Purpose Name Accession number of gene Sequence (5′-3′)

qRT-PCR

MdASN1 F MDP0000292272 CCATGAACATTGATCCAGA

MdASN1 R MDP0000292272 AACACCATCACTGAACTG

MdASN2 F MDP0000096208 AAGCACATTCTGTATAGGC

MdASN2 R MDP0000096208 TTCAGCATTCATCATCATCT

MdASN3 F MDP0000119630 TGGTAGGGCTATACTTGAA

MdASN3 R MDP0000119630 TTCATCTGAGGTACATTGTC

MdASN4 F MDP0000302187 TATAATAAGGAATAGACCAGAGTG

MdASN4 R MDP0000302187 CATGGCATAGAATTGAGGA

MdASN5 F MDP0000319314 CTTCTTGTTGGTTCAGGT

MdASN5 R MDP0000319314 CAATTTCATTTCATCGTTTAGTG

Appendix A. Primers used in this study

ASN number

Manihot esculenta

Ricinus communis

Linum usitatissimum

Populus trichocarpa

Medicago truncatula

Thellungiella halophila

Carica papaya

Gossypium raimondii

Theobroma cacao

Citrus sinensis

Citrus clementina

Eucalyptus grandis

Vitis vinifera

Solanum tuberosum

Solanum lycopersicum

Mimulus guttatus

Aquilegia coerulea

Sorghum bicolor

Zea mays

Setaria italica

Phaseolus vulgaris

Glycine max

Cucumis sativus

Prunus persica

Malus domestica

Fragaria vesca

Arabidopsis thaliana

Arabidopsis lyrata

Capsella rubella

Brassica rapa

Panicum virgatum

Selaginella moellendorffii

Physcomitrella patens

Chlamydomonas reinhardtii

Volvox carteri

Coccomyxa subellipsoidea

Micromonas pusilla CCMP1545

Ostreococcus lucimarinus

Oryza sativa

Brachypodium distachyon

Micromonas pusilla RCC299

3

3

6

4

3

4

8

4

3

5

2

4

4

4

5

4

2

7

4

3

3

3

2

3

3

2

3

3

5

5

5

3

4

2

4

2

1

2

2

3

4

146Total

Chlorophyte

Panicoideae

Grass

Embryophyte

Tracheophyte

Angiosperm

Eudicot

Asterid

Malvidae

BrassicalesMalvales

Brassicaceae

Rosales-Cueurbitales

Nitrogen-fixing

Fabidae

Papilionoideae

Malpighiales

Rosid

Viridiplantae

Appendix B

Appendix B. The numbers and phylogenetic relationships of ASNs in 41 species via MEGA5Phylogenetic tree indicating the presence or absence of ASN family members in the indicated species. ASN members showed higher similarity between apple and Prunus persica.

76AtASN1 76AtASN3 76AtASN2 76MdASN1 76MdASN2 120MdASN3 93MdASN4 91MdASN5 91AtASN4

Consensusm

MMMMMMMMMc

CCCCCCCCCg

GGGGGGGGGi

IIIIIIIII

LLLLLLAAA

AAAAAALLI

VVVVVVIIV

LLLFLLIIV

GGGGGGCWC

CCCCCCGGG

SVIISSIIV

DDDDDDRRR

DNNNDDFFI

SSSSSSHDE

QQQQQQLLL

AAAAAASSS

KKKKKKSST

RRRRRRLLL

VSSSVVFLS

RRRRRRLLS

VIIIHVNNS

LIIILLSPL

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SSSSSSPPT

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SSSSSSLLVg

GGGGGGGGG

LLLLLLSSE

YHHHYYTTK

QCCCQQKKT

NYYHHHLLI

GEEGGGLLH

DDDNDDLLL

NCCCCCHHR

YYYYFFSSP

LLLLLLPAN

AAAAAAIVC

HHHHHHLSG

QEEQQQNNQ

RRRRRRRRE

LLLLLLLLS

AAAAAAPPA

VIIIIILVT

IVIVIIRRL

DDDDDDGES

PPPPPPVIV

ATTAAASVV

SSSSSSPSE

GGGGGGVST

DDDDDDVIS

QQQQQQQEE

PPPPPPPGG

LLLLLLLVT

FYYYYYIVY

NNNNNNDKK

EEEEEESEL

DDDDDDAEE

KKKKKKKAE

TTTTSSNGT

IIVVII.XT

VAAVVV.ES

VVVVVV.GL

TTTTTT.DG

VVVVVV.EE

NNNNNN.GL

GGGGGG.KH

150AtASN1 150AtASN3 150AtASN2 150MdASN1 150MdASN2 194MdASN3 170MdASN4 211MdASN5 191AtASN4

Consensus

EEEEEE.CF

IIIIIIIFI

YYYYYYLSG

NNNNNNVLS

HHHHHHYET

EKKKEENNL

EAIQEE.XQ

LLLLLL.RL

RRRRRR.TR

.

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.PG

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.

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.

.

.

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GGGGGGGGG

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SAASSSAAA

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VVVVVVIII

LLLLLLYYY

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DDDDDDQQQ

TTTTTTEEE

RRRRRRSSS

DDDDDDASS

NKKQNNKKR

SSSSSSTTT

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MIIIIIWWW

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AAAAAAAAG

RRRRRRRRKd

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GGGGGGGGG

VIIIIIRRR

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GGGGGGHHH

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.

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.TTT

266AtASN1 266AtASN3 266AtASN2 266MdASN1 266MdASN2 310MdASN3 280MdASN4 317MdASN5 307AtASN4

Consensus

.

.

.

.

.

.ELV

LLLLLLEEEd

DDDDDDDDD

GGGGGGSSP

SSSSSSRRR

VVVIVVLFF

WWWWWWLLL

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SAAASSSSSs

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KKKKKKPPP

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LLLLLLSSS

NSSSNNSSS

DDDDDDNN.

DDDDDDEE.

CCCCCCHRV

EEEEEESSS

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FFFFFFDDG

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TCSSSSEED

FFFFFFAAT

PPPPPPEEE

PPPPPPNNNg

GGGGGGGGG

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GGGGGGEEE

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RRRRRRKKK

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GGGGGGEEE

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SSSSSSIITs

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LLLLLLHHS

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SSAASS..G

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GGGGGGRHL

PSSSAALSV

QKQQQQVVV

LLLLLLNNL

HHHHHHS.K

STTTSSD.E

FFFFFFI.S

CCCCCCV.V

377AtASN1 377AtASN3 377AtASN2 377MdASN1 377MdASN2 421MdASN3 382MdASN4 431MdASN5 412AtASN4

Consensus

VIIIVVP.R

GGGGGGI.R

LLLLLLK.R

EKQEEESST

GGGKGGGGS

SSSSSSRRL

PPPPPPLHH

DDDDDDDDS

LLLLLLMMI

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VRRRVVSSS

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HHHHHHGGG

EEEEEELLL

FLFFFFDDD

HHQHHHSSS

FFFFFFMMM

STTTTXIII

VVVVVVIIL

QQQQQQAAA

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GGGGGGLLL

IIIIIILLL

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DEEEDEDDD

VVVVVVPPP

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YYYYYYYYY

HHHHHHDDE

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EEEEEEDDD

TTTTTTLLL

YYYFYYLLL

DDDDDDNNNv

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TTTTTTFFF

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KKKKKKAAA

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KKKKKK.L.

SSSSSS.W.

LLLLLLVII

GGGGGGNKK

VVVVVVEVE

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VVVVVVRGK

LLLLIIILI

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GGGGGGPPP

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KKKKKKIII

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KKKEEESSS

EEEEEETTK

FFFFFFLLL

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QEEQRRFFFe

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TTTTTTTTT

CCCCCCKKK

RRRQRRHHR

KKKKKKVVV

IIIIIIMMM

KKKKKKSSS

AAAAAALLL

LLLLLLIII

HHHHHHNNN

KQQLMMPPP

488AtASN1 488AtASN3 488AtASN2 486MdASN1 488MdASN2 532MdASN3 483MdASN4 547MdASN5 514AtASN4

Consensus

YYFYYYAAA

DDDDDDNND

.

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.

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.

.TTT

CCCCCCYYY

LLLLLLMMM

RRRRRRDDD

AAAAAALLLn

NNNNNNNNN

KKKKKKIII

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TTTTTTIIT

SSSSSSAAA

AAAAAALLL

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GGGGGGLLL

LVVVLLAAA

EEEEEEAAA

AAAAAAGGR

RRRRRRGGG

VVVVVVDDD

PPPPPPGGG

FFFFFFWWW

LLLLLLVVI

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KKKKKKEEE

DEEEDDEED

FFFFFFNNN

IILIIITTG

NNNNKNNNN

TVVIVV..P

AAAAAAYYS

MMMMMMNNV

SSSNDDDDE

LIIIIIEEE

DDDDDDDDN

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EEEEEERQQ

SWWWFFCCR

KKKKKKIVV

MMLMMMKKK

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KRKRKKKKK

PPPPKKSSS

EDD.DD...

ELL.QQ...

GGGGGG...

RRRRRRKKD

IIIIIIAAA

EEEEEERRR

KKKKKKIII

WWWWWWLLL

VVVLVVLLL

LLLLLLVVV

RRRRRRGGG

RNNNKKSSA

AAAAAAGGG

FFFFFFAAAd

DDDDDDDDD

DDDDDDEEE

EEEDEEQQQ

EKEQEECCC

RNRKQKAAA

PPPPPPGGGy

YYYYYYYYY

LLLLLLGGG

PPPPPPRRR

KKKKKKHHH

HHHHHHRRR

IIIIIITTT

LLLLLLKKKy

YYYYYYYYYr

RRRRRRRRR

QQQQQQNSN

KKKKKKGGG

EEEEEE.G.

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FFFFFF.V.

SSSSSS.L.

DDDDDD.Y.

GGGGGG.V.

VVVVVV.F.

GGGGGGSSS

YYYYYYWWW

SSSSSSLRV

WWWWWWAAA

IIIIIILLL

DDDDDDNND

GGGGGGEDQ

LLLLLLEEE

KKKKKKMMM

DDDDSAKKK

HHHHHHLLL

AAAAAADDD

ANNNAEMMM

QKKSLLQQQ

NHHQHHRRR

VVVVVVIII

NSSTTTWWW

DEDDDDKKK

KTTSKKRRR

MMMMMMNNN

MLLLMMLLL

SMSSMLGGG

NNNNNNRRR

AAAAAADDD

GSSSEEDDD

HFFFRRRRR

IVVVIICCC

FFFYFFIII

PPPPPPAAA

HDDEHHDDD

NNNNNNHNN

584AtASN1 578AtASN3 578AtASN2 582MdASN1 586MdASN2 630MdASN3 603MdASN4 643MdASN5 610AtASN4

Consensus

TTTTTTGGG

PPPPPPKKK

NLLTNYEEE

TTTTTTAAG

KKKKKKRRR

EEEEEEFFF

AAAAAAPPP

YYYYYYFFF

YYYYYYLLL

YYYYYYDDD

RRRRRREEE

MTTTMMDDD

IIIIIIVVV

FFFFFFIII

EEEEEERRK

RKKKRRIIT

FFFFFFLLL

FFFFFFLLL

PPPPPPGGD

QKKKQQFFI

.

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NSSNNNEEE

SAAASSVVI

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RRRRRRNND

LAASNNLLL

TTTTTTDDE

VVVVVVQQQp

PPPPPPPPP

GGGGGGSXSg

GGGGGGGGG

APPPPPIIT

TSSSSSGGG

VVIVVVDDD

AAAAAAKKK

CCCCCCKKK

SSSSSSIII

TTTTTTLLL

AAAAAARRR

KKKKTTEGQ

AAAAAAVVV

VVVVVVAAA

EEEEAAEES

WWWWWWLLL

DDDDDDLLL

AAAAAAGGG

SATEEELLV

WWWWWWHYH

SSSSSSEEE

NQKKKKAAV

NNNNNNAAA

MLLPLLSSK

DDDDDDLLMp

PPPPPPPPP

SSSSSSKKK

GGGGGGRRR

RRRRRRAAA

AAAAAAIII

AAAAIIQQQ

ILLLFLMFF

GGGGEEEGG

VVVIVVSSS

HHHHHHHRR

LVVTQQRII

SSAAQQSAA

AAAAAASRR

YYYYYYSEE

DGEEDDLSS

GEEEKKSNN

KDDAQQSRR

NKKGGGSKK

VTADAAMNN

AEAAPPXYF

LDAELVNGG

T..NTTGSS

I..GSSNNN

P..NGGXRR

P..VIIXAA

L..LPPKAA

K..SEEENN

ASAGIIQQQ

IRASIIWAA

DPKKDDRSS

NEAKNNAAA

MKGVVVEGG

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MQDEQQAAV

MKLGMMIVR

MLVIKKAIF

GADVAAGHL

.EPESSNKA

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GPKAGGDDH

VANAVLL..

VIGVAAM..

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584AtASN1 578AtASN3 578AtASN2 582MdASN1 586MdASN2 630MdASN3 723MdASN4 643MdASN5 610AtASN4

Consensus

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150AtASN1 150AtASN3 150AtASN2 150MdASN1 150MdASN2 194MdASN3 170MdASN4 211MdASN5 191AtASN4

Consensus

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Consensus

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377AtASN1 377AtASN3 377AtASN2 377MdASN1 377MdASN2 421MdASN3 382MdASN4 431MdASN5 412AtASN4

Consensus

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SSSSSSRRL

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LLLLLLIII

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KQQLMMPPP

488AtASN1 488AtASN3 488AtASN2 486MdASN1 488MdASN2 532MdASN3 483MdASN4 547MdASN5 514AtASN4

Consensus

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584AtASN1 578AtASN3 578AtASN2 582MdASN1 586MdASN2 630MdASN3 603MdASN4 643MdASN5 610AtASN4

Consensus

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PPPPPPKKK

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TTTTTTAAG

KKKKKKRRR

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CCCCCCKKK

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AAAAAASRR

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Consensus

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Consensus

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Consensus

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MdASN5

AtASN2

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MdASN1

MdASN4MdASN3

Appendix C

AtASN1AtASN3

MdASN2

MdASN5

AtASN2

AtASN4

MdASN1

MdASN4MdASN3

AtASN1AtASN3

MdASN2

MdASN5

AtASN2

AtASN4

MdASN1

MdASN4MdASN3

AtASN1AtASN3

MdASN2

MdASN5

AtASN2

AtASN4

MdASN1

MdASN4MdASN3

AtASN1AtASN3

MdASN2

MdASN5

AtASN2

AtASN4

MdASN1

MdASN4MdASN3

AtASN1AtASN3

MdASN2

MdASN5

AtASN2

AtASN4

MdASN1

MdASN4MdASN3

7676767676

120939191

150150150150150194170211191

266266266266266310280317307

377377377377377421382431412

377377377377377421382431412

584578578582586630603643610

76AtASN1 76AtASN3 76AtASN2 76MdASN1 76MdASN2 120MdASN3 93MdASN4 91MdASN5 91AtASN4

Consensusm

MMMMMMMMMc

CCCCCCCCCg

GGGGGGGGGi

IIIIIIIII

LLLLLLAAA

AAAAAALLI

VVVVVVIIV

LLLFLLIIV

GGGGGGCWC

CCCCCCGGG

SVIISSIIV

DDDDDDRRR

DNNNDDFFI

SSSSSSHDE

QQQQQQLLL

AAAAAASSS

KKKKKKSST

RRRRRRLLL

VSSSVVFLS

RRRRRRLLS

VIIIHVNNS

LIIILLSPL

EEEEHETTS

LLLLTLLPE

SSSSSSPPT

RRRRRRVLE

.

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.

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PPPPPPPPPd

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SSSSSSLLVg

GGGGGGGGG

LLLLLLSSE

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QCCCQQKKT

NYYHHHLLI

GEEGGGLLH

DDDNDDLLL

NCCCCCHHR

YYYYFFSSP

LLLLLLPAN

AAAAAAIVC

HHHHHHLSG

QEEQQQNNQ

RRRRRRRRE

LLLLLLLLS

AAAAAAPPA

VIIIIILVT

IVIVIIRRL

DDDDDDGES

PPPPPPVIV

ATTAAASVV

SSSSSSPSE

GGGGGGVST

DDDDDDVIS

QQQQQQQEE

PPPPPPPGG

LLLLLLLVT

FYYYYYIVY

NNNNNNDKK

EEEEEESEL

DDDDDDAEE

KKKKKKKAE

TTTTSSNGT

IIVVII.XT

VAAVVV.ES

VVVVVV.GL

TTTTTT.DG

VVVVVV.EE

NNNNNN.GL

GGGGGG.KH

150AtASN1 150AtASN3 150AtASN2 150MdASN1 150MdASN2 194MdASN3 170MdASN4 211MdASN5 191AtASN4

Consensus

EEEEEE.CF

IIIIIIIFI

YYYYYYLSG

NNNNNNVLS

HHHHHHYET

EKKKEENNL

EAIQEE.XQ

LLLLLL.RL

RRRRRR.TR

.

.

.

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VVVVVVVVV

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