuento en productos de azúcar refinado por el método de vertido en placas –Oficial.

13.2 ICUMSA GS 2/3 – 47 (1998) Determinación de levaduras y mohos enproductos de azúcar refinado por el método de vertido en placas.

13.3 ICUMSA(Tentativo) Detección de EnterobacteriáceasSétima recomendación, 21 reunión de (1994).Detección de patógenos (Salmonella)

13.4 ICUMSA. GS 2/3 – 49 (1998) Determinación de Bacterias Termofílicasformadoras de esporas en productos de azúcar refinado por el método de vertido en placaso el método de Membrana Filtrante (Oficial)

13.5 ICUMSA GS 2/3 – 45 (1998) Determinación de Bacterias formadoras demucílago. Recuento en productos de azúcar refinado por el método de Vertido en placas ométodo de membrana Filtrante (Tentativo).

13.6 NTP 207.028:1987 Métodos de Ensayo Microbiológicos en elAzúcar Refinado.

13.7 NTP 207.032:2005 Métodos de Ensayo Microbiológicos en elAzúcar Refinado con uso de membranasFiltrantes

13.8 NTP 207.050-1:2005 AZÚCAR. Azúcar rubia. Determinación yrecuento de microorganismos

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ANEXO A(INFORMATIVO)

DIAGRAMA DE PROCEDIMIENTO -DETERMINACIÓN DE SALMONELLA

Muestra 25 g

Pre-enriquecimiento en medio líquido no selectivoAgua peptonada bufferada, 225 ml, 37 ºC, 16 h - 20 h

Enriquecimiento selectivo en medio líquido10 ml en medio selenito cistina, 0,1 ml en medio R.V.37 ºC, 18 h – 24 h 42 ºC, 18 h – 24 h

AislamientoPlaquear sobreMedio selectivo sólidoAgar (BPLS) Agar Verde Brillante-rojo de fenolAgar (XLD) Agar Xilosa-lisina, desoxicolato37 ºC, 24 h (48 h si es necesario)

IdentificaciónSeleccionar las colonias, por forma y5 características de las colonias o de cada medioselectivo, rayar sobre la superficie de placas con Agar nutrientepreviamente secadas37 ºC, 18 h – 24 h

Confirmación ConfirmaciónBioquímica Serológica

Interpretación de resultadosCepas las cuales son consideradas Salmonella o que pueden ser Salmonellaserán enviadas a un Centro de referencia para Salmonella para su tipificacióndefinitiva

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