Journal Identification = ABC Article Identification = 1266 Date: July 25, 2017 Time: 5:29 pm

doi:1

0.16

84/a

bc.2

017.

1266

Biologie au quotidien

Ann Biol Clin 2017 ; 75 (4) : 457-61

Au sujet d’un cas de pseudosyndromedes plaquettes grises avec pseudothrombopénieinduite par le citrate : des artefacts pouvant fausserla numération plaquettaire et mener à des erreursdiagnostiques critiques

A case report of pseudo grey platelet syndrome with citrate-inducedpseudothrombocytopenia: those artifacts may interfere in the plateletnumeration and lead to critical misdiagnosis

Agathe Herb1

MIPCR

HF<

HF

Aa

Résumé. Le pseudo-syndrome des plaquettes grises est un artefact lié à la

Ltrgul

Cop

yrig

ht ©

201

7 Jo

hn L

ibbe

y E

urot

ext.

Dow

nloa

ded

by U

NIV

ER

SIT

E L

OU

IS P

AS

TE

UR

ST

RA

SB

OU

RG

on

02/0

8/20

17.

axime Maurer1

sabelle Alamome1

ierre-Adrien Bihl2

osmina Ghiura3

émy Hurstel1

1 Laboratoire d’hématologie,ôpitaux civils de Colmar, Colmar,ranceRemy.hurstel@ch-colmar.fr>

2 Laboratoire Biorhin, Pfastatt, France3 Service de médecine interne,

ôpitaux civils de Colmar, Colmar,rance

dégranulation des plaquettes causée par l’EDTA in vitro chez certains patients.Ce phénomène peut entraîner des difficultés dans la réalisation de la numérationplaquettaire et il est important de savoir le différencier du syndrome des pla-quettes grises, une thrombopathie constitutionnelle avec macrothrombopénie,afin d’éviter des examens spécialisés inutiles, voire des erreurs diagnostiques.En effet, les deux entités sont cytologiquement proches, puisque des plaquettesgrises sont retrouvées sur le frottis sanguin réalisé à partir d’un prélèvementsanguin effectué sur EDTA et coloré au May-Grünwald Giemsa à la fois dans lesyndrome des plaquettes grises et dans le pseudosyndrome des plaquettes grises.Nous décrivons ici le cas d’une patiente admise aux Hôpitaux civils de Colmarpour une thrombopénie chronique, associant à la fois une pseudothrombopénieet un pseudosyndrome des plaquettes grises.

Mots clés : pseudosyndrome des plaquettes grises, syndrome des plaquettesgrises, pseudothrombopénie

Abstract. The pseudo grey platelet syndrome is a rare artifact due to the degra-nulation of platelets caused, in vitro, by EDTA. This phenomenon is likely todisturb the platelet numeration and it is essential not to mistake it for a grey

syndrome platelet, which is a constitutional thrombopathy with macrothrombo-penia, in order to avoid specialized tests, or even misdiagnosis. Indeed, these twoentities are cytologically alike, as grey platelets are found on the blood smear ofa sample collected on EDTA in both cases. We here describe the case of a patient

ar’ocyt

udoia

rticle recu le 22 novembre 2016,ccepte le 22 novembre 2016

admitted in Colma pseudothromb

Key words: psethrombocytopen

Pour citer cet article : Herb A, Maurer M, Alamome I, Bihl PA, Ghiura C, Hurstel R. Au sujetinduite par le citrate : des artefacts pouvant fausser la numération plaquettaire et mener àdoi:10.1684/abc.2017.1266

e syndrome des plaquettes grises est une thrombopa-hie congénitale, à transmission autosomique généralementécessive [1], et parfois dominante [2, 3]. Cette patholo-ie de l’hémostase primaire se caractérise cliniquement parn syndrome hémorragique cutanéo-muqueux modéré dès’enfance et une évolution fréquente vers la myélofibrose.

s Hospital for a chronic thrombocytopenia, associating bothopenia and a pseudo grey platelet syndrome.

grey platelet syndrome, grey platelet syndrome, pseudo-

457d’un cas de pseudosyndrome des plaquettes grises avec pseudothrombopéniedes erreurs diagnostiques critiques. Ann Biol Clin 2017 ; 75(4) : 457-61

Au niveau biologique, on note l’association d’une throm-bopathie, liée à l’absence de contenu des granules alpha,avec une fréquente macrothrombopénie qui est secondaireà la durée de vie raccourcie des plaquettes. On observeégalement des plaquettes grises sur le frottis sanguin, ce quioriente le diagnostic, lequel est confirmé par microscopie

Journal Identification = ABC Article Identification = 1266 Date: July 25, 2017 Time: 5:29 pm

4

B

éNLlppcuraLàqLsPdqpt

Te

Cop

yrig

ht ©

201

7 Jo

hn L

ibbe

y E

urot

ext.

Dow

nloa

ded

by U

NIV

ER

SIT

E L

OU

IS P

AS

TE

UR

ST

RA

SB

OU

RG

on

02/0

8/20

17.

iologie au quotidien

lectronique et par la recherche de mutations du gèneBEAL2.e pseudosyndrome des plaquettes grises est un artefact

ié à la dégranulation in vitro des granules denses et alphalaquettaires induite par l’EDTA chez de rares patients, res-onsable d’un aspect gris des plaquettes au frottis sanguinoloré au May-Grünwald Giemsa (MGG), simulant ainsin syndrome des plaquettes grises. Cet artefact n’est pasetrouvé lorsque le prélèvement est collecté sur un autrenticoagulant tel que le citrate ou sur CTAD.es patients présentant une dégranulation plaquettaire liéel’EDTA ne présentent, en revanche, ni dysfonction pla-

uettaire ni syndrome hémorragique associé.’incidence de ce phénomène n’est pas connue, et à ce jour

58

euls quelques cas ont été décrits [4-10].ar ailleurs, la pseudothrombopénie due à la présence’agrégats plaquettaires est un phénomène relativement fré-uent, dont la prévalence est estimée de 0,07 à 0,2 % desatients [11]. Il est secondaire au démasquage par un addi-if anticoagulant (généralement l’EDTA, plus rarement le

ableau 1. Résultats des différentes numérations plaquettaires effectut selon la technique de numération utilisée.

Anticoagulant utiliséDate Laborato

Ad

Février 2016

18/2

EDTA(1er passage)

250Suspicionavec des

EDTA(2e passage aprèschauffage 1 h à 37 ◦C)

55Présenceplaquettai

24/2 EDTA(après chauffage1 h à 37 ◦C)

47Présenceplaquettai

29/2EDTA

Citrate 54

Mars 2016

7/3 EDTA 195

14/3EDTA

Citrate 49

17/3 EDTA

31/3EDTA

Citrate 94

Mai 2016

13/5EDTA

Citrate 15

15/5 EDTA

18/5

EDTA

Citrate

CTAD

citrate) d’un site cryptique du complexe plaquettaire GpII-bIIIa, qui se trouve alors exposé à des auto-anticorps dirigéscontre cet épitope, présents chez certains patients, générantainsi une agglutination des plaquettes in vitro, ce qui fausseleur dénombrement.

L’observation

Une femme âgée de 54 ans est admise aux urgences desHôpitaux civils de Colmar (HCC) le 15 mai 2016 pour unethrombopénie profonde révélée dans un laboratoire de ville,estimée à 15 G/L (Advia 2120i, Siemens, États-Unis) surprélèvement citraté. Un comptage sur cellules de Malassez,effectué sur le tube EDTA, confirme ce résultat (tableau 1).

Ann Biol Clin, vol. 75, n◦ 4, juillet-août 2017

ées, selon l’anticoagulant sur lequel le prélèvement a été collecté

Plaquettes (G/L)

ire de ville Laboratoired’hématologie des HCC(Sysmex XE 5000)via 2120i Cellule de

Malassez

d’interférencecryoglobulines

d’amasres

d’amasres

68

50

217

71

40

220

247

Amas

262

La patiente est bipare, sans histoire hémorragique enpériode péri- ou post-natale. Elle rapporte des méno-métrorragies dans un contexte de fibrome utérin. Aucunautre symptôme hémorragique n’est rapporté à l’anamnèseet l’examen clinique est sans particularité. Un hémo-gramme réalisé en 2014 n’objectait aucune anomalie. Un

Journal Identification = ABC Article Identification = 1266 Date: July 25, 2017 Time: 5:29 pm

A

Pseudo-syndrome des plaquettes grises avec pseudothrombopénie

Fsn

pe(asÀld((ctdprLmcrpOsqdr(cddd

D

La

Figure 2. Frottis sanguin réalisé à partir du prélèvement collectésur citrate, sur lequel on peut observer des plaquettes granuleuses,d’aspect normal, formant de grands amas dans les franges dufrottis.

Cop

yrig

ht ©

201

7 Jo

hn L

ibbe

y E

urot

ext.

Dow

nloa

ded

by U

NIV

ER

SIT

E L

OU

IS P

AS

TE

UR

ST

RA

SB

OU

RG

on

02/0

8/20

17.

igure 1. Frottis sanguin réalisé à partir du prélèvement collectéur EDTA, sur lequel on peut observer des plaquettes grises, dégra-ulées, formant parfois de petits amas.

remier épisode de thrombopénie modérée avait été misn évidence en février 2016 dans le même laboratoiretableau 1). Sa régression spontanée et la négativité du bilanuto-immun avaient fait conclure à une thrombopénie tran-itoire d’origine probablement virale.

l’admission aux urgences des Hôpitaux civils de Colmare 15 mai, une numération est réalisée au laboratoire’hématologie des HCC sur automate Sysmex XE 5000Sysmex, Japon) et n’objecte pas de thrombopénietableau 1). Devant la discordance, un frottis sanguinoloré au MGG est réalisé, et retrouve des plaquettesotalement dégranulées, d’aspect gris (figure 1). L’aspectes plaquettes motive un second prélèvement avec, enarallèle, des numérations plaquettaires et des frottiséalisés sur tube EDTA, citrate et CTAD.a numération plaquettaire est normale sur les prélève-ents de contrôle (tableau 1), à l’exception du prélèvement

itraté sur lequel de très nombreux amas plaquettaires sontetrouvés, révélant ainsi une pseudothrombopénie induitear le citrate (figure 2).n note la persistance de plaquettes grises sur le frottis

anguin issu du prélèvement effectué sur EDTA, ainsi queuelques agrégats plaquettaires de petite taille. Cet aspecte plaquettes dégranulées n’est pas retrouvé sur le frottiséalisé sur les échantillons prélevés sur citrate ou sur CTADfigures 2 et 3), sur lesquels les plaquettes ont un aspectytologique normal, le tout en faveur d’un pseudosyndromees plaquettes grises induit par l’EDTA, s’accompagnant

nn Biol Clin, vol. 75, n◦ 4, juillet-août 2017

’agrégats plaquettaires induits par le citrate et l’EDTA et’une pseudothrombopénie due au citrate.

iscussion

es discordances entre les résultats fournis par les deuxutomates s’expliquent par plusieurs phénomènes.

Figure 3. Frottis sanguin réalisé à partir du prélèvement collectésur CTAD, sur lequel on peut observer des plaquettes granuleuses,d’aspect normal, ne formant pas d’amas.

Tout d’abord, différentes technologies sont disponiblespour la numération plaquettaire : l’impédance, développéepar Coulter en 1953, est une technique de mesure volu-métrique et permet de classer les éléments selon leur tailleseule. La numération plaquettaire peut également être réa-lisée par une méthode optique qui se base sur l’analysebidimensionnelle (petit angle et grand angle) de la diffrac-tion par la cellule de la lumière émise par un laser, ce qui

459

permet de déterminer la taille et la granularité d’un élément,et de le classer selon ces deux paramètres.Les analyseurs d’hématologie Advia sont équipés, pour lanumération plaquettaire, de ce dernier système seulement,tandis que les analyseurs Sysmex XE ont à leur bord un

Journal Identification = ABC Article Identification = 1266 Date: July 25, 2017 Time: 5:29 pm

4

Biologie au quotidien

Diffraction plaquettes

Fdsdc

slLEfEllLpgSadtpqpipedqpe

Cop

yrig

ht ©

201

7 Jo

hn L

ibbe

y E

urot

ext.

Dow

nloa

ded

by U

NIV

ER

SIT

E L

OU

IS P

AS

TE

UR

ST

RA

SB

OU

RG

on

02/0

8/20

17.

igure 4. Scattergramme plaquettaire sur l’analyseur Advia2120i’un prélèvement collecté sur EDTA. On peut remarquer la pré-ence d’une population à gauche de la base des courbes deistribution isovolumétrique, représentée ici en noir, ayant déclen-hé l’alarme de suspicion de cryoglobulines.

ystème d’impédance avec un système optique basé sur’utilisation d’un fluorochrome.es plaquettes dégranulées du prélèvement effectué surDTA ont généré, sur l’analyseur Advia 2120i, une alarme

aisant suspecter la présence de cryoglobulines (figure 4).n effet, celles-ci peuvent former des amas de taille simi-

aire à celle des plaquettes mais agranuleux et fausser ainsia numération plaquettaire en menant à une surestimation.’analyseur Sysmex n’a, quant à lui, pas été pris en défautuisque le système d’impédance ne tient pas compte de laranularité des plaquettes.elon la procédure mise en place, le laboratoire de ville alors placé le prélèvement à 37 ◦C pendant une heure, afin’éliminer toute surestimation de la numération plaquet-aire liée à la présence de cryoglobulines. Néanmoins, cetterocédure a eu pour effet de générer de nombreux amas pla-uettaires chez cette patiente, qui n’existaient pas ou peu surrélèvement non chauffé, aboutissant à une sous-estimationmportante de la numération plaquettaire. Ce phénomène

60

ourrait avoir comme origine le chauffage du prélèvement :n effet, une étude fait mention de trois patients présentantes pseudo-thrombopénies induites par l’EDTA et pour les-uels le chauffage à 37 ◦C du prélèvement avait augmenté lehénomène d’agrégation plaquettaire [12]. Il est égalementnvisageable que, pour cette patiente, la formation de ces

amas soit temps dépendante, comme cela a déjà été décrit[13, 14], et que la formation d’amas se soit alors majo-rée pendant le délai d’environ une heure de chauffage duprélèvement.La sous-estimation quasi systématique de la numérationplaquettaire par le laboratoire de ville a ainsi plusieurs ori-gines. Tout d’abord, la présence d’amas plaquettaires sur letube EDTA après chauffage a mené le laboratoire de ville àcollecter quasiment tous les prélèvements sur EDTA et surcitrate. Les numérations ont quasiment toutes été renduessur prélèvement citraté, tandis que l’absence d’amas pla-quettaire n’a été contrôlée que sur le prélèvement collectésur EDTA (non chauffé). L’importante agrégation plaquet-taire spontanée induite par le citrate chez cette patienteexplique alors la pseudothrombopénie. D’autre part, lanumération plaquettaire sur cellule de Malassez a été sys-tématiquement effectuée sur le prélèvement collecté surEDTA. Elle est particulièrement délicate en présence deplaquettes dégranulées en raison de la perte de réfringencedes plaquettes. Les résultats des numérations plaquettairesen cellule de Malassez ont ainsi été fortement sous-estimés.Le laboratoire de ville a, en raison de la thrombopénie,réalisé à plusieurs reprises un frottis sanguin à partir duprélèvement collecté sur EDTA, afin d’observer la mor-phologie plaquettaire. Le frottis sanguin retrouvait de raresplaquettes, confirmant les résultats de la numération pla-quettaire. Ceci est probablement dû à la difficulté de lecturede ce type de frottis car les plaquettes agranuleuses prennentun aspect grisâtre pâle dont l’intensité de coloration varieselon la technique de coloration par le MGG utilisée.Environ 17 % des patients présentant des pseudo-thrombopénies induites par l’EDTA développent des amasplaquettaires sur prélèvement citraté [12]. Il a été décrit derares cas où le citrate induisait une agrégation plaquettaireplus prononcée [13], comme nous avons pu l’observer cheznotre patiente.Dans ces situations, d’autres alternatives existent telles quel’usage du CTAD comme anticoagulant. En effet, ce derniercontient de la théophylline qui a déjà été décrite commeinhibant la formation des amas plaquettaires induite parl’EDTA [15, 16]. Il est également possible d’utiliser des selsde magnésium comme anticoagulant [14]. La kanamycinesemble, elle aussi, posséder des propriétés intéressantes : ila été décrit que celle-ci, ajoutée indifféremment avant ouaprès la collecte du prélèvement, permettait de dissocier lesamas plaquettaires induits par l’EDTA [17, 18].

Ann Biol Clin, vol. 75, n◦ 4, juillet-août 2017

Conclusion

Chaque laboratoire doit établir des procédures claires quantà la conduite à tenir en cas de thrombopénie ou d’alarmeconcernant les plaquettes. Il est également impératif de

Journal Identification = ABC Article Identification = 1266 Date: July 25, 2017 Time: 5:29 pm

A

o-sy

gddaIqdlpc

RnA

Ld

R

1PG

2o2

3s

4H

5sE

6da

17. Ahn HL, Jo YI, Choi YS, Lee JY, Lee HW, Kim SR, et al.

Cop

yrig

ht ©

201

7 Jo

hn L

ibbe

y E

urot

ext.

Dow

nloa

ded

by U

NIV

ER

SIT

E L

OU

IS P

AS

TE

UR

ST

RA

SB

OU

RG

on

02/0

8/20

17.

Pseud

arder à l’esprit que la recherche d’amas plaquettairesoit être systématiquement réalisée lors de la découverte’une thrombopénie ou de sa confirmation sur un autrenticoagulant.l faut également être vigilant lors de la détection de pla-uettes grises sur le frottis sanguin : en effet, en dehorse toute histoire hémorragique cliniquement pertinente,e biologiste doit en premier lieu contrôler la numérationlaquettaire et l’aspect du frottis sanguin sur d’autres anti-oagulants que l’EDTA.

emerciements. Les auteurs remercient le docteur Domi-ique De Briel pour sa relecture, ainsi que les docteursnne-Cécile Galoisy et Nicolas Bernhard pour leur aide.

iens d’intérêts : Les auteurs déclarent ne pas avoir de lien’intérêt en rapport avec cet article.

éférences

. Albers CA, Cvejic A, Favier R, Bouwmans EE, Alessi M-C, Bertone, et al. Exome sequencing identifies NBEAL2 as the causative gene forray Platelet Syndrome. Nat Genet 2011 ; 43 : 735-7.

. Mori K, Suzuki S, Sugai K. Electron microscopic and functional studiesn platelets in gray platelet syndrome. Tohoku J Exp Med 1984 ; 143 :61-87.

. Aminkeng F. GFI1B mutation causes autosomal dominant gray plateletyndrome. Clin Genet 2014 ; 85 : 534-5.

. Agarwal S. Pseudo-grey platelet syndrome : a rare artifact. Indian J

nn Biol Clin, vol. 75, n◦ 4, juillet-août 2017

ematol Blood Transfus 2013 ; 29 : 52-4.

. Cockbill SR, Burmester HB, Heptinstall S. Pseudo grey plateletyndrome–grey platelets due to degranulation in blood collected intoDTA. Eur J Haematol 1988 ; 41 : 326-33.

. Lesesve J-F, Latger-Cannard V, Lecompte T. Pseudo-storage poolisease due to platelet degranulation in EDTA-collected peripheral blood :rare artifact. Clin Lab Haematol 2005 ; 27 : 336-42.

ndrome des plaquettes grises avec pseudothrombopénie

7. Mues G, Wians FH, Kroft SH. EDTA-induced pseudo–gray plateletsyndrome. Lab Med 2001 ; 32 : 361-4.

8. Toyota S, Nakamura N, Dan K. Pseudo gray platelet syndrome ina patient with acute myocardial infarction. Int J Hematol 2002 ; 76 :376-8.

9. Yoo J, Kim Y, Han K. Pseudo gray platelet syndrome : the first casereport in Korea. Blood Res 2015 ; 50 : 117-8.

10. Pancione Y, Fumi M, Sale S, Rocco V, Bain BJ. Gray platelets –artifact or real ? Am J Hematol 2016 ; 91 : 538.

11. Xiao Y, Yu S, Xu Y. The prevalence and biochemical profiles ofEDTA-dependent pseudothrombocytopenia in a generally healthy popu-lation. Acta Haematol 2015 ; 134 : 177-80.

12. Bizzaro N. EDTA-dependent pseudothrombocytopenia : a clinical andepidemiological study of 112 cases, with 10-year follow-up. Am J Hematol1995 ; 50 : 103-9.

13. Salama A. Autoimmune thrombocytopenia complicated by EDTA-and/or citrate-dependent pseudothrombocytopenia. Transfus Med Hemo-therapy 2015 ; 42 : 345-8.

14. Schuff-Werner P, Steiner M, Fenger S, Gross H-J, Bierlich A,Dreissiger K, et al. Effective estimation of correct platelet counts inpseudothrombocytopenia using an alternative anticoagulant based onmagnesium salt. Br J Haematol 2013 ; 162 : 684-92.

15. Ohnuma O, Shirata Y, Miyazawa K. Use of theophylline in the inves-tigation of pseudothrombocytopenia induced by edetic acid (EDTA-2K).J Clin Pathol 1988 ; 41 : 915-7.

16. Shimasaki A, Kato T, Ozaki Y. Studies of platelet aggregation insix cases of EDTA-dependent pseudothrombocytopenia. Rinsho Ketsueki1994 ; 35 : 529-34.

461

EDTA-dependent pseudothrombocytopenia confirmed by supplementa-tion of kanamycin ; a case report. Korean J Intern Med 2002 ; 17 :65-8.

18. Sakurai S, Shiojima I, Tanigawa T, Nakahara K. Aminoglycosidesprevent and dissociate the aggregation of platelets in patients withEDTA-dependent pseudothrombocytopenia. Br J Haematol 1997 ; 99 :817-23.