Anti–Pepper mild mottle virus Polyclonal Antibody

ส.วก.ท.

วารสารวทยาศาสตรเกษตร ปท 48 ฉบบท 3 กนยายน - ธนวาคม 2560 403

โพลโคลนอลแอนตบอดตอเชอไวรสใบดางพรก : การผลต คณสมบต และการน�าไปใชในการตรวจวนจฉย

Anti–Pepper mild mottle virus Polyclonal Antibody : Production, Characteristics and Diagnostic Applicationธรวศษฐ แพทยสมาน1,2 รชน ฮงประยร1,2,3,* และ สรกล วะส3,4

Teewasit Phatsaman1,2 Ratchanee Hongprayoon1,2,3,* and Sirikul Wasee3,4

1 ภาควชาโรคพช คณะเกษตร ก�าแพงแสน มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก�าแพงแสน นครปฐม 731402 ศนยวทยาการขนสงเพอเกษตรและอาหาร สถาบนวทยาการขนสงแหงมหาวทยาลยเกษตรศาสตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร กรงเทพฯ

109003 ศนยเทคโนโลยชวภาพเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก�าแพงแสน นครปฐม 731404 ศนยวจยและพฒนาพชผกเขตรอน คณะเกษตร ก�าแพงแสน มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก�าแพงแสน นครปฐม 731401 Department of Plant Pathology, Faculty of Agriculture at Kamphaeng Saen, Kasetsart University, Kamphaeng Saen

Campus, Nakhon Pathom 73140 Thailand2 Center for Advanced Studies for Agriculture and Food, Kasetsart University Institute for Advanced Studies, Kasetsart

University, Bangkok 10900 Thailand (CASAF, NRU–KU, Thailand)3 Center for Agricultural Biotechnology, Kasetsart University, Kamphaeng Saen Campus, Nakhon Pathom 73140

Thailand4 Tropical Vegetable Research Center, Faculty of Agriculture at Kamphaeng Saen, Kasetsart University, Kamphaeng Saen Campus, Nakhon Pathom 73140 Thailand รบเรอง: มนาคม 2560 Received: March 2017 รบตพมพ: ตลาคม 2560 Accepted: October 2017* Corresponding author: [email protected]

ABSTRACT: Pepper mild mottle virus (PMMoV) is a plant virus in the genus Tobamovirus infecting peppers which are economic plants. The virus can be transmitted from plant to plant mechanically and by seed, causing serious yield loss. Since no chemical control is available therefore screening for disease–free seed by serological assay is recommended for control measure. Production high quality antibody is very important in this case. The objective of this study is to produce a specific polyclonal antibody against PMMoV by using its recombinant coat protein (PMMoV–CP) as an antigen. The virus isolated from Kamphaeng Saen district, Nakhon Pathom Province was used as a template for PMMoV coat protein (PMMoV–CP) gene cloning. The PMMoV–CP gene, 474 bp, was ligated into pQE80–L expression vector and produced the recombinant PMMoV–CP at 17.5 kDa which was then immunized into a New Zealand White rabbit subcutaneously and intramuscularly. The antiserum had been collected weekly for the period of eight weeks. Their titers ranged from 25,600 – 204,800 with the highest titer presented in 8th week. Indirect PTA–ELISA using the antiserum at a dilution 1:1000 could detect PMMoV in the infected leaf saps up to the dilution 1:5,120. Specificity test was performed and the result showed high specificity to five tobamoviruses including PMMoV, Tobacco mosaic virus (TMV), Odontoglossum ringsot virus (ORSV), Tomato mosaic virus (ToMV) and Ribgrass mosaic virus

>>

404 Agricultural Sci. J. 2017 Vol. 48 (3)

โพลโคลนอลแอนตบอดตอเชอไวรสใบดางพรก

(RMV), but showed no cross reaction to other viruses tested including Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV) in the genus Tobamovirus; Potato virus Y (PVY), Chilli veinal mottle virus (ChiVMV) and Papaya ringspot virus (PRSV) in the genus Potyvirus; Tomato necrotic ring virus (TNRV), Watermelon silver mottle virus (WSMoV) and Melon yellow spot virus (MYSV) in the genus Tospovirus; Tomato leaf curl New Delhi virus (ToLCNDV) in the genus Begomovirus and Cucumber mosaic virus (CMV) in the genus Cucumovirus. Examination of the antiserum reactivity was carried out by comparison with the commercial antibodies from Agdia and the results from every sample were corresponding.

Keywords: Virus coat protein, diagnosis, phytosanitary certification, serological technique, tobamovirus

บทคดยอ

Pepper mild mottle virus (PMMoV) เปนเชอไวรสในจนส Tobamovirus มพรกซงเปนพชทส�าคญทางเศรษฐกจเปนพชอาศย สามารถถายทอดโรคดวยวธกลโดยน�าคนพช และผานทางเมลด ท�าความเสยหายตอผลผลตพรก อกทงยงไมมสารเคมใดก�าจดเชอไวรสชนดน การคดกรองเมลดพนธเพอใหปราศจากโรคดวยวธการทางซรมวทยานบเปนขนตอนเบองตนท จะชวยควบคมโรคได การผลตแอนตบอดทมคณภาพจงมความส�าคญเปนอยางยง งานวจยนมวตถประสงคเพอผลตโพลโคลนอลแอนตบอดตอเชอ PMMoV โดยใชรคอมบแนนทโปรตนหอหมอนภาค (PMMoV–CP) เปนแอนตเจน โดยน�าตวอยางโรคพรกทตรวจพบ เชอ PMMoV จากอ�าเภอก�าแพงแสน จงหวดนครปฐม มาใชเปนตนแบบในการโคลนยนโปรตนหอหมอนภาคของเชอไวรส ไดชนยนขนาด 474 นวคลโอไทด เพอโคลนเขาสพลาสมดพาหะ pQE–80L expression vector และกระตนใหเกดการแสดงออกของยน พบวาโปรตน PMMoV–CP มน�าหนก 17.5 กโลดาลตน สกด PMMoV–CP ใหบรสทธเพอใชในการผลตแอนตซรม โดยวธฉดเขาใตผวหนงและเขากลามเนอขาหลงของกระตายพนธ New Zealand White เกบแอนตซรม

ทกสปดาห เปนเวลา 8 สปดาห พบวา มคาไตเตอรอยระหวาง 25,600 – 204,800 โดยมคาไตเตอรสงสดในสปดาหท 8 เมอน�าไปเจอจางท 1:1,000 และตรวจน�าคนพรกเปนโรค พบวามความไวในการตรวจทระดบการเจอจาง 1:5,120 การตรวจสอบความจ�าเพาะของแอนตซรมพบวามความจ�าเพาะกบเชอไวรส 5 ชนดในจนส Tobamovirus ไดแก PMMoV Tobacco mosaic virus (TMV) Odontoglossum ringsot virus (ORSV) Tomato mosaic virus (ToMV) และ Ribgrass mosaic virus (RMV) โดยไมท�าปฏกรยากบไวรสชนดอนอก 9 ชนดทน�ามาทดสอบ คอ Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV) ในจนส Tobamovirus; Potato virus Y (PVY), Chilli veinal mottle virus (ChiVMV) และ Papaya ringspot virus (PRSV) ในจนส Potyvirus; Tomato necrotic ring virus (TNRV), Watermelon silver mottle virus (WSMoV) และ Melon yellow spot virus (MYSV) ในจนส Tospovirus; Tomato leaf curl New Delhi virus (ToLCNDV) ในจนส Begomovirus และ ไดแก Cucumber mosaic virus (CMV) ในจนส Cucumovirus การทดสอบประสทธภาพในการตรวจเชอ PMMoV โดยใชแอนตซรมทผลตไดเปรยบเทยบกบแอนตบอดทางการคาพบวาใหผลตรงกนทกตวอยางทน�ามาทดสอบ

Agricultural Sci. J. (2017) Vol. 48(3): 403–414 ว. วทย. กษ. (2560) 48(3): 403–414

ส.วก.ท.


ค�าส�าคญ: โปรตนหอหมอนภาคไวรส, การตรวจวนจฉย, การตรวจรบรอง, เทคนคซรมวทยา, โทบาโมไวรส

บทน�า

โรคทเกดจากเชอไวรสใบดางพรก (Pepper mild mottle virus หรอ PMMoV) (Sutabutra, 1989) มรายงานการพบครงแรกในสหรฐอเมรกาในป ค.ศ. 1952 (Wetter et al., 1984) ปจจบนพบรายงานการระบาดทวโลก เชน ในทวปอเมรกาเหนอ ประเทศสหรฐอเมรกา ออสเตรเลย ญปน จน ไตหวน ยโรป และแอฟรกา (Lamb et al., 2001) โดยเขาท�าลายทงพรกผลใหญ ผลเลก และพรกประดบ ท�าใหพรกแสดงอาการใบดาง เนอใบมสเขยวออนสลบเขยวเขม รปราง บดเบยวเสยรป และเสนใบหงกงอ สวนลกษณะอาการบนผลพรก จะท�าใหผวขรขระ ดาง และมขนาดผลเลกกวาปกต ท�าใหคณภาพและผลผลตของพชลดลง และยงสงผลตอการผลตเมลดพนธทางการคา ซงไวรสใบดางพรกมพชอาศยกวาง ถายทอดโรคไดงายดวยวธกล มความเขมขนสงในน�าคนพช และเปนเชอไวรสกลมทมความทนทานสงจงมโอกาสตดไปโดยการสมผสกบพชทเปนโรคหรอดนและซากพชทมการปนเปอนเชอไวรสดงกลาว นอกจากนนยงสามารถถายทอดโรคโดยตดไปกบสวนเปลอกหมเมลด (seed coat) แตไมมรายงานของพาหะน�าโรค (Zaitlin, 2000) ในป พ.ศ. 2559 ประเทศไทยสงออกเมลดพนธ พรก คดเปนมลคามากกวา 620 ลานบาท (Thai seed trade association, 2016) ซงตดอนดบ 1 ใน 10 ของเมลดพนธทมการสงออกมากทสดของไทย ดงนนการน�าเขาและสงออกเมลดพรกเพอการคาจงมความเสยงตอการเขาท�าลายของโรคนและเปนอปสรรคตอการผลตและการสงออกไดในอนาคต ซงหากมการปนเปอนของเชอไวรสตดไปกบผลผลตหรอเมลดพนธ ทจะสงออก นอกจากจะเปนการลดความนาเชอถอแลวยงอาจเกดคาใชจายในการตกลบอกดวย เนองจากเชอไวรสชนดนเปนเชอ

ไวรสกกกนในหลายประเทศ ไดแก ประเทศในกลมยโรป สเปน อนเดย อเมรกา เกาหลใต และญปน เปนตน (Department of Agriculture, 2016) ทหามปนเปอนมากบผลผลตและสวนขยายพนธตาง ๆ ตองมการออกใบรบรองพชปลอดโรคซงเปนขอบงคบในประเทศผคา หนวยงานทเกยวของในการตรวจสอบโรคตองเสยคาใชจายสงในการน�าเขาแอนตบอดจากตางประเทศทมราคาแพง การผลตแอนตบอดทจ�าเพาะตอเชอไวรสดงกลาวภายในประเทศจงชวยลดคาใชจาย สามารถน�าไปใชในการตรวจสอบดวยเทคนคซรมวทยาและชวโมเลกลทใหผลตรวจทรวดเรวและแมนย�า งานวจยครงนจงมวตถประสงคเพอผลตโพลโคลนอลแอนตบอดตอเชอไวรสใบดางพรก ศกษาคณสมบตของแอนตบอด และพฒนาวธ enzyme– l inked immunosorbent assay (ELISA) เพอการตรวจวนจฉยโรคใบดางพรก

อปกรณและวธการ

1. การเกบตวอยางโรคไวรสใบดางพรก (PMMoV) เกบตวอยางพรกทแสดงอาการของโรคไวรส

ใบดางพรก ไดแก ใบดางมสเขยวออนสลบเขยวเขม รปรางบดเบยวเสยรป และเสนใบหงกงอ นอกจากนนสามารถสงเกตอาการจากผลพรกซงมอาการดาง และมขนาดผลเลกกวาปกต โดยเกบตวอยางจากพนทปลกในจงหวดนครปฐม กาญจนบร เชยงใหม และเชยงราย น�าตวอยางทไดมาตรวจดวยวธ Double antibody sandwich ELISA (DAS–ELISA) โดยใชแอนตบอดทจ�าเพาะตอเชอ PMMoV ทางการคา (Agdia Inc., USA) จากนนน�าตวอยางทใหผลบวกมาท�าการแยกเชอไวรสให เป นสายพนธ เดยว โดยปลกเชอไวรสลงบน Chenopodium amaranticolor ซงแสดงอาการแผลจดเฉพาะแหง ตดจดแผลแตละจดแยกบดใน 0.01 M phosphate buffer อตราสวน 1:10 (น�าหนกตอปรมาตร) ปลกเชอไวรสจากแตละจดบนใบพรกจนดา Capsicum annuum ท�าการแยกเชอซ�าอกครงเพอ

>>



ใหไดเชอไวรสบรสทธตามวธการดงกลาวขางตน น�าตวอยางทไดมาตรวจสอบดวยวธ DAS–ELISA เพอยนยนวาเปนไวรส PMMoV จากนนน�าตวอยางพรกทผานการตรวจสอบแลวมาท�าแหงโดยใชสารดดความชนและเกบไวใน 4 องศาเซลเซยส เพอเกบไวใชงานตอไป (Anon, 2005)

2. การเพมปรมาณยนโปรตนหอหมอนภาคไวรส PMMoV

สกดอารเอนเอจากตวอยางพรกโดยใชชดสกด FavorPrepTM Tissue Total RNA Kit (Favorgen, Taiwan) น�าสวนของ total RNA ทไดไปเตรยม cDNA library ดวย SuperscriptTM III One–Step RT–PCR System with Platinum (Invitrogen, USA) และเพมจ� านวนด เอน เอของยน PMMoV–CP โดยว ธ polymerase chain reaction (PCR) ใชไพรเมอรดงน Forward primer คอ 5’–TTT TTG GAT CCA TGG CTT ACA CAG TTT CCA GTG–3’ และ Reverse primer คอ 5’–CCT TTA AGC TTT TAA GGA GTT GTA GCC CAG GTG–3’ ปฏกรยาส�าหรบเพมปรมาณชนยนมดงน Total RNA 1 ไมโครลตร, 2x Reaction mix 25 ไมโครลตร, Forward primer (10 µM) 1 ไมโครลตร, Reverse primer (10 µM) 1 ไมโครลตร, SuperscriptTM III RT/Platinum Taq Max 2 ไมโครลตร และ Deionized water (dH

20) 16

ไมโครลตร ปรมาตรของปฏกรยารวม 50 ไมโครลตร โดยอณหภมทใชในขนตอน RT–PCR คอ cDNA synthesis 50 องศาเซลเซยส 30 นาท; Initial denaturat ion 94 องศาเซลเซยส 2 นาท ; Denaturation 94 องศาเซลเซยส 30 วนาท; Annealing 59 องศาเซลเซยส 30 วนาท Extension 68 องศาเซลเซยส 40 วนาท เรมกระบวนการท 3–5 ซ�าอก 34 รอบ และ Final extension 68 องศาเซลเซยส 5 นาท ลดอณหภมลงมาท 16 องศาเซลเซยส ตรวจสอบขนาดของชนดเอนเอโดยใช 1.5% agarose gel electrophoresis ใน Tris–borate buffer (TBE)

และน�าไปยอมแถบ DNA ดวย Ethidium bromide ตรวจแถบ DNA ภายใตแสงอลตราไวโอเลตเปรยบเทยบขนาดของ DNA กบ 100 bp Plus markers (Fermentas, USA)

3. การเชอมตอยน PMMoV–CP เขากบพลาสมดพาหะ pQE–80L vector และถายเขาส E. coli สายพนธ DH5α

น�า PCR product จากขอ 2 มาตดดวยเอนไซม BamHI โดยใช 10x Fast Digest Buffer ปรมาตร 2 ไมโครลตร ดเอนเอพาหะสายผสมปรมาตร 7 ไมโครลตร เอนไซม HindIII ปรมาตร 1 ไมโครลตร และ น�ากลน (nuclease–free) ปรมาตร 10 ไมโครลตร บมปฏกรยาทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 1 ชวโมง และอณหภม 65 องศาเซลเซยส นาน 15 นาท น�าผลผลตทไดเชอมตอกบพลาสมดพาหะ pQE–80L expression vector (Qiagen, USA) โดยใชอตราสวน insert gene ตอ vector เทากบ 3:1 2x ligation buffer 5 ไมโครลตร และ T4 ligase 1 ไมโครลตร บมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 2 ชวโมง น�าพลาสมดลกผสมปรมาตร 10 ไมโครลตร เข าส เซลล แบคทเรย Escherichia coli สายพนธ DH5α ปรมาตร 100 ไมโครลตร ดวยวธการ heat shock transformation (Sambrook and Russell, 2001) ตรวจสอบการเชอมตอของยนดวยวธ PCR แลวสงวเคราะหขอมลล�าดบ นวคลโอไทดและแปลงขอมลล�าดบนวคลโอไทดทได เปนล�าดบกรดอะมโน ด วยโปรแกรม ExPASy–Translate tool (http://web.expasy.org/translate/)

4. การสกดโปรตน PMMoV–CP บรสทธเลยงเซลล E. coli สายพนธ DH5α ทมยน

PMMoV–CP ในอาหารเลยงเชอ 2YT ทม Ampicillin 100 ไมโครกรมตอมลลลตร เปนเวลา 1 คน ท 37 องศาเซลเซยส จากนนยายลงในอาหารเหลว 2YT ทผสม Ampicillin 100 ไมโครกรมตอมลลลตร เลยงเชอ

ส.วก.ท.


ตอจนมคา OD600

เทากบ 0.5 เตม IPTG ใหมความเขมขนสดทายเทากบ 1 mM เลยงเชอตอเปนเวลาอยางนอย 6–8 ชวโมง แยกตะกอนเซลลโดยหมนเหวยงดวยความเรว 5,000 รอบตอนาท เปนเวลา 45 นาท ละลายตะกอนเซลลดวย purification buffer (100 mM NaH

2PO

4, 10 mM Tris–Cl, 8M Urea, pH 8.0) ทเตม

lysozyme ความเขมขน 10 มลลกรมตอมลลลตร อตราสวนบฟเฟอร 30 มลลลตรตอตะกอนเซลลทไดจากอาหารเลยงเชอ 1 ลตร ท�าใหเซลลแตกดวยวธ freeze–thaw แลวน�ามาหมนเหวยงดวยความเรว 10,000 รอบตอนาท เปนเวลา 45 นาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เกบสวนน�าใสมาผานคอลมน Ni–NTA ตามวธการของผผลต เตม Elution Buffer เพอชะ PMMoV–CP ออกจากคอลมน โดยเกบสารละลายโปรตน fraction ละ 1 มลลลตร จ�านวน 8–10 fraction น�าไปตรวจสอบความบรสทธของโปรตนดวยวธ SDS–PAGE ตามวธการของ Laemmli (1970)

5. การผลตโพลโคลนอลแอนตบอดตอเชอ PMMoVน�าโปรตน PMMoV–CP ฉดกระตนกระตาย

พนธ New Zealand White อาย 3 เดอน โดยฉดครงแรกดวยโปรตนความเขมขน 0.5 มลลกรมตอมลลลตร ผสมกบ Complete Freund’s Adjuvant (CFA) อตราสวน 1:1 โดยฉดเขาทใตผวหนง (Subcutaneous injection, SC) ตอมาฉดกระตนโดยใชโปรตนผสมกบ Incomplete Freund’s Adjuvant (IFA) อตราสวน 1:1 ปรมาตร 1 มลลลตร ฉดเขากลามเนอขาหลง (Intramuscular injection, IM) ในสปดาหทสอง เรมเกบเลอด หลงจากฉดครงแรกไปแลว 3 สปดาห และเกบเลอดตอไปทกสปดาหจนครบ 8 ครง น�าเลอด มาตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 30 นาท เพอใหเลอดแขงตว และแยกสวนแอนตซรมตามวธการของ Hongprayoon (2015)

6. วธการตรวจวนจฉยเชอ PMMoVการตรวจวนจฉยเชอ PMMoV ใชวธ indirect

plate–trapped antigen enzyme– l inked immunosorbent assay (indirect PTA–ELISA) โดยเคลอบ ELISA plate ดวย rCP ความเขมขน 5 ไมโครกรมตอมลลลตร ใน coating buffer ปรมาตรหลมละ 50 ไมโครลตร เปรยบเทยบกบพชปกตและพชเปนโรคทเปนแอนตเจนควบคม (บดดวย coating buffer อตราสวน 1:10) บมทอณหภม 4 องศาเซลเซยส ขามคน จากนนเตม Blocking buffer (PBS + 5% skim milk) ปรมาตร 100 ไมโครลตรตอหลม บมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 1 ชวโมง เตมแอนตซรมทจ�าเพาะตอเชอ PMMoV (crude antiserum) เจอจาง 1:1,000 ใน PBS ปรมาตร 50 ไมโครลตรตอหลม บมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 1 ชวโมง แลวเตม goat anti–rabbit IgG conjugated with alkaline phosphatase (GAR–AP) (Sigma, USA) เจอจาง 1:30,000 ใน PBS ปรมาตร 50 ไมโครลตร ตอหลม บมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 1 ชวโมง แตละขนตอนกอนเตมสารชนดตอไป ลาง ELISA plate ดวย PBST (PBS + 0.05% Tween 20) ปรมาตร 200 ไมโครลตรตอหลม 3 ครง ครงละ 5 นาท ตรวจสอบปฏก รยาโดยเตมสบสเตรท p–nit rophenyl phosphate ทเจอจางใน substrate buffer ความเขมขน 1 มลลกรมตอมลลลตร ปรมาตร 100 ไมโครลตรตอหลม บมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 60 นาท อ านผลปฏกรยาด วยเครอง ELISA reader ทความยาวคลน 405 นาโนเมตร (Hongprayoon, 2015)

7. การตรวจคาไตเตอร (titer) ของแอนตบอด และความไว (sensitivity) ของวธการ

ตรวจคาไตเตอรของแอนตบอดทผลตไดโดยเจอจางแอนตซรม แบบ 2 เทา (2–fold dilutions) เรมจาก 1:200 ถง 1:204,800 และใหท�าปฏกรยากบโปรตน PMMoV–CP ความเขมขน 5 ไมโครกรมตอมลลลตร เปรยบเทยบกบพชปกตและพชเปนโรคซงเปนแอนตเจนควบคม ใชวธ indirect PTA–ELISA ตามวธการในขอ 6. สวนการตรวจสอบความไวของวธการ

>>



โดยน�าใบพรกท เป นโรคบดใน coating buffer อตราสวน 1:20 จากนนเจอจาง แบบ 2 เทา (2–fold dilution) แลวมาทดสอบกบแอนตซรมครงท 8 ท เจอจาง 1:1,000 ดวยวธ indirect PTA–ELISA เชนเดยวกน (Hongprayoon, 2015)

8. การตรวจสอบความจ�าเพาะของแอนตบอดทผลตได ทดสอบความจ�าเพาะของแอนตซรมทผลตได

โดยใหท�าปฏกรยากบไวรสสาเหตโรคพช จ�านวน 14 ชนด ไดแก Pepper mild mottle virus (PMMoV), Tobacco mosaic virus (TMV), Ribgrass mosaic virus (RMV), Tomato mosaic virus (ToMV), Odontoglossum ringsot virus (ORSV), Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV), Potato virus Y (PVY), Chilli veinal mottle virus (ChiVMV), Papaya ringspot virus (PRSV), Tomato necrotic ring virus (TNRV), Watermelon silver mottle virus (WSMoV), Melon yellow spot virus (MYSV), Tomato leaf curl New Delhi virus (ToLCNDV) และ Cucumber mosaic virus (CMV) ใชวธ indirect PTA–ELISA ตามวธการในขอ 6.

9. การประเมนประสทธภาพของแอนตบอดทผลดไดโดยตรวจวเคราะหตวอยางพรกทเกบจากสภาพแปลงปลก

น�าตวอยางพรกสายพนธ Thai Super Hot (C. annuum) ทเกบจากสภาพแปลงปลกทอ�าเภอ

ก�าแพงแสน จงหวดนครปฐม 10 ตวอยาง โดยสมตวอยางทแสดงอาการใบดางเขยวออนสลบเขยวเขมและตวอยางทไมแสดงอาการดาง มาตรวจหาเชอไวรส PMMoV โดยใชแอนตบอดทผลตไดดวยวธ indirect PTA–ELISA ตามวธการ Hongprayoon (2015) เปรยบเทยบกบวธการ DAS–ELISA โดยใชแอนตบอดทจ�าเพาะตอเชอ PMMoV ทางการคา (Agdia Inc., USA) ตามค�าแนะน�าของบรษท

ผลการทดลองและวจารณ

1. การเกบตวอยางโรคไวรสใบดางพรก (PMMoV)การเกบตวอยางโรคพรกทมลกษณะอาการ

คล ายโรคไวรสใบด างพรกจากจงหวดนครปฐม กาญจนบร เชยงใหม และเชยงราย จ�านวนทงหมด 70 ตวอยาง พบเชอไวรส PMMoV จ�านวน 3, 1, 2 และ 2 ตวอยาง คดเปน 5%, 20%, 13.33% และ 10% ของตวอยางทเกบมาในแตละพนท ตามล�าดบ (Figure 1) โดยจงหวดนครปฐมพรกทตรวจพบเชอ PMMoV ใหคาการดดกลนแสงจากการตรวจดวยวธ DAS–ELISA สงสดเทากบ 1.318 และแยกไดแผลจดเฉพาะแหงบน C. amaranticolor หลงจากปลกเชอ 3–4 วน เมอตดแผลจดมาปลกเชอไวรสบนใบพรกจนดา พบวาแสดงอาการใบดางสเขยวออนสลบเขยวเขม ซงเปนอาการของ PMMoV หลงจากปลกเชอไปแลวประมาณ 7 วน และใหผลบวกโดยการตรวจสอบยนยนดวยวธ DAS–ELISA

ส.วก.ท.


Figure 1 Chlorosis and distertion symptoms on peppers associated with PMMoV from Nakhon Pathom (A–C), Kanchanaburi (D), Chiang Mai (E–F) and Chiang Rai (G–H)

A

E

B

F

C

G

D

H

2. การเพมปรมาณยนโปรตนหอหมอนภาคไวรส PMMoV

การเพมปรมาณยน PMMoV–CP ไดชนยนทมขนาดประมาณ 474 นวคลโอไทด จากพรก 3 ตวอยาง และเมอน�าตวอยาง NPT–1S6 ไปตรวจวเคราะหล�าดบนวคลโอไทดและล�าดบกรดอะมโนพบวายนมขนาด 474 นวคลโอไทด แปลรหสใหกรดอะมโนทงหมด 157 เรสดวส ดงน MAYTVSSAN-QLVYLGSVWADPLELQNLCTSALGNQFQTQQA-RTTVQQQFSDVWKTIPTATVRFPATGFKV-

FRYNAVLDSLVSALLGAFDTRNRIIEVENPQNPT-TAETLDATRRVDDATVAIRASISNLMNELVRGTG-MYNQALFESASGLTWATTP

โดยยน PMMoV–CP ทศกษามล�าดบนวคลโอไทดและล�าดบกรดอะมโนเหมอนกบทมรายงานในฐานขอมล GenBank ทคา identity เทากบ 100% โดยเหมอนกบขอมลจากประเทศจน (KC020357.1) บราซล (AB550911.1) และ สเปน (FN594853.1) การวเคราะหโปรตนโดยใชโปรแกรม CPH models 2.0, Swiss–Pdb viewer 4.10 และโปรแกรม IEBD analysis

>>



resource (Figure 2) ท�าใหทราบเบองตนถงต�าแหนง ทสามารถเปนแอนตเจนได คอสวนของโปรตนทมลกษณะเปน linear epitope ซงมจ�านวน 2 ต�าแหนง ทล�าดบ กรดอะมโน 5–11 และ 51–68 โดยอพโทปชนดนมขอดคอ จะยงคงรปรางเดมเสมอแมวาโปรตนจะมการ

เสอมสภาพ (denatured protein) ทงนเนองจากในขนตอนการท�าใหโปรตน PMMoV–CP บรสทธ จ�าเปนตองใชบฟเฟอรซงมองคประกอบของยเรยทท�าใหโปรตนเสอมสภาพ แตการทอพโทปเปนชนด linear epitope จะท�าใหมนใจไดวาอพโทปดงกลาวจะยงคงอย

Figure 2 The predicted tertiary structure of recombinant PMMoV coat protein analyzed by SWISS–pdb Viewer shows 78% identity with TMV structure from protein databank. The 2 regions at the amino acid positions 5–11 and 51–68 (in boxes) are predicted to be linear epitopes for immune response for antibody production

3. การสกดโปรตน PMMoV–CP บรสทธก า ร ส ก ด โ ป ร ต น โ ด ย ว ธ a f f i n i t y

chromatography พบวา ไดโปรตนบรสทธใน fraction ท 2–8 มความเขมขน 0.1342, 1.0615, 1.0745, 0.3470, 0.2132, 0.1008 และ 0.0912 มลลกรมตอมลลลตร ตามล�าดบ ผลผลตโปรตนรวมทงสน 3.02 มลลกรมตอมลลลตร และโปรตนมน�าหนก 17.5 กโลดาลตน

4. วธการตรวจวนจฉยเชอ PMMoVการตรวจวนจฉยเชอ PMMoV ดวยวธ indirect

PTA–ELISA พบวา เมอใช rCP เปนแอนตเจน ไดคา O.D.405 สงทสด คอ 1.968 เมอเปรยบเทยบกบพช

เปนโรค มคาเทากบ 1.799 โดยไมท�าปฏกรยาขามกบพชปกต

5. การตรวจคาไตเตอร (titer) ของแอนตบอด และความไว (sensitivity) ของวธการ

จากการเกบเลอดเปนเวลา 8 สปดาห ตรวจสอบไตเตอรของแอนตซรมไดในชวง 25,600–204,800 โดยมคาสงสดในสปดาหท 8 (AS#8) รองลงมาไดแกสปดาหท 6–7, 2–5 และ 1 โดยมคาไตเตอรเทากบ 204,800, 102,400, 51,200 และ 25,600 ตามล�าดบ (Figure 3) การวเคราะหความไวในการตรวจสอบโดยวธ indirect PTA–ELISA พบวามความไวทระดบการเจอจาง น�าคนพชเปนโรค 1:5,120

ส.วก.ท.


Figure 3 Titration of anti–PMMoV antiserum collected from week 1–8 using PMMoV–CP as an antigen and analyzed by indirect PTA–ELISA

6. การทดสอบความจ�าเพาะของแอนตซรมทผลตไดการทดสอบความจ�าเพาะของแอนตซรมกบเชอ

14 ชนด โดยใชน�าคนพชหรอไวรสบรสทธเปนแอนตเจน พบวาแอนตซรมท�าปฏกรยากบเชอ PMMoV โดยมคา O.D.

405 สงสด นอกจากนนยงท�าปฏกรยากบเชอไวรส

ในจนสเดยวกนอก 4 ชนด คอ TMV, ORSV, ToMV และ RMV แตไมท�าปฏกรยาขามกบไวรสจนสอนทน�ามาทดสอบและพชปกต (Table 1) เนองจากการผลตแอนตบอดใชรคอมบแนนทโปรตนทมการแสดงออกของยนโปรตนหอหมอนภาคเปนแอนตเจน เมอน�าล�าดบกรดอะมโนของโปรตนหอหมอนภาคไวรสในจนส Tobamovirus ทง 6 ชนดทน�ามาทดสอบมาเปรยบเทยบกน พบวา มความเหมอนกนของเชอ PMMoV กบ TMV, ToMV, ORSV, RMV และ CGMMV อยท 73.89%, 73.89%, 68.79%, 49.68 และ 36.31 ตามล�าดบ แตเมอพจารณาเฉพาะสวนทวเคราะหจาก

โปรแกรมคอมพวเตอรคาดวาเปน linear epitope จ�านวน 15 เรสดวส (ซงจ�านวนกรดอะมโนบรเวณ อพโทปอาจมเพยง 4–6 เรสดวส) ในสวนล�าดบกรด อะมโนท 51–58 ของ PMMoV–CP กบเชอไวรสชนดอนดงกลาวพบวามความเหมอนกบเชอ ORSV, TMV, ToMV และ RMV เทากบ 66.7, 60, 60 และ 33.3 ตามล�าดบ ซงการเกดปฏกรยาขามนมขอมลสนบสนนจากรายงานของ Monia and Kerim (2006) ทผลตโพลโคลนอลแอนตบอดตอ PMMoV แตพบวาแอนตบอดทไดท�าปฏกรยาขามกบเชอไวรส TMV Keila Maria et al. (2002) ไดผลตโมโนโคลนอลแอนตบอดตอ ToMV พบวาแอนตบอดท�าปฏกรยาขามกบ TMV จากรายงานทกลาวมาเบองตนนนแสดงใหเหนวาไวรสในกลม Tobamovirus นยงคงมบางอพโทปทเหมอนกนอยจงท�าใหแอนตบอดเกดปฏกรยาขามในกลมเดยวกน อยางไรกตามปรมาณไวรสในตวอยางพชกมสวนส�าคญ

>>



ตอคา O.D.405

ทอานได เนองจากตวอยาง TMV และ ORSV ทน�ามาทดสอบเปนไวรสบรสทธและมความเขมขนสง สวน ToMV และ RMV เปนตวอยางควบคมทจดซอมา ซงโดยปกตจะพบวามปรมาณไวรสนอยกวา ในภาพรวมแมวาแอนตบอดทผลตไดไมจ�าเพาะกบ PMMoV เพยงอยางเดยว แตการทมปฏกรยาขาม

กบเชออนในจนส Tobamovirus โดยเฉพาะทเขาท�าลายพรกได จงเปนขอดในการน�าไปใชเพอการคดกรองเชอ PMMoV, TMV, ToMV และ RMV ในการตรวจสอบเบองตนกอนทจะน�ามาตรวจสอบแยกชนดของไวรส ท�าใหประหยดเวลาและคาใชจายในการตรวจสอบ

Table 1 Specificity test of anti–PMMoV antiserum at 1:1,000 dilution against PMMoV–CP and other viruses by Indirect PTA–ELISA

Genus Viruses species Antigen/source O.D.405

Result

Tobamovirus

PMMoVTMVRMVToMVORSV

CGMMV

positive control/Agdiapurified virus/tobaccopositive control/Agdiapositive control/Agdiapurified virus/orchidpurified virus/cucumber

1.746 ± 0.010a

1.670 ± 0.0230.465 ± 0.0250.459 ± 0.0041.452 ± 0.0070.189 ± 0.001

+++++–

Potyvirus

PVYChiVMVPRSV

plant sap/potatoplant sap/pepperplant sap/papaya

0.207 ± 0.0020.183 ± 0.0030.193 ± 0.002

–––

TospovirusTNRV

WSMoVMYSV

plant sap/pepperplant sap/cucumberplant sap/cucumber

0.190 ± 0.0010.184 ± 0.0010.210 ± 0.002

–––

Begomovirus ToLCNDV plant sap/cucumber 0.182 ± 0.002 –

Cucumovirus CMV plant sap/pepper 0.183 ± 0.002 –

Negative control plant sap/pepper 0.142 ± 0.002 –

a The absorbance value was the mean value obtained from three independent assays at 60 min after adding the substrate at 37°C

7. การประเมนประสทธภาพของแอนตบอดทผลดไดโดยตรวจวเคราะหตวอยางพรกทเกบจากสภาพแปลงปลก

การตรวจตวอยางพรกจ�านวน 10 ตวอยาง โดยวธ indirect PTA–ELISA ตรวจพบเชอ PMMoV

5 ตวอยาง และไมพบเชอ PMMoV จ�านวน 5 ตวอยาง ซงใหผลตรงกบการตรวจโดยใชแอนตบอดทางการคา (Table 2) ผลทได แสดงใหเหนว าแอนตบอดทผลตไดมประสทธภาพทดใกลเคยงกบทางการคา

ส.วก.ท.


Table 2 Detection of PMMoV in plant disease samples collected from Nakhon Pathom province by Indirect PTA–ELISA using the produced antiserum at 1:1,000 compared to DAS–ELISA using the commercial antibodies (Agdia, Inc., USA)

SampleResult/O.D.

405

Indirect PTA–ELISAa DAS–ELISAa

Thai Super Hot 1Thai Super Hot 2Thai Super Hot 3Thai Super Hot 4Thai Super Hot 5Thai Super Hot 6Thai Super Hot 7Thai Super Hot 8Thai Super Hot 9Thai Super Hot 10

+/2.080–/0.174+/2.433+/1.741–/0.173–/0.178+/2.221+/2.206–/0.175+/2.310

+/2.997–/0.157+/3.023+/2.266–/0.190–/0.169+/3.082+/3.053–/0.161+/3.097

a The absorbance value was the mean value obtained from three independent assays at 60 min after adding the substrate at 37°C

สรป

งานวจยนไดผลตโพลโคลนอลแอนตบอดตอเชอ PMMoV โดยใช โปรตนหอห มอนภาคไวรสเป นแอนตเจน โดยการโคลนยนโปรตนหอหมอนภาคไวรสเขาสพลาสมดพาหะ pQE–80L expression vector ยนมขนาด 474 นวคลโอไทด และแปลรหสใหกรดอะมโน 157 เรสดวส น�าหนกโมเลกล 17.5 กโลดาลตน การวเคราะหล�าดบกรดนวคลโอไทดและกรดอะมโนเปรยบเทยบกบทมรายงานในฐานขอมล GenBank พบวามความเหมอนกนทคา identity 100 เปอรเซนต เมอน�าไปใชเปนแอนตเจนในการผลตแอนตบอดและเกบแอนตซรมจ�านวน 8 สปดาห พบวามคาไตเตอรอยในชวง 25,600 – 204,800 มความไวในการตรวจสอบน�าคนพชเปนโรคทระดบการเจอจาง 1:5,120 แอนตซรมมความจ�าเพาะกบเชอไวรสในจนส Tobamovirus

5 ชนดทน�ามาทดสอบ ไดแก PMMoV, TMV, ORSV, ToMV และ RMV โดยไมท�าปฏกรยาขามกบไวรสในจนสอน ๆ และพชปกต ถ งแม ว าแอนตบอด จะไมจ�าเพาะตอ PMMoV ชนดเดยวตามเปาหมาย แตการทแอนตบอดมความจ�าเพาะตอเชอในจนส Tobamovirus โดยเฉพาะทเขาท�าลายพรกถง 4 ชนด และใหผลการตรวจใกลเคยงกบแอนตบอดทาง การคา แสดงวาแอนตบอดมประสทธภาพทจะใชในการตรวจคดกรองตวอยางพรกทอาจไดรบเชอในจนสนได ซงในประเทศไทยยงไมมรายงานการผลตแอนตบอด ทสามารถตรวจ PMMoV, ToMV และ RMV ได

กตตกรรมประกาศ

งานวจยนไดรบการสนบสนนจาก ศนยวทยาการขนสงเพอเกษตรและอาหารมหาวทยาลยเกษตรศาสตร

>>



ภายใต โครงการสงเสรมการวจยในอดมศกษาและพฒนามหาวทยาลยวจยแหงชาต ส�านกงานคณะกรรมการ การอดมศกษา และ ทนอดหนนวจยมหาวทยาลยเกษตรศาสตร สถาบนวจยและพฒนาแหงมหาวทยาลย

เกษตรศาสตร และขอขอบคณศนยเทคโนโลยชวภาพเกษตรทใหความอนเคราะหเครองมอและอปกรณ ในการท�าวจย

เอกสารอางอง

Anon. 2005. Management of plant pathogen collection. Department of Agriculture, Fisheries and Forestry, Canberra, Australia. 126 p.

Department of Agriculture. 2016. Pest categorisation of pests associated with species worldwide. Available Source: http://www.doa.go.th/plprotect/index.php/8-2016-02-11-07-20-29/23-2016-02-12-04-10-34, March 4, 2017.

Hongprayoon, R. 2015. Serological techniques for plant disease diagnosis. Phet Kasem Printing Group, Nakhon Pathom, Thailand. 88 p. (in Thai)

Keila Maria, R.D., L.H. Gomes, F.G. Andrino, G.A. Leal Jr., F.H. Bicudo da Silva, J.A. Rizzato Paschoal, A.M. Brancalion Giacomelli and F.C. Almeida Tavares. 2002. Identification of Tomato mosaic virus (ToMV) tobamovirus using monoclonal antibodies. Sci. Agric. 59(1) : 107–112.

Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680–685.

Lamb, E.M., S. Atkins, K.D. Schuler and P.D. Roberts. 2001. Pepper mild mottle virus. University of Florida, IFAS Extension Bull. HS–808.

Monia, M.H. and K. Ezzaier. 2006. Biological, serological, and molecular characterization of pepper mild mottle virus (PMMoV) in Tunisia. Tunis. J. Plant Prot. 1(1) : 1–12.

Sambrook, J. and D.W. Russell. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual vols. 1, 2 and 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. 2100 p.

Sutabutra, T. 1989. Virus and virus–like diseases of plants in Thailand. Funny Publishing, Bangkok, Thailand. 130 p. (in Thai)

Thai seed trade association (THASTA). 2016. The volume and value of exports of controlled seed for commercial purposes 2016. Available Source: http://www.thasta.com/web/index.php/2016-05-29-01-47-24/2016-05-29-01-48-39, March 6, 2017.

Wetter, C., D. Conti, R. Altscuh, R. Tabillion and M.H.V. van Regenmortel. 1984. Pepper mild mottle virus, a tobamovirus infecting pepper cultivars in Sicily. J. Phytopathol. 74: 405–410.

Zaitlin, M. 2000. Tobacco mosaic virus. CMI/AAB Description of plant viruses, No.370. Available Source: http://www.dpvweb.net/dpv/showdpv.php?dpvno=370, September, 2013.

Documents

Anti–Pepper mild mottle virus Polyclonal Antibody