Análisis de la variabilidad genética de la colección

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Análisis de la variabilidad genética de la colección colombiana de musáceas usando marcadores isoenzimáticos

Analysis of the genetic variability of colombian collection of Musaceae

using isozyme markers

Martha C. Giraldo1†, Gustavo A. Ligarreto2*, Gerardo Cayón2‡, y Constanza Melo3††

1Department of Plant Pathology, Kansas State University, USA. 2Facultad de Agronomía, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, Colombia. 3�� *Autor para correspondencia: [email protected]; †[email protected]; ‡[email protected]; ††[email protected]

Rec.: 06.05.11 Acep.: 09.09.11

Resumen

��!��"��#��$��!��%!��!��%!��!��!��"&�'())��#��+��!��!�!��+��-��el mejoramiento genético de la especie, mediante el uso de materiales diploides con características ��+��//�� in vitro, fueron evaluadas ��%!��')��+��!��!��4!��7��<��!��=��transaminasa (GOT), ��-esterasa (��HIJL#��=��"�MQ#�-��4��"�VW�#��+��XYL�4!��!��!��MQ��VW��-��HIJL��!��!��I��!��4��!��!��Z��los genotipos de plátano y banano cultivados en Colombia.

Palabras clave:� ��+�� 4�� +�� Z��Musa, Musaceae.

Abstract

The Colombian Collection of Musaceae (CCM) represents a great value to the world agriculture for being the only one with high Andean germplasm. The characterization of this germplasm can generate added value to use in processes of clone selection and breeding of the species by using diploid materials with desirable traits to be transferred and thus help alleviate food problems in poor countries. For this reason the CCM 33 clones conserved in vitro, were assessed biochemically using 10 enzymes of which four \��7��<�=��!��"XYL#��-esterase (��HIJL#��=��"�MQ#��]��"�VW�#��L]��XYL��+-��\��]��!��!��MQ��HIJL��VW��\��!��!��]��-�\��]��]��!��L]��!�-��understanding of the genetic structure of the genotypes of plantain and banana grown in Colombia.

Key words: Colombia, genetic markers, isoenzymes, morphological characterization, Musa, Musaceae.

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Introducción

Los plátanos y bananos (Musa spp) son consi-derados componentes básicos en la alimenta-��_))��]��las regiones tropicales y subtropicales (Perea, 2003). Colombia es el mayor productor de plátanos de América Latina con 400.000 ha ��-�!��!��/�)))�)))��q�x�

Botánicamente son hierbas gigantes, mo-��-��familia Musaceae que comprende los géneros Ensete Horan y Musa��I��Z��Ensete es monocárpico, con nueve cromosomas básicos y se caracteriza por la ausencia de retoños y 4�!��H��I��Z��Musa es el más ampliamente distribuido y comprende cuatro secciones (Eumusa, Rhodochlamys, Callimusa y Australimusa). Callimusa y Aus-tralimusa tienen un número básico de cro-mosomas de 10 (2n = 20), mientras Eumusa y Rhodochlamys tienen un número básico de 11 (2n = 22). Las especies de Rhodochlamys y Callimusa son principalmente de importan-cia ornamental y las especies de Eumusa y Australimusa son las de mayor importancia por producir frutos comestibles (Chandel y W!��]�� ~)))�� -�� ~)))#�� Eumusa, que incluye bananos y plátanos, muestra una gran variabilidad entre sus especies expresada en la cantidad de formas ��-��!��7��-��-��!��" �-lalcázar, 1991; Chandel y Anuradha, 2000). La existencia de esta poliploidía ha originado ��!��7��=��entre las subespecies (Simmonds, 1966).

Las especies de bananos y plátanos co-mestibles se originaron de los cruces interes-��7�� Musa acuminata Colla (Genoma A) y Musa balbisiana Colla (Genoma B), de las cuales esta última presen-ta menos variabilidad (Chandel y Anuradha, 2000). Musa acuminata��con Musa balbisiana son las especies progeni-toras de la mayoría de bananos cultivados, los cuales pueden ser diploides (2n = 22), triploi-��"~��//#��"~��__#��I�Musa las plantas poliploides son más vigorosas, re-sistentes y de mayor productividad y adapta-��%!��!��

presentar en varios niveles: triploides de M. acuminata pura AAA, triploides híbridos de ��4��!��WW �-�W ��WWWW��ABBB, AAAB y AABB (Bakry et al., 2001). Según Simmonds (1979) los clones triploides son resultado de cruces entre diploides, donde uno de los dos produce gametos no reducidos; los tetraploides se desarrollan de un gameto triploide no reducido y uno diploide reducido o de gametos diploides no reducidos, aspecto que es de gran importancia si se quiere deter-minar a partir de cuáles diploides silvestres se originaron los nuevos grupos y proponer una adecuada taxonomía. Los triploides se �� $� �� !��<� "'#�AAA para bananos con muy bajo contenido ��-��-��+$��"~#�WW ��-nancia acuminata, (3) ABB para plátanos con dominancia balbisiana con alto contenido de ��-��+$��I��últimos han resultado ser resistentes y tole-rantes a sequías y a enfermedades infecciosas como sigatoka negra, causada por el hongo �� var. difformis, siga-toka amarilla causada por Mycosphaerella musicola y moko, causado por la bacteria Ralstonia solanacearum (Purseglove,1985; X��+�et al., 1987).

Las semillas son muy raras en los ba-nanos y plátanos cultivados y la esterilidad, combinada con la partenocarpia son ca-racterísticas de calidad favorables del fruto %!��!��]��hecho de estas plantas cultivos de interés co-mercial de primera importancia entre los fru-��"��'��#��I��!��de estas plantas directamente disponible es un conjunto de aproximadamente 500 clones (De Langhe, 1987), el cual es distribuido por ��!��" ��-�V-ternational) a diferentes regiones del mundo, ��4��(Bakry et al., 2001). Sin embargo, el movi-miento acelerado de este germoplasma y la carencia de un acuerdo común entre culti-vadores y campesinos sobre la nomenclatura de las diferentes variedades, ha limitado la ��7��-��!��-��!��de su diversidad genética.

VARIABILIDAD GENÉTICA DE LA COLECCIÓN COLOMBIANA DE MUSÁCEAS USANDO MARCADORES ISOENZIMÁTICOS

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La mayor parte de los esfuerzos de la ��Musa se ha concentrado en ��4�!�� de enanismo en la planta para contrarrestar su volcamiento, la resistencia a enfermeda-des y plagas (Bakry et al., 2001; Rodríguez y ��-��~))�#�-��"��~))'#��7��+�� -�� Musa se han generado programas ��en condiciones de campo e in vitro, ya que ambas facilitan un acceso continuo a los materiales para estudios de sistemática y 7��-��una base genética amplia (De Langhe, 1987). ��!��"��#�en condiciones de campo, ubicada anterior-��I=��I��W��(Montenegro, Quindío) y actualmente en el �� V�� "��Valle) cuenta con más de 140 introducciones entre diploides (AA, BB, AB), triploides (AAA, AAB, ABB) y tetraploides (AAAA, AAAB, AABB, ABBB) todas ellas caracterizadas por �Z��4��-��-culares. La CCM en condiciones in vitro se ��!��V��L��-tatá (Mosquera, Cundinamarca) y tiene 145 materiales clonales, la mayoría provenientes de la CCM y establecida en campo.

I��!��=��!��-vamente vegetativa como plátano y banano, las colecciones de germoplasma son de vital �� 7�� -�� +�� -� ��-�!�� %!�� -�deben ser objeto de estudios continuos para evaluar su rango de diversidad genética. I��condiciones de campo e in vitro ya que son ��Z��!�!��-��4��!��"��-mura, 1999); mientras que en las colecciones de campo estos riesgos están representados por plagas, enfermedades y desastres natu-rales (Horry, 2000).

L�� +�� -��7��!��]��

��!��4��(Simmonds y Shepherd, 1955; Stover y Sim-��'��~#��%!��material genético basada en fenotipos visibles (forma, tamaño y colores) del seudotallo, hojas, racimo y frutos. Aunque estas características ��!-�$��7��7��!��!��por la edad, la etapa de desarrollo o los efectos ambientales sobre las características medidas (Bhat et al., 1995a). Debido a la naturaleza �!��7��7��están ahora complementándola con técnicas ��!�� +�� grupos de Musa que incluyen la diversidad de ��-��7��"��-�-��-��'��#��7��+��" ��et al., 1974; Bhat et al., 1992a), heterogeneidad �� !�� "��H��]�#� ��rARN (Lannaud et al.��'��~#��7��ADN de cloroplastos (Gawel et al., 1992), RFLP "��7�� !�� 4��#�"��et al., 1992; Bhat et al., '��(�#��MW��"W��7��7��azar) (Jarret et al., 1993; Bhat y Jarret, 1995), VNTR (número variable de repeticiones en tán-dem) (Kaemmer et al., 1993), SSR (secuencias ��#�-�W��"��7��!��4��7��#�"��et al.��~))�#��I��!��Z�-��7��Z��!�� 7�� +��M��-�MW��ha permitido el conocimiento más detallado y profundo del género Musa (Quiroz, 1991). I�� +�� Z��]��!��$��!��Z��7��de un gran número de materiales con una in-��%!��por técnicas moleculares, no obstante, la in-4��Z��!��!��de menor veracidad comparada con algunas técnicas moleculares, dado que el proceso de �=��!��$��4��de ambiente.

I��!��4!��+��Z��-lombiana de Musáceas (CCM) mediante la ��+��%!��//��banco base in vitro.

ACTA AGRONÓMICA. 60 (2) 2011, p 108-119

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Materiales y métodos

Material vegetalI��4��de germoplasma in vitro de la CCM, formado por 145 materiales clonales, se incorpora-ron algunos materiales que por parámetros ��4��-�7��J��-garon 66 clones provenientes de la CCM en �� I=�� I�� W��(Montenegro, Quindío), para ser incluidos en el banco base in vitro, y de estos se emplea-��+��%!��//�clones que presentaron mayor respuesta en ��"�!��'#�

W��=��!��tejidos para análisis bioquímicos se evalua-

��7��y físicas del material conservado in vitro y las de almacenamiento (temperatura y luz). Generalmente, cualquier tejido de la planta (hojas, raíces, tallos, semillas, organelos ce-lulares) sirve para estudios enzimáticos, no obstante es importante tener en cuenta que los metabolitos secundarios pueden causar =�� =��se tomaron muestras de tejido de 0.5 g de toda la plántula y se maceraron con buffer de �=��L��)�)(��/�"M��+�et al��'��#��'<~��=��crudos fueron centrifugados a 14 000 gn y 4 °C por 20 min y posteriormente se tomaron ��!��!��I�-pendorf que se almacenaron a 0 ºC para su uso posterior.

Cuadro 1.��!��!��+��

Nombre Sección Subgrupo Genoma1. Red Yade I!�!�� Plantain AAB2. K.W.A. I!�!�� Plantain AAB3. Madre del platanal I!�!�� Plantain AAB4. Dominico Maqueño I!�!�� Plantain AAB5. Dominico 300 I!�!�� Plantain AAB6. Diby I!�!�� Plantain AAB��J�� I!�!�� Plantain AAB8. Dominico Caoba I!�!�� Plantain AAB9. Pelipita I!�!�� Pelipita ABB10. Messiatza I!�!�� Plantain AAB11. Njock kon I!�!�� Plantain AAB'~��I� I!�!�� Plantain AAB'/��$ I!�!�� Plantain AAB14. Plantain 17 I!�!�� Plantain AAB'(�� I!�!�� Plantain AAB16. Amou I!�!�� Plantain AAB17. Kelong mekintu I!�!�� Plantain AAB18. Pompo Comino I!�!�� Popoulou AAB19. FHIA 2 I!�!�� V��7�� AAAA~)��]��I� I!�!�� Bluggoe ABB21. Bend mossendjo I!�!�� Plantain AAB22. Dominico Mutant rojo I!�!�� Plantain AAB23. Dominico Guaicoso I!�!�� Plantain AAB24. IC 2 I!�!�� Gros Michel AAAA25. Dominico Ancuyan I!�!�� Plantain AAB26. Rose D’ekona I!�!�� Plantain AAB27. Dominico Común I!�!�� Plantain AAB28. FHIA 3 I!�!�� V��7�� AABB29. Musa laterita Rhodoclamys – –30. Bocadillo Chileno I!�!�� Sucrier AA31. Popoulou I!�!�� Popoulou AAB32. Saba I!�!�� Saba ABB33. ¾ Nain I!�!�� Plantain AAB


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Corrida electroforéticaJ��!��+��!��!��')��"�q�#�-�_��"�q�#��L��H ��<��)��!��por Ramírez et al. (1987). Las condiciones uti-lizadas en la electroforesis fueron las siguien-tes: 250 V y 25 W, iniciando el proceso con una corriente de 15 mA hasta que las mues-��-��!��(��W��')��]��+��~(� �W� 7�� 4�� '(��!Z��%!��"�+!��4��#��+��-��]��

Como marcadores enzimáticos se eva-luaron diez enzimas: glutamato oxaloacetil transaminasa (GOT), shikímico dehodrogena-��"J��#��+��"�I#��-esterasa (��HIJL#��=��"�MQ#��4��"�VW�#��6-fosfogluconato dehidrogenasa (6-PGDH), malato dehidrogenasa (MDH), fosfogluconato isomerasa (PGI) y fosfatasa ácida (ACP); los �� +�� !��+��fueron los propuestos por Ramírez et al. (1987).

Análisis estadísticoCon base en los zimogramas obtenidos con cada una de las enzimas analizadas, se rea-��+��!��=-presando numéricamente como 1 = presencia ��)��!��+��una matriz básica de datos (MBD). Luego se analizaron los datos de las enzimas más ��7��LJ�JH��"M]�4��~))�#��!��7��similitud de Nei (Dice), con el cual se efec-tuaron los agrupamientos con el método de ligamiento promedio no-ponderado (UPGMA) (Crisci, 1983).

Resultados y discusión

I��%!��%!��=��7��-��7��4�Z��!��!��!��=��%!��!-��=��!��De los diez sistemas enzimáticos utilizados como marcadores, (GOT, ��HIJL��VW��MQ��

�I��J��H�X��XV�-�W��#��sistemas PGI y ACP no presentaron actividad �+��-��+��H�X��I��J��-� �� 7��!��+��!��matrices de datos de las cuatro enzimas más ��7�� "XYL��HIJL��MQ�-��VW�#��-�en este orden se presentan los resultados obtenidos con cada enzima.

Glutamato oxaloacetato transaminasa (GOT)Se encontraron tres zonas de actividad que corresponden a los tres loci reportados por Jarret y Litz (1986) (Figura 1a) y al igual que ellos, los loci GOT-1 y GOT-2 presentaron !��7��!��XYLH/��de estructura dimérica, presentando un pa-��!��7��como se representa en la Figura 1b.

-Esterasa ( -EST)De todas las enzimas evaluadas fue la más ��7��!�$��bandas, como se observa en la Figura 2. �� +��7�� +��de actividad que corresponden a: (1) zona A, para las bandas 1 y 2; (2) zona B, bandas 3 y 4; (3) zona C, corresponde a las bandas 5 y 6; (4) zona D: para las bandas 7 y 8; (5) zona I��-�')��"�#�+��bandas 11 y 12 y (7) zona G, que corresponde a las bandas 13 y 14. La banda 9 es única para el material M. laterita y la banda 10 se ��]��M��y Dominico Común (Figura 2a).

Peroxidasa (PRX)J��7��+��W�� -��"��!��/�#��!��análisis estadístico la zona C con dos bandas ��7��!��/��debido a que las zonas A y B no presentaron patrones consistentes para el análisis.

Diaforasa (DIAP)J��7��!��+��W�� -��"��!��_#��7-cas 1 y 2 corresponden a la zona A; 3 y 4 a la zona B; la zona C, inconsistente, comprende


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Figura 1a.��7��+��XYL

Figura 1b.��+��XYL�

Figura 2a. ��+��IJL

Figura 2. ��7��+��IJL


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las bandas 5 y 6; y la zona D está constitui-��7��-��análisis se tomaron las zonas A, B, y D, por ��%!��-��7��!��-��bandeo (Figura 4a).

I��!��~��]��4��$-mero de alelos por locus o zona de actividad ��!��+��7��evaluadas. Del análisis estadístico con todas las enzimas se obtuvieron nueve grupos, en ��!��!��así: Plantain (AAB), Popoulou (AAB), Pelipita (ABB) y la especie M. laterita, y se agrupan otros materiales como Bocadillo Chileno (AA) y FHIA 03 (AABB), IC2-Gros Michel (AAAA), J��"W #�-��]��I��"W #�"��!��(#�

A partir de estos resultados se puede �4��%!��+��I�-�J��recomendables para estudios de diversidad en Musa��!��7��%!��!��7��!��que MDH y 6-PGDH ya que se comportaron de forma inconsistente en el revelado. Las enzimas ��HIJL�� MQ� -� �VW�� !� ��7�� ]�� -��+��!��-��-��!��+��XYL��!%!��!��7��que las anteriores, permite evaluar la varia-��4��!��de la CCM.

Figura 3b.��+��MQ�

Figura 3a. ��7��+��MQ�


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Figura 4a. ��+��VW��

Figura 4. ��+��VW�

Cuadro 2. Número de alelos por locus o zonas de actividad ��+��7��

Enzima Locus Zonas Alelos o bandas

GOT GOT-1 100GOT-2 100GOT-3 100, 97, 94

IJL A 100, 95B 91, 88C 87, 85D 83, 78I 75, 72F 68, 64G 59, 55

DIAP A 100, 95B 81, 76C 71, 66D 61, 56

�MQ A* –B* –C 102, 100

�+��!��

I��7��!��enzimas consideradas permite predecir que al interior de la CCM existe una variabilidad ��7��-�%!��-riabilidad presente de los diferentes grupos ��+��VW��MQ�-��-IJL��W��-do por la enzima ��HIJL��!��!��herencia, se puede deducir que, posiblemen-te, la estructura de la enzima para las siete +��"W�� I��-�X#��Z��(Figura 2). Dentro del grupo Plantain (AAB) con las cuatro enzimas utilizadas para el análisis estadístico fue posible discriminar algunos genotipos y detectar tres grupos como posibles duplicados: uno constituido por Bend Mossendjo y Dominico Ancuyano, ��'��-�� -��tercero compuesto por Dominico Maqueño y Dominico 300 (Figura 5).


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La banda 10 ��HIJL�"��!��~�#��!��la existencia de una característica única en los clones Rose D’ekona y Dominico Común, lo que podría ser interesante si se logra ha-�� !�� !�� 4�� W��7��por esta enzima permite diferenciar clara-mente a la especie M. laterita,��Rhodochlamys (Figura 2a) por la banda 9, única de los clones pertenecientes a la sec-��I!�!��

Los patrones presentados por la enzima DIAP en las zonas A, B, C y D corresponden, posiblemente, a una estructura monomérica (Figura 4a). De todas las enzimas evalua-das, DIAP es la única que permite evaluar la variabilidad al interior del grupo Plantain, separando los materiales Dominico Común, ��I��X!��-��-�como clones únicos dentro del núcleo común de los Plantain; adicionalmente, muestra

�!��!��interesantes por presentar patrones únicos ��<��]��I��" �!��#�� -dillo Chileno (Sucrier), Popoulou (Popoulou) y Pompo Comino (Popoulou). Lo anterior indica que se trata de materiales con una variabili-dad muy útil para programas de mejoramien-to genético, por tanto es interesante conocer ��7��-q��4��-gicas que permitan hacer correlaciones de los mismos con los patrones bioquímicos únicos %!��

I��!��XYLH/�-��+��+��MQ� �� !�� !��!��dimérica y monomérica, respectivamente, ��!��'�-�/��I��-��7�� +��XYL��!7��!��!��+�-��-��%!��4��!��-��!��I��+��!��=��%!��]��

Red yade (AAB) Plantain

K.W.A (AAB)

Rose Dékona (AAB)

Messiatzo (AAB) Plantain

Dominico ancuyano (AAB)

Dominico guaicoso (AAB) Madre del platanal (AAB)

Dominico caoba (AAB) Plantain Kelong mekintu (AAB)

Njock kon (AAB)

Plantain No17 (AAB)

Harton birracimo (AAB) Plantain Harton común (AAB)

Diby (AAB) Plantain 3/4 Nain (AAB) Plantain

IC2 (AAAA) Gros Michel

Fhia 02 (AAAA) Fhia 03 (AABB) Bocadillo chileno (AA) Sucrier

Pelipita (ABB)

Popoulou (AAB)

Pompo o comino (AAB) Popoulou Musa laterita Rhodochlamys

0.45

Similaridad

0.60 0.75 0.90 1.05

Bend mossendjo (AAB) Plantain

Dominico mut. R (AAB)

Amou (AAB) Plantain

Dominico maqueño (AAB) Plantain

Harton de Santander (AAB) Plantain

Dominico 300(AAB) Plantain

Dominico común (AAB) Plantain

Saba (ABB)

Dominico enano(AAB) Plantain

Cachaco enano (ABB) Bluggoe

Figura 5.�W��!��!��+��+��!��!��


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los resultados, independientemente de las con-��!��<��!44��=��!44��-�clase de gel, siendo éste un comportamiento similar al conseguido por Jarret y Litz (1986).

I��7��+��MQ��VW�)~�-��!��bandas peculiar que los hace formar grupos distintos y únicos, lo que sugiere la rique-za genética que encierran estos clones. Un ��!�� 7�� +�� setenta cultivares de Musa, pertenecientes a ��!��W ��WWW��WW �-�W ��%!��+��4!��7��!��-vares (Bhat et al., 1992 a,b). Aunque la am-��7��4!�� 4!�� !7�� !�� cultivares analizados ya que el 25% de estos ��7��+��

I� �� enzimas, los materiales de banano se dis-tribuyeron formando tres grupos: (1) cons-tituido por FHIA 03 y Bocadillo Chileno, (2) ��!��]��I��J��V�~��Gros Michel y (3) constituido solo por FHIA 02 (Figura 5). Para el primer grupo es de es-perar que el material FHIA 03 se agrupe con Bocadillo Chileno, ya que es un clon híbrido derivado de dos progenitores de genoma AAB y AA, y Bocadillo Chileno es de genoma AA. I��del genoma acuminata, lo cual sería de interés para cruces en los que se busque aumentar la variabilidad de los bananos comerciales, si se tiene en cuenta que un diploide AA, como es el caso de Bocadillo Chileno, representa un genoma más cercano a los parientes silves-tres o ancestrales de los bananos cultivados ��!��I��!��!��]��I��-�J��ABB, se agrupan con el banano IC2-GrosMi-chel, de genoma AAAA, un banano calidad �=��J��!��%!��J��es uno de los pocos plátanos que se pueden consumir maduros como fruta y que los re-sultados bioquímicos lo agrupan en calidad �=��7��-nancia del genoma acuminata para estos dos plátanos, lo cual los hace interesantes para

��I��!��4��VW�)~��7��%!��gran relevancia para el mejoramiento en mu-��+��+��electroforesis de isoenzimas permite agrupar los plátanos colombianos con un mínimo de variabilidad genética, como descendientes de una o dos ramas comunes, diferenciándolas de las introducciones recientes del Oeste africano, las cuales también revelan entre sí !��!��]��I��!��existencia de plátanos que han evolucionado, adaptándose a diferentes agroecosistemas colombianos (Rosales y Pocasangre, 2002).

I�� !�� %!�� =��alta variabilidad al interior del grupo de los bananos ya que, a pesar de tener un bajo número de clones representados en la colec-��!��-��materiales únicos al realizar el análisis con ��+��L��Z��%!��las isoenzimas tienen buen potencial para ��!��Musa, estudios que se pueden complementar con los marcadores moleculares para la diferencia-��!��acuminata y balbisiana y para entender las relaciones estrechas de variabilidad entre los cultivares de plátano (Sánchez et al., 1998). Los resultados de este �� Z��7�� =�!��Chandel y Anuradha (2000) quienes sostienen %!�� +�� Z�� 7�� plátano y banano en colecciones.

Conclusiones

Las enzimas ��HIJL��MQ�-��VW��-timas para evaluar variabilidad en Musa spp y podrían ser marcadores enzimáticos �7��XYL��!�� +��-��!��=��=��

Los clones FHIA 02 y Pompo Comino representan una fuente importante de variabilidad dentro de la CCM, mientras %!��'��-��Birracimo, Dominico 300 y Dominico Ma-queño, al igual que entre Bend Mossendjo y Dominico Ancuyano, posiblemente exista !��!��


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� I�� $�� !��-��!��de los análisis con todas las enzimas sugie-ren la necesidad de incorporar un mayor número de clones tradicionales cultivados -��7��7��de los materiales ya existentes y, adicio-nalmente, aumentar la variabilidad gené-��!�� Colombiana de Musáceas.

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Análisis de la variabilidad genética de la colección