UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA

CARLA VIVIANNE PEREIRA ESTEVÃES RIBEIRO

ESTRUTURA E ATIVIDADE ANTIDIARREICA DE POLISSACARÍDEOS

DA ALGA MARINHA VERMELHA Bryothamnion triquetrum S. G. GMELIN

FORTALEZA

2016

CARLA VIVIANNE PEREIRA ESTEVÃES RIBEIRO

ESTRUTURA E ATIVIDADE ANTIDIARREICA DE POLISSACARÍDEOS

DA ALGA MARINHA VERMELHA Bryothamnion triquetrum S. G.GMELIN

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Bioquímica da Universidade

Federal do Ceará, como requisito parcial à

obtenção do título de Mestre em Bioquímica.

Área de concentração: Bioquímica Vegetal.

Orientadora: Profa. Dra. Ana Lúcia Ponte

Freitas.

Coorientador: Prof. Dr. Jand-Venes Rolim

Medeiros.

FORTALEZA

2016

CARLA VIVIANNE PEREIRA ESTEVÃES RIBEIRO

ESTRUTURA E ATIVIDADE ANTIDIARREICA DE POLISSACARÍDEOS DA

ALGA MARINHA VERMELHA Bryothamnion triquetrum S. G.GMELIN

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Bioquímica da Universidade

Federal do Ceará, como requisito parcial à

obtenção do título de mestre em Bioquímica.

Área de concentração: Bioquímica Vegetal.

Aprovada em 03 de fevereiro de 2016.

BANCA EXAMINADORA

________________________________________

Profa. Dra. Ana Lúcia Ponte Freitas (Orientadora)

Universidade Federal do Ceará (UFC)

_________________________________________

Prof. Dr. Jand-Venes Rolim Medeiros (Coorientador)

Universidade Federal do Piauí (UFPI)

_________________________________________

Profa. Dra. Norma Maria Barros Benevides

Universidade Federal do Ceará (UFC)

A Deus.

A minha querida mãe Maria de Fátima Pereira

Silva.

Ao meu marido Fernando Jorge Almeida

Ribeiro pelo apoio e dedicação.

AGRADECIMENTOS

A Profa. Dra. Ana Lúcia Ponte Freitas pela orientação, por ter me acolhido em seu

laboratório de forma profissional e materna, pela generosidade em compartilhar seus

conhecimentos, um exemplo como pessoa e pesquisadora.

Ao Prof. Dr. Jand-Venes Rolim Medeiros pela sua coorientação, atenção, receptividade

e pelo apoio na realização desta dissertação.

À Profa. Dra. Regina Célia Monteiro de Paula, por sua contribuição para realização

deste trabalho.

Ao Laboratório de Polímeros da UFC pela disponibilização de equipamentos para as

análises químicas.

Á Profa. Dra. Norma Maria Barros Benevides participante da banca examinadora pelas

valiosas sugestões dadas na análise deste manuscrito.

Aos companheiros de laboratório: Clark Barros, Eliane Silva, Felipe Bezerra, Glauber

Cruz, Luis Eduardo Castanheira e Willer Malta, em especial Poliana Cavalcante, pelo carinho

e amizade.

A minha mãe Maria de Fátima Pereira Silva pela determinação e luta na minha

formação e na minha vida, meu exemplo.

Ao meu pai Luis António Ramos Estevães pelo incentivo aos meus estudos.

Ao meu esposo Fernando Jorge Almeida Ribeiro pelo tempo todo ao meu lado me

apoiando. Devido ao companheirismo, amizade, paciência e compreensão, este trabalho pôde

ser concretizado. Sou grata por cada gesto de carinhoso e amor.

A minha madrinha Helena da Silva pelo grande carinho e apoio.

À Universidade Federal do Ceará e à FUNCAP pelo auxílio financeiro.

Por fim, mas não por último, agradeço a Deus que é minha luz, fortaleza, proteção,

sabedoria e que iluminou o meu caminho durante essa caminhada.

“Um pouco de ciência nos afasta de Deus.

Muito, nos aproxima”.

(Louis Pasteur)

RESUMO

As algas marinhas são fontes de diversas moléculas com atividades biológicas, tais como os

polissacarídeos sulfatados, os quais têm despertado grande interesse nas ciências biomédicas.

O objetivo deste estudo foi caracterizar química e estruturalmente os polissacarídeo sulfatados

totais (PST) da macroalga marinha vermelha Bryothamnion triquetrum e avaliar seu potencial

antidiarreico. Os PST foram obtidos através de extração enzimática com papaína, tendo sua

massa molecular e teor de sulfato e carbono determinados por cromatografia de permeação

em gel e microanálise elementar, respectivamente. A diarreia aguda em camundongos foi

induzida por óleo de rícino e os efeitos antidiarreicos dos PST foram avaliadas através da

quantidade total de fezes e fezes diarréicas, da secreção de fluido intestinal (enteropooling) e

da motilidade intestinal utilizando carvão ativado. Os efeitos dos PST na diarreia secretora

induzida pela toxina da cólera foram analisados por secreção e absorção do fluido intestinal

em alças intestinais isoladas e por meio de interações com o gangliosídeo GM1 utilizando o

método de ELISA. O rendimento dos PST a partir da biomassa de alga seca foi de 7,2% com

massa molecular estimada em 61,41 kDa. As análises estruturais mostraram que este

composto é uma galactana tipo ágar, contendo principalmente unidades de 3,6-anidro-α-L-

galactose e β-D-galactose-6-O-metil. Grupamentos sulfato estão presentes em baixas

quantidades, na forma de α-L-galactose-6-sulfato, com grau de sulfatação de 0,28%,

correspondendo a 2,1% dos átomos presentes nos PST. Doses de 1, 3, 10 e 30 mg/Kg de PST

(v.o.) foram testadas contra a diarreia aguda e a dose de 10 mg/Kg exibiu os melhores

resultados, reduzindo as fezes totais e as fezes diarreicas em 90,24% e 93,98%,

respectivamente. Portanto, esta dose foi utilizada como dose padrão em experimentos

subsequentes. O enteropooling e a motilidade intestinal foram reduzidos pelos PST em

54,26% e 45,35%, respectivamente. Na diarreia secretora, os PST inibiram a secreção de

fluido intestinal em 20,00%, revertendo o estado secretor induzido pela toxina da cólera, mas

não teve qualquer efeito na absorção intestinal. Os resultados mostraram ainda que os PST

estavam interagindo com os receptores GM1 e/ou com a toxina da cólera, bloqueando a

ligação da toxina com o seu receptor e prevenindo o desencadeamento da doença. Estes

resultados confirmam o potencial uso dos PST da alga B. triquetrum como um composto

antidiarreico.

Palavras-chave: Rhodomelaceae. Carboidratos. Diarreia. Óleo de rícino. Toxina da Cólera.

ABSTRACT

Marine algae (seaweeds) are source of several molecules with biological activities, such as

sulfated polysaccharides which have aroused a great interest in biomedical sciences. The aim

of this study was to characterize chemically and structurally the total sulfated polysaccharides

(TSP) from the red seaweed Bryothamnion triquetrum and to evaluate its antidiarrheal

potential. The TSP were obtained through enzymatic extraction with papain, its molecular

mass and sulfate and carbon content were determined by gel permeation chromatography and

elemental microanalysis, respectively. Acute diarrhea in mice was induced by Castor oil and

the antidiarrheal effects of the TSP were evaluated through the total amount of stool and

diarrheal stools, intestinal fluid secretion (enteropooling) and intestinal motility using

charcoal meal. The effects of the TSP on secretory diarrhea induced by cholera toxin were

analyzed by fluid secretion and absorption in intestinal closed loops and through interactions

with the ganglioside GM1, utilizing ELISA method. The TSP yield from dry seaweed was

7.2% and its molecular mass estimated at 61.41 kDa. Structural analyses have shown that this

compound consisted of an agar-type galactan, containing mainly 3,6-anhydro-L- galactose

and β-D-galactose-6-O-methyl. Sulfate groups are present in small amounts, in the form of α-

L-galactose-6-sulfate, with sulfation degree of 0.28%, corresponding to 2.1% of the atoms

present in TSP. Doses of 1, 3, 10 and 30 mg/Kg of TSP (v.o.) were tested against acute

diarrhea and the dose of 10 mg/Kg has shown the best results, reducing the total amount of

stool and diarrheal stools in 90.24% and 93.98%, respectively. Hence, it was used as the

standard dose for subsequent experiments. Enteropooling and intestinal motility were

decreased by TSP in 54.26% and 45.35%, respectively. In secretory diarrhea, TSP have

inhibited intestinal fluid secretion in 20.00% reversing the secretory state induced by the

cholera toxin, however, it had no effect on the intestinal absorption. The results also showed

that TSP were interacting with GM1 receptors and/or cholera toxin, blocking toxin binding to

its receptor and preventing the onset of the disease. These results confirm the potential use of

the TSP obtained from the red seaweed B. triquetrum as an antidiarrheal compound.

Keywords: Rhodomelaceae. Carbohydrates. Diarrhea. Castor oil. Cholera Toxin.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 -Estrutura química básica de galactanas........................................................... 23

Figura 2 -Estrura do gangliosídio GM1. ......................................................................... 31

Figura 3 -Ação da toxina colérica. .................................................................................. 32

Figura 4 -Aspecto macroscópico da alga marinha vermelha Bryothamnion triquetrum

e sua classificação taxonômica. ........................................................................ 37

Figura 5 -Esquema de extração enzimática dos PST extraídos da alga vermelha

Bryothamnion triquetrum . .......................................................................... 40

Figura 6 - Perfil cromatográfico dos PST extraídos da alga Bryothamnion triquetrum

em cromatografia de permeação em gel . .........................................................52

Figura 7 -Espectros de FT-IV em pastilhas de KBr dos PST extraídos da alga

Bryothamnion triquetrum na região e número de onda de 1400 – 700............ 53

Figura 8 - Espectro de RMN do 1H do polissacarídeo da alga Bryothamnion

triquetrum em solução de D2O. ........................................................................ 55

Figura 9 - Espectro de RMN do polissacarídeo da alga B. triquetrum em D2O

(A) 13

C RMN (B) DEPT. .................................................................................. 56

Figura 10 - Espectro HSQC de1H e

13C do polissacarídeo da alga B. triquetrum em

D2O. ................................................................................................................. 57

Figura 11 -Fluidez das fezes em diarreia induzida por óleo de rícino em

camundongos. ............................................................................................. 60

Figura 12 -Efeitos da atividade dos PST no trânsito intestinal induzido por óleo de

rícino em camundongos. ................................................................................... 62

Figura 13 - O efeito dos PST sobre a secreção de fluido induzido pela toxina da

Cólera em alças intestinais. .......................................................................... 63

Figura 14 - Secreção de fluidos medidos indiretamente como proporção em peso da

alça / comprimento. .......................................................................................... 63

Figura 15 -Absorção do fluido intestinal.......................................................................... 64

Figura 16 -Efeitos dos PST sobre a toxina colérica (CT) e GM1..................................... 65

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Espécies de algas marinhas produzindo polissacarídeos e suas aplicações... 26

Tabela 2 - As lectinas e os seus oligossacarídeos ligantes.............................................. 31

Tabela 3 - Rendimento de polissacarídeos sulfatados em diferentes espécies de algas

vermelhas. .........................................................................................................

50

Tabela 4 - Assinalamentos de RMN de 1H e

13C para PST de B. triquetrum.................. 58

Tabela 5 - Efeitos dos PST sobre a diarreia induzida por óleo de rícino em

camundongos . ................................................................................................ 59

Tabela 6 - Efeito dos PST no enteropooling induzido por óleo de rícino em

camundongos. ................................................................................................. 61

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AMPc Monofosfato Cíclico de Adenosina

BSA Albumina Sérica Bovina

CPC Cloreto de Cetil Peridínio

Cl- Íon cloro

CT Toxina da Cólera

D2O Água deuterada

DSS 2,2-dimetilsilapentano-5-sulfonato de sódio

EDTA Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético

EP3 Receptores 3 de prostaglandina E2

EP4 Receptores 4 de prostaglandina E2

FTIR Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier

GPC Cromatografia de Permeação em Gel

GM1 Monossialogangliosídeo 1

HCO3-

Bicarbonato

MPK Pico das Massas Molares

Na*

Íon sódio

PBS Tampão fosfato – salino

PST Polissacarídeos Sulfatos Totais

RMN Ressonância Magnética Nuclear

TMB Tetrametilbenzidina

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO. ..................................................................................................... 17

1.1 Algas. ....................................................................................................................... 17

1.2 Gênero Bryothamnion…………………………………………………...……… 18

1.3 Importância ecológica das algas .......................................................................... 18

1.4 Importância econômica das algas ....................................................................... 20

1.5 Polissacarídeos sulfatados de algas marinhas .................................................... 21

1.6 Propriedades farmacológicas de polissacarídeos de algas marinhas................ 24

1.7 Diarreia. .................................................................................................................. 27

1.7.1 Classificação da diarreia. ....................................................................................... 27

1.8 Modelos de diarreia……………………………………………………………... 29

1.8.1 Diarreia induzida pela toxina da Cólera……………………………...………… 29

1.8.2 Diarreia induzida com óleo de rícino…………………………………………… 33

1.9 Medicamentos utilizados no tratamento da diarreia......................................... 34

2 OBJETIVOS . ........................................................................................................ 36

2.1 Geral . ..................................................................................................................... 36

2.2 Específicos . ............................................................................................................ 36

3 MATERIAIS E MÉTODOS . ............................................................................... 37

3.1 Coleta e Identificação da alga marinha .............................................................. 37

3.2 Animais . ................................................................................................................. 38

3.3 Soluções e Reagentes . ........................................................................................... 38

3.4 Extração dos polissacarídeos sulfatados totais (PST)….................................... 38

3.5 Rendimento . .......................................................................................................... 41

3.6 Caracterização de composição química .............................................................. 41

3.6.1 Determinação de carboidratos totais .................................................................... 41

3.6.2 Determinação de proteínas . ................................................................................... 41

3.6.3 Determinação de sulfato e carbono ...................................................................... 42

3.6.4 Determinação da massa molar………................................................................... 43

3.6.5 Espectroscopia de absorção na região do infravermelho .................................... 43

3.6.6 Ressonância Magnética Nuclear (RMN).............................................................. 43

3.7 Atividade dos PST da alga Bryothamnion triquetrum no modelo de diarreia.. 44

3.7.1 Modelo de diarreia induzida por óleo de rícino em camundongos ..................... 44

3.7.2 Avaliação do acúmulo de fluido intestinal (enteropooling) induzido por óleo

de rícino em camundongos . .................................................................................. 45

3.7.3 Trânsito intestinal induzido por óleo de rícino ................................................. 45

3.7.4 Avaliação da secreção de fluido intestinal induzida pela toxina da Cólera em

camundongos…………………………………………………………………….. 46

3.7.5 Avaliação da absorção de fluido intestinal induzida pela toxina da Cólera em

camundongos……………………………………………………………………..

47

3.7.6 Interação dos PST com receptor e/ou com a CT-GM1 ELISA............................. 47

3.7.7 Análises estatísticas. ............................................................................................. 48

4 RESULTADOS E DISCUSSÕES ...................................................................... 49

4.1 Extração e rendimento dos PST . ......................................................................... 49

4.2 Análises de composição química. ....................................................................... 50

4.3 Determinação da massa molar………………..................................................... 51

4.4 Espectroscopia de absorção na região do infravermelho ….............................. 52

4.5 Ressonância Magnética Nuclear . ........................................................................ 54

4.6 Atividade dos PST da alga Bryothamnion triquetrum no modelo de diarreia.. 58

4.6.1 Modelo de diarreia induzida por óleo de rícino em camundongos ..................... 58

4.6.2 Avaliação do acúmulo de fluido intestinal (enteropooling) induzido por óleo de

rícino em camundongos………………………………………………………….. 60

4.6.3 Trânsito intestinal induzido por óleo de rícino ..................................................... 61

4.6.4 Avaliação da secreção de fluido intestinal induzida pela toxina da Cólera em

camundongos…………………………………………………………………….. 62

4.6.5 Avaliação da absorção de fluido intestinal induzida pela toxina da Cólera em

camundongos. ......................................................................................................... 646

4.6.6 Interação dos PST com receptor e/ou com o CT-GM1 ELISA………................. 64

6 CONCLUSÃO . ...................................................................................................... 67

REFERÊNCIAS . ................................................................................................... 68

ANEXO………………………………………………………………………....... 80

17

1 INTRODUÇÃO

1.1 Algas

As algas são organismos fotossintetizantes, unicelulares (microalagas) ou

multicelulares (macroalgas) com dois tipos de reprodução (sexuada e assexuada) e

encontradas em ambientes marinhos e continentais fornecendo proteção para diversos

organismos microscópicos, invertebrados e peixes que também podem utilizá-las como

alimento. As algas apresentam grande variação morfológica e possuem, assim como as

plantas, parede celular composta de celulose (ROCHA et al., 2004; BARSANTI;

GUALTIERI, 2014).

Estas necessitam de luz e gás carbônico para a geração de alimentos e para seu

crescimento e produzem oxigênio e carboidrato como resultados da fotossíntese que são

utilizados por outros organismos. Dessa forma, possuem um papel importante no equilíbrio

dos ambientes em que se encontram (TORTORA; FUNKE; CASE, 2012), representando a

base da cadeia alimentar nos ecossistemas aquáticos, sustentando mais de dois terços da

biomassa mundial e responsáveis por aproximadamente metade da atividade fotossintética

global (DAY; BENSON; FLECK,1999; OLIVEIRA, 2002; EL GAMAL, 2010).

As algas estão subdivididas entre os filos Rhodophyta (algas vermelhas),

Phaeophyta (algas pardas) e Chlorophyta (algas verdes). As algas vermelhas são entre 4.000 e

6.000 espécies, elas ocorrem em águas marinhas sejam elas frias temperadas ou tropicais, têm

tamanhos variando de poucos centímetros até cerca de 1 m de comprimento e, apesar de

serem ditas vermelhas, podem apresentar-se em tonalidades vermelho acastanhadas ou mesmo

roxas. Apresentam em especial, maior riqueza de táxons de valor econômico, principalmente

os gêneros Digenia, Gracilaria, Gelidiella, Gelidium, Hypnea e Pterocladiella (MARINHO-

SORIANO, 1999, MCHUGH, 2003, DE OLIVEIRA- CARVALHO, 2008, MEDEIROS,

2014).

As algas pardas possuem cerca de 1.500 representantes, em sua maioria, estão

presentes nas regiões de águas marinhas geladas, apresentam tamanhos que variam entre 30

cm a 20 m de comprimento. O grupo das algas verdes possui cerca de 17.000 representantes,

com tamanhos semelhantes às algas vermelhas e habitando ambientes aquáticos, seja ela água

doce ou marinha (MCHUGH, 2003, DE OLIVEIRA- CARVALHO, 2008).

Nos últimos tempos, com o advento de técnicas mais modernas nas áreas de

genômica e filogenia molecular, a história evolutiva de genes e taxonomia das algas vem

18

sofrendo algumas alterações. Com base em tais análises, particularmente na interpretação da

sequência de base de DNA do cloroplasto e de sequências de RNA ribossomal, as algas são

classificadas atualmente em Cyanophyta, Glaucophyta, Rhodophyta, Cryptophyta,

Phaeophyta, Dinophyta, Haptophyta, Euglenophyta, Clorophyta e Charophyta (PEREIRA;

NETO, 2014).

O grupo das cianófitas engloba as algas procariontes. Estas algas estão relacionadas

com as bactérias gram negativas devido à estrutura da sua parede celular, mas compartilham

algumas ca racterísticas com as algas eucariontes, como por exemplo, a presença de clorofila.

As algas dos grupos restantes fazem parte do taxon Eukarya, são mais numerosas, e

geralmente possuem células recobertas por uma parede fibrilosa produzida pelo aparelho de

Golgi, contendo polissacarídeos além de celulose (SAMBAMURTY, 2006; PEREIRA;

NETO, 2014).

1.2 Gênero Bryothamnion

As algas marinhas vermelhas do gênero Bryothamnion são compostas de talo

parenquimatoso, espesso, cilíndrico, apresentando crescimento por meio de células apicais,

eixo polissinfônico, com numerosos ramos curtos, tristicamentes disposto. O gênero

Bryothamnion possui 12 espécies e se encontra amplamente distribuído nos mares ocidentais

e orientais da África, no oceano Atlântico tropical e subtropical e no Pacífico (GUIRY, M;

GUIRY,G, 2013).

Estudo demonstrou atividade antinociceptiva de polissacarídeos da alga marinha

vermelha B. triquetrum no ensaio de contorções abdominais induzidas por ácido acético

(VIANA et al., 2002). Os polissacarídeos da alga marinha vermelha B. seaforthii reduziram o

número de contorções abdominais induzidas por ácido acético, o tempo de lambedura da pata

no teste da formalina, na primeira e segunda fase, e prolongaram o tempo de reação ao

estímulo térmico no teste da placa quente (VIEIRA et al., 2004). Há poucos estudos de

polissacarídeos sulfatados de macroalgas marinhas do gênero Bryothamnion o que torna este

gênero uma fonte ampla de pesquisa.

1.3 Importância ecológica das algas

As algas são parte essencial dos mares, rios e lagos e apresentam grande

importância biológica devido ao fato de serem organismos fotossintetizantes capazes de

19

converter a energia do sol em energia química. Esta energia está representada na

produtividade primária, medida que indica a quantidade de gás carbônico que a alga leva

durante a fotossíntese e converte em matéria orgânica ou biomassa durante um determinado

tempo. Esta matéria orgânica ou biomassa se converte na base da cadeia alimentícia de

invertebrados, peixes e outros animais de ambiente aquático (LUNNING, 1990; HOLDT;

KRAAN, 2011).

Nos ecossistemas aquáticos, como os recifes de corais, manguezais, pantanais,

rios e lagos, as algas não contribuem somente de maneira considerável na produção de

matéria orgânica, mas também na reciclagem de nutrientes e na produção de oxigênio em suas

águas. Esta contribuição em cada um desses sistemas pode variar e está influenciada pelas

condições de luz e as características físico-químicas da água, como temperatura, oxigênio,

salinidade, nutrientes, pH entre outros. Estes fatores intervêm no crescimento e

desenvolvimento da alga, razão pela qual influenciam na produtividade do ecossistema

(DAWES, 1998; RAMOS; TRAVASSOS; LEITE, 2010).

Os efeitos da contaminação por atividades humanas afetam a qualidade da água e,

portanto a reprodução das algas. Na maioria das espécies de algas, os efeitos por

contaminação das águas trazem como consequência a diminuição da biomassa de espécies

não adaptadas a tolerar estas novas condições e, por conseguinte a redução da produtividade

do sistema. Estas condições podem favorecer o aparecimento de outras espécies de algas

resistentes à contaminação que podem ser usadas como indicadoras de condições ambientais

nos ecossistemas aquáticos. Para isto se tem desenvolvido uma série de índices que permitam

estabelecer uma correlação entre a composição taxonômica de espécies, a densidade da alga e

as condições da qualidade da água no sistema (PALMER, 1969; BELLINGER; SIGEE,

2010).

As algas podem ter um papel importante na remoção de elementos químicos

tóxicos por organismos vivos (biorremediação) devido à capacidade de remover íons

metálicos como cádmio, cobre, zinco, chumbo, cromo e mercúrio, pois contribuem para a

diminuição da fração do contaminante para os demais organismos. O uso de algas na

recuperação de efluentes contendo espécies metálicas apresentam vantagens, como o baixo

custo e elevada eficiência na remoção dos contaminantes de efluentes muito diluídos (DAVIS;

VOLESKY; MUCCI, 2003; PIMENTA, 2012).

20

1.4 Importância econômica das algas

Por ano são processados, aproximadamente, dois milhões de toneladas de algas

frescas para obter produtos alimentícios, os maiores produtores são a China, Coreia do Norte,

Coreia do Sul, Japão, Filipinas e Indonésia. Na América do Sul, o maior produtor é o Chile.

As propriedades nutricionais das algas marinhas não são tão bem conhecidas quanto as das

plantas superiores, porém vários estudos têm demonstrado que apesar de deficientes em

lipídeos, são ricas em proteínas, polissacarídeos, minerais e vitaminas (ZEMKE-WHITE;

OHNO, 1999; DAWCZYNSKI; SCHUBERT; JAHREIS, 2007).

Mais de 250 espécies de algas são exploradas comercialmente, onde 145 espécies

são utilizadas na alimentação e 101 espécies para a produção de ficocolóides (ZEMKE-

WHITE; OHNO, 1999). Os gêneros de macroalgas mais cultivados para exploração comercial

incluem Porphyra, Laminaria, Monostroma, Enteromorpha e Gracilaria (MOLL;

DEIKMAN, 1995; OLIVEIRA, 2003; VIDOTI; ROLLEMBERG, 2004).

Cerca de um milhão e meio de toneladas de algas são coletadas por ano para

extração de biomoléculas de interesse econômico, como alginato, ágares e carragenanas.

(VIDOTI; ROLLEMBERG, 2004). Ágar e carragenana são polissacarídeos sulfatados ricos

em galactose encontradas em algumas espécies de algas vermelhas e usadas em diversas

finalidades, como na fabricação de cosméticos, gelatina e meios de cultura. Os alginatos são

polímeros constituídos de monossacarídeos ácidos (ácido gulurônico e ácido manurônico), de

caráter viscoso, produzidos por certas espécies de algas pardas são utilizados na fabricação do

papel e como estabilizantes de creme dental e sorvete (TRIUS; SEBRANEK; LANIER, 1996;

MINHAS et al., 2002; RASMUSSEN; MORRISSEY, 2007).

No Brasil, a região costeira compreendida entre o estado do Ceará e o norte do

estado do Rio de Janeiro abriga a flora de algas mais diversificada do país. Com relação à

exploração de espécies para fins comerciais, a atividade de maior porte corresponde à coleta

de algas vermelhas no litoral do nordeste, principalmente na costa entre os estados do Ceará e

Paraíba. A coleta das algas vermelhas Glacilaria é realizada desde a década de 60 para a

produção de ágar e a Hypnea tem sido exportada como matéria-prima ou processada para a

indústria de carragenana (VIDOTI; ROLLEMBERG, 2004).

Algumas algas vermelhas são consumidas diretamente pelo homem utilizado para

a preparação de sushis como as algas Porphyra e Palmaria palmata. As rodófitas calcificadas

exercem um papel de cimentação indispensável à constituição e à sobrevivência dos recifes de

21

corais e podem ser exploradas para serem utilizadas como adubo calcário. Compostos

extraídos de algas vermelhas, como àgares e carragenanas são amplamente utilizados como

geleificantes ou espessantes (REVIERS, 2010).

As algas marrons são utilizadas para a alimentação do homem e de animais e

também como fertilizantes (FLEURENCE, 1999). São importantes fontes de ácidos algínicos,

cujas propriedades coloidais são aproveitadas, por exemplo na preparação de pomadas e

suspensões (VIDOTTI; ROLLEMBERG, 2004). As algas verdes são comumente utilizadas

como alimentos devido ao alto conteúdo de vitaminas, β-caroteno e minerais (FLEURENCE,

1999). Ulva e Enteromorpha são gêneros consumidas em países asiáticos e europeus

(QUEMENER; LAHAYANE; BOBIN-DUBIGEON,1997).

Em relação ao potencial farmacológico no que concerne a bioprodutos,

tendências recentes na pesquisa de drogas a partir de fontes naturais sugerem que as algas são

promissoras no fornecimento de novas substâncias bioativas (IOANNOU; ROUSSIS, 2009).

Já foram isolados, a partir de algas, agentes terapêuticos naturais que incluem classes de

compostos como terpenóides, ácido ribonucleico, proteínas, carboidratos, lipídios, entre

outros (FUSETANI, 2000) com as mais diversas atividades biológicas, tais como

antibacterianas, antioxidantes, antifúngicas, antimaláricas, antitumorais, anti-inflamatórias

entre outras (MAYER et al., 2013).

1.5 Polissacarídeos sulfatados de algas marinhas

Os carboidratos, também conhecidos como glicídios ou açúcares são

poliidroxialdeídos ou poliidroxicetonas, ou moléculas que formam estes compostos quando

hidrolisados, ocorrendo principalmente nos vegetais. A maioria dos carboidratos possui a

fórmula empírica (CH2O)n, além de alguns também possuirem nitrogênio, fósforo ou enxofre.

Os carboidratos estão divididos em monossacarídeos, dissacarídeos, oligossacarídeos e

polissacarídeos (NELSON; LEHNINGER; COX, 2008).

Na sua forma mais simples, os carboidratos são açúcares chamados de

monossacarídeos (ex. glicose, frutose) que podem se ligar com outros açúcares para formar

carboidratos mais complexos. A combinação de dois açúcares simples é definida como

dissacarídeo (ex. sacarose, maltose). Os carboidratos que são compostos por dois ou até seis

açúcares simples são chamados de oligossacarídeos, e aqueles com maior número de

monossacarídeos são denominados de polissacarídeos (ex. glicogênio, amidos de milho e

mandioca) (MELO et al.,1998; NELSON; LEHNINGER; COX, 2008).

22

Acreditou-se por muito tempo que os carboidratos tinham função apenas

energética no organismo humano, mas o estudo desses compostos permitiu a descoberta de

vários eventos biológicos como o reconhecimento e a sinalização celular, tornando possível

entender os mecanismos moleculares envolvidos em algumas doenças causadas por

deficiência ou excesso dessas moléculas. A combinação das diferentes funções bioquímicas de

cada uma dessas moléculas permite a integridade da célula e de todos os processos

metabólicos, fisiológicos e genéticos dos organismos vivos (POMIN; MOURÃO, 2006).

Os polissacarídeos sulfatados são macromoléculas complexas de amplo espectro

de ação devido ao fato de apresentarem uma estrutura química rica em grupos sulfato, o que

possibilita sua interação a um grande número de proteínas em solução (ARFORS; LEY,

1993). Apresentam ampla distribuição na natureza, podendo ser encontrados em

microrganismos, animais vertebrados e invertebrados e também em algas marinhas

(DIETRICH et al., 1985). Nestas, estão presentes como estrutura complexas, altamente

heterogêneas e muitas vezes ramificadas (MULLOY et al., 1994), sendo, entretanto até bem

pouco tempo consideradas ausentes nas plantas superiores ( ROCHA et al., 2004). Contudo,

foram encontrados galactanas sulfatadas em Ruppia maritima uma gramínia marinha

(AQUINO et al., 2005).

A matriz extracelular das algas marinhas encontram-se os polissacarídeos. Estes

polissacarídeos expressam estrutura heterogênea e complexa, e são componentes estruturais

da matriz extracelular das algas, recobrindo a parede celular de celulose (POMIN; MOURÃO,

2008). Formam mucilagens e parecem apresentar capacidade protetora contra a desidratação

em períodos de maré baixa. Ainda fornecem flexibilidade à estrutura da alga facilitando o

processo de captura de luz e nutrientes por estes organismos (PERCIVAL; MCDOWELL,

1967).

Os polissacarídeos podem variar na sua composição em função do grupo de algas

em que se encontram. Polissacarídeos encontrados nas algas vermelhas apresentam a

galactose como principal monossacarídeo, sendo, portanto, classificados como galactanas

(PERCIVAL; MCDOWELL, 1967; FREDERICQ; HOMMERSAND; FRESHWATER,

1996). Nas algas verdes os polissacarídeos sulfatados encontrados em maior quantidade são

compostos por unidades de D-manose e galactose (RAMANA; RAO, 1991), sendo

classificados como arabinogalactanas (PERCIVAL; MCDOWELL, 1967). Já os

polissacarídeos sulfatados abundantes das algas pardas, por terem a α-L–fucose como seu

monômero majoritário, são conhecidos como fucanas (PATANKAR et al., 1993; BLONDIN;

DE AGOSTINIZ, 1995; ROCHA et al., 2004).

23

Polissacarídeos de algas marinhas são substâncias naturalmente ativas, possuindo

importantes aplicações. Ágar, carragenanas e fucoidanas são bem conhecidos por terem vasta

aplicação na indústria alimentícia, farmacêutica e biotecnológica. Entretanto, o interesse pelos

polissacarídeos de algas marinhas é recente (PENGZHAN et al., 2003).

As galactanas sulfatadas estão presentes principalmente na forma de carragenanas

e agaranas e apresentam estrutura linear alternante de resíduos de β-D-galactopiranose 3-

ligadas e α-galactopiranose 4-ligadas, os quais estão na configuração D em carragenanas e na

configuração L em agaranas. Alguns resíduos podem estar na forma de anidrogalactose

(KNUTSEN et al., 1994; LAHAYE, 2001).

A Figura 1 mostra a estrutura básica das galactanas de algas marinhas, onde a

unidade A é sempre formada por (1→3) β-D-Galactopiranose e a unidade B pode consistir de

α-L Galactopiranose para agaranas e α-D-Galactopiranose para carragenanas.

Figura 1- Estrutura química básica de galactanas.

Fonte: BARROS, 2011.

O ágar é composto por unidades de agarose e unidades de agaropectina. A agarose

é um polissacarídeo neutro, caracterizado por uma estrutura linear de unidades repetidas do

dissacarídeo agarobiose (1→3)-β-D-galactose e (1→4)-3,6-anidro-α-L-galactose. Já a

agaropectina caracteriza-se como um polissacarídeo ácido contendo sulfato, metil, ácido

pirúvico e ácido D-glucurônico adicionado à agarobiose (DUCKWORTH; YAPHE, 1971).

O ágar tem a capacidade de formar gel devido à estrutura molecular em cadeia

24

com formação helicoidal, que produz uma rede capaz de reter considerável quantidade de

moléculas de água. As ligações de hidrogênio formadas entre os átomos de oxigênio presente

no polissacarídeo com moléculas de água são responsáveis pela estabilização da estrutura do

gel (LAHAYE; ROCHAS, 1991).

Os polissacarídeos sulfatados são conhecidos por modular uma série de

funções biológicas (MOURÃO; ASSREUY, 1995; POMIN; MOURÃO, 2006). Apesar da

imensa variedade de atividades, estudos mostram que as relações entre estrutura e função de

polissacarídeos sulfatados não são claramente estabelecidas devido a muitas dificuldades

relacionadas com a determinação mais precisa das suas estruturas (FERREIRA; NOSEDA;

DUARTE, 2006).

A complexidade na estrutura desses compostos é devido a diversas possibilidades

de ligações entre os monossacarídeos e à distribuição de grupamentos sulfato, portanto cada

polissacarídeo pode possuir conformação estrutural única (ROCHA et al., 2004). Deste modo,

a identificação de um novo polissacarídeo sulfatado vem sempre acompanhada de

perspectivas de descobertas de um novo fármaco a ser utilizado pela indústria farmacêutica.

1.6 Propriedades farmacológicas de polissacarídeos de algas marinhas

Polissacarídeos sulfatados são macromoléculas bioativas onde alguns dos grupos

hidroxila dos resíduos de açúcar são substituídos por grupamentos sulfato (PÉREZ-

RECALDE et al., 2014). O estudo dessas macromoléculas se justifica devido ao fato de

possuírem várias atividades biológicas importantes que despertam interesse em vários ramos

da ciência médica e biotecnologia de organismos aquáticos (RODRIGUES et al., 2009), tais

como antioxidante (COSTA et al., 2010), antimicrobiana (PAULERT, et al., 2005); antiviral

(CHOTIGEAT et al, 2004), antitumoral (WIJESEKARA; PANGESTUTI, 2011),

antiinflamatória e antinoceptiva (CHAVES et al., 2013; PEREIRA J. et al.; 2014);

anticoagulante (RODRIGUES et al., 2010). Diversas atividades biológicas dependem das

densidades de cargas, teor de sulfato, conformação da cadeia e peso molecular (PEREIRA et

al., 2005; FONSECA et al., 2008; ZHANG et al., 2008; RODRIGUES et al., 2010).

Estabelecer uma relação estre as estruturas dos polissacarídeos sulfatados e suas

bioatividades/ações têm sido um desafio devido à complexidade deste tipo de polímeros

(Tabela 1). A maioria destes polissacarídeos são heteropolímeros com diferentes substituintes

altamente ramificados nos diferentes carbonos componentes do açúcar. Além disso, a

composição e distribuição monossacarídica no interior da molécula e as ligações glicosídicas

25

entre os monossacarídeos podem ser bastante heterogênea que é uma deficiência real para o

estudo das suas estruturas (DE JESUS RAPOSO; DE MORAIS; DE MORAIS, 2015).

A atividade anticoagulante está entre as propriedades mais estudadas dos

polissacarídeos sulfatados de algas (RODIGUES et al., 2009) e foi relatada pela primeira vez

para fucoidanos isolados de F. vesiculosus por Springer et al.,(1957) que detectaram a

inibição da formação de coágulo de fibrina e atividade antitrombina. Desde então, os estudos

sobre fucanas de várias algas revelaram atividades anticoagulantes e antitrombóticas

(KUSAYKIN et al., 2008; POMIN; MOURÃO, 2008; JIAO et al., 2011).

Frações polissacarídicas sulfatadas da alga Gracilaria birdiae reduziram lesões

macroscópicas e microscópicas de lesões gastrointestinais induzidas pelo anti-inflamatório

naproxeno (SILVA et al., 2012). Atividade anti-inflamatória e analgésica de uma fração

polissacarídica da alga Digenea simplex obteve uma dose dependente na inibição de edema de

pata induzido por carragenana, e também teve uma redução na inflamação induzida por

dextrana, histamina, serotonina e bradicinina (PEREIRA J. et al., 2014). Além disso,

pesquisadores tem revelado que os açúcares extraídos das macroalgas podem agir na mucosa

do estômago, formando uma camada de revestimento e proteção contra o ácido gástrico o que

torna efetivo no tratamento para úlcera gástrica (BHAKUNI; RAWAT, 2005).

Polissacarídeos sulfatados da alga Gracilaria caudata mostraram efeito

antidiarreico na diarreia aguda (modelo induzido por óleo de rícino) e diarreia secretora

(modelo induzida pela toxina da cólera) (COSTA et al.,2015). Este estudo foi pioneiro e único

até o momento no uso de polissacarídeos sulfatados de origem marinha para o tratamento de

diarreia que indica que novos estudos devem ser realizados para verificar se polissacarídeos

de algas marinhas de outras espécies apresentam atividade antidiarreica. Nesse contexto, os

PST da B. triquetrum podem ter potencial famacológico antidiarreico.

26

Tabela 1 – Espécies de algas marinhas produzindo polissacarídeos e suas aplicações.

Fonte Unidade principal de açúcar Ação/aplicação

Rhodophyta

Cryptonemia crenulata Galactose Antiviral

Chondrus crispus Galactose, Anidrogalactose Antiviral, anticoagulante,

Antitrombótica

Nemalion helminthoides Manose Antiviral

Nothogenia fastigiata Xilose, galactose, manose Antiviral, anticoagulante

Champia feldmannii Galactose, Anidrogalactose Antitumoral

Phaeophyta

Dictyopteris delicatula Fucose Anticoagulante, antioxidante,

antitumoral, antiproliferativa

Lobophora variegata Galactose, fucose Anticoagulante,

antioxidante e antiinflamatório

Leathesia difformis Fucose Antiviral

Nemacystus decipiens Fucose Anticoagulante

Undaria pinnatifida Galactose, fucose, xilose, ácido urônico Antiviral, anticoagulante,

antitumoral, antiinflamatório,

imunomodulador

Chlorophyta

Caulerpa cupressoides Galactose, manose, Antiinflamatório,

Antinociceptivo

Caulerpa racemosa Galactose, glicose, arabinose, ácido urônico Antiviral, antitumoral

Capsosiphon fulvescens Manose, ácido glucurônico, galactose Imunomodulador

Enteromorpha intestinalis Ramnose, xilose, ácido glucurônico Antitumoral,

Imunomodulador

Ulva conglobata Ramnose, ácido urônico Anticoagulante

Fonte: DE JESUS RAPOSO; DE MORAIS; DE MORAIS, 2015.

27

1.7 Diarreia

A diarreia é um problema de saúde pública já que no mundo ocorrem cerca de

dois milhões de mortes por ano causadas por essa doença (WALKER et al.,2012). Essa

doença é caracterizada como distúrbio gastrointestinal por um aumento da frequência das

fezes, presença de três ou mais evacuações e mudança na consistência (AMOLE;

MOFOMOSARA; EKENE, 2010).

O conteúdo líquido é o principal determinante do volume e consistência das fezes,

refletindo um equilíbrio entre a entrada luminal (ingestão e secreção de água e eletrólitos) e a

saída ao longo do trato gastrointestinal. Patógenos e medicamentos podem alterar estes

processos, resultando em mudanças na secreção ou absorção de fluido pelo epitélio intestinal.

A motilidade alterada também contribui de uma maneira geral para este processo, assim como

a extensão da absorção paralela ao tempo de trânsito. Assim, a viscosidade do bolo fecal

depende basicamente da absorção de água e da intensidade da propulsão intestinal (VITALI et

al., 2006).

No processo diarreico observa-se uma redução da absorção ou uma hipersecreção

de água juntamente com um aumento da motilidade intestinal, que reduz a solidez das fezes.

Esta mudança no fluxo de água é basicamente devido a um aumento na secreção de íons

cloreto (Cl-) ou bicarbonato (HCO3

-) e uma inibição na absorção de íons Na

+ (sódio)

e Cl

-

(FIELD; SEMRAD, 1993; BESERRA, 2014).

O maior risco da diarreia é a desidratação. O excesso de perda de água e

eletrólitos nas fezes pode levar à desidratação, hiponatremia e hipocalecemia. A terapia de

reidratação oral exerce importante papel no tratamento da diarreia (MARTINEZ; BARUA;

MERSON, 1988). Tal tratamento, no entanto, não reduz o volume de fezes nem a frequência

de defecação (HARTLING, 2006).

1.7.1 Classificação da diarreia

A classificação clínica da diarreia é baseada na duração da mesma. A diarreia

aguda é geralmente autolimitada e tem duração menor que duas semanas. A diarreia que

persiste por 14 dias ou mais é classificada como diarreia persistente e, se os sintomas

persistirem mais de um mês, a diarreia é classificada como crônica (MATHAN, 1998).

A diarreia infecciosa aguda é definida como uma diarreia acompanhada de

infecção intestinal por um patógeno entérico conhecido (vírus, bactéria, parasita ou fungo). Os

28

patógenos que causam a infecção diarreica aguda são divididos em organismos invasivos e

não invasivos. É aceito que organismos não invasivos produzem diarreia aquosa através de

uma enterotoxina que afeta o intestino delgado, como por exemplo, a toxina da Cólera (CT) e

Escherichia coli. Os organismos invasivos, por sua vez, afetam primeiramente o intestino

grosso, invadem a mucosa e produzem uma resposta inflamatória e fezes sanguinolentas ou

mucóides, Shigella, Campylobacter, Salmonella e Clostridium difficile são exemplos

(DHAWAN; DESAI, 1996).

A diarreia persistente é definida como diarreia infecciosa aguda com duração de

14 dias ou mais. É responsável por altas taxas de morbidade e mortalidade em lactentes de

baixo nível socioeconômico em países em desenvolvimento (MATHAN, 1998). Sua etiologia

ainda não é totalmente conhecida o que acarreta em um tratamento difícil (GUERRANT et

al., 1992).

A diarreia do viajante é a situação clínica de pessoas que viajam de zonas mais

desenvolvidas para outras menos desenvolvidas. Pode apresentar de forma aguda ou crônica,

mas é majoritariamente infecciosa, sendo algumas bactérias responsáveis pela maior parte dos

casos em todo o mundo. Pode manifestar-se como diarreia aquosa ou disentérica e nas

crianças são particularmente frequentes os vírus como agentes etiológicos. Caracteriza-se por

aumento das dejeções para pelo menos o dobro da habitual com consistência pastosa ou

líquida. O tratamento compreende basicamente três medidas: hidratação, fármacos

antiperistálticos e antimicrobianos (ALEIXO, 2003).

Diarreia crônica é definida como diarreia prolongada por períodos superiores há

um mês. Uma abordagem clínica divide a diarreia crônica em síndromes de má-absorção (por

exemplo, spru tropical), diarreia crônica sem má-absorção (como a síndrome do intestino

irritável) e diarreia crônica do imunodeficiente. O spru tropical tem essa denominação por

ocorrer quase exclusivamente nas pessoas que vivem nos trópicos ou que visitam esta região

(MATHAN, 1998).

29

1.8 Modelos de diarreia

1.8.1 Diarreia induzida pela toxina da Cólera

A cólera apresenta grande poder de disseminação, sendo registrada em todos os

continentes (KAPER; MORRIS; LEVINE, 1995). Considerada uma doença reemergente,

continua impondo desafios tanto em função das características do agente, como pela

vulnerabilidade de grande parcela da população mundial que sobrevive em condições de

extrema pobreza (BRASIL, 2010).

É uma doença infecciosa intestinal, de transmissão predominantemente hídrica,

causada pela enterotoxina do Vibrio cholerae, bacilo gram-negativo, aeróbio ou anaeróbio

facultativo, isolado por Koch no Egito e na Índia, em 1884, inicialmente denominado de

Kommabazilus (bacilo em forma de vírgula) (KAPER; MORRIS; LEVINE, 1995). É um

microrganismo autóctone natural do ecossistema aquático e pode ser encontrado em forma

livre na água ou associado ao zooplâncton, ao fitoplâncton, às plantas e aos organismos

marinhos, como peixes, ocasionando a contaminação passiva da ostra e do mexilhão, no

processo de filtração da água que contenha plâncton (COLWELL; HUQ, 1994).

As manifestações clínicas ocorrem de formas variadas, desde infecções

inaparentes ou assintomáticas até casos graves com diarreia profusa, desidratação rápida,

acidose e colapso circulatório, devido a grandes perdas de água e eletrólitos corporais em

poucas horas, caso tais perdas não sejam restabelecidas de forma imediata (NITRINI et al.,

1997).

A severidade da infecção depende de muitos fatores, entre eles a resistência do

hospedeiro mediada pela acidez gástrica, seu estado imunológico e o tamanho do inóculo

ingerido (CLEMENS et al., 1989; GLASS et al., 1991; LONGO; FAUCI, 2014). O

tratamento da cólera consiste na reposição hidroeletrolítica adequada e imediata, de acordo

com o grau de desidratação apresentado e antibioticoterapia (SÃO PAULO, 2001).

A cólera é causada pela invasão tecidual do organismo através da produção de

toxina que inibe as trocas normais de água e eletrólitos culminando em diarreia (KAPER;

MORRIS; LEVINE, 1995). Sua patogenicidade é um processo complexo e envolve

numerosos fatores que auxiliam o V. cholerae a colonizar o epitélio do intestino delgado e

produzir a toxina da Cólera (CT). A infecção começa com a ingestão de água ou alimentos

contaminados com o V. cholerae. O período de incubação da cólera varia de algumas horas a

cinco dias após a ingestão de água ou alimento contaminado. Logo após o período de

incubação a transmissibilidade dura enquanto houver eliminação dos vibrios pelas fezes, em

30

geral poucos dias após a cura (NITRINI et al., 1997).

A CT consiste por duas subunidades: A (parte ativa) e B (pentamérica), que estão

ligadas covalentemente. Na subunidade B estão presentes lectinas, proteínas que se ligam a

carboidratos com alta afinidade e especificidade e participam de vários processos de

reconhecimento célula-célula e processos de adesão (Tabela 2), estas interagem com o GM1,

um gangliosídeo com galactose em sua estrutura (Figura 2) (NELSON; LEHNINGER; COX,

2008). Quando a subunidade B liga-se ao gangliosídeo GM1, ligações sulfidrilas que mantêm

unidas as duas subunidades se rompem, e a subunidade A ativa penetra na parede celular

atingindo o interior do enterócito que transfere, de modo irreversível, a ADP-Ribose à

proteína G, levando uma perda da capacidade desta de hidrolisar o GTP. A proteína G ADP-

ribolisada suprarregula a atividade da adenil ciclase; o resultado consiste no acúmulo

intracelular de altos níveis de AMP cíclico (AMPc) ( KAPER; MORRIS; LEVINE, 1995; DA

SILVA, 2013).

Nas células espitéliais do intestino, o AMPc inibe o sistema de tranporte absortivo

de sódio nas células das vilosidades e ativa o sistema de trasporte secretor de cloreto nas

células das criptas, eventos que levam ao acúmulo de cloreto de sódio no lúmem intestinal

(Figura 3). Como a água move passivamente para manter a osmolidade, ocorre o acúmulo de

líquido isotônico. Quando o volume de líquido excede a capacidade do restante do intestino

de reabsorbê-lo, há diarreia aquosa. A bomba de Na+

é preservada, o que permite a reabsorção

do sódio em presença de glicose, explicando a notável eficiência da reidratação oral no

tratamento da doença (COMSTOCK et al., 1995; KAPER; MORRIS; LEVINE, 1995; DA

SILVA, 2013).

31

Tabela 2 – As lectinas e os seus oligossacarídeos ligantes.

Família da Lectina Ligante

Planta

Concanavalina A Manα1-OCH3

Griffonia simplicifolia lectina 4 Lewis b (Leb) tetrassacarídeo

Aglutina do germe de trigo Neu5Ac(α2→3)Gal(β1→4)GlcGlcNAc(β1→4)GlcNAc

Ricina Gal(β1→4)GLC

Animal Galectina-1 Gal(β1→4)GLC

Proteína A ligada a manose Octassacarídeo de manose

Viral

Hemaglutinina do vírus influenza Neu5Ac(α2→6)Gal(β1→4)Glc

Proteína 1 do vírus polioma Neu5Ac(α2→3)Gal(β1→4)Glc

Bacteriano

Enterotoxina (LT) Gal

Toxina coléria Pentassacarídeo GM1

Fonte: NELSON; LEHNINGER; COX, 2008.

Figura 2- Estrura do gangliosídio GM1.

Fonte: Adaptação de Voet; Voet, 1995.

32

Figura 3- Ação da toxina da Cólera. 1. Movimento iônico normal, Na+ do lúmem para o

sangue, sem deslocamento líquido de Cl-.

2. Colonização e produção de toxina da Cólera.

3. Ativação da adenil ciclase pela toxina.

4. Movimento de Na+ bloqueado, movimento líquido de

Cl- para o lúmen.

5. Maciço deslocamento de água ára o lúmen.

Fonte: MADIGAN et al., 2004.

33

1.8.2 Diarreia induzida com óleo de rícino

Os laxativos mais utilizados no mundo são provenientes de fontes botânicas, o óleo

de rícino é um laxativo efetivo extraído das sementes de uma planta encontrada em várias

partes do mundo: Ricinus communis, Euphorbiaceae, uma mamoneira, a qual recebe outras

designações, conforme a região como carrapateira e abelmeluco (GAGINELLA; BASS, 1978;

GAGINELLA, 1994).

O óleo de rícino é amplamente empregado para a triagem de drogas com

propriedade antidiarreica. Uma das vantagens do modelo utilizando o óleo é a grande

reprodutibilidade de evacuação de fezes não formadas uma hora após a administração do

laxante (BORRELLI et al., 2006). Quando ingerido, é hidrolisado pelas lipases pancreáticas a

glicerol e ácido ricinoleico, sendo este último, por ser seu constituinte farmacologicamente

ativo, o responsável pela atividade diarreica do óleo (AKINDELE; ADEYEMI, 2006).

Vários mecanismos têm sido propostos para a diarreia induzida por óleo de rícino.

Estes incluem a inibição da Na+/K

+- ATPase intestinal, o que reduz a absorção de fluidos

normais (PHILLIPS et al., 1965); ativação da adenil ciclase com consequente aumento de

monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) na mucosa, o qual medeia o acúmulo de secreção

no intestino delgado e cólon e afeta a contratilidade do músculo liso intestinal (GAGINELLA;

BASS, 1978); estimulação da síntese de prostaglandinas, que por sua vez, promovem

vasodilatação, contração do músculo liso, aumento da secreção no intestino delgado e injúria

do epitélio (CAPASSO et al., 1986); além da estimulação da secreção de fator ativador de

plaquetas,um dos prováveis mediadores do dano intestinal induzido pelo óleo de rícino

(CAPASSO; TAVARES; BENNETT, 1992).

Pesquisas com células em cultivo sugerem que o ácido ricinoléico é um agonista

seletivo dos receptores de prostaglandinas EP3 e EP4, e que os efeitos farmacológicos de óleo

de rícino são mediados pela ativação de receptores EP3 sobre as células da musculatura lisa

intestinal. O ácido ativa o EP3, receptores acoplados a Proteína-G, que é ativado pela

Prostaglandina E2 (TUNARU et al.,2012). A ativação de receptores EP3 induz a contração do

músculo liso intestinal, ocasionando a diarreia (BRIJESH et al., 2009). Apesar do fato de

inúmeros mecanismos terem sido propostos para o efeito laxativo do óleo de rícino, ainda não

foi possível definir com clareza seu mecanismo de ação.

34

1.9 Medicamentos utilizados no tratamento da diarreia

Atualmente, não existe nenhum tratamento farmacológico eficaz para tratar a

diarreia. São usadas drogas antidiarreicas que reduzem os sintomas da diarreia como a perda

da consistência das fezes e o aumento da frequência de defecação e da massa fecal. Sua ação é

produzida através de efeitos sobre o trânsito intestinal, o transporte da mucosa, ou o conteúdo

do lúmen intestinal (RANG et al., 2007). Adsorventes, bismuto e os agentes que modificam o

transporte de líquidos e eletrólitos, como o maleato de zaldarida, são frequentemente

utilizados (SCHILLER; SELLIN, 2006).

As drogas mais usadas atualmente no tratamento da diarreia são os

anticolinérgicos e opióides. Anticolinérgicos funcionam através de seu efeito sobre a

motilidade intestinal, bloqueando a ligação do neurotransmissor acetilcolina ao seu receptor.

Alivia cólicas, espasmos do estômago e intestino e reduzem a secreção ácida. O seu uso é

limitado devido aos seus efeitos secundários: boca seca, hipertermia, aumento do tamanho da

pupila, visão turva, taquicardia, retenção urinária, constipação, dificuldade de concentração e

confusão mental (GURGEL, 2000).

Os opióides são os agentes antidiarreicos mais utilizados, diminuem o

peristaltismo em vários segmentos do intestino, inibe a secreção de fluidos, resultando na

diminuição do trânsito gastrointestinal e aumento da absorção de fluidos e eletrólitos do trato

gastrointestinal. A Loperamida é um derivado sintético da fenilpiperidina com uma potente

ação agonista do receptor µ-opióide, não apresenta efeitos sobre o SNC e é a principal escolha

popular para o tratamento da diarreia aguda indolor. Os efeitos colaterias mais comuns estão

relacionados com o impacto sobre a motilidade intestinal, incluído dor abdominal, inchaço,

náuseas, vômitos e constipação. As drogas antidiarreicas reduzem as características da

doença, porém todas possuem efeitos colaterais indesejáveis associados ao seu uso (GHOSH,

2005, GUARINO, 2008).

O tratamento para a diarreia frequentemente envolve o uso de antibióticos e os

microrganismos estão se tornando cada vez mais resistentes aos antibióticos tradicionais por

isso a necessidade de outros mecanismos de combater os efeitos adversos provovados pelas

infecções microbianas no trato gastrointestinal (KELLY, 2011). As soluções de reidratação

oral têm tido grande importância no salvamento de vidas e continuam sendo utilizadas.

Contudo, novos métodos para o tratamento da diarreia ainda estão sendo explorados

(SCHILLER; SELLIN, 2006).

35

A Organização Mundial de Saúde (OMS) e o Fundo das Nações Unidas para a

Infância (UNICEF) são exemplos de programas que incentivam o desenvolvimento de novos

tratamentos e a busca de novas terapias que utilizam produtos naturais por apresentarem

menos efeitos colaterais e menos índices de recidivas que as drogas existentes no mercado

(COSTA, 2015). Assim, as algas podem levar ao desenvolvimento de novas drogas, sendo

importante avaliá-las como alternativa terapêutica antidiarreica

36

2 OBJETIVOS

2.1 Geral

Determinar a estrutura química e avaliar a atividade antidiarreica em

camundongos dos polissacarídeos sulfatados totais (PST) da alga vermelha Bryothamnion

triquetrum utilizando modelos de diarreia induzida por óleo de rícino e toxina da Cólera.

2.2 Específicos

Realizar extração dos PST da alga marinha Bryothamnion triquetrum por digestão

com papaína;

Calcular o rendimento dos PST;

Determinar os teores de carboidratos, sulfato e proteínas dos PST;

Estimar a massa molar dos PST através de Cromatografia de Permeação em Gel

(GPC);

Determinar a estrutura química dos PST através de Espectroscopia de Absorção na

Região do Infravermelho com transformada de Fourier e por Ressonância Magnética

Nuclear (RMN) de próton (1H) e carbono (

13C);

Avaliar a atividade antidiarreica dos PST em modelo de diarreia induzida por óleo de

rícino em camundongos;

Avaliar o efeito dos PST no enteropooling e trânsito intestial induzido por óleo de

rícino em camundongos;

Avaliar a secreção e absorção de fluido intestinal em modelo de diarreia induzida pela

toxina da Cólera;

Examinar a possível interação dos PST com o receptor específico da toxina da Cólera

(GM1) e os PST com a toxina.

37

3. MATERIAS E MÉTODOS

3.1 Coleta e identificação da alga marinha

Exemplares da alga marinha vermelha Bryothamnion triquetrum (registrada sob o

número 2989 herbário ficológico do Laboratório de Ciências do Mar – Labomar,

Universidade Federal do Ceará) foram coletados na Praia de Flexeiras, município de Trairi,

Ceará, Brasil em julho/2013, durante maré baixa. Após a coleta, as algas foram transportadas

em recipiente térmico em baixa temperatura para o Laboratório de Algas Marinhas do

Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular (UFC). No laboratório, as algas foram

lavadas com água corrente e separadas de epífitas e/ou outros organismos incrustantes. Por

último, as algas foram novamente lavadas com água destilada e acondicionadas em sacos

plásticos devidamente etiquetados e armazenadas em temperatura de -20ºC, até posterior

utilização. O aspecto macroscópico da alga e sua classificação taxonômica podem ser

observados na Figura 4.

Figura 04- Aspecto macroscópico da alga marinha vermelha Bryothamnion triquetrum e sua

classificação taxonômica.

Fonte: Smithsonian tropical Research Isntitute, 2009.

Filo: Rhodophyta

Subfilo Eurhodophytina

Classe: Florideophyceae

Subclasse: Rhodymeniophycidae

Ordem: Ceramiales

Família: Rhodomelaceae

Gênero Bryothamnion

Epíteto específico: triquetrum

Nome botânico: Bryothamnion

triquetrum (S.G.Gmelin) M.A.Howe 1915

38

3.2 Animais

Foram utilizados camundongos albinos Swiss fêmeas (25-30g), no total de 6

animais por grupo (n=6) para os ensaios de efeito antidiarreico da fração polissacarídica

sulfatada da alga marinha vermelha Bryothamnion triquetrum em modelo de diarreia aguda

induzida por óleo de rícino e pela toxina da Cólera.

Os animais foram fornecidos pelo Biotério Central da Universidade Federal do

Ceará, e receberam água e alimentação ad libitum. Todos os animais foram colocados em

jejum de dezoito a vinte e quatro horas antes das realizações dos experimentos, com acesso a

água. Os ensaios realizados seguiram os princípios éticos, a biossegurança e o respeito da

experimentação animal; conduzidos de acordo com o Guide for Care and Use of Laboratory

Animals (National Institutes of Health, Bethesda, MD) e foram aprovados pelo Comitê de

Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Ceará sob o número de 11/2013.

3.3 Soluções e Reagentes

Todos os reagentes utilizados apresentavam grau de pureza e propriedades

analíticas adequadas. Os reagentes e soluções utilizadas foram:

Ácido fosfórico, acetato de sódio, ácido sulfúrico, cloreto de cetilpiridínio (CPC), cloridrato

de loperamida, Comassie G-250, EDTA, papaína, NaCl, etanol, galactose, nitrato de sódio

(NaNO3), etileno glicol, 2,2-dimetilsilapentano-5-sulfonato de sódio (DSS), óleo de rícino,

solução de carvão ativado (suspensão a 10% de carvão em 5% de goma arábica), ketamina,

xilazina, tampão fosfato-salino (PBS), Tween 20, tetrametilbenzidina (TMB).

3.4 Extração dos polissacarídeos sulfatados totais (PST)

O mecanismo de extração do PST da alga marinha Bryothamnion triquetrum foi

realizado de acordo com Farias et al. (2000), com algumas modificações. Primeiramente a

alga foi despigmentada em recipiente com água e exposta ao sol, em seguida desidratada em

temperatura ambiente e macerada em nitrogênio líquido e colocada em contato com tampão

de extração acetato de sódio 0,1 M pH 5,0 contendo EDTA 5 mM e cisteína 5 mM e 510 mg

de papaína bruta, na proporção de 5g de alga para 250mL de tampão. A mistura foi incubada

por 6 horas a 60°C em banho-maria e em seguida, o material foi filtrado em malha fina e o

filtrado centrifugado (8000 x g; 30 min; 5 °C). Os polissacarídeos presentes no sobrenadante

39

do material centrifugado foram precipitados através da adição de 16 mL de uma solução a

10% de cloreto de cetilpiridínio (CPC) mantendo-se a mistura por 24 horas à temperatura

ambiente. Logo após a precipitação, o material foi novamente centrifugado (8000 x g; 30 min;

25 °C) e o sobrenadante descartado. O precipitado foi lavado com 610 mL de solução a 0,05%

de CPC, centrifugado (8000 x g; 30 min; 5 °C), e depois dissolvido em 172 mL de solução

NaCl 2 M : etanol 80% (100:15; v/v). Os polissacarídeos foram novamente precipitados com

adição de etanol P.A (305 mL) por 24 horas a 4°C. Após a precipitação o material foi

centrifugado novamente. Os polissacarídeos obtidos foram dialisados exaustivamente contra

água destilada e liofilizados. A Figura 5 esquematiza a extração dos PST da alga marinha

Bryothamnion triquetrum.

40

Figura 5- Esquema de extração enzimática dos PST da alga vermelha Bryothamnion

triquetrum.

Lavagem com CPC 0,05% seguida

de centrifugação a 8000 x g, 5°C,

30min.

Extração em tampão acetato 0,2M

pH 5,0 contendo EDTA 5mM,

cisteína 5mM e papaína; a 60°C

por 6h

Filtração em malha fina

Centrifugação a 8000 x g,

5°C, 30min.

Resíduo Sobrenadante

Precipitação com CPC 10%

e centrifugação a 8000 x g,

5°C, 30min.

Sobrenadante Precipitado

Dissolução em

NaCl 2M : etanol

80% (100:15, v/v)

Precipitação com

etanol P.A por

24h a 4° C

Diálise e liofilização

Polissacarídeos

sulfatados

totais (PST)

41

3.5 Rendimento

Para cálculo do rendimento dos PST obtidos em relação ao peso de alga utilizado

para a extração foi calculado utilizando a seguinte fórmula:

3.6 Caracterização de composição química

3.6.1 Determinação de Carboidratos Totais

A quantificação dos carboidratos totais foi realizada seguindo o método de

Albalasmeh; Berhe; Ghezzehei (2013). A partir de uma solução estoque de 1 mg/mL de PST

foram realizadas três diluições em proporções diferentes: 1:10, 1:20 e 1:30. Em seguida, 1 mL

de cada diluição foi separado em tubos de ensaio para posterior adição de 3 mL de ácido

sulfúrico concentrado, seguido de agitação por 30 segundos. Posteriormente, a solução foi

colocada em banho de gelo por 2 minutos até atingir a temperatura ambiente, tendo em vista a

mistura reacional ser bastante exotérmica. Finalmente, foi feita a leitura de absorbância a 315

nm em um espectrofotômetro ultravioleta (UV). Todas as concentrações foram realizadas em

triplicata. Foi realizada a curva padrão de galactose substituindo os polissacarídeos por uma

solução de galactose (10 a 100 µg/mL), permitindo assim a quantificação dos PST por

correlação com a curva de calibração.

3.6.2 Determinação de proteínas

O conteúdo de proteínas contaminantes foi determinado através do método

proposto por Bradford (1976). A solução de Bradford foi realizada contendo: 50,0 mg de

Comassie G-250 que foram dissolvidos em 25,0 mL de álcool etílico e agitada durante 1 hora

em erlenmeyer envolto com papel alumínio. Em seguida, adicionaram-se 50,0 mL de ácido

fosfórico 85%. O volume foi então aferido em balão volumétrico para um volume de 500 mL

com uso de água destilada. A solução resultante foi filtrada três vezes com papel de filtro no

escuro e armazenada em frasco âmbar à temperatura ambiente.

Foi realizada a confecção de uma curva padrão com Albumina Sérica Bovina

(BSA) através da mistura de 1,0 mL de solução de BSA em diferentes concentrações (5 a 50

Rendimento (%) = massa (g) do material seco obtido

massa (g) de macroalga seca utilizada para o

processo de extração

x 100 (1)

42

μg/mL) com 2,5 mL de solução de Bradford. Após 10 minutos, as soluções foram analisadas

em espectrofotômetro (SPECTRONIC INSTRUMENTS, modelo SPECTRONIC® 20

GENESYSTM

) em um comprimento de onda de 595 nm. Todas as concentrações foram

analisadas em triplicatas.

Para quantificar o teor de proteínas da amostra, foram utilizadas soluções de 1

mg/mL de polissacarídeos. A partir dessas soluções, 1 mL foi adicionado a 2,5 mL de solução

de Bradford e após 10 minutos foram realizadas as leituras em espectrofotômetro a 595 nm. A

análise foi realizada em triplicata. A estimativa das concentrações de proteínas foi realizada

através da correlação entre as leituras obtidas das soluções contendo as amostras e as da curva

padrão de BSA.

3.6.3 Determinação de sulfato e carbono

O teor de sulfato livre e carbono nos polissacarídeos extraídos foram

determinados por microanálise elementar (Equipamento Perkin-Elmer CNH 2400). O grau

de sulfatação foi determinado de acordo com método descrito por Melo et al., (2002), a

partir dos percentuais de carbono (%C) e enxofre (%S) obtidos.

O método de quantificação baseado na equação abaixo é possível através da

estrutura dos PST, que são formados por dissacarídeos contendo um β-D-galactopiranose

(Unid A) com outro α-D-galactopiranose ou 3,6-anidrogalactose (Unid B), considerando

que o teor de sulfatação é definido como o número de OSO3-, ou átomos de enxofre, por

unidade dissacarídica repetitiva, com 12 atómos de carbono. Logo, o número 12

multiplicado pela massa atômica do carbono corresponde ao número de carbono por

unidade dissacarídica.

Teor de sulfato % =

S%

massa atômica do S

C%

massa atômica do C x12

= 4,5x (S% / C%) (2)

43

3.6.4 Determinação da massa molar

O pico da massa molar (MPK) foi realizada por cromatografia de permeação em

gel (GPC) com equipamento Shimadzu a temperatura ambiente usando uma coluna

Ultrahydrogel linear (7,8 x 300 mm) e fluxo 0,5 ml/min. Solução dos PST com concentração

de 3mg/mL foi preparada em NaNO3 0,1M como fase móvel e filtrada em membrana de

acetato de celulose com poros de 0,45µL. Foi injetado 50 µL da amostra e do padrão. Para a

construção da curva de calibração foram utilizadas pululanas, polissacarídeos neutros de

cadeia linear, de diferentes massas molares em intervalo de grandeza de 103 a 10

6g/mol. A

equação obtida a partir da curva de calibração foi:

Log MPK = 14,6827 – 1,06967 Ve (3)

R= 0,99254

Onde Ve é o volume de eluição em mL e R é o coeficiente de correlação linear.

3.6.5. Espectroscopia de absorção na região do infravermelho

O espectro dos PST foi obtido através da dispersão das amostras em pastilhas de

KBr e para obtenção do espectro foi utilizado um Espectrofotômetro de Infravermelho com

transformada de Fourier da Shimadzu, modelo FTIR-8300, apresentando uma janela espectral

de 400 a 4000 cm-1

.

3.6.6. Ressonância Magnética Nuclear (RMN)

Os espectros de 13

C e 1H de RMN foram obtidos no Centro Nordestino de

Aplicação e uso da Ressonância Magnética Nuclear (CENAUREMN) da UFC em

espectrômetro Bruker Avance DRX 500. Os PST da alga marinha Bryothamnion triquetrum

foram dissolvidas em água deuterada D2O a 2,5% m/v. A análise dos PST foi realizada a 60 ºC

por 12 horas, utilizando 2,2-dimetilsilapentano-5-sulfonato de sódio (DSS) como padrão

interno (0,00 ppm por 1H).

44

3.7 Atividade dos PST da alga Bryotamnion triquetrum no modelo de diarreia.

3.7.1 Modelo de diarreia induzida por óleo de rícino em camundongos

O modelo de diarreia induzida por óleo de rícino foi realizado de acordo com o

método descrito por Mascolo et al., (1994) com algumas modificações. Os camundongos

Swiss fêmeas (n=6) foram divididos em grupos e pré-tratados com os PST (1, 3, 10 e 30

mg/Kg v.o.) ou loperamida (IMOSEC®,

, Cloridrato de loperamida, Jansen-Cilag Farmacêutica

LTDA) (5 mg/Kg v.o.), droga padrão para o tratamento da diarreia. A diarreia foi induzida

pela administração do óleo de rícino (10 mL/Kg, v.o.) 60 minutos após o pré-tratamento. Os

grupos controles receberam apenas solução salina (0,9%, 2,5mL/Kg, v.o.) ou salina + óleo de

rícino. Imediatamente após a administração do óleo de rícino os camundongos foram

colocados em caixas forradas com papel absorvente e observados durante 3 horas, por um

observador alheio ao tratamento dos grupos, para detectar a presença de fezes diarreicas.

Foram observadas a massa total de saída de fezes (mg) e o número total de fezes diarreicas

(mg) que foram excretados por cada grupo nesse período de tempo. O resultado do grupo de

controle foi considerado como 100%. A percentagem de inibição da defecação e diarreia foi

calculada como se segue:

Onde A indica a massa média de defecação causada por óleo de rícino; B indica a

massa média de defecação (ou média de fezes diarreicas) após o tratamento com loperamida

ou PST.

Escores foram atribuídos utilizando o método de Carlo et al., (1994), para a

presença de diarreia definida como a presença de fezes mal formadas de aspecto úmido/fluido

na porção proximal da cauda do animal onde foi atribuído a cada camundongo escores de 0 a

3 onde: 0= ausência de diarreia; 1= eliminação de fezes de aspecto úmido; 2= eliminação de

fezes de aspecto pastoso em pequena/moderada quantidade e 3 = eliminação de fezes de

aspecto fluido ou pastoso em grande quantidade. A dose mais eficaz foi utilizada para os

experimentos seguintes.

% Inibição de defecação

(e %de inibição de fezes =

diarreicas)

(A - B)

A

x 100 (3)

45

3.7.2 Avaliação do acúmulo de fluido intestinal (enteropooling) induzido por óleo de rícino

em camundongos

O modelo de enteropooling induzido por óleo de rícino foi utilizado para avaliar o

acúmulo de fluido intestinal gerado pelo processo diarreico, pelo método de Robert et al,.

(1976) com algumas modificações. Camundongos Swiss fêmeas (n=6) foram divididos em

grupos e foram privados de alimento durante 18 horas antes do experimento, com livre acesso

à água. Os animais foram pré-tratados com a dose mais eficaz dos PST (10 mg/Kg, v.o.) ou

loperamida (5 mg/Kg, v.o.) enquanto que o grupo de controle recebeu solução salina. Todos

os grupos foram administrados por gavagem. Após 60 minutos, todos os grupos foram

tratados com óleo de rícino (10 mL / kg, vo). Após 3 horas, os camundongos foram

eutanasiados, o intestino delgado a partir do piloro ao ceco foi isolado e os conteúdos

intestinais foram medidos por tubo de ensaio graduado. A atividade de cada tratamento foi

expressa como percentagem de inibição (%) do volume do fluido intestinal e foi calculado

por:

Onde A representa a média do volume de fluido intestinal após a administração de

óleo de rícino; B representa o volume médio do fluido intestinal, após tratamento com

loperamida ou PST.

3.7.3 Trânsito intestinal induzido por óleo de rícino

O trânsito intestinal foi medido utilizando o teste de carvão ativado (CARLO et al.,

1994) para avaliar o efeito dos PST na redução da motilidade gastrointestinal no modelo de

diarreia induzida por óleo de rícino. Camundongos Swiss fêmeas (n=6) foram privados de

alimento durante 18 horas antes do experimento, com livre acesso à água. Todos os grupos

receberam óleo de rícino (10 mL/kg, vo) para induzir a diarreia e, trinta minutos mais tarde,

foram tratados oralmente com solução salina (grupo controle), PST (10 mg/kg), ou de

loperamida (5 mg/kg). Uma hora após a última administração do fármaco, todos os animais

receberam uma suspensão de carvão ativado (0,2 mL de 10% de carvão ativado em suspensão

% Inibição do volume do fluido intestinal= (A - B)

A

x 100 (4)

46

em 5% de goma-arábica) por gavagem. Vinte minutos mais tarde, todos os animais foram

eutanasiados, e a distância percorrida pelo carvão ativado (marcador) no intestino a partir do

piloro ao ceco foi medida e expressa em percentagem de distância percorrida, onde:

Onde A representa a média da distância percorrida pelo carvão ativado e B

representa o comprimento total do intestino.

3.7.4 Avaliação da secreção de fluido intestinal induzida pela toxina da Cólera em

camundongos

Camundongos Swiss fêmeas (n=6) foram privados de alimento durante 24 horas

antes do experimento, com livre acesso à água. Inicialmente os camundongos foram pré-

tratados com PST (10 mg/kg) ou solução salina por gavagem. Os animais foram anestesiados

por via intraperitoneal com a combinação de cloridrato de xilazina (5 mg / kg) e cetamina (60

mg/kg). Uma hora mais tarde, uma laparotomia mediana foi realizada, uma incisão na pele e,

em seguida, o peritônio para visualizar e expor o intestino delgado. Uma porção do jejuno foi

isolada e fechada com laços duplos para formar uma alça intestinal medindo

aproximadamente 2-3 cm (TRADTRANTIP; KO; VERKMAN, 2014).

Nas alças intestinais foram inoculadas com uma solução tampão fosfato-salino

(PBS; 100 µL; grupo controle) ou PBS com toxina da Cólera (CT) (1 µg/alça; grupo

experimental). As alças intestinais foram devolvidas para a cavidade abdominal, e a incisão

abdominal foi fechada com suturas permitindo que os camundongos se recuperem da

anestesia dentro das caixas. A temperatura corporal dos camundongos foi mantida em torno

de 36 a 38º C com a ajuda de uma lâmpada incandescente mantida sobre as caixas. Quatro

horas após a anestesia, os camundongos foram eutanasiados, e as alças fechadas foram

rapidamente removidas. A secreção de fluido foi medida indiretamente como a relação do

peso da alça / comprimento, expresso em g/cm.

% Distância percorrida pelo marcador = A

B

x 100 (5)

47

3.7.5 Avaliação da absorção de fluido intestinal induzida pela toxina da Cólera em

camundongos

Para estudar o efeito dos PST na absorção de fluido intestinal, camundongos

Swiss fêmeas (25-30 g) foram privados de alimentos durante 24h antes do experimento, com

livre acesso à água. Inicialmente os camundongos foram anestesiados com cloridrato de

xilazina (5 mg / kg) e cetamina (60 mg / kg) por injeção intraperitoneal. Alças intestinais

fechadas foram geradas como descrito na secção 4.7.4. Nas alças foram inoculados com 200

µL de PBS (controle negativo), PBS contendo glicose 10 mM (controle positivo para a

absorção de fluidos), ou PBS contendo PST (10 mg/kg), tal como descrito por Tradtrantip,

Ko, Verkman, 2014. As alças intestinais foram reintroduzidas na cavidade abdominal, a

incisão abdominal foi fechada com suturas, e os camundongos ficaram a se recuperar da

anestesia. Trinta minutos após a inoculação das alças, os animais foram eutanasiados, a

cavidade abdominal foi reaberta, e a alça intestinal fechada foi removida e pesadas com e sem

o conteúdo luminal e o peso das secreções foi calculado pela subtração dos dois valores. A

percentagem de absorção de fluido foi medida indiretamente através da relação do peso da

alça / comprimento.

3.7.6 Interação dos PST com receptor e com a CT – GM1 ELISA

A atividade de ligação dos PST com o receptor e a CT foi analisada por Ensaio de

imunoabsorção ligado a enzima GM1-gangliosídio – GM1 ELISA como descrito por Saha,

Das, Chaudhuri (2013). O controle negativo não tem GM1 adicionado. Então foram

adicionados 100 µL de uma solução contendo GM1 de cérebro bovino (2 µg/mL) em PBS

(Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) a placas de microtitulação (Global Plast, China) e

incubadas overnigth a temperatura ambiente. Locais que não foram ligados com a solução

GM1 em PBS foram bloqueados pela adição de 200 µL de BSA (1% w/v dissolvido em PBS,

albumina de soro bovino, Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA), e incubou-se a placa durante 30

minutos a 37 °C em seguida, as placas foram lavadas três vezes com PBS contendo 0,05% v /

v de Tween 20 (etapa de lavagem). As amostras que contêm a toxina da Cólera (CT) (Sigma-

Aldrich, St. Louis, EUA), com ou sem diferentes concentrações dos PST (1 a 300 µg/mL)

foram diluídas em série, adicionadas a placas de microtitulação e incubou-se à temperatura

ambiente durante 2 h. Após um passo de lavagem, 100 µL de anti-soro apropriado, diluído 1:

2000 em PBS foram adicionados. Para o ELISA GM1, os anticorpos utilizados foram o

48

anticorpo anti-toxina da cólera produzido em coelhos (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA),

seguido de anti-imunoglobulina de coelho conjugada com Horseradish peroxidase produzido

em cabras (GE Healthcare, Amersham Place, UK ). As placas foram então incubadas durante

1 hora à temperatura ambiente, lavou-se e incubou-se com a solução de 3, 30, 5, 50-

tetrametilbenzidina (TMB) (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) durante 15 min à temperatura

ambiente. A intensidade de cor foi medida a 492 nm no leitor de ELISA (Bio-Rad). Cada

experimento foi efetuado em triplicata e validado contra uma curva padrão de concentrações

conhecidas (100 a 1,56 ng/mL) de CT e foi utilizada para estimar a quantidade de CT nos

poços.

3.7.7 Análises estatísticas

Os testes estatísticos foram realizados com software Graphpad Prism (versão 5.0).

Os resultados são representados como a média ± SEM. A significância estatística das

diferenças entre grupos foi determinada por análise de variância (ANOVA) e o teste de

Student-Newman-Keuls. Para estudar a fluidez das fezes, foi utilizado o teste não paramétrico

de Kruskal-Wallis, seguido do teste de Dunn para comparações múltiplas. As diferenças

foram consideradas significativas quando P <0,05.

49

4 RESULTADOS E DISCUSSÕES

4.1 Extração e Rendimento dos PST

Várias metodologias podem ser empregadas para a extração de polissacarídeos

sulfatados de algas marinhas, tais como aquosas, enzimáticas, básicas e ácidas. Contudo, a

extração aquosa com digestão enzimática é capaz de eliminar contaminantes protéicos

(PERCIVAL, McDOWELL, 1967). Desse modo, a extração de polissacarídeos sufatados de

B. triquetum foi realizada em tampão acetato contendo a protéase papaína, com o intuito de

reduzir a presença de resíduos proteicos nos polissacarídeos isolados.

Foram obtidos 360 mg dos PST a partir de 5 g de massa seca da espécie em

estudo, correspondendo a um rendimento de 7,2 %. O rendimento obtido nesse estudo está em

conformidade com os valores encontrados para outras espécies de algas marinhas vermelhas

da costa brasileira, que apresentaram rendimento variando de 2,4 a 46% (MARINHO-

SORIANO; BOURRET, 2003). O percentual de recuperação de polissacarídeos da alga

Gelidium crinale foi de 2,4% (PEREIRA et al., 2005), enquanto para a espécie Brotryocladia

occidentalis foi de 4% (FARIAS et al., 2000). Vanderlei et al (2011) obtiveram rendimento de

4,66% para Gracilaria birdie, ao passo que para a alga Halymenia pseudofloresia o

rendimento foi de 40,5% (RODRIGUES et al., 2009) e para Halymenia sp. 46%

(RODRIGUES et al., 2010).

A espécie de alga, a metodologia empregada para a extração de seus

polissacarídeos, fatores fisiológicos, estágio de vida, variações sazonais e mesmo o local

de origem das espécimes são fatores que podem afetar o rendimento de polissacarídeos

(MARINHO-SORIANO; BOURRET, 2003). O rendimento dos PST obtido nesse estudo

para a alga B. triquetrum demonstra um resultado coerente comparando com os

rendimentos de outras espécies de algas marinhas (Tabela 3).

50

Tabela 3- Rendimento de polissacarídeos sulfatados em diferentes espécies de algas

vermelhas.

Espécies Local Rendimento

(%)

Referência

Bryothamnion triquetrum Brasil 7,2% Presente estudo

Acanthophora muscoides Brasil 11,6 QUINDERÉ et al., 2013

Agardhiella ramosissima Brasil 45.2 BATISTA et al., 2014

Gracilaria birdiae Brasil 6,50 MACIEL et al., 2008

Gracilaria birdiae Brasil 4,66 VANDERLEI., 2011

Gracilaria caudata Brasil 32,80 BARROS et al., 2013

Gracilaria córnea Brasil 21,40 MELO et al., 2002

Gracilaria edulis Tailândia 10,90 PRAIBOON et al.,2006

Gracilaria fisheri Tailândia 13,30 PRAIBOON et al.,2006

Solieria filiformis Brasil 19,14 DE ARAÚJO et al., 2011

4.2 Análises da composição química

O teor de galactose dos PST de Bryothamnion triquetrum foi de 87%, calculada a

partir de curva de calibração de galactose. Valores mais baixos foram encontrados para outras

espécies de algas vermelhas, como Agardiella ramosissima , que mostrou um teor de açúcar

de 64,4 % (BATISTA et al., 2014), Gracilaria ornata com teor de açúcar variando entre

33,14 e 62,20 (AMORIM et al.,2012), Gracilaria birdeae o teor de açúcar oscilou entre 30,8

e 68,2% (VANDERLEI et al., 2011), em Solieria chordalis com valor de 51,58%

(STEPHANIE et al.,2010). A quantidade de carboidrato pode variar em função da

metodologia empregada na determinação dessas moléculas (RODRIGUES, 2011).

As leituras de absorbância de proteínas das soluções contendo PST ficaram

abaixo do poder de detecção do aparelho utilizado, o que demonstra que o material obtido

pela extração possui apenas traços de proteínas.

51

Teores de carbono (C) e enxofre (S) foram analisados por microanálise e

obtiveram como resultado 33,58% e 2,1%, respectivamente. Então foi determinado o grau

de substituição por grupamentos sulfato dos PST, sendo encontrado grau de sulfatação

igual a 0,28. Esse valor indica um baixo grau de sulfatação na amostra que é característica

de agarocolóides (MELO et al., 2002).

4.3 Determinação da massa molar

A distribuição de massas molares dos polissacarídeos extraídos de Bryothamnion

triquetrum foi estimada através de Cromatografia de Permeação em Gel (GPC). Para a

construção da curva de calibração foram utilizadas pululanas, homopolissacarídeos lineares

isolados do fungo Aureobasidium pullulans (LEATHERS, 2003) de diferentes massas

molares, em intervalo de grandeza de 103 a 10

6 g/mol.

O perfil cromatográfico dos PST (Figura 6) apresentou um perfil polidisperso

(pico largo), característico de polissacarídeos naturais. O cromatograma mostra um único

pico, comportando-se como um sistema homogêneo, com volume de eluição de 9,25 mL no

seu ápice, cuja massa molar do pico foi estimada em 61,4 kDa, valor menor que observado

para os polissacarídeos de outras espécies de algas marinhas vermelhas; como Gracilaria

caudata com massa molar de 250 kDa (BARROS et al., 2013) e como Gracilariopsis persica

de 222 kDa (SALEHI et al., 2011).

Polissacarídeos são polímeros que não apresentam massas molares precisamente

definidas, e sim, massas molares médias. Isso se deve ao fato destes compostos geralmente

serem polidispersos, apresentando uma distribuição de espécies moleculares quase idênticas

em estrutura, com variação apenas no tamanho da cadeia. (STANLEY, 1995).

52

Figura 6- Perfil cromatográfico dos PST extraídos da alga Bryothamnion triquetrum em

cromatografia de permeação em gel.

4.4 Espectroscopia de absorção na região do infravermelho

A espectroscopia de absorção na região do infravermelho (FT-IR) é uma técnica

bastante utilizada para caracterização estrutural de compostos químicos, principalmente de

origem natural. Além de necessitar de pequenas quantidades de amostras (miligramas), essa

técnica é um método não agressivo, rápido e de alta confiabilidade. Portanto, é uma técnica

útil na identificação de componentes estruturais em polissacarídeos (PEREIRA et al., 2011). A

FT-IR permite sugerir atribuições estruturais características de compostos químicos. O

espectro de infravermelho de uma determinada molécula é bastante característico e pode ser

utilizado como uma assinatura química para a mesma (SOLOMONS, 2001).

O espectro de FT-IR para os PST da alga marinha Bryothamnion triquetrum

(Figura 7) na região entre 1400 e 700 cm-1

representa bandas características de polissacarídeos

tipo agarose, onde unidades de -D- galactose 3-O ligado encontram-se conectadas a unidades

53

de 3,6-anidro--L-galactose 4-O ligado. (LAHAYE, 1989; MOLLET; RAHAOUI;

LEMOINE, 1998; PEREIRA J. et al, 2014, ROCHAS; LAHAYE; YAPHE, 1986; CHOPIN;

WHALEN, 1993; PRADO-FERNÁNDEZ et al., 2003, MACIEL et al, 2008, MELO et al.,

2002). As unidades de 3,6-anidro--L-galactose podem ser substituídas na posição 6 por

grupamentos sulfato, os precursores biogênicos da 3,6-anidro--L-galactose (REES, 1961).

Figura 7- Espectros de FT-IV em pastilhas de KBr dos PST extraídos da alga Bryothamnion

triquetrum na região e número de onda de 1400 - 700.

As bandas em 1376 e 1250 cm-1

são devido à presença de ésteres de sulfato e o

esqueleto básico de galactanas é observado na banda em 1070 cm-1

(CHRISTIAEN;

BODARD, 1983; MACIEL et al., 2008; MOLLET; RAHAOUI; LEMOINE, 1998; BARROS

et al., 2013). A banda característica do segmento C-O-C da unidade 3,6-anidro--L-galactose

está presente em 931 cm-1

. A região entre 800 e 850 cm-1

em polissacarídeos de algas são úteis

na identificação da posição de grupos sulfato. A presença de uma banda de baixa intensidade

em 819 cm-1

pode ser atribuída à presença de ésteres de sulfato em C-6 na molécula

(PRADO-FERNÁNDEZ, 2003; ROCHAS;LAHAYE; YAPHE, 1986).

54

Nenhuma banda significativa foi observada em 850, 830 e 805 cm-1

, indicando a

ausência de substituição por sulfato nos carbonos C-4 e C-2 de -D- galactose e C-2 de 3,6-

anidro--L-galactose (PEREIRA J. et al, 2014; ROCHAS; LAHAYE; YAPHE, 1986;

CHOPIN; WHALEN, 1993; PRADO-FERNÁNDEZ, 2003, MACIEL et al, 2008, MELO et

al., 2002).

4.5 Ressonância Magnética Nuclear

Análises de RMN 1D e 2D foram utilizadas para investigar a estrutura do

polissacarídeo da espécie Bryothamnion triquetrum. O RMN de 1H é mostrado na Figura 8.

O sinal do próton anomérico α foi de δ 5,13 atribuído à 3,6 α - L- anidrogalactose ( LA ). A

H-1 de β - D - galactose ( L ) está ligado à 3,6 α-L- anidrogalactose em δ4,56. O espectro de

13C de B. triquetum (Figura 9 A) na região entre 90 e 110 ppm apresenta dois sinais

principais em δ 102.5 e δ 98.4, os quais foram assinalados baseado em dados da literatura

como C-1 de β-D-galactose ligado a 3,6 α-L-anidrogalactose. O sinal de baixa intensidade em

δ 98.8 pode corresponder a -L-galactose-6-sulfate (LAHAYE et al, 1989; MACIEL et al.,

2008, MILLER; FURNEAUX, 1997; USOV; YAROTSKY; SHASHKOV,

1980; VALIENTE, 1992).

Evidência de sinal O-CH3 em δ 59.15 foi observado neste espectro, indicando que

uma quantidade significante de resíduo de açúcar O-metilado está presente neste

polissacarídeo. O sinal O-CH3 foi confirmado pelo espectro de DEPT 135 (Figura 9B), onde

os carbonos CH e CH3 apresentam amplitude oposta aos carbonos CH2. O espectro de DEPT

do polissacarídeo de B. triquetum indica a presença de dois carbonos CH2 em δ 71.9 e δ 69.5.

Nenhum sinal detectável de carbono CH2 foi observado na região de δ 60-62, característica de

carbonos primários (C6) não substituídos. Baseado nesta informação, podemos inferir que o

sinal em δ 71.9 é devido à unidade β-D-galactose O-metilada no carbono 6 (G6M) e o sinal

em δ 69.5 foi atribuído ao C6 da unidade 3,6-anidro--L-galactose (LA).

Baseado nas correlações H/C observadas no espectro de HSQC (Figura 10) e em

dados da literatura (LAHAYE et al., 1989; MACIEL et al., 2008, MILLER; FURNEAUX,

1997, USOV; YAROTSKY; SHASHKOV, 1980; VALIENTE, 1992) os assinalamentos de

carbono e hidrogênio para o polissacarídeo de B. triquetum estão descritos na Tabela 4. O uso

da técnia de HSQC permite também detectar a presença de sinais de baixa intensidade não

observados em no espectro de 13

C NMR. A correlação em δ 3.80/61.4 é atribuída a baixa

55

proporção de β-D-galactose (G) e em δ 4.19/67.5 é devido à unidade -L-galactose-6-sulfato

(LA6S).

Figura 8- Espectro de RMN do 1H do polissacarídeo da alga Bryothamnion triquetrum em

solução de D2O.

BT.carla.001.esp

6 5 4 3 2 1 0Chemical Shift (ppm)

1.000.70

5.1

3

4.6

54.5

5

4.0

8

3.8

33.7

63.6

83.6

3 3.5

03.4

1

56

Figura 9- - Espectro de RMN do polissacarídeo da alga B. triquetrum em D2O (A) 13

C RMN

(B) DEPT.

57

Figura 10 - Espectro HSQC de 1H e

13C do polissacarídeo da alga B. triquetrum em

D2O.

58

Tabela 4 - Assinalamentos de RMN de 1H e

13C para PST de B. triquetrum

Unidade 1H deslocamento químico (ppm)

H-1 H-2 H-3 H-4 H-5 H-6 O-Me

β-D-galactose-O-CH3 (G6M) 4,56 3.62 3.76

4.07 3.83 3.67 3.41

3,6 α-L-anidrogalactose (LA) 5.13 4.10 4.52 4.65 4.55 4.16/4.01 -

α-L-galactose-6 sulfato (L-6S) n.d n.d n.d n.d n.d 4.19 -

β-D-galactose (G) n.d n.d n.d n.d n.d 3.80 -

13C deslocamento químico (ppm)

C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 O-Me

β-D-galactose-O-CH3 (G6M) 102.5 70.2 82.2 69.1 73.3 71.9 59.2

3,6 α-L-anidrogalactose (LA) 98.41 69.7 80.1 77.5 75.68 69.5 -

α-L-galactose-6 sulfato (L-6S) 98.8 n.d n.d n.d n.d 67.5 -

β-D-galactose (G) n.d n.d n.d n.d 73.64 61.4 -

4.6 Atividade dos PST da alga Bryotamnion triquetrum no modelo de diarreia

4.6.1 Modelo de diarreia induzida por óleo de rícino em camundongos

O ensaio com óleo de rícino foi utilizado para determinar o efeito antidiarreico

dos PST, que é amplamente empregado para a triagem de drogas com esta propriedade. Nos

experimentos foi observado que a administração de óleo de rícino em camundongos resultou

em diarreia abundante. No entanto, o pré-tratamento com os PST em todas as doses testadas

(1, 3, 10, e 30 mg / kg) inibiram significamente os parâmetros de diarreia examinados

reduzindo a massa total de fezes e fezes diarreicas com destaque a dose de 10 mg/kg que teve

90,24% de inibição da defecação e 93,98% de inibição de diarreia dentro de 3 horas após a

administração do óleo de rícino em comparação com o grupo controle (Tabela 5).

Além disso, os PST de dose oral de 1, 3, 10 mg / kg reduziram a gravidade da

diarreia (Figura 11) de forma significativa medida pelo índice de diarreia geral e fezes duras,

leves, e copiosa, em comparação com o tratamento do controle. A dose de 10 mg/kg no

modelo de diarreia induzida por óleo de rícino foi a mais eficiente na redução dos efeitos da

diarreia e, portanto, esta dose foi escolhida como a dose padrão.

Costa et al., (2015) avaliou o efeito antidiarreico do polissacarídeo sulfatado da

alga Gracilaria caudata em ratos e obteve, com a dose de 90 mg/kg, 48,79% de inibição da

59

defecação e 49,41% de inibição de diarreia, isso mostra que os PST da alga B. triquetrum tem

um grande potencial em inibir a defecação e a diarreia (número de fezes líquidas) sugerindo

que esta ação pode ser por uma alteração na motilidade intestinal de inibição de trânsito e/ou

pelo aumento da absorção de água e eletrólitos e consequentemente diminuição da secreção

de líquidos no trato intestinal, uma vez que este polissacarídeo diminui significamente o

número de bolos fecais líquidos comparados com o grupo controle positivo.

Tabela 5- Efeitos dos PST sobre a diarreia induzida por óleo de rícino em camundongos.

Os valores são apresentados como média ± SEM. Número de animais / grupo = 5-6. * P <

0,05 vs. grupo controle.

Tratamento (v.o.) Nº total de

fezes (g)

Inibição da

defecação (%)

Nº total de fezes

diarreicas (g)

Inibição da

diarreia (%)

Salina (2,5 ml/Kg) 9,651±0,016 - 9,311±0,008

-

PST (1mg/Kg) 3,490±0,006* 63,83 2,240±0,007* 75,94

PST (3mg/Kg) 3,110±0,007* 67,77 2,576±0,007* 72,33

PST (10mg/Kg) 0.943±0.006* 90,24 0,556±0,006* 93,98

PST (30mg/Kg) 2,963±0,008* 74,37 2,423±0,006* 74,00

Loperamida (5mg/Kg)

1,300±0,010* 86,51 1,017±0,060* 89,25

60

Figura 11 - Fluidez das fezes em diarreia induzida por óleo de rícino em camundongos.

Os dados são apresentados como a mediana e alcance mínimo/máximo. #P < 0,01 vs. grupo

salina; * P < 0,05 vs grupo óleo de rícino. Não paramétrico de Kruskal - Wallis seguido pelo

teste de Dunn foi usado para as comparações múltiplas. Abreviaturas: Sal: salina; Lop:

loperamida.

4.6.2 Avaliação do acúmulo de fluido intestinal (enteropooling) induzido por óleo de rícino

em camundongos

O acúmulo do fluído intestinal (enteropooling) gerado pela a diarreia é de um

comprometimento da função intestinal, na qual há prejuízo da absorção intestinal, excessiva

secreção intestinal de água e eletrólitos e um rápido trânsito intestinal (GURGEL et al., 2001).

A avalição da quantidade de fluido intestinal gerada a partir da diarreia induzida por óleo de

rícino mostrou que os PST (10 mg/kg) de B. triquetrum reduziram significativamente

(54,26% de inibição) o enteropooling em relação ao controle (59,00 % de inibição ) que

estatisticamente esses valores são iguais mostrando que os PST é eficaz na redução de fluido

intestinal quanto a Loperamida (Tabela 6). Estes dados confirmam os resultados obtidos pelo

método anterior sugerindo que o mecanismo de ação antidiarreico dos PST envolve alterações

na secreção intestinal. Estudos andiarreicos demosntram que a redução do volume de fezes é

tornado possível por promover a redução da acumulação intraluminal de água e redução de

61

perda de eletrólitos, impedindo a inibição da bomba de prótons, como demonstrado em vários

estudos antidiarreicos (GANDHIMATHI et al., 2009; RAJPU et al., 2011).

Tabela 6 - Efeito dos PST no enteropooling induzido por óleo de rícino em camundongos.

Os valores estão expressos como média ±SEM (n = 6-7).** P <0,05 quando comparado com o

grupo controle.

.

4.6.3 Trânsito intestinal induzido por óleo de rícino

Para avaliar a motilidade intestinal, a distância percorrida pelo carvão ativado

através do intestino foi medida. Neste modelo foi possível observar que o tratamento com

PST e Loperamida diminuiu significativamente (P < 0,05) o trânsito gastrintestinal de

45.35% e 49.57 %, respectivamente , em comparação com o grupo tratado com solução salina

(Figura 12).

Os PST apresentaram efeito inibitório da motilidade intestinal reduzindo a relação

entre a distância percorrida pelo carvão e o comprimento total do intestino delgado, sugerindo

assim que o mecanismo de ação antidiarreico envolve a motilidade intestinal.

Estudos posteriores precisam ser realizados para se estabelecer especificamente uma

relação de interação entre PST de B. triquetrum e moduladores da motilidade gastrintestinal,

tais como receptores α-2-adrenérgicos, Mbagwua e Adeyemi (2008), receptores opióides,

Kurz e Sessler (2003), colinérgicos muscarinicos e histamínicos, Awe et al (2014).

Tratamento (v.o.)

Volume do conteúdo intestinal

(mL)

Inibição (%)

Salina (2,5 ml/Kg) 0,492±0,053 -

PST (10mg/Kg) 0,267±0,051**

54,26

Loperamida (5mg/Kg) 0,2017±0,016 59,00

62

Figura 12- Efeitos da atividade dos PST no trânsito intestinal induzida por óleo de rícino em

camundongos. Os resultados são expressos como média ± SEM de um mínimo de 5 animais

por grupo. *P< 0.05 vs. grupo óleo de rícino; ANOVA e Newman–Keuls. Abreviaturas Sal:

solução salina; Lop: loperamida.

4.6.4 Avaliação da secreção de fluido intestinal induzida pela toxina da Cólera em

camundongos

A atividade anti-secretora dos PST foi avaliada através da medição da quantidade

de fluido intestinal induzida por CT em modelo em alças intestinais. Figuras 13 e 14 mostram

um grande acúmulo de fluido intestinal (proporção peso da alça / comprimento ) na alça com

CT injetada (µg/ alça), comparado ao controle, alças injetadas com PBS (g/cm). O tratamento

com PST (10 mg/kg) diminuiu de forma significativa a acumulação de fluido (g/cm) nas

alças intestinais tratadas com CT, a uma concentração de 1 µg/alça no período de quatro

horas, mostrado que o polissacarídeo foi ativo na inibição na secreção do fluido intestinal e

foi capaz de reverter a ação secretora da CT.

63

Figura 13- O efeito inibitório dos PST sobre a secreção de fluido induzido pela toxina

da Cólera em alças intestinais. Os resultados são expressos como média ± SEM de um

mínimo de 5 animais por grupo. ANOVA e Newman-Keuls.

Figura 14 - Secreção de fluidos medidos indiretamente como proporção em peso da

alça / comprimento. Os resultados são expressos como média ± SEM de um mínimo

de 5 animais por grupo. # P < 0.05 vs. grupo PBS; * P< 0.05 vs. grupo CT. ANOVA e

Newman-Keuls.

64

4.6.5 Avaliação da absorção de fluido intestinal induzida pela toxina da Cólera em

camundongos

O efeito dos PST na absorção de fluido intestinal induzida pela CT foi analisado

com este modelo. Observou-se que as alças injetadas com glicose, utilizado como controle

positivo, apresentaram a absorção de fluido de 78,25 ± 8,06 % em 30 min ( Figura 15). Os

PST ( 33,27 ± 6,77 %) não tiveram efeito significativo sobre a absorção de fluido intestinal

comparado com o controle positivo. Estes resultados indicam que a redução do fluido

intestinal estimulado por CT deve ser medida por outro mecanismo.

Figura15- Absorção do fluido intestinal. Os resultados são expressos como média ±

SEM de um mínimo de 5 animais por grupo.# P < 0.05 vs. Grupo PBS;

*P< 0.05 vs.

Grupo glicose. ANOVA e Newman-Keuls.

4.6.6 Interação dos PST com receptor e com a CT – GM1 ELISA

Para examinar a possível interação entre os PST e o receptor GM1, e os PST e a

CT bloqueando a ligação do GM1 com a CT, um ensaio de ELISA foi realizado. Em uma

placa com GM1 pré-incubado foram adicinados: a CT (100 ng/mL), que corresponde a

coluna a; 100 µg/mL de PST foi pré incubado com o GM1 e depois adicionado a CT (100

ng/mL), correspondendo a coluna b e concentrações crescentes (1, 10, 50, 100, e 300 µg/mL)

de PST adicionadas juntamente com CT foram incubadas nas colunas c a g respectivamente.

65

Os resultados mostraram que a pré-incubação com GM1 e PST (100 µg/mL) reduziram

significativamente a detecção CT por ELISA. Além disso, quando a CT (100 ng/mL) e

concentrações crescentes da PST (1-300 µg/mL) foram adicionadas simultaneamente à placa

de microtitulação previamente adsorvida a GM1, a ligação GM1-CT também diminuiu

significativamente em todas as concentrações (Figura 16).

Figura 16- Efeitos da PST sobre a toxina da Cólera (CT) e GM1. Os valores obtidos

para 100 ng de CT foram tomados como 100 % de ligação. Os dados apresentados são

médias ± SEM de três experiências independentes realizadas em condições

semelhantes. * P <0,001 vs coluna a.

Para elucidar a possível interação entre o GM1 e os PST deve levar em

consideração que derivados de galactose estão sendo selecionados para desenvolver

antagonistas do GM1 (POLIZZOTTI; KIICK, 2006). Estudos demonstram que os receptores

de gangliosídeos possuem alta afinidade de ligação com carboidratos, e a CT pode assumir

uma forma similar a um carboidrato (SINCLAIR et al.,2008). De acordo com a caracterização

química dos PST a sua composição base é de galactose o que sugere que os PST podem

interagir com o local de ligação do GM1 e impedir a ligação da CT com este receptor.

Lectinas, proteínas com afinidade com carboidratos, encontradas na subunidade B

da CT (CRUZ et al, 2005) sugere uma possível interação dos PST com esta subunidade

impedindo a ligação da CT com o GM1.

66

Os polissacarídeos sulfatados são poliânions (POMIM, 2010) então devido a essa

característica, os PST podem está interagindo com GM1 e/ou toxina por um impedimento

estérico. Trabalhos adicionais devem ser realizados para identificar se os PST atua com a CT,

o GM1 ou ocorre à sobreposição de ambas as atividades.

67

5 CONCLUSÃO

A caracterização estrutural realizada por métodos químicos e espectroscópicos dos

polissacarídeos sulfatados totais (PST) da alga marinha vermelha Bryothamnion triquetrum

demonstrou que esse composto é uma galactana tipo ágar e sua massa molar

correspondendo a 61,4 kDa.

Os resultados indicam que os PST têm um efeito antidiarreico em testes de

diarreia aguda (modelo induzido por óleo de rícino) e diarreia secretora (modelo induzida

pela toxina colérica). Mais testes serão necessários para avaliar outros parâmetros e

mecanismos de ação dos PST em casos de diarreia aguda e a diarreia colérica. Com isso os

PST da alga B. triquetrum torna-se uma possível ferramenta biológica para o

desenvolvimento de fármacos para o tratamento de doenças diarreicas.

68

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ANEXO A – CARTA DE APROVAÇÃO DA COMISSÃO DE ÉTICA EM PESQUISA

ANIMAL (CEPA) DA UFC